KR20230120846A

KR20230120846A - 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하기 위한 바이오마커 패널 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230120846A
Application number: KR1020220017578A
Authority: KR
Inventors: 이혜옥; 안명주; 김나영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2022-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2023-08-17
Also published as: WO2023153833A1

Abstract

폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하기 위한 바이오마커 패널 및 상기 패널을 이용한 뇌전이암의 진단 또는 예측 방법에 관한 것이다. 종양 세포 및 암 미세 환경 세포가 섞인 형태의 벌크 데이터 기반으로 선별된 바이오마커의 한계를 넘어 순수 종양 세포에서 선별된 바이오마커를 제공함으로써, 폐암 뇌전이 진단의 정확성 및 민감도를 향상시켰다.

Description

폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하기 위한 바이오마커 패널 및 이의 용도{A biomarker panel for diagnosing or predicting brain metastasis of lung cancer and use thereof}

폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하기 위한 바이오마커 패널 및 상기 패널을 이용한 뇌전이암의 진단 또는 예측 방법에 관한 것이다.

폐암은 19세기까지만해도 드문 질환이었으나, 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여 우리나라에서도 폐암의 발생이 가파르게 상승하고 있는 추세이다. 또한, 폐암은 다른 암에 비해 치료가 잘 되지 않아, 발병률은 1위가 아니나, 사망자는 암 환자 중 가장 많은 것으로 알려져 있다. 상기 폐암이 발병된 환자 중에서 일부 환자의 경우에는 뇌로 전이되는 경우가 빈번함이 보고되었는데, 특히 선암종(adenocarcinoma, ADC)의 비소세포성 폐암이 발병된 환자의 경우에는 비교적 높은 빈도로 뇌로 전이되어 뇌전이암이 발병됨이 보고되었다. 상기 뇌전이암이 발병된 경우에는 외과적 절제술, 화학 치료법, 방사선 치료법 등을 통하여 발병된 뇌전이암을 치료할 수 있으나, 뇌전이암의 치료과정에 따른 부작용의 발생율이 높은 것으로 보고되어 있으므로, 가급적 뇌전이암의 발병을 예방하려는 노력이 계속되고 있다. 이처럼 뇌전이암를 예방하는 방법은 뇌전이암의 발병원인 및 발병기작의 연구를 통하여 개발될 수 있을 것으로 예상되고 있다.

또한, 폐암의 뇌전이 여부를 조기에 진단하거나 예후를 예측하게 함으로써, 적합한 치료가 폐암을 앓고 있는 환자에게 적용될 수 있게 하는 유전적 마커를 확인할 필요성이 있다.

관련 연구로, 폐 ADC에서 조기 원격 전이와 관련된 유전학적 변화를 규명하기 위하여, 동시성 뇌 전이 폐 ADC에서 유전자 증폭 및 결실을 속발성 뇌 전이 폐 ADC와 비교한 연구를 통해, 몇몇의 유전학적 변화 중에서, ACTA2의 증폭이 동시성 뇌 전이와 현저하게 관련되어 있음이 보고되었다 (HW Lee et al, Int　J　Oncol., 41:2013-20, 2012). ACTA2는 세포유래 기계적 자극 및 세포 모양 및 운동의 유지에 기여하는 것으로 알려져 있으며, 세포 운동성이 액틴 세포골격에 결정적으로 좌우되기 때문에, ACTA2에 의해 영향을 받는 세포골격 구조의 역학이 폐 ADC의 침습 및 전이에 필수적이라 할 수 있다(Fritz G. et al,　CurrCancerDrugTargets, 6:1-14, 2006; Lambrechts A. et al,　Int　J　BiochemCellBiol, 36:1890-909, 2004).

본 발명자들은 폐암의 뇌전이 가능성을 진단하고 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커를 선별하기 위하여 실제 폐암으로부터 뇌전이가 발생한 환자를 대상으로 다양한 유전자들의 발현 양상을 확인함으로써 본 발명의 바이오마커 패널을 발명하였다.

본 발명의 목적은 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측할 수 있는 바이오마커 패널을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 단일 세포 전사체 분석을 통하여 유전자 복제수 변이를 갖는 종양 세포로부터 폐암 뇌전이를 진단할 수 있는 바이오마커를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 환자로부터 분리된 시료에서 상기 바이오마커의 수준을 확인할 수 있는 제제를 이용하여 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 FN1(Fibronectin 1), MIF(macrophage migration inhibitory factor), PLIN2(Perilipin 2), KLF6(Kruppel Like Factor 6), PFKP(Phosphofructokinase, Platelet), BLVRB(Biliverdin Reductase B), SOX4(SRY-Box Transcription Factor 4), PYGL(Glycogen Phosphorylase L), IMPA2(Inositol Monophosphatase 2), VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A), MGST1(Microsomal Glutathione S-Transferase 1), NGRN(Neugrin), RAB11A(Member RAS Oncogene Family), MORF4L1(Mortality Factor 4 Like 1), SMAD9(SMAD Family Member), LHFPL6(lipoma HMGIC fusion partner L6), MTHFS(Methenyltetrahydrofolate Synthetase), MRPL18(Mitochondrial Ribosomal Protein L18), 및 PEPD(Peptidase D) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측할 수 있는 바이오마커 패널을 제공한다.

일 구체예에서, 상기 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측할 수 있는 바이오마커 패널은 FN1(Fibronectin 1), MIF(macrophage migration inhibitory factor), PLIN2(Perilipin 2), KLF6(Kruppel Like Factor 6), PFKP(Phosphofructokinase, Platelet), BLVRB(Biliverdin Reductase B), SOX4(SRY-Box Transcription Factor 4), PYGL(Glycogen Phosphorylase L), IMPA2(Inositol Monophosphatase 2), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 폐암은 폐선암일 수 있다.

다른 일 구체예에서, 상기 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측할 수 있는 바이오마커 패널은 MGST1(Microsomal Glutathione S-Transferase 1), NGRN(Neugrin), RAB11A(Member RAS Oncogene Family), MORF4L1(Mortality Factor 4 Like 1), SMAD9(SMAD Family Member), LHFPL6(lipoma HMGIC fusion partner L6), MTHFS(Methenyltetrahydrofolate Synthetase), MRPL18(Mitochondrial Ribosomal Protein L18), 및 PEPD(Peptidase D) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 폐암은 소세포폐암(small cell lung carcinoma, SCLC)일 수 있다.

본 명세서 내 용어 "바이오마커 패널"은 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하기 위한 복수의 바이오마커의 임의의 조합을 사용하여 구성된 것으로서, 상기 조합은 전체 세트, 또는 그의 임의의 서브세트 또는 서브조합을 의미할 수 있다. 즉, 바이오마커 패널은 바이오마커의 한 세트를 의미할 수 있으며, 측정되는 임의 형태의 복수의 바이오마커를 의미할 수 있다. 예를 들어, FN1이 바이오마커 패널의 일부일 경우, FN1 mRNA 또는 FN1 단백질이 상기 패널의 일부인 것으로 간주될 수 있다. 진단의 정확도를 높이기 위해서는 단일의 바이오마커보다는 복수의 바이오마커 조합이 더 유용할 수 있다. 구체적으로, 시료 중 복수 개의 바이오마커를 검출하는 것이 시험의 감도 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 바이오마커 패널은 2개 이상의 바이오마커 유형을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 바이오마커 패널은 최소 개수의 바이오마커로 구성되어 최대량의 정보를 생성한다. 따라서, 바이오마커 패널이 "바이오마커 한 세트"로 구성될 경우, 상기 세트를 이루는 것 이외에는 어떤 바이오마커도 포함되지 않는다. 일 구체예에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 바이오마커 중 2개 이상의 바이오마커로 구성될 수 있다. 다른 구체예에서, 바이오 마커 패널은 본원에 개시된 바이오마커 중 3개 이상의 바이오마커로 구성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 바이오마커 중 4개 이상의 바이오마커로 구성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 바이오마커 패널은 폐선암의 뇌전이와 관련하여 본원에 개시된 10개의 바이오마커로 구성될 수 있으며, 소세포폐암의 뇌전이와 관련하여 본원에 개시된 9개의 바이오마커로 구성될 수 있다. 본 발명의 바이오마커는 폐암의 뇌 전이 진단에서 통계학상 유의적인 차이를 나타낸다. 일 구체예에서, 이러한 바이오마커를 단독으로, 또는 복수의 바이오마커를 조합하여 사용하는 진단 테스트는 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이 상, 및 약 100%의 감도 및 특이성으로 진단 정확도가 향상될 수 있다.

상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이오마커 유전자의 mRNA 수준을 측정하기 위한 제제일 수 있으며, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 각각의 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드는 상기 각각의 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제는 항체일 수 있다. 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있으며, 예를 들어, 상기 바이오마커 중 임의의 것에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항체들은 상기 각각의 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명은 또한 개체로부터 분리된 시료에서 상기 바이오마커 중 2개 이상의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하는 방법을 제공한다.

구체적인 일 실시예에서, 상기 방법은 폐선암의 뇌전이를 진단 또는 예측하는 방법일 수 있으며, FN1(Fibronectin 1), MIF(macrophage migration inhibitory factor), PLIN2(Perilipin 2), KLF6(Kruppel Like Factor 6), PFKP(Phosphofructokinase, Platelet), BLVRB(Biliverdin Reductase B), SOX4(SRY-Box Transcription Factor 4), PYGL(Glycogen Phosphorylase L), IMPA2(Inositol Monophosphatase 2), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널이 이용될 수 있다.

구체적인 다른 일 실시예에서, 상기 방법은 소세포폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하는 방법일 수 있고, MGST1(Microsomal Glutathione S-Transferase 1), NGRN(Neugrin), RAB11A(Member RAS Oncogene Family), MORF4L1(Mortality Factor 4 Like 1), SMAD9(SMAD Family Member), LHFPL6(lipoma HMGIC fusion partner L6), MTHFS(Methenyltetrahydrofolate Synthetase), MRPL18(Mitochondrial Ribosomal Protein L18), PEPD(Peptidase D)로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널이 이용될 수 있다.

상기 개체는 폐암의 뇌전이를 진단하기 위한 대상이 되며, 예를 들어 전이의 가능성을 예측하기 위한 대상, 전이의 상태를 진단하기 위한 대상, 예후 예측을 판단하기 위한 대상, 뇌전이 예방 또는 치료용 약제의 투여량을 결정하기 위한 대상, 전이의 진행에 따른 치료 방법을 결정하기 위한 대상 등을 의미한다. 상기 개체는 척추동물인 것일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등 일 수 있으며, 보다 구체적으로, 포유 동물인 것일 수 있고, 예를 들면 인간(Homo sapiens)일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.

상기 바이오마커 수준의 측정은 상기 바이오마커 유전자의 mRNA 수준을 측정하거나 또는 단백질 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 mRNA 수준 측정은 뇌전이를 진단하기 위하여 개체의 시료에서 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것이다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있다. 또한, 상기 단백질 수준 측정은 뇌전이를 진단하기 위하여 개체의 시료에서 상기 바이오마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 바이오마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정할 수 있다. 상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단 백질칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조 직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있다.

일 구체예에 따른 방법은 상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 바이오마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 바이오마커가 대조군 시료와 비교하여 과발현 하는 경우, 폐암의 뇌전이가 발생한 것으로 판단하거나 뇌전이 가능성이 높음을 예측할 수 있다. 구체적인 일 실시예에서, 폐암 조직에서의 상기 바이오마커의 발현 수준은 전이된 뇌조직에서의 바이오마커 발현 양상과 동일함을 확인함으로써, 뇌전이암이 폐암 조직으로부터 유래된 세포의 전이에 의해서 발생한 것임을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 바이오마커의 정확도 및 민감도를 향상시키기 위하여, 폐암 환자들의 암조직에 대한 단일세포 전사체 분석을 통해 뇌전이 유무에 따른 종양세포의 분자적 특성 차이를 기반으로 폐암 뇌전이를 진단할 수 있는 바이오마커를 선별하였다.

이에 따라, 본 발명은

뇌전이된 폐암 환자 및 뇌전이되지 않은 폐암환자로부터 각각 분리된 폐암 샘플에 대하여 단일 세포 전사체 분석을 수행하는 단계;

단일 세포 전사체 분석으로 얻은 데이터 통해 유전자 복제수 변이 (copy number variation, CNV)의 증폭을 나타내는 종양 세포를 동정하는 단계; 및

동정된 종양 세포를 대상으로 단일 세포 수준 또는 슈도-벌크(pseudo-bulk) 수준에서 뇌전이된 폐암 환자 유래 종양 세포와 뇌전이되지 않은 폐암 환자 유래 종양 세포간의 발현 차이를 나타내는 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 선별하는 단계; 를 포함하는 뇌전이 폐암을 진단 또는 예측하기 위한 바이오마커 선별 방법을 제공한다.

상기 바이오마커 선별 방법은 도 1을 참고하여 추가적으로 설명될 수 있다.

상기 종양 세포를 동정하는 단계는 구체적으로 상기 분석된 단일 세포 전사체 데이터 기반으로 세포들을 클러스터 단위로 나누고, 기존에 알려져 있는 세포 유형 특이적 유전자 발현 정도를 기준으로 세포 유형을 분류한 후(Cell annotation), 이 중 상피 세포의 유전자 발현을 보이는 클러스터에 속한 세포들 중 유전자 복제수 변이(copy number variation)의 증폭을 나타내는 세포를 종양 세포로 동정할 수 있다.

본 발명은 상기 동정된 순수 종양 세포를 대상으로 뇌전이에 따른 유전자의 발현 차이를 비교하여 선별된 바이오마커 및 환자간 종양 비율의 불균형을 보정한 순수 종양 세포의 슈도-벌크 데이터 기반으로 선별된 바이오마커를 비교하여 중복된 바이오마커를 선택함으로써, 기존 종양 세포뿐만 아니라 암 미세 환경 세포도 섞인 형태의 Bulk 데이터 기반으로 선별된 바이오마커의 한계를 넘어 폐암 뇌전이 진단의 정확성 및 민감도를 향상시킬 수 있다.

상기 방법은 폐암, 구체적으로 폐선암 또는 소세포폐암의 전이를 진단 또는 예측하기 위한 바이오마커를 선별하는데 적용될 수 있다.

종양 세포 및 암 미세 환경 세포가 섞인 형태의 벌크 데이터 기반으로 선별된 바이오마커의 한계를 넘어 순수 종양 세포에서 선별된 바이오마커를 제공함으로써, 폐암 뇌전이 진단의 정확성 및 민감도를 향상시켰다.

도 1은 본 발명의 폐암 뇌전이 진단을 위한 바이오마커의 선별 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 뇌전이 유무에 따른 폐암 환자의 단일세포 전사체 데이터를 이용하여 종양세포 및 정상 상피세포의 세포 하위 유형을 결정한 그래프이고, 도 2b는 세포 유형별 특이적 마커 유전자를 나타낸 것이다.
도 3은 단일 종양 세포 수준의 분석 및 슈도-벌크 수준의 분석의 결합을 통해 선별된 바이오마커를 나타낸 것이다. 상기 바이오마커들은 뇌전이 폐암 환자에서 상대적으로 발현량이 높은 바이오마커를 선별한 것이다.
도 4는 뇌전이가 있는 폐암 환자의 폐조직에서 특이적으로 발현이 증가하는 유전자 마커가 실제 폐선암에서 전이된 뇌조직 샘플에서도 발현되는지를 확인한 데이터이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예 1] 단일 세포 전사체 분석을 통한 바이오마커 선별

1-1 폐암 조직 샘플의 준비

삼성 의료원의 기관 검토위원회 (IRB) (IRB no. 2010-04-039-041)로부터 검토 및 승인 받았으며, 병리학적으로 사전 치료 없이 폐암의 뇌전이 진단을 받은 34명의 환자 및 뇌전이 되지 않은 폐암 환자 43명을 대상으로 각각 37개 및 50개의 폐암 조직 샘플을 수득하였다. 구체적으로, 전이성 림프절 및 폐암 조직은 기관지 초음파 및 기관지경을 통해 진행된 병기 폐암 환자로부터 수집하였다. 흉막액은 악성 흉수를 통해 폐암 환자로부터 획득되었다. 수술 당일, 기계적 해리 및 효소 소화를 사용하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이후, Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Sweden) 분리로 죽은 세포를 제거하였다.

1-2 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 전처리

제조사의 제공하는 실험 프로토콜에 따라 GemCode 시스템 (10x genomics, Pleasanton, CA, USA)을 사용하여 각각의 세포 현탁액으로부터 총 5,000개의 세포를 타겟으로 하여 3' 단일 세포 RNA 서열 분석을 수행하였다. GemCode 단일 세포 RNA 시퀀싱의 판독은 Cell Ranger 툴킷 (버전 5.0.0)에 의해 GRCh38 인간 참조 게놈으로 맵핑(mapping) 되었다. 표준화 과정을 거치지 않은 유전자-세포-바코드 매트릭스로부터 계산된 미토콘드리아 유전자(20% 미만) 및 유전자 카운트(200 초과)의 품질 척도를 적용하였다. 또한, 하나의 Gem에 두개 이상의 세포가 캡쳐되는 경우(doublet)를 제거하기 위해 R 패키지 Scrublet 툴킷(Samuel L. Wolock et al., 2019)에서 doublet으로 판정된 세포들을 제거하였다. 각 세포의 유전자에 대한 UMI 수를 TPM(transcript per million)-유사 값으로 로그 표준화한 후 log(TPM+1)의 척도로 유전자 발현을 정량하였다. 하위 분석을 위해 표준적인 세포 주기 관련 유전자를 바탕으로 세포 주기 발현 값(cell cycle score)을 계산해 이의 영향을 완화하는 회귀 분석을 적용하는 Z-변환(z-transformation)을 수행하여 유전자 발현을 보정하였다.

1-3 세포 클러스터링

상기 실시예 1-2의 단일 세포 RNA-시퀀싱 결과를 감독되지 않은 클러스터링을 사용하여 분석하였고, 그 결과 종양 및 주변 면역환경 영역에 의해 크게 구분된 하위 클러스터를 나타냈다(도 2a). 구체적으로, R 패키지 Seurat R 툴킷(Tim Stuart et al., 2019)에서 가변 유전자를 선택하여 주성분(Principal Components, PC)을 계산하는데 사용하였다. Seurat 패키지의 R function ElbowPlot에 의해 세포 클러스터링을 위한 주성분의 하위 집합 (PC=40)을 선택하였으며 UMAP 시각화에 사용하였다. 알려진 마커 유전자의 발현 정도를 가지고 각 클러스터의 세포 유형을 정의하고 분류하였다(도 2b).

1-4 종양 세포 선별

상기 세포 유형 중 상피 세포 마커의 발현을 보이는 클러스터에 속한 세포들 중 유전자 복제수 변이 (copy number variation)의 증폭을 나타내는 종양 세포를 동정하였다. 구체적으로, 각 샘플별로 R 패키지 CopyKAT 툴킷(Ruli Gao et al., 2021)을 가지고 주변 면역환경 세포들의 유전자 발현 양상을 대조군으로 활용하여 상피 세포들의 유전자 복제수 변이를 예측하였다. 계산에 사용된 파라미터는 기본값(default)을 사용하되 세포 필터링을 위한 염색체당 최소 유전자 수(ngene.chr)는 3으로 느슨하게, 분할(segmentation) 매개변수(KS.cut)는 0.05으로 엄격하게 조정하여 사용하였다. 예측 결과에서 이수체(aneuploid)로 관찰된 상피 세포들을 종양 세포로 선별하였다.

1-5 폐암의 종류에 따른 종양 세포의 분류 및 뇌전이 특이적 바이오 마커 선별

폐암의 종류에 따른 2차 샘플 분류를 수행하여 폐선암 및 소세포폐암 각각에 대해 뇌전이 발생 여부에 따른 유전자 발현 비교를 수행하였다. 바이오마커의 선별을 위해, Seurat 패키지의 R function FindMarkers를 이용하여 두 그룹 사이의 log (배수 변화) (logFC)를 계산하였다(뇌전이된 환자 유래 종양 세포 대 뇌전이되지 않은 환자 유래 종양 세포). 윌콕슨 부호순위 검정과 Bonferroni correction에 의해 차이의 중요성을 결정하였다. 단일 세포 수준에서의 뇌전이 진단을 위한 바이오마커로 발현을 가지는 세포의 비율(pct)이 0.25보다 크면서 FDR 값과 P 값이 0.01 미만이고 logFC> 0.25인 유전자, 슈도-벌크 수준에서는 발현을 가지는 샘플의 비율 (pct)이 0.25보다 크면서 P 값이 0.01 미만이고 logFC> 0.25인 유전자를 선택하였다.

구체적으로, 폐암에 종류 및 뇌전이 발생 여부에 따라 샘플을 분류한 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다. 폐선암 및 소세포폐암 유래 종양 세포군 각각에 대하여 뇌전이 발생 여부에 따라 발현량의 차이가 발생하는 유전자 또는 단백질을 바이오마커로 선별하였다. 그 결과, 폐선암의 뇌전이 진단을 위한 바이오마커로 262개의 단백질이 선별되었고, 소세포폐암의 뇌전이 진단을 위한 바이오마커로 353개의 단백질이 선별되었다(도 3a). 상기 단일 세포 수준에서의 바이오마커를 선별함과 동시에, 종양 세포를 샘플 단위의 슈도-벌크 수준으로 변환하여 바이오마커를 선별한 결과, 폐선암 및 소세포폐암 각각의 뇌전이 진단을 위한 바이오마커로 13개 및 19개의 단백질이 선별되었다(도 3b).

최종적으로, 폐선암 및 소세포폐암 각각의 뇌전이 진단을 위한 단일 세포 수준에서 선별된 바이오마커 및 슈도-벌크 수준에서 선별된 바이오마커 중 중복되는 10개 및 9개의 바이오마커를 선별하였다. 상기 폐선암 및 소세포폐암의 뇌전이 진단을 위한 바이오마커의 상대 발현 평균값을 이해 표 1 및 2에 각각 나타내었다.

폐선암 유전자	단일세포 수준					슈도-벌크 수준				UMI 평균발현양
폐선암 유전자	log FC	P-값	FDR	pct.1	pct.2	log FC	P-값	pct.1	pct.2	뇌전이된 환자	뇌전이되지 않은 환자
FN1	0.683	0	0	0.438	0.294	0.763	0.007	0.966	0.88	7.9	3.9
MIF	0.384	0	0	0.997	0.991	0.301	0.009	1	1	87.4	40.7
PLIN2	0.38	0	0	0.597	0.384	0.583	0	0.966	0.92	4	1
KLF6	0.376	0	0	0.924	0.853	0.374	0.001	1	1	24.6	10.4
PFKP	0.373	0	0	0.653	0.445	0.281	0.009	1	0.96	4.8	1.1
BLVRB	0.362	0	0	0.899	0.815	0.321	0.003	0.966	0.96	10.9	4.1
SOX4	0.305	0	0	0.928	0.856	0.458	0.004	0.966	0.92	24.8	14.6
PYGL	0.303	0	0	0.438	0.131	0.251	0.002	0.966	0.84	2	0.3
IMPA2	0.298	0	0	0.677	0.435	0.254	0.003	0.966	0.88	3.7	1
VEGFA	0.295	0	0	0.822	0.677	0.296	0.006	0.966	0.92	8.9	4.5

소세포폐암 유전자	단일세포 수준					슈도-벌크 수준				UMI 평균발현양
소세포폐암 유전자	log FC	P-값	FDR	pct.1	pct.2	log FC	P-값	pct.1	pct.2	뇌전이된 환자	뇌전이되지 않은 환자
MGST1	0.692	0	0	0.749	0.415	0.572	0.01	1	1	6.9	1.6
NGRN	0.481	0	0	0.908	0.745	0.409	0.006	1	1	5.2	2.1
RAB11A	0.451	0	0	0.87	0.733	0.477	0.002	1	1	5.1	1.9
MORF4L1	0.394	0	0	0.937	0.842	0.365	0.004	1	1	6.1	2.9
SMAD9	0.323	0	0	0.659	0.393	0.397	0.01	1	1	1.8	0.8
LHFPL6	0.322	0	0	0.419	0.082	0.399	0.002	1	1	0.9	0.1
MTHFS	0.286	0	0	0.605	0.372	0.285	0.001	1	1	1.6	0.6
MRPL18	0.273	0	0	0.843	0.695	0.283	0.007	1	1	3.1	1.8
PEPD	0.26	0	0	0.571	0.465	0.289	0.004	1	1	2.5	0.8

[실시예 2] 선별된 바이오마커를 이용한 폐암의 뇌전이 검증 및 진단

뇌전이 폐암환자의 폐암 조직 샘플 및 뇌전이암 샘플에서의 선별된 바이오마커의 종양 세포에서의 발현 양상을 비교하였다. 그 결과, 두 샘플에서 동일한 바이오마커 발현 양상을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 뇌전이암이 폐암 조직에서 유래한 세포에 의한 것임을 입증함과 동시에, 선별된 바이오마커가 폐암의 뇌전이를 진단하는데 이용될 수 있음을 나타낸다.

Claims

FN1(Fibronectin 1), MIF(macrophage migration inhibitory factor), PLIN2(Perilipin 2), KLF6(Kruppel Like Factor 6), PFKP(Phosphofructokinase, Platelet), BLVRB(Biliverdin Reductase B), SOX4(SRY-Box Transcription Factor 4), PYGL(Glycogen Phosphorylase L), IMPA2(Inositol Monophosphatase 2), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오 마커 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암의 뇌전이를 진단하거나 예측하기 위한 바이오마커 패널.
MGST1(Microsomal Glutathione S-Transferase 1), NGRN(Neugrin), RAB11A(Member RAS Oncogene Family), MORF4L1(Mortality Factor 4 Like 1), SMAD9(SMAD Family Member), LHFPL6(lipoma HMGIC fusion partner L6), MTHFS(Methenyltetrahydrofolate Synthetase), MRPL18(Mitochondrial Ribosomal Protein L18), PEPD(Peptidase D) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암의 뇌전이를 진단하거나 예측하기 위한 바이오마커 패널.
제 1항에 있어서,
상기 폐암은 폐선암인 바이오마커 패널.
제 2항에 있어서,
상기 폐암은 소세포폐암인 바이오마커 패널.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것인 바이오마커 패널.
뇌전이된 폐암 환자 및 뇌전이되지 않은 폐암환자로부터 각각 분리된 폐암 샘플에 대하여 단일 세포 전사체 분석을 수행하는 단계;
단일 세포 전사체 분석으로 얻은 데이터 통해 유전자 복제수 변이 (copy number variation, CNV)의 증폭을 나타내는 종양 세포를 동정하는 단계; 및
동정된 종양 세포를 대상으로 단일 세포 수준 또는 슈도-벌크(pseudo-bulk) 수준에서 뇌전이된 폐암 환자 유래 종양 세포와 뇌전이되지 않은 폐암 환자 유래 종양 세포간의 발현 차이를 나타내는 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 선별하는 단계; 를 포함하는 뇌전이 폐암을 진단 또는 예측하기 위한 바이오마커 선별 방법.
제 6항에 있어서,
상기 단일 세포 수준 또는 슈도-벌크 수준에서 각각 선별된 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 비교하여 중복되는 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 바이오마커로 선별하는 것인, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 폐암은 폐선암 또는 소세포폐암인, 방법.
개체로부터 분리된 시료에서 FN1(Fibronectin 1), MIF(macrophage migration inhibitory factor), PLIN2(Perilipin 2), KLF6(Kruppel Like Factor 6), PFKP(Phosphofructokinase, Platelet), BLVRB(Biliverdin Reductase B), SOX4(SRY-Box Transcription Factor 4), PYGL(Glycogen Phosphorylase L), IMPA2(Inositol Monophosphatase 2), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및
상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하는 방법.
개체로부터 분리된 시료에서 MGST1(Microsomal Glutathione S-Transferase 1), NGRN(Neugrin), RAB11A(Member RAS Oncogene Family), MORF4L1(Mortality Factor 4 Like 1), SMAD9(SMAD Family Member), LHFPL6(lipoma HMGIC fusion partner L6), MTHFS(Methenyltetrahydrofolate Synthetase), MRPL18(Mitochondrial Ribosomal Protein L18), PEPD(Peptidase D)로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및
상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 뇌전이를 진단 또는 예측하는 방법.
제 9항에 있어서,
상기 폐암은 폐선암인 방법.
제 10항에 있어서,
상기 폐암은 소세포폐암인 방법.
제 9항 또는 제10항에 있어서,
상기 2 이상의 바이오마커가 대조군에 비하여 상대적인 발현량이 높은 경우, 뇌전이되었거나 뇌전이 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.