KR20230106134A - 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물 - Google Patents

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이윤미
손은정
성윤영
육흥주
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Abstract

본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 병풀 발효 추출물이 병풀 추출물에 비해 대식세포의 NO(Nitric Oxide), PGE2(Prostaglandin E2) 및 사이토카인의 분비량을 증가시키고, 비장세포의 증식 및 사이토카인 분비량을 증가시키며, NK 세포 활성을 증진시키는 효과가 우수하므로, 면역증진용 건강기능식품 조성물, 면역증진을 위한 동물용 사료 첨가제 또는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물{Immune-enhancing composition comprising extract of fermented Centella asiatica as effective component}
본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관한 것이다.
면역은 인체가 자기 성분 이외의 물질이 생체의 항상성을 깨뜨리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 자기 보호기작으로, 크게 선천적 면역(innate immunosurveillance)과 획득 면역(adaptive immunosurveillance)으로 구분된다.
자연 면역이라고도 하는 선천적 면역은 대식 세포, 자연살해 세포 등을 포함하는 백혈구, TNF-α 등의 다양한 사이토카인, 점액조직, 혈액에 존재하는 보체(complement) 등으로 구성되어 있어 획득 면역이 발생하기 전에 미생물, 바이러스 침입 등의 감염성 병원체뿐만 아니라 노화된 정상세포와 암세포 등에 대해 대식작용(phagocytosis)을 일으켜 1차적인 방어 면역 역할을 담당한다. 선천 면역을 보강하는 역할을 하는 획득 면역은 적응 면역이라고도 하는데, 항원 제시 세포가 포식하여 제시한 항원을 T 세포가 인식하면서 이루어지며, T 세포가 관여하는 세포성 면역과 B 세포가 생산하는 항체에 의한 체액성 면역반응으로 이루어진다. 이처럼 인체는 외부 항원과 같은 외래 물질의 침입 혹은 감염에 대하여 선천적 면역 및 획득 면역이 적절하게 대항하여 항상성을 유지하도록 설계되어 있다.
비장은 림프구와 대식 세포, 자연살해 세포 등 다양한 면역 세포를 형성하는 중요한 면역기관이다. 비장은 혈액에서 유래된 항원에 대해 면역반응을 하며, 노화된 세포 및 손상된 세포를 제거하는 역할도 수행한다.
선천 면역에서 비장 등에 존재하는 대식 세포가 가장 중요한 역할을 담당하는데, 대식 세포는 외부물질 침입을 가장 먼저 인지하여 체액성 면역과 세포성 면역에 관여하며, 활성화되면 증식과 확산능력의 향상, 대식 능력 증강뿐만 아니라 NO(nitric oxide), TNF-α, IL-1β, IL-6 등의 사이토카인을 분비하여 각종 미생물, 바이러스 등 감염성 병원체의 증식을 억제하고 암세포 등에 대해서도 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
한편, 면역력의 저하는 본래 우리 몸이 가지고 있는 자연치유기능을 점차 약화시켜 다양한 질환 또는 증상을 유발한다. 이를 해결하기 위해서는 근본적으로 면역력 증진이 요구되지만, 면역력은 개인별로 차이가 있어, 장기적인 관점에서 접근할 필요가 있다. 현재까지 면역증진을 목적으로 한 다양한 치료제 또는 보조제가 개발되어 시판되고 있으나, 장기간 복용에 따른 부작용을 이유로 치료제보다는 상대적으로 안전한 보조제, 특히 천연보조제의 사용이 바람직한 방안으로 지목되고 있으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 병풀(Centella asiatica)은 한반도 남부 섬의 산이나 들에 흔히 나는 여러해살이풀이다. 원줄기는 옆으로 뻗고, 뿌리가 내리는 마디 근처에 2개의 퇴화된 비늘 모양의 잎이 있다. 잎은 마디에서 밀생하고, 신장형, 지름 2~5cm, 표면은 광택이 나고, 가장자리에 둔한 톱니가 있으며, 잎자루의 길이는 4~20cm이다. 꽃은 홍자색, 잎겨드랑이에 3~4송이씩 산형꽃차례로 달리며, 머리 모양이다. 암술대는 2갈래이며, 열매는 분과의 편원형이다. 인도에서는 상처를 입은 호랑이가 병풀이 많이 난 곳에서 뒹굴어 치료하는 것을 보고 호랑이풀이라고 부르며, 오래전부터 약으로 사용하였다. 병풀의 잎과 줄기에 있는 마데카식산이란 성분이 염증을 낫게 하고, 종양과 궤양 등의 상처를 치유하는 힘이 있다는 게 밝혀지면서 연고, 치약 또는 화장품 등의 원료로 쓰인다.
천연물의 면역증진 효과와 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제2119178호에 참당귀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2168310호에 아로니아 발효 추출물을 포함하는 면역증진용 건강기능성 식품 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 '병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물을 제공하고, 본 발명의 병풀 발효 추출물이 병풀 추출물에 비해 대식세포의 NO(Nitric Oxide), PGE2(Prostaglandin E2) 및 사이토카인의 분비량을 증가시키고, 비장세포의 증식 및 사이토카인 분비량을 증가시키며, NK 세포 활성을 증진시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 병풀 발효 추출물이 병풀 추출물에 비해 대식세포의 NO(Nitric Oxide), PGE2(Prostaglandin E2) 및 사이토카인의 분비량을 증가시키고, 비장세포의 증식 및 사이토카인 분비량을 증가시키며, NK 세포 활성을 증진시키는 효과가 우수하다.
도 1은 대식세포에 대한 병풀 발효 추출물의 세포독성을 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 대조군이다.
도 2는 병풀 발효 추출물 처리에 의한 대식세포의 NO 분비량을 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 대조군이다. ****은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Con) 대비 LPS 처리군 및 병풀 발효 추출물(25, 50, 100㎍/㎖) 처리군의 NO 함량이 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.0001이다.
도 3은 병풀 발효 추출물 처리에 의한 대식세포의 PGE2 분비량을 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 대조군이다. ****은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Con) 대비 LPS 처리군 및 병풀 발효 추출물(25, 50, 100㎍/㎖) 처리군의 PGE2 함량이 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.0001이다.
도 4는 병풀 발효 추출물 처리에 의한 대식세포의 TNF-α 및 IL-6 분비량을 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군이고, LPS는 면역반응 유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 대조군이다. ****은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Con) 대비 LPS 처리군, 병풀 추출물(25, 50, 100㎍/㎖) 처리군 및 병풀 발효 추출물(25, 50, 100㎍/㎖) 처리군의 TNF-α 또는 IL-6 함량이 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.0001이다.
도 5는 비장세포에 병풀 발효 추출물을 처리하여 세포 증식 효과를 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군이며, ConA(Concanavalin A)는 양성 대조군이다. *, **, ***은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Con) 대비 병풀 추출물(200㎍/㎖) 처리군, 병풀 발효 추출물(50, 100, 200㎍/㎖) 처리군 또는 양성 대조군의 세포 증식이 유의미하게 증가하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이며, ***은 p<0.001이다. #은 병풀 추출물(200㎍/㎖) 처리군 대비 병풀 발효 추출물(200㎍/㎖) 처리군의 세포 증식이 유의미하게 더 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 6은 병풀 발효 추출물 처리에 의한 비장세포의 IL-10 분비량을 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군이며, ConA(Concanavalin A)는 양성 대조군이다. ****은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Con) 대비 양성 대조군 및 병풀 발효 추출물(50, 100, 200㎍/㎖) 처리군의 IL-10 함량이 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.0001이다.
도 7은 병풀 발효 추출물 처리에 의한 NK 세포 활성 증가 효과를 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군이며, ConA(Concanavalin A)는 양성 대조군이다. *, **은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Con) 대비 양성 대조군 또는 병풀 발효 추출물(200㎍/㎖) 처리군의 NK 세포 활성이 유의미하게 증가하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다. #, ###은 병풀 추출물(50, 100㎍/㎖) 처리군 대비 병풀 발효 추출물(50, 100㎍/㎖) 처리군의 NK 세포 활성이 유의미하게 더 증가하였다는 것으로, #은 p<0.05이고, ###은 p<0.001이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 병풀 발효 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다;
1) 병풀 분말에 물을 가하여 멸균하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 상온으로 식혀 발효균을 첨가하고 25~40℃에서 2~4일 동안 발효하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, 50~70℃에서 건조하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 건조한 병풀 발효물의 건조 분말에 추출용매를 첨가하여 추출하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 2)에서 발효균은 누룩인 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 4)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 4)의 병풀 발효물의 추출은 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 병풀 발효 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합체 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물을 건강 음료로 사용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 텍스트린, 사이클로텐스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물은 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 면역력 저하에 의한 질환은 감기, 천식, 부비동염, 폐렴, 패혈증, 골수염, 수막염, 단순포진, 대상포진, 구내염 및 건선 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 환제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량의 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 복합 한약재 추출물의 양을 기준으로 0.01~2,000mg/kg이고, 바람직하게는 50~1000mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 300~500mg/kg이며, 하루 1~6회 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 병풀 발효 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 병풀 발효 추출물을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 병풀 발효 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 병풀 추출물 제조
병풀 에탄올 추출물은 200g의 병풀을 분쇄한 후, 70%(v/v) 에탄올 2ℓ를 첨가하여 병풀 에탄올 추출물을 제조하였다.
제조예 2. 병풀 발효 추출물 제조
200g의 병풀을 분쇄한 후, 400㎖의 증류수를 첨가하여 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 상온으로 식힌 상기 병풀에 10g의 누룩을 첨가한 후, 32℃에서 3일 동안 발효시키고, 60℃에서 건조하여 병풀 누룩 발효물을 제조한 후 70%(v/v) 에탄올로 추출하여 병풀 발효 추출물을 제조하였다.
제조예 3. 누룩 발효 추출물 제조
200g의 누룩을 분쇄한 후, 200㎖의 멸균된 증류수를 첨가하여 32℃에서 3일 동안 발효시키고, 60℃에서 건조하여 누룩 발효물을 제조한 후 70%(v/v) 에탄올로 추출하여 누룩 발효 추출물을 제조하였다.
실시예 1. 대식세포에서 면역증진 효능 확인
1) 세포 독성 측정
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 적정 농도로 분주한 후, 병풀 추출물(제조예 1), 병풀 발효 추출물(제조예 2), 누룩 발효 추출물(제조예 3)을 농도별(25, 50, 100㎍/㎖)로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포에 MTT(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, sigma) 용액을 첨가하고, 4시간 반응시킨 후 ELISA 리더로 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이후 대조군과의 비교를 통해 상대적 세포 생존율(%)을 계산하였다.
그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 병풀 추출물, 병풀 발효 추출물 및 누룩 발효 추출물 모두 세포 독성이 없어 세포 생존율에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.
2) NO(Nitric Oxide) 측정
96웰 플레이트에 적정 농도로 분주한 RAW 274.7 세포에 병풀 추출물, 병풀 발효 추출물 및 누룩 발효 추출물을 농도별(25, 50, 100㎍/㎖)로 처리하고, LPS(500ng/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 원심분리하여 얻은 배양 상층액을 취한 후 Griess 시약을 사용하여 제조사의 방법에 따라 NO 함량을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 LPS 처리군은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(con)에 비해 NO 생성량이 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 병풀 발효 추출물도 마찬가지로 NO 생성을 농도 의존적으로 증가시켰다. 반면, 병풀 추출물 및 누룩 발효 추출물은 NO 생성에 아무런 영향을 미치지 못하였다.
3) PGE 2 (Prostaglandin E 2 ) 측정
96웰 플레이트에 적정 농도로 분주한 RAW 274.7 세포에 병풀 추출물, 병풀 발효 추출물 및 누룩 발효 추출물을 농도별(25, 50, 100㎍/㎖)로 처리하고, LPS(500ng/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 원심분리하여 얻은 배양 상층액을 취한 후 PGE2 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 방법에 따라 PGE2의 생성량을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 LPS 처리군은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(con)에 비해 PGE2 생성량이 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 병풀 발효 추출물도 마찬가지로 PGE2 생성을 농도 의존적으로 증가시켰다. 반면, 병풀 추출물 및 누룩 발효 추출물은 PGE2 생성에 아무런 영향을 미치지 못하였다.
4) 사이토카인 측정
96웰 플레이트에 적정 농도로 분주한 RAW 274.7 세포에 병풀 추출물, 병풀 발효 추출물 및 누룩 발효 추출물을 농도별(25, 50, 100㎍/㎖)로 처리하고, LPS(500ng/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 원심분리하여 얻은 배양 상층액을 취한 후 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 방법에 따라 TNF-α 및 IL-6의 생성량을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 LPS 처리군은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(con)에 비해 TNF-α 및 IL-6의 생성량이 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 병풀 발효 추출물도 마찬가지로 TNF-α 및 IL-6의 생성을 농도 의존적으로 증가시켰다. 병풀 추출물의 경우, 대조군(con)에 대비하여 IL-6의 생성량이 유의적으로 증가하였으나, 본 발명의 병풀 발효 추출물의 효능이 더 우수하였다. 반면, 누룩 발효 추출물은 TNF-α 및 IL-6 분비에 아무런 영향을 미치지 못하였다.
실시예 2. 비장세포 증식능 및 사이토카인 생성 확인
면역세포의 증식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마우스의 비장을 이용하였다. 마우스의 비장을 적출하여 PBS(phosphate buffered saline)로 비장을 세척한 후 5㎖ 일회용 주사기 막대피스톤으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 분리된 세포현탁액을 40μm의 세포 스트레이너에 통과시켜 배양액으로 2번 세척하고, 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이후, RBC(red blood cell) 용해 버퍼에 현탁시켜 10분간 처리하여 적혈구를 제거하고 다시 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 용액에 분산시켜, 트리판블루 용액으로 염색한 후 세포수를 측정하였다. 1.0×105 cell/㎖의 농도가 되도록 96웰 플레이트에 분주하고 병풀 발효 추출물 및 누룩 발효 추출물을 농도별(50, 100, 200㎍/㎖)로 각각 처리하였다. 양성 대조군으로 1㎍/㎖의 콘카나발린 A(Concanavalin A, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하여 48시간 배양한 후 세포 증식능을 확인하였다. 또한, 원심분리하여 얻은 배양 상층액을 취한 후 IL-10 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 방법에 따라 IL-10의 생성량을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 누룩 발효 추출물은 비장세포 증식에 영향을 미치지 못하였지만, 병풀 추출물의 경우 고농도(200㎍/㎖)에서 비장세포 증식이 유의미하게 촉진되었다. 하지만, 본 발명의 병풀 발효 추출물의 비장세포 증식이 유의미하게 더 촉진되는 것을 확인하였다.
또한, 비장세포에서 병풀 추출물 및 누룩 발효 추출물은 IL-10 분비에 거의 영향을 미치지 못하였으나, 본 발명의 병풀 발효 추출물은 IL-10 생성량을 현저하게 증가시켰다(도 6).
실시예 3. NK(Natural Killer) 세포의 활성 증가 확인
Balb/c 마우스의 비장을 멸균적으로 취한 후, 비장세포를 분리하여 NK 세포 활성을 측정하였다. NK 세포 활성은 상용화된 LDH 분석 키트(CK12-20, Dojindo, Japan)를 사용하여 실시하였다. 분리된 비장세포를 영향세포(Effector cell)로 사용하고, 표적세포(target cel)는 YAC-1 세포를 사용하였다. U-Bottomed 96-웰 플레이트에 E/T(effector-to-target) 비율이 100 : 1이 되도록 조정하여 6시간 동안 공동 배양하였다. 배양종료 후에 원심분리를 통하여 배양 상등액을 취한 후, 영향세포에 의해 표적세포가 공격받아 방출하는 LDH(lactate dehydrogenase)의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 개시한 바와 같이 본 발명의 병풀 발효 추출물은 병풀 추출물에 비해 NK 활성을 유의미하게 더 증가시키는 것을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 병풀 발효 추출물은
    1) 병풀 분말에 물을 가하여 멸균하는 단계;
    2) 상기 단계 1) 이후에, 상온으로 식혀 발효균을 첨가하고 25~40℃에서 2~4일 동안 발효하는 단계;
    3) 상기 단계 2) 이후에, 50~70℃에서 건조하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)에서 건조한 병풀 발효물의 건조 분말에 추출용매를 첨가하여 추출하여 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강기능식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단계 2)에서 발효균은 누룩인 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강기능식품 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단계 4)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강기능식품 조성물.
  6. 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역력 저하에 의한 질환은 감기, 천식, 부비동염, 폐렴, 패혈증, 골수염, 수막염, 단순포진, 대상포진, 구내염 및 건선 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 사료 첨가제.
  10. 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역력 저하에 의한 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
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