KR20230112227A - 백렴 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백렴 추출물의 골 손실 억제 효과에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 백렴 추출물은 세포독성이 없으면서, 파골세포의 분화를 억제하고, 파골세포의 분화 전사인자의 발현을 억제하므로, 이를 골 손실 억제 용도 또는 여성 폐경기 골다공증을 포함하는 골 손실과 관련된 다양한 골 질환을 예방 또는 치료하는 약학 조성물 및 건강기능 식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

백렴 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING BONE DISEASES COMPRISING AMPELOPSIS RADIX}

본 발명은 백렴 추출물의 골 손실 억제 효과에 관한 것이다.

뼈는 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성과 파골세포(osteoclast)의 균형을 통해 유지된다 (Alliston T. et al. Interfering with bone remodelling. Nature. 2002;416:686-687.). 조골세포와 파골세포의 균형을 유지하는 것은 골 항상성 유지에 필수 요소이다. 노령화에 의한 파골세포와 조골세포 간의 균형 붕괴는 조골세포의 골 형성 능력보다 파골세포의 골 파괴 능력이 과도하여 항상성이 깨어짐으로써 발생하며, 이는 노령화에 의한 골 질환의 예방 및 치료 방법은 파골 세포에 의한 골 흡수를 억제하는 것이 중요하다는 것을 의미한다 (Tanaka, Y., et al., 2005). 조골세포의 활성을 능가하는 과도한 파골세포 활성은 여러 가지 골 질환을 야기하며, 뼈의 질량감소와 골격의 구조적 악화를 특징으로 한다 (Kim N. et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. J Exp Med. 2005;202:589-595.).

골다공증은 골량의 감소와 미세구조의 변화로 뼈의 강도가 약해져 골절을 일어나기 쉬운 상태가 되는 골격계 질환이다. 골다공증은 파골세포 (osteoclast)가 오래된 골을 흡수하고 조골세포 (osteoblast)가 골을 형성함으로써 뼈 재형성 (bone remodeling)이 유지가 된다. 골다공증은 여러가지 원인에 의한 골격계 질환으로 뼈의 질량이 감소하고 미세구조 적 변형의 원인이 된다. 하지만, 폐경으로 인해 에스트로겐의 분비가 감소되면 파골세포와 조골세포 사이의 불균형으로 인해 폐경기 골다공증이 발생한다 (Teitelbaum, S.L., Ross, F.P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nat. Rev. Genet. 4: 638-649, 2003.). 따라서 파골세포의 분화를 억제시키는 것은 골다공증을 치료하기 위해서 가장 중요한 치료방안이다 (Cheng, M.H, et al. Osteoporosis treatment in postmenopausal women with pre-existing fracture. Taiwan J Obstet Gynecol 51: 153-166, 2012.). 파골세포는 조혈모세포에서 유래된 대식세포(macrophage)가 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)와 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)에 의해 여러 분화 단계를 거쳐 생성된다 (Asagiri, M., et al., 2007; Chambers, T.J., 2000). 파골세포의 전구세포 표면에 존재하는 파골세포 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 RANKL이 결합하게 되면 c-Fos의 활성화를 유도한다 (Teitelbaum, S. L: RANKing c-jun in osteoclast development. J. Clin. Invest. 114, 463 (2004).). 활성화된 c-Fos는 또 다른 전사인자인 NFATc1(nuclear factor of activated T cell c1)의 발현을 유도한다. NFATc1은 파골세포의 분화에 필수적인 중요한 전사인자로 파골세포 지표인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), OSCAR(osteoclast-associated receptor), CtsK(cathepsin K), MMP-9(matrix methalloproteinase 9) 및 DC-STAMP(dendritic cell-specific transmembrane protein) 등의 발현을 촉진하여 파골세포의 분화 및 기능을 활성화시켜 (Qing Hong, Z., et al., 2013), 골 흡수, 활성화, 생존 및 분화를 조절한다 (Ginaldi L, Di Benedetto MC, De Martinis M. Osteoporosis, inflammation and ageing. Immun Ageing. 2005 Nov;4;2:14.).

현재 골다공증 치료에 가장 많이 사용되고 있는 치료제는 비스포스포네이트(bisphosphonates) 제제이다 (Cheng MH, et al. Osteoporosis Osteoporosis treatment in postmenopausal women with pre-existing fracture. Taiwan J Obstet Gynecol. 2012;51:153-66.). 하지만, 비스포스포네이트 제제로 치료받은 환자들에게서 많은 부작용이 발견되면서 골다공증 치료제에 대한 문제점이 제기되고 있으므로, 부작용이 적으면서 좋은 치료효과를 낼 수 있는 치료제 개발하기 위한 연구는 진행 중이다.

한편, 백렴(白斂, Ampelopsis japonica Makino)은 맛이 쓰고 성질은 차기 때문에 열을 식히고 독을 풀어주는 효능이 있다. (한의과대학 본초학 편찬위원회. 본초학. 서울:영림사, 2010:308-309). 현재 백렴의 골다공증 치료 효과에 대해서는 개시되거나 교시된 바 없다.

본 발명의 목적은 골 손실 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 골 질환 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 백렴 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 백렴 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 백렴 추출물을 함유하는 골 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 백렴 추출물은 세포독성이 없으면서, 파골세포의 분화를 억제하고, 파골세포의 분화 전사인자의 발현을 억제하므로, 이를 골 손실 억제 용도 또는 여성 폐경기 골다공증을 포함하는 골 손실과 관련된 다양한 골 질환을 예방 또는 치료하는 약학 조성물 및 건강기능 식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 백렴 에탄올 추출물 (AR)의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 2는 백렴 에탄올 추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 3은 백렴 에탄올 추출물의 파골세포 분화 억제 기전을 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

일 측면에서, 본 발명은 백렴(Ampelopsis Radix, 白斂) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 추출물은 물, 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있으며, 유기용매는 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 사이클로헥산, 석유에테르(petroleum ether), 벤젠 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 구현예에서, 일 구현예에서, 상기 백렴 추출물은 에탄올 추출물일 수 있으며, 80% 에탄올 추출물인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 백렴 추출물은 파골세포 분화와 관련된 유전자인 NFATc1(nuclear factor of activated T cell c1) 및/또는 c-Fos의 발현을 억제하여 파골세포의 분화를 억제할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 백렴 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 골 질환은 골 손실로 인한 골 질환일 수 있으며, 골다공증(osteoporosis), 골 감소증(osteopenia), 골 융해성 전이(osteolytic metastasis), 노인성척추후만증(senile kyphosis) 및 파제트병(paget disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 골다공증인 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 추출물은 물, 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있으며, 유기용매는 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 사이클로헥산, 석유에테르(petroleum ether), 벤젠 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 구현예에서, 일 구현예에서, 상기 백렴 추출물은 에탄올 추출물일 수 있으며, 80% 에탄올 추출물인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 백렴 추출물은 파골세포 분화와 관련된 유전자인 NFATc1(nuclear factor of activated T cell c1) 및/또는 c-Fos의 발현을 억제하여 파골세포의 분화를 억제할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "추출물(extract)"이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다. 추출물의 추출 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 교반 추출, 진탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법으로 추출될 수 있다. 추출 용매로는 물, C₁-C₄의 저급 알코올과 같은 극성 용매나 헥산, 클로로 포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 사용할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 백렴 추출물 뿐 아니라 이와 동일 또는 유사한 기능을 지닌 다른 유효성분을 추가로 함유하거나, 또는 상기 성분들과 상이한 기능을 지닌 다른 유효성분을 추가로 함유함으로써, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 골 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 골 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 골 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 골 질환의 발병 원인, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으며, 경구형 또는 주사 제형이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 개체 또는 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 본 발명의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 상기 골 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 백렴 추출물을 함유하는 골 질환 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 추출물은 물, 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있으며, 유기용매는 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 사이클로헥산, 석유에테르(petroleum ether), 벤젠 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 구현예에서, 일 구현예에서, 상기 백렴 추출물은 에탄올 추출물일 수 있으며, 80% 에탄올 추출물인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 골 질환은 골 손실로 인한 골 질환일 수 있으며, 골다공증(osteoporosis), 골 감소증(osteopenia), 골 융해성 전이(osteolytic metastasis), 노인성척추후만증(senile kyphosis) 및 파제트병(paget disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 골다공증인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 백렴 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 해조류를 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 골 질환 치료제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 백렴 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 백렴 추출물 제조

백렴(白斂) (옴니허브)을 80% 에탄올에 침지하여 2주간 추출하였으며, 추출이 끝난 뒤 여과지를 이용해 여과하였다. 이후 감압농축기를 이용하여 농축 후 동결건조 하여 백렴 에탄올 추출물(Ethanol extract of Ampelopsis Radix 이하: AR)을 제조하였으며, 실험 기간 동안 냉장 보관하여 사용하였다.

실시예 2. 세포독성 확인

마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포 (한국세포주은행, 서울, 한국)를 96-웰 플레이트에 분주하고, 10% FBS 및 1% P/S를 포함하는 DMEM 배지로 95%의 습도, 37℃의 온도 및 5% CO₂ 환경인 CO₂배양기에서 하루 동안 배양하여 안정화한 후 배지를 버리고 각각 배양액에 상기 실시예에서 제조한 백렴 에탄올 추출물 (AR)을 125, 250 및 500 mg/ml 농도로 각각 첨가한 뒤 1일간 배양하였다. 그 후 CCK-8 분석 용액을 처리하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 표기하였다. 그 결과, 백렴 에탄올 추출물 (AR)은 모든 농도에서 세포 독성을 보이지 않았다 (도 1).

실시예 3. 파골세포 분화 억제 효과 확인

백렴 에탄올 추출물이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해, TRAP 염색 및 TRAP 활성을 측정하였다. 구체적으로, 파골세포의 분화를 유도하기 위하여, 96-웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 동일한 양으로 분주한 뒤, RANKL (100 ng/ml)을 첨가한 배양액으로 교환하여 배양하였다. 이 후 백렴 에탄올 추출물을 125, 250 및 500 mg/ml의 농도로 각각 첨가하고, 5일 동안 파골세포의 분화를 유도하였으며, 실험 기간 동안 2일 간격으로 배지를 교체하였다. 이후 10% 포르말린을 사용하여 세포를 고정하고, TRAP kit을 사용하여 제조사의 지침에 따라 염색한 뒤, 도립현미경을 사용하여, 핵이 3개 이상인 세포를 다핵의 파골세포로 계수하였다. 또한, 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (sigma aldrich, MO, USA) 4.93 mg, 0.5 M acetate 850 μL 및 tartrate acid solution 150 μL을 혼합한 TRAP 용액을 세포 배양액과 혼합한 뒤 새로운 96-웰 플레이트에 50 μL씩 분주하였다. 이후, 60분 동안 37℃에서 반응시킨 후 0.5M NaOH를 50 μL 투입하여 반응을 종료시키고, ELISA 리더기로 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 TRAP 활성을 확인하였다.

그 결과, RANKL로 유도된 TRAP-양성 세포의 형성 및 TRAP 활성을 백렴 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다 (도 2).

실시예 4. 파골세포 분화 억제 기전 확인

백렴 에탄올 추출물에 의한 파골세포의 분화 억제 효과가 파골세포 핵심 기전 단백질인 NFATc1 및 c-Fos의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 60mm 디쉬에 RAW 264.7 세포를 동일한 양으로 분주한 뒤, RANKL (100 ng/ml)을 첨가한 배양액으로 교환하여 1일간 배양하였다. 세포 상등액을 제거하고 DPBS로 3번 세척한 후, RIPA 버퍼 (50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% Na-deoxycholate, 0.1% SDS, protease inhibitor cocktail 및 phosphatase inhibitor cocktail)를 사용하여 단백질을 용해하고, 추출한 단백질을 BCA 단백질 분석으로 정량한 후 NFATc1 및 c-Fos에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

그 결과, RANKL로 유도된 파골세포 분화에 의해 증가한 파골세포 분화 관련 전사인자인 NFATc1 및 c-Fos의 단백질 발현이 백렴 에탄올 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소/억제되는 것으로 나타났다 (도 3).

Claims (13)

1. 백렴(Ampelopsis Radix, 白斂) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 추출물은 물, 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매로 추출된, 골 손실 억제용 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 사이클로헥산, 석유에테르(petroleum ether), 벤젠 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 골 손실 억제용 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 파골세포의 분화를 억제하는, 골 손실 억제용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 파골세포 분화와 관련된 유전자의 발현을 억제하는, 골 손실 억제용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 파골세포 분화와 관련된 유전자는 NFATc1(nuclear factor of activated T cell c1) 또는 c-Fos인, 골 손실 억제용 조성물.
7. 백렴 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골 감소증(osteopenia), 골 융해성 전이(osteolytic metastasis), 노인성척추후만증(senile kyphosis) 및 파제트병(paget disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 파골세포의 분화를 억제하는, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
10. 제 7항에 있어서, 파골세포 분화와 관련된 유전자의 발현을 억제하는, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 파골세포 분화와 관련된 유전자는 NFATc1 또는 c-Fos인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
12. 백렴 추출물을 함유하는 골 질환 개선용 식품 조성물.
13. 제 12항에 있어서, 골 질환은 골다공증, 골 감소증, 골 융해성 전이, 노인성척추후만 및 파제트병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 골 질환 개선용 식품 조성물.