KR20230123509A - 재조합 게놈, 비인간 포유동물 세포 및 이의 생산 방법및 용도 - Google Patents

재조합 게놈, 비인간 포유동물 세포 및 이의 생산 방법및 용도 Download PDF

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KR20230123509A
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Abstract

본 발명은 비인간 포유동물 세포, 비인간 포유동물 세포 재조합 게놈 및 이의 생산 방법을 개시한다. 상기 게놈의 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자의 일부 또는 전부는 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자로 치환되고, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 일부 또는 전부 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임은 녹아웃되며, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자는 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH의 코딩 서열 및 비코딩 서열, 또는 인간 경쇄 기능성 VL, JL의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함한다. 본 발명의 비인간 포유동물 세포는 인간 면역글로불린 기능 영역을 포함하므로, 가변 영역이 완전 인간인 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물의 제조에 사용될 수 있고, 그 유전자 변형 동물을 이용해 완전 인간 항체를 효율적으로 스크리닝할 수 있고, 수득된 항체는 친화도가 더 높고, 연구개발 비용이 절감되고, 연구개발 주기가 단축된다.

Description

재조합 게놈, 비인간 포유동물 세포 및 이의 생산 방법 및 용도
본 발명은 유전공학 분야에 관한 것이며, 구체적으로 의학 및 질병 연구 목적을 위해 유전공학적으로 개조된 비인간 포유동물 세포 및 이의 게놈, 이러한 비인간 포유동물 세포 및 이의 게놈을 기반으로 비인간 포유동물을 수득하는 방법, 및 이러한 동물로부터 유래된 세포, 항체, 항체 단편 및 항체 단편을 포함한 유도체 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
Bruggemann et al. 1989a는 최초로 동물 체내에 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 유전자 단편을 도입해 동물 혈청에서 인간 면역글로불린 유전자 유래 항체를 검출할 수 있다고 보고했으며, 이러한 시도는 유전공학적으로 변형된 동물을 이용해 동물 체내에서 직접 가변 영역이 완전 인간인 치료성 항체를 생성할 수 있는 장을 열었다. 많은 회사들이 유사한 원리를 기반으로 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 유전자 변형 동물을 생산하고 있으며, 이러한 제조 방법 및 사례는 국제 특허 WO90/10077, WO90/04036, WO2012/018610, WO2010/039900, WO2011/004192, WO2002/066630, WO1994/002602, WO1996/030498, WO1998/024893, WO1994/004667, WO1990/006359, WO1992/003917, 미국 특허 US7041871, US6673986, US6091001, US5877397 및 Nat Biotechnol. 2014 Apr;32(4):356-63, Proc Natl Acad Sci USA, 2014 Apr 8;111(14):5147-52 및 Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Apr 8;111(14):5153-8 등에 개시되어 있다.
이러한 방법은 동물 체내 내인성 항체 유전자 클러스터의 기능적 불활성화 및 인간 면역글로불린 유전자의 재조합(recombination)과 발현에 관한 것이다. 이 두 목적을 달성하기 위해 수행되는 유전공학적 변형은, 마우스 배아줄기세포의 일부 또는 전부의 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 녹아웃시키고, 인간의 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 도입하여 이러한 유전자의 기능 결실을 보완함으로써, 마우스가 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 단편 유래 항체를 생성하는 것과 같이, 일반적으로 이러한 비인간 포유동물 배아줄기세포에서 수행된다. 그러나 종래 기술의 이러한 동물 모델은 시간과 비용이 많이 소요되고, 보통 하기와 같은 몇 가지 제한이나 결함이 있다.
1) 녹아웃되거나 불활성화해야 하는 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌 크기는 일반적으로 모두 Megabase 수준으로, 보통 이러한 녹아웃 또는 불활성화 유전자의 조작 효율을 저하시키거나 일부만 성공시킨다. 내인성 면역글로불린 유전자좌의 녹아웃 또는 불활성화가 완전하지 않은 상황에서 수득된 동물은 인간 항체를 발현하는 동시에, 내인성 마우스 항체도 발현됨에 따라, 항체 스크리닝의 난이도를 증가시키는 제한이나 결함;
2) 삽입이 필요한 인간 면역글로불린 유전자좌의 크기 역시 Megabase 수준이며, 벡터의 크기가 일회성으로 도입되는 인간 DNA 단편의 크기를 제한하기 때문에, 일반적으로 모든 인간 면역글로불린 유전자 단편을 전부 도입하려면 더 많은 단계와 더 많은 시간이 필요하다. 전부 도입될 수 없는 상황에서 수득된 동물은 더 작은 V 영역 레퍼토리 또는 더 적은 불변 영역 범주만 가짐에 따라, 더 작은 인간 항체 다양성을 보유하거나 또는 B세포 발달이 더 열악할 수 있는 제한이나 결함;
3) 인간 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편 DNA의 성공적 삽입, 특히 제자리(in situ) 삽입은 효율성이 매우 낮으므로, 이러한 삽입 단계를 여러 번 수행해야 할 때 비효율적 요인이 이러한 유전자 변형 동물을 수득하는 시간 비용 및 실패 위험을 증가시킨다. 무작위 삽입 방법을 사용해 인간 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편 DNA를 이러한 유전자 변형 동물에 도입하면, 원격 조절 영역의 결실 및 무작위 삽입 부위로 인한 불확실성의 영향으로 인해, 일부 마우스 모델에 B 세포의 발달이 상이한 정도로 차단되며, 특히 T1형 B 세포가 T2형 B 세포로 발달하는 과정이 지연된다. 이러한 동물의 항원에 대한 면역반응은 비유전자 변형 동물 수준에 도달하기 어렵고, 생성된 항체의 친화도 역시 비유전자 변형 동물에 생성된 항체의 친화도에 도달하기 어려운 제한이나 결함;
4) 인간 면역글로불린 유전자 단편의 도입 크기, 수량 등의 제약으로 인해, 최적화 발현 분석을 수행할 수 있는 유전자 변형 스트레인의 수가 제한되며, 최종적으로 수득되는 유전자 변형 마우스는 V(D)J 재조합 효율이 낮고 일부 유전자 보체(partial gene complement)를 가지기 때문에, 일반적으로 생성되는 항체가 제한되어 항체 생산의 효율이 저하되는 제한이나 결함.
상기 제한에 대한 분석을 바탕으로, 저비용으로 빠르게 대규모 항체 발현 러이브러리를 얻고, 인간 가변 영역 유전자 단편의 재배열 효율이 높고 발현 효율이 높은 방법에 대한 요구사항, 특히, 항원 반응성이 우수하고 친화도가 높은 인간 면역글로불린을 효율적으로 발현할 수 있는 유전자 변형 동물에 대한 요구사항이 있음을 알 수 있다.
특허문헌 1: 국제공개공보 WO1990-010077
본 발명은 상술한 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 일부 또는 전부 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임의 녹아웃을 통해, 최대한 많은 기능(functional)을 갖는 인간 항체 가변 영역 유전자 단편이 하나의 벡터에 농축할 수 있도록 하는 것을 그 해결 과제로 한다.
전술한 종래의 기술적 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 안정적으로 유전될 수 있고, 완전 인간 치료용 항체 스크리닝에 사용되는 비인간 포유동물 세포를 제공하며, 이의 게놈은 41개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 기능성 V 유전자, 또는 20개의 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 기능성 V 유전자, 또는 31개의 인간 면역글로불린 lambda 경쇄 가변 영역 기능성 V 유전자를 포함할 수 있다. 상기 비인간 포유동물 세포에 기반하여 제조되는 유전자 변형 동물은 다양성이 높고 친화도가 높으며 가변 영역이 완전 인간인 항체를 효율적이고 빠르게 수득할 수 있다.
본 출원의 발명자는 인간 게놈 데이터베이스의 분석을 통해, 인간 중쇄 가변 영역 DNA 단편은 14번 염색체 105863198과 106879844 부위 사이에서 유래되고, 인간 Kappa 경쇄 가변 영역 DNA 단편은 2번 염색체 88860568과 90235398 부위 사이에서 유래되고, 인간 Lambda 경쇄 가변 영역 DNA 단편은 22번 염색체 22023114와 22922913 부위 사이에서 유래됨을 발견하였으며, 모든 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조한다.
발명자는 인간의 면역글로불린 유전자좌에서, V 영역 유전자, D 영역 유전자, J 영역 유전자 또는 불변 영역 유전자는 모두 기여하지 않거나 재배열된 항체 전사체에만 비효율적으로 기여하는 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임이 나타날 수 있음을 발견했다. 이 세 유형의 유전자에 대한 정의 및 특징은 하기의 IMGT 데이터베이스 설명 링크 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/SequenceDescription/IMGTfunctionality.html를 참조하며, http://www.imgt.org/genedb/데이터베이스 링크를 통해 종 호모사피엔스(Homo sapiens)와 유전자 범주(V 영역 유전자는 variable 선택, D 영역 유전자는 diversity 선택, J 영역 유전자는 joining 선택, 불변 영역 유전자는 constant 선택) 및 해당 면역글로불린 유전자좌 명칭(중쇄 유전자좌는 IGH 선택, Kappa 경쇄 유전자좌는 IGK 선택. Lambda 경쇄 유전자좌는 IGL 선택)을 선택하면, 인간 면역글로불린 유전자좌의 기능성 유전자(functional), 유사 유전자(pseudogene) 및 오픈 리딩 프레임(ORF, open reading frame)의 유전자 명칭 목록을 검색할 수 있다. IMGT 데이터베이스에 등록된 유전자는 모두 보고된 기능성 유전자, 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 유전자이며, 실제로 데이터베이스의 일부 유전자는 소수의 개체에만 존재할 수 있다는 점에 주의해야 한다.
인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌, Kappa 경쇄 및 Lambda 경쇄 유전자좌 유전자 단편은 BAC 또는 YAC 라이브러리에 구축된 방법을 통해 대장균 또는 효모에서 복제될 수 있는 BAC 벡터 또는 YAC 벡터로 클론될 수 있다.
유전자 편집을 거치지 않은 경우, 유사 V 유전자, 오픈 리딩 프레임 V 유전자 및 기능성 V 유전자 단편은 혼합 배열된다(도 1 참조). 이러한 유전자는 모두 5’ 말단에 위치한 유전자 조절 영역, 유전자 코딩 서열 영역(인트론 및 엑손 포함) 및 3’ 말단에 위치한 항체 유전자 재조합 신호 서열(RSS, Recombination Signal Sequence)의 3개 영역을 포함할 수 있다. 게놈에서 일부 인간 기능성 V 유전자, 유사 V 유전자 및 오픈 리딩 프레임 유전자 단편(V 영역 유전자의 5‘ 말단 조절 영역, 유전자 코딩 서열 영역 및 3’ 말단 항체 유전자 재조합 신호 서열(RSS, Recombination Signal Sequence)포함)의 부위는 표 1 내지 표 5를 참조할 수 있으며, 이러한 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조한다.
표 1 내지 표 5는 인간 중쇄 V 영역 유전자, 인간 Kappa 경쇄 근위(proximal) V 영역 유전자 및 인간 Lambda 경쇄 V 영역 유전자 목록 및 이의 범주를 나타낸 것이다.
서열
번호 		인간 중쇄 V영역 유전자 명칭 V영역 유전자 범주 인간 14번 염색체 개시 부위 인간 14번 염색체 종결 부위 단편 크기(염기쌍)
H1 IGHV6-1 기능성 V 유전자 105944896 105939715 5182
H2 IGHV(II)-1-1 유사 V 유전자 105986542 105944897 41646
H3 IGHV1-2 능성 V 유전자 106001494 105986543 14952
H4 IGHV(III)-2-1 유사 V 유전자 106005055 106001495 3561
H5 IGHV1-3 기능성 V 유전자 106011882 106005056 6827
H6 IGHV4-4 기능성 V 유전자 106025105 106011883 13223
H7 IGHV7-4-1 기능성 V 유전자 106037862 106025106 12757
H8 IGHV2-5 기능성 V 유전자 106039632 106037863 1770
H9 IGHV(III)-5-1, IGHV(III)-5-2, IGHV3-6 유사 V 유전자 106062109 106039633 22477
H10 IGHV3-7, IGHV1-8, IGHV3-9 기능성 V 유전자 106088082 106062110 25973
H11 IGHV2-10 유사 V 유전자 106116595 106088083 28513
H12 IGHV3-11 기능성 V 유전자 106120286 106116596 3691
H13 IGHV(III)-11-1, IGHV1-12 유사 V 유전자 106129500 106120287 9214
H14 IGHV3-13 기능성 V 유전자 106142246 106129501 12746
H15 IGHV(III)-13-1, IGHV1-14 유사 V 유전자 106153582 106142247 11336
H16 IGHV3-15 기능성 V 유전자 106163495 106153583 9913
H17 IGHV(II)-15-1, IGHV(II)-16-1, IGHV1-17, IGHV1-16(ORF) 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 106184859 106163496 21364
H18 IGHV1-18 기능성 V 유전자 106196658 106184860 11799
H19 IGHV3-19 유사 V 유전자 106210896 106196659 14238
H20 IGHV3-20 기능성 V 유전자 106212785 106210897 1889
H21 IGHV(II)-20-1 유사 V 유전자 106235022 106212786 22237
H22 IGHV3-21 기능성 V 유전자 106257722 106235023 22700
H23 IGHV3-22, IGHV(II)-22-1, IGHV(III)-22-2 유사 V 유전자 106268566 106257723 10844
H24 IGHV3-23 기능성 V 유전자 106276506 106268567 7940
H25 IGHV1-24 기능성 V 유전자 106288923 106276507 12417
H26 IGHV3-25, IGHV(III)-25-1 유사 V 유전자 106301355 106288924 12432
H27 IGHV2-26 기능성 V 유전자 106308995 106301356 7640
H28 IGHV(III)-26-1, IGHV(II)-26-2, IGHV7-27 유사 V 유전자 106324214 106308996 15219
H29 IGHV4-28 기능성 V 유전자 106331105 106324215 6891
H30 IGHV3-29 유사 V 유전자 106335040 106331106 3935
H31 IGHV3-30 기능성 V 유전자 106344384 106335041 9344
H32 IGHV3-30-2 유사 V 유전자 106349243 106344385 4859
H33 IGHV4-31 기능성 V 유전자 106356144 106349244 6901
H34 IGHV3-32 유사 V 유전자 106359751 106356145 3607
H35 GOLGA4P1 기타 관련없는 유전자 106360243 106359752 492
H36 IGHV3-33 기능성 V 유전자 106369097 106360244 8854
H37 IGHV3-33-2 유사 V 유전자 106373621 106369098 4524
H38 IGHV4-34 기능성 V 유전자 106377231 106373622 3610
H39 IGHV7-34-1, IGHV3-35(ORF), IGHV3-36, IGHV3-37, IGHV3-38(ORF), IGHV(III)-38-1 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 106421669 106377232 44438
H40 IGHV4-39 기능성 V 유전자 106425408 106421670 3739
H41 IGHV7-40, IGHV(II)-40-1, IGHV3-41, IGHV3-42 유사 V 유전자 106470223 106425409 44815
H42 IGHV3-43 기능성 V 유전자 106472846 106470224 2623
H43 IGHV(II)-44-1, IGHV(III)-44, IGHV(IV)-44-1, IGHV(II)-44-2 유사 V 유전자 106506956 106472847 34110
H44 IGHV1-45 기능성 V 유전자 106511075 106506957 4119
H45 IGHV1-46 기능성 V 유전자 106515891 106511076 4816
H46 IGHV(II)-46-1, IGHV3-47, IGHV(III)-47-1 유사 V 유전자 106537770 106515892 21879
H47 IGHV3-48 기능성 V 유전자 106556896 106537771 19126
H48 IGHV3-49 기능성 V 유전자 106564377 106556897 7481
H49 IGHV(II)-49-1, IGHV3-50 유사 V 유전자 106578702 106564378 14325
H50 IGHV5-51 기능성 V 유전자 106583409 106578703 4707
H51 IGHV8-51-1, IGHV(II)-51-2, IGHV3-52 유사 V 유전자 106592636 106583410 9227
H52 IGHV3-53 기능성 V 유전자 106599595 106592637 6959
H53 IGHV(II)-53-1, IGHV3-54, IGHV4-55, IGHV7-56, IGHV3-57 유사 V 유전자 106622317 106599596 22722
H54 IGHV1-58 기능성 V 유전자 106627209 106622318 4892
H55 IGHV4-59 기능성 V 유전자 106639079 106627210 11870
H56 IGHV4-61 기능성 V 유전자 106643021 106639080 3942
H57 IGHV3-62, IGHV(II)-62-1, IGHV3-63 유사 V 유전자 106657683 106643022 14662
H58 IGHV3-64 기능성 V 유전자 106666004 106657684 8321
H59 IGHV3-65, IGHV(II)-65-1 유사 V 유전자 106674975 106666005 8971
H60 IGHV3-66 기능성 V 유전자 106680592 106674976 5617
H61 IGHV(III)-67-1, IGHV(III)-67-2, IGHV(III)-67-3, IGHV(III)-67-4, IGHV1-68 유사 V 유전자 106762052 106680593 81460
H62 IGHV1-69 기능성 V 유전자 106770537 106762053 8485
H63 IGHV2-70 기능성 V 유전자 106775077 106770538 4540
H64 IGHV3-71 유사 V 유전자 106790652 106775078 15575
H65 IGHV3-72 기능성 V 유전자 106802652 106790653 12000
H66 IGHV3-73 기능성 V 유전자 106810400 106802653 7748
H67 IGHV3-74 기능성 V 유전자 106822782 106810401 12382
H68 IGHV(II)-74-1, IGHV3-75, IGHV3-76, IGHV5-78, IGHV(II)-78-1, IGHV3-79, IGHV4-80, IGHV7-81(ORF), IGHV(III)-82 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 106879844 106822783 57062
서열
번호 		인간 Kappa 경쇄 근위(proximal) V영역 유전자 명칭 V영역 유전자 범주 인간 2번 염색체 개시 부위 인간 2번 염색체 종결 부위 단편 크기(염기쌍)
K1 IGKV4-1 기능성 V 유전자 88861968 88886183 24216
K2 IGKV5-2 기능성 V 유전자 88886184 88897814 11631
K3 IGKV7-3, IGKV2-4 유사 V 유전자 88947270 88897815 49456
K4 IGKV1-5 기능성 V 유전자 88966231 88947271 18961
K5 IGKV1-6 기능성 V 유전자 88978388 88966232 12157
K6 IGKV3-7 오픈 리딩 프레임 88992378 88978389 13990
K7 IGKV1-8 기능성 V 유전자 89009981 88992379 17603
K8 IGKV1-9 기능성 V 유전자 89019913 89009982 9932
K9 IGKV2-10 유사 V 유전자 89027140 89019914 7227
K10 IGKV3-11 기능성 V 유전자 89040193 89027141 13053
K11 IGKV1-12 기능성 V 유전자 89045910 89040194 5717
K12 IGKV1-13, IGKV2-14 유사 V 유전자 89085146 89045911 39236
K13 IGKV3-15 기능성 V 유전자 89099828 89085147 17483
K14 IGKV1-16 기능성 V 유전자 89117311 89099829 17483
K15 IGKV1-17 기능성 V 유전자 89128657 89117312 11346
K16 IGKV2-18, IGKV2-19 유사 V 유전자 89142543 89128658 13886
K17 IGKV3-20 기능성 V 유전자 89159022 89142544 16479
K18 IGKV6-21 기능성 V 유전자 89170744 89159023 11722
K19 IGKV1-22, IGKV2-23 유사 V 유전자 89176297 89170745 5553
K20 IGKV2-24 기능성 V 유전자 89192412 89176298 16115
K21 IGKV3-25, IGKV2-26 유사 V 유전자 89213392 89192413 20980
K22 IGKV1-27 기능성 V 유전자 89221667 89213393 8275
K23 IGKV2-28 기능성 V 유전자 89234120 89221668 12453
K24 IGKV2-29 유사 V 유전자 89244750 89234121 10630
K25 IGKV2-30 기능성 V 유전자 89252117 89244751 7367
K26 IGKV3-31, IGKV1-32 유사 V 유전자 89267970 89252118 15853
K27 IGKV1-33 기능성 V 유전자 89275176 89267971 7206
K28 IGKV3-34, IGKV1-35, IGKV2-36, IGKV1-37(ORF), IGKV2-38 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 89319594 89275177 44418
K29 IGKV1-39 기능성 V 유전자 89330085 89319595 10491
K30 IGKV2-40 기능성 V 유전자 89333431 89330086 3346
서열 번호 인간 Lambda 경쇄 V영역 유전자 명칭 V영역 유전자 범주 인간 22번 염색체 개시 부위 인간 22번 염색체 종결 부위 단편 크기(염기쌍)
L1 IGLV3-1 기능성 V 유전자 22873533 22881431 7898
L2 IGLV3-2 유사 V 유전자 22872075 22873532 1457
L3 IGLV4-3 기능성 V 유전자 22857100 22872074 14974
L4 IGLV3-4, IGLV2-5, IGLV3-6, IGLV3-7 유사 V 유전자 22823329 22857099 33770
L5 IGLV2-8 기능성 V 유전자 22819792 22823328 3536
L6 IGLV3-9 기능성 V 유전자 22812321 22819791 7470
L7 IGLV3-10 기능성 V 유전자 22793043 22812320 19277
L8 IGLV2-11 기능성 V 유전자 22772622 22793042 20420
L9 IGLV3-12 기능성 V 유전자 22762614 22772621 10007
L10 IGLV3-13 유사 V 유전자 22759251 22762613 3362
L11 IGLV2-14 기능성 V 유전자 22755877 22759250 3373
L12 IGLV3-15 유사 V 유전자 22747961 22755876 7915
L13 IGLV3-16 기능성 V 유전자 22739231 22747960 8729
L14 IGLV3-17 유사 V 유전자 22735129 22739230 4101
L15 IGLV2-18 기능성 V 유전자 22721195 22735128 13933
L16 IGLV3-19 기능성 V 유전자 22715483 22721194 5711
L17 IGLV(I)-20 유사 V 유전자 22713239 22715482 2243
L18 IGLV3-21 기능성 V 유전자 22704858 22713238 8380
L19 IGLV3-22 유사 V 유전자 22698461 22704857 6396
L20 IGLV2-23 기능성 V 유전자 22695110 22698460 3350
L21 IGLV3-24, IGLV(II)-24-1 유사 V 유전자 22687321 22695109 7788
L22 IGLV3-25 기능성 V 유전자 22685389 22687320 1931
L23 IGLV(VI)-25-1, IGLV3-26 유사 V 유전자 22668848 22685388 16540
L24 IGLV3-27 기능성 V 유전자 22664971 22668847 3876
L25 IGLV3-28, IGLV3-29, IGLV3-30, IGLV3-31, IGLV3-32(ORF), IGLV2-33(ORF), IGLV2-34, IGLV7-35 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 22432505 22664970 232465
L26 IGLV1-36 기능성 V 유전자 22428075 22432504 4429
L27 IGLV5-37 기능성 V 유전자 22426318 22428074 1756
L28 IGLV(I)-38 유사 V 유전자 22410322 22426317 15995
L29 IGLV1-40 기능성 V 유전자 22404761 22410321 5560
L30 IGLV1-41(ORF), IGLV(I)-42 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 22395529 22404760 9231
L31 IGLV7-43 기능성 V 유전자 22381387 22395528 14141
L32 IGLV1-44 기능성 V 유전자 22376545 22381386 4841
L33 IGLV5-45 기능성 V 유전자 22370127 22376544 6417
L34 IGLV7-46 기능성 V 유전자 22358302 22370126 11824
L35 IGLV1-47 기능성 V 유전자 22353473 22358301 4828
L36 IGLV5-48 오픈 리딩 프레임 22343774 22353472 9698
L37 IGLV9-49 기능성 V 유전자 22327856 22343773 15917
L38 IGLV1-50 오픈 리딩 프레임 22323009 22327855 4846
L39 IGLV1-51 기능성 V 유전자 22319266 22323008 3742
L40 IGLV5-52 기능성 V 유전자 22220173 22319265 99092
L41 IGLV(IV)-53 유사 V 유전자 22215311 22220172 4861
L42 IGLV10-54 기능성 V 유전자 22202201 22215310 13109
L43 IGLV11-55(ORF), IGLV(I)-56 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 22196316 22202200 5884
L44 IGLV6-57 기능성 V 유전자 22182891 22196315 13424
L45 IGLV(V)-58, IGLV(IV)-59, IGLV(III)-59-1 유사 V 유전자 22162721 22182890 20169
L46 IGLV4-60 기능성 V 유전자 22099252 22162720 63468
L47 IGLV8-61 기능성 V 유전자 22087064 22099251 12187
L48 IGLV1-62, IGLV(I)-63, IGLV(IV)-64, IGLV(IV)-65, IGLV(V)-66, IGLV(IV)-66-1, IGLV10-67, IGLV(I)-68 유사 V 유전자 22031512 22087063 55551
L49 IGLV4-69 기능성 V 유전자 22026593 22031511 4918
L50 IGLVI-70 유사 V 유전자 22023114 22026592 3478
참고 : 1) 개시 부위 수치가 종결 부위보다 큰 V 영역 유전자 방향은 역상보 방향이고, 개시 부위 번호가 종결 부위 번호보다 작은 V 영역 유전자 방향은 정방향이다;
2) 모든 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조한다.
추가적으로는, 발명자는 http://www.imgt.org/genefrequency/query 데이터베이스에서 이 세 유형의 가변 영역 유전자 단편이 재배열된 후의 항체 전사체 cDNA의 시퀀싱 및 유전자 빈도(Gene Frequency)의 분석을 통해, 기능성 유전자 단편이 유전자 재배열을 통해 항체 전사체에 높은 빈도로 기여할 수 있지만, 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임은 일반적으로 항체 전사체에 거의 또는 전혀 기여하지 않는 것을 발견했다.
비록 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임이 항체 전사체에 거의 또는 전혀 기여하지 않지만, 이 두 유형의 유전자는 여전히 유전자 재배열을 통해 유효하지 않은 V/D/J 또는 V/J 재배열 산물을 생성할 수 있다.
비록 비생산적으로 재배열(unproductive rearrangement)된 B 세포만 결국 사멸 방식으로 사라지지만, 방대한 수량의 유사 유전자와 오픈 리딩 프레임의 존재는 비효율적이고 비생산적인 V/D/J 또는 V/J 재조합의 주요 원인이 될 수 있다.
따라서, 발명자는 유사 유전자(pseudogene)와 오픈 리딩 프레임(ORF, open reading frame)을 무분별하게 동물 게놈에 동일하게 도입하면 동물 체내에서 인간 가변 영역 유전자 단편의 재배열 시행착오 비용을 증가시키고, 재조합 효율을 저하시킨다고 추측하였다.
인간, 마우스 또는 랫의 면역글로불린 가변 영역 유전자좌를 예로 들면, 기능성 유전자, 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임은 모두 개재 배열이며, 유전자 재배열 단계, 유전자 전사 단계 심지어 번역 단계에서, 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임은 모두 유효한 재배열을 방해함에 따라 효과적인 재배열 효율을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 발명자는 기능성 유전자만 재배열 및 발현을 통해 기능성 면역글로불린을 생산할 수 있음을 인식한 후, 발명자는 게놈 수준에서 인간 항체의 효율적인 생산에 대한 요구사항을 충족하기 위해, 이러한 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임을 포함하는 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하여 이러한 유사 유전자, 오픈 리딩 프레임의 녹아웃을 시도하였다.
한 측면에서, 본 발명은 핵산 구조체(또는 비인간 포유동물 유전공학적 재조합 게놈)을 제공하며, 상기 핵산 구조체(또는 재조합 게놈)은 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트를 포함하고, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자는 일부(즉, 하나 이상) 또는 전부가 결실된다.
본 발명에서, "일부 또는 전부"는 하나 이상 또는 전부를 의미한다.
상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트의 코딩 영역 및 비코딩 영역은 모두 인간 면역글로불린에서 유래된다.
구체적으로는, 본 발명은 비인간 포유동물 유전공학적 재조합 게놈(또는 핵산 구조체)를 제공하며, 여기서 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자는 일부 또는 전부가 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자에 의해 치환되고, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 일부 또는 전부의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임은 녹아웃된다.
"인간 면역글로불린 가변 영역 유전자"는 "인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자(세그먼트)"와 상동한 의미를 갖는다.
본 발명에서, 선택적으로는, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 기타 관련없는 유전자(예를 들어, 표 1 내지 표 5의 H35 단편으로 표시되는 유전자)는 일부 또는 전부가 녹아웃된다.
선택적으로는, 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역은 인간 면역글로불린의 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 κ 가변 영역, 및/또는 경쇄 λ 가변 영역에서 선택된다.
선택적으로는, 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역은 인간 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 V, D 및 J 영역 중 임의의 하나 또는 이의 조합에서 선택된다.
선택적으로는, 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역은 인간 면역글로불린의 경쇄 κ 가변 영역의 V 및 J 영역 중 임의의 하나 또는 이의 조합에서 선택된다.
선택적으로는, 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역은 인간 면역글로불린의 경쇄 λ 가변 영역의 V 및 J 영역 중 임의의 하나 또는 이의 조합에서 선택된다.
선택적으로는, 유전자 녹아웃을 통해 상기 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자는 결실된다. 선택적으로는, 상기 유전자 놋아웃은 박테리아, 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 대장균, CHO, 피키아 파스토리스와 같은 원핵 또는 진핵 세포에서 수행된다.
또한, 상기 유사 V 유전자 및 오픈 리딩 프레임 유전자의 정의는 IMGT 데이터베이스를 참조한다.
본 발명의 핵산 구조체(또는 유전공학적 재조합 게놈)에서, 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트의 코딩 영역 및 비코딩 영역은 모두 인간 면역글로불린에서 유래된다. 선택적으로는, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트는 인간 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 기능성 V, D 및 J 영역의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함한다.
선택적으로는, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트는 인간 면역글로불린의 k 경쇄 가변 영역 기능성 V 및 J 영역의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하고, 및/또는 인간 면역글로불린의 l 경쇄 가변 영역 기능성 V 및 J 영역의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함한다.
예를 들어, 구체적 실시 양태에서, 본 발명의 핵산 구조체(또는 유전공학적 재조합 게놈)는, (1) 표 1 내지 표 5에서 인간 면역글로불린 중쇄 V 영역 중 유사 V 영역 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 V 영역 유전자를 포함하는 H2, H4, H9, H11, H13, H15, H19, H21, H23, H17의 10개 DNA 단편을 녹아웃하고, H1, H3, H5, H6, H7, H8, H10, H12, H14, H16, H18, H20, H22, H24(이들은 각각 기능성 인간 중쇄 V 영역 유전자 IGHV6-1, IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV4-4, IGHV7-4-1, IGHV2-5, IGHV3-7, IGHV1-8, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV1-18, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23을 포함한다), 및 인간 14번 염색체 105863198과 105939714 사이에서 유래되어 인간 면역글로불린 중쇄 D 유전자 영역 및 J 유전자 영역을 포함하는 서열을 보존하며; 또는, (2) 표 1. 1 내지 표 1.5에서 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 V 영역 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 H26, H28, H39, H41, H43, H46, H49, H51, H53, H57, H59, H61, H64, H68의 이 14개 DNA 단편을 녹아웃하고, 표 1 내지 표 5에서 기능성 V 영역 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 H25, H27, H29, H31, H33, H36, H38, H40, H42, H44, H45, H47, H48, H50, H52, H54, H55, H56, H58, H60, H62, H63, H65, H66, H67의 25개 단편 및 표 1 내지 표 5에서 상기 서열 번호 H30, H32, H34, H37 이 수 개의 유사 V 영역 유전자 단편 및 H35 유전자 단편을 보존하며; 또는, (3) 표 1 내지 표 5에서 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 상기 서열 번호 K3, K6, K9, K12, K16, K19, K21, K24, K26, K28의 10개 영역을 녹아웃하고, 표 1 내지 표 5에서 기능성 인간 Kappa 경쇄 V 영역 유전자 및 2번 인간 염색체 88861967과 88860568 사이의 인간 면역글로불린 Kappa 경쇄 J 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 K1, K2, K4, K5, K7, K8, K10, K11, K13, K14, K15, K17, K18, K20, K22, K23, K25, K27, K29, K30의 20개 영역을 보존하며; 또는, (4) 표 1.1 내지 표 1. 5에서 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 상기 서열 번호 L2, L4, L10, L12, L14, L17, L19, L21, L23, L25, L28, L30의 12개 영역을 녹아웃하고, 표 1. 1 내지 표 1.5에서 기능성 인간 Lambda 경쇄 V 영역 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 L1, L3, L5, L6, L7, L8, L9, L11, L13, L15, L16, L18, L20, L22, L24, L26, L27, L29, L31 의 19개 영역 및 22번 염색체 22881432와 22922913 사이의 인간 면역 글로불린 lambda 경쇄 J 유전자 영역 및 C 유전자 영역을 보존하며; 또는, (5) 표 1 내지 표 5에서 유사 V 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 상기 서열 번호 L36, L38, L41, L43, L45, L48, L50의 7개 영역을 녹아웃하고, 표 1 내지 표 5에서 기능성 인간 Lambda 경쇄 V 영역 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 L32, L33, L34, L35, L37, L39, L40, L42, L44, L46, L47, L49의 12개 영역을 보존하며; 또는, (1) 내지 (5) 중 임의의 두 개 이상을 포함하며, 바람직하게는 (1) 및 (2) 또는 (4) 및 (5)를 포함한다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 본 발명의 핵산 구조체(또는 비인간 포유동물 유전공학적 재조합 게놈)를 제조하는 방법을 더 제공한다.
(1) PCR 방법을 통해 증폭하여 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트의 각 단편을 수득하는 단계, 선택적으로는, 증폭해서 수득된 각 단편을 벡터의 적절한 부위에 개별적으로 삽입하거나, 또는 증폭해서 수득된 단편의 일부 또는 전부를 결합시킨 후 벡터의 적절한 부위에 삽입하는 단계를 더 포함하며; 또는,
(2) 유전자 녹아웃 방법을 통해 인간 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 DNA 단편 또는 경쇄 가변 영역 DNA 단편의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자를 녹아웃함에 따라, 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트를 수득하는 단계; 또는,
(3) 유전자를 합성하는 방식.
본 발명에서, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자는 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH의 코딩 서열 및 비코딩 서열, 또는 인간 경쇄 기능성 VL, JL의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄이다.
추가적으로는, 상기 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 VH, DH, JH 또는 경쇄 가변 영역 VL, JL을 포함하며, 여기서 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄를 의미한다.
추가적으로는, 상기 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 14번 염색체에서 유래되며, 상기 인간 경쇄 기능성 VL, JL의 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 2번 또는 22번 염색체에서 유래된다.
추가적으로는, 상기 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 14번 염색체 105863198과 106879844 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열을 포함하며, 상기 좌표는, 표 1 내지 표 5의 상기 서열 번호 H1, H3, H5, H6, H7, H8, H10(그 단편은 3개의 기능성 V 영역 단편을 포함한다), H12, H14, H16, H18, H20, H22, H24, H25, H27, H29, H31, H33, H36, H38, H40, H42, H44, H45, H47, H48, H50, H52, H54, H55, H56, H58, H60, H62, H63, H65, H66, H67 서열 단편에서 하나 이상의 VH 영역 유전자를 포함하고, 바람직하게는 10 내지 41개의 기능성 VH 영역 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 15 내지 41개의 기능성 VH 영역 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 18 내지 41개의 기능성 VH 영역 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 22 내지 41개의 기능성 VH 영역 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41개의 기능성 V 영역 유전자와 같이, 25 내지 41개의 기능성 VH 영역 유전자를 포함하는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조한다.
추가적으로는, 상기 인간 kappa 경쇄 기능성 VL, JL 코딩 서열 및 비코딩 서열은, 표 1 내지 표 5에서 상기 서열 번호 K1, K2, K4, K5, K7, K8, K10, K11, K13, K14, K15, K17, K18, K20, K22, K23, K25, K27, K29, K30 서열 단편 중 하나 이상의 VL 영역 유전자를 포함하는 인간 2번 염색체 88860568과 90235398 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열; 또는 표 1 내지 표 5에서 상기 서열 번호 L1, L3, L5, L6, L7, L8, L9, L11, L13, L15, L16, L18, L20, L22, L24, L26, L27, L29, L31, L32, L33, L34, L35, L37, L39, L40, L42, L44, L46, L47, L49 서열 단편 중 하나 이상의 VL 영역 유전자를 포함하는 인간 22번 염색체 22023114와 22922913 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열을 포함하며, 여기서 모든 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조한다.
추가적으로는, 상기 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자는 상동 재조합 방법을 통해 일부 또는 전부가 결실되며, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자는 상기 결실된 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 상류 3KB 내지 하류 3KB 부위로 삽입되고, 상기 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자는 상기 결실된 내인성 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 상류 3KB 내지 하류 3KB 부위로 삽입된다.
상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자에서 녹아웃(또는, 일부 또는 전부가 놋아웃)되는 수는 각 유전자의 길이를 단축시켜야 하며, 특히 비교적 큰 폭으로 단축시킬 수 있다.
일반적으로, 비인간 포유동물 세포 게놈에 삽입되는 인간 면역글로불린 중쇄, Lambda 경쇄 가변 영역 유전자의 길이는 각각 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자를 녹아웃하기 전 인간 면역글로불린 중쇄, Lambda 경쇄 가변 영역 유전자 총 길이의 10% 내지 50%이고, 바람직하게는 12% 내지 47%이고, 바람직하게는 14% 내지 45%이고, 바람직하게는 15% 내지 43%이고, 더 바람직하게는 16% 내지 40%이고, 더 바람직하게는 16.10%, 18%, 18.50%, 20%, 25%, 30%, 31%, 31.75%, 35%, 38% 또는 38.06%이다. 또한, 비인간 포유동물 세포 게놈에 삽입되는 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 유전자의 길이는 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자가 녹아웃되기 전 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 유전자 총 길이의 35% 내지 65%이고, 바람직하게는 37% 내지 63%이고, 바람직하게는 38% 내지 61%이고, 바람직하게는 40% 내지 60%이고, 바람직하게는 42% 내지 58%이고, 바람직하게는 45% 내지 57%이고, 바람직하게는 47% 내지 56%이고, 더 바람직하게는 51%, 52%, 53%, 53.08% 또는 54%와 같이 50% 내지 55%이다.
상기 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자의 총 수는 인간 중쇄 가변 영역에서 약 75개이고, 인간 kappa 경쇄 근위 가변 영역에서 약 20개 이고, 인간 lambda 경쇄 가변 영역에서 약 42개이다.
바람직하게는, "일부 또는 전부 녹아웃" 또는 "일부 또는 전부 결실"의 경우, 10% 내지 100%(바람직하게는 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 또는 88%와 같이 15-95%, 20-90%이다)의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자의 녹아웃 또는 결실이며, 그 백분율은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임 유전자의 총 수가 기준이다.
추가적으로는, 상기 비인간 포유동물 세포는 마우스 배아줄기세포이며, 결실되는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 부위는 마우스 12번 염색체 113428530 내지 116027502의 두 부위 사이에 위치한다; 결실되는 내인성 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 부위는 마우스 6번 염색체 67536984 내지 70723924의 이 두 부위 사이에 위치한다; 결실되는 내인성 면역글로불린 lambda 경쇄 가변 영역 부위는 마우스 16번 염색체 19065021 내지 19260700의 이 두 부위 사이에 위치하며, 마우스 게놈 염색체 부위 좌표는 모두 ENSEMBL GRCm38.p6 버전 C57BL/6J 마우스 게놈 데이터베이스 부위를 참조한다.
바람직하게는, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 삽입 부위는 마우스 게놈 12번 염색체 113428513 부위이다; 상기 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 유전자 삽입 부위는 마우스 게놈 6번 염색체 70723924 부위이다.
상기 인간 면역글로불린 lambda 경쇄 가변 영역 유전자 삽입 부위는 마우스 게놈 6번 염색체 70726758 부위이며, 마우스 게놈 염색체 부위 좌표는 ENSEMBL GRCm38.p6 버전 C57BL/6J 마우스 게놈 데이터베이스 부위를 참조한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 유전공학적 재조합 게놈을 포함하는 비인간 포유동물 세포를 제공한다. 상기 포유동물 세포는 비인간 포유동물 배아줄기세포이고, 더 바람직하게는, 상기 배아줄기세포는 마우스 배아줄기세포, 랫 배아줄기세포 또는 토끼 배아줄기세포이다.
본 발명은 본 발명의 핵산 구조체를 표적 세포에 도입하여 제조되는 본 발명의 핵산 구조체를 포함하는 재조합 세포를 더 제공한다.
선택적으로는, 상기 세포는 대장균 세포, 효모 세포, 조류 세포, 포유동물 세포, 랫 또는 마우스 배아줄기세포, 조류 원시 생식세포, C57BL/6J*129S3 배아줄기세포와 같은 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하는 불멸화 세포 또는 비불멸 세포이다(예를 들어, 1차 세포, 계대 세포).
유전자 변형 동물의 제조에 있어서, 본 발명의 핵산 구조체, 재조합 세포의 용도를 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 게놈에 포함되는 면역글로불린 유전자좌는 숙주 비인간 포유동물 세포의 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자가 결실되고, 코딩 영역 및 비코딩 영역이 모두 인간 면역글로불린 가변 영역에서 유래된 유전자 단편에 삽입되는 조작된 비인간 포유동물 세포를 제공하며; 상기 인간 면역글로불린 가변 영역의 유전자 단편은 일부 또는 전부의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 결실된다.
일반적으로, 상기 세포는 불멸화 세포 또는 비불멸 세포이다(예를 들어, 1차 세포 또는 계대 세포).
본 발명의 조작된 비인간 포유동물 세포에서, 삽입된 상기 인간 면역글로불린 가변 영역의 유전자 단편은, 중쇄 가변 영역 기능성 V, D, J 영역 코딩 서열 및 비코딩 서열, 및/또는, k 또는 l 경쇄 가변 영역 기능성 V, J 영역 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함한다. 선택적으로는, 비인간 포유동물은 마우스, 랫, 닭, 토끼 등과 같은 조류, 설치동물이고, 비인간 포유동물 세포는 조류, 설치동물, 마우스, 랫, 닭, 토끼 등에서 유래될 수 있으며, 랫 또는 마우스 배아줄기세포, 조류 원시 생식세포, C57BL/6J*129S3 배아줄기세포일 수 있다. 선택적으로는, 결실된 내인성 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 단편은 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 V, D, J 영역 또는 경쇄 k 또는 l 가변 영역 V, J 영역을 포함한다. 선택적으로는, 삽입된 상기 중쇄 가변 영역 기능성 V, D, J 영역 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 14번 염색체 105863198과 106879844 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열을 포함하며; 선택적으로는, 삽입된 상기 경쇄 k 가변 영역 기능성 V, J 영역 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 2번 염색체 88860568과 90235398 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열을 포함하며; 선택적으로는, 삽입된 상기 경쇄 l 가변 기능성 V, J 영역 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 22번 염색체 22023114와 22922913 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열을 포함하며; 또한, 상기 뉴클레오티드 부위 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 그 방법은 하기를 포함한다.
a) 숙주 비인간 포유동물 세포 게놈의 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 클러스터 상류 및 하류에 방향이 상동하고 호환되는 재조합 효소 표적 부위를 각각 도입하는 단계; b) 단계 a)의 세포에 상기 재조합 효소 표적 부위를 특이적으로 인식할 수 있는 재조합 효소를 계속 도입하고, 단계 a)의 상기 두 개의 재조합 효소 표적 부위 사이에 재조합이 발생하는 조건 하에 숙주 비인간 포유동물 세포 내인성 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자의 일부 또는 전부를 결실시켜서, 표적화 세포를 수득하는 단계; c) 일부 또는 전부의 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역을 포함하는 벡터를 제공하며, 상기 벡터에 포함된 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 중의 일부 또는 전부의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임을 녹아웃시켜 표적화 벡터를 얻는 단계; d) 표적화 벡터를 단계 b)에 도입하여 수득되는 표적화 세포 중, 표적화 벡터에 포함된 인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역이 표적화 세포 중 결실된 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자를 치환함에 따라, 상기 조작된 비인간 포유동물 세포를 수득하는 단계.
선택적으로는, 단계 c)의 표적화 벡터는 중쇄 가변 영역 유전자를 포함하는 중쇄 표적화 벡터, 또는 κ 또는 λ 경쇄 가변 영역 유전자를 포함하는 경쇄 표적화 벡터이다. 또한, 도 10, 13, 14에 도시된 표적화 벡터와 같이, 도입해야 하는 가변 영역 유전자 수에 따라 하나 이상의 중쇄 표적화 벡터 또는 경쇄 표적화 벡터를 구축할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 표적화 벡터가 복수일 경우, 단계 d)에서 순차적으로 이들 표적화 벡터를 도입할 수 있다.
여기서, 단계 c)의 상기 표적화 벡터는 대장균 또는 효모 세포에서 구축이 완료된다.
더 구체적으로는, 본 발명의 또 다른 측면은 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 그 방법은 하기를 포함한다.
a) 숙주 비인간 포유동물 Ig 유전자좌의 경,중쇄 가변 영역을 결실 또는 불활성화시키는 단계; b) 숙주 비인간 포유동물 Ig 유전자좌의 중쇄 불변 영역 상류에 일부 또는 전부의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자가 결실된 인간 IgH VDJ 영역을 삽입하는 단계, 상기 인간 IgH VDJ 영역은 복수의 인간 IgH V 영역, 하나 이상의 인간 D 영역 및 하나 이상의 인간 J 영역을 포함하며, 및/또는; c) 숙주 비인간 포유동물 Ig 유전자좌의 κ 불변 영역 상류에 일부 또는 전부의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 결실된 인간 κ VJ 영역을 삽입하는 단계, 상기 인간 κ VJ 영역은 복수의 인간 Ig 경쇄 κ V 영역 및 하나 이상의 인간 Ig 경쇄 κ J 영역을 포함하며, 및/또는; d) 숙주 비인간 포유동물 Ig 유전자좌의 κ 불변 영역 하류에 일부 또는 전부의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 결실된 인간 λ VJ 영역을 삽입하는 단계, 상기 인간 λ VJ 영역은 복수의 인간 Ig 경쇄 λ V 영역 및 하나 이상의 인간 Ig 경쇄 λ J 영역을 포함하며; 여기서 단계 a) 내지 c)는 임의의 순서로 수행될 수 있고 단계적 방식으로 수행되거나 단일 단계로 수행될 수도 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 그 방법은 하기를 포함한다.
a) 비인간 포유동물 세포 게놈 면역글로불린 가변 영역 유전자 상류 및 하류에 방향이 상동하고 호환되는 재조합 효소 표적 부위를 각각 도입하는 단계;
b) 단계 a)의 상기 재조합 효소 부위를 특이적으로 인식할 수 있는 재조합 효소를 도입하고, 단계 a)의 상기 두 재조합 효소 표적 부위 사이에 재조합 이벤트가 발생하도록 허용하여, 상기 비인간 포유동물 세포 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자를 일부 또는 전부 결실시키는 단계;
c) 일부 또는 전부의 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함한 표적화 벡터를 제공하는 단계, 상기 표적화 벡터는 인간 기능성 가변 영역 유전자를 포함하고 일부 또는 전부의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 녹아웃되고, 상기 인간 기능성 가변 영역 유전자는 인간 기능성 VH, DH, JH 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하거나, 또는 인간 기능성 VL, JL 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄이며; 상기 표적화 벡터는 BAC 벡터 또는 YAC 벡터에서 선택된다;
d) 단계 c)의 상기 표적화 벡터를 도입하여, 비인간 포유동물 세포 내에서 단계 c)에 포함된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자가 단계 b)의 상기 결실된 비인간 포유동물 세포 내인성 면역글로불린 유전자를 치환하는 단계;
e) 단계 d)에 의해 게놈에 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된 비인간 포유동물 세포가 생산되는 단계;
바람직하게는 단계 c)의 상기 표적화 벡터는 대장균 또는 효모 세포에서 구축이 완료된다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함하는 표적화 벡터를 제공하며, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자는 일부 또는 전부의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 녹아웃되고, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자는 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH의 코딩 서열 및 비코딩 서열, 또는 인간 경쇄 기능성 VL, JL의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄이다. 상기 표적화 벡터는 BAC 벡터 또는 YAC 벡터에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 비인간 포유동물 세포를 암컷 야생형 비인간 포유동물의 자궁 내에 도입하고, F0세대 비인간 포유동물로 후손 키메라 비인간 포유동물을 선택한다.
추가적으로는, 비인간 포유동물 세포를 암컷 야생형 비인간 포유동물 자궁 내에 도입하기 전, 상기 비인간 포유동물 세포를 스크리닝하여 염색체 수가 증가 또는 감소되지 않은 비인간 포유동물 세포 클론을 수득하고, 상기 비인간 포유동물 세포 클론을 야생형 비인간 포유동물 배아 포배강에 이식하고, 배아를 가임신한 암컷 야생형 비인간 포유동물 자궁 내에 이식한다.
추가적으로는, F0세대 비인간 포유동물이 야생형 비인간 포유동물과 교배되면 안정적으로 유전이 가능하고, 지정 부위에 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자가 삽입된 F1세대 비인간 포유동물을 수득할 수 있다.
추가적으로는, 중쇄 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물과 경쇄 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물이 암수로 교배되면, 중쇄, 경쇄 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 수득할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 생산하는 상기 방법에 의해 제조된 비인간 포유동물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 비인간 포유동물은 마우스, 랫 또는 토끼이고, 상기 비인간 포유동물 세포는 마우스 배아줄기세포, 랫 배아줄기세포 또는 토끼 배아줄기세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 완전 인간 항체를 스크리닝하거나 또는 완전 인간 항체 약제의 제조에서 상기 재조합 게놈, 상기 비인간 포유동물 세포, 상기 표적화 벡터 또는 수득된 비인간 포유동물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비인간 포유동물의 제조에서 상기 재조합 게놈, 상기 비인간 포유동물 세포, 상기 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법 또는 상기 표적화 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 비인간 포유동물에 의해 생산된 가변 영역이 완전 인간인 항체, 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 유도체 또는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 유전자 변형 동물의 제조에서 본 발명의 조작된 비인간 포유동물 세포의 용도 및 유전자 변형 동물을 생산하는 방법을 더 제공하며, 그 방법은, 본 발명의 조작된 비인간 포유동물 세포(예를 들어 배아줄기세포)를 배반포에 주입한 후, 키메라 배반포를 암컷 동물 체내에 이식하여 후손을 생산하고, 및 필요한 삽입을 갖는 동형접합 재조합체를 교배 및 선택하여 유전자 변형 동물을 수득하는 단계를 포함한다. 선택적으로 동물은 조류, 설치동물 등이며, 랫, 마우스, 닭 또는 토끼일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제조되어 수득된 유전자 변형 동물을 항원으로 면역화하고, 상기 항체 또는 항체 사슬을 회수하거나 또는 상기 항체 또는 중쇄 또는 경쇄를 생산하는 세포를 회수하는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다.
선택적으로는, 수득된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 불변 영역을 인간 불변 영역으로 치환하여 완전 인간화 항체를 생산한다. 본 발명은 이렇게 제조되어 수득된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적 조성물을 제조하는 용도를 더 제공하고, 또 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 벡터를 더 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 항체를 포함하고 항체-소분자 독성 약물 접합체, 항체-방사면역 약물 접합체, 항체-치료용 폴리펩타이드 약물 접합체, 이중/다중특이성 항체 등과 같이 기타 분자와 결합 형성되는 약물을 포함하는 항체 유도체일 수 있다.
본 발명에서 인간 면역글로불린 유전자의 모든 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조하며, 인간 중쇄 가변 영역 DNA 단편은 14번 염색체 105863198과 106879844 부위 사이에서 유래되고, 인간 Kappa 경쇄 가변 영역 DNA 단편은 2번 염색체 88860568과 90235398 부위 사이에서 유래되고, 인간 Lambda 경쇄 가변 영역 DNA 단편은 22번 염색체 22023114와 22922913 부위 사이에서 유래된다.
인간 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 유전자 세그먼트 중 유사 V 유전자 및 오픈 리딩 프레임의 총 수에서, 일반적으로 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%와 같이 10% 내지 100%의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임은 놋아웃된다.
본 발명에서 유전자 녹아웃 방법은 당업계에 공개된 임의의 적용 방법일 수 있으며, 예를 들면, 상동 재조합을 이용해 녹아웃할 수 있고, 예시적 실시 예는 도면을 참조한다.
본 발명의 재조합 효소는 Cre, FLP 등과 같이 당업계에 공개된 임의의 적절한 효소일 수 있으며, 인식 부위는 LoxP, FRT 등일 수 있다. 상동 재조합 및 부위 특이적 재조합을 이용해 본 발명의 구조체, 세포 및 동물을 생산할 수 있다. 예시적 상동 재조합 방법은 미국 특허 6,689,610호, 6,204,061호, 5,631，153호, 5,627,059호, 5,487,992호 및 5,464,764호에 개시되어 있고, 이러한 특허는 인용 방식으로 본 명세서에 포함된다. 부위 특이적 재조합은 부위를 인식하고 이들 부위에 재조합을 촉진하기 위한 특별한 재조합 효소가 필요하다. 티로신 계열의 박테리오파지 P1 Cre/LoxP, 효모 FLP-FRT 시스템 및 Dre 시스템과 같은 많은 박테리오파지 및 효모가 유도하는 부위 특이적 재조합 시스템은 각각 진핵 세포 중 DNA 통합에 사용되고, 본 발명에도 적합한 재조합 효모 및 특이적 상동 재조합 부위를 포함한다.
이러한 시스템 및 사용 방법은 7,422,889호, 7,112,715호, 6,956,146호, 6,774,279호, 5,677,177호, 5,885,836호, 5,654,182호 및 4,959,31호와 같은 미국 특허에 개시되어 있으며, 이는 인용을 통해 본 명세서에 포함된다.
재조합 효소가 매개하는 RMCE는 야생형 및 돌연변이 LoxP(또는 FRT 등) 부위와 음성 선택의 조합을 통해 수행된다.
박테리오파지 λInt 통합 효소, HK2022 통합 효소와 같은 티로신 계열의 기타 시스템, 및 박테리오파지 phiC31, R4Tp901 통합 효소와 같은 또 다른 재조합 효소에 속하는 세린 계열의 시스템도 본 발명에 적용된다. 부위 특이적 재조합 부위의 도입은 종래의 상동 재조합 기술을 통해 구현될 수 있으며, 이러한 기술은 Sambrook 및 Russell(2001)(Molecular　 cloning：a　laboratory　manual 제3판(Cold　Spring　Harbor，N.Y.：Cold　Spring　 Harbor　Laboratory　Press) 및 Nagy, A.(2003).(Manipulating　the　mouse　embryo： a　laboratory　manual，제3판(Cold　Spring　Harbor，N.Y.：Cold　Spring　Harbor　 Laboratory　Press), Frederic　P.Miller，Agnes　F.Vandome와 John　McBrewster의 Genetic　Recombination：Nucleic　acid，Homology(biology)，Homologous　 recombination，Non-homologous　end　joining，DNA　repair，Bacteria，Eukaryote， Meiosis，Adaptive　immune　system，V(D)J　recombination(페이퍼백-2009년 12월 23일)과 같은 참고 논문에 개시되어 있다.
녹아웃 또는 녹인된 유전자는 제한효소 동정, PCR 동정, 이종교배 또는 스크리닝 태그(예 : 저항성, 영양, 독소 선택 등)를 포함하나 이에 국한되지 않는 당업계에 공개된 임의의 방법을 사용할 수 있으며, 예시적 방식은 도 11, 12에 도시된다.
본 발명에 사용되는 표적화 벡터（targeting vector）는 본 발명에 적합한 임의의 공개된 유형일 수 있다.
전형적인 유전자 표적화 벡터는, 일반적으로 수용체 세포 게놈으로 삽입될 표적화에 사용되는 유전자 또는 외인성 유전자, 외인성 유전자 양측에 위치하여 세포 내의 표적화 유전자좌와 상동성을 갖는 DNA 서열 및 스크리닝에 사용되는 마커를 포함하는 3부분으로 구성된다.
통상적으로 네오마이신 인산기 전달효소（neo）를 양성（+）선택 마커로 사용하여, 네오마이신 인산기 전달효소 유전자를 발현하는 수용체 세포가 G418을 포함하는 배지에서 배양을 통해 스크리닝될 수 있으며, 예시적 표적화 벡터는 예를 들면 BAC 벡터이다.
세포에서 상동 재조합에 사용되는 벡터를 생산하는 본 발명의 재조합 공학 방법은 예를 들어 WO9929837 및 WO0104288에 개시되어 있으며, 그 기술은 당업계에 널리 알려진 것이다. 한 측면에서, BAC를 인간 DNA의 공급원을 사용해 인간 DNA의 재조합 공학을 수행한다. MN NucleoBond BAC 100 정제 키트를 사용해 인간 BAC DNA를 분리한다.
각 인간 BAC의 게놈 삽입 서열은 모두 재조합 공학을 사용해 편집됨에 따라, 일단 삽입되면, 마우스 IgH 또는 IgK 유전자좌는 인간 人V(D)J 게놈 영역의 심리스 연속 부분을 형성한다. BAC DNA의 전기천공 형질감염 및 유전형 분석은 표준 방식(Prosser,H.M.,Rzadzinska,A.K.,Steel,K.P.,and Bradley,A.(2008). Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for myosin Vila in actin dynamics ofstereocilia.Molecular and Cellular Biology 28,1702-1712；Ramirez-Solis,R.,Davis,A.C.,and Bradley,A.(1993).Gene targeting in embryonic stemcells.Methods in Enzymology 225,855-878.)을 참조할 수 있다.
본 발명의 조작된 비인간 포유동물 세포는 유전자 변형 동물 생산에 사용되어 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 결합 단편을 생산할 수 있다.
한 측면에서, 내인성 면역글로불린 유전자가 치환되는 숙주 세포는 배아줄기세포이며, 그 배아줄기세포는 이후 유전자 변형 포유동물 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은, 도입된 일부 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 배아줄기세포를 단리하고 상기 배아줄기세포를 사용해 일부가 치환된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 동물을 생산하는 단계를 더 포함한다.
선택적으로는, 유전자 변형 동물은 조류일 수 있고, 원시 생식세포를 사용해 유전자 변형 동물을 생산한다.
따라서, 본 발명의 방법은, 도입된 일부 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 원시 생식세포를 단리하고, 및 상기 생식세포를 사용해 일부가 치환된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 동물을 생산하는 단계를 더 포함한다.
이러한 유전자 변형 조류의 생산에 사용되는 방법은 7,323,618호 및 7,145,057호와 같은 미국 특허에 개시되어 있고, 이는 인용을 통해 본 명세서에 인용된다.
본 발명의 유전자 변형 동물은 다중클론 항체 및 단일클론 항체와 같은 인간 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다.
이들 항체는 조성물(예를 들어 약학적 조성물) 제조, 항원 검출(예를 들어 검출 시약 또는 키트) 또는 진단(예를 들어 진단 시약 또는 키트) 등의 다양한 목적을 포함하는 당업계의 일반적 용도에 사용될 수 있다.
항원 면역 및 항체 제조의 방법 및 조성물, 검출 또는 진단용 제품의 제조 기술은 당업계에 널리 알려진 것이다.
이상, 상술한 바와 같이 본 발명에 따르면,
1) 일부 또는 전부 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임의 녹아웃을 통해, 최대한 많은 기능(functional)을 갖는 인간 항체 가변 영역 유전자 단편이 하나의 벡터에 농축되므로, 마우스 체내 고효율의 VHDHJH 또는 VLJL 재조합을 구현할 수 있는 효과가 있다.
2) 보다 작은 벡터를 통해 보다 많은 기능성 인간 항체 유전자 단편이 실험 동물에 도입됨에 따라, 구축 위험이 감소되고, 구축 시간이 단축되고, 구축 비용이 절감되는 효과가 있다.
3) 본 발명의 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 녹아웃하는 조작이 대장균에서 완료되기 때문에, 조작이 간단하며, 이러한 녹아웃은 효율이 높고, 소요 시간이 상대적으로 짧은 효과; 대장균에서 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자를 단순화함에 따라, 배아줄기세포에서의 유전자 표적화 단계가 최소화되고, 한 단계만으로 완료될 수도 있기 때문에, 매우 적은 비인간 포유동물 세포 유전자 표적화 단계만으로 최대한 많은 기능을 갖는 인간 항체 가변 영역 유전자 도입을 완료할 수 있으므로, 매우 짧은 시간 내에 완전 인간 가변 영역을 발현하는 실험 동물 구축을 완료할 수 있다.
4) 본 발명을 통해 구축이 완료된 실험 동물은 가변 영역이 완전 인간이고, 불변 영역이 마우스 유래인 키메라 항체를 정상적으로 발현할 수 있으며, 항원에 대해서도 야생형 마우스와 유사하거나 또는 더 높은 수준의 특이적 면역 반응을 갖는 효과가 있다.
5) 종래의 항체 스크리닝 플랫폼에 비해, 본 발명의 유전자 변형 마우스는 항체의 효율적인 스크리닝에 사용될 수 있는 보다 큰 항체 라이브러리를 생산할 수 있으며, 생산된 항체의 친화도는 nM 수준이고, pM 수준까지도 달할 수 있어 친화도가 매우 강한 효과가 있다.
6) 본 발명의 유전자 변형 마우스의 비장에서 성숙 B세포 및 비성숙 B세포의 비율은 야생형 마우스와 차이가 없어 효율적이고 정상적인 B세포의 발달이 보장될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인간 면역글로불린 중쇄, Kappa 및 Lambda 경쇄 유전자좌 게놈에서 유래된 DNA 단편이 BAC 또는 YAC 벡터에 분할 삽입되는 사시도 및 기능성(functional) 가변 영역 V 유전자 단편, 유사(pseudogene) 가변 영역 V 유전자 단편 및 오픈 리딩 프레임(open reading frame) V 유전자 단편의 기본 구조 사시도
도 2는 두 개의 재조합 효소 인식 부위가 상동한 염색체에 위치하고 방향이 상동할 때의 재조합 녹아웃 사시도
도 3은 두 개의 재조합 효소 인식 부위가 두 개의 상동 염색체에 위치하고 방향이 상동할 때의 전좌 이벤트 사시도
도 4는 게놈에서 상동한 염색체에 상동한 방향의 호환 재조합 효소 인식 부위 및 반으로 나누어진 항생제 스크리닝 유전자 발현 요소를 단계별로 도입한 후, 재조합을 통해 완전한 항생제 스크리닝 유전자 발현 요소로 조합함에 따라, 재조합 효소 인식 부위 사이의 긴 표적 단편 DNA 서열 녹아웃을 효율적으로 구현하는 방법의 사시도
도 5는 마우스 게놈 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역(마우스 12번 염색체 113428530 내지 116027502 사이의 서열)에 대해 재조합 녹아웃을 수행하는 사시도(PolyA-hygromycin-LoxP, Puro-CAG, PolyA-Neo-LoxP-PGK, PolyA-hygro-LoxP-PGK)
도 6은 마우스 게놈 내인성 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역(마우스 6번 염색체 67536984 내지 70723924 사이의 서열)에 대해 재조합 녹아웃을 수행하는 사시도
도 7은 마우스 게놈 내인성 면역글로불린 lambda 경쇄 가변 영역(마우스 16번 염색체 19065021 내지 19260700사이의 서열)에 대해 재조합 녹아웃을 수행하는 사시도
도 8은 인간 면역글로불린 영역 DNA 단편을 포함하는 BAC 벡터에서 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 녹아웃시키는 단계 사시도
도 9는 상이한 기능성 V 영역 유전자의 5’ 말단 유전자 조절 영역, V 영역 코딩 서열(인트론 및 엑손 포함) 및 3’ 항체 유전자 재조합 신호 서열(RSS, Recombination Signal Sequence)을 새로운 기능성 V 영역 유전자 단편으로 재조합하는 사시도
도 10은 인간 중쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자 단편을 포함하는 두 개의 표적화 벡터 서열 및 구조 사시도
도 11은 중쇄 표적화 벡터1의 박테리아 인공 염색체 제한효소 펄스장 겔 전기영동 이미지를 예로 들어, BAC 벡터에 포함된 인간 면역글로불린 영역 DNA 단편의 무결성을 동정하는 방법의 예시
도 12는 중쇄 표적화 벡터1의 박테리아 인공 염색체는 PCR 템플릿이며, PCR 방법을 이용해 인간 면역글로불린 유전자 단편의 무결성을 동정하는 방법의 예시
도 13은 인간 Kappa 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자 단편을 포함하는 표적화 벡터 서열 및 구조 사시도
도 14는 인간 Lambda 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자 단편을 포함하는 두 개의 표적화 벡터 서열 및 구조 사시도
도 15는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자를 마우스 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 부위(원래의 12번 염색체 113428530 내지 116027502는 결실됨)에 삽입하는 방안의 사시도
도 16은 인간 중쇄 표적화 벡터1 및 2가 마우스 내인성 중쇄 가변 영역 서열이 결실된 마우스 배아줄기세포로 단계적으로 도입되는 사시도
도 17은 도 2의 ACE001-H2 단일 상동성 팔 표적화 벡터가 유전자 단편의 제자리 삽입을 구현하는 예시이며, 표적화 벡터가 상동 재조합을 통해 유전자 단편의 제자리 삽입이 정확하게 구현되는 방안에서 정확한 유전자 삽입 이벤트를 설명하는 PCR 동정 방법 사시도
도 18은 도 2의 ACE001-H2 단일 상동성 팔 표적화 벡터가 유전자 단편의 제자리 삽입을 구현하는 예시이며, 프라이머 P1/P4 및 P3/P2를 사용해 5’ 말단 및 3’ 말단 PCR 동정을 수행하여 정확한 유전자 삽입 이벤트를 설명하는 방법 및 전기영동 결과
도 19는 인간 면역글로불린 Kappa 경쇄 가변 영역 유전자를 마우스 내인성 면역글로불린 Kappa 경쇄 가변 영역 부위(원래의 6번 염색체 67536984 내지 70723924는 결실됨)로 삽입하는 방안의 사시도
도 20은 인간 kappa 경쇄 표적화 벡터가 마우스 내인성 kappa 경쇄 가변 영역 서열이 결실된 마우스 배아줄기세포로 도입되는 사시도
도 21은 인간 면역글로불린 Lambda 경쇄 가변 영역 유전자를 마우스 내인성 면역글로불린 Kappa 경쇄 불변 영역 하류 부위(원래의 6번 염색체 67536984 내지 70723924는 결실됨)로 삽입하는 방안의 사시도
도 22는 인간 Lambda 경쇄 표적화 벡터1 및 2가 마우스 내인성 kappa 경쇄 서열이 결실된 마우스 배아줄기세포로 단계적으로 도입되는 사시도
도 23은 본 발명에 의해 제공되는 유전자 변형 마우스와 야생형 BALB/c 마우스의 B세포 발달 상태 비교
도 24는 유전자 변형 및 BALB/c 마우스의 제3차 부스터 면역 후 OVA 특이적 항체 혈청 수준의 비교
도 25는 본 발명 유전자 변형 마우스에 의해 수득되는 항체의 친화도 수준
도 26은 실시 예 4의 단계 2에서 SEQ ID NO:1임.
정의
유사 유전자(pseudogene) : 가짜 유전자, 위유전자로도 불리며, 유전자 패밀리의 진화 과정에서 형성되는 기능이 없는 잔류물질이다. 유사 유전자는 게놈에서 코딩 유전자 서열과 매우 유사한 비기능성 게놈 DNA 사본으로 간주될 수 있으며, 일반적으로 전사되지 않고, 명확한 생리학적 의미가 없다. 유사 유전자는 상동적인 정상 유전자에 존재하고, 이의 DNA 서열이 매우 유사하다. 유사 유전자의 조상 유전자는 기능적이지만, 돌연변이 발생으로 인해 서열 이상이 초래되어 전사할 수 없거나, 또는 전사물이 번역할 수 없기 때문에, 유사 유전자는 기능이 결실된다. 유사 유전자는 포유동물 게놈에서 보편적으로 존재하므로, 진화의 흔적으로 간주될 수 있다.
오픈 리딩 프레임(open reading frame，ORF) : 오픈 리딩 프레임은 mRNA의 염기 서열이며, ORF 개시 코돈에서 개시되고, 종결 코돈에서 종결되며, 하나의 ORF는 하나의 단백질에 해당된다.
인간 또는 마우스 면역글로불린 유전자좌의 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임의 구체적 정의 및 특징은 하기 IMGT 데이터베이스의 설명 링크 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/SequenceDescription/IMGTfunctionality.html를 참조할 수 있다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역(variable region of heavy chain of Ig，VH) : 면역글로불린 중쇄 분자에서 아미노산 서열 변화가 비교적 많은 영역이다. 아미노산 말단 약 115-120개 잔기의 기능적 영역이다. 여기에 변화가 더 뚜렷한 3 부위의 초가변 영역이 있고, 이의 아미노산 잔기는 각각 29-31, 49-58, 95-102 부위에 위치한다.
면역글로불린 경쇄 가변 영역(variable region of light chain of Ig，VL) : 면역글로불린 경쇄 분자에서 아미노산 서열 변화가 비교적 많은 영역이다. 약 110개의 아미노산 잔기가 있는 기능적 영역이다. 여기에 변화가 더 뚜렷한 3 부분을 초가변 영역이라 하며, 이의 아미노산 잔기는 28-35부위, 49-56부위 및 91-98부위이다.
면역글로불린 유전자 재배열(immunoglobulin gene rearrangement) : B 림프구의 분화를 따라 면역글로불린 유전자가 VH/DH/JH, VL/JL 등의 재배열 현상을 일으킴에 따라, 면역글로불린의 다양성이 초래된다.
코딩 서열 : 전사 영역 내에서 엑손과 같은 성숙 RNA 염기 서열을 코딩하는 DNA 염기 서열이다. 인간 게놈 서열에서 2% 미만이 코딩 서열이다.
비코딩 서열 : ① 유전자 서열에서 코딩 서열을 제외한 프로모터, 인트론, 인핸서와 같은 모든 서열이다. ② 게놈 서열에서 유전자 서열을 제외한 모든 서열이다. 인간 게놈 서열에서 98% 이상이 모두 비코딩 서열이다.
표적화 벡터(targeting vector) : 전형적인 유전자 표적화 벡터는, 일반적으로 수용체 세포 게놈으로 삽입될 표적화에 사용되는 유전자 또는 외인성 유전자, 외인성 유전자 일측 또는 양측에 위치하여 세포 내의 표적화 유전자좌와 상동성을 갖는 DNA 서열 및 스크리닝에 사용되는 마커를 포함하는 3부분으로 구성된다. 통상적으로 네오마이신 인산기 전달효소（neo）를 양성（+）선택 마커로 사용하여, 네오마이신 인산기 전달효소 유전자를 발현하는 수용체 세포가 G418을 포함하는 배지에서 배양을 통해 스크리닝될 수 있다.
항체 또는 항체 단편을 포함하는 유도체 : 항체 또는 항체 단편을 포함하고 항체-소분자 독성 약물 접합체, 항체-방사면역 약물 접합체, 항체-치료용 폴리펩타이드 약물 접합체, 이중/다중특이성 항체 등과 같이 기타 분자와 결합하여 형성되는 약물이다.
본 발명에 대해 추가적으로 설명하기 전, 본 발명은, 당업자가 종래의 기술을 사용해 실시 양태의 요소에 대해 일상적인 변형을 수행할 수 있기 때문에, 상기 구체적 실시 양태에 제한되지 않음을 응당히 이해해야 한다.
별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 용어 및 과학적 용어가 갖는 의미는 당업자가 통상적으로 이해하는 용어와 상동하다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 인용 방식으로 본 명세서에 포함되어 상기 간행물과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시 및 설명한다.
별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 용어 및 과학적 용어가 갖는 의미는 당업자가 통상적으로 이해하는 용어와 상동하다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 인용 방식으로 본 명세서에 포함되어 상기 간행물과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시 및 설명한다.
하기의 실시 예에서, 모든 마우스 게놈 염색체 부위 좌표는 모두 ENSEMBL GRCm38.p6 버전 C57BL/6J 마우스 게놈 데이터베이스 부위를 참조하고, 모든 인간 게놈 염색체 부위 좌표는 모두 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조한다.
본 발명에서 DNA 단편을 단계적으로 녹아웃하는 방법은 도2에 도시된 바와 같으며, 하기의 단계를 통해 세포의 표적 단편을 녹아웃할 수 있다.
1) 세포 표적 단편 5’ 말단에서 상동 재조합을 통해 재조합 효소 인식 부위(예를 들어 LoxP 또는 FRT)를 포함한 DNA 단편을 삽입하는 단계; 2) 1)단계에서 완료된 동일 세포 클론 표적 단편 3’ 말단에 상동 재조합을 통해 1) 단계의 재조합 효식 인식 부위와 호환되고, 방향이 상동한 재조합 효소 인식 부위(예를 들어 LoxP 또는 FRT)의 DNA 단편을 삽입하는 단계; 3) 2) 단계에서 완료된 동일 세포 클론에 1) 또는 2) 단계에서 삽입된 재조합 효소 인식 부위를 인식하는 재조합 효소(예를 들어 Cre 또는 FLP)를 도입하는 단계, 두 개의 재조합 효소 인식 부위가 상동한 DNA에 있고, 방향이 상동하면, 재조합 효소가 두 개의 재조합 효소 사이의 서열을 효과적으로 절단하여 표적 단편의 녹아웃을 구현할 수 있다(도 2 참조).
이배체 세포에서, 표적 단편이 두 개의 상이한 염색체에 존재하기 때문에, 전술한 1) 단계의 상동 재조합이 매개하는 재조합 효소 인식 부위 삽입 및 2) 단계의 상동 재조합이 매개하는 재조합 효소 인식 부위 삽입이 절반의 확률로 두 개의 상이한 염색체에서 발생하며, 이러한 경우 방향이 상이한 재조합 효소 인식 부위는 3) 단계에서 도입되는 재조합 효소에 의해 여전히 인식될 수 있고, 도 3에 도시된 바와 같이, 상동 염색체 간의 전좌 이벤트(translocation)가 발생하며, 이러한 경우 여전히 표적 단편의 녹아웃이 구현될 수 있다.
표적 단편이 길수록 단계 1)에서 단계 3)까지의 방법을 통해 표적 단편 녹아웃이 수행되는 효율 역시 떨어지며, 이러한 경우, 바람직하게는, 동일한 저항성 스크리닝 유전자(프로모터, 코딩 영역 및 폴리 A 전사 종결 영역 포함)를 각각 저항성 스크리닝 기능이 없는 두 개의 A, B 부위로 분할하고, 각각 1) 단계 및 2) 단계에 의해 표적 유전자 양단이 삽입된 재조합 효소 인식 부위로 진입한 5' 말단 및 3' 말단으로 진입하며, 재조합 이벤트가 발생하면, 두 개의 재조합 효소 사이의 표적 단편을 효과적으로 절단하여, A, B 두 부위를 하나의 스크리닝 기능을 갖는 저항성 스크리닝 유전자로 재조합함에 따라, 표적 유전자 단편이 효과적으로 녹아웃된 세포 클론을 효율적으로 스크리닝한다(도 4 참조).
유전자 녹아웃 또는 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 녹인에 사용되는 마우스 배아줄기세포는 C57BL/6J*129 스트레인 마우스 배아줄기세포와 같은 129, C57BL/6J, C57BL/6N 등의 스트레인 또는 이종교배 F1 세대에서 유래될 수 있으며, 이 줄기세포는 초기 마우스의 배아 내세포집단에서 분리되거나(참고 논문 : Evans M. J., Kaufman M. H. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, 154-156. 10.1038/292154a0), 또는 사이젠 바이오사이언스(제품번호 MUAES-01001 또는 MUBES-01001) 또는 미국 적용 줄기세포 회사(Applied Stemcell, 제품번호 ASE-9005, ASE-9006, ASE-9007, ASE-9008 또는 ASE-9005)와 같은 상업화 제공업체에서 구매할 수 있다.
실시 예 1 : 마우스 내인성 중쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자좌의 녹아웃
마우스 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자좌가 녹아웃되는 전반적인 전략은 도 5를 참조한다. 구체적인 단계는 하기와 같다.
단계 1. Ace001-H1, Ace001-H2 두 개의 표적화 벡터를 구축하는 단계, 표적화 벡터의 구축은 당업자에게 익숙한 것이다.
Ace001-H1 벡터는 도 5에 도시된 바와 같으며, 1) 상동성 팔로 마우스 12번 염색체 113428529와 113425469 사이의 서열(HC arm)을 포함하고, 113426998 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 EcoRI가 삽입되는 특징; 2) 네오마이신 스크리닝 유전자 발현 요소 PGK-neo-polyA를 포함하고, 여기서 네오마이신 Neo 코딩 유전자 번역 개시 코돈 ATG 앞에 재조합 효소 인식 부위 LoxP가 삽입되는 특징;을 갖는다.
Ace001-H2 벡터는 도 5에 도시된 바와 같으며, 1) 상동성 팔로 마우스 12번 염색체 116032177과 116027503 사이의 서열(HV arm)을 포함하고, 116029758 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 PmeI가 삽입되는 특징; 2) 완전 발현 기능을 갖는 퓨로마이신 저항성 유전자 발현 요소 CAG-puro-polyA를 포함하는 특징; 3) 프로모터가 없는 하이그로마이신 B 저항성 유전자 코딩 영역 및 polyA를 포함하고, 그 요소 양단에서 각각 재조합 효소 인식 부위 FRT 및 LoxP를 운반하는 특징;을 가지며, Ace001-H1 및 Ace001-H2 벡터에서, FRT 및 LoxP의 방향은 화살표로 표시된다.
단계 2. 순차적으로 Ace001-H1, Ace001-H2 벡터를 마우스 배아줄기세포에 도입하고, 각각 225mg/ml 네오마이신(Neomycin, 공급업체 : 잉웨이졔지(상하이) 무역 유한회사, 제품번호 : 10131027) 또는 1.25mg/ml 퓨로마이신(Puromycin, 공급업체 : 잉웨이졔지(상하이) 무역 유한회사, 제품번호 : A1113803)으로 스크리닝하여 생존한 배아줄기세포 클론을 수득하고, 이들 클론에 일반적인 PCR 방식을 사용해 두 개의 벡터가 모두 마우스 배아줄기세포 게놈 부위에 정확하게 녹인된 배아줄기세포 클론을 검출해 수득하는 단계; 그후 이들 배아줄기세포 클론에 Cre 재조합 효소를 발현하는 벡터를 도입하고, 50mg/ml 하이그로마이신 B(Hygromycin B, 공급업체 : 잉웨이졔지(상하이) 무역 유한회사, 제품번호 : 10687010)로 스크리닝하여 생존한 배아줄기세포 클론을 수득하고, 이들 클론에 일반적인 PCR 방식을 사용해 Cre 재조합 효소 매개를 성공적으로 생성하는 큰 단편이 녹아웃된 배아줄기세포 클론을 검출해 수득하고, 이들 마우스 배아줄기세포 클론 중 하나의 염색체는 12번 염색체 113428530 내지 116027502 이 두 부위 사이의 마우스 내인성 서열이 결실되는 단계; 이 단계에서, Ace001-H1 및 Ace001-H2는 순차적으로 임의의 순서에 따라 마우스 배아줄기세포에 도입된다. 그 단계에서, 상동 재조합 표적화 벡터 녹인 마우스 배아줄기세포에 상동성 팔 영역 외부 정방향 및 역방향 프라이머 PCR을 사용하는 동정 방법(도 17 참조), 프라이머의 설계 및 PCR 실험의 구체적 조작 단계는 당업자에게 익숙한 것이다.
실시 예 2 : 마우스 내인성 kappa 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자좌의 녹아웃
마우스 내인성 kappa 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자좌가 녹아웃되는 전반적 전략은 도 6을 참조할 수 있다. 구체적 단계는 하기와 같다.
단계 1. Ace002-K1, Ace002-K2 두 개의 표적화 벡터를 구축하는 단계.
Ace002-K1 벡터는 도 6에 도시된 바와 같으며, 1) 좌측 상동성 팔로 6번 염색체 70718872와 70723924 사이의 서열(KCL arm), 우측 상동성 팔로 6번 염색체 70723925와 70726001 사이의 서열(KCR arm)을 포함하고, 여기서 KCR 하류는 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 NotI를 운반하는 특징; 2) 좌측 상동성 팔 및 우측 상동상 팔 사이에 네오마이신 스크리닝 유전자 발현 요소 PGK-neo-polyA를 포함하며, 여기서 네오마이신 Neo 코딩 유전자 번역 개시 코돈 ATG 앞에 재조합 효소 인식 부위 LoxP가 삽입되는 특징;을 갖는다.
Ace002-K2 벡터는 도 6에 도시된 바와 같으며, 1) 상동성 팔로 마우스 6번 염색체 67532019와 67536983 사이의 서열을 포함하고, 67534443 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 PmeI이 삽입되는 특징; 2) 완전 발현 기능을 갖는 퓨로마이신 저항성 유전자 발현 요소 CAG-puro-polyA를 포함하는 특징; 3) 프로모터가 없는 하이그로마이신 B 저항성 유전자 코딩 영역 및 polyA를 포함하고, 그 요소 양단에서 각각 재조합 효소 인식 부위 FRT 및 LoxP를 운반하는 특징;을 가지며, Ace002-K1 및 Ace002-K2 벡터에서, FRT 및 LoxP의 방향은 화살표로 표시된다.
단계 2. 순차적으로 Ace002-K1, Ace002-K2 벡터를 마우스 배아줄기세포에 도입하고, 각각 225mg/ml 네오마이신(neomycin) 또는 1.25mg/ml 퓨로마이신(Puromycin)으로 스크리닝하여 생존한 배아줄기세포 클론을 수득하고, 이들 클론에 일반적인 PCR 방식을 사용해 두 개의 벡터가 모두 마우스 배아줄기세포 게놈 부위에 정확하게 녹인된 배아줄기세포 클론을 수득하는 단계; 그후 이들 배아줄기세포 클론에 Cre 재조합 효소를 발현하는 벡터를 도입하고, 50mg/ml 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로 스크리닝하여 생존한 배아줄기세포 클론을 수득하고, 이들 클론에 일반적인 PCR 방식을 사용해 Cre 재조합 효소 매개를 성공적으로 생성하는 큰 단편이 녹아웃된 배아줄기세포 클론을 검출해 수득하고, 이들 마우스, 배아줄기세포 클론 중 하나의 염색체는 6번 염색체 67536984 내지 70723924 이 두 부위 사이의 마우스 내인성 서열이 결실되는 단계; 이 단계에서, Ace002-K1 및 Ace002-K2는 순차적으로 임의의 순서에 따라 마우스 배아줄기세포에 도입된다. 그 단계에서, 상동 재조합 표적화 벡터 녹인 마우스 배아줄기세포에 상동성 팔 영역 외부 정방향 및 역방향 프라이머 PCR을 사용하는 동정 방법(도 17 참조), 프라이머의 설계 및 PCR 실험의 구체적 조작 단계는 당업자에게 익숙한 것이다.
실시 예 3 : 마우스 내인성 lambda 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자좌의 녹아웃
마우스 내인성 lambda 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자좌가 녹아웃되는 전반적인 전략은 도 7을 참조한다. 구체적인 단계는 하기와 같다.
단계 1. Ace003-L1, Ace003-L2 두 개의 표적화 벡터를 구축하는 단계, 표적화 벡터의 구축은 당업자에게 익숙한 것이다.
Ace003-L1 벡터는 도 7에 도시된 바와 같으며, 1) 상동성 팔로 마우스 16번 염색체 19065020과 19059018 사이의 서열(LC arm)을 포함하고, 19061523 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 FseI이 삽입되는 특징; 2) 네오마이신 스크리닝 유전자 발현 요소 PGK-neo-polyA를 포함하고, 여기서 네오마이신 Neo 코딩 유전자 번역 개시 코든 ATG 앞에 재조합 효소 인식 부위 LoxP가 삽입되는 특징;을 갖는다.
Ace003-L2 벡터는 도 7에 도시된 바와 같으며, 1) 상동성 팔로 마우스 16번 염색체 19265943과 19260701 사이의 서열(LV arm)을 포함하고, 19263393 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 NotI가 삽입되는 특징; 2) 완전 발현 기능을 갖는 퓨로마이신 저항성 유전자 발현 요소 CAG-puro-polyA를 포함하는 특징; 3) 프로모터가 없는 하이그로마이신 B 저항성 유전자 코딩 영역 및 polyA를 포함하고, 그 요소 양단에서 각각 재조합 효소 인식 부위 FRT 및 LoxP를 운반하는 특징;을 가지며, Ace003-L1 및 Ace003-L2 벡터에서, FRT 및 LoxP의 방향은 화살표로 표시된다.
단계 2. 순차적으로 Ace003-L1, Ace003-L2 벡터를 마우스 배아줄기세포에 도입하고, 각각 225mg/ml 네오마이신(neomycin) 또는 1.25mg/ml 퓨로마이신(Puromycin)으로 스크리닝하여 생존한 배아줄기세포 클론을 수득하고, 이들 클론에 일반적인 PCR 방식을 사용해 두 개의 벡터가 모두 마우스 배아줄기세포 게놈 부위에 정확하게 녹인된 배아줄기세포 클론을 수득하는 단계; 그후 이들 배아줄기세포 클론에 Cre 재조합 효소를 발현하는 벡터를 도입하고, 50mg/ml 하이그로마이신 B(Hygromycin B)로 스크리닝하여 생존한 배아줄기세포 클론을 수득하고, 이들 클론에 일반적인 PCR 방식을 사용해 Cre 재조합 효소 매개를 성공적으로 생성하는 큰 단편이 녹아웃된 배아줄기세포 클론을 검출해 수득하고, 이들 마우스 배아줄기세포 클론 중 하나의 염색체는 16번 염색체 19065021 내지 19260700 이 두 부위 사이의 마우스 내인성 서열이 결실되는 단계; 이 단계에서, Ace003-L1 및 Ace003-L2는 순차적으로 임의의 순서에 따라 마우스 배아줄기세포에 도입된다. 그 단계에서, 상동 재조합 표적화 벡터 녹인 마우스 배아줄기세포의 일반적인 PCR 방식은 상동성 팔 영역 외부 정방향 및 역방향 프라이머 PCR의 동정 방법(도 17 참조)을 사용하며, 프라이머의 설계 및 PCR 실험의 구체적 조작 단계는 당업자에게 익숙한 것이다.
실시 예 4 : 인간 면역글로불린 가변 영역 중 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임의 녹아웃 및 동정
인간 중쇄 가변 영역 DNA 단편은 14번 염색체 105863198과 106879844 부위 사이에서 유래되고, 인간 Kappa 경쇄 가변 영역 DNA 단편은 2번 염색체 88860568과 90235398 부위 사이에서 유래되고, 인간 Lambda 경쇄 가변 영역 DNA 단편은 22번 염색체 22023114와 22922913 부위 사이에서 유래된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 인간 게놈에서 유래된 이들 DNA 단편은 박테리아 인공 염색체(BAC)와 같은 비인간 DNA 단편을 포함하는 벡터에 분할 삽입되며, 적합한 BAC는 ENSEMBL을 통해 검색할 수 있다. 본 발명에 사용되는 BAC 벡터는 공급업체 Source BioScience 또는 잉웨이졔지(상하이) 무역 유한회사에서 구매한다.
원래 상태의 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 단편을 포함하는 BAC로부터 필요하지 않는 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임 DNA 세그먼트를 제거하는 과정은 대장균에서 완료되며, 예시적 녹아웃 과정은 도 8에 도시된 바와 같고, 구체적 단계는 하기와 같다.
단계 1. 1.1) 인간 면역글로불린 가변 영역 DNA 세그먼트를 포함하는 박테리아 인공 염색체 BAC1(클로람페니콜 저항성 운반)을 제조하는 단계, 그 BAC1은 유전공학적 숙주 대장균 DH10B(공급업체 : Source BioScience)로 사전 전환되며; 1.2) pKD46(공급업체 : 오노 유전자, 제품번호 : HG-VJC0521, 참고 논문 Datsenko, KA, BL Wanner 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(12):6640-5.)와 같은 재조합 효소 발현 벡터를 제조하는 단계, 그 벡터는 아라비노오스 유도 재조합 효소(예를 들어 대장균 λ 박테리오파지 Redα/Redβ/Redγ 단백질 유래) 발현 요소, 온도 민감성 플라스미드 벡터 레플리콘 요소 및 암피실린 저항성 유전자를 포함하며; 1.3) pKD46을 일반적인 전기천공 형질감염 방법으로 BAC1을 포함하는 DH10B 숙주 대장균에 도입하고, 대장균을 클로람페니콜 및 암피실린을 포함하는 LB 고체 배지(공급업체 : 칭다오 호프 바이오 테크놀러지, 제품번호 : HB0129) 평판에 접종하여 섭씨 30도에서 밤새 배양하는 단계; 2) 다음날 대장균 단일클론을 선별하여 클로람페니콜(공급업체 : 성공 바이오테크, 제품번호 : A100230) 및 암피실린(공급업체 : 성공 바이오테크, 제품번호 : A100339)을 포함하는 액체 LB 배지(공급업체 : 칭다오 호프 바이오 테크놀러지, 제품번호 : HB0128)에서 섭씨 30도 배양 조건으로 16시간 동안 진탕하고, 수득된 균주를 대장균 A로 명명하는 단계;
단계 2. 2.1) PCR 템플릿 rpsL/tetA 서열은 SEQ ID NO:1을 참조하여 도 8A에 도시된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(공급업체 : 성공 바이오테크)를 설계 및 합성하는 단계, 정방향 프라이머는 50bp의 녹아웃 대기 영역 5’ 말단 상동성 팔 영역 HA1 및 rpsL/tetA의 5’ 말단 프라이머 영역을 포함하고, 역방향 프라이머는 50bp의 녹아웃 대기 영역 3’ 말단 상동성 팔 영역 HA2 및 rpsL/tetA의 3’ 말단 프라이머 영역을 포함하고, 프라이머의 설계 원칙은 당업자에게 익숙한 것이다; 2.2) 전술한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 중합효소 연쇄반응 기술(PCR)을 사용해 양단이 각각 50bp 상동성 팔 및 rpsL/tetA 발현 요소를 갖는 DNA 단편을 수득하는 단계(도 8A 참조); 2.3) 최종 농도 OD600=0.1의 농도에 따라 3ml의 클로람페니콜 및 암피실린을 포함한 액체 LB 배지에서 단계 1.3)에 의해 수득된 대장균 A 균액을 다시 접종하고, 농도가 10%인 45μL의 L(+)아라비노오스(공급업체 : 성공 바이오테크, 제품번호 : A610071)를 섭씨 37도의 진탕기에 첨가하여 3-5시간 배양시키고 균액 OD600=0.6이 될 때까지 재조합 효소의 발현을 유도하는 단계; 2.4) 전기천공 형질감염 방식을 사용해 단계 2.2)에 의해 수득된 rpsL/tetA 단편을 2.3) 단계의 대장균 A에 도입하고, 재조합 효소 매개 상동 재조합이 rpsL/tetA으로 녹아웃 대기 DNA 단편을 제자리 치환시키고(도 8B 참조), 클로람페니콜 및 테트라사이클린(공급업체 : 성공 바이오테크, 제품번호 : A100422)을 포함한 LB 고체 배지 평판에서 섭씨 37도로 밤새 배양하는 단계; 2.5) 단계 2.4)에 의해 수득된 집락 클론을 선별하여 클로람페니콜 및 테트라사이클린이 포함된 LB 액체 배지에서 섭씨 37도로 배양하고, 도 8C에 도시된 스크리닝 프라이머 1 및2로 PCR 동정 및 PCR 산물 시퀀싱 방법을 사용해 녹아웃 대기 영역을 정확하게 녹아웃시킨 BAC1을 포함하는 대장균 클론을 동정하고, 대장균 B로 명명하는 단계;
단계 3. 3.1) 단계 1.3)의 상기 방법에 따라 pKD46 벡터를 단계 2.5)에 의해 수득된 녹아웃 대기 단편을 정확하게 녹아웃시킨 BAC1을 포함하는 대장균 B 클론을 도입하고, 대장균 C로 명명하는 단계; 3.2) 순서에 따라 결합되는 50bp 상동성 팔 HA1 및 50bp 상동성 팔 HA2의 이중 가닥 DNA 단편 HA1-HA2를 설계 및 합성하는 단계; 3.3) 단계 3.2)의 상기 DNA 단편을 전기천공 형질감염 방식을 사용해 단계 3.1)에 의해 수득된 대장균 C에 도입하는 단계, 도입 단계는 단계 2.3)-2.4)의 상기 방법을 참조하고, 재조합 효소 매개 상동 재조합은 HA1-HA2 단편으로 BAC1 중 녹아웃 대기 영역을 녹아웃할 때 삽입되는 rpsL/tetA 단편을 제자리 치환하고(도 8D 참조), 클로람페니콜 및 스트렙토마이신(공급업체 : 성공 바이오테크, 제품번호 : A100382)을 포함한 LB 고체 배지 평판에서 섭씨 37도로 밤새 배양하는 단계; 3.4) 단계 3.3)에 의해 수득된 집락 클론을 선별하여 클로람페니콜 및 스트렙토마이신을 포함한 LB 액체 배지에서 섭씨 37도로 배양하고, 도 8E에 도시된 스크리닝 프라이머1 및 2로 PCR 동정 및 PCR 산물 시퀀싱 방법을 사용해 rpsL/tetA 영역을 정확하게 녹아웃한 BAC1을 포함하는 대장균 클론을 동정하는 단계;
단계 4. BAC1에서 복수의 녹아웃 대기 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하고 있는 경우, 단계 1 내지 단계 3을 반복하면 표적 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 영역이 BAC1에서 모두 녹아웃될 때까지 각 녹아웃 대기 영역을 각각 녹아웃할 수 있다. 분절된 인간 면역글로불린 가변 영역 DNA가 상이한 BAC 벡터에 각각 삽입되면, 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임 영역의 녹아웃은 상이한 BAC 벡터에서 각각 개별적으로 녹아웃 단계가 수행되고, 최종적으로 보존된 DNA 단편은 공개 논문 “Assisted large fragment insertion by Red/ET-recombination (ALFIRE)―an alternative and enhanced method for large fragment recombineering”의 단계에 따라 결합된다.
본 발명의 구체적 실시 양태에서, 일반적으로, "일부 또는 전부 녹아웃" 또는 "일부 또는 전부 결실"은 10% 내지 100%(바람직하게는 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 또는 88%와 같이 15-95%, 20-90%이다)의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자의 녹아웃 또는 결실이며, 그 백분율은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 유사 유전자 및 오픈 리딩 프레임 유전자의 총 수가 기준이다.
예를 들어, 본 발명의 구체적 실시 양태에서, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 유사 유전자 및/오픈 리딩 프레임은 녹아웃된다.
예를 들어, 일 실시 양태에서, 10 내지 25개의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자를 녹아웃 또는 결실시킨다. 또 다른 실시 양태에서, 10, 15 또는 25개의 유사 V 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자를 녹아웃 또는 결실시킨다.
인간 면역글로불린 유전자 클러스터 영역의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임을 녹아웃시키는 과정에서, 보존되는 기능성 유전자 단편의 조절 영역, 유전자 코딩 영역 및 항체 유전자 재조합 신호 서열은 상동한 면역글로불린 가변 영역 유전자의 연속 단편에서 유래될 수 있고, 조절 영역이 인간 VA 유전자의 5' 말단 조절 영역에서 유래되고, 코딩 서열이 VB 유전자에서 유래되고, 항체 유전자 재조합 신호 서열이 VC 유전자에서 유래되는 것과 같이 상이한 면역글로불린 유전자의 조절 영역, 유전자 코딩 영역 및 항체 유전자 재조합 신호에서 유래된 재조합일 수도 있다(도 9 참조).
그중의 일 실시 양태에서, 도 10의 중쇄 표적화 벡터1의 구축은, 전술한 단계에 따라 표 1 내지 표 5의 면역글로불린 중쇄 V 영역 중 VH 영역 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 VH 영역 유전자를 포함하는 H2, H4, H9, H11, H13, H15, H19, H21, H23, H17의 10개 DNA 단편을 녹아웃하고, 기능성 인간 중쇄 VH 영역 유전자 IGHV6-1, IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV4-4, IGHV7-4-1, IGHV2-5, IGHV3-7, IGHV1-8, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV1-18, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23을 포함하는 H1, H3, H5, H6, H7, H8, H10, H12, H14, H16, H18, H20, H22, H24, 및 인간 14번 염색체 105863198과 105939714 사이에서 유래되어 인간 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 영역 및 JH 유전자 영역을 포함하는 서열이 보존되며, 및 113426008 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 NotI가 삽입되는 12번 염색체 113428513과 113423504 사이에서 유래된 서열은 도 10에 도시된 순서에 따라 결합된다; 그 중쇄 표적화 벡터1은 네오마이신 저항성 발현 요소 PGK-neo-polyA, 재조합 효소 인식 부위 FRT 및 pBACe3.6 박테리아 인공 염색체 플라스미드 골격을 운반한다. 그 벡터 구축이 종료되면 두 가지 상이한 방식을 사용해 이의 DNA 단편에 DNA 단편이 결실되었는지 여부를 동정한다. 첫 번째 동정 방식은 도 11에 도시된 바와 같이, SalI 또는 AgeI로 효소를 절단한 후 펄스장 겔 전기영동을 통해 이의 제한효소 지도가 예상에 부합되는지를 판단하며, 두 그룹의 상이한 집락 클론 a 및 b에서 유래된 두 그릅의 상이한 효소의 중쇄 표적화 벡터1에 대해 효소를 절단하면 각 단편의 크기는 모두 예상과 일치하므로, 이 두 개의 클론 유래 중쇄 표적화 벡터1은 큰 단편 DNA의 결실 위험이 비교적 낮다는 것이 설명된다; 도 12에 도시된 바와 같이 두 번째 동정 방식은, 중쇄 표적화 벡터1에서 24쌍의 프라이머 Cargo1-Cargo24를 무작위 설계하고(표 6 참조), 벡터에서 각 쌍의 프라이머 거리는 약 10KB이며, 두 개의 상이한 집락 클론 a 및 b 유래 중쇄 표적화 벡터1로 이 프라이머 24쌍의 PCR 증폭을 수행하고, 산물의 크기 및 산물의 존재 유무를 통해 이 두 클론 유래의 중쇄 표적화 벡터1은 큰 단편 DNA 의 결실 위험이 비교적 낮은지를 설명할 수 있다.
인간 면역글로불린 유전자 단편 특이적 프라이머 쌍Cargo1-24
프라이머 명칭 정방향 프라이머 역방향 프라이머 SEQ ID NO 산물 크기
Cargo1 gcaggagagaggttgtgagg gtgacccattcgagtgtcct 2，3 505bp
Cargo2 actggtccctggtgccttat ccttgagcaagacccagtgt 4，5 497bp
Cargo3 gaactggggcatctctcgga tgactggactcgcagggttt 6，7 263bp
Cargo4 gtcccttttgctggctttggtc ggtggccccataacacaccta 8，9 333bp
Cargo5 tccagaagtggaagcgttta aaaccccctggaaatcatagta 10，11 197bp
Cargo6 ctctctctggttcccagcac ggcaggctgactttcactct 12，13 499bp
Cargo7 ctgagggccgatggtactaa acactctggggccatgtaag 14，15 505bp
Cargo8 ctaggccctggtaaccaaca agttctgaatggggctgaga 16，17 503bp
Cargo9 aggcatctcggcaaaaatta ggcatggaggaaatgacaaa 18，19 519bp
Cargo10 gggcatggacatagcagatt gcgcaatgaactggtacaaa 20，21 503bp
Cargo11 gcccactccacaattcctaa ctgtgactttccccacaggt 22，23 358bp
Cargo12 ggtgttgcatctgtggtgag ggcttctctggaaatgcaag 24，25 400bp
Cargo13 agcgaaaggagtcattcaaa ggttggtttccaggttgtgt 26，27 392bp
Cargo14 ttttgctccttcctgtgtcc atccagcaccacagtcacaa 28，29 501bp
Cargo15 aacaaaagcaggcgttcact cacccatccactgcctattt 30，31 491bp
Cargo16 ctcagtaagggagcgcatct gggctgagaaaagggaagtc 32，33 500bp
Cargo17 atggggcacaaaggtatgtt ccagtgtggtctcgatttcc 34，35 514bp
Cargo18 agggtcccagataggttgct cctgaaagatcgggctgtaa 36，37 520bp
Cargo19 gctccctaccatccattcaa gttcaaacaaaaggcccaga 38，39 303bp
Cargo20 ttactttgcaggggaaccac tgagtgttcctgaccctcct 40，41 300bp
Cargo21 gcaaatgctgtttatggatca gcaaatggcagcatctttct 42，43 347bp
Cargo22 ctctcacccagggaaaacag gataaccagacatgttgggtca 44，45 495bp
Cargo23 ccttgctaggttggggaagt ccagcaacagaacaaagctg 46，47 501bp
Cargo24 ggtgagaggcctttggagat catcacaccatgttcccatt 48，49 498bp
표 6에서 SEQ ID NO:는 한 열이고, 짝수는 정방향 프라이머에 해당되고, 홀수는 역방향 프라이머에 해당된다.
또 다른 실시 예에서, 도 10과 같이 하기의 특징을 갖는 중쇄 표적화 벡터2를 구축한다.
14번 인간 염색체 106879844와 106268567 사이의 서열에서, 전술한 단계에 따라 대장균에서 표 1 내지 표 5의 유사 VH 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 VH 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 H26, H28, H35, H39, H41, H43, H46, H49, H51, H53, H57, H59, H61, H64, H68의 15개 DNA 단편을 녹아웃하고, 표 1 내지 표 5의 기능성 VH 영역 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 H25, H27, H29, H31, H33, H36, H38, H40, H42, H44, H45, H47, H48, H50, H52, H54, H55, H56, H58, H60, H62, H63, H65, H66, H67의 25개 단편 및 표 1 내지 표 5의 상기 서열 번호 H30, H32, H34, H37의 복수의 유사 VH 영역 유전자 단편 및 H35 유전자 단편, 및 상동성 팔로 사용되는 14번 인간 염색체 106276506과 106268567 사이의 서열을 보존하고, 여기서 상동성 팔의 106273423 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 PmeI이 삽입되고, 이들 DNA 단편은 도 10에 도시된 바와 같이 순서에 따라 결합되는 특징; 그 중쇄 표적화 벡터2는 퓨로마이신 저항성 발현 요소 CAGpuro-polyA, 재조합 효식 인식 부위 FRT 및 pBACe3.6 박테리아 인공 염색체 플라스미드 골격을 운반하는 특징. 중쇄 표적화 벡터2의 용도는, 중쇄 표적화 벡터1이 마우스 12번 염색체 113428513과 113423504 부위로 유도 도입되면, 중쇄 표적화 벡터1에 의해 운반되어 진입한 14번 인간 염색체 106276506과 106268567 사이의 서열은 상동성 팔로 중쇄 표적화 벡터2의 보다 많은 V 영역 유전자 단편을 마우스 배아줄기세포 12번 염색체로 도입하는 데 있다.
또 다른 실시 예에서, 도 13과 같이 하기의 특징을 갖는 Kappa 경쇄 표적화 벡터를 구축한다.
2번 염색체 89333431과 88860568 사이의 서열에서, 전술한 단계에 따라 대장균에서 표 1 내지 표 5의 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 상기 서열 번호 K3, K6, K9, K12, K16, K19, K21, K24, K26, K28의 10개 영역을 녹아웃하고, 표 1 내지 표 5의 기능성 인간 Kappa 경쇄 VL 영역 유전자 및 2번 인간 염색체 88861967과 88860568 사이의 인간 면역글로불린 Kappa 경쇄 JL 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 K1, K2, K4, K5, K7, K8, K10, K11, K13, K14, K15, K17, K18, K20, K22, K23, K25, K27, K29, K30의 20개 영역, 상동성 팔로 사용되는 마우스 6번 염색체 70723924와 70729434 사이의 서열을 보존하며, 여기서 그 상동성 팔은 70726623 부위에 독립적인 선형화 제한효소 절단 부위 NotI이 삽입되고, 그 Kappa 경쇄 표적화 벡터는 네오마이신 저항성 발현 요소 PGK-neo-polyA, 재조합 인식 부위 FRT 및 pBACe3.6 박테리아 인공 염색체 플라스미드 골격을 운반한다.
또 다른 실시 예에서, 도 14와 같이 Lambda 경쇄 표적화 벡터1 및 2를 구축하며, Lambda 벡터1은 인간 22번 염색체에서 유래된 22881432와 22922913 사이의 인간 면역글로불린 Lambda 경쇄 J-C 유전자 영역을 포함한 서열을 포함하며, 전술한 단계에 따라 대장균에서 표 1 내지 표 5의 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 상기 서열 번호 L2, L4, L10, L12, L14, L17, L19, L21, L23, L25, L28, L30의 12개 영역을 녹아웃하고, 표 1 내지 표 5의 기능성 인간 Lambda 경쇄 VL 영역 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 L1, L3, L5, L6, L7, L8, L9, L11, L13, L15, L16, L18, L20, L22, L24, L26, L27, L29, L31의 19개 영역, 및 상동성 팔로 사용되는 마우스 6번 염색체 70726758과 70731223 사이의 서열을 보존하며, 여기서 상동성 팔은 70729051 부위에 독특한 선형화 제한효소 절단 부위 FseI이 삽입되고, 그 Lambda 경쇄 표적화 벡터1은 네오마이신 저항성 발현 요소 PGK-neo-polyA, 재조합 효시 인식 부위 FRT 및 pBACe3.6 박테리아 인공 염색체 플라스미드 골격을 운반한다; Lambda 경쇄 표적화 벡터2는 전술단 단계에 따라 대장균에서 표 1 내지 표 5의 유사 유전자 또는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 상기 서열 번호 L36, L38, L41, L43, L45, L48, L50의 7개 영역을 녹아웃하고, 표 1 내지 표 5의 기능성 인간 Lambda 경쇄 VL 영역 유전자를 포함하는 상기 서열 번호 L32, L33, L34, L35, L37, L39, L40, L42, L44, L46, L47, L49의 12개 영역, 및 상동성 팔로 사용되는 인간 22번 염색체 22381387과 22387465 사이의 서열을 보존하며, 여기서 그 상동성 팔은 22383529 부위에 선형화 제한효소 절단 부위 NotI가 삽입되고, 그 Lambda 경쇄 표적화 벡터2는 퓨로마이신 저항성 발현 요소 CAGpuro-polyA, 재조합 효소 인식 부위 FRT 및 pBACe3.6 박테리아 인공 염색체 플라스미드 프레임워크를 운반한다. 이의 용도는, Lambda 경쇄 표적화 벡터1이 마우스 6번 염색체 70726758과 70731223 부위로 유도 도입되면, Lambda 경쇄 표적화 벡터1에 의해 운반되어 진입하는 22번 염색체 22381387과 22387465 사이의 서열을 상동성 팔로 Lambda 경쇄 표적화 벡터2의 더 많은 V 영역 유전자 단편을 마우스 배아줄기세포 6번 염색체에 도입하는 데 있다
상기 중쇄 표적화 벡터2, kappa 경쇄 표적화 벡터 및 lambda 경쇄 표적화 벡터1및 2의 DNA 무결성 동정 방법은 중쇄 표적화 벡터1과 유사한 벡터 제한효소 절단 단편 펄스장 겔 전기영동 및 무작위 작은 단편 PCR 동정 방법을 사용한다.
실시 예 5 : 상동 재조합을 통한 마우스 배아줄기세포로 표적화 벡터의 유도 도입
그 중의 일 실시 예에서, 표적 세포는 실시 예 1에서 단계 2의 유전자 표적화 및 재조합 효소 Cre를 통해 마우스 12번 염색체 113428530 내지 116027502 사이의 영역을 녹아웃한 마우스 배아줄기세포이며, 사용된 표적화 벡터는 중쇄 표적화 벡터1이고(도 10 참조), 유도 도입되는 과정은 도 15 및 도 16을 참조할 수 있고, 구체적 단계는 하기와 같다.
단계 1. 1-2Х107 표적 마우스 배아줄기세포를 50mg 선형화된 중쇄 표적화 벡터1로 전기천공법(240V, 250uF，Bio-rad Gene Pulser)을 통해 형질감염시키는 단계, 여기서 전기천공 형질감염 방법은 당업자에게 익숙한 것이다. 표적화 벡터에 의해 운반되는 저항성 유전자에 따라, 형질감염된 세포를 24-48 시간 이내에 네오마시인 225mg/ml로 형질감염에 성공한 세포 클론을 7일 동안 선별한다. 항생제 저항성 세포 클론을 96웰 배양 플레이트로 선별하여 확대 배양 및 유전자형 동정을 수행한다.
단계 2. 단계 1에 의해 수득된 일부 항생제 저항성 세포를 취해 이의 게놈 DNA를 추출한 후, 도 17에 도시된 바에 따라 상동성 팔 영역 외부 정방향 및 역방향 프라이머를 설계해 일반적인 PCR 증폭을 수행하는 단계는, 1) 프라이머 P1 및 P2는 각각 야생형 대립 유전자 표적 상동성 팔 5’ 말단 및 3’ 말단에 설계되고, 두 프라이머의 서열은 모두 상동성 팔 영역 외부에 있는 단계; 2) 프라이머 P3 및 P4는 각각 표적화 벡터 상동성 팔 5’ 말단 및 3’ 말단에 설계되고, 두 프라이머의 서열은 모두 상동성 팔 영역 외부에 있는 단계; 3) 선형화된 표적화 벡터가 상동 재조합을 통해 야생형 대립 유전자 표적 상동성 팔 부위에 삽입되면, P1 및 P4, P3 및 P2 프라이머를 사용해 단편 크기가 상동성 팔 세그먼트 크기보다 큰 DNA 단편 P1P4 및 P3P2를 각각 PCR 증폭할 수 있는 단계, P1 및 P4, P3 및 P2 프라이머를 각각 사용하면 모두 야생형 대립 유전자 템플릿 또는 표적화 벡터 템플릿만 있는 PCR 시스템에서는 단편 크기가 상동성 팔 세그먼트 크기보다 큰 DNA 단편을 증폭할 수 없다. P1P4 및 P3P2의 두 PCR 산물에 대한 단편 크기 및 서열 분석을 통해 방안 중의 표적화 벡터가 상동 재조합을 통해 야생형 대립 유전자 표적 상동성 팔 영역에 정확하게 삽입되었는지 판단할 수 있다. 도 18에 도시된 바와 같이, 중쇄 표적화 벡터1이 표적 마우스 배아줄기세포로 유도 도입되면, P1P4 산물의 크기는 5.3KB이고, P3P2 산물의 크기는 5.4KB이며, 그 결과에 따르면, 이 유도 도입을 통해 예상대로 마우스 배아줄기세포 표적 영역에 성공적으로 도입된 복수의 세포 클론을 수득했음을 알 수 있다. P1P4 및 P3P2 증폭 산물은 시퀀싱 방식을 통해 추가적으로 확인될 수 있다.
마우스 배아줄기세포로 도입된 인간 중쇄 표적화 벡터1의 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 무결성 동정은 표 6의 Cargo1 내지 Cargo24를 프라이머로 PCR 증폭 동정을 수행하는 것과 같이, 성공적으로 표적화 도입된 이들 세포 게놈을 템플릿으로 PCR을 통해 동정할 수 있으며, Cargo1-24를 사용하면 모두 예상 크기의 PCR 산물을 수득할 수 있으므로, 마우스 배아줄기세포 클론은 인간 면역글로불린 가변 영역 게놈에 성공적으로 도입되고 중대한 DNA 세그컨트 결실 위험이 없는 클론임을 알 수 있다.
그중의 일 실시 예에서, 도 15 및 도 16에 도시된 바와 같이, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 16개의 인간 VH 기능성 유전자 및 27개의 인간 DH 유전자 및 6개의 인간 JH 유전자는 중쇄 표적화 벡터1을 통해 실시 예 1의 모든 단계를 완료한 마우스 배아줄기세포에 도입되며, 그 배아줄기세포 클론은 추가적으로 중쇄 표적화 벡터2를 통해 또 다른 25개의 인간 VH 기능성 유전자에 도입된다.
그중의 일 실시 예에서, 도 19 및 도 20에 도시된 바와 같이, 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 20개의 인간 kappa VL 기능성 유전자 및 5개의 kappa JL 유전자는 kappa 경쇄 표적화 벡터를 통해 실시 예 2의 모든 단계를 완료한 마우스 배아줄기세포에 도입된다.
그중의 일 실시 예에서, 도 21 및 도 22에 도시된 바와 같이, 인간 면역글로불린 lambda 경쇄 가변 영역 19개의 인간 lambda VL 기능성 유전자 및 전부 7개의 lambda JL 유전자 및 lambda CL 유전자는 lambda 경쇄 표적화 벡터 1을 통해 실시 예 3의 모든 단계를 완료한 마우스 배아줄기세포에 도입되며, 그 배아줄기세포 클론은 추가적으로 lambda 표적화 벡터2를 통해 또 다른 12개의 인간 lambda VL 기능성 유전자에 도입된다. Lambda 경쇄 표적화 벡터1에 도입 완료된 후 세포로 FLP 발현이 도입되고, 두 개의 FRT 부위 사이에 재조합이 허용되어 두 FRT 사이의 서열이 녹아웃됨에 따라, 잔류된 Lambda 경쇄 표적화 벡터 유래 비인간 DNA 서열 및 마우스 내인성 kappa CL 코딩 서열이 제거된다.
도 15 내지 도 16, 도 19 내지 도 20, 도 21 내지 도 22에 도시된 실시 예에서 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 유전자가 마우스 배아줄기세포에 도입되기 전, 이들 인간 면역글로불린 가변 영역 V 영역 유전자 중의 일부 또는 전부의 유사 V 영역 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 V 영역 유전자는 녹아웃되기 때문에, 최종적으로 마우스 배아줄기세포에 도입되는 V 영역 유전자 영역의 단편 크기는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스 중 인간 면역글로불린 V 영역 크기의 일부만 차지하며, 이의 백분율 요약은 하기 표 7과 같다.
실시 예 5의 각 표적화 단계를 완료한 후 세포에 도입된 V 영역 유전자 단편이 차지하는 해당 V 영역 총 길이의 백분율
완료 단계 도입된 V 영역 유전자 길이 해당 V 영역 유전자 영역 총 길이 도입된 V 영역 유전자 백분율
중쇄 표적화 벡터1의 도입 완료 후 151362bp 940130bp 16.10%(1)
중쇄 표적화 벡터1 및 중쇄 표적화 벡터 2의 도입 완료 후 357803bp 940130bp 38.06%(1)
Kappa 경쇄 표적화 벡터의 도입 완료 후 250235bp 471464bp 53.08%(2)
Lambda 경쇄 표적화 벡터1의 도입 완료 후 158751bp 858318bp 18.50%(3)
Lambda 경쇄 표적화 벡터1 및 Lambda 경쇄 표적화 벡터2의 도입 완료 후 272518bp 858318bp 31.75%(3)
주 : (1) 인간 중쇄 V 영역 총 길이를 계산할 때, ENSEMBL GRCh38.p13 14번 염색체 부위 105939715와 106879844 사이에 따라 계산하며, 총 길이는 940130bp이다; (2) 인간 kappa 경쇄 근위 V 영역 총 길이를 계산할 때, ENSEMBL GRCh38.p13 2번 염색체 88861968과 89333431사이에 따라 계산하며, 총 길이는 471464 bp이다; (3) 인간 lambda 경쇄 V 영역 총 길이를 계산할 때, ENSEMBL GRCh38.p13 22번 염색체 22023114와 22881431 사이에 따라 계산하며, 총 길이는 858318 bp이다.
실시 예 6 : 마우스 배아줄기세포의 형질전환(conversion) 및 증식
유전자 편집된 마우스 배아줄기세포가 유전자 변형 마우스로 형질전환(conversion)되는 기술은 당업자에게 익숙한 것이다. 유전자형 동정에 적합한 마우스 배아줄기세포 클론은 핵형 검출을 통해 이의 염색체 수가 증가되거나 감소되지 않은 것이 확인되면, 그 클론의 마우스 배아줄기세포를 주입 밀도로 희석 처리하여 약 50개의 2.5-3.5일령의 포배강에 주입한 후, 현미주사로 주입한 포배강을 대리모 마우스의 나팔관 또는 자궁으로 돌려 보내고, 마우스가 태어나면, 마우스 꼬리 DNA를 템플릿으로 유전자 편집 특이적 프라이머를 이용하면, PCR로 후손 키메라의 유전자형을 동정하여 유전자 편집된 마우스 배아줄기세포가 키메라 후손 마우스의 체세포에 기여했는지 여부를 확인할 수 있다. 후손 키메라 마우스와 성별이 다른 야생형 마우스를 교배시키면 1세대 마우스(F1)가 수득되고, 동일한 PCR 방법으로 F1 세대 마우스의 유전자형을 동정하면, 그 유전자 편집된 마우스 배아줄기세포가 생식선 전이(germline transmission)를 구현할 수 있는지 여부를 판단할 수 있으며, F0 세대 및 F1 세대 마우스 유전자형 동정 프라이머 설계 원칙 및 실시방안은 당업자에게 익숙한 것이다.
그중의 일 실시 예에서, 상기 방법에 따라, 실시 예 5에 의해 수득된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에 성공적으로 도입되고 표 6과 같이 Cargo1-24의 PCR 증폭 동정 및 핵형 검출을 통과한 마우스 배아줄기세포를 2.5-3.5일령 마우스 배아 포배강에 주입하여 F1 세대 마우스를 수득하며; 또 다른 실시 예에서, 도 19 및 도 20의 방안에 따라 도 13에 도시된 Kappa 경쇄 표적화 벡터를 마우스 배아줄기세포에 도입하여 마찬가지로 F1 세대 마우스를 수득하고, 이 둘의 F1 세대 마우스를 이종교배 방식으로 중쇄 표적화 벡터1의 부위와 Kappa 경쇄 표적화 벡터 부위가 모두 동협접합자인 마우스로 교배하며; 또 다른 실시 예에서. 도 21 및 도 22의 방안에 따라 도 14에 도시된 Lambda 경쇄 표적화 벡터1 및 2를 마우스 배아줄기세포에 도입하여 마찬가지로 F1 세대 마우스를 수득한다. 표 8는 본 발명에 의해 수득된 복수의 유전자 변형 마우스의 특징을 나타낸다.
본 발명에 의해 수득된 유전자 변형 마우스의 특징
마우스
종류 		특징
유전자
변형
마우스
1그룹		 각각 중쇄 표적화 벡터1 및 Kappa 경쇄 표적화 벡터로 유도 도입한 후 마우스 번식 교배를 통해 수득되며, 두 개의 벡터 부위는 모두 동형접합자이고, 그 마우스는 16개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 VH 유전자 IGHV6-1, IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV4-4, IGHV7-4-1, IGHV2-5, IGHV3-7, IGHV1-8, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV1-18, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23 및 20개의 인간 면역글로불린 Kappa 경쇄 가변 영역 VL 유전자 IGKV4-1, IGKV5-2, IGKV1-5, IGKV1-6, IGKV1-8, IGKV1-9, IGKV3-11, IGKV1-12, IGKV3-15, IGKV1-16, IGKV1-17, IGKV3-20, IGKV6-21, IGKV2-24, IGKV1-27, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV1-33, IGKV1-39, IGKV2-40을 포함한다.
유전자
변형
마우스
2그룹		 각각 중쇄 표적화 벡터1과 2 및 Kappa 경쇄 표적화 벡터로 유도 도입되고 그후 마우스 번식 교배를 통해 수득되며, 벡터 부위는 모두 동형접합자이고, 그 마우스는 41개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 VH 유전자 IGHV6-1, IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV4-4, IGHV7-4-1, IGHV2-5, IGHV3-7, IGHV1-8, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV1-18, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV1-24, IGHV2-26, IGHV4-28, IGHV3-30, IGHV4-31, IGHV3-33, IGHV4-34, IGHV4-39, IGHV3-43, IGHV1-45, IGHV1-46, IGHV3-48, IGHV3-49, IGHV5-51, IGHV3-53, IGHV1-58, IGHV4-59, IGHV4-61, IGHV3-64, IGHV3-66, IGHV1-69, IGHV2-70, IGHV3-72, IGHV3-73, IGHV3-74 및 20개의 인간 면역글로불린 Kappa 경쇄 가변 영역 VL 유전자 IGKV4-1, IGKV5-2, IGKV1-5, IGKV1-6, IGKV1-8, IGKV1-9, IGKV3-11, IGKV1-12, IGKV3-15, IGKV1-16, IGKV1-17, IGKV3-20, IGKV6-21, IGKV2-24, IGKV1-27, IGKV2-28, IGKV2-30, IGKV1-33, IGKV1-39, IGKV2-40을 포함한다.
유전자
변형
마우스
3그룹		 각각 중쇄 표적화 벡터1과 2 및 Lambda 경쇄 표적화 벡터1과 2로 유도 도입되고 그후 마우스 번식 교배를 통해 수득되며, 벡터 부위는 동형접합자이고, 그 마우스는 41개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 VH 유전자 IGHV6-1, IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV4-4, IGHV7-4-1, IGHV2-5, IGHV3-7, IGHV1-8, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV1-18, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV1-24, IGHV2-26, IGHV4-28, IGHV3-30, IGHV4-31, IGHV3-33, IGHV4-34, IGHV4-39, IGHV3-43, IGHV1-45, IGHV1-46, IGHV3-48, IGHV3-49, IGHV5-51, IGHV3-53, IGHV1-58, IGHV4-59, IGHV4-61, IGHV3-64, IGHV3-66, IGHV1-69, IGHV2-70, IGHV3-72, IGHV3-73, IGHV3-74 및 31개의 인간 면역글로불린 Lambda 경쇄 가변 영역 VL 유전자 IGLV3-1, IGLV4-3, IGLV2-8, IGLV3-9, IGLV3-10, IGLV2-11, IGLV3-12, IGLV2-14, IGLV3-16, IGLV2-18, IGLV3-19, IGLV3-21, IGLV2-23, IGLV3-25, IGLV3-27, IGLV1-36, IGLV5-37, IGLV1-40, IGLV7-43, IGLV1-44, IGLV5-45, IGLV7-46, IGLV1-47, IGLV9-49, IGLV1-51, IGLV5-52, IGLV10-54, IGLV6-57, IGLV4-60, IGLV8-61, IGLV4-69를 포함한다.
표 8에 관련된 가변 영역 V 유전자의 서열은 표 1 내지 표 5를 참조한다.
실시 예 7 : 유전자 변형 마우스의 B세포 발달 시험
대부분의 포유동물에서, 비장은 B 세포 함량이 풍부한 장기이며, 비장의 B 세포에 대한 분석을 통해 그 동물의 B 세포 발달이 정상인지 여부를 판단할 수 있다. (실시 예 6에 의해 수득된 유전자 변형) 마우스 비장을 취하여 비장 세포를 분리하고, 및 비장 유래 세포에 대해 수행하는 유세포 분석 기술은 당업자에게 익숙한 것이다. 실시 예 6의 유전자 변형 마우스 1그룹(도 23에서 동형접합자 유전자 변형 마우스 그룹)을 면역화하지 않은 상태에서 이의 비장을 취해 비장 세포를 분리하고, 이형접합자 유전자 변형 마우스 및 야생형 한배 대조 마우스 유래 비장 세포를 유세포 분석 비교하고, B220양성/IgM높음/IgD낮음 세포를 비성숙 B 세포로, B220양성/IgM낮음 내지 중간/IgD높음 을 성숙 B 세포로 선택한다. 도 23에 도시된 바와 같이 야생형 한배 대조 마우스, 이형접합자 유전자 마우스 및 동형접합자 유전자 마우스 그룹은 성숙 및 비성숙 B 세포의 비율 방면에서 통계학적 차이가 없으므로, 본 발명에 의해 수득된 유전자 변형 마우스 1그룹의 B 세포 발달은 정상임을 나타낸다. 유사하게는, 유전자 변형 마우스 2그룹 및 유전자 변형 마우스 3그룹은 성숙 및 비성숙 B 세포의 비율 방면에서 야생형 한배 대조 마우스, 이형접합자 유전자 변형 마우스와 모두 통계학적 차이가 없고, B 세포가 정상적으로 발달한다.
실시 예 8 : 유전자 변형 마우스의 면역 시험
본 발명의 목적의 하나는 인간에서 유래된 가변 영역 코딩 유전자의 항체를 발현하는 유전자 변형 동물을 수득하고, 이들 유전자 변형 동물이 항원 자극 하에 정상적으로 항원 특이적 면역 반응을 일으킬 수 있는 데 있다.
실시 예 6에 의해 수득된 유전자 변형 마우스 1그룹과 2그룹 및 대조그룹 야생형 BALB/c 마우스에 동일한 양을 투여하고, 동일한 면역 방안의 오브알부민(OVA, 공급업체 : Sigma-Aldrich, 제품번호 : A5503) 면역을 수행한다. 면역 3차 부스터 이후, 마우스 혈청을 취해 OVA 특이적 효소결합 면역흡착검사(ELISA)를 수행하며, 여기서 항원 특이적 효소결합 면역흡착검사 방법은 당업자에게 익숙한 것이다. 결과는 도 24에 도시된 바와 같이, 유전자 변형 마우스 1그룹과 유전자 변형 마우스 2그룹은 모두 야생형 BALB/c 마우스보다 우수한 항원 특이적 면역반응을 생성할 수 있다.
실시 예 9. 완전 인간 항체 후보 물질 개발에서 유전자 변형 마우스의 적용 사례
인간 면역글로불린 가변 영역 재배열에서 유래된 가변 영역 코딩 유전자의 항체를 생산할 수 있기 때문에, 본 발명의 마우스 모델의 중요한 용도의 하나는 완전 인간 항체 후보 물질의 개발에 있다.
특정 항원을 사용해 유전자 변형 마우스를 단계적으로 자극하여 그 특정 항원에 대한 특이적 면역반응을 일으키고, 마우스 비장 및/또는 림프절을 취해 세포 융합을 수행해 불멸화시켜 지속적으로 항체를 분비하는 하이브리도마 기술을 얻는 것은 당업자에게 익숙한 것이다.
면역글로불린 코딩 유전자 클러스터에 대한 유전자 편집은 마우스 B 세포의 발달에 중요한 부정적인 영향을 미치며, 여기서 객관적으로 반영할 수 있는 가능한 현상 중 하나는 항원에 대한 마우스의 특이적 면역반응은 친화도가 낮은 항체만 생산할 수 있다는 것이다.
본 발명의 실시 예 6에 의해 수득된 유전자 변형 마우스 1그룹, 2그룹 및 3그룹의 마우스 모델을 이용해 하이브리도마 기술로 인간 BCMA, GALECTIN-10 또는 TGFb1의 3개 상이한 표적에 대해, 각각 12, 12 및 20개의 상이한 항원 특이적 단일클론 항체를 수득한다. BIAcore T200(GE Healthcare)을 사용해 이들 항체의 친화도 수준을 측정하면(도 25 참조), 본 발명의 마우스 모델로부터 수득된 이들 항체는 3개의 상이한 표적에 대해 모두 pM 범위의 높은 친화도 수준의 항체를 수득할 수 있고, 측정된 친화도 수준 범위가 각각 10pM-1nM, 1pM-10nM, 1pM-10nM 범위 이내임을 알 수 있다.
본 발명의 방법을 사용해 제조된 유전자 변형 마우스는 B 세포의 발달 수준 뿐 아니라, 항원 특이적 면역반응 및 항체의 친화도 수준 방면에서 모두 놀라운 효과가 나타났으며, 이러한 효과는 당업자들이 예상하지 못한 것이다.
전술된 특정 실시 양태는 본 발명의 몇 가지 측면을 예시적으로 설명하기 위한 것이므로 본 발명 및 청구범위를 제한해서는 안 되며, 임의의 등가의 실시 방안은 모두 본 발명의 범위에 속해야 한다. 전술한 개시를 통해, 본 명세서에 설명된 변형 이외에, 당업자라면 본 발명에 대해 다양하게 기타 변형을 수행할 수 있으며, 이러한 변형 역시 본 발명의 범위 내에 속해야 한다.

Claims (23)

  1. 게놈의 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자의 일부 또는 전부는 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자로 치환되며,
    상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 일부 또는 전부의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 녹아웃되는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자는 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH의 코딩 서열 및 비코딩 서열, 및/또는 인간 경쇄 기능성 VL, JL 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포힘하고, 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자는 비인간 포유동물 면역글로불린 중쇄 가변 영역 VH, DH, JH 및/또는 경쇄 가변 영역 VL, JL을 포함하고, 여기서 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.
  4. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 14번 염색체에서 유래되고, 상기 인간 경쇄 기능성 VL, JL의 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 2번 또는 22번 염색체에서 유래되는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 14번 염색체 105863198과 106879844 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열을 포함하고, 상기 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조하며, 바람직하게는, 상기 VH, DH, JH 코딩 서열 및 비코딩 서열은 하기 표의 서열 번호 VH 유전자 중의 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 10 내지 41개의 VH 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 15 내지 41개의 VH 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 18 내지 41개의 VH 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 22 내지 41개의 VH 유전자를 포함하고, 더 바람직하게는 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41개의 VH 유전자와 같이 25 내지 41개의 VH 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.

  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 경쇄 기능성 VL, JL 코딩 서열 및 비코딩 서열은 인간 2번 염색체 88860568과 90235398 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열, 또는 인간 22번 염색체 22023114와 22922913 뉴클레오티드 부위 사이에서 유래된 서열을 포함하고, 여기서 상기 좌표는 ENSEMBL GRCh38.p13 버전의 인간 게놈 데이터베이스를 참조하며, 바람직하게는, 상기 인간 경쇄 기능성 VL, JL 코딩 서열 및 비코딩 서열은 하기 표의 서열 번호 V 영역 게놈 중의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.



  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자는 일부 또는 전부가 결실되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자는 상기 결실된 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 상류 3KB 내지 하류 3KB 부위로 삽입되고, 상기 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자는 상기 결실된 내인성 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 상류 3KB 내지 하류 3KB 부위로 삽입되며,
    바람직하게는, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자에서 녹아웃(또는, 일부 또는 전부가 놋아웃)되는 수는, 비인간 포유동물 세포 게놈에 삽입되는 인간 면역글로불린 중쇄, Lambda 경쇄 가변 영역 유전자의 길이가 각각 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자를 녹아웃하기 전 인간 면역글로불린 중쇄, Lambda 경쇄 가변 영역 유전자 총 길이의 10% 내지 50%이고, 바람직하게는 12% 내지 47%이고, 바람직하게는 14% 내지 45%이고, 바람직하게는 15% 내지 43%이고, 더 바람직하게는 16% 내지 40%이고, 더 바람직하게는 16.10%, 18%, 18.50%, 20%, 25%, 30%, 31%, 31.75%, 35%, 38% 또는 38.06%이며,
    및/또한, 비인간 포유동물 세포 게놈에 삽입되는 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 유전자의 길이는 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임 유전자가 녹아웃되기 전 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 유전자 총 길이의 35% 내지 65%이고, 바람직하게는 37% 내지 63%이고, 바람직하게는 38% 내지 61%이고, 바람직하게는 40% 내지 60%이고, 바람직하게는 42% 내지 58%이고, 바람직하게는 45% 내지 57%이고, 바람직하게는 47% 내지 56%이고, 더 바람직하게는 51%, 52%, 53%, 53.08% 또는 54%와 같이 50% 내지 55%인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비인간 포유동물 세포는 마우스 배아줄기세포이고, 결실된 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 부위는 마우스 12번 염색체 113428530 내지 116027502의 두 부위 사이에 위치하며,
    결실된 내인성 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 부위는 마우스 6번 염색체 67536984 내지 70723924의 이 두 부위 사이에 위치하며,
    결실된 내인성 면역글로불린 lambda 경쇄 가변 영역 부위는 마우스 16번 염색체 19065021 내지 19260700의 이 두 부위 사이에 위치하며,
    여기서, 마우스 게놈 염색체 부위 좌표는 모두 ENSEMBL GRCm38.p6 버전 C57BL/6J 마우스 게놈 데이터베이스 부위를 참조하며,
    바람직하게는, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 삽입 부위는 마우스 게놈 12번 염색체 113428513 부위이며,
    상기 인간 면역글로불린 kappa 경쇄 가변 영역 유전자 삽입 부위는 마우스 게놈 6번 염색체 70723924 부위이며,
    상기 인간 면역글로불린 lambda 경쇄 가변 영역 유전자 삽입 부위는 마우스 게놈 6번 염색체 70726758 부위인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포 유전공학적 재조합 게놈.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항을 포함하는 비인간 포유동물 세포 제조합 게놈의 비인간 포유동물 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포는 비인간 포유동물 배아줄기세포이고, 바람직하게는, 상기 비인간 포유동물 배아줄기세포는 마우스 배아줄기세포, 랫 배아줄기세포 또는 토끼 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법, 상기 방법은,
    a) 비인간 포유동물 세포 게놈 면역글로불린 가변 영역 유전자 상류 및 하류에 방향이 상동하고 호환되는 재조합 효소 표적 부위를 각각 도입하는 단계,
    b) 단계 a)의 상기 재조합 효소 부위를 특이적으로 인식할 수 있는 재조합 효소를 도입하고, 단계 a)의 상기 두 재조합 효소 표적 부위 사이에 재조합 이벤트가 발생하도록 허용하여, 상기 비인간 포유동물 세포 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자를 일부 또는 전부 결실시키는 단계,
    c) 일부 또는 전부의 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 표적화 벡터를 제공하며, 상기 표적화 벡터는 인간 기능성 가변 영역 유전자를 포함하고 일부 또는 전부의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 녹아웃되는 단계, 상기 인간 기능성 가변 영역 유전자는 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하거나, 또는 인간 경쇄 기능성 VL, JL 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄이며,
    d) 단계 c)의 상기 표적화 벡터를 도입하여, 비인간 포유동물 세포 내에서 단계 c)에 포함된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자가 단계 b)의 상기 결실된 비인간 포유동물 세포 내인성 면역글로불린 유전자를 치환하는 단계,
    e) 단계 d)에 의해 게놈에 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된 비인간 포유동물 세포가 생산되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 표적화 벡터는 BAC 벡터 또는 YAC 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법.
  13. 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 c)의 상기 표적화 벡터는 대장균 또는 효모 세포에서 구축이 완료되는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법.
  14. 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함하며, 상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 일부 또는 전부의 유사 유전자 및/또는 오픈 리딩 프레임이 녹아웃되고,
    상기 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자는 인간 중쇄 기능성 VH, DH, JH의 코딩 서열 및 비코딩 서열, 또는 인간 경쇄 기능성 VL, JL의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 kappa 또는 lambda 경쇄인 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 표적화 벡터는 BAC 벡터 또는 YAC 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  16. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 비인간 포유동물 세포 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 비인간 포유동물 세포를 생산하는 상기 방법으로 수득된 비인간 포유동물 세포를 야생형 비인간 포유동물 자궁 내에 도입하고,
    F0세대 비인간 포유동물로 후손 키메라 비인간 포유동물을 선택하는 것을 특징으로 하는 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 생산하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    비인간 포유동물 세포를 암컷 야생형 비인간 포유동물 자궁 내에 도입하기 전, 상기 비인간 포유동물 세포를 스크리닝하여 염색체 수가 증가 또는 감소되지 않은 비인간 포유동물 세포 클론을 수득하고,
    상기 비인간 포유동물 세포 클론을 야생형 비인간 포유동물 배아 포배강에 이식하고,
    배아를 가임신한 암컷 야생형 비인간 포유동물 자궁 내에 이식하는 것을 특징으로 하는 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 생산하는 방법.
  18. 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    F0세대 비인간 포유동물이 야생형 비인간 포유동물과 교배되면 안정적으로 유전이 가능하고,
    지정 부위에 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자가 삽입된 F1세대 비인간 포유동물을 수득할 수 있는 것을 특징으로 하는 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 생산하는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비인간 포유동물은 마우스, 랫 또는 토끼이고,
    상기 비인간 포유동물 세포는 마우스 배아줄기세포, 랫 배아줄기세포 또는 토끼 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 생산하는 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 가변 영역이 완전 인간인 항체를 발현하는 비인간 포유동물을 생산하는 상기 방법에 의해 제조된 비인간 포유동물, 바람직하게는 상기 비인간 포유동물은 마우스, 랫 또는 토끼임.
  21. 가변 영역이 완전 인간인 항체의 스크리닝 또는 완전 인간 항체 약제의 제조 과정에서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 게놈, 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비인간 포유동물 세포, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법, 제14항 내지 제15항 중 어느 한 항의 표적화 벡터 또는 제20항의 비인간 포유동물의 용도.
  22. 비인간 포유동물의 제조에서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 게놈, 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비인간 포유동물 세포, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 비인간 포유동물 세포를 생산하는 방법 또는 제14항 내지 제15항 중 어느 한 항의 표적화 벡터의 용도.
  23. 제20항의 비인간 포유동물에 의해 생산되는 가변 영역이 완전 인간인 항체, 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 유도체 또는 약학적 조성물.
KR1020237024727A 2021-01-14 2022-01-13 재조합 게놈, 비인간 포유동물 세포 및 이의 생산 방법및 용도 KR20230123509A (ko)

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