KR20230112808A - 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법, 이에 따른 녹차 추출물 및 이의 용도 - Google Patents

항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법, 이에 따른 녹차 추출물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법, 이에 따른 녹차 추출물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 녹차 추출물은 B. cereus 및 S. aureus 등에 대해 우수한 항균 활성을 가지면서도 친환경적이고 식품학적으로 안전하다. 또한, 본 발명에 따른 녹차 추출물은 총 페놀 화합물 함량 및 총 플라보노이드 함량이 증대되어 항산화 활성이 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 녹차 추출물을 식품 보존제 등의 용도로 사용하는 경우 가공식품, 특히 어육 가공품의 보존성을 증대시키고 유해균 증식 또는 식중독 발생 등을 예방함으로써 안전한 식품 유통 및 국민의 식생활 안정에 기여할 수 있다.

Description

항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법, 이에 따른 녹차 추출물 및 이의 용도{Method for preparing green tea extract with enhanced antimicrobial and antioxidant activity and green tea extract using the same, and uses thereof}
본 발명은 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법, 이에 따른 녹차 추출물 및 이의 용도에 관한 것이다.
어묵은 어육가공품 가운데 하나로 원료 어육의 염용성 단백질을 용출시켜 만든 고기풀에 전분, 부재료 등을 첨가하여 성형한 뒤 steaming, frying 또는 baking 등과 같은 가열 공정을 거쳐 만든 것으로 연제품에 속한다. 이와 같은 어육 연제품은 저온 저장 및 유통 중에도 부패가 쉽게 일어나는데, 제조 시 사용되는 원료 연육, 부재료인 전분 및 농산물 등에서 유래되는 내열성 포자 형성균인 바실러스 속 세균이 원인인 것으로 알려져 있다. 바실러스 속 세균은 가열처리 후에도 포자로 존재하여 생육에 적절한 환경이 되었을 때 증식하여 어육 연제품에서 기포, 어묵의 연화, 얼룩무늬 등으로 나타난다. 이를 방지하기 위해 어육 연제품, 특히 어묵의 제조에 소르브산칼륨과 같은 합성 보존료의 첨가가 필요하다.
또한, 어묵의 경우 단백질의 열 변성 및 첨가된 전분의 겔 형성을 유도하여 탄력성을 생성하기 위해 가열 공정을 거쳐 제조된다. 그런데 어묵의 원료 어육에는 불포화도가 높은 지질이 함유되어 있으며, 특히 튀김 어묵의 경우 가공 중 과도한 열처리로 인한 지질산패 및 가열처리된 유지가 최종 제품에 함유되어 있어 저장 중 지질산패가 쉽게 일어날 수 있어 항산화제의 첨가가 필요하다.
그런데, 소비자의 식품 안전성에 대한 의식 향상 및 건강 지향적 식물화로의 소비패턴 변화 등으로 가능한 한 합성 보존료 및/또는 합성 항산화제 등의 합성 첨가물을 사용하지 않는 방법으로 전환하는 것이 요구되고 있다.
한편, 식물은 자외선, 기생충, 미생물 등 외부 환경 스트레스로부터 스스로를 보호하기 위해 phenolics, alkaloids, flavonoids 계열의 phytochemicals 물질을 생합성한다. 식물의 잎에 있는 mesophyll 영역에 1차 대사를 위한 엽록소를 포함하여 생체 방어기작을 담당하는 2차 대사산물인 phytochemicals 물질이 축적되어 있다. 이러한 phytochemicals 물질은 식물의 2차 대사산물로 다양한 생리활성 효과 및 항미생물 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 상기 phytochemicals 물질 대부분은 세포 내부에 존재하므로 세포벽 파괴를 하지 않는 기존의 미세균질 및 용매 추출법으로는 회수율이 낮을 수밖에 없다.
본 발명자들은 녹차잎으로부터 2차 대사산물인 phytochemicals 물질들의 회수율을 증가시킴으로써, 항균 활성 및 항산화 활성이 향상된 녹차 추출물을 개발하였다.
Isah, 2019, Biological Research 52:39 Jun JY, et al., 2015, Isolation of antimicrobial agent from the marine algae Cystoseira hakodatensis, Int. J. Food Sci. Tech. 50, 871-877. Jun JY, et al., 2021, Inhibitory effect of an antioxidant complex on the lipid oxidation of freeze-dried convenience food, Korean J. Food Preserv. 28, 654-662. Park YH, et al., 1994, 6. Fish meat paste. In:Fishery processing and utilization. Hyungseul Publishing, Seoul, Korea, 791-837. Yamazaki K, et al., 2014, Growth inhibition of spore-forming bacteria in fish-paste products by nisin, Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi 61, 70-76.
본 발명의 목적은 환경친화적이고 인체에 무해하며, 다양한 식품 오염균 내지 병원균에 대하여 우수한 항균 활성을 가지면서 우수한 항산화 활성을 가지는 녹차 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 녹차잎을 건조시킨 후 분쇄하여 녹차 분말을 준비하는 단계; (2) 상기 녹차 분말에 물을 첨가한 후 균질화하는 단계; (3) 상기 녹차 균질액에 효모균을 접종하여 발효시키는 단계; (4) 상기 녹차 균질액의 발효액을 열처리하여 실활시키는 단계; (5) 상기 실활시킨 발효액에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 그들의 혼합용매를 첨가하여 추출하는 단계;를 포함하는 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (1) 단계의 녹차 분말은 평균 입도가 100 ㎛ 이하일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (2) 단계의 물은 녹차 분말에 대하여 5 내지 15 부피배로 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (2) 단계의 균질화는 8,000 내지 12,000 rpm으로 0.5 내지 5분간 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (2) 단계 및 (3) 단계의 사이에, (2-1) 상기 녹차 균질액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제의 혼합효소를 1 내지 4 중량부로 첨가한 후 반응시키는 단계;를 추가하여 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 효소 반응은 40 내지 60 ℃에서 10 내지 20시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (3) 단계의 효모균은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (3) 단계의 효모균은 4 내지 5 log CFU/mL로 첨가될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (3) 단계의 발효는 30 내지 40 ℃에서 2 내지 3일간 100 내지 300 rpm으로 진탕배양하여 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (3) 단계 및 (4) 단계의 사이에, (3-1) 상기 녹차 발효액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제의 혼합효소를 1 내지 4 중량부로 첨가한 후 반응시키는 단계;를 추가하여 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (5) 단계의 혼합용매는 70 내지 90%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 녹차 추출물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로로커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 따라 제조되어 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는 어육 또는 어육 가공품의 선도 유지용 보존제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 녹차 추출물을 포함하여 보존성이 증진된 어육 가공품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 어육 가공품은 어묵일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 녹차 추출물은 B. cereus 및 S. aureus 등에 대해 우수한 항균 활성을 가지면서도 친환경적이고 식품학적으로 안전하다. 또한, 본 발명에 따른 녹차 추출물은 총 페놀 화합물 함량 및 총 플라보노이드 함량이 증대되어 항산화 활성이 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 녹차 추출물을 식품 보존제 등의 용도로 사용하는 경우 가공식품, 특히 어육 가공품의 보존성을 증대시키고 유해균 증식 또는 식중독 발생 등을 예방함으로써 안전한 식품 유통 및 국민의 식생활 안정에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 추출물의 제조방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에서 사용된 녹차 분말을 주사전자현미경으로 관찰한 이미지이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에서 사용된 녹차 분말의 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 녹차 추출물의 수율을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 녹차 추출물의 B. cereus에 대한 항균 활성을 나타내는 그래프이고, 도 4b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 녹차 추출물의 S. aureus에 대한 항균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 녹차 추출물의 총 페놀 화합물 함량을 나타내는 그래프이고, 도 5b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 녹차 추출물의 총 플라보노이드 함량을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에서, 용어 “어육 가공품”은 어육 연제품, 어포, 어육 패티(Patty), 어육 맛바, 조미 어육 등을 총칭하는 것으로 생선의 살만을 분리하여 가공한 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은 (1) 녹차잎을 건조시킨 후 분쇄하여 녹차 분말을 준비하는 단계; (2) 상기 녹차 분말에 물을 첨가한 후 균질화하는 단계; (3) 상기 녹차 균질액에 효모균을 접종하여 발효시키는 단계; (4) 상기 녹차 균질액의 발효액을 열처리하여 실활시키는 단계; (5) 상기 실활시킨 발효액에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 그들의 혼합용매를 첨가하여 추출하는 단계;를 포함하는 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법에 관한 것이다(도 1 참조).
(1) 녹차 분말 준비 단계
먼저, 녹차잎을 건조시킨 후 분쇄하여 녹차 분말을 준비한다.
상기 녹차 분말은 평균 입도가 100 ㎛ 이하, 바람직하게는 50 ㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 20 ㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 ㎛일 수 있다.
상기 녹차 분말의 평균 입도가 상기 하한치 미만인 경우 일반적인 분쇄기가 아닌 초미분쇄기가 필요하게 되어 분쇄 및 채에 여과하기 위한 생산비용이 크게 증가될 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 항균 및 항산화 활성 증진 효과가 미미해질 수 있다.
(2) 균질화 단계
상기 녹차 분말에 물을 첨가한 후 균질화한다.
일 구현예에 있어서, 상기 물은 녹차 분말에 대하여 5 내지 15 부피배, 바람직하게는 7 내지 13 부피배, 더욱 바람직하게는 9 내지 11 부피배의 양으로 첨가될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 균질화는 8,000 내지 12,000 rpm으로 0.5 내지 5분간 수행될 수 있다.
상기 균질화 단계를 거치지 않고 단순히 녹차 분말과 물을 혼합한 경우 원료가 잘 분산 되지않고, 유효성분 회수율 또한 낮아지는 문제점이 생길 수 있다.
(2-1) 효소처리 단계
상기 녹차 균질액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제의 혼합효소를 1 내지 4 중량부, 바람직하게는 2 내지 3 중량부로 첨가한 후 반응시킬 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 혼합효소는 셀룰라아제 및 펙티나아제가 1 : 0.1 내지 5의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.3 내지 3의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 내지 2의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 내지 1.5의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.8 내지 1.2의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
상기 셀룰라아제 및 펙티나아제의 중량비가 상기 범위일 때 녹차 추출물의 수율이 극대화될 수 있다. 상기 셀룰라아제에 대한 펙티나아제의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 수율 증대 효과가 미미해질 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 혼합효소의 첨가량이 상기 범위일 때 녹차 추출물의 수율이 극대화될 수 있다. 상기 혼합효소의 첨가량이 상기 하한치 미만인 경우에는 수율이 미미해질 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 효소사용량 증가에 따른 생산비가 높아져 비용적인 측면에서 비효율적이다.
일 구현예에 있어서, 상기 효소 반응은 40 내지 60 ℃, 바람직하게는 45 내지 55 ℃에서 10 내지 20시간, 바람직하게는 12 내지 20시간 동안 수행될 수 있다. 상기 효소 반응 온도 및 시간이 상기 범위일 때 수율 증대 효과가 극대화될 수 있다.
(3) 효모 발효 단계
상기 녹차 균질액에 효모균을 접종하여 발효시킨다.
상기 효모균은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 효모균은 4 내지 5 log CFU/mL로 첨가될 수 있다. 효모균의 첨가 농도가 상기 범위일 때 녹차 추출물의 항균 및 항산화 활성이 극대화될 수 있다. 효모균의 첨가량이 상기 하한치 미만인 경우에는 녹차 추출물의 항균 및 항산화 활성이 미미해질 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 스타터 균주 배양을 위한 비용이 증가되어 경제성이 떨어질 수 있는 문제점과 균증식 활성이 낮아져 유효성분 생산수율이 저하 될 수 있는 문제점이 생길 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 발효는 30 내지 40 ℃에서 2 내지 3일간 100 내지 300 rpm으로 진탕배양하여 수행될 수 있다. 상기 효모 발효 온도 및 시간이 상기 범위일 때 항균 및 항산화 활성 증진 효과가 극대화될 수 있다.
본 발명의 녹차 균질액에 효모균을 접종하여 발효시킨 발효액의 항균 및 항산화 활성이 녹차 용매 추출물에 효모균을 접종하여 발효시킨 발효액에 비해 현저히 우수한 것을 구체적으로 확인하였다.
(3-1) 효소처리 단계
상기 (2-1) 단계를 수행하지 않은 경우에, 상기 녹차 발효액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제의 혼합효소를 1 내지 4 중량부, 바람직하게는 2 내지 3 중량부로 첨가한 후 반응시킬 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 혼합효소는 셀룰라아제 및 펙티나아제가 1 : 0.1 내지 5의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.3 내지 3의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 내지 2의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 내지 1.5의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.8 내지 1.2의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
상기 셀룰라아제 및 펙티나아제의 중량비가 상기 범위일 때 녹차 추출물의 수율이 극대화될 수 있다. 상기 셀룰라아제에 대한 펙티나아제의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 수율 증대 효과가 미미해질 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 혼합효소의 첨가량이 상기 범위일 때 녹차 추출물의 수율이 극대화될 수 있다. 상기 혼합효소의 첨가량이 상기 하한치 미만인 경우에는 수율 증대 효과가 미미해질 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 분해율의 차이가 미미하고 효소 사용량 증가에 따른 생산비가 높아져 비용적인 측면에서 비효율적인 문제점이 생길 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 효소 반응은 40 내지 60 ℃에서 10 내지 20시간 동안 수행될 수 있다. 상기 효소 반응 온도 및 시간이 상기 범위일 때 수율 증대 효과가 극대화될 수 있다.
(4) 실활 단계
상기 녹차 균질액의 발효액을 열처리하여 실활시킨다.
상기 열처리는 100 내지 140 ℃, 바람직하게는 110 내지 130 ℃, 더욱 바람직하게는 115 내지 125 ℃, 더욱 바람직하게는 120 내지 125 ℃의 온도로 1 내지 10분, 바람직하게는 2 내지 8분, 더욱 바람직하게는 4 내지 6분 동안 수행될 수 있다.
(5) 추출 단계
상기 실활시킨 발효액에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 그들의 혼합용매를 첨가하여 추출한다.
본 발명의 녹차 발효액은 추출용매와 1 : 1 내지 5, 바람직하게는 1 : 1 내지 3, 더욱 바람직하게는 1 : 1 내지 2의 중량비로 혼합하여 20 내지 60 ℃, 바람직하게는 25 내지 55 ℃, 더욱 바람직하게는 30 내지 50 ℃에서 1 내지 6시간, 바람직하게는 1 내지 3시간 동안 추출한 후 감압농축을 수행하여 추출물을 제조한다. 상기 녹차 발효액과 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 녹차 발효액의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
상기 물은 식품 제조에 적합할 경우 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 지하수, 정제수, 증류수, 탈이온수 등이 이용될 수 있다.
상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 특별히 한정할 필요는 없으나 예들 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 또는 노말-부탄올 등이 이용될 수 있고, 바람직하게는 에탄올이다.
상기 혼합 용매는 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 물과 탄소수 1 내지 4의 알코올의 혼합 용매인 경우 5 내지 95 중량% 수용액, 바람직하게는 10 내지 90 중량% 수용액, 더욱 바람직하게는 70 내지 90 중량% 수용액, 더욱 바람직하게는 80 내지 90 중량% 수용액, 더욱 바람직하게는 85 내지 90 중량% 수용액이 이용될 수 있다.
본 명세서에서 녹차를 언급하면서 사용되는 용어 “추출물”은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 녹차 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 녹차 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제조된 녹차 추출물을 5,000 g 이상, 바람직하게는 5,000 내지 15,000 g, 더욱 바람직하게는 6,000 내지 10,000 g, 더욱 바람직하게는 7,000 내지 9,000 g에서 10 내지 60분, 바람직하게는 20 내지 40분간 원심분리하여 상등액을 분리할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기의 방법에 따라 제조되어 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 녹차 추출물은 효모발효 단독처리하여 제조한 녹차 추출물, 또는 효소처리 및 효모발효를 병용처리하여 제조한 녹차 추출물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 녹차 균질액을 효모발효 단독처리하여 제조한 녹차 추출물이 효소처리 및 효모발효를 병용처리하여 제조한 녹차 추출물에 비해 항균 및 항산화 활성이 더욱 우수하였고, 녹차 균질액을 효소처리 및 효모발효 병용처리하여 제조한 녹차 추출물이 효모발효 단독처리하여 제조한 녹차 추출물에 비해 수율이 더욱 증대되는 것을 구체적으로 확인하였다.
상기 녹차 추출물은 식중독을 유발하는 B. cereus 및 S. aureus 등에 대하여 높은 항균 활성을 나타내고, 우수한 항산화 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물에 관한 것이다.
상기 식품 첨가제 조성물은 본 발명의 녹차 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 식중독을 유발하는 B. cereus 및 S. aureus 등에 대하여 항균 활성을 나타내고, 우수한 항산화 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는 어육 또는 어육 가공품의 선도 유지용 보존제 조성물에 관한 것이다.
상기 어육 또는 어육 가공품의 선도 유지용 보존제 조성물은 본 발명의 녹차 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 식중독을 유발하는 B. cereus 및 S. aureus 등에 대하여 항균 활성을 나타내고, 우수한 항산화 활성을 나타낼 수 있다.
상기 보존제 조성물은 본 발명의 녹차 추출물을 포함함으로써 식중독을 유발하는 B. cereus 및 S. aureus 등에 대하여 항균 활성을 나타내고, 우수한 항산화 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 보존제 조성물을 어육 또는 어육 가공품에 첨가하여 제조하는 경우 저장 및/또는 유통 과정에서의 지질산패 및 부패를 방지할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 녹차 추출물을 포함하여 보존성이 증진된 어육 가공품에 관한 것이다.
상기 어육 가공품은 어묵일 수 있다.
상기 어육 가공품은 본 발명의 녹차 추출물을 포함함으로써 식중독을 유발하는 B. cereus 및 S. aureus 등에 대하여 항균 활성을 나타내고, 우수한 항산화 활성을 나타낸다. 이로 인해, 저장 및/또는 유통 과정에서 지질산패 및 부패가 쉽게 일어나지 않으므로, 저장성이 현저히 향상된다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 실험방법>
재료 및 외형 관찰
재료로 사용된 녹차는 건조분말 형태로 가공 포장된 것(leaf of Camellia sinensis, 화개농협)으로 온라인 마켓을 통해 구입하였다.
녹차분말의 형태학적 관찰 및 입도 분포 분석을 위해 별다른 처리 없이 시료를 백금도금한 뒤 주사전자현미경(SNE-3000M, ㈜세크)으로 관찰하였고, Image J 프로그램을 사용하여 촬영된 주사전자현미경 결과를 바탕으로 입자크기 및 분포도를 측정하였다.
일반성분 및 구성당 분석
녹차분말의 일반성분은 AOAC 방법(2005)에 따라 분석하였다. 수분은 상압가열 건조법(method 950.46), 회분은 직접회화법(method 923.03), 조단백질은 자동화 장치를 이용한 Kjeldahl 법(method 976.05), 조지질은 petroleum ether를 사용한 용매 침지 추출법(method 991.36)에 준하여 분석하였다.
구성당은 pulsed amperometric detector가 결합된 high performance anion exchange chromatography로 분석하였다. 시료 10 mg에 72% H2SO4 100 ㎕를 가한 뒤 121 ℃에서 1시간 동안 가수분해를 진행하였고, 2.8 mL 탈이온수에 희석하고 0.20 ㎛ PTFE 시린지 필터에 여과 후 분석용 시액으로 사용하였다. 컬럼은 Dionex CarboPac PA-1(10 ㎛, 4×250 mm, Thermo Fisher Scientific)을 사용하였고, 시액 20 ㎕를 주입한 뒤, 18 mM NaOH를 1 mL/min 유속으로 흘리면서 분석하였다. 구성당 동정 및 정량을 위해 8종의 단당류 표준시약(fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, mannose, xylose, fructose) 및 3종의 산성당 표준시약(glucuronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid)을 사용하였다. 혼합한 표준시약을 위와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 머무른 시간과 비교하여 동정하였고, 3 point 농도의 외부 표준용액 분석법으로 정량하였다.
수율
사용된 원료 대비 얻은 고형분에 대한 수율을 구하기 위해 원심분리하여 얻은 상징액(추출물)의 총 부피를 측정하였고, 추출물 10 mL를 105 ℃에서 가열건조하여 고형분 함량을 측정한 다음 추출물 mL 당 g으로 환산하여 아래 계산식에 대입해 수율로 나타내었다(Jun et al., 2021).
수율(%) = (고형분의 농도(g/mL) × 추출물의 총 부피(mL)) / 사용된 시료의 무게 (g) × 100
항산화 활성 시험
녹차 용매(물, 에탄올) 추출물을 포함한 효소분해물 및 효모발효물의 항산화 활성은 DPPH 시약을 사용하는 Xu et al.(2007)의 방법을 약간 변형하여 평가하였다. 0.25 mM DPPH-ethanol 반응액을 517 nm에서 약 1.2가 되도록 조절하여 준비하였고, 시료 용액마다 50% ethanol을 사용하여 2배씩 희석한 5단계 희석액을 각각 준비하였다. 각 시료의 희석액 200 ㎕에 DPPH-ethanol 반응액 600 ㎕를 가한 뒤 vortex하였고, 상온에서 30분간 반응시켰다. 각 반응액은 5,000 g(4 ℃)에서 5분간 원심분리하였고, 상징액 200 ㎕를 96-well plate에 옮긴 뒤 517 nm에서 흡광도를 측정하여 아래 계산식에 대입해 DPPH 소거 활성(%)으로 나타내었다. EC50 값을 구하기 위해, 각 시료 희석단계 별 농도를 x 축, 활성을 y 축으로 하여 1차 함수식을 구하였고, y 값에 소거활성 50%일 때를 가정한 50을 대입하여 얻은 x 값을 EC50 값으로 정의하였다.
DPPH 소거 활성(%) = (1 - (시료의 흡광도(OD517, nm) / blank의 흡광도(OD517, nm)) × 100
항균 활성 시험
각 추출물의 항균 활성은 agar-well diffusion 방법(Jun et al., 2015)으로 평가하였다. 대상균으로 식품위해균 7종(Bacillus cereus KCTC 3062, Bacillus licheniformis KCTC 1918, Listeria monocytogenes KCTC 13064, Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC 3881, Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila KCTC 2358, Escherichia coli KCTC 2441, Salmonella Typhimurium NCCP 12219)을 선택하여 사용하였다. 평가전 L. monocytogenes는 tryptic soy broth(TSB, difco), 나머지 대상균 6종은 Mueller hinton broth(MHB, difco)를 사용하여 30 ℃에서 15 시간 전배양하였고, 전배양에 사용한 동일한 배지조성의 agar에 약 5 log CFU/g 농도가 되도록 접종한 뒤 plate에 부어 굳혔다. 각 균주가 접종된 agar plate에 가열 살균한 직경 5 mm의 실린더를 사용하여 well을 만들었고, 각 추출물 50 ㎕를 주입한 뒤 30 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 뒤 버니어캘리퍼스를 사용하여 균의 증식이 저해된 저해존(diameter of inhibition zone, DIZ)의 직경을 측정하였고, well의 직경을 감하여 실제 저해존의 크기를 나타내었다. 각 추출물의 평가 농도는 10 mg/mL 농도로 동일하게 조제하여 평가하였다.
통계처리
모든 실험은 3회 반복 수행하였고, 항산화 활성을 나타내는 EC50 값을 제외한 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었으며, 평균값들 사이 유의적 차이는 IBM SPSS Statistics 20(IBM, Armonk, NY, USA) 프로그램을 사용하여 one-way ANOVA 방법에 따라 유의수준 95%에서 Tukey test(p < 0.05)로 검증하였다.
<실시예>
실시예 1: 녹차 추출물의 제조 (SC)
(1) 녹차 분말(입도 100 ㎛ 이하)에 10배 부피에 해당하는 정제수를 첨가하고, 10,000 rpm에서 약 2분 동안 균질화하였다.
(2) 상기 녹차 균질액에 전배양한 활성 효모균주(S. cerevisiae)를 4.5 log CFU/mL 농도가 되도록 접종하고, 35 ℃에서 2-3일간 진탕배양(150 rpm)하였다.
(3) 이후, 상기 녹차 발효액을 121 ℃에서 5분간 열처리하여 실활시켰다.
(4) 상기 실활시킨 발효액에 85 중량% 에탄올 수용액을 상기 (1) 단계의 정제수와 동일한 부피로 첨가하고 상온에서 1시간 동안 추출하였다.
(5) 상기 녹차 추출물을 8,000 g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 분리하고, 상기 상등액을 총 부피의 50%가 되도록 농축한 뒤 동결건조하여 분말화하였다.
실시예 2: 녹차 추출물의 제조 (Ecp25 + SC)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 (1) 단계와 (2) 단계의 사이에 (1-1) 상기 녹차 균질액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제 (1 : 1의 중량비)의 혼합효소를 2.5 중량부로 첨가한 후 50 ℃에서 12시간 동안 반응시키는 단계;를 추가로 수행하여 녹차 추출물을 제조하였다.
실시예 3: 녹차 추출물의 제조 (SC + Ecp25)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 (2) 단계와 (3) 단계의 사이에 (2-1) 상기 녹차 균질액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제 (1 : 1의 중량비)의 혼합효소를 2.5 중량부로 첨가한 후 50 ℃에서 12시간 동안 반응시키는 단계;를 추가로 수행하여 녹차 추출물을 제조하였다.
대조군: 녹차의 50% 에탄올 추출물
녹차 분말과 50 중량% 에탄올 수용액을 1 : 10의 부피비로 혼합한 후 60 ℃에서 6시간 동안 추출하여 녹차 에탄올 추출물을 제조하였다.
비교예 1: 녹차 추출물의 제조 (Ecp25)
실시예 2와 동일하게 실시하되, (2) 단계의 효모 발효 단계를 생략하고 녹차 추출물을 제조하였다.
<예비시험예>
예비시험예 1: 녹차 분말의 화학적 조성 특성 및 형태학적 관찰
1-1: 녹차 분말의 화학적 조성 특성
여러 연구에서 항산화제 및 항균제로의 사용에 대한 잠재성이 밝혀진 녹차를 실험재료로 선정하였고, 재료의 화학적 조성 특성을 이해하고자 녹차 분말의 일반성분 및 구성당 분석을 진행하여 하기 표 1에 나타내었다.
일반성분 (%, wet)
Moisture 4.4 ± 0.1
Ash 5.8 ±0.1
Crude protein 16.9 ±0.9
Crude lipid 3.1 ±0.0
Carbohydrate* 69.9 ± 0.9
구성당 (mg/g, wet)
Fucose 5.04 ± 0.03
Rhamnose 11.14 ± 0.05
Arabinose 22.93 ± 0.26
Galactose 37.03 ± 0.25
Glucose 173.85 ± 1.25
Mannose 10.26 ± 0.08
Xylose 15.44 ± 0.42
Galacturonic acid 44.26 ± 0.38
상기 표 1에 있어서, 녹차 분말은 약 69.9% 이상의 탄수화물로 구성되어 있고, 조단백질 함량은 약 16.9%인 것으로 나타났다. 일반적으로 식물 잎의 탄수화물은 cellulose 및 hemicellulose 등의 섬유소로 구성되어 있는데, 녹차 분말의 구성당 분석결과에서는 glucose가 단당류의 약 63.1%를 차지하는 것으로 나타나, 녹차 분말은 glucose를 기반으로 한 전형적인 cellulose 구조를 가지고 있는 것으로 예상되었다. 또한, pectin의 구성당으로 알려진 galacturonic acid의 함량 또한 비교저거 높은 수준으로 함유되어 있어 pectin의 구성 비율도 적지 않을 것으로 예상되었다.
1-2: 녹차 분말의 형태학적 관찰
본 발명의 실험에 이용된 녹차 분말을 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a 및 도 2b를 살펴보면, 본 발명의 실험에 이용된 녹차 분말은 모양 또는 크기가 일정하지는 않지만 대체로 타원형의 형태를 나타내었고, 평균 입도가 약 20 ㎛ 이하인 것을 확인할 수 있다.
예비시험예 2: 녹차 에탄올 추출물의 에탄올 농도 및 열처리 유무에 따른 수율 변화
물에 비해 극성도가 낮고 저분자 형태의 식물 유래 phytochemicals 물질들은 유기 용매 가운데 알코올과 같은 비교적 극성도가 있는 용매에 잘 추출된다(Jun et al., 2015). 녹차 분말로부터 항산화 및 항균 활성이 높은 물질을 회수하기 위해 물을 비롯하여 다양한 농도의 에탄올을 조제하여 극성을 달리하였고, 이들을 추출 용매로 사용하여 추출한 후 phytochemicals의 수율을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다. 또한, 살균, 가열 등 열처리를 동반한 다양한 식품제조공정에서 보존료로서의 위력을 잃지 않기 위해서는 추출물의 열안정성이 필요하므로 열처리 유무에 따른 수율 변화를 살펴보았다. 아래 표 2에서, “열처리*”는 각각의 시료를 121 ℃에서 15분간 가열처리한 것이다.
구분 수율 (g/100g, dry)
물 21.35 ± 0.36
25% 에탄올 27.42 ± 0.21
50% 에탄올 27.12 ± 0.12
75% 에탄올 26.44 ± 0.84
물 - 열처리* 27.12 ± 0.50
25% 에탄올 - 열처리* 31.36 ± 2.09
50% 에탄올 - 열처리* 27.20 ± 0.81
75% 에탄올 - 열처리* 25.62 ± 0.43
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 녹차 추출물 제조 시 25% 에탄올을 추출용매로 사용하고 열처리(121 ℃, 15분)를 할 경우 가장 높은 수율을 나타내었고, 물을 사용하여 상온에서 추출할 때 가장 낮은 수율을 나타내었다(p < 0.05). 상기 두 경우를 제외하고, 에탄올 농도 및 열처리에 따른 추출물간의 유의적인 수율 차이는 없었고, 평균적으로 약 26% 가량의 수율을 나타내었다.
예비시험예 3: 녹차 에탄올 추출물의 에탄올 농도 및 열처리 유무에 따른 항산화 활성 변화
녹차 추출물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성으로 평가하였다. 추출물 간 활성 비교를 위해 각 추출물마다 7단계로 희석한 농도에 대한 활성 평가를 진행하였고, 이들 값을 기준으로 1차 함수를 작성하여 DPPH 라디칼 50% 소거 활성을 가지는 추출물의 농도인 EC50 값으로 환산하여 하기 표 3에 나타내었다. 아래 표 3에서, “열처리*”는 각각의 시료를 121 ℃에서 15분간 가열처리한 것이다.
구분 최대 DPPH 라디칼 소거 활성 (%) EC50 값
(㎍/mL)		 Linear equation
물 78.0 ± 1.9 75.3 Y=0.3592 X + 22.958 (R2=0.99)
25% 에탄올 80.2 ± 2.4 49.3 Y=0.6079 X + 20.057 (R2=0.99)
50% 에탄올 86.3 ± 1.8 33.4 Y=0.585 X + 30.478 (R2=0.95)
75% 에탄올 85.7 ± 1.2 41.0 Y=0.6627 X + 22.8 (R2=0.98)
물 - 열처리* 83.7 ± 3.4 85.8 Y=0.3088 X + 23.5 (R2=0.98)
25% 에탄올 - 열처리* 84.4 ± 0.9 49.1 Y=0.492 X + 25.822 (R2=0.98)
50% 에탄올 - 열처리* 85.6 ± 2.0 36.4 Y=0.597 X + 28.2517 (R2=0.96)
75% 에탄올 - 열처리* 84.7 ± 1.1 42.4 Y=0.6959 X + 20.512 (R2=0.98)
X축, 농도 (㎍/mL) : Y 축, 소거활성 (%)
상기 표 3을 통해, 항산화 활성은 에탄올 농도에 영향을 받았으며, 50% 에탄올을 용매로 사용하는 경우 가장 낮은 EC50 값을 나타내어 항산화 잠재력이 가장 우수한 추출물을 제조할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 모든 추출물에서 열처리에 따른 항산화 활성 감소는 나타나지 않아, 추출물 내 활성 물질은 121 ℃, 15분간 열처리에 비교적 안정한 것으로 판단된다.
예비시험예 4: 녹차 에탄올 추출물의 에탄올 농도 및 열처리 유무에 따른 항균 활성 변화
식품 보존료로서 사용가능성을 확인하기 위해, 평가 대상균으로 대표적인 식품위해균 7종을 선택하였고, 각 추출물의 항균 활성을 agar-well diffusion 방법으로 측정하여 하기 표 4에 나타내었다. 이때, 시험된 모든 세균 세포 밀도는 대략 5×105 CFU/mL이었고, 샘플의 시험 농도는 10 mg/mL이었다.
Bacterium Solvent control Extract (non-heat treatment) Extract (heat treatment:
121 ℃, 5 min)
DW 70% EOH CON-
DW		 25% EOH 50% EOH 75% EOH CON-
DW-H		 25% EOH-H 50% EOH-H 75% EOH-H
Gram positive
B. cereus KCTC 3062 - - - 1.00 2.23 2.72 - 1.01 2.13 3.04
B. Licheniformis KCTC 1918 - - - - 1.92 2.17 - - 1.61 2.01
L. monocytogenes KCTC 13064 - - - - - - - - - -
S. aureus subsp. aureus KCTC 3881 - - - 3.26 3.56 3.53 - 3.01 3.26 3.43
Gram negative
A. hydrophila subsp. hydrophila KCTC 2358 - - - 2.41 4.26 6.05 - 3.39 4.63 5.49
E. coli KCTC 2441 - - - - - - - - - -
Sal. Typhimurium NCCP 12219 - - - - - - - - - -
상기 표 4를 살펴보면, 균의 증식이 억제된 저해존 (DIZ, diameter of inhibition zone)은 B. cereus, B. licheniformis, S. aureus 및 A. hydrophila에서 관찰되었고, 물 추출물은 모든 실험 대상균에 대해 항균 활성이 없었다. 추출용매로 25% 에탄올 사용 시 B. licheniformis에 대해 항균활성을 보이지 않았던 반면, 에탄올 50% 농도부터 앞서 나열한 균종 모두에 대해 항균 활성을 나타내었다. 열처리에 따른 모든 추출물의 항균 활성 변화는 거의 없었다. 앞선 항산화 활성 결과와 종합해보면, 추출용매로 50% 에탄올 사용 시 항산화 및 항균 활성 모두 가장 우수한 것으로 나타났고, 121 ℃에서 15분간 열처리하는 것은 항산화 및 항균 활성 변화에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
<시험예>
시험예 1: 효모발효 단독처리 또는 효소처리 및 효모발효의 병용처리에 따른 수율 변화
식물 잎 mesophyll 영역에는 1차 대사를 위한 엽록소를 포함하여 생체방어기작을 담당하는 2차 대사산물인 phytochemicals 물질이 축적되어 있으나, 이들 대부분은 세포 내부에 존재해 세포벽 파괴를 하지 않는 기존의 미세균질 및 용매 추출법으로는 회수율이 낮을 수밖에 없다. 따라서, 식물 잎과 같은 소재를 사용할 경우 세포벽 파괴는 phytochemicals 물질의 회수율을 높이는데 긍정적으로 작용할 것으로 판단되었다. 앞선 화학적 조성 분석 결과에서 녹차 분말에 존재하는 세포벽 물질은 cellulose로 구성되어 있고, 적지 않은 pectin을 함유하고 있는 것으로 예상되었던 것을 바탕으로, 세포벽 파괴목적으로 cellulase와 pectinase를 혼합하여 사용하였다. 일반적인 Saccharomyces 속 균주는 cellulase 활성을 보유하고 있지 않지만, 일부 연구에서 발효과정에서 다양한 생리활성 효과를 나타내는 2차 대사산물을 생산하는 것으로 알려져 있다.
앞선 추출용매 선정결과에서 항산화 및 항균 활성 모두 우수하였던 50% 에탄올을 추출용매로 사용하여 녹차 분말을 현탁한 후 균질처리하고 121 ℃에서 5분간 열처리한 것을 기존의 용매추출 및 균질처리를 병행한 대조구(Con-50% EOH)로 설정하였고, 녹차 분말에 cellulase와 pectinase를 1 : 1의 비율로 혼합 처리한 것을 혼합효소 처리구(비교예 1, Ecp25), S. cerevisiae 균주로 발효만 진행한 것을 효모발효구(실시예 1, SC), 혼합효소 처리 후 S. cerevisiae 균주를 사용하여 발효한 것을 혼합효소 처리 및 효모발효 병행구(실시예 2, Ecp25 + SC), 동 균주 발효 후 혼합효소를 처리한 것을 효모발효 및 혼합효소 처리 병행구(실시예 3, SC + Ecp25)로 각각 설정하였다.
각 그룹의 수율을 나타낸 도 3을 살펴보면, 혼합효소 처리만 진행한 비교예 1(Ecp25)이 약 41.2%의 수율을 보이며 가장 높았고, 50% 에탄올 추출 대조구(Con-50% EOH)와 실시예 1(SC)는 약 27.2% 수준으로 가장 낮은 수율을 나타내었다(p < 0.05). 반면, 처리 순서와 관계없이 효소처리 및 효모발효를 병행 진행한 실시예 2(Ecp25 + SC) 및 실시예 3(SC + Ecp25)의 수율은 적게는 약 5.3%에서 많게는 약 9.2% 가량 상기 두 그룹 (대조구 및 실시예 1)보다 높게 나타났다. 달리 표현하면, 효소처리 시 추출물의 수율은 증가되었고, 효모 발효는 수율 변화에 영향을 주지 않았다는 것을 알 수 있었다.
시험예 2: 효모발효 단독처리 또는 효소처리 및 효모발효의 병용처리에 따른 항산화 활성 변화
효소처리 및 효모발효가 녹차 추출물의 항산화 활성 변화에 미치는 영향을 하기 표 5에 나타내었다. 식품보존료로서 사용되고 있는 자몽종자추출물(GSE)을 비교물질로 사용하였다.
구분 최대 DPPH 라디칼 소거 활성 (%) EC50 값
(㎍/mL)		 Linear equation
GSE* 85.9 ± 0.4 453.1 Y=0.0673 X + 19.505 (R2=0.98)
대조군(Con-50% EOH) 86.4 ± 1.7 42.0 Y=0.3851 X + 33.82 (R2=0.98)
실시예 1 87.7 ± 1.1 30.2 Y=0.3885 X + 38.271 (R2=0.97)
실시예 2 87.6 ± 1.4 41.2 Y=0.4614X + 30.98 (R2=0.98)
실시예 3 86.1 ± 2.3 39.5 Y=0.4396 X + 32.655 (R2=0.97)
비교예 1 86.3 ± 0.9 58.3 Y=0.2784 X + 33.774 (R2=0.99)
상기 표 5를 살펴보면, 최대 DPPH 라디칼 소거활성은 약 85% 정도로 모두 비슷한 수준인 것을 알 수 있다. 추출물간 활성 비교를 위해 계산한 EC50 값은 효모발효만 진행한 실시예 1에서 가장 낮아 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 나타났고, 자몽종자추출물이 가장 높은 값을 나타내어 항산화 활성이 가장 낮은 것으로 보인다. 값만 놓고 본다면 이 둘 사이에 약 10배 이상의 차이가 있었다. 다양한 처리에 따른 항산화 활성 변화에서 효소만 처리한 비교예 1의 경우 용매 추출법을 적용한 대조군에 비해 활성이 감소하였고, 효소처리 및 효모발효를 병행할 경우 활성이 증가하였다.
시험예 3: 효모발효 단독처리 또는 효소처리 및 효모발효의 병용처리에 따른 항균 활성 변화
50% 에탄올 추출 대조구(Con-50% EOH)와 시판 자몽종자추출물(GSE)을 포함하여 처리를 달리한 녹차 추출물의 항균 활성 결과를 도 4에 나타내었다. 어묵 제품의 부패 원인균 중 하나로 식중독을 유발하는 B. cereus와 가공 중 2차 혼입되어 식중독을 일으킬 수 있는 S. aureus를 대상균으로 설정하였다.
도 4를 살펴보면, 모든 평가물질들에 대해 S. aureus(도 4b)가 B. cereus(도 4a)에 비해 감수성이 높았다. 비록 시판 자몽종자추출물에 비해 낮은 활성을 보였지만 실시예 1 내지 3의 항균 활성은 대조구에 비해 현저하게 높게 나타나 효모발효 단독처리 또는 효소처리 및 효모발효의 병용처리가 항균활성 증가에 긍정적인 영향을 준 것으로 판단된다.
시험예 4: 효모발효 단독처리 또는 효소처리 및 효모발효의 병용처리에 따른 추출물 내 phytochemicals 함량 변화
실시예 및 비교예에 따른 녹차 추출물 내 phytochemicals 물질 가운데 항산화 활성과 항균 활성에 관여하는 주요물질로 알려져 있는 페놀 화합물(도 5a)과 플라보노이드 함량(도 5b)을 각각 측정하여 도 5에 나타내었다.
도 5a를 살펴보면, 모든 녹차 추출물의 총 페놀 화합물 함량은 자몽종자추출물보다 약 5배 이상 높은 것으로 나타났고, 이러한 결과는 항산화 활성에서도 비슷한 경향을 나타내었는데, 이는 총 페놀 화합물 함량과 항산화 활성 사이에 연관성이 높다는 것을 의미하였다. 실시예 1 내지 3의 녹차 추출물의 경우 대조구(Con-50% EOH)에 비해 총 페놀 화합물 함량 및 총 플라보노이드 함량 모두 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(p < 0.05). 즉, 효모발효 단독처리 또는 효소처리 및 효모발효의 병용처리가 총 페놀 화합물 함량 및 총 플라보노이드 함량 모두를 증가시켜 항산화 및 항균 활성을 높이는 것으로 판단된다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (18)

  1. (1) 녹차잎을 건조시킨 후 분쇄하여 녹차 분말을 준비하는 단계;
    (2) 상기 녹차 분말에 물을 첨가한 후 균질화하는 단계;
    (3) 상기 녹차 균질액에 효모균을 접종하여 발효시키는 단계;
    (4) 상기 녹차 균질액의 발효액을 열처리하여 실활시키는 단계;
    (5) 상기 실활시킨 발효액에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 그들의 혼합용매를 첨가하여 추출하는 단계;를 포함하는 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (1) 단계의 녹차 분말은 평균 입도가 100 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (2) 단계의 물은 녹차 분말에 대하여 5 내지 15 부피배로 첨가하는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (2) 단계의 균질화는 8,000 내지 12,000 rpm으로 0.5 내지 5분간 수행되는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (2) 단계 및 (3) 단계의 사이에,
    (2-1) 상기 녹차 균질액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제의 혼합효소를 1 내지 4 중량부로 첨가한 후 반응시키는 단계;를 추가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 효소 반응은 40 내지 60 ℃에서 10 내지 20시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    (3) 단계의 효모균은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    (3) 단계의 효모균은 4 내지 5 log CFU/mL로 첨가되는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    (3) 단계의 발효는 30 내지 40 ℃에서 2 내지 3일간 100 내지 300 rpm으로 진탕배양하여 수행되는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    (3) 단계 및 (4) 단계의 사이에,
    (3-1) 상기 녹차 발효액 100 중량부에 셀룰라아제 및 펙티나아제의 혼합효소를 1 내지 4 중량부로 첨가한 후 반응시키는 단계;를 추가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    (5) 단계의 혼합용매는 70 내지 90%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액인 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 녹차 추출물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로로커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되어 항균 및 항산화 활성이 증진된 녹차 추출물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 녹차 추출물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로로커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물.
  15. 제13항의 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물.
  16. 제13항의 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는 어육 또는 어육 가공품의 선도 유지용 보존제 조성물.
  17. 제13항의 녹차 추출물을 포함하여 보존성이 증진된 어육 가공품.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 어육 가공품은 어묵인 것을 특징으로 하는 어육 가공품.
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