JP7364682B2 - 位相差および明視野イメージングを用いた無標識細胞セグメンテーション - Google Patents

Description

相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年２月１日に出願された米国特許出願第１６／２６５９１０号に対する優先権を主張する。

生物学的標本内の細胞をセグメント化する現在の既知の方法は、蛍光標識されたタンパク質を必要とし、例えば、マーカー制御されたセグメンテーションアルゴリズムのために、ヒストンのような核局在化タンパク質を閾値処理する。プチコグラフィベースの方法、横方向せん断干渉法、およびデジタルホログラフィなどの代替の無標識手法が存在しているが、これらには複雑な画像取得セットアップや処理時間が長い複雑な画像形成アルゴリズムが必要である。別の無標識手法には、画像の大規模なデータセットに関する広範なトレーニングおよび遅い処理時間を必要とする深層学習アルゴリズム（例えば畳み込みニューラルネットワーク）が含まれる。他の方法では、ピンホールアパーチャのような特殊なハードウェアを必要とし、細胞別セグメンテーションを可能にしない、焦点外状態の明視野画像を使用する。

一態様では、例示的な方法が開示される。方法は、（ａ）プロセッサを介して、１つ以上の細胞を含む生物学的標本の焦点面を中心とする、生物学的標本の少なくとも１つの位相差画像を生成することと、（ｂ）プロセッサを介して、少なくとも１つの位相差画像に基づいて、バイナリ画像の形式でコンフルエンスマスクを生成することと、（ｃ）プロセッサを介して、焦点面の上方の合焦外れ距離における、生物学的標本内の１つ以上の細胞の第１の明視野画像、および焦点面の下方の合焦外れ距離における、生物学的標本内の１つ以上の細胞の第２の明視野画像を受信することと、（ｄ）プロセッサを介して、第１の明視野画像および第２の明視野画像に基づいて、生物学的標本内の１つ以上の細胞の細胞画像を生成することと、（ｅ）プロセッサを介して、細胞画像および少なくとも１つの位相差画像に基づいてシードマスクを生成することと、（ｆ）プロセッサを介して、シードマスクおよびコンフルエンスマスクに基づいて、細胞別セグメンテーションマスクを示す生物学的標本内の１つ以上の細胞の画像を生成することと、を含む。

別の態様では、例示的な非一時的コンピュータ可読媒体が開示される。コンピュータ可読媒体は、プロセッサによって実行されると、以下を含む行為のセットを実行させるプログラム命令がその上に記憶されており、（ａ）プロセッサが、１つ以上の細胞を含む生物学的標本の少なくとも１つの位相差画像を、生物学的標本の焦点面を中心とする少なくとも１つの明視野画像に基づいて生成することと、（ｂ）プロセッサが、少なくとも１つの位相差画像に基づいて、バイナリ画像の形式でコンフルエンスマスクを生成することと、（ｃ）プロセッサが、焦点面の上方の合焦外れ距離における、生物学的標本内の１つ以上の細胞の第１の明視野画像、および焦点面の下方の合焦外れ距離における、生物学的標本内の１つ以上の細胞の第２の明視野画像を受信することと、（ｄ）プロセッサが、第１の明視野画像および第２の明視野画像に基づいて、１つ以上の細胞の細胞画像を生成することと、（ｅ）プロセッサが、細胞画像および少なくとも１つの位相差画像に基づいてシードマスクを生成することと、（ｆ）プロセッサが、シードマスクおよびコンフルエンスマスクに基づいて、細胞別セグメンテーションマスクを示す、生物学的標本内の１つ以上の細胞の画像を生成することと、を含む。

論じた特徴、機能、および利点は、様々な例で独立して達成することができるか、または、さらに他の例で組み合わせてもよく、そのさらなる詳細は、以下の説明および図面を参照して見ることができる。

１つの例示的な実装による、システムの機能ブロック図である。 例示的な実装による、コンピューティングデバイスおよびコンピュータネットワークのブロック図を示す。 例示的な実装による、方法のフローチャートを示す。 例示的な実装による、生物学的標本の画像を示す。 例示的な実装による、別の生物学的標本の画像を示す。 カンプトテシン（ＣＰＴ、細胞毒性）処理後のＨＴ１０８０線維肉腫アポトーシスの２４時間の時間経過後での細胞画像応答について、例示的な実装に従って生成された細胞別セグメンテーションマスクの実験結果を示す。 図６Ａの実装による、赤色（Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ、細胞健康指標、「ＮｕｃＲｅｄ」）および緑色の蛍光（Ｃａｓｐａｓｅ ３／７、アポトーシス指標）に基づいて分類された細胞サブセットを示す。 図６Ａの実装による、ＣＰＴ処理後に赤色集団の減少があったことを示し、これは生細胞の喪失を示し、赤色および緑色の蛍光の増加は、初期アポトーシスを示し、２４時間後の緑色蛍光の増加は、後期アポトーシスを示す。 図６Ａの実装による、初期アポトーシス集団の濃度応答時間経過（赤色および緑色蛍光を示す全細胞のパーセンテージ）を示す。 シクロヘキサミド（ＣＨＸ、細胞増殖抑制）処理後のＨＴ１０８０線維肉腫アポトーシスの２４時間の時間経過後での細胞画像応答について、例示的な実装に従って生成された細胞別セグメンテーションマスクの実験結果を示す。 図６Ｅの実装による、赤色（Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ、細胞健康指標、「ＮｕｃＲｅｄ」）および緑色の蛍光（Ｃａｓｐａｓｅ ３／７、アポトーシス指標）に基づいて分類された細胞サブセットを示す。 図６Ｅの実装による、ＣＨＸ処理後にアポトーシスはなかったが、細胞カウントの減少があったことを示す。 図６Ｅの実装による、初期アポトーシス集団の濃度応答時間経過（赤色および緑色蛍光を示す全細胞のパーセンテージ）を示す。 例示的な実装に従って生成された、細胞別セグメンテーション分析を使用して、付着細胞の無標識細胞カウントのために位相差画像上に課された細胞別セグメンテーションマスクを示す。ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ試薬で標識された様々な密度のＡ５４９細胞を、無標識細胞別分析と赤色核カウント分析との両方で分析して、経時的な無標識カウントを検証した。 背景に位相差画像がない、図７Ａによる細胞別セグメンテーションマスクを示す。 図７Ａの実装による、密度にわたる位相カウントおよびＮｕｃＲｅｄカウントデータの時間経過を示す。 図７Ａの実装による、４８時間にわたるカウントデータの相関を示し、Ｒ２値１および傾き１を示す。

図面は、例を図示することを目的としているが、本発明は、図面に示されている配置および手段に限定されないことが理解される。

Ｉ．概要
本明細書に説明される方法の実施形態は、焦点外明視野画像を利用して生物学的標本の１つ以上の細胞の位相差画像をセグメント化するために使用することができ、これにより、速い処理時間で個々の細胞および亜集団の分析を可能にする。開示された例示的な方法はまた、細胞のリアルタイムの無標識（すなわち、蛍光なし）カウントを有益に可能にし、生細胞の生存率および機能性を損なう可能性がある蛍光マーカーの影響を回避する。開示された例示的な方法のさらなる利点は、ＨＵＶＥＣのような平坦な細胞を含む、細胞形態の複雑さに関係ない、個々の細胞境界の検出である。

ＩＩ．例示的なアーキテクチャ
図１は、例えば、光学顕微鏡１０５、および１つ以上の細胞を有する生物学的標本１１０を含むかまたは伴う動作環境１００を示すブロック図である。以下に説明される図３～図５の方法３００は、この動作環境１００内で実装することができる方法の実施形態を示している。

図２は、直接または間接的に動作環境１００とインターフェースするように構成された、例示的な実装による、コンピューティングデバイス２００の例を示すブロック図である。コンピューティングデバイス２００は、図３～図５に示され、以下に説明される方法の機能を行うために使用され得る。特に、コンピューティングデバイス２００は、例えば、光学顕微鏡１０５によって得られた画像に部分的に基づく画像生成機能を含む、１つ以上の機能を行うように構成することができる。コンピューティングデバイス２００は、プロセッサ（複数可）２０２、ならびに通信インターフェース２０４、データストレージ２０６、出力インターフェース２０８、およびディスプレイ２１０も有し、各々が通信バス２１２に接続されている。コンピューティングデバイス２００はまた、コンピューティングデバイス２００内、およびコンピューティングデバイス２００と他のデバイス（例えば、図示せず）との間の通信を可能にするハードウェアを含み得る。ハードウェアは、例えば、送信器、受信器、およびアンテナを含み得る。

通信インターフェース２０４は、１つ以上のネットワーク２１４または１つ以上のリモートコンピューティングデバイス２１６（例えば、タブレット２１６ａ、パーソナルコンピュータ２１６ｂ、ラップトップコンピュータ２１６ｃ、およびモバイルコンピューティングデバイス２１６ｄなど）への短距離通信および長距離通信の両方を可能にする無線インターフェースおよび／または１つ以上の有線インターフェースであり得る。このような無線インターフェースは、ブルートゥース、ＷｉＦｉ（例えば、電気電子技術者協会（ＩＥＥＥ）８０２．１１プロトコル）、ロングタームエボリューション（ＬＴＥ）、セルラー通信、近距離無線通信（ＮＦＣ）、および／または他の無線通信プロトコルなどの１つ以上の無線通信プロトコルの下での通信を提供し得る。このような有線インターフェースには、イーサネットインターフェース、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インターフェース、または、ワイヤ、ツイストペアワイヤ、同軸ケーブル、光リンク、光ファイバリンク、もしくは他の物理的接続を介して有線ネットワークに通信するための同様のインターフェースが含まれ得る。したがって、通信インターフェース２０４は、１つ以上のデバイスから入力データを受信するように構成され得、また、出力データを他のデバイスに送信するように構成され得る。

通信インターフェース２０４はまた、例えば、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、タッチパッド、コンピュータマウス、トラックボール、および／または他の同様のデバイスなどのユーザ入力デバイスを含み得る。

データストレージ２０６は、プロセッサ（複数可）２０２によって読み取られるかまたはアクセスすることができる１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体を含むか、またはその形式をとることができる。コンピュータ可読記憶媒体は、全体的または部分的にプロセッサ（複数可）２０２と統合することができる、光学、磁気、有機もしくは他のメモリまたはディスクストレージなどの揮発性および／または不揮発性ストレージ構成要素を含むことができる。データストレージ２０６は、非一時的なコンピュータ可読媒体と見なされる。いくつかの例では、データストレージ２０６は、単一の物理デデバイス（例えば、１つの光学、磁気、有機もしくは他のメモリまたはディスクストレージユニット）を使用して実装することができ、他の例では、データストレージ２０６は、２つ以上の物理デバイスを使用して実装することができる。

したがって、データストレージ２０６は、非一時的コンピュータ可読記憶媒体であり、実行可能命令２１８がその上に記憶されている。命令２１８は、コンピュータ実行可能コードを含む。命令２１８がプロセッサ（複数可）２０２によって実行されると、プロセッサ（複数可）２０２は機能を行わされる。そのような機能には、光学顕微鏡１００から明視野画像を受信すること、ならびに、位相差画像、コンフルエンスマスク、細胞画像、シードマスク、細胞別セグメンテーションマスク、および蛍光画像を生成することが含まれるが、これらに限定されない。

プロセッサ（複数可）２０２は、汎用プロセッサまたは専用プロセッサ（例えば、デジタル信号プロセッサ、特定用途向け集積回路など）であり得る。プロセッサ（複数可）２０２は、通信インターフェース２０４から入力を受信し、入力を処理して、出力を生成することができ、出力は、データストレージ２０６に記憶され、ディスプレイ２１０に出力される。プロセッサ（複数可）２０２は、データストレージ２０６に記憶されており、本明細書に説明されるコンピューティングデバイス２００の機能を提供するために実行可能である実行可能命令２１８（例えば、コンピュータ可読プログラム命令）を実行するように構成することができる。

出力インターフェース２０８は、情報をディスプレイ２１０または他の構成要素にも出力する。したがって、出力インターフェース２０８は、通信インターフェース２０４と同様であり得、無線インターフェース（例えば、送信器）または有線インターフェースでもあり得る。出力インターフェース２０８は、例えば、１つ以上の制御可能なデバイスにコマンドを送信することができる。

図２に示されるコンピューティングデバイス２００はまた、例えば、光学顕微鏡１０５と通信する、動作環境１００内のローカルコンピューティングデバイス２００ａを表し得る。このローカルコンピューティングデバイス２００ａは、以下に説明される方法３００のステップのうちの１つ以上のステップを行うことができ、ユーザから入力を受信することができ、ならびに／または画像データおよびユーザ入力をコンピューティングデバイス２００に送信して、方法３００のステップのすべてまたは一部を行うことができる。さらに、１つの任意選択の例示的な実施形態では、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）プラットフォームが、方法３００を行うために利用されてもよく、また、コンピューティングデバイス２００および光学顕微鏡１０５の組み合わされた機能を含む。

図３は、例示的な実装による、生物学的標本１１０の１つ以上の細胞の細胞別セグメンテーションを達成するための例示的な方法３００のフローチャートを示している。図３に示される方法３００は、例えば、図２のコンピューティングデバイス２００で使用され得る方法の例を提示している。さらに、デバイスまたはシステムを使用して、または構成して、図３に提示されている論理機能を行うことができる。場合によっては、デバイスおよび／またはシステムの構成要素は、当該構成要素がそのような実行を可能にするようにハードウェアおよび／またはソフトウェアで構成および構造化されるように、機能を行うように構成され得る。デバイスおよび／またはシステムの構成要素が、特定のやり方で操作されるときなど、機能を行うように適合されるか、行うことが可能であるか、または行うのに適するように配置され得る。方法３００は、ブロック３０５～３３０のうちの１つ以上のブロックによって示されるように、１つ以上の動作、機能、またはアクションを含み得る。ブロックは連続した順序で示されているが、これらのブロックのうちのいくつかは並列に行われても、および／または本明細書に説明されているものとは異なる順序で行われてもよい。また、様々なブロックは、より少ないブロックに組み合わされ、追加のブロックに分割され、および／または所望の実装に基づいて除去されてもよい。

本明細書に開示されるこのおよび他のプロセスおよび方法について、フローチャートは、本例の１つの可能な実装の機能および動作を示すことを理解されたい。これに関して、各ブロックは、モジュール、セグメント、またはプログラムコードの一部を表すことができ、プロセス内の特定の論理機能またはステップを実装するためにプロセッサによって実行可能な１つ以上の命令を含む。プログラムコードは、例えば、ディスクドライブもしくはハードドライブを含むストレージデバイスなどの、任意のタイプのコンピュータ可読媒体またはデータストレージに記憶することができる。さらに、プログラムコードは、コンピュータ可読記憶媒体上、または他の非一時的媒体もしくは製造品上で、機械可読形式に符号化することができる。コンピュータ可読媒体は、例えば、レジスタメモリ、プロセッサキャッシュ、およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）など、短期間データを記憶するコンピュータ可読媒体などの非一時的コンピュータ可読媒体またはメモリを含み得る。コンピュータ可読媒体はまた、例えば、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、光学ディスクもしくは磁気ディスク、コンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）のような二次的または永続的な長期ストレージなどの非一時的媒体も含み得る。コンピュータ可読媒体はまた、任意の他の揮発性または不揮発性記憶システムでもあり得る。コンピュータ可読媒体は、例えば、有形のコンピュータ可読記憶媒体と見なされ得る。

さらに、図３、ならびに、本明細書に開示される他のプロセスおよび方法における各ブロックは、プロセス内の特定の論理機能を行うように配線された回路を表し得る。代替の実装は、本開示の例の範囲内に含まれ、機能は、当業者には理解されるように、関与する機能に応じて、実質的に同時または逆の順序を含めて、示されたまたは説明されたものから順不同で実行され得る。

ＩＩＩ．例示的な方法
本明細書で使用される場合、「明視野画像」は、光波が生物学的サンプルの透明部分を通過するように下から照明された生物学的サンプルに基づいて顕微鏡を介して得られた画像を指す。次に、様々な輝度レベルが明視野画像にキャプチャされる。

本明細書で使用される場合、「位相差画像」は、下から照明された生物学的サンプルに基づいて、直接または間接的に顕微鏡を介して得られた画像を指し、生物学的サンプルの異なる部分の屈折率の違いによる生物学的サンプルを通過する光の位相シフトをキャプチャする。例えば、光波が生物学的標本を通って進むとき、光波の振幅（すなわち、輝度）および位相は、生物学的標本の特性に応じるように変化する。結果として、位相差画像は、高屈折率を有するより密度の高い領域が結果の画像においてより暗くレンダリングされ、より低い屈折率を有するより密度の低い領域が結果の画像においてより明るくレンダリングされるように変化するピクセルに関連付けられた輝度強度値を有する。位相差画像は、明視野画像のＺスタックからを含む、いくつかの手法を介して生成することができる。

本明細書で使用される場合、明視野画像の「Ｚスタック」または「Ｚスイープ」は、異なる焦点距離で撮影された複数の画像を組み合わせて、個々のソース明視野画像のいずれかよりもより深い被写界深度（すなわち、焦点面の厚さ）を有する合成画像を提供するデジタル画像処理方法を指す。

本明細書で使用される場合、「焦点面」は、生物学的標本が最適な焦点で観察可能である、光学顕微鏡のレンズの軸に垂直に配置された平面を指す。

本明細書で使用される場合、「合焦外れ距離」は、生物学的標本が焦点外で観察可能であるように、焦点面の上方または下方の距離を指す。

本明細書で使用される場合、「コンフルエンスマスク」は、ピクセルが生物学的標本中の１つ以上の細胞に属するものとして特定され、それにより、１つ以上の細胞に対応するピクセルに１の値が割り当てられ、背景に対応する残りのピクセルに０の値が割り当てられる（またはその逆も同様）バイナリ画像を指す。

本明細書で使用される場合、「細胞画像」は、背景に対する細胞のコントラストを強調するために、異なる平面で得られた少なくとも２つの明視野画像に基づいて生成された画像を指す。

本明細書で使用される場合、「シードマスク」は、設定されたピクセル強度閾値に基づいてバイナリピクセル化が生成された画像を指す。

本明細書で使用される場合、「細胞別セグメンテーションマスク」は、生物学的標本１１０の細胞が、各々、明確な関心領域として表示されるように、バイナリピクセル化された（すなわち、各ピクセルは、プロセッサによって０または１の値が割り当てられている）画像を指す。細胞別セグメンテーションマスクは、有利には、そこに表示される細胞の無標識カウントを可能にし、個々の付着細胞の全エリアの決定を可能にし、細胞テクスチャメトリックおよび細胞形状記述子に基づく分析を可能にし、および／または、生物学的標本１１０において各細胞が他のいくつかの隣接する細胞に接触し得る、シート状に形成される傾向がある付着細胞を含む、個々の細胞の境界の検出を可能にし得る。

本明細書で使用される場合、「領域成長反復」は、最初に特定された１つ以上の個々のピクセルまたはピクセルのセット（すなわち、「シード」）を取り、隣接するピクセルをセットに追加することにより、そのシードを反復的に拡張することによって関心領域（「ＲＯＩ」）が画定される反復画像セグメンテーション方法における単一のステップを指す。プロセッサは、類似性メトリックを利用して、成長領域に追加されるピクセルを決定し、領域の成長がいつ完了するのかを決定するためにプロセッサに停止基準が規定される。

ここで図３～図５を参照すると、方法３００が、図１～図２のコンピューティングデバイスを使用して示されている。方法３００は、ブロック３０５において、プロセッサ２０２が、１つ以上の細胞を含む生物学的標本１１０の焦点面を中心とする、生物学的標本１１０の少なくとも１つの位相差画像４００を生成することを含む。次に、ブロック３１０において、プロセッサ２０２は、少なくとも１つの位相差画像４００に基づいて、バイナリ画像の形式でコンフルエンスマスク４１０を生成する。次に、ブロック３１５において、プロセッサ２０２は、焦点面の上方の合焦外れ距離における、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の第１の明視野画像４１５と、焦点面の下方の合焦外れ距離における、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の第２の明視野画像４２０と、を受信する。次に、プロセッサ２０２は、ブロック３２０において、第１の明視野画像４１５および第２の明視野画像４２０に基づいて、生物学的標本内の１つ以上の細胞の細胞画像４２５を生成する。ブロック３２５において、プロセッサ２０２は、細胞画像４２５および少なくとも１つの位相差画像４００に基づいてシードマスク４３０を生成する。そして、プロセッサ２０２は、ブロック３３０において、シードマスク４３０およびコンフルエンスマスク４１０に基づいて、細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す、生物学的標本内の１つ以上の細胞の画像を生成する。

図３に示されるように、ブロック３０５において、プロセッサ２０２が、１つ以上の細胞を含む生物学的標本１１０の焦点面を中心とする、生物学的標本１１０の少なくとも１つの位相差画像４００を生成することは、プロセッサ２０２が、明視野画像のＺスイープを受信することと、次いで、明視野画像のＺスイープに基づいて少なくとも１つの位相差画像４００を生成することと、の両方を含む。様々な実施形態において、生物学的標本１１０は、実験セットを表すウェルプレート内の複数のウェル内に分散され得る。

１つの任意選択の実施形態では、方法１００は、プロセッサ２０２が、少なくとも１つの蛍光画像を受信することと、次いで、細胞別セグメンテーションマスク４３５内の生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の蛍光強度を計算することと、の両方を含む。この実施形態では、蛍光強度は、関心タンパク質のレベル、例えば、ＣＤ２０のような細胞表面マーカーを標識する抗体、または細胞死に対応する蛍光を誘導するアネキシンＶ試薬に対応する。さらに、個々の細胞境界内の蛍光強度を決定すると、亜集団の特定が増加し、亜集団固有のメトリック（例えば、アネキシンＶの存在によって定義されるすべての末期細胞の平均エリアおよび偏心度）の計算が可能になる。

別の実施形態では、ブロック３１０において、プロセッサ２０２が、少なくとも１つの位相差画像４００に基づいて、バイナリ画像の形式でコンフルエンスマスク４１０を生成することは、プロセッサ２０２が、局所テクスチャフィルタまたは輝度フィルタのうちの１つ以上を適用して、生物学的標本１１０内の１つ以上細胞に属するピクセルの特定を可能にすることを含む。例示的なフィルタには、局所範囲フィルタ、局所エントロピーフィルタ、局所標準偏差フィルタ、局所輝度フィルタ、およびガボールウェーブレットフィルタが含まれ得るが、これらに限定されない。図４および図５に、例示的なコンフルエンスマスク４１０が示されている。

別の任意選択の実施形態では、光学顕微鏡１０５が、生物学的標本１１０の焦点面を決定する。さらに、様々な実施形態では、合焦外れ距離は、２０μｍ～６０μｍの範囲であり得る。最適な合焦外れ距離は、対物レンズの倍率および作動距離を含む、使用する対物レンズの光学特性に基づいて決定される。

図５に示されるさらなる実施形態では、ブロック３２０において、プロセッサ２０２が、第１の明視野画像４１５および第２の明視野画像４２０に基づいて細胞画像４２５を生成することは、プロセッサ２０２が、複数のピクセル単位の数学演算のうちの少なくとも１つまたは特徴検出を利用して、焦点面を中心とする第３の明視野画像４０５に基づいて、第１の明視野画像４１５および第２の明視野画像４２０を強調することを含む。ピクセル単位の数学演算の一例には、加算、減算、乗算、除算、またはこれらの演算の任意の組み合わせが含まれる。次に、プロセッサ２０２は、変換パラメータを計算して、第１の明視野画像４１５および第２の明視野画像４２０を少なくとも１つの位相差画像４００と位置合わせする。次に、プロセッサ２０２は、位置合わせされた第２の明視野画像４２０の各ピクセルの輝度レベルを、位置合わせされた第１の明視野画像４１５内の対応するピクセルの輝度レベルと組み合わせて、これにより、細胞画像４２５を形成する。各ピクセルの輝度レベルの組み合わせは、上記の数学演算のいずれかを介して達成できる。細胞画像４２５を生成する際の技術的効果は、明視野アーチファクト（例えば、影）を除去し、画像コントラストを強調して、シードマスク４３０の細胞検出を増加させることである。

別の任意選択の実施形態では、ブロック３２０において、プロセッサ２０２が、第１の明視野画像４１５および第２の明視野画像４２０に基づいて、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の細胞画像４２５を生成することは、プロセッサ２０２が、１つ以上の閾値値レベルおよび１つ以上のフィルタサイズを決定する１つ以上のユーザ定義パラメータを受信することを含む。次に、プロセッサ２０２は、１つ以上のユーザ定義パラメータに基づいて、１つ以上の平滑化フィルタを細胞画像４２５に適用する。平滑化フィルタの技術的効果は、シードマスク４３０における細胞検出の精度をさらに高め、細胞ごとに１つのシードが割り当てられる可能性を高めることである。平滑化フィルタのパラメータは、様々な付着細胞の形態、例えば、平らな形状と丸い形状、突出した細胞、クラスター細胞などに適合するように選択される。

さらなる任意選択の実施形態では、ブロック３２５において、プロセッサ２０２が、細胞画像４２５および少なくとも１つの位相差画像４００に基づいてシードマスク４３０を生成することは、プロセッサ２０２が、閾値ピクセル強度以上の各ピクセルが細胞シードピクセルとして特定されるように、細胞画像４２５を修正することを含み、これにより、バイナリピクセル化されたシードマスク４３０がもたらされる。シードマスクのバイナリピクセル化の技術的効果は、コンフルエンスマスクの対応するバイナリピクセル化との比較を可能にすることである。シードマスクのバイナリピクセル化はまた、以下で論じられる領域成長反復の開始点としても利用される。例えば、さらに別の任意選択の実施形態では、シードマスク４３０は、各々が生物学的標本１１０内の単一の細胞に対応する複数のシードを有し得る。この実施形態では、方法３００は、プロセッサ２０２が、細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す、生物学的標本内の１つ以上の細胞の画像を生成する前に、プロセッサ２０２が、シードマスク４３０とコンフルエンスマスク４１０とを比較し、コンフルエンスマスク４１０のエリアに配置されていない１つ以上の領域をシードマスク４３０から除外し、シードマスク４３０の複数のシードのうちの１つを含まない１つ以上の領域をコンフルエンスマスク４１０から除外することをさらに含む。これらの除外された領域の技術的効果は、シードを生成する小さな明るい物体（例えば、細胞破片）を除き、以下で説明される領域成長反復で利用されるシードの特定を増加させることである。

さらなる任意選択の実施形態では、ブロック３３０において、プロセッサ２０２が、シードマスク４３０およびコンフルエンスマスク４１０に基づいて細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の画像を生成することは、プロセッサ２０２が、シードのアクティブセットのうちの各々に対して領域成長反復を行うことを含む。次に、プロセッサ２０２は、所与のシードの成長領域がコンフルエンスマスク４１０の１つ以上の縁に到達するか、または別のシードの成長領域とオーバーラップするまで、シードのアクティブセット内の各シードに対して領域成長反復を繰り返す。シードのアクティブセットは、細胞画像内の対応するピクセルの値の特性に基づいて、反復ごとにプロセッサ２０２によって選択される。さらに、少なくとも１つの位相差画像４００、ならびに明視野画像４１５、２４０、４０５を使用することの技術的効果は、シードが、細胞画像４２５内の輝点と、位相差画像４００内の高テクスチャのエリアとの両方に対応すること（すなわち、コンフルエンスマスク４１０と、以下でより詳細に説明されるシードマスク４３０とのオーバーラップ）である。コンフルエンスマスク４１０、少なくとも１つの位相差画像、および明視野画像４１５、４２０、４０５を使用することからもたらされる別の技術的効果は、一例として、細胞表面タンパク質発現のような特徴の定量化を有利に可能にする、細胞別セグメンテーションマスク４３５における個々の細胞位置および細胞境界の特定における精度の向上である。

さらに別の任意選択の実施形態では、方法３００は、プロセッサ２０２が、ユーザ入力に応答して１つ以上のフィルタを適用して、１つ以上の細胞テクスチャメトリックおよび細胞形状記述子に基づいて物体を除去することを含み得る。次に、プロセッサ２０２は、１つ以上のフィルタの適用に応答して、細胞別セグメンテーションマスクを示す生物学的標本の画像を修正する。例示的な細胞テクスチャメトリックおよび細胞形状記述子には、細胞のサイズ、周囲長、偏心度、蛍光強度、アスペクト比、固体性、フェレット直径、位相差エントロピー、および位相差標準偏差が含まれるが、これらに限定されない。

さらなる任意選択の実施形態では、方法３００は、プロセッサ２０２が、細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の画像に基づいて、生物学的標本１１０の細胞カウントを決定することを含み得る。前述の細胞カウントは、例えば、図４に示されている、細胞別セグメンテーションマスク４３５に示されている画定された細胞境界の結果として有利に可能になる。１つの任意選択の実施形態では、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞は、付着細胞および非付着細胞のうちの１つ以上である。さらなる実施形態では、付着細胞は、ヒト肺癌細胞、線維癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞を含む様々な癌細胞株、またはヒト臍静脈細胞を含むヒト微小血管細胞株のうちの１つ以上を含み得る。任意選択の実施形態では、プロセッサ２０２は、ＰＭＢＣおよびジャーカット細胞のようなヒト免疫細胞を含む非付着細胞に、付着細胞に適用されるものとは異なる平滑化フィルタが適用されて細胞境界の近似が向上するように領域成長反復を行う。

上述のように、非一時的コンピュータ可読媒体には、プロセッサ２０２によって実行されると、前述の方法の機能のいずれかを実行するように利用され得るプログラム命令がその上に記憶されている。

一例として、非一時的コンピュータ可読媒体には、プロセッサ２０２によって実行されると、プロセッサ２０２が、生物学的標本１１０の焦点面を中心とする少なくとも１つの明視野画像４０５に基づいて、１つ以上の細胞を含む生物学的標本１１０の少なくとも１つの位相差画像４００を生成することを含む、行為のセットを実行させるプログラム命令がその上に記憶されている。次に、プロセッサ２０２は、少なくとも１つの位相差画像４００に基づいて、バイナリ画像の形式でコンフルエンスマスク４１０を生成する。次に、プロセッサ２０２は、焦点面の上方の合焦外れ距離における、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の第１の明視野画像４１５と、焦点面の下方の合焦外れ距離における、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の第２の明視野画像４２０と、を受信する。次に、プロセッサ２０２は、第１の明視野画像４１５および第２の明視野画像４２０に基づいて、１つ以上の細胞の細胞画像４２５を生成する。プロセッサ２０２はまた、細胞画像４２５および少なくとも１つの位相差画像４００に基づいてシードマスク４３０を生成する。そして、プロセッサ２０２は、シードマスク４３０およびコンフルエンスマスク４１０に基づいて、細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す、生物学的標本１００内の１つ以上の細胞の画像を生成する。

１つの任意選択の実施形態では、非一時的コンピュータ可読媒体は、プロセッサ２０２が、少なくとも１つの蛍光画像を受信することと、プロセッサ２０２が、細胞別セグメンテーションマスク内の生物学的標本内の１つ以上の細胞の蛍光強度を計算することと、をさらに含む。

別の任意選択の実施形態では、非一時的コンピュータ可読媒体は、プロセッサ２０２が、細胞画像４２５および少なくとも１つの位相差画像４００に基づいてシードマスク４３０を生成することをさらに含む。そして、非一時的コンピュータ可読媒体は、プロセッサ２０２が、閾値ピクセル強度以上の各ピクセルが細胞シードピクセルとして特定されるように細胞画像４１０を修正することをさらに含み、これにより、バイナリピクセル化されたシードマスク４３０がもたらされる。

さらなる任意選択の実施形態では、シードマスク４３０は、各々が単一の細胞に対応する複数のシードを有する。そして、非一時的コンピュータ可読媒体は、プロセッサ２０２が、細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の画像を生成する前に、プロセッサ２０２が、シードマスク４３０とコンフルエンスマスク４１０とを比較し、コンフルエンスマスク４１０のエリアに配置されていない１つ以上の領域をシードマスク４３０から除外し、シードマスク４３０の複数のシードのうちの１つを含まない１つ以上の領域をコンフルエンスマスク４１０から除外することをさらに含む。

さらに別の任意選択の実施形態では、シードマスク４３０およびコンフルエンスマスク４１０に基づいて細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す、生物学的標本１１０内の１つ以上の細胞の画像をプロセッサ２０２に生成させるプログラム命令は、プロセッサ２０２が、シードのアクティブセットのうちの各々に対して領域成長反復を行うことを含む。次に、非一時的コンピュータ可読媒体は、プロセッサ２０２が、所与のシードの成長領域がコンフルエンスマスク４１０の１つ以上の境界に到達するか、または別のシードの成長領域とオーバーラップするまで、シードのアクティブセット内の各シードに対して領域成長反復を繰り返すことをさらに含む。

非一時的コンピュータ可読媒体は、プロセッサ２０２が、ユーザ入力に応答して１つ以上のフィルタを適用して、１つ以上の細胞テクスチャメトリックおよび細胞形状記述子に基づいて物体を除去することをさらに含む。そして、プロセッサ２０２は、１つ以上のフィルタの適用に応答して、細胞別セグメンテーションマスク４３５を示す生物学的標本１１０の画像を修正する。

ＩＶ．実験結果
例示的な実装は、細胞の健康状態を亜集団で経時的に追跡することを可能にする。例えば、図６Ａは、カンプトテシン（ＣＰＴ、細胞毒性）処理後のＨＴ１０８０線維肉腫アポトーシスの２４時間の時間経過後での位相差画像応答について、例示的な実装に従って生成された細胞別セグメンテーションマスクの実験結果を示している。細胞の健康状態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）のＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（核生存率マーカー）および非摂動のＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）のＣａｓｐａｓｅ ３／７緑色試薬（アポトーシス指標）の多重読み出しで決定された。図６Ｂは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）のＣｅｌｌ－ｂｙ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅツールを使用して、図６Ａの実装に従って、赤色および緑色の蛍光に基づいて分類された細胞サブセットを示している。図６Ｃは、図６Ａの実装による、ＣＰＴ処理後に赤色集団が減少したことを示し、これは生細胞の喪失を示し、赤色および緑色の蛍光の増加は初期アポトーシスを示し、２４時間後の緑色蛍光の増加は、後期アポトーシスを示す。図６Ｄは、図６Ａの実装による、初期アポトーシス集団の濃度応答時間経過（赤色および緑色の蛍光を示す全細胞のパーセンテージ）を示している。示されている値は、３つのウェルの平均±ＳＥＭである。

別の例において、図６Ｅは、シクロヘキサミド（ＣＨＸ、細胞増殖抑制）処理後のＨＴ１０８０線維肉腫アポトーシスの２４時間の時間経過後での細胞画像応答について、例示的な実装に従って生成された細胞別セグメンテーションマスクの実験結果を示している。細胞の健康状態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）のＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（核生存率マーカー）および非摂動のＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）のＣａｓｐａｓｅ ３／７緑色試薬（アポトーシス指標）の多重読み出しで決定された。図６Ｆは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）のＣｅｌｌ－ｂｙ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅツールを使用して、図６Ｅの実装に従って、赤色および緑色の蛍光に基づいて分類された細胞サブセットを示している。図６Ｇは、図６Ｅの実装による、ＣＨＸ処理後にアポトーシスはなかったが、細胞カウントが減少（データは図示しない）したことを示している。図６Ｈは、図６Ｅの実装による、初期アポトーシス集団の濃度応答時間経過（赤色および緑色の蛍光を示す全細胞のパーセンテージ）を示している。示されている値は、３つのウェルの平均±ＳＥＭである。

図７Ａは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ソフトウェアを介して、例示的な実装に従って生成された、細胞別セグメンテーション分析を使用して、付着細胞の無標識細胞カウントのために位相差画像上に課された細胞別セグメンテーションマスクを示している。ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ試薬で標識された様々な密度のＡ５４９細胞を、無標識細胞別分析と赤色核カウント分析との両方で分析して、経時的な無標識カウントを検証した。図７Ｂは、背景に位相差画像がない、図７Ａによる細胞別セグメンテーションマスクを示している。図７Ｃは、図７Ａの実装による、密度にわたる位相カウントおよび赤色カウントデータの時間経過を示している。図７Ｄは、図７Ａの実装による、４８時間にわたるカウントデータの相関を示し、Ｒ２値１および傾き１を示している。これは、様々な細胞型で繰り返されている。示されている値は、４つのウェルの平均±ＳＥＭである。

異なる有利な配置の説明は、例示および説明の目的で提示されており、網羅的であること、または開示された形態の例に限定されることを意図していない。当業者には多くの修正および変更が明らかであろう。さらに、異なる有利な例は、他の有利な例と比較して、異なる利点を説明し得る。選択された１つ以上の例は、例の原理、実際の適用を最もよく説明し、当業者が企図される特定の使用に適した様々な修正を伴う様々な例についての開示を理解できるようにするために選択され説明されている。

Claims (21)

1. 方法であって、
   プロセッサを介して、１つ以上の細胞を含む生物学的標本の焦点面を中心とする、前記生物学的標本の少なくとも１つの位相差画像を生成することと、
   前記プロセッサを介して、前記少なくとも１つの位相差画像に基づいて、バイナリ画像の形式でコンフルエンスマスクを生成することと、
   前記プロセッサを介して、前記焦点面の上方の合焦外れ距離における、前記生物学的標本内の１つ以上の細胞の第１の明視野画像、および前記焦点面の下方の前記合焦外れ距離における、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の第２の明視野画像を受信することと、
   前記プロセッサを介して、前記第１の明視野画像および前記第２の明視野画像に基づいて、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の細胞画像を生成することと、
   前記プロセッサを介して、前記細胞画像および前記少なくとも１つの位相差画像に基づいてシードマスクを生成することと、
   前記プロセッサを介して、前記シードマスクおよび前記コンフルエンスマスクに基づいて、細胞別セグメンテーションマスクを示す、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の画像を生成することと、を含む、方法。
2. 前記プロセッサを介して、前記１つ以上の細胞を含む前記生物学的標本の前記焦点面を中心とする、前記生物学的標本の前記少なくとも１つの位相差画像を生成することは、
   前記プロセッサを介して、明視野画像のＺスイープを受信することと、
   前記プロセッサを介して、明視野画像の前記Ｚスイープに基づいて前記少なくとも１つの位相差画像を生成することと、を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記合焦外れ距離は、２０μｍ～６０μｍの範囲である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記プロセッサを介して、少なくとも１つの蛍光画像を受信することと、
   前記プロセッサを介して、前記細胞別セグメンテーションマスク内の前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の蛍光強度を計算することと、をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記プロセッサを介して、前記少なくとも１つの位相差画像に基づいて、前記バイナリ画像の形式で前記コンフルエンスマスクを生成することは、
   前記プロセッサを介して、局所テクスチャフィルタおよび輝度フィルタのうちの１つ以上を適用して、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞に属するピクセルの特定を可能にすることを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記プロセッサを介して、前記第１の明視野画像および前記第２の明視野画像に基づいて前記細胞画像を生成することは、
   前記プロセッサを介して、複数のピクセル単位の数学演算のうちの少なくとも１つまたは特徴検出を利用して、前記焦点面を中心とする第３の明視野画像に基づいて、前記第１の明視野画像および前記第２の明視野画像を強調することと、
   前記プロセッサを介して、変換パラメータを計算することと、
   前記プロセッサを介して、前記変換パラメータに基づいて、前記第１の明視野画像および前記第２の明視野画像を、前記少なくとも１つの位相差画像と位置合わせすることと、
   前記プロセッサを介して、前記位置合わせされた第２の明視野画像の各ピクセルの輝度レベルを、前記位置合わせされた第１の明視野画像内の対応するピクセルの輝度レベルと組み合わせて、これにより、前記細胞画像を形成することと、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記プロセッサを介して、前記第１の明視野画像および前記第２の明視野画像に基づいて、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の前記細胞画像を生成することは、
   前記プロセッサを介して、１つ以上の閾値レベルおよび１つ以上のフィルタサイズを決定する１つ以上のユーザ定義パラメータを受信することと、
   前記プロセッサを介して、前記１つ以上のユーザ定義パラメータに基づいて、１つ以上の平滑化フィルタを前記細胞画像に適用することと、をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記プロセッサを介して、前記細胞画像および前記少なくとも１つの位相差画像に基づいて、前記シードマスクを生成することは、
   前記プロセッサを介して、閾値ピクセル強度以上の各ピクセルが細胞シードピクセルとして特定されるように前記細胞画像を修正することを含み、これにより、バイナリピクセル化された前記シードマスクがもたらされる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記シードマスクは、各々が単一のセルに対応する複数のシードを有し、前記方法は、
   前記プロセッサを介して、前記細胞別セグメンテーションマスクを示す、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の前記画像を生成する前に、前記プロセッサを介して、前記シードマスクと前記コンフルエンスマスクとを比較し、前記コンフルエンスマスクのエリアに配置されていない１つ以上の領域を前記シードマスクから除外し、前記シードマスクの前記複数のシードのうちの１つを含まない１つ以上の領域を前記コンフルエンスマスクから除外することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記プロセッサを介して、前記シードマスクおよび前記コンフルエンスマスクに基づいて、前記細胞別セグメンテーションマスクを示す、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の前記画像を生成することは、
    前記プロセッサを介して、シードのアクティブセットのうちの各々に対して領域成長反復を行うことと、
    前記プロセッサを介して、所与のシードの成長領域が前記コンフルエンスマスクの１つ以上の境界に到達するか、または別のシードの成長領域とオーバーラップするまで、シードの前記アクティブセット内の各シードに対して前記領域成長反復を繰り返すことと、を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記プロセッサを介して、ユーザ入力に応答して１つ以上のフィルタを適用して、１つ以上の細胞テクスチャメトリックおよび細胞形状記述子に基づいて物体を除去することと、
    前記プロセッサを介して、前記１つ以上のフィルタの適用に応答して、前記細胞別セグメンテーションマスクを示す前記生物学的標本の前記画像を修正することと、をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞は、付着細胞および非付着細胞のうちの１つ以上である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記付着細胞は、ヒト肺癌細胞、線維癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、またはヒト微小血管細胞株、のうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 光学顕微鏡を介して、前記生物学的標本の前記焦点面を決定することをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記プロセッサを介して、前記細胞別セグメンテーションマスクを示す、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の前記画像に基づいて、前記生物学的標本の細胞カウントを決定することをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. プロセッサによって実行されると、以下を含む行為のセットを実行させるプログラム命令がその上に記憶されている非一時的コンピュータ可読媒体であって、
    前記プロセッサが、１つ以上の細胞を含む生物学的標本の少なくとも１つの位相差画像を、前記生物学的標本の焦点面を中心とする少なくとも１つの明視野画像に基づいて生成することと、
    前記プロセッサが、前記少なくとも１つの位相差画像に基づいて、バイナリ画像の形式でコンフルエンスマスクを生成することと、
    前記プロセッサが、前記焦点面の上方の合焦外れ距離における、前記生物学的標本内の１つ以上の細胞の第１の明視野画像、および前記焦点面の下方の前記合焦外れ距離における、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の第２の明視野画像を受信することと、
    前記プロセッサが、前記第１の明視野画像および前記第２の明視野画像に基づいて、前記１つ以上の細胞の細胞画像を生成することと、
    前記プロセッサが、前記細胞画像および前記少なくとも１つの位相差画像に基づいてシードマスクを生成することと、
    前記プロセッサが、前記シードマスクおよび前記コンフルエンスマスクに基づいて、細胞別セグメンテーションマスクを示す、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の画像を生成することと、を含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
17. 前記プロセッサが、少なくとも１つの蛍光画像を受信することと、
    前記プロセッサが、前記細胞別セグメンテーションマスク内の前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の蛍光強度を計算することと、をさらに含む、請求項１６に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
18. 前記プロセッサが、前記細胞画像および前記少なくとも１つの位相差画像に基づいて、前記シードマスクを生成することは、
    前記プロセッサが、閾値ピクセル強度以上の各ピクセルが細胞シードピクセルとして特定されるように前記細胞画像を修正することを含み、これにより、バイナリピクセル化された前記シードマスクがもたらされる、請求項１６または１７に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
19. 前記シードマスクは、各々が単一のセルに対応する複数のシードを有し、前記非一時的コンピュータ可読媒体は、
    前記プロセッサが、前記細胞別セグメンテーションマスクを示す、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の前記画像を生成する前に、前記プロセッサが、前記シードマスクと前記コンフルエンスマスクとを比較し、前記コンフルエンスマスクのエリアに配置されていない１つ以上の領域を前記シードマスクから除外し、前記シードマスクの前記複数のシードのうちの１つを含まない１つ以上の領域を前記コンフルエンスマスクから除外することをさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
20. 前記プロセッサが、前記シードマスクおよび前記コンフルエンスマスクに基づいて、前記細胞別セグメンテーションマスクを示す、前記生物学的標本内の前記１つ以上の細胞の前記画像を生成することは、
    前記プロセッサが、シードのアクティブセットのうちの各々に対して領域成長反復を行うことと、
    前記プロセッサが、所与のシードの成長領域が前記コンフルエンスマスクの１つ以上の境界に到達するか、または別のシードの成長領域とオーバーラップするまで、シードの前記アクティブセット内の各シードに対して前記領域成長反復を繰り返すことと、を含む、
    請求項１６～１９のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
21. 前記プロセッサが、ユーザ入力に応答して１つ以上のフィルタを適用して、１つ以上の細胞テクスチャメトリックおよび細胞形状記述子に基づいて物体を除去することと、
    前記プロセッサが、前記１つ以上のフィルタの適用に応答して、前記細胞別セグメンテーションマスクを示す前記生物学的標本の前記画像を修正することと、をさらに含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。