KR20230120122A - 암 및 암 감수성의 검출을 위한 새로운 바이오마커로서의 dna 손상 민감도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 검출을 위한 바이오마커로 사용될 수 있는 마커에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암 또는 암 감수성 또는 DNA 손상 반응(DDR) 교란을 특징으로 하는 기타 질환 상태에 대한 바이오마커로서 게놈 DNA 손상 민감도(DDS)의 분석에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 또한 암 또는 보다 일반적으로 게놈 DNA 민감도(DDS)를 손상시키는 것에 대한 감수성에 대한 약물, 위험 인자 및/또는 환경적 영향의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 암의 검출을 위한 바이오마커(biomarker)로서 사용될 수 있는 마커에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암 또는 암 감수성(cancer susceptibility) 또는 DNA 손상 반응(DNA damage response; DDR) 교란을 특징으로 하는 기타 질환 상태에 대한 바이오마커로서 게놈 DNA 손상 민감도(DNA damage sensitivityl; DDS)의 분석에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 또한 암에 대한 감수성 또는 보다 일반적으로 게놈 DNA 손상 민감도(DDS)를 손상시키는 위험 인자에 대한 감수성에 대한 약물(medication), 위험 인자 및/또는 환경적 영향의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있다.
DNA 손상 민감도의 진단 및 예후 역할이 최근에 조사되었다. 본 발명에서는 증식성 질환(proliferative disease)의 마커로서 게놈 DNA 손상 민감도(DDS)를 결정하는 방법을 구현할 수 있었다. 상기 방법은 단일 세포 겔 전기영동(SCGE)을 기반으로 한다.
혜성 검정(comet assay)이라고도 하는 SCGE는 DNA 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단과 같은 손상된 DNA를 직접 시각화 및 정량화를 위한 민감한 방법이다. 검사 또는 치료될 세포는, 예를 들어, 아가로스에 매립될 수 있으며, 예를 들어, 물체 담체(carrier) 또는 필름 상과 같은 담체 물질 상에 소위 겔 스팟으로 증착될 수 있다. 그런 다음, 매립된 세포를 용해하고 알칼리성 방식으로 처리하여 DNA를 변성시키거나 대안적으로 중성 환경에 보관하여 세포막과 대부분의 단백질을 제거한다. 두 가지 방법 모두 핵 매트릭스에 연결된 슈퍼코일 DNA를 생성하며, 구조는 때때로 뉴클레오이드라고 지칭된다. 후속 전기영동은 전기장에 노출될 때 손상된 DNA가 뉴클레오이드로부터 스스로 제거되도록 유도하며, 즉 음전하를 띤 DNA 단편이 플러스 극으로 이동하여 소위 "혜성"을 생성한다. 혜성의 머리에서 꼬리로 이동한 DNA의 양은 정량화되어 샘플에 존재하는 DNA 손상의 정량적 척도로서 작용한다. 혜성 꼬리의 성공적인 정량화는 주로 (i) 겔-전기영동 시스템의 성능 및 (ii) DNA 시각화 및 정량화 방법, 예를 들어, 형광 현미경 및 이미징 소프트웨어의 유형에 의해 영향을 받으며, 수동, 부분 자동화 또는 완전 자동화 방식으로 구현된다. 고성능 겔 전기영동 시스템은, 예를 들어, WO 2016/141 495로부터 공지되어 있다. DNA 손상에 대한 대상체(subject)를 스크리닝하기에 적합한 단일 세포 겔 전기영동 장치 및 방법은 WO 2019/135 008로부터 공지되어 있다.
근본적인 생물학적 원리는 건강한 개체와 암 환자의 게놈 DNA가 전자기 방사선과 같은 방사선에 다르게 반응한다는 것이다. 방사선에 의한 손상에 대한 DNA 민감도와 암에 대한 사람의 감수성 사이의 상관관계는 WO 2014/041340 A1에 기재되어 있다. 주요 차이점은 본 발명자들이 그 상관관계가 역전된다는 것을 보여줄 수 있다는 것이다. 본 발명의 방법을 사용하면 건강한 대상체의 건강한 대리 세포, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 암 환자의 건강한 대리 세포, 예를 들어, PBMC와 비교하여 전자기 방사선에 대한 더 높은 민감도를 갖는다는 것을 보여줄 수 있다. 이것은 지금까지 공지되지 않았다. 종양 발생 과정에서 세포의 염색체 환경이 변화하고 있다고 제안되었다. 이는 DNA 과메틸화 또는 저메틸화, DNA 접근성 및 전사 결합 인자 또는 히스톤 변형을 포함한 다양한 방식으로 염색질 구조에 영향을 미친다(참조: Zhao et al. 2020; Mao et al. 2016; for review: Brock et al. 2007; McAnena et al. 2016). 그러나, 게놈 DNA가 방사선에 덜 민감해진다는 것은 기재되지 않았다.
본 발명의 목적은 강력한 예측력으로 암의 조기 및 고감도 검출을 위한 바이오마커를 제공하는 것이다. 이 목적은 방사선에 대한 DNA 손상 내성의 검출 및 본 발명의 방법을 사용하여 건강한 대조군 세포의 게놈 DNA가, 모든 암 단계의 암 환자 또는 암 위험이 증가된 개체의 세포의 게놈 DNA보다 더 민감하다는 통찰력에 의해 달성된다.
본 발명은 특히 증식성 질환 및 증식성 질환에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성을 결정하는 것과 관련된 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro) 방법을 지칭하며, 여기서 게놈 DNA의 내성 증가는 증식성 질환 및/또는 감수성 증가를 나타낸다. 즉, 본 발명은 증식성 질환 및 이의 감수성에 대한 바이오마커로서 (방사선에 의해 유도된) 게놈 DNA 손상 민감도의 생체외 또는 시험관내 용도를 지칭하며, 여기서, 게놈 DNA 손상 민감도의 감소는 증식성 질환 및/또는 이의 감수성의 증가를 나타낸다. 본 발명의 방법은 암 스크리닝, 암의 (암의 초기 단계의) 조기 진단, 치료 후 암의 재발 및 관해에 대한 모니터링에 적합하다. 종양을 포함하는 대부분의 암은 단계 0 내지 IV의 5개의 광범위한 그룹으로 단계화된다. 심지어 매우 초기 단계(예: 단계 0 및/또는 I)도 본 발명을 사용하여 검출할 수 있음을 보여줄 수 있다.
암 단계는 종양이 얼마나 큰지, 그리고 이것이 확산되는 경우와 같은 암의 정도를 지칭한다. 상기 정도는 종종 주로 크기와 국소화를 기준으로 평가되지만, 조직병리학적 평가와 같은 다른 인자도 종양 질환의 전반적인 평가에서 중요한 역할을 한다. 종양 "단계"에 대한 지식은 악성 종양 질환의 치료 계획과 예후에 중요하다. 악성 종양의 UICC(국제 암 연합(Union internationale contre le cancer)) TNM 분류는 암의 확산 정도를 분류하기 위한 전 세계적으로 인정된 표준이다. T 범주는 원발성 종양 부위 및 크기를 기재하고, N 범주는 국소 림프절 침범을 기재하고, M 범주는 원격 전이성 확산의 존재 여부를 기재한다.
바이오마커는 또한 암 치료에 대한 반응을 모니터링하거나 최상의 치료 전략을 찾기 위해 특정 치료 옵션에 대한 반응 가능성(반응성)을 조사하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 용도는 암 또는 보다 일반적으로 게놈 DNA 손상 민감도(DDS)를 손상시키는 위험 인자에 대한 감수성에 대한 약물, 위험 인자 및/또는 환경적 영향의 효과에 관한 연구일 수 있다. 따라서, 세포, 박테리아, 효모, 원생동물, 식물 또는 동물은 후보 물질(가능한 활성제, 위험 인자)과 접촉하게 될 수 있다. 그 후, 본 발명에 따른 방법은 후보 물질이 게놈 DNA 손상 민감도(DDS) 및 암 감수성, 암 진행 또는 증식성 질환의 치료에 영향을 미치는지 여부를 스크리닝하는 데 사용된다.
용어 "증식성 질환"은 본원에서 종양, 특히 고형 종양, 암, 악성 종양 및 그들의 전이를 지칭한다. 증식성 질환의 예는 선암종(adenocarcinoma), 맥락막 흑색종(choroidal melanoma), 급성 백혈병(acute leukemia), 청신경초종(acoustic neurinoma), 팽대부 암종(ampullary carcinoma), 항문 암종(anal carcinoma), 성상세포종(astrocytoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer), 데스모이드 종양(desmoid tumor), 방광암(bladder cancer), 기관지 암종(bronchial carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC), 유방암(breast cancer), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 코퍼스 암(corpus cancer), CUP-증후군(미지의 원발성 암종), 결장직장암(colorectal cancer), 소장암(small intestine cancer), 소장 종양(small intestinal tumors), 난소암(ovarian cancer), 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), 뇌실막종(ependymoma), 상피암 유형(epithelial cancer types), 유잉 종양(Ewing's tumors), 위장 종양(gastrointestinal tumors), 위암(gastric cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 담낭 암종(gallbladder carcinomas), 자궁암(uterine cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁경관(cervix), 교모세포종(glioblastomas), 부인과 종양(gynecologic tumors), 귀, 코 및 인후 종양(ear, nose and throat tumors), 혈액학적 신생물(hematologic neoplasia), 모발 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 요도암(urethral cancer), 피부암(skin cancer), 피부 고환암(skin testis cancer), 뇌 종양(brain tumors)(신경교종(gliomas)), 뇌 전이(brain metastases), 고환암(testicle cancer), 뇌하수체 종양(hypophysis tumor), 카르시노이드(carcinoids), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 후두암(laryngeal cancer), 생식 세포 종양(germ cell tumor), 골암(bone cancer), 결장직장 암종(colorectal carcinoma), 두경부 종양(head and neck tumors)(귀, 코 및 인후 부위의 종양), 결장 암종(colon carcinoma), 두개인두종(craniopharyngiomas), 구강암(oral cancer)(입 부위 및 입술의 암), 중추신경계 암(cancer of the central nervous system), 간암(liver cancer), 간 전이(liver metastases), 백혈병(leukemia), 눈꺼풀 종양(eyelid tumor), 폐암(lung cancer), 림프절암(lymph node cancer)(호지킨(Hodgkin's)/비호지킨(Non-Hodgkin's)), 림프종(lymphomas), 위암(stomach cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 악성 신생물(malignant neoplasia), 위장관 악성 종양(malignant tumors gastrointestinal tract), 유방 암종(breast carcinoma), 직장암(rectal cancer), 수모세포종(medulloblastomas), 흑색종(melanoma), 수막종(meningiomas), 호지킨병(Hodgkin's disease), 균상 식육종(mycosis fungoides), 비강암(nasal cancer), 신경종(neurinoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 신장암(kidney cancer), 신장 세포 암종(renal cell carcinomas), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 식도 암종(esophageal carcinoma), 골용해성 암종(osteolytic carcinomas) 및 골형성 암종(osteoplastic carcinomas), 골육종(osteosarcomas), 난소 암종(ovarian carcinoma), 췌장 암종(pancreatic carcinoma), 음경암(penile cancer), 형질세포종(plasmocytoma), 두경부의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck; SCCHN), 전립선암(prostate cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 직장 암종(rectal carcinoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 질암(vaginal cancer), 갑상선 암종(thyroid carcinoma), 슈니버거병(Schneeberger disease), 식도암(esophageal cancer), 척추암(spinalioms), T-세포 림프종(T-cell lymphoma)(균상 식육종), 흉선종(thymoma), 관 암종(tube carcinoma), 안구 종양(eye tumors), 요도암(urethral cancer), 비뇨기과 종양(urologic tumors), 요로 상피 암종(urothelial carcinoma), 외음부암(vulva cancer), 사마귀 외관(wart appearance), 연조직 종양(soft tissue tumors), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부 암종(cervical carcinoma) 및 혀암(tongue cancer)이다. 본원에 사용된 암은 신체의 다른 부위를 침범하거나 이로 확산될 가능성이 있는 비정상적인 세포 성장을 수반하는 질환을 지칭한다.
암은 종양의 기원으로 추정되는 세포의 유형에 따라 분류될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 생체외 또는 시험관내 방법은 암종(상피 세포로부터 유래), 육종(결합 조직 또는 골수 외부의 중간 엽 세포에서 유래하는 각각의 세포로부터 발생), 림프종 및 백혈병(조혈 세포로부터 발생), 생식 세포 종양 및 모세포종(미성숙 "전구체" 세포 또는 배아 조직으로부터 유래)과 같은 증식성 질환의 바이오마커로서 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성을 결정하는 것에 관한 것이다.
암종 그룹에는 특히 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암 및 결장암이 포함된다. 육종 그룹에는 특히 골암 및 연골, 지방 및 신경 세포에서 유래된 암이 포함된다. 본 발명이 관련된 증식성 질환은 특히 방광암, 유방암, 결장암 및 직장암, 자궁내막암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 흑색종, 비호지킨 림프종, 췌장암, 전립선암, 및 갑상선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 본원에 기재된 바이오마커는 바람직하게는 고형 종양, 특히 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암 또는 이들 암 중 하나에 대한 감수성 증가를 검출하는 데 사용된다. 유방암은 비침습성 및 침습성 유관 암종(non-invasive and invasive ductal carcinoma) 및 잠복 침습성 유방암(occult invasive breast cancer)을 포함한다. 용어 "폐암"은 소세포 폐암(small cell lung cancer; SCLC)과 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함한다. 결장직장암 및 전립선암은 주로 장, 결장, 직장 또는 각각 전립선 내의 선암종을 지칭한다.
손상에 대한 게놈 DNA의 민감도를 결정하는 것은 인간의 악성 종양을 스크리닝하고 모니터링하는 데 도움이 될 수 있다. 오늘날에는, 예를 들어, 친숙한 사건, 유전적 소인(유전적 변이, 유전적 결함) 또는 환경적 영향(예: 독소 노출 또는 흡연)으로 인해 암 위험이 높은 사람을 식별할 수 있다. 본 발명은 간단한 검사로 이러한 사람들을 모니터링 할 수 있다. 암 치료에 대한 반응을 모니터링하는 것은 바이오마커가 또한 성공적인 항암 치료 및 완화 후 암의 재발을 비침습적 방식으로 모니터링하는 데 사용될 수 있기 때문에 본 발명의 또 다른 가능한 적용일 수 있다. 본 발명의 하나의 목적은 또한 성공적인 치료 후 암의 재발 여부를 확인함을 의미하는 후속 치료이기도 한다.
본 발명의 하나의 구현예는 증식성 질환 및 증식성 질환에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성을 결정하는 것과 관련된 생체외 또는 시험관내 방법을 지칭하며, 여기서 게놈 DNA는 환자의 건강한 대리 세포로부터 유래된다. 샘플은 암에서 그 자체로 수득되지 않는다. 게놈 DNA는 전혈 세포 또는, 예를 들어, PBMC 또는 보다 구체적으로 주로 림프구를 함유하는 말초 혈액 세포에서 유래되는 것이 바람직하다. 샘플 중 세포 농도는 스팟당 약 200-400 세포일 수 있다. 본 발명 내에서, 하나의 샘플은 아가로스 겔 내의 하나의 스팟을 나타내는 것이 바람직하다. 대조군 및 이중 측정의 경우, 개체당 더 많은 혈액을 수집하고 이 혈액 시험편을 본 발명에 따른 방법 내에서 여러 샘플로 나누는 것이 적합할 수 있다.
게놈 DNA 내에 DNA 손상을 도입하는 데 사용되는 방사선은 UV-광 및 보다 바람직한 UVB 방사선일 수 있다. 가장 광범위하게 10-400㎚로서 정의되는 자외선의 전자기 스펙트럼은 여러 범위로 세분화될 수 있다. 하나는 파장이 280-315nm인 중간 범위인 UVB이다.
증식성 질환 및 증식성 질환에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성을 결정하는 것과 관련된 생체외 또는 시험관내 방법은 암 감수성에 대한 화학적 화합물, 약물 및/또는 환경적 영향의 효과를 시험하는 데 적합할 수 있다.
DNA 손상을 정량적으로 결정하는 것으로 공지된 상이한 방법이 있으며, 그들 대부분은 종양에서 수득된 종양 DNA 또는 말초 혈액의 순환성 종양 DNA(ctDNA)를 분석한다. 이들 방법은 대부분 종양 DNA의 분자 수준에서 서열 변경을 검출하는 것을 기반으로 한다. 이들은 순환성 종양 세포 또는 ctDNA가 서열분석을 위해 혈액에서 포획되어야 할 때 낮은 민감도로 고통받을 수 있다. 여기에서 PBMC와 같은 살아있는 혈액 세포를 수집하고, 이들을 챌린지하고, 최종적으로 단일 세포 겔 전기영동(혜성 검정이라고도 함)에서 검정하여 DNA 손상의 후속 결정을 평가함으로써 완전히 다른 접근법이 사용된다. 자동화된 분석이 수행될 수 있다. 이는 의미를 강화하고, 단일 세포 겔 전기영동("혜성 분석") 테스트의 성능, 상호 운용성 및 일정 가능성을 보장한다. 본 방법은 암에 대한 적어도 하나의 추가 바이오마커의 결정과 결합될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예는 증식성 질환 및 이의 감수성에 대한 바이오마커로서 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성의 용도를 지칭하며, 여기서 DNA 손상은 단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 정규화된 DNA 꼬리(tail)로서 결정된다. 이러한 검정은 다음과 같이 수행될 수 있다: 액체 샘플은 주로 아가로스 겔 내에 있는 담체 플레이트에 적용한다. 샘플은 아가로스 겔에 도입되기 전에 조사될 수 있다. 그러나, 샘플은 아가로스 겔에 도입 후 방사선에 노출되는 것이 바람직하다. 그 후, 샘플 내의 세포를 용해시킨다. 담체 플레이트는 겔 전기영동 장치의 적어도 한 쌍의 전극에 의해 생성된 균일한 전기장에 배치한다. 담체 플레이트 상에 수용된 샘플의 위치에서 생성된 전기장의 세기 및 방향을 제어함으로써 단일 세포 겔 전기영동(SCGE)이 수행된다. 단일 뉴클레오이드는 혜성이라고도 하는 흰색 점으로 표시된다(점의 색상은 염색 또는 이미징에 따라 다를 수 있다). 각각 단일 세포를 나타내는 단일 혜성은 한쪽에는 머리를, 다른 쪽에는 꼬리를 보여준다. 혜성의 방향은 전기장에서 단일 세포의 방향에 따라 달라진다. 혜성/단일 세포의 꼬리와 머리 사이의 비율로부터 DNA 손상이 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성을 결정하기 위한 생체외 또는 시험관내 방법으로서,
a) 혈액 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플의 혈액 세포를 조사(irradiating)하는 단계,
c) 세포 용해를 수행하는 단계, 및
d) 단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 게놈 DNA 손상을 결정하는 단계를 포함하는, 방법을 지칭한다.
상기 방법 내에서, 게놈 DNA의 증가된 내성은 증식성 질환 및/또는 증식성 질환에 대한 감수성 증가를 나타낸다. 전혈 샘플 또는 단리된 말초 혈액(단핵) 세포를 함유하는 샘플이 이 방법에 적합하다. 액체 샘플, 소위 액체 생검을 사용하는 것이 가장 적합하다.
샘플 내의 세포는 조사된다. 사용된 방사선은 UV 방사선, 바람직하게는 UVB 범위일 수 있다. 방사 전후에, 샘플의 세포는 아가로스 겔에 매립된다. 조사 직후, 세포가 용해된다. 하나의 구현예는 방법을 지칭하며, 여기서 세포 용해는 혈액 세포의 조사 후 10분 미만, 바람직하게는 7분 미만 또는 5분 미만, 더욱 바람직하게는 3분 미만 내에 일어난다. 본원에 사용된 세포 용해는 세포의 개방을 지칭한다. 용해는 효소 또는 세제 또는 기타 카오트로픽제(chaotropic agent)에 의해 영향을 받을 수 있다. 반복적인 동결 및 해동, 초음파 처리, 압력 또는 여과에 의해서와 같이 세포막의 기계적 파괴가 또한 사용될 수 있다. 그러나, DNA를 변성시키거나 분해하는 기계적 전단력(shear force)은 피하는 것이 바람직하다.
전자기 방사선은 암 환자의 각 세포보다 건강한 사람의 세포에서 더 많은 DNA 손상을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 건강한 피실험자의 세포가 암 환자의 세포보다 손상에 더 취약하다는 것은 매우 놀라운 일이다. 최첨단 기술에서는 반대 효과가 제시된다, 예를 들어 (참조: Anderson et al. 2014 (Anderson D, Najafzadeh M, Gopalan R, et al. Sensitivity and specificity of the empirical lymphocyte genome sensitivity (LGS) assay: implications for improving cancer diagnostics. FASEB J. 2014;28(10):4563-4570. doi:10.1096/fj.14-254748)). 그러나, 발명가들의 결과는 암 환자의 혈액 세포의 게놈 DNA가 건강한 개체의 세포보다 UVB 손상으로부터 더 잘 보호된다는 것을 보여준다.
현재, 이 차이에 대한 명확한 과학적인 합리적 설명은 없다. 상이한 다양한 가설이 있을 가능성이 높다. 암은 종양 세포의 게놈의 병리학적인 변화를 기반으로 한다. 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 순환하는 건강한 세포가 이들 세포가 DNA 손상으로부터 이들의 게놈을 보호하도록 하는 직간접적 신호를 수신할 가능성이 높다. 보호는 후성유전학적 변화 및/또는 DNA 및 히스톤 변형 또는 기타 번역 후 변화에 의해 발생할 수 있다. 이 가설에 기초하여, 순환 혈액의 세포가 어느 단계에서 이러한 직간접적 신호를 수신하기 때문에 암이 신체의 어느 기관에 위치하든 전혀 차이가 없어야 한다. 이는 DDS 바이오마커가 다발성 암 또는 범암 바이오마커가 될 수 있는 큰 가능성을 열어준다.
차이의 원인은 또한 측정 시점일 수도 있다. DNA 손상을 해결하고 게놈 무결성을 유지하기 위해, 세포는 총칭하여 DNA 손상 반응(DDR) 네트워크로서 공지된 복잡한 메커니즘을 개발했다. DNA 손상 반응 네트워크는 세포가 세포 주기를 일시 중지하여 복구 시간을 허용하고, 이들의 DNA 복구 경로를 활성화하고, 복제를 중지하여 손상된 DNA 주형의 복제를 방지하거나, 병변이 너무 심할 경우 세포 사멸을 유발하는 다양한 세포 과정을 포함한다. DNA 손상 반응 네트워크는 DNA 손상을 감지, 처리 및 복구하는 데 필수적이며 암에서 자주 중단된다. DNA 손상 반응 메커니즘이 이미 시작되었는지 여부와 각 세포에서 그들이 얼마나 효과적인지가 결정적일 수 있다. 건강한 세포는 더 효율적으로 복구되지만, 건강한 대상체로부터 유래된 PBMC의 DNA 손상 반응 메커니즘은 암 환자로부터 유래된 세포와 비교하여 현저하게 상이한 시간 방식이어서 DNA 손상 민감도의 측정 가능한 변화를 초래할 수 있다.
본원에 기재된 방법을 사용하는 경우, DNA 손상이 건강한 환자의 대조군 값과 비교하여 적고, DNA 손상이 적을수록 암 감수성이 더 높은 경우 암이 진단된다. 즉, DNA 손상 민감도(DDS)가 건강한 공여자의 대조군 값과 비교하여 낮고, DNA 손상이 적을수록 암 감수성이 더 높은 경우 암이 진단된다. 본원에 기재된 방법에 따르면, DNA 손상의 척도로서 DTN이 개체의 샘플에서 건강한 공여자 샘플의 DNA 손상과 비교하여 적어도 1.05배, 바람직하게는 적어도 1.1배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.15배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.2배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.3배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.4배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.6배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.7배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.8배, 더욱 바람직하게는 적어도 1.9배, 더욱 바람직하게는 적어도 2배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.1배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.2배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.3배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.4배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.5배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.6배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.7배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.8배, 더욱 바람직하게는 적어도 2.9배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.0배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.1배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.2배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.3배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.4배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.5배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.6배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.7배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.8배, 더욱 바람직하게는 적어도 3.9배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 4.0배 감소되는 경우, 암 진단이 이루어진다.
대조군의 경우, 방법이 작업자의 손에 적절하게 작동하는지 확인하기 위해, 참조 샘플(검정내 및 검정간 대조군으로 검증된 샘플)은 항상 (암 검출을 위해 검정될 개체의) 목적 샘플과 함께 사용되어야 한다. 이는 생물학적 또는 진단 검정의 일반적인 특징이다. 이는 동시에 또는 즉시 시험될 사람의 샘플뿐만 아니라, 블랭크 및/또는 건강한 공여자로부터 유래된 샘플 또는 건강한 공여자의 샘플 풀일 수 있는 참조 샘플도 검정된다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 방법의 "단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 게놈 DNA 손상을 결정하는" 단계 d)는 적어도 두 개의 하위 단계, 즉 단일 세포 겔 전기영동을 수행하고 단일 세포 겔 전기영동에 의해 수득된 데이터의 분석을 포함할 수 있다. 단일 세포 겔 전기영동으로 수득된 데이터의 분석은 이미지 평가와 이미지 평가로 수득된 데이터를 사용하는 계산으로 나눌 수 있다.
DNA 손상은 샘플 스팟의 사진을 획득함으로써 평가된다. 한 스팟의 이미지는 여러 개의 단일 샷으로부터 함께 스티칭(stiching)될 수 있다. 아마도, 스팟의 하나의 단일 이미지만이 DNA 손상을 결정하는데 필요할 수 있다. 즉, 각각의 이미지의 하나의 샷, 즉 하나의 사진이 단일 세포를 포함하는 하나의 스팟, 즉 하나의 샘플로부터 촬영된다. 공지된 알고리즘에 의해 결정될 수 있는 "DNA 꼬리 퍼센트(DNA tail Percent; DT%) 또는 올리브 꼬리 모멘트(OTM)"와 같은 이미지 분석으로부터 획득된 데이터는 샘플과 건강한 공여자의 대조군의 DNA 손상 정도를 비교하는 데 사용될 수 있다. 데이터 분석은 Komet7TM 및 CometIVTM과 같은 시판되는 소프트웨어로 수행될 수 있다.
본 발명 내에서, "단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 게놈 DNA 손상을 결정하는" 단계 d)는 DNA꼬리 정규화(DTN)의 비교/평가를 포함하는 것이 바람직하다. DNA꼬리 정규화(DTN)는 UV 노출 후 시점의 DNA 꼬리(DT, 꼬리에서 혜성에 대해 측정된 총 광도의 백분율)%에서 교란되지 않은 상태(또는 대조군 또는 기준선)의 DT%를 뺀 값으로 계산된다. ANDOR에 의한 Komet®을 사용하면, 혜성 옵션의 선택에 따라, 특히 헤드 대칭 옵션의 선택/선택 취소에 따라 결과가 달라질 수 있다. (DT%)의 바람직한 계산은 %헤드DNA = (헤드.OptInten /(해드.OptInten + 꼬리.OptInten))*100을 기준으로 한다. OptInten= 각 영역의 광도 %꼬리-DNA= 100-%헤드DNA.
다소 간단한 알고리즘을 사용할 수 있다. 따라서, 건강한 사람과 환자 또는 각각의 암 의심 환자에서 측정된 값 사이의 절대적인 차이를 결정하고 비교할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 상대적 차이에 기초하거나 개별 실험을 보정하는 것과 같은 다른 알고리즘을 사용하는 것도 가능하다. 그러나, 하나의 구현예는 본 발명에 따른 방법을 지칭하며, 여기서 단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 게놈 DNA 손상을 결정하는 단계는 데이터를 분석하는 방법에 대한 하나의 가능한 알고리즘으로서 DT%의 계산 및 평가를 포함한다.
도 1은 기재된 발명의 방법을 사용하여 수집된 데이터의 그래픽 표현이다. 이것은 19명의 유방암, 23명의 폐암, 42명의 전립선암 및 15명의 결장암 환자와 비교하여 31명의 건강한 공여자로부터 유래된 샘플의 DTN(기준선 값으로 정규화된 UVB 노출 후 DT%)을 도시한다. 박스 플롯은 중앙값(박스 내부 선), 75% 백분위수(박스 상단) 및 25% 백분위수(박스 하단)를 표시하고, 위스커(whisker)는 값의 최소 및 최대를 나타낸다. "+"는 평균을 나타낸다. (A) 가장 두드러진 네 가지 암 유형에서 DTN에 의해 결정된 DNA 손상 민감도를 보여준다. (B) A와 동일한 데이터이지만 공지된 경우 암 단계에 의해 정렬되었다. 유방암 환자 중 단계 0은 단계 I에 포함되었다. 백분율은 샘플 집단 내 빈도를 기재한다.
도 2는 23명의 폐암 및 13명의 양성 종양 환자와 비교하여 31명의 건강한 공여자로부터 유래된 샘플의 DTN(기준선 값으로 정규화된 UVB 노출 후 %DNA 꼬리) 값으로 기재된 발명의 방법을 사용하는 데이터를 도시한다. 각 점은 단일 개체 대상체를 나타낸다. 수평선은 평균을 나타낸다. (A)는 건강한 대조군과 비교하여 폐암 환자 및 양성 코호트의 감수성을 나타낸다. (B) 단계에 의해 정렬된 폐암 샘플이 있는 A와 동일한 데이터. (C) 공지된 경우, 폐암 유형에 의해 그룹화된 A에서와 동일한 폐암 데이터. (D) 단계에 의해 정렬된 유방암 환자 유래 샘플만의 민감도.
본 데이터는 단일 세포 수준에서 DNA 손상의 차이를 정량화하고 마찬가지로 세포 샘플에서 UV 광을 유도하는 DNA 손상에 대한 민감도를 측정하고, 궁극적으로 결과를 사용하여 대상체의 암에 대한 감수성을 결정하는 효과적이고 정확한 도구로서 작용하는 기재된 구현예를 나타낸다.
도 2는 23명의 폐암 및 13명의 양성 종양 환자와 비교하여 31명의 건강한 공여자로부터 유래된 샘플의 DTN(기준선 값으로 정규화된 UVB 노출 후 %DNA 꼬리) 값으로 기재된 발명의 방법을 사용하는 데이터를 도시한다. 각 점은 단일 개체 대상체를 나타낸다. 수평선은 평균을 나타낸다. (A)는 건강한 대조군과 비교하여 폐암 환자 및 양성 코호트의 감수성을 나타낸다. (B) 단계에 의해 정렬된 폐암 샘플이 있는 A와 동일한 데이터. (C) 공지된 경우, 폐암 유형에 의해 그룹화된 A에서와 동일한 폐암 데이터. (D) 단계에 의해 정렬된 유방암 환자 유래 샘플만의 민감도.
본 데이터는 단일 세포 수준에서 DNA 손상의 차이를 정량화하고 마찬가지로 세포 샘플에서 UV 광을 유도하는 DNA 손상에 대한 민감도를 측정하고, 궁극적으로 결과를 사용하여 대상체의 암에 대한 감수성을 결정하는 효과적이고 정확한 도구로서 작용하는 기재된 구현예를 나타낸다.
본 방법의 구현예에 대한 다음의 보다 상세한 설명은 상기 기술의 예시적인 구현예의 대표이다.
대상체로부터 시험편 또는 시험편들을 수득하기 위해, 말초 혈액은 정맥천자(venipuncture)에 의해 채취되며, 다음 검정 방법에 사용될 수 있다. 바람직한 프로토콜은 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 사용을 기재하지만, 대신 전혈을 사용할 가능성을 배제하지는 않는다. 종양의 단계화는 로마 숫자 단계화로서 지칭되기도 하는 국제적으로 통용되는 전체 단계 그룹화에 따라 수행되었다. 이 시스템은 암의 진행을 기재하기 위해 숫자 I, II, III 및 IV(+ 0)를 사용한다. 단계는 다음을 지칭한다:
단계 0: 정상 위치에서 자라는 비정상적인 세포인 원위치 암종("그 자리에(in its place)"를 라틴어로 "원위치(in situ)").
단계 I: 암은 신체의 한 부분에 국소화된다. 단계 I의 암은 충분히 작으면 외과적으로 제거될 수 있다.
단계 2: 암은 국소적으로 진행된다. 단계 II는 화학 요법, 방사선 또는 수술로 치료될 수 있다.
단계 3: 암은 또한 국소적으로 진행된다. 암이 단계 2 또는 단계 3으로 지정되는지 여부는 특정 유형의 암에 따라 달라질 수 있고; 예를 들어, 호지킨병의 경우, 단계 II는 횡격막의 한쪽에만 영향을 받은 림프절을 나타내는 반면, 단계 III은 횡격막의 위와 아래에 영향을 받은 림프절을 나타낸다. 따라서, 단계 II 및 III에 대한 특정 기준은 진단에 따라 상이하다. 단계 III은 화학 요법, 방사선 또는 수술로 치료될 수 있다.
단계 IV: 암은 종종 전이되거나 다른 장기 또는 신체 전체로 확산된다. 단계 IV 암은 화학 요법, 방사선 또는 수술로 치료될 수 있다. 치료에도 불구하고, 단계 IV 암을 갖는 환자의 사망률은 상당히 더 높을 수 있다, 즉 암은 말기로 진행될 수 있다.
DNA 손상과 DNA 손상 민감도(DDS)를 각각 정량화하기 위해, 샘플을 UV 방사선에 노출 전(대조군/기준선) 및 노출 직후에 수집한다. 이 소위 시간 제로(T0) 시점은 피펫팅에 필요한 시간과 같은 실용적인 이유이며, 15분 이내, 예컨대, 12분, 10분, 8분 또는 심지어 5분 이내에 달성된다.
UV 노출은 제조된 세포 현탁액(예: 세포 배양 배지 또는 세포 배양 플레이트 중 PBS에 재현탁된 PBMC 세포)의 방사선에 의해 또는 4D Lifeplate와 같은 아가로스가 있는 플레이트(유리 플레이트)에 스팟으로 로딩된 샘플의 직접 방사선에 의해 수행될 수 있다. 시점 T0은 방사선이 스팟 샘플에서 수행될 경우 더 정확할 수 있다.
도 1 및 2에 제시된 데이터는 현탁액 중의 PBMC 세포를 UVB 방사선에 노출시킴으로써 수득되었다. 방사선을 제외한 추가 절차는 아래에 기재되어 있다.
단리된 PBMC를 저융점 아가로스(PBS 중 LMA)와 혼합하고, 37℃로 설정된 열 블록에 보관하여 최종 농도 0.4% LMA를 초래했다. 혼합 직후, 아가로스/세포 혼합물(200-400개 세포 함유)의 분취량을 4D Lifeplate에 적용했다. 4D Lifeplate 상의 아가로스 매립된 세포 중의 것들은 본원에서 스팟으로 지칭된다. 스팟을 4℃에서 1-2분 동안 중합시키고, 이어서 세포를 용해 완충액(NaCl, EDTA, 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS)-염기, Na-라우릴사르코시네이트, 트리톤-X-100)에 4℃에서 1시간 동안 용해시켰다. 4D Lifeplate는 4D Lifetank에 넣기 전에 이중 증류수(ddH2O)로 곧바로 세척했다. 그 안에, 슬라이드를 저온 전기영동 용액(NaOH 기반)에 침지시키고, 4℃에서 40분 동안 언와인딩(unwinding)시켰다. 이어서, 슬라이드를 1V/cm로 30분 동안 전기영동하고 4℃에서 일정하게 냉각시켰다. 전기영동 후, Lifeplate는 중화 완충액(TRIS-염기)으로 5분 동안 2회 세척하고, ddH2O로 세정한 다음, 스팟을 EtOH로 10분 동안 고정시켰다. 샘플을 37℃에서 1시간 동안 또는 실온에서 밤새 건조시키고, DNA를 30분 동안 SYBRTM Gold(30mM TAE, pH 8.0에서 50-240nM)로 염색했다. ddH2O에 의한 간단한 세척 후, 플레이트를 탈색 용액(abcbiopply 유래)에서 30분 동안 2회 배양한 후 실온에서 밤새 또는 암실에서 37℃에서 2시간 동안 건조시켰다.
슬라이드는 10배 대물렌즈 및 상응하는 소프트웨어 세포 치수를 갖는 현미경 BX63(Olympus)으로 이미지화하였다. 혜성의 채점은 Andor Komet 7.1로 수행되었다.
본 발명자들은 동일한 시험편(동일한 환자)으로부터 유래된 샘플을 사용하여 방사선의 시점 또는 각각의 위치의 영향을 조사했다.
동일한 시험편으로부터 유래된 샘플을 아가로스 겔에 도입하기 전 또는 후에 조사했다. 검정 프로토콜은 조사 시점에서만 다양하였다(V1 = 아가로스 겔에 도입하기 전 세포의 조사, V2 = 아가로스 겔에 도입한 후 세포의 조사). 건강한 환자의 시험편 5개와 폐암 환자의 시험편 5개를 시험하였다. 결과는 방사선의 시점과 무관했으며, 원시 데이터의 차이는 이전에 기록된 통계적 편차 내에 있었다(변경되지 않은 검정 프로토콜 사용). 진단 결과는 각 개별 환자의 샘플에 대해 동일했다(표 1 참조).
[표 1]
Claims (12)
- 증식성 질환(proliferative diseases) 및 이의 감수성(susceptibility)에 대한 바이오마커(biomarker)로서 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성의 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 용도로서, 상기 게놈 DNA의 증가된 내성이 증식성 질환 및/또는 이의 증가된 감수성을 나타내는, 용도.
- 제1항에 있어서, 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성이 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer, 전립선암(prostate cancer) 및 결장암(colon cancer) 또는 이러한 암 중 하나에 대한 증가된 감수성에 대한 바이오마커로서 사용되는, 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 게놈 DNA가 전혈 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포에서 유래되는, 용도.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 암 감수성에 대한 화학적 화합물, 약물(medication) 및/또는 환경적 영향의 효과를 시험하기 위한, 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암에 대한 적어도 하나의 추가 바이오마커가 결정되는, 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 손상이 단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 정규화된 DNA 꼬리(tail)의 평가에 의해 결정되는, 용도.
- 방사선에 의한 손상에 대한 게놈 DNA의 내성을 결정하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
a) 혈액 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플의 혈액 세포를 조사(irradiating)하는 단계,
c) 세포 용해를 수행하는 단계, 및
d) 단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 게놈 DNA 손상을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제7항에 있어서, 상기 게놈 DNA의 증가된 내성이 증식성 질환 및/또는 증식성 질환에 대한 증가된 감수성을 나타내는, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 샘플이 전혈, 또는 단리된 말초 혈액 세포를 함유하는 샘플인, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 용해가 혈액 세포의 조사 후 7분 미만에 일어나는, 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 샘플의 말초 혈액 세포를 조사하는 단계가 UVB 방사선을 사용하여 이루어지는, 방법.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포 겔 전기영동 검정을 사용하여 게놈 DNA 손상을 결정하는 단계가 DNA 꼬리 퍼센트(DNA tail Percent; DT%)의 계산 및 평가를 포함하는, 방법.
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