KR20230114473A

KR20230114473A - 액적 포획 구조 어레이 및 이를 이용한 스페로이드 전달 및 스페로이드 어레이의 형성 방법

Info

Publication number: KR20230114473A
Application number: KR1020220010679A
Authority: KR
Inventors: 박제균; 김휘수
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2023-08-01
Also published as: US20230235261A1

Abstract

본 발명은 스페로이드 어레이에서, 전체 또는 선택한 스페로이드들을 고립된 액적 어레이 환경으로 분리시킬 수 있는 액적 포획 구조 어레이 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 액적 포획 구조 어레이, 이를 이용한 스페로이드의 전달 방법/장치는 두 어레이의 접촉이라는 간단한 방법으로 매우 높은 효율로 액적 또는 스페로이드를 전달할 수 있으며, 사용자간의 편차가 매우 적다는 장점이 있다. 본 발명의 스페로이드 전달방법/장치를 사용하는 경우 통해 고립된 환경의 스페로이드 어레이를 대량 제조할 수 있으며, 특히, 본 발명의 액적 포획 구조 어레이 및 스페로이드 전달 방법을 사용하여 어레이에 나열된 각각의 스페로이드에 다양한 시약의 처리, 배양 배지의 교환 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

액적 포획 구조 어레이 및 이를 이용한 스페로이드 전달 및 스페로이드 어레이의 형성 방법 {Droplet trapping structure array and method for spheroid delivery and formation of spheroid array using same}

본 발명은 스페로이드 어레이에서, 전체 또는 선택한 스페로이드들을 고립된 액적 어레이 환경으로 분리시킬 수 있는 액적 포획 구조 어레이 및 이의 용도에 관한 것이다.

스페로이드(spheroid)는 세포들이 뭉쳐져 이루어진 구 형태의 세포 집합체로, 삼차원 배양법 중에서도 그 제조 방법이 간단하여 넓은 범위에서 유용하게 활용되고 있다(E. Fennema et al., Trends Biotechnol., 2013, 31, 108-115). 스페로이드를 제조하는 방법으로는 행잉 드롭(hanging drop), 저접착 웰플레이트(low-attachment well plate)과 같이 각 구획별로 한 개의 스페로이드를 생성시키는 방법과 스피너 플라스크(spinner flask), 마이크로웰 어레이(microwell array), 그리고 특허문헌 1에서 제시한 행잉 드롭 마이크로어레이(hanging drop microarray) 등 동일 배지 내에서 대규모의 스페로이드를 생성시키는 형태가 있다.

하지만, 기존의 기술들은 스페로이드를 고효율 약물 조건 실험에 적용하기에 다음과 같은 한계를 나타내었다. 첫째로, 행잉 드롭과 저접착 웰플레이트의 경우, 서로 구획화되어 있으므로 한 번의 파이펫 구동으로 스페로이드가 동시에 생성되지 않아 원하는 스페로이드의 개수만큼의 파이펫 구동 횟수가 요구된다. 이는 동시에 여러 구획의 파이펫 구동이 가능한 멀티파이펫 또는 파이펫팅 기계로 해결해볼 수 있으나, 후의 대규모 스페로이드 생성 방법에 비해 생성 효율이 떨어지며 고가의 큰 장비를 요구한다는 단점이 존재한다. 스피너 플라스크의 경우 생성된 스페로이드의 균일성(homogeneity)이 떨어지며, 마이크로웰 어레이, 행잉 드롭 마이크로어레이는 대규모의 균일한 스페로이드를 생성할 수 있으나 큰 액체 저장소(liquid reservoir)로 서로 연결되어 있어 스페로이드간의 상호작용이 가능하고, 서로 고립된 환경이 아니라는 문제점이 있다. 행잉 드롭 마이크로어레이의 경우, 웰에 담긴 다른 액체와의 접촉을 통해 스페로이드 제작용 디바이스에 있는 스페로이드들을 동시에 회수하는 방법을 보여주었으나, 이 역시도 같은 웰로 이동하기 때문에 다조건 처리에 사용하기엔 적합하지 않다.

한편, R. Tomasi 등은 미세유체 기반의 스페로이드 액적 어레이 생성 및 다조건 약물 처리 플랫폼을 제시한 바 있다(R. Tomasi et al., Cell Reports., 2020, 31, 107670). 해당 연구에서는 기름과 물이 섞이지 않는 성질을 이용하여 스페로이드를 생성 가능한 세포현탁액 액적을 기름 내에 빠른 속도로 제작하고, 미세유체 채널 내의 높이 차의 변화를 응용하여 생성된 스페로이드 액적이 미세유체 플랫폼 내의 특정 구간들에 고정되도록 하였다. 뿐만 아니라 다양한 약물을 활용하여 다종의 약물 액적을 생성하고, 계면장력으로 인한 액적 움직임을 고려한 구조를 이용해 약물 액적을 스페로이드 액적 주변에 고정 후 합쳐지도록 하였다. 이 때 각 스페로이드 액적은 액적을 둘러싼 기름으로 인해 서로 구획화되어 있는 상태가 유지된다. 그러나 해당 연구의 경우 액적의 주입은 항상 주사기 펌프를 이용한 구동에 기반하므로, 반응시킬 스페로이드의 수 또는 위치를 조절하기 어려우며 스페로이드 액적이 디바이스의 채널 내에 고정된 상태이므로 특정 스페로이드의 회수 역시 어려움이 존재한다. 따라서, 스페로이드의 접근성이 좋고 구동 방법이 용이한, 구획화된 스페로이드 어레이의 고효율 형성 방법은 아직도 해결해야할 문제로 남아있다.

이에 본 발명자들은 구획화된 콜라겐 하이드로겔 어레이에 스페로이드 어레이를 동시 이식 및 배양할 수 있는 액적 접촉 기반의 스페로이드 전달(a droplet contact-based spheroid transfer (DCST)) 기술을 개발하여 보고한 바 있다(H. Kim et al., Biomicrofluidics, 2018, 12, 044109). 상기 문헌에서, 본 발명자들은 스페로이드를 포획할 수 있는 기둥이 반복적으로 나열된 기둥 어레이 칩(a pillar array chip (PAC))을 드롭 어레이 칩(drop array chip (DAC))에 접촉하는 방식으로 스페로이드를 이동시킴으로써, 직접적인 파이펫팅으로 인한 스페로이드 손실 및 오염 위험을 최대한 감소시키면서 단순한 액적 접촉을 통해 다른 매체 또는 하이드로겔로 전송할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 해당 문헌의 기둥 어레이 칩에 나열된 기둥은 평평한 상단면을 가져, 장기간의 배양 또는 반복적인 액적 접촉 시에는 액적이 기둥 밖으로 흘러내려, 스페로이드가 소실되는 문제점이 있었다.

이러한 배경 기술 아래에서, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 액적과 접촉하는 오목부를 포함하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 개발하였으며, 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 액적 접촉식 스페로이드 전달 기술을 수행하는 경우, 반복적인 액적 접촉시에도 기존에 보고한 수평 기둥 어레이 칩보다 현저히 뛰어난 스페로이드 전달률을 나타내고, 특히 오목부에 에어 채널을 형성시키는 경우 보다 큰 볼륨의 액적에서도 뛰어난 스페로이드 전달률을 나타내는 것을 확인하였으며, 기둥뿐만 아니라 다양한 형태의 액적 포획용 어레이를 사용하는 경우에도 뛰어난 스페로이드 전달률을 나타내고, 대규모로 생성된 균일한 스페로이드를 간편한 방법으로 구획화된 스페로이드 액적으로 분리시킬 수 있음을 확인하였다. 나아가, 상기 액적 접촉식 스페로이드 전달 기술(DCST)을 사용하여 시약의 처리, 배양액 교환 등과 같은 다양한 용도에 상기 액적 접촉식 스페로이드 전달 기술을 사용하는 경우 수행자에 관계없이 균일하게 뛰어난 효율 및 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 드롭 어레이로부터 높은 전달률로 액적을 포획할 수 있는 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 포함하는 액적 또는 스페로이드의 전달 방법 및 장치를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 이용한 스페로이드에 시약을 처리하는 방법 또는 배지의 교환 방법을 제공하는 데 있다

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오목부를 포함하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 제공한다.

본 발명은 또한, 드롭 어레이; 및 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 포함하는 액적 전달 장치 또는 액적 포획 장치를 제공한다.

본 발명은 또한, 스페로이드 어레이; 및 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 포함하는 스페로이드 전달 장치를 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) 드롭 어레이와 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 드롭 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부에 액적을 포획시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액적의 전달 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) 스페로이드 어레이와 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 스페로이드 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부에 스페로이드를 함유하는 액적을 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액적 접촉식 스페로이드 전달 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 스페로이드 전달 방법을 이용한 스페로이드 어레이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 스페로이드 어레이의 제조방법으로 제조된 고립된 스페로이드 어레이를 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) 배양된 스페로이드 어레이와 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 배양된 스페로이드 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 고립된 스페로이드 액적 어레이를 제조하는 단계; 및

(c) 고립된 스페로이드 액적 어레이를 시약이 로딩된 어레이에 접촉하는 단계를 포함하는 스페로이드에 시약을 처리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

(c) 고립된 스페로이드 액적 어레이를 배지가 로딩된 드롭 어레이에 접촉하여 스페로이드를 전달하는 단계를 포함하는 스페로이드 배지의 교환 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 액적 포획 구조 어레이, 이를 이용한 스페로이드의 전달 방법/장치는 두 어레이의 접촉이라는 간단한 방법으로 매우 높은 효율로 액적 또는 스페로이드를 전달할 수 있으며, 사용자간의 편차가 매우 적다는 장점이 있다.

본 발명의 스페로이드 전달방법/장치를 사용하는 경우 통해 고립된 환경의 스페로이드 어레이를 대량 제조할 수 있으며, 특히, 본 발명의 액적 포획 구조 어레이 및 스페로이드 전달 방법을 사용하여 어레이에 나열된 각각의 스페로이드에 다양한 시약의 처리, 배양 배지의 교환 등에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 액적 접촉 기반 스페로이드 전달(DCST) 장치를 사용하여 행잉 드롭 스페로이드 어레이에 대한 분석 플랫폼을 개략적으로 나타낸 것이다: (A) DCST 방법을 사용한 분석 플랫폼의 작동 원리. (B) DCST 장치의 설계: 드롭 어레이 칩(DAC), 기둥 어레이 칩(PAC) 및 스페이서. (C) DCST 장치의 제조 과정. (D) 각 시약 변경 단계의 세부 과정.
도 2는 PDMS 몰딩에 대한 실란화(silanization)의 효과를 나타낸 것이다. 도 2A 및 2B는 실란화되지 않은 PlasCLEAR 몰드로 제조한 PDMS 기반 기둥 어레이 칩(A) 및 이의 확대된 이미지(B)이다. 도 2A 및 2B는 실란화된 PlasCLEAR 몰드로 제조한 PDMS 기반 기둥 어레이 칩(A) 및 이의 확대된 이미지(B)이다.
도 3은 DCST 기반 다단계 분석 플랫폼을 특성화하여 나타낸 것이다: 도 3A 오목부 및 공기 채널을 포함하는 기둥 형태의 접촉식 액적 포획 구조(Pillar array chip; PAC)를 나타낸 것이다. 도 3B 및 3C는 PAC의 기둥 직경에 따른 이송된 drop volume(B)과 spheroid transfer rate(C)의 변화를 나타낸 것이다, (스페로이드 전달률 = 전달 후 스페로이드 수/전달 전 스페로이드 수). 도 3D 및 3E는 접촉 횟수에 따른 세척 효율을 나타낸 것이다 (D) 반복적인 DAC-PAC 접촉을 사용한 세척 절차의 개략도(왼쪽) 및 사진(오른쪽). (E) 세척 액적과의 접촉횟수 대비 첫 번째 시약의 잔류량(상단) 및 세척 효율(하단)을 나타낸 것이다. 세척 효율(%) = (1 - 액적의 제1 시약의 현재 농도/제1 시약 액적의 초기 농도) × 100
도 4는 수동 파이펫팅 및 액적 접촉 기반 스페로이드 전달(DCST)을 사용하여 384웰 스페로이드 마이크로플레이트 및 드롭 어레이 칩에서 14일 동안 BT-474 스페로이드의 성장을 나타낸 것이다. 스페로이드를 구성하는 BT-474 세포의 초기 수는 두 장치 모두에 대해 4000개 임
도 5는 배지(또는 시약) 교체 과정에서 기존 수동 파이펫팅 방법과 DCST 방법 간의 사용자 편차를 비교한 결과이다. 도 5A는 기존 마이크로웰 플레이트에서 수동 파이펫팅을 사용한 배지(또는 시약) 교체 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 5B는 DCST 방법을 사용한 배지(또는 시약) 교체 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 5C및 5D는 7명의 개인에 대한 두 가지 방법의 스페로이드 유지율을 비교한 결과(C) 및 세 가지 다른 방법의 평균 유지율을 비교한 결과이다(D). Games-Howell 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석을 사용하였다. (n.s.: not significant, p > 0.05, *p < 0.05, and **p < 0.01).
도 6은 자동화된 피펫팅 플랫폼을 사용한 스페로이드 유지율 및 피펫 팁의 z 위치에 따른 잔여 액체의 계산된 부피를 나타낸 것이다.
도 7은 BT-474 스페로이드의 DCST 기반 화학적 염색 및 면역 염색을 나타낸 것이다. 도 7A는 BT-474 스페로이드의 Live/Dead 및 저산소증 염색 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바 = 500 μm. 도 7B 및 7C 1차 항체 농도에 따른 저산소증 유발 인자-1 알파(HIF-1α)(B) 및 E-카드헤린(C)의 면역형광 염색 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바 = 1mm. 도 7D 는 수동 파이펫팅을 사용하는 기존 스페로이드 마이크로플레이트와 DCST 방법을 사용하는 DCST 장치 간의 면역 염색 균일성을 비교한 것이다.
도 8은 BSA가 코팅되지 않은 장치에 스페로이드가 부착됨을 나타내는 사진이다. 빨간색 화살표가 가리키는 흰색 점은 드롭 어레이 칩에 부착된 스페로이드이다. 스케일 바 = 5mm.
도 9는 RTF, ScaleSQ, 수정된 ScaleS 및 FOCM 투명화 방법을 사용한 스페로이드 투명화 결과를 나타낸 것이다.(A) 명시야 이미지. (B) 스페로이드 중앙의 형광 이미지. (C) 다른 z축 높이와 측면에서의 형광 이미지.
도 10은 본 발명의 실시예에서 제조된 액적 접촉식 스페로이드 전달 장치에 사용된 스페로이드 어레이로서, 하부에 복수의 구멍을 갖는 행잉 드롭 마이크로어레이를 도시한 것이다(국제특허공개 제WO2015/129263호)
도 11은 상기 하부에 복수의 구멍을 갖는 행잉 드롭 마이크로어레이를 사용하여 스페로이드를 생성/배양한 결과를 시간에 따라 나타낸 사진 및 Live/Dead 염색 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 제조된 공기 채널을 포함하는 오목 기둥 형태의 접촉식 액적 포획 구조 및 이를 포함하는 마이크로어레이를 나타낸 것이다.
도 13은 평면 상에 공기 채널 및 미세벽을 포함하는 오목부를 갖는 접촉식 액적 포획 구조를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 액적 접촉식 스페로이드 전달 장치를 사용하여, 스페로이드를 함유하는 액적을 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이에 전달하는 방법 및 이의 결과를 개략적으로 나타낸 것이다. (A: 스페로이드 어레이의 스페로이드를 전부 전달, B: 스페로이드 어레이의 스페로이드를 선택적으로 일부 전달)
도 15는 본 발명의 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 사용하여 배양된 스페로이드를 콜라겐 하이드로겔 드롭어레이로 전달하는 방법에 관한 것이다.
도 15 (i)는 배양된 스페로이드를 본 발명의 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이에 전달하여 격리된 스페로이드 어레이를 제조하는 방법을 도시한 것이다. 도 15 (ii)는 스페로이드를 포함하지 않는 콜라겐 하이드로겔을 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이에 전달하여 하이드로겔 지지 마이크로어레이(HSMA)를 제조하는 방법을 도시한 것이다. 도 15 (iii)는 격리된 스페로이드 어레이와 하이드로겔 지지 마이크로어레이(HSMA)를 접촉하여 스페로이드를 콜라겐 하이드로겔로 최종적으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 오른쪽은 각 단계의 결과로, 빨간색, 노란색, 파란색 박스는 각각 단계 (i), (ii) 및 (iii)을 나타낸다.
도 16은 본 발명의 액적 포획 구조 어레이 디바이스를 이용하여 콜라겐 하이드로겔 액적 어레이로 옮겨 스페로이드-하이드로겔 액적 어레이를 형성했을 때, 스페로이드의 변화 및 배양 후의 크기를 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

스페로이드(spheroid)는 세포들이 뭉쳐져 이루어진 구 형태의 세포 집합체로, 삼차원 배양법 중에서도 그 제조 방법이 간단하여 매우 다양한 범위에서 유용하게 활용되나, 기존에 보고된 대규모의 스페로이드 생성 방법은 스페로이드간의 상호작용이 가능하고, 서로 고립된 환경이 아니라는 문제점이 있다. 각각의 스페로이드 간에 상이한 조건의 실험을 위해, 전통적으로 수동 파이펫팅 방법에 의해 반복작업을 통해 실험하거나, 고가의 자동 파이펫팅 장치를 사용하여 수행하고 있으나, 비용, 절차, 실험자의 숙련도 등에 따라 균일하지 못한 결과를 가져오는 문제가 있다.

이를 극복하기 위해 본 발명자들은 이전에 보고한 액적 접촉식 스페로이드 전달(a droplet contact-based spheroid transfer (DCST)) 기술을 개량하여 H. Kim et al., Biomicrofluidics, 2018, 12, 044109), 오목부를 포함하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 발명하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 오목부를 포함하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 사용하는 경우, 접촉과 접촉해제라는 단순한 절차에 의해서 대량으로 배양된 스페로이드 어레이를 고립된 스페로이드-액적의 형태로 분리할 수 있음을 확인하였다. 특히 본 발명의 액적 포획 구조 어레이를 사용한 액적 접촉식 스페로이드 전달 기술은 기존의 수동 파이펫팅 방법에 비해 스페로이드의 손상 및 손실이 낮고 사용자간의 편차가 매우 낮음을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명의 액적 포획 구조 어레이를 사용한 액적 접촉식 스페로이드 전달 기술이, 스페로이드를 함유하는 액적의 포획뿐만 아니라, 배지의 교환, 시약의 처리, 스페로이드의 염색, 투명화, 세척 등의 다양한 분야에 서 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 오목부를 포함하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이에 관한 것이다.

본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이는 오목부를 포함하여, 본 발명자들이 이전에 보고한 평평한 상단면을 갖는 기둥 어레이 칩(pillar array chip; PAC)(H. Kim et al., Biomicrofluidics, 2018, 12, 044109)보다 뛰어난 액적 전달 부피 및 스페로이드 전달률을 나타내며, 반복 액적 접촉 등에도 스페로이드가 소실되지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 용어, “접촉식 액적 포획 구조 어레이”는 접촉식 액적 포획 구조가 나열된 기판을 의미하며, 상기 어레이는 “어레이 장치” 또는 “어레이 칩”과 실질적으로 동등한 의미에서 상호호환적으로 사용된다.

본 발명의 용어, “오목부”는 수평면을 기준으로 움푹 들어간 부위를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 오목부는 수평면 대비 들어가 있는 것이라면 형태를 불문하고 모두 포함하는 넓은 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 액적 또는 스페로이드의 전달은 중력에 의해 발생하기 때문에, 상기 오목부는 수평면을 기준으로 아래로 들어간 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 접촉식 액적 포획 구조는 오목부를 상부 단면에 포함하는 기둥을 포함하도록 하여, 기둥 어레이 칩(Pillar Array Chip; PAC)으로 제작되었다.

본 발명에 있어서, 상기 오목부는 기둥 모양의 접촉식 액적 포획 구조의 상부 단면에 형성된 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기둥 모양의 접촉식 액적 포획구조는 삼각기둥, 사각기둥 등의 다각 기둥을 포함하며, 상부로 갈수록 단면의 면적이 좁아지거나 넓어지는 잘린 뿔 형태의 기둥을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 도 1 및 도 12에 도시된 것과 같이, 상기 기둥 모양의 접촉식 액적 포획 구조는 잘린 원뿔 도는 잘린 육각형 형태의 상부에 오목부를 포함하는 형태로 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 기둥 모양의 접촉식 액적 포획구조의 오목부는 기둥의 평평한 단면의 중심을 깎아 형성되거나, 오목부의 기둥의 평평한 단면 상에 미세 벽을 세워 형성시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 오목부는 평면상에 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 초기에 접촉 간격의 조정 및 용이성을 위해 상기 기둥 모양의 접촉식 액적 포획구조를 설계하였으나, 평면상에 미세벽을 형성하여 오목부를 구성하여 제조하는 경우에도 드롭 어레이로부터 효과적으로 액적을 포획할 수 있음을 확인하였다. 도 13에 도시된 것과 같이, 미세 벽을 원형으로 형성시켜 오목 구조를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 오목부는 평단면에 비해 오목한 구조를 가진다면 그 형태에 관계없이 모두 포함하는 개념으로 사용된다.

본 발명의 실시예에서 오목 기둥 형태의 접촉식 액적 포획구조 어레이를 통해 스페로이드 액적을 전달하는 경우, 액적과 오목부 사이에 공기가 갇혀(trapped) 공기층이 형성되고 이에 의해 전달되는 액적의 부피가 평평한 상단면을 갖는 액적 포획 구조 어레이보다도 감소하고, 스페로이드가 약 6~12% 소실될 수 있는 것으로 확인되었다. 이를 극복하기 위해 오목부에 공기 채널을 형성시킨 결과 더욱 큰 전달 액적 부피를 가지며, 100%의 스페로이드 전달률을 나타내어 안정적으로 액적을 포획할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 오목부는 공기 채널을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 공기 채널은 오목부의 옆면에 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 오목부는 하나 이상의 공기 채널을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 2-6개, 가장 바람직하게는 4개 이상의 공기 채널을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 접촉식 액적 포획구조 어레이는 스페로이드 어레이로부터 스페로이드 액적을 포획하여 고립된 스페로이드 액적 어레이를 형성하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 액적은 스페로이드를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 스페로이드는 구형 또는 타원구형 형태를 나타내므로, 형성 상기 접촉식 액적 포획구조 어레이가 스페로이드의 전달을 위해 사용되는 경우, 스페로이드를 중앙부에 위치되도록 하기 위해 상기 오목부의 내부 형상은 반구형 또는 반타원구형인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 미세 벽에 의해 오목구조가 형성되는 경우, 상기 오목부 내부 형상은 원기둥 또는 다각 기둥의 형태일 수 있으며, 미세벽의 내부를 곡선형태로 가공하여 반구형 또는 타원구형을 갖도록 제조할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 오목부의 크기는 전달 하고자 하는 액적의 종류 및 부피에 따라 크기를 조정할 수 있다. 예를 들어 스페로이드의 전달에 사용하는 경우, 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 제조된 것과 같이 1μm 내지 1 mm의 직경을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예서, 상기 접촉식 액적 포획구조 어레이가 스페로이드를 함유하는 액적의 전달을 위해 사용되는 경우, 스페로이드 크기 및 오목부의 직경에 따른 스페로이드 전달률을 확인하였으며, 기둥보다 스페로이드의 직경이 큰 경우, 스페로이드 전달률이 현격하게 떨어지는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 접촉식 액적 포획구조 어레이가 스페로이드를 함유하는 액적의 전달을 위해 사용되는 경우, 상기 오목부의 너비는 스페로이드의 직경보다 큰 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 적어도 100μm 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 200μm 이상, 가장 바람직하게는 적어도 300μm 이상 큰 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 오목부의 깊이는 너비의 1/2를 갖는 반구 형태 또는 원기둥 형태로 제작되었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이는 3D 프린팅된 몰드에 PDMS를 경화하여 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며 다양한 재료를 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 접촉식 액적 포획구조 어레이는 드롭(액적) 어레이(drop array)와 접촉 및 접촉 해제를 통해 각 접촉식 액적 포획구조의 오목부에 액적이 포획되는 것을 특징으로 한다. 드롭 어레이는 본 발명의 접촉식 액적 포획구조 어레이의 위에서 아래를 향해 접촉식 액적 포획구조 어레이의 오목부에 접촉되며, 중력에 의해 액적이 전달 및 포획된다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉식 액적 포획 구조는 바람직하게는 접촉되는 어레이는 드롭(액적) 어레이(drop array)의 나열에 동일하게 또는 유사하게 나열되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 사용하여 드롭 어레이의 일부 액적을 선택적으로 전달하고자 하는 경우, 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 액적 포획 구조는 드롭 어레이의 나열과 상이할 수 있으며, 일부 어레이만 접촉 가능하도록 배열될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 드롭 어레이; 및 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 포함하는 액적 전달 장치 또는 액적 포획 장치에 관한 것이다.

본 발명의 용어, “드롭 어레이” 또는 “액적 어레이”는 액체가 로딩된 각각의 구획이 나열된 어레이 장치를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 마이크로웰 플레이트 규격에 맞춘 드롭 어레이 칩에 액체를 로딩한 뒤 뒤집어서 드롭 어레이를 형성하거나, 하부에 복수의 구멍을 포함하는 행잉 드롭 마이크로어레이를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 액적은 스페로이드를 함유할 수 있으며, 이 때 액적의 포획과 함께 중력에 의해 스페로이드가 함께 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부로 전달된다. 본 발명에 있어서 상기 드롭 어레이는 스페로이드를 함유하는 액적을 포함하는 스페로이드 어레이인 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 스페로이드 어레이; 및 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 포함하는 스페로이드 전달 장치에 관한 것이다.

본 발명의 용어, “스페로이드”는 세포들이 뭉쳐져 이루어진 구 형태의 세포 집합체를 의미한다 (E. Fennema et al., Trends Biotechnol., 2013, 31, 108-115).

본 발명에 있어서, 상기 스페로이드를 구성하는 세포는 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 스페로이드를 구성하는 세포는 질병 관련 세포, 바람직하게는 종양 세포 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 스페로이드 어레이는 본 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 비제한적인 예를 들어, 행잉 드롭(hanging drop), 저접착 웰플레이트(low-attachment well plate)과 같이 각 구획별로 한 개의 스페로이드를 생성시킨뒤 어레이를 형성하는 방법, 또는 스피너 플라스크(spinner flask), 마이크로웰 어레이(microwell array), 행잉 드롭 마이크로어레이(hanging drop microarray) 등 동일 배지 내에서 대규모의 스페로이드를 생성시켜 스페로이드 어레이로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 마이크로웰 어레이에 스페로이드를 배양한 뒤 뒤집거나, 하부에 복수의 구멍을 갖는 행잉 드롭 마이크로어레이를 사용하여 스페로이드 어레이를 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 행잉 드롭 마이크로어레이는 국제특허공개 제WO2015/129263호에서 공개하는 하부에 복수의 구멍을 갖는 행잉 드롭 마이크로 어레이를 제조하여 사용하였다. 상기 하부에 복수의 구멍을 갖는 행잉 드롭 마이크로 어레이는 상기 복수의 구멍에 맺힌 액적에 세포가 응집되며, 행잉 드롭 형태의 스페로이드를 형성한다. 이와 같은 구조의 행잉 드롭 마이크로어레이를 사용하는 경우, 하부에 바로 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시켜 스페로이드 액적의 포획 및 스페로이드의 전달을 수행할 수 있다는 장점이 있다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 스페로이드 어레이는 바람직하게는 마이크로웰 어레이 또는 행잉 드롭 마이크로어레이, 더욱 바람직하게는 행잉 드롭 마이크로어레이인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 스페로이드 어레이; 및 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 수동으로 수행하였다. 상기 두 어레이 간의 간격 조절을 용이하게 하기 위해 PMMA를 절단하여 제조한 스페이서를 사용하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 액적 전달 장치 또는 상기 스페로이드 전달 장치는 스페이서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 스페로이드 어레이는 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 위에서 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부에 접촉하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 수동 방법으로 상기 두 어레이를 접촉하였으나, 드롭 어레이(또는 스페로이드 어레이)와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉은 자동화 될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하게 이해될 수 있다.

본 발명의 액적 전달 장치 또는 스페로이드 전달 장치가 자동화되는 경우, 각 어레이를 정렬하기 위한 X-Y 축 정렬 및 운동 장치, 접촉 및 접촉해제를 위한 Z 축 운동 장치, 각 운동 장치를 제어하기 위한 제어부 및 각종 설정을 위한 기억 장치 등이 제한 없이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서와 같이, 두 어레이의 접촉시 스페로이드 및 액적은 중력에 의해 위의 어레이에서 아래의 어레이로 전달 및 포획된다. 이를 이용하여, 본 발명의 다른 실시예에서와 같이, 스페로이드-액적을 포획한 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 아래에서, PBS등의 시약을 포함하는 드롭 어레이와 접촉시키는 경우 스페로이드의 전달 없이 시약 처리를 수행할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 액적 전달 장치 또는 스페로이드 전달 장치는 하나 이상의 드롭 어레이를 추가로 포함할 수 있으며, 각 어레이의 위치를 전환하기 위한 회전 운동 장치 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(b) 상기 드롭 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부에 액적을 포획시키는 단계를 포함하는 것을 액적의 전달 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 위에서 드롭 어레이를 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부에 접촉시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계 전에 드롭 어레이와 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 정렬시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(b) 상기 스페로이드 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부에 스페로이드를 함유하는 액적을 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액적 접촉식 스페로이드 전달 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계 전에 스페로이드 어레이와 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 정렬시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 위에서 스페로이드 어레이를 접촉시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 스페로이드의 전달 방법을 통해 스페로이드 어레이로부터 각각의 스페로이드를 함유하는 액적이 분리되어, 고립된 스페로이드 액적 어레이가 형성되며, 고립된 스페로이드 액적 어레이의 스페로이드 액적은 각각 물리적으로 고립되어, 상이한 조건 또는 상이한 시약을 처리할 수 있는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 스페로이드 전달 방법을 이용한 스페로이드 어레이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 스페로이드 어레이는 각각의 스페로이드가 고립된 환경으로 분리된 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 스페로이드 어레이의 제조방법으로 제조된 고립된 스페로이드 어레이에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이 및 스페로이드 전달방법을 사용하여 배지의 교환, 각종 시약의 처리, 화학적 염색, 면역염색, 투명화 등의 다양한 용도로 사용 가능함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이는 스페로이드의 전달뿐만 아니라, 고립된 스페로이드 액적 어레이에 동시에 시약을 처리하는 데에도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(c) 고립된 스페로이드 액적 어레이를 시약이 로딩된 어레이에 접촉하는 단계를 포함하는 스페로이드에 시약을 처리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계 및 (c) 단계는 접촉 전, 각 어레이를 정렬시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 세척 버퍼(PBS)가 로딩된 드롭 어레이를 고립된 스페로이드 액적 어레이의 위에서 접촉하고 접촉 해제하는 단계를 반복하여, 스페로이드의 전달 없이 세척하는 단계를 수행하는 경우, 반복 횟수에 따라 제2 시약에 전달되는 제1 시약의 양이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, (b') 상기 (C) 단계 전, 세척 버퍼가 로딩된 드롭 어레이의 아래에서 상기 (b) 단계의 고립된 스페로이드 액적 어레이를 접촉 및 접촉 해제하여 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세척 단계는 적어도 1회 이상 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세척 단계는 적어도 1회 이상 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 세척횟수가 증가될수록 2차 시약으로 전달되는 1차 시약의 양이 감소하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 20회 이상의 세척을 수행하는 경우, 0.1% 미만의 1차 시약이 전달되는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 스페로이드는 중력에 따라 위의 어레이에서 아래의 어레이로 전달되는 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 스페로이드의 전달 필요 여부에 따라 시약이 로딩된 어레이 위 또는 아래에서 고립된 스페로이드 액적 어레이를 접촉하여 시약을 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시약은 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서는 배양배지, PBS와 같은 세척 버퍼, 포름알데히드 용액, 화학적 염색시약, 항체, 항생제 등 다양한 종류의 시약을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 스페로이드 전달 방법은 배지의 교환에도 용이하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 배양된 스페로이드 어레이와 본 발명의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시키는 단계;

(c) 고립된 스페로이드 액적 어레이를 배지가 로딩된 드롭 어레이에 접촉하여 스페로이드를 전달하는 단계를 포함하는 스페로이드 배지의 교환 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 각 배지간의 오염을 최소화하기 위해 상기 (c) 단계의 수행 전 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b') 상기 (C) 단계 전, 세척 버퍼가 로딩된 드롭 어레이의 아래에서 상기 (b) 단계의 고립된 스페로이드 액적 어레이를 접촉 및 접촉 해제하여 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 배지가 로딩된 드롭 어레이 위에서 고립된 스페로이드 액적 어레이를 접촉하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, 스페로이드는 중력에 의해 배지가 로딩된 드롭 어레이로 전달된다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 재료 및 방법

실시예 1-1: 세포 및 시약

PlasCLEAR (Asiga, Australia));

폴리우레탄 이형제(polyurethane release agent) (Nabakem, Korea);

PDMS(Poly(dimethylsiloxane)) 단량체 및 경화제(Dow Corning, USA);

PMMA(Poly(methyl methacrylate)) 플레이트 (YM Tech, Korea);

16% w/v 포름알데히드용액 및 Image-iT™ 적색 저산소증 시약(red hypoxia reagent) (Thermo Fisher Scientific, USA);

Triton X-100 (Junsei, Japan). BSA(Bovine serum albumin) (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA). PBS(Phosphate buffered saline), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum), 및 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) (Corning, USA);

인간 유방암 세포주 BT- 474 (KCLB No. 60062) (Korean Cell Line Bank (KCLB; Seoul, Korea);

Calcein-AM, EthD-1 (ethidium homodimer-1), 및 Hoechst 33342 (Invitrogen, USA);

마우스 항-인간 저산소증 유도 인자-1 알파 항체(mouse anti-human hypoxia-inducible factor-1 alpha antibody, HIF-1α antibody) (No. 610959) (BD Biosciences, USA);

토끼 항-E-cadherin 항체(rabbit anti-E-cadherin antibody) (ab40772), Alexa Fluor 594-접합염소 항-토끼 IgG H&L 항체 (ab150080), 및 Alexa Fluor 488-접합 염소 항-마우스 IgG H&L 항체 (ab150113) (Abcam, United Kingdom); 및 기타 화합물 및 시약 (Sigma-Aldrich, USA).

실시예 1-2: 액적 접촉식 스페로이드 전달(droplet contact-based spheroid transfer (DCST)) 장치의 제작

DCST 장치, 드롭 어레이 칩, 및 기둥 어레이 칩의 복제 몰드(replica mold)는 Autodesk Inventor 2018을 사용하여 디자인되었으며, PlasCLEAR 레진을 사용한 3D 프린터(Pico2 HD; Asiga, Alexandria, Australia)로 3D 프린팅하였다. 프린트된 몰드를 에탄올에 담그고 20분동안 초음파 처리하였다. 몰드를 건조시킨 후 양쪽 면을 각각 3분동안 자외선을 조사하여 경화되지 않은 수지를 경화하였다. PDMS 이형 공정을 쉽게 하기 위해 금형을 O₂ 플라즈마로 1분동안 처리하고, 진공조건에서 1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-trichlorosilane에 노출시켰다. 처리된 몰드는 사용전 폴리우레탄 이형제로 추가코팅하였다.

DCST 장치는 상기 몰드에서 PDMS 몰딩을 사용하여 제작하였다. 경화되지 않은 PDMS 혼합물(단량체: 경화제 = 10:1)를 몰드에 붓고 85℃의 컨벡션 오븐에서 2시간동안 경화하였다. 몰드에서 분리된 장치는 증류수에 담근 뒤 오토클레이브하고, 컨벡션 오븐에서 건조시켰다. 스페이서와 지지기둥은 레이저커터(C40-60 W; Korea)를 사용하여 PMMA를 절단하여 제작하였다.

실시예 1-3: 세포 및 스페로이드 배양

BT-474 세포는 37℃ 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 DMEM에서 유지하였다. 배양 배지는 2일마다 교환하였고 세포 컨플루언시(cell confluency)는 80% 이하로 유지하였다. 행잉 드롭 방식으로 스페로이드를 형성하기 위해 세포 현탁액을 원하는 농도로 제조하고 25 μL의 액적 부피로 DAC의 웰에 시딩하였다. 액적을 로딩한 후 DAC를 배양 플레이트에 부착된 2개의 PMMA 컬럼에 놓았다. 액적의 증발을 방지하기 위해 플레이트에 PBS를 채우고 PBS로 채워진 다른 플레이트를 DAC가 포함된 플레이트 위에 놓았다. 초저 부착 플레이트(ultra-low attachment plate)로 스페로이드를 형성하기 위해 원하는 농도로 제조된 세포 현탁액을 384-웰 스페로이드 마이크로플레이트(Corning)의 각 웰에 시딩하고 액체의 부피는 50μL로 하였다. 배양 배지는 2일마다 교환하였다.

실시예 1-4: 액적 내 시약 잔량 측정

기둥 어레이 칩(PAC) 상 액적 내의 잔류 시약은 기존의 연구와 동일한 방법로 계산되었다(H. Kim et al., Biomicrofluidics, 2018, 12, 044109). 0.5 내지 5μL의 1mM 에리오글라우신(erioglaucine) 용액과 100μL의 PBS를 혼합하여 형성된 에리오 글라우신 용액의 406nm에서의 피크 흡광도를 측정하여 부피 보정 곡선을 얻었다. PAC로 옮겨진 액적의 부피와 농도는 액적을 100μL의 PBS로 채워진 96 웰 플레이트로 옮기고 마이크로 플레이트 분광 광도계 (SpectraMax 250; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정 및 계산하였다. DAC의 두번째 시약 액적에 PAC와 접촉시켜 옮겨준 첫번째 시약의 잔류량을 분광 광도계 (Nanodrop 2000; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였다. 부피 보정 곡선을 얻은 뒤, 두번째 시약 액적에 옮겨진 첫번째 시약 용액의 양과 농도를 액적으로부터 2 μL를 취하여 계산하였다.

실시예 1-5: 스페로이드의 Live/Dead 및 저산소증(hypoxia) 이미징

세포의 생존률은 종래 알려진 Live/Dead 형광 염색법을 사용하여 평가하였다. 스페로이드는 37℃에서 1시간동안 4μM calcein-AM 및 4 μM EthD-1 용액을 사용하여 염색하였다. 배지로 세척한 뒤, 도립 현미경(inverted microscope, IX51; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 형광이미지를 얻었다.

저산소 이미징은 스페로이드를 37℃에서 24시간동안 10 μM Image-iT™ 적색 저산소증 시약(10 μM Image-iT™ red hypoxia reagent)로 처리한 뒤, 용액을 배양액으로 교체하여 48시간 동안 스페로이드를 배양하고 현미경으로 이미지를 얻었다.

실시예 1-6: 스페로이드의 면역 염색

스페로이드의 단백질 마커를 분석하기 위해, 4% 포름알데히드 용액으로 30분동안 고정(fixation)하고, 0.1% Triton X-100 용액에서 1시간동안 투과화(permeabilization) 한 뒤, 5% BSA 용액으로 실온에서 30분동안 블록(blocking)하였다. 스페로이드는 먼저 오비탈 셰이커에서 4℃로 밤새 마우스 항-HIF-1α 및 토끼 항-Ecadherin 단일클론 항체로 밤새 처리하였다. 그 뒤, 스페로이드를 염소 항-마우스 및 항-토끼 다클론 항체를 사용하여 37℃에서 2시간동안 처리하였다. 최종적으로 핵은 실온에서 10분동안 5 μg/ml의 Hoechst 33342 용액을 사용하여 대조염색하였다. DCST 방법을 적용하는 경우, 면역 염색 단계에 사용된 DAC 및 PAC는 스페로이드의 접착을 방지하기 위해 30분동안 5%의 BSA 용액으로 전처리하였다.

실시예 1-7: 스페로이드의 광학적 투명화

기존에 보고된 RTF, ScaleSQĲ0), modified ScaleS, 및 FOCM 방법이 면역 염색된 스페로이드의 투명화를 위해 수행되었다

E. Boutin et al., Sci. Rep., 2018, 8, 11135. 43; X. Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2019, 166, 11480-11489)

RTF.

RTF 용액은 기존의 보고에 따라 트리에탄올아민, 포름아미드 및 증류수를 혼합하여 제조하였으며(T. Yu et al., Sci. Rep., 2018, 8, 1964. 41), 스페로이드 용액은 RTF-R1, RTF-R2 및 RTF-R3 용액으로 각각 30분, 1시간 및 1.5시간 동안 순차적으로 실온에서 처리하였다. 스페로이드는 이미징 전에 RTF-R3 용액에 담가 콘포컬 디쉬에 위치시켰다.

ScaleSQ(0).

ScaleSQ(0) 및 ScaleS4(0) 용액은 기존의 보고에 따라 제조되었다(H. Hama et al., Nat. Neurosci., 2015, 18). 요소 침전을 방지하기 위해 ScaleSQ(0) 용액은 사용할 때까지 30°C 이상에서 보관하였다. ScaleS 기반의 방법으로 처리된 스페로이드는 기존의 보고된 권장사항에 따라 면역 염색 후 사후 고정을 거쳤다. 30분 동안 4% 포름알데히드 용액으로 후고정된 스페로이드를 37℃에서 2시간 동안 ScaleSQ(0) 및 ScaleS4(0)로 순차적으로 처리하였다. 광학적 투명화 후, 스페로이드를 ScaleS4(0) 용액에 담가 콘포컬 디쉬에 위치시켰다.

Modified ScaleS.

ScaleS4 용액은 D-(-)-sorbitol, glycerol, urea, Triton X-100, dimethyl sulfoxide(DMSO)를 증류수에 혼합하여 기존에 공지된 방법에 따라 제조하였으며, 다만 Triton- X 100은 0.1%로 설정하였다. 수정된 ScaleS 투명화는 Boutin et al. Sci. Rep., 2018, 8, 11135.에 의해 제시된 프로토콜을 따라 수행하였다. 후고정된 스페로이드는 37°C에서 12시간 동안 ScaleS4 용액으로 처리한 뒤, 콘포컬 디쉬에 놓았다.

FOCM

FOCM 용액은 뇌절편 투명화 조건과 동일한 용액인, DMSO에 30%(w/v) urea, 20%(w/v) D-(-)-sorbitol, 5%(w/v) glycerol을 혼합하여 제조하였다(X. Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2019, 166, 11480-11489). 스페로이드는 실온에서 10분 동안 FOCM 용액으로 처리한 뒤, 콘포컬 디쉬에 놓았다.

모든 투명화된 샘플은 본 발명의 DCST 장치를 이용하여 콘포컬 디쉬로 옮기고 KAIST 분석 센터(Daejeon, Korea)에서, 콘포컬 레이저 주사현미경(LSM 880; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.

실시예 1-8: 통계분석

데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

IBM SPSS Statistics에서 Games-Howell 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석을 사용하여 세 그룹의 데이터를 비교하였다. p 값 >0.05, <0.05 및 <0.01은 각각 유의하지 않음(n.s.), 통계적으로 유의함(*) 및 매우 유의함(**)으로 간주하였다.

실시예 2: 액적 접촉 기반 스페로이드 전달(droplet contact-based spheroid transfer (DCST)) 장치의 설계 및 작동

순차적인 시약 처리는 드롭 어레이 칩(Drop array chip; DAC) 및 기둥 어레이 칩(Pillar array chip; PAC) DCST 장치를 사용하여 스페로이드 어레이를 전달하는 단계를 반복하여 수행된다(도1 A). 본 발명의 실시예에서, DCST 장치는 DAC, PAC 및 이들의 접촉 간격을 조절하기 위한 스페이서로 구성되며, 이의 예시적인 디자인은 도 1B와 같다.

DAC 및 PAC의 크기는 일반적인 384-well plate에 맞추어 제작하였으며, 실시예에서 사용된 어레이의 크기는 2x2(Clearing 용), 4x4 (특성 분석용) 및 5x10 (스페로이드 배양 및 면역 염색용)과 같이 필요에 따라 다양하게 디자인하였다.

스페로이드의 배양 또는 시약 액적을 만들기 위해 사용되는 DAC는 직경과 높이가 모두 3mm가 되도록 설계하였으며 최대 25μL의 액적을 포함할 수 있도록 설계되었다. DAC의 바닥은 가장자리에 기포가 형성되지 않도록 둥글게 설계하였다. DAC는 세포 현탁액을 로딩 및 배양하여 스페로이드를 배양하거나, 스페로이드 어레이의 액적환경을 변경하기 위해 빈 DAC에 시약을 로딩하여 사용하였다. DAC에 시약을 로딩한 뒤, DCST를 사용하여 스페로이드를 전달하는 방식은 파이펫팅하는 단계를 포함하지 않기 문에 시약의 교체 과정에서 스페로이드의 손실 또는 손상의 위험이 적다.

기둥 어레이 칩(PAC)은 스페로이드를 안정적으로 유지하고 이동시키는데 사용되도록 설계하였다. 기둥 어레이 칩은 잘린 원뿔 모양의 평평한 상단을 갖는 기둥(Flat plateau), 오목한 상단을 갖는 오목 기둥(Concave plateau), 및 공기 채널을 갖는 미세벽을 상단에 포함하는 기둥(Concave plateau with air channels)의 3가지 형태로 제조하였다.

기존 본 발명자들의 보고에서 DAC 및 PAC 몰드는 PMMA의 레이저 절단을 통해 제조되었으나, 본 발명의 실시예에서는 광경화성 수지를 사용한 3D 프린팅 기술을 이용하여 제조하였다(도 1C). 본 발명의 실시예에서 제조된 PAC는 오목한 상단 구조 및 공기 채널의 복잡한 구조를 갖기 때문에 제조공정에 실란(silane) 처리를 통해 복잡한 구조의 PDMS 기반의 장치를 생성하였다(도 2). 3D 프린팅 기술은 설계 자유도가 높기 때문에 DCST 장치는 이전에 보고된 방법(H. Kim et al., Biomicrofluidics, 2018, 12, 044109) 또는 전통적인 포토리소그래피(photolithography)를 사용하여 만든 것보다 스페로이드 배양, 처리 및 취급에 적합한 디자인을 설계할 수 있다.

도 1D는 본 발명의 DCST 장치를 이용한 스페로이드 전달 및 시약 처리 방법을 상세히 기재한다. 구체적으로 DAC에서 배양된 스페로이드는 PAC와 접촉하여, PAC 상단으로 이동되며 PAC 상단의 스페로이드는 워싱 버퍼 또는 시약이 로딩된 또 다른 DAC와 접촉하여, 시약 처리가 가능하다. 상기 과정에서, 스페로이드는 중력에 의해 아래에 위치한 DAC 또는 PAC에 이동되거나 유지되므로, 원하는 어레이 칩에 이동 또는 유지되도록 설계 및 사용될 수 있다.

실시예 3: 액적 접촉식 스페로이드 전달(droplet contact-based spheroid transfer (DCST)) 장치의 스페로이드 전달효율 확인

스페로이드를 가장 안정적으로 유지하고 전달할 수 있는 PAC의 기둥 디자인을 설계하기 위해 직경 450μm의 BT-474 스페로이드 및 1mm의 상단 너비를 갖는 세가지 디자인의 PAC를 사용하여 스페로이드 전달을 수행하였다(표 1).

이전의 보고(H. Kim et al., Biomicrofluidics, 2018, 12, 044109)에서 본 발명자들이 개발한 평평한 상단을 갖는 기둥은 약 80%의 스페로이드 전달률을 나타내었다. DAC와 평평한 상단을 갖는 기둥으로 구성된 PAC가 접촉하는 경우 높이가 낮은 형태의 액적이 기둥의 상부로 옮겨지는데, 스페로이드의 높이가 액적보다 높은 경우 안정적으로 스페로이드가 고정되지 않으며, 특히 평평한 상단으로 인해, 반복 접촉과 같이 기둥이 약간이라도 기울어지거나 외부의 힘이 가해지는 경우 액적 및 스페로이드가 기둥의 옆면을 따라 흘러내려 소실되는 현상이 나타났다.

오목한 상단을 갖는 기둥의 경우, DAC 및 PAC의 접촉으로 전달되는 액적의 높이가 평평한 상단을 갖는 기둥보다 높게 형성되고 스페로이드가 중앙부에 위치될 수 있도록 유도하였다. 오목한 상단을 갖는 기둥으로 제작된 PAC는 스페로이드 전달률이 약 10% 증가하였으나, 오목 구조와 액적사이에 공기가 갇히는 경우 스페로이드가 제대로 전달되지 않는 것으로 확인되었다.

이를 극복하기 위해, 오목 구조와 액적사이의 갇힌 공기가 빠져나갈 수 있도록 공기 채널을 추가한 기둥을 사용한 PAC의 경우 가장 안정적으로 가장 큰 부피의 액적을 수용할 수 있었으며 100%의 스페로이드 전달률을 나타내었다.

다음으로, 스페로이드 전달률과 기둥의 직경 및 스페로이드의 크기의 연관성에 대해 확인하였다(도 3A 내지 3C). BT-474 세포는 한 액적당 4000개의 세포 농도가 되도록 시딩하고, DCST 장치를 사용하여 2주간 배양하였다(도 4).

동일한 조건에서 기존의 스페로이드 마이크로 플레이트에서 배양된 스페로이드와 비교할 때 DCST 장치를 사용하여 배양한 스페로이드는 초기에 크기가 작았으나, 빠른 성장률을 나타내어 14일째 스페로이드 마이크로플레이트에서 배양한 스페로이드와 유사한 크기를 나타내었다. 기둥에 전달된 액적의 부피는 기둥의 직경에 비례하여 증가하였으며(도 3B), 1.4mm의 직경을 갖는 기둥에 전달된 액적의 부피는 0.7μL였다. 작은 스페로이드는 모든 기둥 직경에서 잘 전달되었으나, 스페로이드의 크기가 증가하면서 작은 직경 기둥으로의 전달률이 점차 감소하였다(도 3C). 반면, 직경이 1mm이상인 기둥은 14일 배양한 약 660μm 크기의 스페로이드도 100%의 전달률을 나타내었다.

상기 결과는 스페로이드 전달을 위해 기둥의 크기를 설계할 때, 스페로이드의 직경보다 일정한 여백을 가질 수 있도록(적어도 300μm 이상) 설계하여야 함을 의미한다. 스페로이드의 직경과 기둥의 직경이 동일하거나, 기둥보다 스페로이드의 직경이 큰 경우 DAC-PAC의 접촉에도 스페로이드가 전달되지 않는다. 따라서, 이하의 실시예에서는 상단 직경이 1mm인 에어채널을 갖는 오목 기둥을 갖는 PAC를 사용하여 실험을 진행하였다.

실시예 4: DCST 기반의 시약 처리 방법

PAC에 의해 독립적으로 전달된 스페로이드에 시약을 처리하는 DCST 장치 기반의 시약 처리방법을 수행하였다. 시약간의 교차오염을 방지하기 위해 각 단계 사이에 세척 단계를 도입하였다. DCST 장치를 사용한 세척 효율을 확인하기 위해 첫번째 시약으로 가정한 에리오글라우신(erioglauicine) 용액과 세척 버퍼로 PBS를 사용하였다(도 3D). 먼저, 첫 번째 시약을 로딩한 DAC를 PAC에 접촉시켜 PAC 상단에 첫 번째 시약의 액적을 전달하였다. 다음으로, PBS를 로딩한 DAC를 첫 번째 시약 액적이 전달된 PAC와 반복적으로 접촉시켜, 최종적으로 세척된 PAC 상의 액적에서 첫번째 시약의 부피와 농도를 측정하였다. 세척 단계 후 두번째 시약이 로딩된 DAC를 PAC와 접촉하고 두번째 시약이 로딩된 DAC에서 첫번째 시약의 농도를 측정하였다.

도 3E에 도시된 것과 같이 세척단계에서의 접촉 횟수가 증가할수록 첫 번째 시약의 부피가 점차 감소하고, 세척의 효율이 증가하였다. 세척 버퍼가 로딩된 DAC와의 접촉횟수가 20회 이상인 경우 세척 효율이 수렴되었다. 2차 시약을 로딩한 DAC로 전달된 첫번째 시약의 양은 세척단계를 수행하지 않은 경우에도, PAC 상에 존재하는 1차 시약의 양보다 낮았으며, 접촉횟수가 증가함에 따라 감소하여 20회를 초과할 때 수렴되는 경향을 나타내었다. 한편, 2차 시약 액적에서의 세척 효율은 PAC 상의 액적과 세척 액적의 접촉 횟수가 0일 때 99.3%에서 시작하여 접촉 횟수가 20회 이상일 때 99.99%로 수렴하였다. 이는 PAC로 전달되는 액적의 부피가 DAC의 액적 부피의 1% 미만이기 때문이다. 따라서, 충분한 세척과정을 거친 스페로이드를 2차 시약 액적으로 옮기면 1차 시약과 2차 시약의 농도가 각각 초기 농도의 0.01% 및 99.3%가 됨을 의미한다.

실시예 5: 사용자 간의 편차 비교 실험

기존의 수동 파이펫팅 방법을 이용한 스페로이드의 전달은 사용자의 기술에 따라 사용자간의 편차가 매우 컸기 때문에, DCST 장치를 사용하는 경우의 사용자간 편차를 비교하였다. 상기 실시예 4의 시약의 교환 단계를 사용하여 스페로이드 배양 배지를 신선한 배지로 교환하였다. DCST 장치 또는 스페로이드 마이크로플레이트를 다뤄보지 않은 7명의 실험자를 모집하였다. 도 5A는 파이펫팅 방법을 사용한 배지의 교환 방법을 나타내며, 도 5B는 DCST 장치를 사용한 배지 교환 방법을 나타낸다. 각 실험은 16개의 스페로이드를 사용하였으며 3회 독립하여 반복 수행하였다. 또한, DCST 장치를 사용한 방법을 자동화된 파이펫팅 플랫폼을 사용한 방법과 비교하기 위해서, 96-well 스페로이드 마이크로플레이트에서 동일한 조건의 스페로이드를 준비하고 자동화 파이펫팅 플랫폼((12-channel VIAFLO electronic pipette integrated with an ASSIST pipette adapter; Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland)을 사용하여 배지를 교환하였다. 바닥에서 파이펫 팁의 높이에 따른 스페로이드의 유지율 및 잔류 액적의 부피는 도 6에 나타내었다. 자동 파이펫팅 실험에서는 최대 24개의 스페로이드를 사용하였다.

도 5C 및 5D에 나타난 것과 같이, 모든 실험 참가자의 데이터에서 DCST 장치를 사용한 배지 변경 방식을 사용하는 경우에 스페로이드의 유지율은 수동 파이펫팅을 사용하여 배지를 변경하는 경우보다 현저히 높게 나타났다(도 5C). 또한 DCST 장치를 사용한 방법은 수동 파이펫팅 방법을 사용할 때보다 현저히 작은 편차를 나타내었다. DCST 장치를 사용한 방법의 경우, 전체 평균에 비해 스페로이드의 평균 유지율은 97.92%, 표준편차는 4.11%였으며, 수동 파이펫팅을 사용한 평균 유지율은 77.98% 및 표준편차 21.97%를 나타내었다(도 5D). 또한, 변동계수의 경우 DCST 장치를 사용한 경우 4.20%, 수동 파이펫팅 방법의 경우 28.18%를 나타내어 DCST 장치를 사용한 방법이 수동 파이펫팅보다 사용자에 관계없이 높은 스페로이드 유지율을 나타낼 수 있음을 의미하며, 2회 이상의 추가적인 배지 교환 또는 시약처리 단계가 추가될수록 상기 두 방법 간의 평균 유지율과 표준편차의 차이가 더욱 클 것이라 할 수 있다.

또한, 자동 파이펫팅 플랫폼을 사용하는 경우에도 94.44%의 평균 유지율 및 5.20%의 표준편차, 5.50%의 변동계수를 나타내어, DCST 보다도 다소 낮은 효율을 나타내었다. 자동 파이펫팅 플랫폼에서, 스페로이드의 손실을 최소화하면서, 잔류 액체를 최대한 제거할 수 있는 파이펫 팁의 최적의 높이는 1.3mm였으며, 이 경우 잔여 액체는 13.63μL로 약 7%의 잔류율을 나타내나, 앞서 설명한 것과 같이 1mm 기둥을 사용하는 DCST 장치에서 잔류 액체 부피는 약 1%이다. 이는 DCST 장치를 사용한 방법에서 시약 교체 사이에 하나의 세척단계를 추가하는 것과 동일한 효과를 얻기 위해서 자동 파이펫팅 플랫폼에서는 두 번 이상의 세척단계가 필요함을 의미한다. DCST는 자동화 파이펫팅 플랫폼과 다소 뛰어난 스페로이드 유지율 및 편차를 보였으나 자동화된 파이펫팅보다 훨씬 작은 잔류 액체 부피를 나타내었다.

실시예 6: DCST를 사용한 화학적 염색 및 면역형광 염색

DCST 장치 기반의 플랫폼이 스페로이드 어레이의 생물학적 분석을 위한 플랫폼으로 기능할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 DCST 장치를 사용하여 스페로이드의 Live/Dead 염색, 저산소 염색 및 면역 염색을 수행하였다. BT-474 세포를 한 액적당 4000개의 초기 접종 농도로 DAC에 시딩하고 14일간 배양하였다.

화합물을 사용한 스페로이드 어레이의 Live/Dead 염색, 저산소 염색 은 모두 DCST 장치를 통해 수행할 수 있다 (도 7A). 2주 후, 스페로이드는 이전의 보고된 것과 같이, 괴사 및 저산소 코어를 나타냈다. 저산소 영역은 괴사 코어보다 더욱 크고 뚜렷하게 나타났다. 배양 7일째에, 500μm 크기의 스페로이드에서는 저산소증의 발현 및 괴사 중심이 나타나지 않음을 확인하였다. 높은 산소 투과도를 나타낼 수 있는 바닥을 갖는 장치에서 배양된 스페로이드가 괴사 코어와 저산소 부분이 적었다는 기존의 연구에 기반하여 판단하면, 행잉 드롭 시스템은 기존의 웰 플레이트 또는 기타 미세 유체보다 산소투과도가 상대적으로 높을 수 있다.

다음으로 DCST 장치를 이용하여 면역염색을 하는 경우 표적단백질이 잘 표지될 수 있는지 확인하기 위해, 저산소증 표지자인 HIF-1α와 세포-세포 접착 표지자인 E-cadherin을 표적으로 면역염색하였다. 스페로이드는 DCST를 사용하여, 고정, 투과화 및 차단을 진행한 후 면역염색하였다. 전처리 단계를 포함하는 전체 면역염색 과정에서, 코팅을 하지 않는 경우 고정 단계 후 스페로이드가 장치에 부착되었기 때문에 BSA로 코팅한 DAC 및 PAC를 사용하였다(도 8). 코팅되지 않은 장치를 이용하여 면역염색을 수행하는 경우 스페로이드가 최종 공정을 거치지 않아 스페로이드가 유실되었다. 따라서, 기포가 형성되는 것을 방지하면서 장치를 BSA 용액으로 코팅하였는지 확인하였다. 하나의 장치에서 각각의 스페로이드에 대해 여러 조건을 동시에 처리할 수 있음을 입증하기 위해, 스페로이드 어레이의 각 열마다 5가지의 다른 조건으로 DAC를 구성하여 스페로이드 어레이의 면역 염색을 수행하였다. 테스트한 모든 항체 유형에서 형광의 강도는 1차 항체의 농도에 따라 증가하였다(도 7B 및 7C). 또한, 형광 강도는 HIF-1α 보다 E-cadherin에서 더욱 밝게 나타나는 경향이 있었다. HIF-1α의 경우 1차 항체 농도가 1/100일 때 blank 값과 차이가 나기 시작하였고 농도가 1/50일 때 명확히 구분되었다. 한편, E-cadherin의 경우 1차 항체 농도가 1/400일 때 blank 값과 차이를 보였다.

스페로이드 어레이 내 염색 균일성을 확인하기 위해 DCST 장치 및 기존 스페로이드 마이크로플레이트의 스페로이드를 각각 DCST 및 수동 파이펫팅 방법을 사용하여 면역 염색하였다(도 7D). DCST 장치를 사용하여 면역염색된 스페로이드 어레이는 모든 시험 조건에서 수동 파이펫팅 방법에 비해 더 균일하게 염색되었으며, 형광강도도 수동 파이펫팅 방법을 사용하여 스페로이드 마이크로플레이트에서 면역 염색을 수행하는 경우보다 더욱 밝게 나타났다. 수동 파이펫팅으로 염색된 BT-474 스페로이드의 변동계수는 변동 계수는 HIF-1α의 경우 5.52%, E-cadherin의 경우 9.59%였다. DCST를 이용하여 염색한 스페로이드의 경우, 각 조건에 따른 변동계수는 각각 2.49%와 4.85%로 더 낮은 값을 보였다. 변동계수가 5% 미만일 때 데이터의 신뢰성이 높아짐을 알 수 있어 DCST 플랫폼은 신뢰성 있는 면역염색 플랫폼으로의 적용 가능성을 나타낸다.

실시예 7: DCST 장치를 이용한 스페로이드의 투명화

전체 스페로이드 이미징의 마지막 단계로 본 발명의 DCST 기반 장치를 사용한 투명화가 가능한지 확인하였다. 스페로이드 어레이를 PBS로 투명화한 뒤, 이를 PAC에 놓고 투명화 용액이 로딩된 DAC와 접촉시켰다. 물(또는 PBS)와 투명화 용액의 밀도차로 인해 접촉 직후 스페로이드가 액적의 상단으로 떠올랐다가 스페로이드 내부의 액체가 투명화 용액으로 교체됨에 따라 다시 침전되었다. 스페로이드를 투명화용액에서 행잉 드롭 형태로 배양할 때, 증발 속도의 차이로 인한 드롭 부피의 증가를 방지하기 위해 배양용기 바닥에 PBS를 두지 않고 배양하였다. 스페로이드의 투명화결과는 도 9에 도시된 것과 같다. 모든 투명화 방법에서 스페로이드가 더욱 투명해지고, E-cadherin, HIF-1α 및 nuclei의 형광 신호도 spheroid 내부에서 나오는 것을 관찰하였다. 간단히 비교하여, 투명화하지 않은 스페로이드의 광 투과 깊이는 약 40μm인 반면, 투명화된 스페로이드의 투과 깊이는 약 2배 이상이었다. 그러나, 일부 형광신호는 RTF 및 FOCM 방법에 의해 투명화된 스페로이드에서 상당히 약화되는 것으로 관찰되었다. RTF는 ClearT2를 개량한 방법으로 ClearT2 시료에서 핵의 형광신호가 약해진다는 보고가 있었다. 따라서 같은 이유로 신호가 약해진 것으로 이해된다. FOCM의 경우 ScaleS의 개선된 방법으로, 용매를 물에서 DMSO로 변경하여 신속하게 투명화할 수 있으며, 이는 탈지(delipidation) 및 과수화(hyperhydration)과정이 빠르게 일어나는 가혹한 환경이 될 수 있음을 의미한다. 또한, 또한, ScaleSQ(0) 및 변형된 ScaleS의 경우 매뉴얼에 따라 면역염색 직후 후고정을 시행하였으나, FOCM의 경우 명시되지 않아 고정을 하지 않아 이 역시 형광 신호가 약화된 것으로 판단된다. 그럼에도 불구하고 스페로이드의 투명화는 스페로이드 내부의 이미징을 용이하게 하는 데 도움이 됨을 확인하였으며, 전체 스페로이드에서 표적 마커의 위치별 발현 분석에 필수적인 기법이 될 수 있다.

실시예 8: 다른 형태의 DCST 장치의 설계

실시예 8-1: 행잉 드롭 마이크로 어레이(Hanging Drop Microarray; HDMA)

상기 실시예에서 제작된 DCST는 하부가 막힌 웰 플레이트형태의 드롭 어레이 칩(DAC)을 사용하여 스페로이드를 배양하였으며, 본 발명의 DAC를 뒤집어(Flip) 기둥 어레이 칩(PAC)과 접촉시킴으로써 스페로이드를 PAC 내 기둥의 상단에 전달하였다. 그러나 이러한 구조의 DAC를 사용한 DCST 장치는 스페로이드 배양 용액의 점도, 웰의 크기 및 재질, 사용자의 숙련도 등에 따라, DAC를 뒤집는 과정에서, 스페로이드를 포함하는 용액이 드롭을 형성하지 못하고 흘러내리는 등 스페로이드의 손상이나 소실될 가능성을 배제할 수 없다.

따라서, 본 발명자들은 별도의 뒤집기(Flip) 과정 없이 드롭 어레이의 액적과, PAC를 접촉시키기 위해서 국제특허 공개 제WO2015/129263호에 개시된 하부에 복수의 구멍을 갖는 행잉 드롭 마이크로 어레이(Hanging Drop Microarray; HDMA)를 제작하였다(도 10).

국제 특허공개 제WO2015/129263호 및 도 10에 도시된 것과 같이 상기 HDMA는 하부에 복수의 미세한 구멍을 포함하는 구조를 나타내며, 하부의 구멍이 고체나 액체 표면에 의해 막히지 않도록 상기 HDMA는 바닥에서 어느 정도 띄운 상태를 유지한다. 세포 현탁액(cell suspension)을 용기에 주입하면, 시간이 지남에 따라 중력에 의해 세포들이 가라앉으면서 하부의 구멍에서 스페로이드를 형성한다.

도 11은 하부에 복수의 구멍을 갖는 상기 HDMA에서 스페로이드를 생성한 결과이다. 스페로이드의 배양은 하루 간격으로 배양액을 교체하여 진행하였다. 시간이 지남에 따라 구멍에 가라앉은 세포들은 서로 상호작용하여 밀도 높은 스페로이드를 형성한다. 이 과정에서 세포의 생존율은 높게 유지된다. 또한 스페로이드는 구멍의 개수만큼 생성되고, 각 구멍에는 한 개의 스페로이드가 존재한다. 나아가 앞서 기재한 같이 행잉 드롭 시스템은 액적과 공기의 계면에서 스페로이드가 형성되기 때문에 실시예 6의 웰 플레이트를 사용하여 제조된 스페로이드보다 산소투과도가 상대적으로 높아, 괴사 코어와 저산소 부위가 적게 나타날 것임을 예상할 수 있다.

실시예 8-2: 다양한 형태의 액적 포획 구조를 갖는 액적 포획용 마이크로 어레이의 설계 및 제조

상기 실시예 3에서 뛰어난 효과를 나타낸 에어 채널을 포함하는 오목한 상부를 갖는 오목 기둥 기반의 마이크로어레이(Concave pillar microarray; CPMA)를 기반으로, 실시예 8-1에서 제조된 HDMA의 미세 구멍에 접촉할 수 있도록 거리 및 크기를 설계하여 어레이 칩으로 제조하였다(도 12).

나아가, 오목 기둥 기반의 마이크로어레이를 사용한 스페로이드 액적의 전달은 실질적으로 기둥 상단에 형성된 에어채널을 포함하는 벽으로 구성된 오목한 구조와의 접촉에 의해 발생하기 때문에, 기둥을 제거하고 평면상에 에어 채널을 포함하는 미세 벽을 형성시켜, 새로운 형태의 액적 포획용 어레이 칩을 제조하였다(도 13).

또 다른 액적 포획용 어레이 칩의 예로서, 상기 액적 포획용 어레이 칩은 미세구조가 없어도 액적의 크기를 안정적으로 유지할 수 있도록, 액적을 놓을 부분은 친수성, 나머지 부분은 소수성으로 처리하여 제조할 수 있다.

도 8-3: DCST 장치를 사용한 스페로이드 전달 방법

상기 행잉 드롭 마이크로어레이 및 다양한 액적 포획용 마이크로어레이를 사용하여 액적 접촉식 스페로이드 전달(DCST) 장치를 제조하였다.

도 14는 본 발명의 오목 기둥 기반의 마이크로어레이(Concave pillar microarray; CPMA)를 사용한 액적 접촉식 스페로이드 전달 방법을 통해 행잉 드롭 마이크로어레이에서 제조된 스페로이드의 전부(도 14A) 또는 일부 (도 14B)를 고립된 액적 어레이로 분리하는 방법을 나타낸 것이다. 구체적으로 용기의 구멍과 디바이스의 기둥 상면의 위치를 정렬시킨 후 둘의 간격을 좁혀 용기의 액체가 기둥 상면에 접촉시킨다. 이후 다시 둘의 간격을 넓혀 비접촉된 상태로 돌아가게 하면 기둥 상면에는 용기에 존재하는 액체와 동일한 액체로 이루어진 액적이 형성되고, 스페로이드는 중력에 의해 기둥 상면에 위치한 액적 내에 잔여하게 된다. 이를 이용하여 대량으로 형성한, 같은 액체 환경으로 연결되어 있는 스페로이드 어레이를 서로 분리된 액적 어레이의 형태로 존재하게 할 수 있다. 이를 통해 스페로이드 액적 어레이를 빠르고 효율적으로 형성할 수 있고, 추후 각 스페로이드별로 다른 종류, 농도, 조합의 조건을 주어 스페로이드 어레이 내에서 다양한 조건을 동시에 처리하는 것이 가능하다.

실시예 8-4: 액적 접촉식 스페로이드 전달(DCST) 장치를 이용한 스페로이드 전달 확인

본 발명의 액적 접촉식 스페로이드 전달 장치를 이용한 스페로이드의 전달을 확인하였다.

첫째로, HDMA와 오목 기둥 기반의 마이크로어레이(Concave pillar microarray; CPMA)를 사용하여 선택적으로 생성된 스페로이드의 일부를 포획하여 고립된 스페로이드 액적 어레이를 제조하였다(도 15, i).

실시예 8-2에서 제조된 평면상에 에어 채널을 포함하는 미세 벽을 갖는 형태의 액적 포획용 어레이 칩은 상기 CPMA로부터의 2차 전달을 위해, 스페로이드 없이 콜라겐 하이드로젤이 로딩된 HDMA와 접촉하여 콜라겐 하이드로젤만을 전달하여 액적을 형성하여, 하이드로젤 지지 마이크로어레이(Hydrogel support microarray; HSMA)를 제조하였다(도 15, ii).

CPMA를 뒤집어 CPMA상에 포획된 스페로이드 액적을 HSMA상의 콜라겐 하이드로젤 액적과 접촉시켜 스페로이드를 HSMA로 전달하여, 스페로이드-수화젤 액적 어레이를 형성하였다(도 15, iii).

최종적으로 생성된 스페로이드-수화젤 액적 어레이에서, 스페로이드가 손상 없이 전달되었는지 확인한 결과 도16에 도시된 것과 같이 수화젤 액적까지의 이식 과정에서 스페로이드의 손상이 발생하지 않았으며, 스페로이드가 수화젤 액적 내에서 안정적으로 배양되어 시간이 지남에 따라 크기, 진원도(circularity), 원마도(roundness)가 모두 증가함을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

오목부를 포함하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이로 상기 오목부는
i) 하나 이상의 미세 벽에 의해 형성되거나; 또는
ii) 기둥의 상단면에 형성되는 것을 특징으로 하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이.
제1항에 있어서, 상기 오목부는 반구 또는 반타원구 형태인 것을 특징으로 하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이.
본 발명에 있어서, 상기 오목부는 공기 채널을 포함하는 것을 특징으로 하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이
제1항에 있어서, 상기 액적은 스페로이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이.
제4항에 있어서, 상기 오목부의 너비는 액적에 스페로이드보다 큰 것을 특징으로 하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이.
제4항에 있어서, 상기 오목부의 너비는 스페로이드보다 적어도 300μm 이상 큰 것을 특징으로 하는 접촉식 액적 포획 구조 어레이.
스페로이드 어레이; 및 1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 포함하는 스페로이드 전달 장치.
제7항에 있어서, 상기 스페로이드 어레이는 행잉 드롭 어레이인 것을 특징으로 하는 스페로이드 전달 장치.
제7항에 있어서, 상기 행잉 드롭 어레이는 하부에 복수의 구멍을 포함하며, 상기 구멍에 스페로이드를 포함하는 액적이 형성되는 것을 특징으로 하는 스페로이드 전달 장치.
제7항에 있어서, 스페이서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스페로이드 전달 장치.
제7항에 있어서, 상기 스페로이드 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부를 접촉시키는 경우, 스페로이드를 함유하는 액적이 상기 오목부로 액적이 포획되는 것을 특징으로 하는 스페로이드 전달 장치.
제11항에 있어서, 상기 스페로이드 어레이는 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 위에서 오목부에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 스페로이드 전달 장치.
(a) 스페로이드 어레이와 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 스페로이드 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 상기 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부에 스페로이드를 함유하는 액적을 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스페로이드의 전달방법.
제13항에 있어서, 상기 (a) 단계는 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 오목부의 위에서 스페로이드 어레이를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 스페로이드의 전달방법.
(a) 배양된 스페로이드 어레이와 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 배양된 스페로이드 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 고립된 스페로이드 액적 어레이를 제조하는 단계; 및
(c) 고립된 스페로이드 액적 어레이를 시약이 로딩된 어레이에 접촉하는 단계를 포함하는 스페로이드에 시약을 처리하는 방법.
제15항에 있어서,
(b') 상기 (C) 단계 전, 세척 버퍼가 로딩된 드롭 어레이의 아래에서 상기 (b) 단계의 고립된 스페로이드 액적 어레이를 접촉 및 접촉 해제하여 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 (c) 단계는 시약이 로딩된 어레이 아래에서 고립된 스페로이드 액적 어레이를 접촉하여 시약을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 배양된 스페로이드 어레이와 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 접촉식 액적 포획 구조 어레이를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 배양된 스페로이드 어레이와 접촉식 액적 포획 구조 어레이의 접촉을 해제하여 고립된 스페로이드 액적 어레이를 제조하는 단계; 및
(c) 고립된 스페로이드 액적 어레이를 배지가 로딩된 드롭 어레이에 접촉하여 스페로이드를 전달하는 단계를 포함하는 스페로이드 배지의 교환 방법.
제18항에 있어서, 상기 (c) 단계는 배지가 로딩된 드롭 어레이 위에서 고립된 스페로이드 액적 어레이를 접촉하여 시약을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.