KR20230104954A

KR20230104954A - 세포 분류 방법

Info

Publication number: KR20230104954A
Application number: KR1020237019707A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 포르토; 티모시 잭슨; 길리안 로벨; 네빈 홀츠
Original assignee: 싸토리우스 바이오애널리티컬 인스트루먼츠, 아이엔씨
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-07-11
Also published as: CN116348921A; JP2023549020A; WO2022108885A1; EP4248357A1

Abstract

본 개시는 생물학적 샘플의 현미경 이미지에서 세포를 자동 또는 반자동으로 분류하기 위한 예시적인 실시예를 제공한다. 이들 실시예들은 분류기 모델들의 발전을 위한 트레이닝 세트들을 선택하기 위한 방법들을 포함한다. 개시된 선택 실시예는 타겟 샘플과 동일하거나 유사한 배양 조건을 겪은 트레이닝 예를 사용하여 분류기 모델의 재트레이닝을 허용할 수 있다. 이러한 선택 실시예들은 트레이닝 예들을 특정하기 위해 요구되는 인간의 노력의 양을 감소시킬 수 있다. 개시된 실시예들은 또한 위상차 이미지 및 디포커싱된 명시야 이미지를 사용하여 세포들에 대해 결정된 메트릭들에 기초한 개별 세포들의 분류를 포함한다. 이러한 메트릭들은 크기, 형상, 텍스처, 및 세기 기반 메트릭들을 포함할 수 있다. 이러한 메트릭들은 기본 이미지의 분할에 기초하여 결정된다. 분할은, 일부 실시예들에서, 생물학적 샘플들의 위상차 이미지 및/또는 디포커싱된 명시야 이미지에 기초한다.

Description

세포 분류 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 11월 17일에 출원된 미국 출원 제17/099,983호에 대한 우선권을 주장하는 국제 출원이며, 이는 본원에 참조로 통합된다. 또한 2019년 2월 1일에 출원된 미국 출원 제16/265,910호 및 2020년 11월 17일에 출원된 미국 출원 제16/950,368호는 참조로서 통합된다.

현재 알려진 생물학적 시료에서의 세포 분할 방법은 형광으로 라벨링된(labeled) 단백질, 예를 들어, 마커-제어 분할 알고리즘(marker-controlled segmentation algorithm)을 위한 히스톤(histone)과 같은 핵-국소화 단백질을 임계화(thresholding)하는 것을 요구한다. 타이코그래피(ptychography) 기반 방법, 측방 전단 간섭계(lateral shearing interferometry) 및 디지털 홀로그래피(digital holography)와 같은 대안적인 라벨-프리(label-free) 기술이 존재하지만, 이들은 복잡한 이미지 취득 셋업(setup) 및 긴 프로세싱 시간을 갖는 복잡한 이미지 형성 알고리즘을 요구한다. 다른 라벨-프리 기술은 이미지들의 큰 데이터세트들에 대한 광범위한 트레이닝 및 느린 프로세싱 시간들을 요구하는 딥-러닝 알고리즘들(예를 들어, 컨볼루션 신경망들)을 포함한다. 다른 방법들은 핀홀 애퍼처(pinhole aperture)와 같은 전문화된 하드웨어를 요구하고 세포별 분할을 허용하지 않는 아웃-포커스(out-of-focus) 상태에서 명시야 이미지를 사용한다.

현미경 이미지(예를 들어, 이미지 내의 위치 및 범위가 분할(segmentation)에 의해 결정된 세포의 분류)에서 세포의 분류는 샘플 내에 존재하는 세포의 수의 증가 또는 감소 및/또는 다양한 조건(예를 들어, 분화(differentiated) vs. 미분화)에 대응하는 세포의 비율의 측면에서 다양한 실험 조건의 영향을 정량화함으로써 이들 조건의 영향을 평가하는 것을 포함하는 다양한 애플리케이션을 가능하게 할 수 있다. 세포 분류는 수동으로 수행될 수 있지만, 이러한 수동 분류는 시간 및 노력 측면에서 비용이 많이 들 수 있고, 세포의 부정확한 분류를 초래할 수 있다. 자동화된 방법들이 또한 이용가능하지만, 이들 방법들은 세포의 자연 생물학을 방해할 수 있는 형광으로 라벨링된 단백질들을 요구할 수 있거나, 자동화된 알고리즘들을 트레이닝하기 위해 트레이닝 예들의 큰 세트들을 제공하는 것을 요구할 수 있다.

일 양태에서, 세포의 분류를 위한 예시적인 방법이 개시된다. 상기 방법은 : (i) 복수의 생물학적 샘플들의 이미지들의 세트를 획득하는 단계 - 상기 이미지들의 세트는 상기 복수의 생물학적 샘플들의 각각의 샘플의 적어도 하나의 이미지를 포함함 -; (ii) 상기 복수의 생물학적 샘플들 내의 제1 세트의 세포들의 표시를 획득하고, 상기 복수의 생물학적 샘플들 내의 제2 세트의 세포들의 표시를 획득하는 단계 - 상기 제1 세트의 세포들은 제1 조건과 연관되고, 상기 제2 세트의 세포들은 제2 조건과 연관됨 -; (iii) 상기 이미지들의 세트, 상기 제1 세트의 세포들의 표시, 및 상기 제2 세트의 세포들의 표시에 기초하여, 제1 복수의 메트릭들의 세트들을 결정하는 단계 - 상기 제1 복수의 메트릭들의 세트들은 상기 제1 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트 및 상기 제2 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 포함함 -; (iv) 상기 제1 복수의 메트릭들의 세트들에 기초하여, 지도 학습 알고리즘(supervised learning algorithm)을 사용하여 상기 제1 세트의 세포들 내의 세포들과 상기 제2 세트의 세포들 내의 세포들을 구별하기 위한 모델을 생성함으로써 트레이닝된 모델을 생성하는 단계; (v) 상기 이미지들의 세트에 기초하여, 제2 복수의 메트릭들의 세트들을 결정하는 단계 - 상기 제2 복수의 메트릭들의 세트들은 타겟 샘플 내에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 포함함-; 및 (vi) 상기 타겟 샘플 내의 세포를 분류하는 단계를 포함하되, 상기 세포를 분류하는 단계는 상기 트레이닝된 모델을 상기 세포에 대한 메트릭들의 세트에 적용하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 세포의 분류를 위한 예시적인 방법이 제공된다. 이 방법은 (i) 타겟 샘플의 3개 이상의 이미지를 획득하는 단계 - 상기 타겟 샘플은 상기 타겟 샘플에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하고, 상기 3개 이상의 이미지는 위상차 이미지, 제1 명시야 이미지 및 제2 명시야 이미지를 포함하고, 상기 제1 명시야 이미지는 상기 초점면 위의 제1 디포커싱 거리에서 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내고, 상기 제2 명시야 이미지는 상기 초점면 아래의 제2 디포커싱 거리에서 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타냄 -; (ii) 상기 제1 및 제2 명시야 이미지들에 기초하여 상기 타겟 샘플의 세포 이미지를 결정하는 단계; (iii) 상기 세포 이미지 및 상기 위상차 이미지에 기초하여 상기 타겟 샘플에 대한 타겟 분할 맵을 결정하는 단계; (iv) 상기 타겟 샘플의 2개 이상의 이미지 및 상기 타겟 분할 맵에 기초하여, 상기 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정하는 단계; 및 (v) 상기 타겟 샘플 내의 세포를 분류하는 단계 - 상기 세포를 분류하는 단계는 상기 세포의 메트릭들의 세트를 트레이닝된 분류기에 적용하는 단계를 포함함 - 를 포함한다.

또 다른 양태에서, 세포의 분류를 위한 예시적인 방법이 제공된다. 방법은: (i) 타겟 샘플의 2개 이상의 이미지들을 획득하는 단계 - 타겟 샘플은 타겟 샘플에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포들을 포함하고, 2개 이상의 이미지들은 위상차 이미지 및 하나 이상의 명시야 이미지들을 포함하고, 하나 이상의 명시야 이미지들은 초점면에 포커싱되지 않은 타겟 샘플의 이미지를 나타내는 적어도 하나의 명시야 이미지를 포함함 -; (ii) 2개 이상의 이미지들에 기초하여, 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정하는 단계; 및 (iii) 트레이닝된 모델을 세포에 대한 메트릭들의 세트에 적용함으로써 타겟 샘플 내의 세포를 분류하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 컴퓨팅 디바이스의 하나 이상의 프로세서들에 의해 실행될 때, 컴퓨팅 디바이스로 하여금 상기의 방법들 중 임의의 것을 수행하기 위한 제어기 동작들을 수행하게 하는 적어도 컴퓨터 판독가능 명령어들을 저장하도록 구성된 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다.

또 다른 태양에서, (i) 광학 현미경; (ii) 제어기 - 제어기는 하나 이상의 프로세서를 포함함 -; 및 (iii) 제어기에 의해 실행될 때, 제어기로 하여금 상기 방법들 중 임의의 것을 수행하기 위한 제어기 동작들을 수행하게 하는 적어도 컴퓨터 판독 가능 명령어들을 저장하도록 구성된 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는, 생물학적 시료들을 검정하기 위한 시스템이 제공된다.

논의된 특징부들, 기능들, 및 이점들은 다양한 예들에서 독립적으로 달성될 수 있거나, 또는 다음의 설명 및 도면들을 참조하여 더 상세히 알 수 있는 또 다른 예들에서 조합될 수 있다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행되는 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 비용의 요청 및 지불에 따라 특허청에서 제공될 것이다.
도 1은 하나의 예시적인 구현예에 따른 시스템의 기능 블록도이다.
도 2는 예시적인 구현예에 따른 컴퓨팅 디바이스 및 컴퓨터 네트워크의 블록도를 도시한다.
도 3은 예시적인 구현예에 따른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 4는 예시적인 구현예에 따른 생물학적 시료의 이미지들을 도시한다.
도 5는 예시적인 구현예에 따른 다른 생물학적 시료의 이미지를 도시한다.
도 6a는 캄프토테신(CPT, 세포독성(cytotoxic)) 처리 후 HT1080 섬유육종 세포사멸(fibrosarcoma apoptosis) 시간 경과 후 24시간에 세포 이미지 반응에 대해 예시적인 구현예에 따라 생성된 세포별 분할 마스크(cell-by-cell segmentation mask)의 실험 결과를 도시한다.
도 6b는 도 6a의 구현예에 따른 적색(Nuclear Red, 세포 건강 지표(cell health indicator), "NucRed") 및 녹색 형광(카스파제 3/7, 세포사멸 지표)에 기초하여 분류된 세포 서브세트를 도시한다.
도 6c는 도 6a의 구현예에 따른 생존가능 세포의 손실을 나타내는 CPT 처리 후 적색 개체군(population)의 감소, 초기 세포사멸을 나타내는 적색 및 녹색 형광의 증가, 뿐만 아니라 후기 세포사멸을 나타내는 24시간 후 녹색 형광의 증가가 있었음을 도시한다.
도 6d는 도 6a의 구현예에 따른 초기 세포사멸 개체군의 농도 반응 시간 경과(적색 및 녹색 형광을 나타내는 전체 세포의 백분율)을 도시한다.
도 6e는 시클로헥사미드(CHX, 세포분열 억제(cytostatic)) 처리 후 HT1080 섬유육종 세포사멸의 시간 경과 후 24시간에 세포 이미지 반응에 대해 예시적인 구현예에 따라 생성된 세포별 분할 마스크의 실험 결과를 도시한다.
도 6f는 도 6e의 구현예에 따른 적색(Nuclelight Red, 세포 건강 지표, "NucRed") 및 녹색 형광(카스파제 3/7, 세포사멸 지표)에 기반하여 분류된 세포 서브세트를 도시한다.
도 6g는 도 6e의 구현예에 따른 세포사멸이 결여되었지만 CHX 처리 후 세포 카운트가 감소하였음을 도시한다.
도 6h는 도 6e의 구현예에 따른 초기 세포사멸 개체군의 농도 반응 시간 경과(적색 및 녹색 형광을 나타내는 전체 세포의 백분율)을 도시한다.
도 7a는 예시적인 구현예에 따라 생성된, 세포별 분할 분석을 사용하여 부착성 세포의 라벨-프리 세포 카운팅을 위해 위상차 이미지 위에 부과된 세포별 분할 마스크를 도시한다. NucLight Red 시약으로 라벨링된 A549 세포의 다양한 밀도를 시간에 따른 라벨-프리 카운팅을 검증하기 위해 라벨-프리 세포별 분석 및 적색 핵 카운트 분석(red nuclear count analysis) 둘 모두로 분석하였다.
도 7b는 백그라운드에서 위상차 이미지 없이 도 7a에 따른 세포별 분할 마스크를 도시한다.
도 7c는 도 7a의 구현예에 따른 밀도들에 걸친 위상 카운트 및 NucRed 카운트 데이터의 시간 경과를 도시한다.
도 7d는 48시간에 걸친 카운트 데이터의 상관관계를 도시하고, 도 7a의 구현예에 따른 1의 기울기와 1의 R2 값을 입증한다.
도 8은 예시적인 구현예에 따른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 9는 예시적인 구현예에 따른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 10은 예시적인 구현예에 따른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 11은 예시적인 현미경 이미지 및 관련 예시적인 분할 맵(segmentation map)을 도시한다.
도 12a는 주석이 달린(annotated) 현미경 이미지의 예를 도시한다.
도 12b는 주석이 달린 현미경 이미지의 예를 도시한다.
도 13은 멀티 웰 샘플 플레이트(multi-well sample plate)의 웰의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 14a 및 14b는 본 명세서에 설명된 방법의 실험적 예측 정확도를 도시한다.
도 15a 및 15b는 본 명세서에 설명된 방법의 실험적 예측 정확도를 도시한다.
도 16a, 16b 및 16c는 라벨-기반 분류와 비교하여 본 명세서에 설명된 방법의 실험적 예측 정확도를 도시한다.
도면은 예시들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명이 도면에 도시된 장치 및 수단에 제한되지 않음은 이해될 것이다.

I. 개요

생물학적 샘플의 현미경 이미징은 샘플의 함량 및 다양한 적용된 실험 조건에 대한 이들의 반응의 많은 분석을 가능하게 할 수 있다. 그러한 분석은 적용된 조건의 영향을 결정하기 위해 세포를 분류한 후에 세포를 카운팅하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 분화된 세포의 세트 및 미분화된 세포의 세트를 포함할 수 있고, 샘플의 분석은 예를 들어, 미분화된 세포가 분화되게 하는 데 있어 적용된 조건의 유효성을 결정하기 위해 분화된 세포의 비율을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 분석을 수행하기 위해, 샘플 내의 세포들 각각을 국소화(localize)시킨 다음, 세포들 각각을 분류해야 한다. 이러한 분류 프로세스는 수동으로 수행될 수 있다. 그러나, 수동 분류는 매우 비싸고, 시간 소모적일 수 있고, 부정확한 분류들을 초래할 수 있다.

본원에 설명된 실시예들은 위상차 이미지(phase contrast image)들, 명시야 이미지(brightfield image)들, 위상차 및/또는 명시야 이미지들의 합성들, 또는 세포들의 다른 현미경 이미지에 기초하여 세포들을 자동으로 분류하기 위한 다양한 방법들을 입증하였다. 이들 실시예 중 일부는 세포를 분류하기 위한 모델을 트레이닝시키기 위해 하나 이상의 생물학적 샘플 내의 특정 세트의 세포를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음, 이러한 트레이닝된 모델은 이들 추가 세포를 분류하기 위해 추가 세포에 적용될 수 있다. 특정 세포를 분류하기 위해, 세포를 나타내는 하나 이상의 이미지에 기초하여 세포에 대한 메트릭(metric) 세트가 결정된다. 이러한 메트릭들은 세포의 크기 및/또는 형상과 관련된 메트릭들을 포함할 수 있다. 그러한 메트릭들은 추가적으로 또는 대안적으로 하나 이상의 위상차 이미지들, 명시야 이미지들, 형광 이미지들, 또는 합성 이미지들에서 표현된 세포의 텍스처(texture) 또는 세기와 관련될 수 있다. 예를 들어, 메트릭들 중 하나 이상은 형광 이미지들 또는 일부 다른 다양한 이미지들(예를 들어, 위상차, 명시야)에서 세포들의 텍스처(texture)(예를 들어, 세포의 면적에 걸친 밝기 또는 세기의 가변성 및/또는 가변성의 구조)와 관련될 수 있다. 그런 다음, 세포에 대한 결정된 메트릭 세트는 세포들을 분류하기 위해 트레이닝된 모델에 적용될 수 있다.

모델을 트레이닝시키는 데 사용되는 세포들의 세트들은 다양한 방식들로 식별될 수 있다. 일부 예들에서, 세포들은 사용자에 의해 수동으로 표시될 수 있다. 이것은 사용자가 멀티 웰 샘플 플레이트의 전체 웰을 수동으로 표시하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 사용자는 하나 이상의 생물학적 샘플 내의 개별 세포를 수동으로 표시할 수 있다. 또 다른 예에서, 사용자는 세포들의 세트들을 표시하기 위해 시점들을 특정할 수 있는데, 예를 들어, 샘플 내의 모든 세포들이 제1 세트(예를 들어, 미분화된 세트(undifferentiated set))에 속하기 전에 제1 시점을 설정하고, 샘플 내의 모든 세포들이 제2 세트(예를 들어, 분화된 세트(differentiated set))에 속하기 전에 제2 시점을 설정할 수 있다. 일부 예들에서, 세포들은 자동으로 또는 반자동으로 표시될 수 있다. 이는 세포들의 형광 이미지들에 기초하여 세포들의 세트들을 식별하는 것을 포함할 수 있다(예를 들어, 임계치 초과(supra-threshold) 형광 신호들을 갖는 세포들은 제1 그룹에 할당될 수 있는 반면, 임계치 미만 형광 신호들을 갖는 세포들은 제2 그룹에 할당될 수 있다). 다른 예에서, 비지도 또는 반-지도 학습 알고리즘은 분류기(classifier)를 트레이닝시키는 데 사용될 수 있는 세트들로 세포들을 클러스터링(cluster)하거나 그렇지 않으면 결집시킬 수 있다.

II. 예시적인 아키텍처

도 1은 예를 들어, 광학 현미경(105) 및 하나 이상의 세포를 갖는 생물학적 시료(specimen)(110)를 포함하거나 수반하는 동작 환경(100)을 도시하는 블록도이다. 아래에서 설명되는 도 3-5, 8, 9 및 10의 방법들(300, 800, 900 및 1000)은 이 동작 환경(100) 내에서 구현될 수 있는 방법들의 실시예들을 도시한다.

도 2는, 예시적인 구현예에 따른 동작 환경(100)과 직접 또는 간접적으로 인터페이싱하도록 구성된 컴퓨팅 디바이스(200)의 예를 예시하는 블록도이다. 컴퓨팅 디바이스(200)는 도 3-5, 8, 9 및 10에 도시되고 이하에서 설명되는 방법들의 기능들을 수행하는데 사용될 수 있다. 특히, 컴퓨팅 디바이스(200)는 예를 들어, 광학 현미경(105)에 의해 획득된 이미지들에 부분적으로 기초하는 이미지 생성 기능들을 포함하는 하나 이상의 기능들을 수행하도록 구성될 수 있다. 컴퓨팅 디바이스(200)는 프로세서(들)(202), 및 또한 통신 버스(212)에 각각 연결된 통신 인터페이스(204), 데이터 스토리지(206), 출력 인터페이스(208), 및 디스플레이(210)를 갖는다. 컴퓨팅 디바이스(200)는 또한 컴퓨팅 디바이스(200) 내에서 그리고 컴퓨팅 디바이스(200)와 다른 디바이스들(예를 들어, 도시되지 않음) 사이의 통신을 가능하게 하는 하드웨어를 포함할 수 있다. 하드웨어는, 예를 들어, 송신기들, 수신기들, 및 안테나들을 포함할 수 있다.

통신 인터페이스(204)는 하나 이상의 네트워크(214) 또는 하나 이상의 원격 컴퓨팅 디바이스(216)(예를 들어, 태블릿(216a), 퍼스널 컴퓨터(216b), 랩톱 컴퓨터(216c) 및 모바일 컴퓨팅 디바이스(216d))로의 단거리 통신 및 장거리 통신 둘 다를 허용하는 무선 인터페이스 및/또는 하나 이상의 유선 인터페이스일 수 있다. 이러한 무선 인터페이스들은 블루투스, WiFi(예를 들어, IEEE(institute of electrical and electronic engineers) 802.11 프로토콜), LTE(Long-Term Evolution), 셀룰러 통신들, NFC(near-field communication), 및/또는 다른 무선 통신 프로토콜들과 같은 하나 이상의 무선 통신 프로토콜들 하에서 통신을 제공할 수 있다. 이러한 유선 인터페이스들은 이더넷 인터페이스, USB(Universal Serial Bus) 인터페이스, 또는 와이어, 연선(twisted pair of wires), 동축 케이블, 광 링크, 광섬유 링크, 또는 유선 네트워크에 대한 다른 물리적 접속을 통해 통신하기 위한 유사한 인터페이스를 포함할 수 있다. 따라서, 통신 인터페이스(204)는 하나 이상의 디바이스들로부터 입력 데이터를 수신하도록 구성될 수 있고, 또한 출력 데이터를 다른 디바이스들에 발송하도록 구성될 수 있다.

통신 인터페이스(204)는 또한, 예를 들어, 키보드, 키패드, 터치 스크린, 터치 패드, 컴퓨터 마우스, 트랙 볼(track ball) 및/또는 다른 유사한 디바이스들과 같은 사용자 입력 디바이스를 포함할 수 있다.

데이터 스토리지(206)는 프로세서(들)(202)에 의해 판독되거나 액세스될 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 저장 매체를 포함하거나 그 형태를 취할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 저장 매체는 프로세서(들)(202)와 전체적으로 또는 부분적으로 통합될 수 있는 광학, 자기, 유기 또는 다른 메모리 또는 디스크 스토리지와 같은 휘발성 및/또는 비휘발성 스토리지 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 데이터 스토리지(206)는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체로 간주된다. 일부 예들에서, 데이터 스토리지(206)는 단일 물리적 디바이스(예를 들어, 하나의 광학, 자기, 유기 또는 다른 메모리 또는 디스크 스토리지 유닛)를 사용하여 구현될 수 있는 반면, 다른 예들에서, 데이터 스토리지(206)는 2개 이상의 물리적 디바이스를 사용하여 구현될 수 있다.

따라서, 데이터 스토리지(206)는 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체이고, 실행가능 명령어들(218)이 저장된다. 명령어들(218)은 컴퓨터 실행가능 코드를 포함한다. 명령어들(218)이 프로세서(들)(202)에 의해 실행될 때, 프로세서(들)(202)는 기능들을 수행하게 된다. 이러한 기능은 광학 현미경(100)으로부터 명시야 이미지를 수신하고 위상차 이미지, 컨플루언스 마스크(confluence mask), 세포 이미지, 시드 마스크(seed mask), 세포별 분할 마스크 및 형광 이미지를 생성하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

프로세서(들)(202)는 범용 프로세서 또는 특수 목적 프로세서(예를 들어, 디지털 신호 프로세서, 주문형 집적 회로 등)일 수 있다. 프로세서(들)(202)는 통신 인터페이스(204)로부터 입력들을 수신하고, 입력들을 프로세싱하여 데이터 스토리지(206)에 저장되고 디스플레이(210)에 출력되는 출력들을 생성할 수 있다. 프로세서(들)(202)는 데이터 스토리지(206)에 저장되고 본 명세서에 설명된 컴퓨팅 디바이스(200)의 기능을 제공하도록 실행가능한 실행가능 명령어들(218)(예를 들어, 컴퓨터 판독가능 프로그램 명령어들)을 실행하도록 구성될 수 있다.

출력 인터페이스(208)는 디스플레이(210) 또는 다른 컴포넌트들에도 정보를 출력한다. 따라서, 출력 인터페이스(208)는 통신 인터페이스(204)와 유사할 수 있고, 또한 무선 인터페이스(예를 들어, 송신기) 또는 유선 인터페이스일 수 있다. 출력 인터페이스(208)는 예를 들어, 하나 이상의 제어 가능한 디바이스에 커맨드를 발송할 수 있다.

도 2에 도시된 컴퓨팅 디바이스(200)는 또한, 예를 들어, 광학 현미경(105)과 통신하는, 동작 환경(100)에서의 로컬 컴퓨팅 디바이스(200a)를 나타낼 수 있다. 이 로컬 컴퓨팅 디바이스(200a)는 아래에서 설명되는 방법들(300, 800, 900, 1000)의 단계들 중 하나 이상을 수행할 수 있고, 사용자로부터 입력을 수신할 수 있고 및/또는 이미지 데이터 및 사용자 입력을 컴퓨팅 디바이스(200)에 발송하여 방법들(300, 800, 900 및/또는 1000)의 단계들 중 전부 또는 일부를 수행할 수 있다. 또한, 하나의 옵션의 예시적인 실시예에서, Incucyte® 플랫폼은 하나 이상의 방법들(300, 800, 900, 1000)을 수행하는 데 이용될 수 있고, 컴퓨팅 디바이스(200) 및 광학 현미경(105)의 조합된 기능을 포함한다.

도 3은 예시적인 구현예에 따른 생물학적 시료(110)의 하나 이상의 세포에 대한 세포별 분할(cell-by-cell segmentation)을 달성하기 위한 예시적인 방법(300)의 흐름도를 도시한다. 도 8, 9 및 10은 예시적인 구현예에 따른, 생물학적 시료(110)의 하나 이상의 세포의 세포별 분류를 달성하기 위한 예시적인 방법들(800, 900 및 1000)의 흐름도를 개별적으로 도시한다. 도 3, 8, 9, 10에 도시된 방법들(300, 800, 900, 1000)은 예를 들어, 도 2의 컴퓨팅 디바이스(200)와 함께 사용될 수 있는 방법의 예를 제시한다. 또한, 디바이스들 또는 시스템들은 도 3, 8, 9 및/또는 10에 제시된 논리 기능들을 수행하도록 사용되거나 구성될 수 있다. 일부 경우들에서, 디바이스들 및/또는 시스템들의 컴포넌트들은, 컴포넌트들이 그러한 성능을 인에이블(enable) 하기 위해 하드웨어 및/또는 소프트웨어로 구성되고 구조화되도록 기능들을 수행하도록 구성될 수 있다. 디바이스들 및/또는 시스템들의 컴포넌트들은 특정 방식으로 동작될 때와 같이, 기능들을 수행하도록 적응되거나, 가능하거나, 또는 그에 적합하도록 배열될 수 있다. 방법들(300, 800, 900, 1000)은 도시된 블록들 중 하나 이상의 블록들(예를 들어, 블록들(305-330))에 의해 예시된 하나 이상의 동작, 기능, 또는 액션을 포함할 수 있다. 각각의 방법의 블록들이 각각의 도면 내에서 순차적인 순서로 예시되지만, 이들 블록들 중 일부는 또한 병렬로, 및/또는 본 명세서에 설명된 것들과 상이한 순서로 수행될 수 있다. 또한, 다양한 블록들은 원하는 구현예에 기초하여 더 적은 수의 블록들로 조합되거나, 추가적인 블록들로 분할되거나, 및/또는 제거될 수 있다.

본 명세서에 개시된 이 및 다른 프로세스들 및 방법들에 대해, 흐름도들은 본 예들의 하나의 가능한 구현예의 기능 및 동작을 나타낸다는 것이 이해되어야 한다. 이와 관련하여, 각각의 블록은 모듈, 세그먼트, 또는 프로그램 코드의 일부를 나타낼 수 있고, 이는 프로세스의 특정 논리적 기능들 또는 단계들을 구현하기 위해 프로세서에 의해 실행가능한 하나 이상의 명령어들을 포함한다. 프로그램 코드는, 예를 들어, 디스크 또는 하드 드라이브를 포함하는 스토리지 디바이스와 같은 임의의 유형의 컴퓨터 판독가능 매체 또는 데이터 스토리지 상에 저장될 수 있다. 또한, 프로그램 코드는 기계 판독가능 포맷으로 컴퓨터 판독가능 저장 매체 상에, 또는 다른 비일시적 매체 또는 제조 물품들 상에 인코딩될 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는, 예를 들어, 레지스터 메모리, 프로세서 캐시 및 랜덤 액세스 메모리(RAM)와 같은 단기간 동안 데이터를 저장하는 컴퓨터 판독 가능 매체와 같은 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체 또는 메모리를 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 또한, 예를 들어, 판독 전용 메모리(ROM), 광학 또는 자기 디스크들, 컴팩트 디스크 판독 전용 메모리(CD-ROM)와 같은 2차 또는 영구 장기 스토리지와 같은 비일시적 매체들을 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 또한 임의의 다른 휘발성 또는 비휘발성 스토리지 시스템들일 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는, 예를 들어, 유형의 컴퓨터 판독가능 저장 매체로 간주될 수 있다.

또한, 도 3, 8, 9, 10의 각각의 블록은, 그리고 본 명세서에 개시된 다른 프로세스들 및 방법들 내에서, 프로세스에서 특정 논리 기능들을 수행하도록 배선되는 회로부를 나타낼 수 있다. 당업자에 의해 합리적으로 이해되는 바와 같이, 관련된 기능에 따라, 기능들이 실질적으로 동시적이거나 역순을 포함하여, 도시되거나 논의된 것으로부터 순서가 바뀌어 실행될 수 있는 본 개시의 예들의 범위 내에 대안적인 구현예들이 포함된다.

III. 예제 방법

본 명세서에서 사용되는, "명시야 이미지(brightfield image)"는 광파가 생물학적 샘플의 투명한 부분을 통과하도록 아래에서 조명된 생물학적 샘플에 기초한 현미경을 통해 획득된 이미지를 지칭한다. 그런 다음, 가변 밝기 레벨들은 명시야 이미지에 캡처된다.

본 명세서에서 사용되는, "위상차 이미지(phase contrast image)"는 생물학적 샘플의 상이한 부분들의 굴절률의 차이들로 인해 생물학적 샘플을 통과하는 광의 위상 시프트들을 캡처하는 아래에서 조명되는 생물학적 샘플에 기초하여, 현미경을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 획득된 이미지를 지칭한다. 예를 들어, 광파가 생물학적 시료를 통해 이동할 때, 광파 진폭(즉, 밝기) 및 위상은 생물학적 시료의 특성에 의존하는 방식으로 변화한다. 그 결과, 위상차 이미지는, 높은 굴절률을 갖는 더 조밀한 영역들이 결과적인 이미지에서 더 어둡게 렌더링되고, 더 낮은 굴절률을 갖는 더 얇은 영역들이 결과적인 이미지에서 더 밝게 렌더링되도록 변하는 픽셀들과 연관된 밝기 세기 값들을 갖는다. 위상차 이미지들은 명시야 이미지들의 Z-스택(stack)으로부터 포함하는 다수의 기술들을 통해 생성될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, 명시야 이미지의 "Z-스택(stack)" 또는 "Z-스위프(sweep)"는 개별 소스 명시야 이미지 중 임의의 것보다 더 큰 피사계 심도(depth of field)(즉, 초점의 평면의 두께)를 갖는 합성 이미지를 제공하기 위해 상이한 초점 거리에서 촬영된 다수의 이미지를 조합하는 디지털 이미지 프로세싱 방법을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "초점면(focal plane)"은 광학 현미경의 렌즈의 축에 수직으로 배열된 평면을 지칭하며, 여기서 생물학적 시료는 최적 초점에서 관찰가능하다.

본 명세서에서 사용되는, "디포커싱 거리(defocusing distance)"는 생물학적 시료가 초점 밖에서 관찰가능하도록 하는 초점면 위 또는 아래의 거리를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는, "컨플루언스 마스크(confluence mask)"는 픽셀들이 생물학적 시료 내의 하나 이상의 세포들에 속하는 것으로 식별되어 하나 이상의 세포들에 대응하는 픽셀들에 1의 값이 할당되고, 백그라운드에 대응하는 나머지 픽셀들에 0의 값이 할당되거나 그 반대인 이진 이미지를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는, "세포 이미지(cell image)"는 백그라운드에 대한 세포 콘트라스트(cell contrast)를 향상시키기 위해 상이한 평면들에서 획득된 적어도 2개의 명시야 이미지들에 기초하여 생성된 이미지를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는, "시드 마스크(seed mask)"는 설정된 픽셀 세기 임계치에 기초하여 생성된 이진 픽셀화를 갖는 이미지를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는, "세포별 분할 마스크(cell-by-cell segmentation mask)"는 생물학적 시료(110)의 세포들이 별개의 관심 영역으로 각각 디스플레이되도록 이진 픽셀화(binary pixelation)를 갖는 이미지(즉, 각각의 픽셀은 프로세서에 의해 0 또는 1의 값이 할당됨)를 지칭한다. 세포별 분할 마스크는 유리하게는 그 안에 디스플레이되는 세포의 라벨-프리 카운팅(label-free counting)을 허용하고, 개별 부착성 세포의 전체 영역의 결정을 허용하고, 세포 텍스처(texture) 메트릭 및 세포 형상 디스크립터(cell shape descriptor)에 기초한 분석을 허용하고, 및/또는 시트로 형성되는 경향이 있는 부착성 세포를 포함하는 개별 세포 경계의 검출을 허용할 수 있으며, 여기서 각각의 세포는 생물학적 시료(110) 내의 다수의 다른 인접한 세포와 접촉할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, "영역 성장 반복(region-growing iteration)"은 하나 이상의 초기에 식별된 개별 또는 픽셀들의 세트들(즉, "시드(seed)들")을 취하고 세트에 이웃 픽셀들을 추가함으로써 그 시드를 반복적으로 확장함으로써 관심 영역들("ROI(regions-of-interest)들")이 정의되는 반복적 이미지 분할 방법의 단일 단계를 지칭한다. 프로세서는 어떤 픽셀들이 성장 영역에 추가되는지를 결정하기 위해 유사성 메트릭들을 이용하고, 영역 성장이 완료되는 때를 결정하기 위해 프로세서에 대해 정지 기준들이 정의된다.

본 명세서에서 사용되는, "트레이닝된 모델(trained model)"은 세포의 클래스 멤버십에 대해 예측한 출력(예를 들어, 살아있는/죽은, 분화된/미분화된)을 생성하기 위해, 트레이닝 데이터의 세트에 기초하여, 파라미터들(예를 들어, 가중치들, 필터 뱅크 계수들), 구조(예를 들어, 은닉 층(hidden layer)들 및/또는 유닛들의 수, 그러한 유닛들의 상호연결의 패턴), 또는 구성의 다른 속성들이 트레이닝된(예를 들어, 강화 학습에 의해, 기울기 하강에 의해, 모델 파라미터들의 최대 가능성 값들을 분석하여 결정함으로써) 예측 및/또는 분류를 위한 모델(예를 들어, 인공 신경망, 베이지안 예측기, 결정 트리)을 지칭한다.

이제 도 3-5를 참조하면, 방법(300)이 도 1-2의 컴퓨팅 디바이스를 사용하여 예시된다. 방법(300)은 블록(305)에서, 프로세서(202)가 생물학적 시료(110)에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하는 생물학적 시료(110)의 적어도 하나의 위상차 이미지(phase contrast image)(400)를 생성하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 블록(310)에서, 프로세서(202)는 적어도 하나의 위상차 이미지(400)에 기초하여 이진 이미지의 형태로 컨플루언스 마스크(410)를 생성한다. 다음으로, 블록(315)에서, 프로세서(202)는 초점면 위의 디포커싱 거리(defocusing distance)에서 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 제1 명시야 이미지(415) 및 초점면 아래의 디포커싱 거리에서 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 제2 명시야 이미지(420)를 수신한다. 그런 다음, 블록(320)에서, 프로세서(202)는 제1 명시야 이미지(415) 및 제2 명시야 이미지(420)에 기초하여 생물학적 시료 내의 하나 이상의 세포의 세포 이미지(425)를 생성한다. 블록(325)에서, 프로세서(202)는 세포 이미지(425) 및 적어도 하나의 위상차 이미지(400)에 기초하여 시드 마스크(430)를 생성한다. 그리고, 프로세서(202)는 블록(330)에서, 시드 마스크(430) 및 컨플루언스 마스크(410)에 기초하여 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료 내의 하나 이상의 세포의 이미지를 생성한다.

도 3에 도시된 바와 같이, 블록(305)에서, 프로세서(202)가 생물학적 시료(110)에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하는 생물학적 시료(110)의 적어도 하나의 위상차 이미지(400)를 생성하는 것은, 프로세서(202)가 명시야 이미지의 Z-스위프(sweep)를 수신하고 이어서 명시야 이미지의 Z-스위프에 기초하여 적어도 하나의 위상차 이미지(400)를 생성하는 것을 포함한다. 다양한 실시예에서, 생물학적 시료(110)는 실험 세트를 나타내는 웰 플레이트(well plate) 내의 복수의 웰 내에 분산될 수 있다.

하나의 옵션의 실시예에서, 방법(100)은 프로세서(202)가 적어도 하나의 형광 이미지를 수신한 다음 세포별 분할 마스크(435) 내의 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 형광 세기를 계산하는 단계를 포함한다. 이 실시예에서, 형광 세기는 관심 단백질, 예를 들어, 세포 사멸에 상응하는 형광을 유도하는 CD20 또는 아넥신-V 시약과 같은 세포 표면 마커를 라벨링하는 항체의 레벨에 상응한다. 또한, 개별 세포 경계 내에서 형광 세기를 결정하는 것은 서브포퓰레이션 식별(subpopulation identification)을 증가시킬 수 있고, 서브포퓰레이션-특이적 메트릭(예를 들어, 아넥신-V의 존재에 의해 정의된 모든 죽은 세포(dying cell)의 평균 면적 및 편심)의 계산을 허용할 수 있다.

다른 실시예에서, 블록(310)에서, 프로세서(202)가 적어도 하나의 위상차 이미지(400)에 기초하여 이진 이미지의 형태로 컨플루언스 마스크(410)를 생성하는 것은 프로세서(202)가 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포에 속하는 픽셀의 식별을 가능하게 하기 위해 로컬 텍스처 필터 또는 밝기 필터 중 하나 이상을 적용하는 것을 포함한다. 예시적인 필터들은 로컬 범위 필터들, 로컬 엔트로피 필터들, 로컬 표준 편차 필터들, 로컬 밝기 필터들 및 가버 웨이블릿 필터(Gabor wavelet filter)들을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 컨플루언스 마스크(410)가 도 4 및 도 5에 도시되어 있다.

다른 옵션의 실시예에서, 광학 현미경(105)은 생물학적 시료(110)의 초점면을 결정한다. 또한, 다양한 실시예에서, 디포커싱 거리는 20 ㎛ 내지 60 ㎛의 범위일 수 있다. 최적의 디포커싱 거리는 대물렌즈의 배율 및 작동 거리를 포함하여, 사용되는 대물렌즈의 광학 특성에 기초하여 결정된다.

도 3에 도시된 추가 실시예에서, 블록(320)에서, 프로세서(202)가 제1 명시야 이미지(415) 및 제2 명시야 이미지(420)에 기초하여 세포 이미지(425)를 생성하는 것은 프로세서(202)가 복수의 픽셀 단위 수학적 연산 또는 피처 검출 중 적어도 하나를 이용하여 초점면 주위에 중심을 둔 제3 명시야 이미지(405)에 기초하여 제1 명시야 이미지(415) 및 제2 명시야 이미지(420)를 증강(enhance)시키는 것을 포함한다. 픽셀 단위(pixel-wise) 수학적 연산의 일 예는 덧셈, 뺄셈, 곱셈, 나눗셈 또는 이들 연산의 임의의 조합을 포함한다. 그런 다음, 프로세서(202)는 변환 파라미터를 계산하여 제1 명시야 이미지(415) 및 제2 명시야 이미지(420)를 적어도 하나의 위상차 이미지(400)와 정렬한다. 다음으로, 프로세서(202)는 정렬된 제1 명시야 이미지(415)에서 대응하는 픽셀들의 밝기 레벨에 의해 정렬된 제2 명시야 이미지(420)의 각 픽셀에 대한 밝기 레벨들을 조합하여 세포 이미지(425)를 형성한다. 각각의 픽셀에 대한 밝기 레벨들의 조합은 전술한 수학적 연산들 중 임의의 것을 통해 달성될 수 있다. 세포 이미지(425)를 생성하는 기술적 효과는 명시야 아티팩트(artefact)들(예를 들어, 음영(shadow)들)을 제거하고 이미지 콘트라스트를 증강시켜 시드 마스크(430)에 대한 세포 검출을 증가시키는 것이다.

다른 옵션의 실시예에서, 블록(320)에서, 프로세서(202)가 제1 명시야 이미지(415) 및 제2 명시야 이미지(420)에 기초하여 생물학적 시료(110)의 하나 이상의 세포의 세포 이미지(425)를 생성하는 것은 프로세서(202)가 하나 이상의 임계 레벨 및 하나 이상의 필터 크기를 결정하는 하나 이상의 사용자 정의 파라미터를 수신하는 것을 포함한다. 그런 다음, 프로세서(202)는 하나 이상의 사용자 정의 파라미터들에 기초하여 세포 이미지(425)에 하나 이상의 평활화 필터(smoothing filter)들을 적용한다. 평활화 필터들의 기술적 효과는 시드 마스크(430)에서의 세포 검출의 정확도를 더 증가시키고, 세포 당 하나의 시드가 할당될 가능성을 증가시키는 것이다. 평활화 필터 파라미터들은 상이한 부착성 세포 모폴로지, 예를 들어, 편평 대 둥근 형상(flat versus rounded shape), 돌출 세포(protrusive cell), 클러스터형 세포(clustered cell) 등에 적응하도록 선택된다.

추가적인 옵션의 실시예에서, 블록(325)에서, 프로세서(202)가 세포 이미지(425) 및 적어도 하나의 위상차 이미지(400)에 기초하여 시드 마스크(430)를 생성하는 것은 프로세서(202)가 임계 픽셀 세기 이상의 각각의 픽셀이 세포 시드 픽셀로서 식별되도록 세포 이미지(425)를 수정하는 것을 포함하고, 이에 의해 시드 마스크(430)가 이진 픽셀화를 갖게 한다. 시드 마스크의 이진 픽셀화의 기술적 효과는 컨플루언스 마스크의 상응하는 이진 픽셀화와의 비교를 가능하게 하는 것이다. 시드 마스크의 이진 픽셀화는 또한 아래에 논의되는 영역 성장 반복을 위한 시작점으로서 활용된다. 예를 들어, 또 다른 옵션의 실시예에서, 시드 마스크(430)는 생물학적 시료(110) 내의 단일 세포에 각각 대응하는 복수의 시드를 가질 수 있다. 이 실시예에서, 방법(300)은 프로세서(202)가 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료 내의 하나 이상의 세포의 이미지를 생성하기 전에, 프로세서(202)가 시드 마스크(430)와 컨플루언스 마스크(410)를 비교하고, 컨플루언스 마스크(410)의 영역에 배열되지 않은 시드 마스크(430)로부터 하나 이상의 영역을 제거하고, 시드 마스크(430)의 복수의 시드 중 하나를 함유하지 않는 컨플루언스 마스크(410)로부터 하나 이상의 영역을 제거하는 단계를 더 포함한다. 이러한 제거된 영역의 기술적 효과는 시드를 생성하는 작은 밝은 물체(예를 들어, 세포 파편(cell debris))를 배제하고, 후술되는 영역 성장 반복에서 이용되는 시드의 식별을 증가시키는 것이다.

추가적인 옵션의 실시예에서, 블록(330)에서, 프로세서(202)가 시드 마스크(430) 및 컨플루언스 마스크(410)에 기초하여 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 이미지를 생성하는 것은 프로세서(202)가 활성 시드 세트 각각에 대한 영역 성장 반복을 수행하는 것을 포함한다. 그런 다음, 프로세서(202)는 주어진 시드에 대한 성장 영역이 컨플루언스 마스크(410)의 하나 이상의 경계에 도달하거나 다른 시드의 성장 영역과 중첩될 때까지 시드들의 활성 세트 내의 각각의 시드에 대해 영역 성장 반복(region-growing iteration)을 반복한다. 시드의 활성 세트는 세포 이미지 내의 대응하는 픽셀들의 값들의 속성들에 기초하여 각각의 반복에 대해 프로세서(202)에 의해 선택된다. 또한, 명시야 이미지들(415, 420, 405)뿐만 아니라 적어도 하나의 위상차 이미지(400)를 사용하는 기술적 효과는, 시드들이 세포 이미지(425)에서의 밝은 스팟(spot)과 위상차 이미지(400)에서의 높은 텍스처(texture)의 영역들 모두에 대응한다는 것이다(즉, 아래에 더 상세히 설명되는 컨플루언스 마스크(410)와 시드 마스크(430)의 중첩). 컨플루언스 마스크(410), 적어도 하나의 위상차 이미지, 및 명시야 이미지들(415, 420, 405)을 사용하는 것으로부터 초래되는 다른 기술적 효과는, 일 예로서, 세포 표면 단백질 발현과 같은 피처들을 정량화하는 것을 유리하게 허용하는, 세포별 분할 마스크(435)에서의 개별 세포 위치들 및 세포 경계들의 식별에서의 정확도가 증가된다.

또 다른 옵션의 실시예에서, 방법(300)은 프로세서(202)가 하나 이상의 세포 텍스처 메트릭들 및 세포 형상 디스크립터들에 기초하여 객체들을 제거하기 위해 사용자 입력에 응답하여 하나 이상의 필터들을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 다음, 프로세서(202)는 하나 이상의 필터의 적용에 응답하여 세포별 분할 마스크를 나타내는 생물학적 시료의 이미지를 수정한다. 예시적인 세포 텍스처 메트릭들 및 세포 형상 디스크립터들은 세포의 크기, 둘레, 편심, 형광 세기, 종횡비, 중실도(solidity), Feret의 직경, 위상차 엔트로피 및 위상차 표준편차를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

추가의 옵션의 실시예에서, 방법(300)은 프로세서(202)가 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 이미지에 기초하여 생물학적 시료(110)에 대한 세포 카운트를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 전술한 세포 카운트(cell count)는 예를 들어, 도 4에 도시된 세포별 분할 마스크(cell-by-cell segmentation mask)(435)에 도시된 정의된 세포 경계의 결과로서 유리하게 허용된다. 하나의 옵션의 실시예에서, 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포는 하나 이상의 부착성 세포(adherent cell) 및 비-부착성 세포(non-adherent cell)이다. 추가의 실시예에서, 부착성 세포는 인간 폐 암종 세포, 섬유암종 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 또는 인간 제대 정맥 세포(umbilical vein cell)를 포함하는 인간 미세혈관 세포주(cell line)를 포함하는 다양한 암 세포주 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 옵션의 실시예에서, 프로세서(202)는 세포 경계의 근사화를 향상시키기 위해 상이한 평활화 필터가 부착성 세포에 적용되는 것보다 PMBC 및 Jurkat 세포와 같은 인간 면역 세포를 포함하는 비-부착성 세포에 적용되는 방식으로 영역 성장 반복(region-growing iteration)을 수행한다.

일 예로서, 프로세서(202)에 의한 실행 시에, 프로세서(202)가 생물학적 시료(110)에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 적어도 하나의 명시야 이미지(405)에 기초하여 하나 이상의 세포를 포함하는 생물학적 시료(110)의 적어도 하나의 위상차 이미지(phase contrast image)(400)를 생성하는 것을 포함하는 동작들의 세트의 수행을 야기하는 프로그램 명령어들이 저장된 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다. 그런 다음, 프로세서(202)는 적어도 하나의 위상차 이미지(400)에 기초하여 이진 이미지의 형태로 컨플루언스 마스크(confluence mask)(410)를 생성한다. 다음으로, 프로세서(202)는 초점면 위의 디포커싱 거리(defocusing distance)에서 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 제1 명시야 이미지(415) 및 초점면 아래의 디포커싱 거리에서 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 제2 명시야 이미지(420)를 수신한다. 이어서, 프로세서(202)는 그런 다음 제1 명시야 이미지(415) 및 제2 명시야 이미지(420)에 기초하여 하나 이상의 세포의 세포 이미지(425)를 생성한다. 프로세서(202)는 또한 세포 이미지(425) 및 적어도 하나의 위상차 이미지(400)에 기초하여 시드 마스크(seed mask)(430)를 생성한다. 그리고, 프로세서(202)는 시드 마스크(430) 및 컨플루언스 마스크(410)에 기초하여 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료(100) 내의 하나 이상의 세포의 이미지를 생성한다.

하나의 옵션의 실시예에서, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 프로세서(202)가 적어도 하나의 형광 이미지를 수신하는 것 및 프로세서(202)가 세포별 분할 마스크 내의 생물학적 시료 내의 하나 이상의 세포의 형광 세기를 계산하는 것을 더 포함한다.

다른 옵션의 실시예에서, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 프로세서(202)가 세포 이미지(425) 및 적어도 하나의 위상차 이미지(400)에 기초하여 시드 마스크(430)를 생성하는 것을 더 포함한다. 그리고, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 프로세서(202)가 임계 픽셀 세기 또는 그 이상의 각각의 픽셀이 세포 시드 픽셀로서 식별되도록 세포 이미지(410)를 수정하는 것을 더 포함하고, 이에 의해 시드 마스크(430)가 이진 픽셀화를 갖게 한다.

추가적인 옵션의 실시예에서, 시드 마스크(430)는 각각 단일 세포에 대응하는 복수의 시드를 갖는다. 그리고, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 프로세서(202)가 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 이미지를 생성하기 전에, 프로세서(202)는 시드 마스크(430)와 컨플루언스 마스크(410)를 비교하고, 컨플루언스 마스크(410)의 영역에 배열되지 않은 시드 마스크(430)로부터 하나 이상의 영역을 제거하고, 시드 마스크(430)의 복수의 시드 중 하나를 포함하지 않는 컨플루언스 마스크(410)로부터 하나 이상의 영역을 제거하는 것을 더 포함한다.

또 다른 옵션의 실시예에서, 프로세서(202)가 시드 마스크(430) 및 컨플루언스 마스크(410)에 기초하여 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료(110) 내의 하나 이상의 세포의 이미지를 생성하게 하는 프로그램 명령어는 프로세서(202)가 활성 시드 세트 각각에 대한 영역 성장 반복을 수행하는 것을 포함한다. 그런 다음, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는, 주어진 시드에 대한 성장 영역이 컨플루언스 마스크(410)의 하나 이상의 경계에 도달하거나 다른 시드의 성장 영역과 중첩될 때까지, 프로세서(202)가 시드들의 활성 세트 내의 각각의 시드에 대한 영역 성장 반복을 반복하는 것을 더 포함한다.

비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 프로세서 (202)가 하나 이상의 세포 텍스처 메트릭(cell texture metric)들 및 세포 형상 디스크립터(cell shape descriptor)들에 기초하여 객체들을 제거하기 위해 사용자 입력에 응답하여 하나 이상의 필터들을 적용하는 것을 더 포함한다. 그리고 프로세서(202)는 하나 이상의 필터의 적용에 응답하여 세포별 분할 마스크(435)를 나타내는 생물학적 시료(110)의 이미지를 수정한다.

이제 도 8을 참조하면, 세포들의 분류를 위한 예시적인 방법(800)이 도 1 내지 도 2의 컴퓨팅 디바이스를 사용하여 예시된다. 방법(800)은, 블록(805)에서, 프로세서 (예를 들어, 프로세서(202))가 복수의 생물학적 샘플들의 이미지들의 세트를 획득하는 단계를 포함하고, 이미지들의 세트는 복수의 생물학적 샘플들의 각각의 샘플의 적어도 하나의 이미지를 포함한다. 그런 다음, 블록(810)에서, 프로세서는 복수의 생물학적 샘플들 내의 제1 세트의 세포들의 표시를 획득하고, 복수의 생물학적 샘플들 내의 제2 세트의 세포들의 표시를 획득하며, 여기서 제1 세트의 세포들은 제1 조건과 연관되고, 제2 세트의 세포들은 제2 조건과 연관된다. 다음으로, 블록(815)에서, 프로세서는, 이미지들의 세트, 제1 세트의 세포들의 표시, 및 제2 세트의 세포들의 표시에 기초하여, 제1 복수의 메트릭들의 세트들을 결정하며, 여기서 제1 복수의 메트릭들의 세트들은 제1 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트 및 제2 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 포함한다. 블록(820)에서, 프로세서는 지도 학습 알고리즘(supervised learning algorithm)을 사용하여, 제1 복수의 메트릭들의 세트에 기초하여, 제1 세트의 세포들 내의 세포들과 제2 세트의 세포들 내의 세포들 간을 구별하기 위한 모델을 생성함으로써 트레이닝된 모델을 생성한다. 블록(825)에서, 프로세서는 이미지들의 세트에 기초하여, 제2 복수의 메트릭들의 세트를 결정하고, 여기서 제2 복수의 메트릭들의 세트는 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 포함한다. 그런 다음, 블록(830)에서, 프로세서는 타겟 샘플 내의 세포를 분류하고, 여기서 세포를 분류하는 것은 트레이닝된 모델을 세포에 대한 메트릭들의 세트에 적용하는 것을 포함한다. 방법(800)은 추가적인 단계들 또는 특징부들을 포함할 수 있다.

이제 도 9를 참조하면, 세포들의 분류를 위한 다른 예시적인 방법(900)이 도 1 내지 도 2의 컴퓨팅 디바이스를 사용하여 예시된다. 방법(900)은, 블록(905)에서, 프로세서(예를 들어, 프로세서(202))가 타겟 샘플의 3개 이상의 이미지를 획득하는 단계를 포함하고, 타겟 샘플은 타겟 샘플에 대한 초점면(focal plane) 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하고, 3개 이상의 이미지는 위상차 이미지, 제1 명시야 이미지 및 제2 명시야 이미지를 포함하고, 제1 명시야 이미지는 초점면 위의 제1 디포커싱 거리에 포커싱(focused)된 타겟 샘플의 이미지를 나타내고, 제2 명시야 이미지는 초점면 아래의 제2 디포커싱 거리에 포커싱된 타겟 샘플의 이미지를 나타낸다. 그런 다음, 블록(910)에서, 프로세서는 제1 및 제2 명시야 이미지에 기초하여 타겟 샘플의 세포 이미지를 결정한다. 다음으로, 블록(915)에서, 프로세서는 세포 이미지 및 위상차 이미지에 기초하여 타겟 샘플에 대한 타겟 분할 맵(target segmentation map)을 결정한다. 블록(920)에서, 프로세서는, 타겟 샘플의 2개 이상의 이미지들 및 타겟 분할 맵에 기초하여, 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정한다. 그런 다음, 블록(925)에서, 프로세서는 타겟 샘플 내의 세포를 분류하고, 여기서 세포를 분류하는 것은 트레이닝된 분류기에 세포의 메트릭들의 세트를 적용하는 것을 포함한다. 방법(900)은 추가적인 단계들 또는 특징부들을 포함할 수 있다.

이제 도 10을 참조하면, 세포들의 분류를 위한 다른 예시적인 방법(1000)이 도 1 내지 도 2의 컴퓨팅 디바이스를 사용하여 예시된다. 방법(1000)은, 블록(1005)에서, 프로세서(예를 들어, 프로세서(202))가 타겟 샘플의 2개 이상의 이미지를 획득하는 단계를 포함하고, 여기서 타겟 샘플은 타겟 샘플에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하고, 2개 이상의 이미지는 위상차 이미지 및 하나 이상의 명시야 이미지를 포함하고, 하나 이상의 명시야 이미지는 초점면에서 포커싱되지 않은 타겟 샘플의 이미지를 나타내는 적어도 하나의 명시야 이미지를 포함한다. 그 후, 블록(1010)에서, 프로세서는, 둘 이상의 이미지들에 기초하여, 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정한다. 다음으로, 블록(1015)에서, 프로세서는 트레이닝된 모델을 세포에 대한 메트릭들의 세트에 적용함으로써 타겟 샘플 내의 세포를 분류한다. 방법(1000)은 추가적인 단계들 또는 특징부들을 포함할 수 있다.

상기에서 논의된 바와 같이, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 프로세서(202)에 의한 실행 시에, 전술한 방법들의 기능들 중 임의의 기능의 수행을 야기하기 위해 이용될 수 있는 프로그램 명령어들을 저장한다.

IV. 실험 결과

예시적인 구현예들은 세포 건강이 시간 경과에 따라 서브 개체군들에서 추적될 수 있게 한다. 예를 들어, 도 6a는 캄프토테신(CPT, 세포독성) 처리 후 HT1080 섬유육종 세포사멸 시간 경과 후 24시간에 위상차 이미지 반응에 대해 예시적인 구현에 따라 생성된 세포별 분할 마스크의 실험 결과를 도시한다. 세포 건강(cell health)은 Incucyte® NucLight 적색 (핵 생존력 마커) 및 비-섭동성(non-perturbing) Incucyte® Caspase 3/7 녹색 시약 (세포사멸 지표)의 다중화된 판독으로 결정하였다. 도 6b는 Incucyte® 세포별 분석 소프트웨어 툴(Cell-by-Cell Analysis Software tool)을 사용하여 도 6a의 구현예에 따라 적색과 녹색 형광에 기초하여 분류된 세포 서브셋을 도시한다. 도 6c는 도 6a의 구현예에 따라, 생존 세포의 손실을 나타내는 CPT 처리 후 적색 개체군의 감소, 초기 세포사멸을 나타내는 적색 및 녹색 형광의 증가, 뿐만 아니라 후기 세포사멸을 나타내는 24시간 후 녹색 형광의 증가가 있었음을 도시한다. 도 6d는 도 6a의 구현예에 따른 초기 세포사멸 개체군의 농도 반응 시간 경과(적색 및 녹색 형광을 나타내는 전체 세포의 백분율)을 도시한다. 도시된 값은 3개의 웰(well)의 평균 ± SEM이다.

다른 예에서, 도 6e는 시클로헥사미드(CHX, cytostatic) 처리 후 HT1080 섬유육종 세포사멸의 시간 경과 후 24시간에 세포 이미지 반응에 대해, 예시적인 구현예에 따라 생성된 세포별 분할 마스크의 실험 결과를 도시한다. 세포 건강은 Incucyte® NucLight 적색 (핵 생존력 마커) 및 비-섭동성 Incucyte® Caspase 3/7 녹색 시약 (세포사멸 지표)의 다중화된 판독으로 결정되었다. 도 6f는 Incucyte® 세포별 분석 소프트웨어 툴을 사용하여 도 6e의 구현예에 따라 적색과 녹색 형광을 기준으로 분류한 세포 서브세트를 도시한다. 도 6g는 도 6e의 구현예에 따라, 세포사멸은 없지만 CHX 처리 후 세포 카운트의 감소를 도시한다(데이터 미도시). 도 6h는 도 6e의 구현예에 따른 초기 세포사멸 개체군의 농도 반응 시간 경과(적색 및 녹색 형광을 나타내는 전체 세포의 백분율)을 도시한다. 나타낸 값은 3개의 웰의 평균 ± SEM이다.

도 7a는 Incucyte® 소프트웨어를 통한 예시적인 구현예에 따라 생성된, 세포별 분할 분석을 사용하여 부착성 세포의 라벨-프리(label-free) 세포 카운팅을 위해 위상차 이미지 위에 부과된 세포별 분할 마스크를 도시한다. NucLight 적색 시약으로 라벨링된 A549 세포의 다양한 밀도는 시간에 따른 라벨-프리 카운팅을 검증하기 위해 라벨-프리 세포별 분석 및 적색 핵 카운트 분석 둘 모두로 분석되었다. 도 7b는 도 7a에 따른 세포별 분할 마스크를 백그라운드 내에 위상차 이미지 없이 도시한다. 도 7c는 도 7a의 구현예에 따른, 밀도들에 걸친 위상 카운트 및 적색 카운트 데이터의 시간 경과를 도시한다. 도 7d는 48시간에 걸친 카운트 데이터의 상관 관계를 도시하고 도 7a의 구현예에 따라 기울기가 1이고 1의 R2 값을 실증한다. 이는 다양한 세포 유형에 걸쳐 반복되었다. 도시된 값은 4개의 웰의 평균 ± SEM이다.

V. 셀 분류 예

세포를 함유하는 샘플의 이미지에 기초한 세포의 알고리즘 분류는 다양한 애플리케이션을 가능하게 할 수 있다. 이는 세포 및/또는 세포 샘플의 속성을 정량화하는 것, 적용된 실험 조건(예를 들어, 추정 약물 또는 처리의 독성 또는 유효성)에 대한 세포 샘플의 반응을 정량화하는 것, 또는 샘플에 대한 일부 다른 정보를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 세포의 분류는 샘플 내 각 클래스의 세포의 수가 결정되도록 함으로써 이러한 애플리케이션을 가능하게 한다. 이러한 분류는 2개의 클래스 분류 또는 2개 초과의 클래스로의 분류를 포함할 수 있다. 분류의 일부 예에서, 세포는 생존 또는 사멸, 줄기 세포 또는 성숙 세포, 미분화 세포 또는 분화 세포, 야생형 세포 또는 돌연변이 세포, 상피 또는 중간엽(mesenchymal), 적용된 화합물에 의해 정상 또는 형태학적으로 변경된(예를 들어, 세포골격-표적화(targeting) 치료 화합물의 적용에 의해 변경된) 것, 또는 둘 이상의 추가 또는 대체 분류로 분류될 수 있다. 세포들은 또한, 각각의 다수의 상이한 열거된 클래스들의 세트들로부터 선택되는 다수의 클래스들가 할당될 수 있다. 예를 들어, 세포는 살아있음(alive)으로 (살아있음(alive) 및 '죽음(dead)'의 가능한 클래스들로부터) 그리고 분화된것으로 (분화된(differentiated) 및 '미분화(undifferentiated)'의 가능한 클래스들로부터) 분류될 수 있다.

본 명세서에 설명된 실시예들은 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정함으로써 특정 세포의 분류를 달성한다. 메트릭들의 세트는 세포의 하나 이상의 현미경 이미지들로부터 결정된다. 이러한 메트릭들을 결정하는 데 있어서 특정 유용한 것들은, 세포의 하나 이상의 디포커싱(defocused)된 명시야 이미지들, 또는 그로부터 그리고/또는 세포의 위상차 이미지들과 조합하여 결정된 합성 이미지들이다. 예를 들어, 세포에 대한 하나 이상의 메트릭들은 세포의 위상차 이미지 및 세포의 (전술한 바와 같이 결정된) 세포 이미지 각각으로부터 결정될 수 있다. 메트릭들의 세트의 결정은 일반적으로 이미지(들)의 어떤 부분이 세포에 대응하는지를 결정하기 위해 이미지(들)를 분할(segment)하는 것을 포함한다. 분할 자체는 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 이미지들 중 하나 이상에 기초하여 결정된다. 또한, 분할은 메트릭들 중 하나 이상(예를 들어, 세포의 크기, 세포의 형상과 관련된 하나 이상의 메트릭들 등)을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음 메트릭 세트가 세포를 분류하기 위해 모델에 적용된다.

도 11은 예시적인 세포(1110)를 포함하는 다수의 세포를 포함하는 생물학적 샘플의 위상차 이미지(1100) 위에 부가된 예시적인 세포별 분할 마스크(밝은 라인)를 도시한다. 세포별 분할 마스크는 세포(1110)에 대응하는 위상차 이미지(1100)의 부분의 윤곽을 그리고(delineate); 이것은 예시적인 세포(1110)에 대응하는 세포별 분할 마스크의 부분을 나타내는 어두운 라인(1150)에 의해 표시된다. 어두운 라인(1150) 내의 위상차 이미지(1100)의 부분은 예시적인 세포(1110)의 윤곽을 그리는 세포별 분할 마스크의 부분(1150)(예를 들어, 크기 관련 메트릭(들), 형상 관련 메트릭(들))과 같이, 예시적인 세포(1110)에 대한 하나 이상의 메트릭(예를 들어, 텍스처 관련 메트릭(들), 세기 관련 메트릭(들))을 결정하는 데 사용될 수 있다.

생물학적 샘플 내의 세포를 국소화하기 위한 생물학적 샘플의 하나 이상의 현미경 이미지의 분할은 전술한 방법 중 하나 이상을 사용하여 달성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 샘플의 하나 이상의 현미경 이미지는 이러한 분할 맵을 생성하도록 트레이닝된 컨볼루션 신경망(convolutional neural network)에 적용될 수 있다. 이는 샘플의 위상차 이미지 및 세포 이미지를 적용하는 것을 포함할 수 있다.

분할 맵은 세포에 대한 크기 메트릭을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이는 세포의 면적, 세포에 의해 점유되는 이미지의 픽셀들의 수, 픽셀들의 퍼센트 및/또는 세포에 의해 점유되는 이미지의 면적, 세포의 주변부의 길이, 세포의 최대 페렛(Feret) 직경, 또는 세포의 크기와 관련된 일부 다른 메트릭을 결정하기 위해 분할 맵을 사용하는 것을 포함할 수 있다.

분할 맵은 또한 세포에 대한 하나 이상의 형상 디스크립터 메트릭(shape descriptor metric)들을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 형상 디스크립터 메트릭들은 세포의 원형도(degree of circularity), 세포의 볼록 껍질(convex hull)의 진원도(degree of roundness), 또는 세포에 의해 점유되는 세포의 볼록 껍질의 비율, 세포의 종횡비(즉, 세포의 최대 길이 대 그것의 직교 축의 비율), 세포의 지리적 중심, 세포의 세기-가중된 중심 또는 이들 2개의 중심들 사이의 차이, 또는 세포 형상과 관련된 일부 다른 메트릭일 수 있다.

추가적인 메트릭들은, 세포의 하나 이상의 현미경 이미지들에 묘사된, 세포의 텍스처 및/또는 세기와 관련된 메트릭들을 포함할 수 있다. 세포의 이러한 현미경 이미지는 위상차 이미지, 명시야 이미지, 형광 이미지, 또는 세포의 다른 이미지를 포함할 수 있다. 이미지들은 합성 이미지들을 포함할 수 있다. 이러한 합성 이미지는 전술한 바와 같이, 생물학적 샘플의 세포 함량에 대해 각각의 상이한 평면에 포커싱된 2개 이상의 명시야 이미지로부터 생성된 세포 이미지를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 합성 이미지는 위상차 이미지와 하나 이상의 명시야 이미지들의 합성(예를 들어, 위상차 이미지와 세포 이미지의 합성)이다. 그러한 텍스처 또는 세기 기반 메트릭들을 결정하는 것은 분할 맵에 따라 특정 세포에 대응하는 이미지(들)의 픽셀들에 기초하여 메트릭을 결정하는 것을 포함할 수 있다.

텍스처 메트릭(texture metric)들은 세포를 표현하는 픽셀들의 세트에 걸친 변동 및/또는 텍스처로부터 결정될 수 있다. 이는 이웃 베이시스(basis) 기반으로 하나 이상의 메트릭들을 계산하는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 주어진 픽셀에 대해, 텍스처 값은 지정된 거리 내에서 주어진 픽셀을 둘러싸는 픽셀들의 세트에 기초하여 결정될 수 있다. 그런 다음, 그러한 이웃 텍스처 값들은 세포에 대한 전체 텍스처 값을 생성하기 위해 세포에 대한 픽셀들에 걸쳐 평균화될 수 있다. 이러한 텍스처 값들은 픽셀들의 세트 내의 최대 및 최소 세기 값들 사이의 차이인 범위 값, 분산 또는 표준 편차, 엔트로피, 픽셀들의 세트에 존재하는 로컬 변동들의 측정치인 콘트라스트 값, 픽셀들의 세트에서의 균일도의 측정치인 균질성(homogeneity) 값, 및/또는 일부 텍스처-기반 측정치(들)을 포함할 수 있다.

세기 기반 메트릭들은 이미지에서 세포의 평균 밝기, 이미지에서 세포의 밝기의 표준 편차, 이미지에서 세포의 밝기의 최소값, 이미지에서 세포의 밝기의 최소값, 이미지에서 세포의 밝기의 최대값, 이미지에서 셀 픽셀의 지정된 백분위수(percentile) 밝기, 이미지에서 셀 전체의 밝기 값 분포에 대한 첨도(kurtosis) 또는 왜도 측정치, 또는 하나 이상의 이미지에서 세포의 세기 또는 그 변동을 기반으로 하는 일부 다른 메트릭을 포함할 수 있다.

일단 메트릭들의 세트가 특정 세포에 대해 결정되면, 메트릭들의 세트는 세포를 분류하는데 사용될 수 있다. 이것은 메트릭들의 세트를 트레이닝된 모델에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 모델은 주요 성분 분석, 독립 성분 분석, 지원 벡터 머신(vector machine), 인공 신경망, 룩업 테이블, 회귀 트리, 회귀 트리의 앙상블, 결정 트리, 결정 트리의 앙상블, k-최근접 이웃 분석, 베이지안 추론(Bayesian inference), 또는 로지스틱 회귀(logistic regression) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

모델의 출력은 메트릭들의 세트가 모델에 적용된 세포의 결정된 클래스의 간단한 표시일 수 있다. 대안적으로, 모델은 세포의 클래스를 표시하는 하나 이상의 값을 출력할 수 있다. 그런 다음 이러한 값은 세포를 분류하기 위해 임계치와 비교될 수 있다. 예를 들어, 모델 출력 값이 임계치보다 크면 세포는 '살아있음(alive)'으로 분류될 수 있는 반면, 모델 출력 값이 임계치보다 작으면 세포는 '죽음(dead)'으로 분류될 수 있다. 이러한 임계치의 값은 예를 들어, 트레이닝 데이터에 기초하여 모델을 트레이닝시키는 프로세스의 일부로서 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 임계치는 사용자에 의해 설정될 수 있다. 예를 들어, 사용자는 하나 이상의 현미경 이미지 내에서 이미지(들) 내의 세포의 분류를 나타내는 시각적 피드백에 기초하여 임계치를 조정할 수 있다. 사용자는 알고리즘 프로세스를 통해 초기 임계치가 생성된 후에 임계치를 조정할 수 있다.

도 12a 및 12b는 사용자가 임계치를 조정하고 생물학적 샘플 내의 세포의 분류에 대한 조정의 영향에 관한 시각적 피드백을 수신하는 실질적으로 실시간 또는 달리 반복적인 프로세스의 예를 도시한다. 도 12a는 제1 시간 기간 동안의 예시적인 사용자 인터페이스의 요소들을 도시한다. 예시적인 사용자 인터페이스는 생물학적 샘플의 제1 주석이 달린 이미지(1200a)(예를 들어, 주석이 달린 위상차 이미지)를 포함한다. 제1 주석이 달린 이미지(1200a)는 샘플 내의 세포들을 표시하고 제1 값의 임계치에 따른 세포들의 분류를 표시하기 위해 주석이 달린다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 제1 클래스의 세포는 적색으로 표시되고, 제2 클래스의 세포는 청색으로 표시된다.

그런 다음, 임계치는 사용자 입력에 의해 제2 값으로 업데이트될 수 있다. 이러한 입력은 사용자가 임계치의 값을 증가 또는 감소시키기 위해 실제 또는 가상 버튼을 누르는 것, 사용자가 임계치에 대한 값을 입력하기 위해 키패드 또는 다른 수단을 동작시키는 것, 사용자가 임계치에 대한 값을 조정하기 위해 슬라이더 또는 다이얼을 이동시키는 것, 또는 사용자가 임계치를 제2 값으로 조정하기 위해 일부 다른 사용자 입력 동작에 관여하는 것을 포함할 수 있다. 그런 다음, 제2 값의 임계치를 적용하여 샘플 중의 세포를 재분류한다. 이러한 재분류는 그런 다음 도 12b에 도시된 바와 같이 생물학적 샘플의 업데이트된 제2 주석이 달린 이미지(1200b)의 형태로 사용자에게 시각적으로 제공된다. 제2 주석이 달린 이미지(1200b)는 샘플 내의 세포를 표시하고, 업데이트된 제2 값의 임계치에 따라 세포의 분류를 표시하기 위해 주석이 달린다. 임계치의 조정에 따라 일부 세포의 분류가 변경되었고, 따라서 제2 주석이 달린 이미지(1200b)는 이 변화를 반영한다. 이러한 업데이트 과정은 복수 회 수행될 수 있다. 예를 들어, 업데이트 프로세스는 사용자가 임계치를 조정한 결과로서 세포 분류의 실시간 업데이트를 근사화하기 위해 20 밀리초당 한 번의 속도로 또는 일부 다른 속도로 수행될 수 있다.

세포를 분류하는데 사용되는 모델은 지도 트레이닝 방법 및 적절한 트레이닝 데이터세트를 사용하여 트레이닝될 수 있다. 트레이닝 데이터세트는 트레이닝 세포들의 둘 이상의 그룹들에서 각각의 세포에 대해 결정된 메트릭들의 세트를 포함한다. 트레이닝 세포들의 그룹들 각각은 모델이 구별하도록 트레이닝될 수 있는 각각의 클래스 또는 클래스들의 세트에 대응한다. 트레이닝 데이터세트 내의 메트릭들의 세트들은 특정 트레이닝 세포의 하나 이상의 현미경 이미지들에 기초하여 특정 그룹 내의 특정 트레이닝 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정함으로써, 전술한 바와 같이 결정될 수 있다.

일부 예에서, 트레이닝 세포는 트레이닝 세포에 기초하여 분류될 타겟 세포를 함유하는 동일한 멀티 웰 샘플 플레이트의 웰 내에 배치될 수 있다. 이는 다수의 개별 세포에 대한 수동 주석(manual annotation)을 필요로 하지 않고, 타겟 세포와 동일하거나 유사한 환경 또는 다른 조건에 노출된 트레이닝 세포에 대해 모델을 트레이닝시키는 이점을 갖는다. 대안적으로, 트레이닝 세포는 제1 멀티 웰 샘플 플레이트의 웰에 배치될 수 있고, 타겟 세포는 제2의 상이한 멀티 웰 샘플 플레이트의 웰(들)에 배치될 수 있다. 그러한 제1 및 제2 멀티 웰 샘플 플레이트는 동일한 인큐베이터에서 배양되거나 그렇지 않으면 동일하거나 유사한 환경 조건에 노출될 수 있다.

모델을 트레이닝하기 위해 사용되는 다양한 이미지(들) 및/또는 메트릭들은 알려지지 않은 세포들을 분류하기 위해 트레이닝된 모델에 적용되는 다양한 이미지(들) 및/또는 메트릭들과 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 형광 마커는 트레이닝 세포를 함유하는 생물학적 샘플(들)에 존재할 수 있지만, 분류될 알려지지 않은 타겟 세포를 함유하는 샘플에는 존재하지 않을 수 있다. 이는 형광 마커를 타겟 샘플에 첨가하는 복잡성 또는 혼란 성질을 피하면서 모델의 개선된 트레이닝을 허용할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 형광 마커는 모델을 트레이닝시키기 전에 트레이닝 세포들을 개개의 그룹들에 할당하는데 사용될 수 있다.

트레이닝 세포들의 2개(또는 그 이상)의 그룹들 내의 트레이닝 세포들은 다양한 방식들로 식별될 수 있다. 일부 예들에서, 트레이닝 세포들의 그룹들은 사용자에 의해 수동으로 식별될 수 있다. 이것은 사용자가 2개 이상의 그룹 각각에 대한 개별 세포들을 수동으로 표시하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 표시는 이미지가 이미 분할되었거나 분할되지 않은, 생물학적 샘플 내의 세포의 이미지를 묘사하는 사용자 인터페이스를 사용하여 수행될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 사용자는 트레이닝을 위한 개개의 클래스에 대응하는 것으로서 멀티 웰 샘플 플레이트의 전체 웰을 수동으로 표시할 수 있다. 이러한 방식으로 표시된 웰에서 검출된 임의의 세포는 모델을 트레이닝시키기 위해 대응하는 클래스에 할당될 것이다. 사용자는 웰들의 조건들에 대한 지식에 기초하여 그러한 웰들을 표시할 수 있다. 예를 들어, 특정 웰은 세포 죽음을 유도하는 물질을 포함할 수 있고, 사용자는 모델을 트레이닝하기 위한 '죽음(dead)' 클래스에 속하는 세포를 함유하는 그러한 웰을 나타낼 수 있다. 이러한 웰별 (well-by-well) 방식으로 트레이닝 세포들의 그룹들을 표시하는 것은 (예를 들어, 트레이닝을 위한 개별 세포들을 표시하는 사용자에 비해) 비교적 적은 양의 사용자 시간 및 노력을 요구하는 이점을 갖는다.

도 13은 모델이 그런 다음 구별하도록 트레이닝될 수 있는 2개 이상의 클래스 중 하나에 대응하는 것으로서 멀티 웰 샘플 플레이트의 하나 이상의 웰을 나타내기 위해 사용자에 의해 사용될 수 있는 예시적인 사용자 인터페이스(1300)의 요소를 도시한다. 사용자 인터페이스(1300)는 멀티 웰 샘플 플레이트의 웰들의 상대적 위치들을 도시하며, 각각의 웰은 개개의 정사각형으로 표현된다. 각각의 웰에 대한 추가 정보가 제공될 수 있다. 이러한 추가 정보는 웰의 내용물에 대한 정보, 웰에 적용되는 조건, 웰의 내용물의 이미지, 또는 일부 다른 정보를 포함할 수 있다. 그런 다음, 사용자는 각각의 클래스들에 대응하는 웰들의 세트들을 표시할 수 있다. 도시된 바와 같이, 사용자는 제1 클래스(예를 들어, '살아있는' 클래스)에 대응하는 것으로서 제1 세트의 웰들(1310a) 및 제2 클래스(예를 들어, '죽은' 클래스)에 대응하는 것으로서 제2 세트의 웰들(1310b)을 표시하였다.

(예를 들어, 개별 세포를 표시함으로써, 멀티 웰 샘플 플레이트의 전체 웰을 표시함으로써, 자동화 또는 반자동화 방법과 협력하여 세포를 표시함으로써) 세포 세트의 표시는 하나 이상의 특정된 시점에서 세포를 표시하는 것을 포함할 수 있음에 유의한다. 예를 들어, 제1 세트의 세포들을 표시하는 것은 제1 시점에서 웰을 표시하는 것을 포함할 수 있고(예를 들어, 웰 내의 모든 또는 대부분의 세포들이 살아있는 경우, 살아있는 세포들의 세트를 표시하기 위해), 제2 세트의 세포들을 표시하는 것은 제2 시점에서 동일한 웰을 표시하는 것을 포함할 수 있다(예를 들어, 웰 내의 모든 또는 대부분의 세포들이 죽은 경우, 죽은 세포들의 세트를 표시하기 위해).

표시된 세포들의 세트들, 또는 그로부터 결정된 메트릭들의 세트들은 모델을 트레이닝하기 위해 결과적인 트레이닝 데이터를 사용하기 전에 필터링되거나 달리 수정될 수 있다. 이는 데이터를 피팅하기 위해 요구되는 시간 또는 반복 횟수를 감소시키기 위해, 트레이닝 데이터를 오버피팅(overfitting)하지 않고 더 정확한 모델을 생성하기 위해, 또는 그렇지 않으면 트레이닝된 모델 및/또는 모델을 트레이닝하는 프로세스를 개선하기 위해 행해질 수 있다. 이러한 필터링 또는 다른 전처리 단계들은 세포들의 트레이닝 세트들을 종합적으로 밸런싱하는 것(balancing), 세포들의 트레이닝 세트들을 서브샘플링하는 것, 및/또는 결정된 메트릭들의 값들을 정규화하는 것(예를 들어, 트레이닝 데이터 내의 모든 세포들에 걸쳐 메트릭의 값들의 모집단이 표준 범위를 점유하고 및/또는 지정된 분포에 적합하도록 각각의 결정된 메트릭을 정규화하는 것)을 포함할 수 있다.

추가적으로 또는 대안적으로, 트레이닝 세포들의 그룹들은 알고리즘에 의해 식별되거나 달리 자동으로 또는 반자동으로 식별될 수 있다. 이는 트레이닝 세포들의 그룹들을 식별하기 위해 형광 마커의 존재 또는 부재를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 이는 형광 마커를 함유하는 생물학적 샘플들의 형광 이미지들을 획득하는 것, 및 형광 이미지들에 기초하여, 세포들이 각각 임계 레벨보다 크거나 작은 평균 형광 세기를 갖는지 여부에 따라 샘플 내의 세포들의 제1 및 제2 그룹들을 식별하는 것을 포함할 수 있다.

다른 예에서, 비지도 트레이닝 프로세스(unsupervised training process)가 트레이닝 이미지에서 세포를 분류하는데 사용될 수 있다. 이것은 트레이닝 이미지들 내의 세포들의 2개 이상의 클러스터들을 식별하는 것을 포함할 수 있다. 그런 다음, 사용자는 제한된 수의 세포들을 2개 이상의 클래스들의 세트로부터 선택된 각각의 클래스들에 속하는 것으로 수동으로 분류할 수 있다. 이러한 수동으로 분류된 세포는 비지도 트레이닝 프로세스에 의해 이미 클러스터링된(clustered) 세포이거나 신규한 세포일 수 있다. 수동 분류는 그런 다음 세포들의 클러스터들을 2개 이상의 클래스들의 세트 내의 적절한 클래스들에 할당하는 데 사용될 수 있다. 수동 분류는 세포별 베이시스(cell-by-cell basis), 전체-웰 베이시스(whole-well basis), 또는 일부 다른 방식의 세포의 수동 분류일 수 있다.

상이한 유리한 배열들의 설명은 예시 및 설명의 목적들을 위해 제시되었고, 개시된 형태의 예들로 포괄적이거나 제한되도록 의도되지 않는다. 많은 수정예들 및 변형예들이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 상이한 유리한 예들은 다른 유리한 예들에 비해 상이한 이점들을 설명할 수 있다. 선택된 예 또는 예들은 예들의 원리들, 실제 적용을 가장 잘 설명하고, 당업자가 고려되는 특정 용도에 적합한 다양한 수정예들을 갖는 다양한 예들에 대한 개시를 이해할 수 있게 하기 위해 선택되고 설명된다.

VI. 실험 분류 결과

셀들의 분류는 세포들의 세포 이미지들(즉, 2개 이상의 디포커싱된 명시야 이미지들로부터 결정된 합성 이미지들)로부터 결정된 하나 이상의 메트릭들을 사용할 때 개선된다. 도 14a 및 14b는 캄프토테신(camptothecin)(세포 죽음을 유발할 수 있는 세포독성 화합물, "CMP") 또는 실험 대조군 화합물("VEH")로 처리된 다수의 샘플에 걸쳐 살아있는 또는 죽은 것으로서 세포의 분류의 정확도를 도시한다. 도 13a는 샘플들의 세포별 분할 마스크(예를 들어, 면적, 둘레) 및 샘플들의 위상차 이미지들(예를 들어, 위상차 평균 밝기)로부터 결정된 메트릭들의 세트에 기초한 분류를 도시한다. 도 13b는 상기 메트릭뿐만 아니라 샘플의 세포 이미지(예를 들어, 세포 이미지 평균 밝기)로부터 결정된 추가 메트릭에 기초한 분류를 도시한다. 도 14a와 14b에 표현된 모든 세포들에 걸친 전체 정확도는 0.82에서 0.94로 증가하였고, F1 통계는 0.89에서 0.96으로 증가하였다(살아있는 세포를 '양성(positive)' 클래스로 사용).

도 15a 및 15b는 시간의 함수로서 다수의 샘플에서 결정된 세포 치사율에 대한 살아있는 세포 또는 죽은 세포의 분류의 이러한 개선된 정확도의 효과를 도시한다. 도 15a는 샘플의 세포별 분할 마스크(예를 들어, 면적, 둘레) 및 샘플의 위상차 이미지(예를 들어, 위상차 평균 밝기)로부터 결정된 시간에 따른 결정된 세포 치사율의 샘플을 도시한다. 적색 트레이스는 트레이닝된 모델에 의해 결정된 레이트인 반면, 청색 트레이스는 실제 레이트이다. 도 15b는 샘플의 세포 이미지(예를 들어, 세포 이미지 평균 밝기)로부터 결정된 추가 메트릭 뿐만 아니라 상기의 메트릭을 사용하여 트레이닝된 모델로부터 결정된 시간에 따른 결정된 세포 치사율의 샘플을 도시한다.

본 명세서에 설명된 분류 방법은 형광단-기반 방법의 정확도에 근접한 정확도로 세포의 분류를 가능하게 한다. 이는 형광 라벨의 사용과 연관될 수 있는 비용, 복잡성, 또는 실험적 교란 영향 없이 정확한 분류를 허용한다. 실험에서, A549 세포는 아넥신(Annexin) V 시약의 존재하에서 72시간 동안 증가하는 농도의 세포독성 화합물 캄프토테신(0.1 - 10μΜ)으로 처리되었다. 세포를 형광 아넥신 반응 (살아있는 세포 = 낮은 형광, 죽은 세포 = 높은 형광)에 기초하여 죽음(Dead) 또는 살아있음(Live)로 분류하였다. 아넥신 V-기반 분류의 결과는 도 16a에 도시된다. 본 명세서에 설명된 메트릭 기반 방법은 죽은 (10μΜ, 72h) 및 살아있음 (비히클, 0-72h) 세포의 라벨-프리 특징부를 사용하여 모델을 트레이닝시키는데 사용되었다. 그런 다음, 아넥신 V 반응의 것에 필적하는 %치사 세포를 수득하기 위해 이 모델은 클래스 세포에 살아있음(Live) 또는 죽음(Dead)으로 적용되었다. 이러한 라벨-프리 분류의 결과가 도 16b에 도시된다. 도 16c는 아넥신 V 또는 라벨-프리 방법을 사용하여 계산된 72h에서의 %치사의 농도 반응 곡선의 오버레이(overlay)를 도시하며, 이는 농도 범위에 걸친 예측된 반응이 비슷하고, EC50 값은 유사함을 보여준다 (아넥신 V EC₅₀ = 6.6 E-07; 라벨-프리 EC50 = 5.3 E-07 M^-1).

Claims

세포의 분류 방법에 있어서, 상기 방법은,
복수의 생물학적 샘플들의 이미지들의 세트를 획득하는 단계 - 상기 이미지들의 세트는 상기 복수의 생물학적 샘플들의 각각의 샘플의 적어도 하나의 이미지를 포함함 -;
상기 복수의 생물학적 샘플들 내의 제1 세트의 세포들의 표시를 획득하는 단계 및 상기 복수의 생물학적 샘플들 내의 제2 세트의 세포들의 표시를 획득하는 단계 - 상기 제1 세트의 세포들은 제1 조건과 연관되고, 상기 제2 세트의 세포들은 제2 조건과 연관됨 -;
상기 이미지들의 세트, 상기 제1 세트의 세포들의 표시, 및 상기 제2 세트의 세포들의 표시에 기초하여, 제1 복수의 메트릭들의 세트를 결정하는 단계 - 상기 제1 복수의 메트릭들의 세트는 상기 제1 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트 및 상기 제2 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 포함함 -;
상기 제1 복수의 메트릭들의 세트에 기초하여, 지도 학습 알고리즘(supervised learning algorithm)을 사용하여 상기 제1 세트의 세포들 내의 세포들과 상기 제2 세트의 세포들 내의 세포들 간을 구별하기 위한 모델을 생성함으로써 트레이닝된 모델을 생성하는 단계;
상기 이미지들의 세트에 기초하여, 제2 복수의 메트릭들의 세트를 결정하는 단계 - 상기 제2 복수의 메트릭들의 세트는 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 포함함 -; 및
상기 타겟 샘플 내의 세포를 분류하는 단계를 포함하되, 상기 세포를 분류하는 단계는 상기 트레이닝된 모델을 상기 세포에 대한 메트릭들의 세트에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 트레이닝된 모델을 상기 세포에 대한 상기 메트릭들의 세트에 적용하는 단계는 상기 세포의 상기 메트릭들의 세트에 기초하여 모델 출력 값을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 세포를 분류하는 단계는 상기 모델 출력 값을 임계치와 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 방법은,
상기 타겟 샘플의 주석이 달린(annotated) 이미지를 디스플레이하는 단계, - 상기 타겟 샘플의 주석이 달린 이미지는 상기 세포의 표시 및 상기 세포의 분류의 표시를 포함함 -;
업데이트된 임계치를 표시하는 사용자 입력을 수신하는 단계;
상기 모델 출력 값을 업데이트된 임계치와 비교함으로써 상기 세포를 재분류하는 단계; 및
상기 타겟 샘플의 업데이트된 주석이 달린 이미지를 디스플레이하는 단계를 더 포함하되, 상기 타겟 샘플의 상기 업데이트된 주석이 달린 이미지는 상기 세포 및 상기 세포의 재분류의 표시를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에 대한 상기 메트릭들의 세트를 결정하는 단계는, 크기 메트릭, 형상 디스크립터 메트릭(shape shape descriptor metric), 텍스처 메트릭(texture metric), 또는 세기 기반 메트릭 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레이닝된 모델은 주요 성분 분석, 독립 성분 분석, 지원 벡터 머신, 인공 신경망, 룩업 테이블, 회귀 트리, 회귀 트리의 앙상블, 결정 트리, 결정 트리의 앙상블, k-최근접 이웃 분석, 베이지안 추론(Bayesian inference), 또는 로지스틱 회귀(logistic regression) 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 샘플은 상기 타겟 샘플에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하고, 상기 타겟 샘플을 묘사하는 상기 이미지 세트의 이미지는 위상차 이미지(phase contrast image) 및 하나 이상의 명시야 이미지(brightfield image)를 포함하고, 상기 하나 이상의 명시야 이미지는 상기 초점면에 포커싱(focus)되지 않은 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내는 적어도 하나의 명시야 이미지를 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 명시야 이미지는 제1 명시야 이미지 및 제2 명시야 이미지를 포함하고, 상기 제1 명시야 이미지는 상기 초점면 위의 제1 디포커싱 거리(defocusing distance)에 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내고, 상기 제2 명시야 이미지는 상기 초점면 아래의 제2 디포커싱 거리에 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내고, 상기 방법은,
상기 제1 명시야 이미지 및 상기 제2 명시야 이미지에 기초하여 상기 타겟 샘플의 세포 이미지를 결정하는 단계를 더 포함하되, 상기 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정하는 단계는 상기 세포 이미지에 기초하여 적어도 하나의 메트릭을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 마커(fluorescent marker)가 상기 제1 세트의 세포의 세포들 및 상기 제2 세트의 세포의 세포들에 존재하고, 상기 형광 마커가 상기 타겟 샘플에 존재하지 않는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세트의 세포 및 상기 제2 세트의 세포는 모두 제1 멀티 웰 샘플 플레이트(multi-well sample plate)의 웰 내에 배치되고, 상기 타겟 샘플은 제2 멀티 웰 샘플 플레이트의 웰 내에 배치되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세트의 세포, 상기 제2 세트의 세포, 및 상기 타겟 샘플은 모두 멀티 웰 샘플 플레이트(multi-well sample plate)의 웰(well) 내에 배치되는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 멀티 웰 플레이트의 웰들의 상대적인 위치의 표시를 디스플레이하는 단계, 상기 제1 세트의 세포는 상기 멀티 웰 샘플 플레이트의 제1 세트의 웰에 존재하고, 상기 제2 세트의 세포는 상기 멀티 웰 샘플 플레이트의 웰의 제2 세트에 존재하고, 상기 제1 세트의 세포의 표시 및 상기 제2 세트의 세포의 표시를 획득하는 단계는, 상기 멀티 웰 샘플 플레이트의 웰의 상대적인 위치 표시를 디스플레이한 후, 상기 멀티 웰 샘플 플레이트 내의 웰의 제1 세트의 상대적인 위치 및 웰의 제2 세트의 상대적인 위치를 표시하는 사용자 입력을 수신하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 트레이닝된 모델을 생성하기 전에, 상기 제1 복수의 메트릭들의 세트들 내의 적어도 하나의 메트릭을 정규화하는 것, 상기 제1 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트와 상기 제2 세트의 세포들의 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트 사이에서 상기 제1 복수의 메트릭들의 세트들을 종합적으로 밸런싱하는 것(balancing), 및 상기 제1 복수의 메트릭들의 세트들을 서브샘플링하는 것(sub-sampling) 중 적어도 하나를 수행함으로써 상기 제1 복수의 메트릭들의 세트들을 전처리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 세트의 세포들 및 상기 제2 세트의 세포들은 형광 마커를 포함하고, 상기 복수의 생물학적 샘플들의 이미지들의 세트는 상기 제1 세트의 세포들을 묘사하는 적어도 하나의 형광 이미지 및 상기 제2 세트의 세포들을 묘사하는 적어도 하나의 형광 이미지를 포함하고, 상기 복수의 생물학적 샘플들 내의 상기 제1 세트의 세포들의 표시를 획득하는 단계는 상기 제1 세트의 세포들을 식별하기 위해 상기 제1 세트의 세포들을 묘사하는 상기 적어도 하나의 형광 이미지를 사용하는 단계를 포함하고,
상기 복수의 생물학적 샘플들 내의 제2 세트의 세포의 표시를 획득하는 단계는 상기 제2 세트의 세포를 식별하기 위해 상기 제2 세트의 세포를 묘사하는 상기 적어도 하나의 형광 이미지를 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟의 세포를 분류하는 단계는 상기 세포를 살아있음(alive) 또는 죽음(dead)으로 분류하는 단계, 상기 세포를 줄기 세포 또는 성숙 세포로 분류하는 단계, 상기 세포를 상피 또는 중간엽(mesenchymal)으로 분류하는 단계, 또는 상기 세포를 미분화 세포(undifferentiated cell) 또는 분화 세포(differentiated cell)로 분류하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
세포의 분류 방법에 있어서, 상기 방법은,
타겟 샘플의 3개 이상의 이미지를 획득하는 단계 - 상기 타겟 샘플은 상기 타겟 샘플에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하고, 상기 3개 이상의 이미지는 위상차 이미지, 제1 명시야 이미지 및 제2 명시야 이미지를 포함하고, 상기 제1 명시야 이미지는 상기 초점면 위의 제1 디포커싱 거리에 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내고, 상기 제2 명시야 이미지는 상기 초점면 아래의 제2 디포커싱 거리에 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타냄 -;
상기 제1 및 제2 명시야 이미지들에 기초하여 상기 타겟 샘플의 세포 이미지를 결정하는 단계;
상기 세포 이미지 및 상기 위상차 이미지에 기초하여 상기 타겟 샘플에 대한 타겟 분할 맵(target segmentation map )을 결정하는 단계;
상기 타겟 샘플의 둘 이상의 이미지들 및 상기 타겟 분할 맵에 기초하여, 상기 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정하는 단계; 및
상기 타겟 샘플 내의 세포를 분류하는 단계를 포함하되, 상기 세포를 분류하는 단계는 트레이닝된 분류기(classifier)에 상기 세포의 메트릭들의 세트를 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포에 대한 상기 메트릭들의 세트를 결정하는 단계는, 크기 메트릭, 형상 디스크립터 메트릭, 텍스처 메트릭, 또는 세기 기반 메트릭 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 메트릭들의 세트를 결정하는 단계는 상기 위상차 이미지에 기초하여 상기 세포의 메트릭들의 세트의 적어도 하나의 메트릭을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 명시야 이미지에 기초하여 상기 타겟 샘플에 대한 상기 타겟 분할 맵을 결정하는 단계는 적어도 상기 제1 및 제2 명시야 이미지 및 상기 위상차 이미지를 컨볼루션 신경망(convolutional neural network)에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
세포의 분류 방법에 있어서, 상기 방법은,
타겟 샘플의 2개 이상의 이미지를 획득하는 단계 - 상기 타겟 샘플은 상기 타겟 샘플에 대한 초점면 주위에 중심을 둔 하나 이상의 세포를 포함하고, 상기 2개 이상의 이미지는 위상차 이미지 및 하나 이상의 명시야 이미지를 포함하고, 상기 하나 이상의 명시야 이미지는 상기 초점면에서 포커싱되지 않은 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내는 적어도 하나의 명시야 이미지를 포함함 -;
상기 2개 이상의 이미지에 기초하여, 상기 타겟 샘플에 존재하는 각각의 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정하는 단계; 및
트레이닝된 모델을 상기 세포에 대한 상기 메트릭 세트에 적용함으로써 타겟 샘플 내의 세포를 분류하는 단계를 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 타겟 샘플의 상기 2개 이상의 이미지는 제1 명시야 이미지 및 제2 명시야 이미지를 포함하고, 상기 제1 명시야 이미지는 상기 초점면 위의 제1 디포커싱 거리에 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내고, 상기 제2 명시야 이미지는 상기 초점면 아래의 제2 디포커싱 거리에 포커싱된 상기 타겟 샘플의 이미지를 나타내고, 상기 방법은,
상기 제1 명시야 이미지 및 상기 제2 명시야 이미지에 기초하여 상기 타겟 샘플의 세포 이미지를 결정하는 단계를 더 포함하되, 상기 세포에 대한 메트릭들의 세트를 결정하는 단계는 상기 세포 이미지에 기초하여 적어도 하나의 메트릭을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
컴퓨팅 디바이스의 하나 이상의 프로세서들에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨팅 디바이스로 하여금 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 제어기 동작들을 수행하게 하는 적어도 컴퓨터 판독가능 명령어들을 저장하도록 구성된, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
생물학적 표본을 검정(assay)하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은,
광학 현미경;
하나 이상의 프로세서를 포함하는 제어기; 및
상기 제어기에 의해 실행될 때, 상기 제어기로 하여금 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 제어기 동작들을 수행하게 하는 적어도 컴퓨터 판독가능 명령어들을 저장하도록 구성된 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는, 시스템.