KR20230096955A

KR20230096955A - 분리 장치 및 분리 방법

Info

Publication number: KR20230096955A
Application number: KR1020237000065A
Authority: KR
Inventors: 위초우 천
Original assignee: 센젠 후이신 라이프 테크놀로지스 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2023-06-30
Also published as: WO2022099518A1; JP7397529B2; JP2023506110A; CN113195080A; EP4246118A1; US20220146384A1

Abstract

분리 장치는 분리 칩 조립체, 진공 시스템, 주파수 변환 모듈, 제어기를 포함한다. 분리 칩 조립체는 분리 칩, 제1 진동자 및 제2 진동자를 포함하고, 분리 칩은 샘플 셀과 샘플 셀의 대향하는 양측에 위치하는 제1 여과막과 제2 여과막 및 제1 챔버와 제2 챔버를 포함한다. 제1 진동자는 제1 여과막과 제2 여과막에 고정되고, 제2 진동자는 제1 챔버와 제2 챔버의 외면에 고정된다. 주파수 변환 모듈은 진공 시스템을 제어하여 제1 챔버와 제2 챔버에 교대로 음압을 발생시키도록 한다. 제어기는, 진공 시스템이 제1 챔버에서의 음압 발생을 중지하면, 제1 진동자와 제2 진동자의 진동을 제어하고, 진공 시스템이 제2 챔버에서의 음압 발생을 중지하면, 제1 진동자와 제2 진동자의 진동을 제어한다. 본 발명은 분리 방법도 제공한다.

Description

분리 장치 및 분리 방법

본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 액체 샘플에서 대상 입자를 분리하기 위한 분리 장치 및 분리 방법에 관한 것이다.

엑소좀(exosome)은 살아있는 세포에서 지속적으로 다량 분비되는 직경이 30∼150nm의 인지질 이중막 구조를 가진 작은 베지클(vesicle, 소낭)로, 세포간 통신 교류의 운반체로서 모세포의 단백질, 핵산 및 대사성 소분자와 같은 특정 성분을 운반한다. 수많은 연구에 따르면 엑소좀은 면역 탈출, 혈관 형성(angiogenesis, 혈관 신생), 종양 전이 및 종양 내성을 포함하는 종양 진행의 다양한 사건에 관여하고 있다는 것이 밝혀져 있다. 엑소좀은 암세포에서 조기에 지속적으로 방출되어 환자의 혈액 순환계에 들어갈 수 있으며, 지질 이중막 구조는 운반된 단백질과 캡슐화된 핵산류 물질을 효과적으로 보호할 수 있다. 엑소좀은 혈액, 소변, 복수, 조직액, 눈물, 타액 및 뇌척수액을 포함한 다양한 임상 시료에 광범위하게 안정적으로 존재한다. 그 중 혈액과 소변의 엑소좀 수가 많아 임상 샘플링이 용이하다. 따라서 엑소좀은 체외 진단 연구 및 종양 임상 시험 분야의 핵심 연구 대상으로 여겨지고 있으며, 조기 종양 진단, 종양 전이 및 재발 평가, 종양 이질성 평가, 종양 발생 진행 및 치료 효과의 동태적 검출, 약물 내성 돌연변이 검출, 개인 맞춤 투약 등에서 임상적 가치가 커질 것으로 기대되고 있다.

현재, 엑소좀의 임상적 응용을 위한 주요 장애 요인은, 분리과정에서 여과막의 막힘 현상이 발생하여 유량이 낮고 순도가 낮다는 것이다.

이를 고려하여 상술한 문제점을 해결할 수 있는 분리 장치 및 분리 방법을 제공할 필요가 있다.

본 발명은 액체 샘플로부터 대상 입자를 분리 및 정제하기 위한 분리 장치를 제공한다. 상기 분리 장치는, 분리 칩 조립체, 진공 시스템, 주파수 변환 모듈, 제어기를 포함하며,

상기 분리 칩 조립체는 분리 칩, 제1 진동자 및 제2 진동자를 포함하고, 상기 분리 칩은 샘플 셀과 상기 샘플 셀의 대향하는 양측에 위치하는 제1 여과막과 제2 여과막을 포함하며, 상기 제1 여과막과 제2 여과막의 공경은 모두 상기 대상 입자의 입경보다 작고, 상기 분리 칩은 제1 챔버와 제2 챔버를 포함하며, 상기 제1 챔버는 상기 제1 여과막을 통하여 상기 샘플 셀과 연통되고, 상기 제2 챔버는 상기 제2 여과막를 통하여 상기 샘플 셀과 연통되며, 상기 제1 진동자는 상기 제1 여과막과 상기 제2 여과막에 고정되고, 상기 제2 진동자는 상기 제1 챔버의 외면 및 상기 제2 챔버의 외면에 고정되며,

상기 주파수 변환 모듈은 상기 진공 시스템을 통하여 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버에 각각 연결되고, 상기 주파수 변환 모듈은 상기 진공 시스템을 제어하여 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버에 교대로 음압을 발생시키며,

상기 제어기는, 상기 진공 시스템이 상기 제1 챔버에서의 음압 발생을 중지하면, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하고, 상기 진공 시스템이 상기 제2 챔버에서의 음압 발생을 중지하면, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하되, 상기 제1 진동자 및 상기 제2 진동자는 각각 진동 시에 제1 진동파 및 제2 진동파를 발생시키며, 상기 제1 진동파의 주파수는 상기 제2 진동파의 주파수보다 크고, 상기 제1 진동파의 진폭은 상기 제2 진동파의 진폭보다 작다.

일부 가능한 구현 예에서, 상기 제1 진동파의 진동 주파수는 5000Hz∼8000Hz이고, 상기 제2 진동파의 진동 주파수는 100∼500Hz이다.

일부 가능한 구현 예에서, 상기 제1 진동파의 진동 주파수는 상기 제1 여과막 또는 상기 제2 여과막의 공진 주파수와 같다.

일부 가능한 구현 예에서, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자는 동일한 수평면에 위치한다.

일부 가능한 구현 예에서, 상기 제1 진동자는 고조파 발진기이고, 상기 제2 진동자는 진동 모터이다.

또한, 본 발명은 액체 샘플로부터 대상 입자를 분리 및 정제하기 위한 분리 방법을 제공한다. 상기 분리 방법은,

상기 분리 장치를 제공하여 액체 샘플을 상기 샘플 셀에 제공하는 단계;

상기 제1 챔버에서 음압을 발생시켜, 상기 샘플 셀 내의 액체 샘플 중에서 입경이 상기 제1 여과막의 공경보다 작은 성분이 음압의 작용 하에 상기 제1 챔버에 들어가도록 하는 단계;

상기 제1 챔버에서의 음압 발생을 중지하고, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하는 단계;

상기 제2 챔버에서 음압을 발생시켜, 상기 샘플 셀 내의 액체 샘플 중에서 입경이 상기 제2 여과막의 공경보다 작은 성분이 음압의 작용 하에 상기 제2 챔버에 들어가도록 하는 단계;

상기 제2 챔버에서의 음압 발생을 중지하고, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하는 단계를 포함하되,

상기 제1 진동자 및 상기 제2 진동자는 각각 진동 시에 제1 진동파 및 제2 진동파를 발생시키며, 상기 제1 진동파의 주파수는 상기 제2 진동파의 주파수보다 크고, 상기 제1 진동파의 진폭은 상기 제2 진동파의 진폭보다 작다.

본 발명은, 종래기술에 비해, 진공 시스템이 제1 챔버/제2 챔버에서의 음압의 발생을 중지하면, 제1 진동자와 제2 진동자의 진동을 제어하고, 제1 진동자가 제1 여과막과 제2 여과막에 제1 진동파를 전달하여 여과막의 막공(膜孔)에 흡착된 대상 입자가 여과막의 막공으로부터 신속하게 분리되어 되돌아오는 액체 샘플에 다시 현탁될 수 있도록 하며, 제2 진동자에서 생성된 제2 진동파와 제1 진동파가 함께 액체 샘플과 여과막을 교란시켜 음향 흐름이 발생하도록 하여, 대상 입자가 막공을 막거나 한 곳에 집적되는 것을 방지하고, 효율적인 분리가 이루어지도록 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 의해 제공되는 분리 칩 조립체의 개략적인 구조도이다.
도 2는 도 1에 도시된 분리 칩 조립체에 음압을 인가하는 개략도이다.
도 3은 도 1에 도시된 분리 칩 조립체에 제1 진동파와 제2 진동파를 인가하는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 의해 제공되는 분리 장치의 기능 모듈의 개략도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 및 비교예 1∼4에서 얻어진 엑소좀 함량의 시간에 따른 변화 경향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시에에서 얻은 엑소좀의 주사형 전자현미경 사진이다.
도 7은 본 발명을 적용하여 엑소좀의 체적 및 농도가 다른 소변 샘플을 분리 정제한 후 얻어진 엑소좀 함량의 시험도이다.
도 8은 본 발명을 적용하여 다양한 액체 샘플을 분리 정제한 후 얻어진 엑소좀 함량의 시험도이다.
도 9는 본 발명의 실시예 5 및 비교예 5에서 얻은 엑소좀에 대해 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 행해 얻은 도표이다.
도 10은 본 발명의 실시예와 비교예 5의 정제 시간, 엑소좀 생산량 및 엑소좀 농도의 3차원 비교 개략도이다.

이하, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서, 본 발명에 대하여 상기 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

본 발명의 기술 솔루션은 본 발명의 바람직한 실시방식 및 실시예를 참조하여 이하에서 상세하게 설명될 것이다. 요소가 다른 요소에 "연결된" 것으로 언급될 때 다른 요소에 직접 연결되거나 중간 요소가 동시에 존재할 수 있다. 요소가 다른 요소에 "배치" 또는 "설치" 또는 "제공"된 것으로 간주되는 경우, 다른 요소에 직접 배치되거나 중간에 있는 요소가 동시에 존재할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 본 발명의 설명에 사용된 요소 또는 설비의 명칭은 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며 본 발명의 실시예를 제한하려는 의도는 아니다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예는 특정 크기의 대상 입자(target particle)를 얻기 위해 액체 샘플에서 다양한 크기의 입자를 분리 및 정제하는데 사용되는 분리 칩 조립체(1)를 제공한다. 상기 액체 샘플은 인간 혈장, 혈청, 뇌척수액, 타액, 소변 및 위액 등일 수 있다. 대상 입자는 엠소좀 또는 순환 종양 세포 등일 수 있다. 분리 칩 조립체(1)는 분리 칩(10), 제1 진동자(20) 및 제2 진동자(30)를 포함한다.

분리 칩(10)은 샘플 셀(13)과 샘플 셀(13)의 대향하는 양측에 위치하는 제1 여과막(14)과 제2 여과막(16)을 포함한다. 샘플 셀(13)은 액체 샘플을 보관하는 데 사용된다. 제1 여과막(14)과 제2 여과막(16)의 공경(孔徑, 구멍의 직경)은 대상 입자의 입경(粒徑, 입자의 직경)보다 작다.

또한, 분리 칩(10)은 제1 챔버(15)와 제2 챔버(17)를 포함하고, 제1 챔버(15)는 제1 여과막(14)을 통하여 샘플 셀(13)과 연통하며, 제1 챔버(15)에는 제1 개구부(152)가 제공되고, 제1 개구부(152)는 제1 챔버(15)와 외부 환경을 연통한다. 제2 챔버(17)는 제2 여과막(16)을 통해 샘플 셀(13)과 연통하고, 제2 챔버(17)에는 제2 개구부(172)가 제공되며, 제2 개구부(172)는 제2 챔버(17)와 외부 환경을 연통한다. 여기서, 제1 챔버(15) 및 제2 챔버(17)는 각각 샘플 셀(13)의 서로 마주보는 양측에 위치한다.

분리 칩(1)을 사용할 때, 샘플 셀(13)에 액체 샘플을 첨가하고, 제1 개구부(152) 및 제2 개구부(172)는 각각 진공 시스템(50)에 연결된다(도 4 참조). 진공 시스템(50)이 제1 개구부(152)를 통해 제1 챔버(15)의 공기를 흡입할 때, 제1 챔버(15)에 음압이 발생된다. 제1 챔버(15)의 음압의 작용 하에, 샘플 셀(13) 내의 액체 샘플 중에서 크기가 제1 여과막(14)의 여과 공경(기공 크기)보다 작은 성분(작은 입자와 액체 성분을 포함)이 제1 여과막(14)을 향하여 이동하며, 제1 여과막(14)을 통해 제1 챔버(15)로 흐른다. 진공 시스템(50)이 제2 개구부(172)를 통해 제2 챔버(17)의 공기를 흡입할 때, 제2 챔버(17)에 음압이 발생된다. 제2 챔버(17)의 음압의 작용 하에, 샘플 셀(13) 내의 액체 샘플 중에서 크기가 제2 여과막(16)의 여과 공경보다 작은 성분이 제2 여과막(16)을 향하여 이동하고, 제2 여과막(16)을 통해 제2 챔버(17)로 흐르며, 동시에 샘플 셀(13)의 액체 샘플은 제1 여과막(17)에서 역류 현상(back flow)을 발생시켜, 제1 여과막(14)에 부착된 성분을 줄이거나 제거하여 여과 및 분리 과정에서 여과막이 막히는 것을 방지한다. 제1 챔버(15) 및 제2 챔버(17)에서 반복적으로 교대로 음압을 발생시켜, 액체 샘플이 제1 여과막(14) 및 제2 여과막(16)을 교대로 반복적으로 효과적으로 흐르게 할 수 있으므로, 액체 샘플의 크기가 제1 여과막(14) 및 제2 여과막(16)의 공경보다 큰 성분(즉 대상 입자)이 샘플 셀(13)에 남아 있게 된다. 분리 칩(10)의 구조 설계는, 반복적으로 교체되는 음압 변화에 의해, 제1 여과막(14) 및 제2 여과막(16)의 표면에 흡착된 성분이 여과막의 표면으로부터 쉽게 떨어지도록 하여, 여과막의 막공이 막히는 것을 효과적으로 방지할 수 있다.

도 2를 참조하면, 일 실시예에서, 진공 시스템(50)은 제1 챔버(15) 및 제2 챔버(17)에 음압(Negative pressure, NP)을 교대로 발생시켜 주기적 사다리꼴 펄스 신호를 형성한다. 사다리꼴 펄스 신호의 폭은 10Vpp이며, 주파수는 5000Hz∼ 7000Hz이다. 여기서, 사다리꼴 펄스 신호는 음압 방향이 갑자기 변화하여 제1 여과막(14)과 제2 여과막(16)을 손상시키는 것을 방지한다. 일 실시예에서, 혈장 샘플에 단백질이 많은 것을 감안하여, 여과막의 막힘을 더 방지하기 위해 챔버 중 하나에서 음압을 발생시키고 다른 챔버에서 양압(Air pressure, AP)을 발생시키도록 함으로써, 여과막에서의 역류 현상을 강화할 수 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, 제1 진동자(20)의 수량은 2개이다. 하나의 제1 진동자(20)는 제1 여과막(14)의 제2 여과막(16)으로부터 멀리 떨어져 있는 표면에 고정된다. 다른 하나의 제1 진동자(20)는 제2 여과막(16)의 제1 여과막(16)으로부터 멀리 떨어져 있는 표면에 고정된다. 제1 진동자(20)는 진동 시에 가로 방향의 제1 진동파를 발생시켜 이 제1 진동파를 제1 여과막(14)과 제2 여과막(16)에 전달하고, 그에 따라 제1 여과막(14)과 제2 여과막(16)에서 고주파 진동을 일으키도록 한다. 따라서, 여과막의 막공에 흡착된 대상 입자가 신속하게 여과막의 막공으로부터 분리되어, 역류하는 액체 샘플에 다시 현탁될 수 있도록 함으로써, 여과막의 막공이 막히는 것을 방지하고, 효율적인 분리가 이루어지도록 할 수 있다.

제2 진동자(30)의 수량은 2개이다. 하나의 제2 진동자(30)는 제1 챔버(15)의 외면에 고정된다. 다른 하나의 제2 진동자(30)는 제2 챔버(17)의 외면에 고정된다. 제2 진동자(30)는 진동 시에 가로 방향의 제2 진동파를 발생시킨다. 도 3을 참조하면, 제1 진동파의 주파수는 제2 진동파의 주파수보다 크고, 제1 진동파의 진폭은 제2 진동파의 진폭보다 작다. 제2 진동파는 제1 챔버(15)와 제2 챔버(17)를 통해 전체 분리 칩(10)에 전달되어 분리 칩(10)을 저주파 진동시킨다. 제2 진동파는 제1 진동파와 함께 액체 샘플과 여과막을 교란시켜 음향 흐름(acoustic streaming)이 발생되도록 함으로써, 대상 입자가 막공을 막거나 집적되는 것을 방지하고, 분리 정제 효율을 높일 수 있다. 일 실시예에서, 제1 진동자(20)는 고조파 발진기이고, 제2 진동자(30)는 진동 모터이다.

일 실시예에서, 제1 진동파의 진동 주파수는 5000Hz∼8000Hz이고, 제2 진동파의 진동 주파수는 100∼500Hz이다. 이 진동 주파수에서는 제1 진동파와 제2 진동파 모두가 대상 입자에 손상을 주지 않는다. 바람직하게는, 제1 진동파의 진동 주파수는 제1 여과막(14) 또는 제2 여과막(16)의 공진 주파수와 같은바, 이때 제1 여과막(14) 또는 제2 여과막(16)은 더 큰 진폭으로 진동하여 여과막에 흡착된 대상 입자를 더 빠르게 분리할 수 있다.

일 실시예에서, 제1 진동자(20)와 제2 진동자(30)는 동일한 수평면에 위치한다. 즉, 제1 진동파와 제2 진동파가 같은 방향을 향하도록 함으로써, 제1 진동파와 제2 진동파가 서로 중첩되어 협동 진동을 이루도록 할 수 있다.

일 실시예에서, 분리 칩(10)은 제1 측면 커버(11) 및 제2 측면 커버(12)를 포함한다. 제1 측면 커버(11)는, 제1 커버 본체(110)와, 제1 커버 본체(110)의 양측에 위치하는 제1 가림 판(111) 및 제2 가림 판(112)을 포함하며, 제1 여과막(14)은 제1 가림 판(111)과 제2 가림 판(112) 사이에 고정되고 또한 제1 커버 본체(110)와 마주하고 있다. 제1 커버 본체(110), 제1 가림 판(111), 제2 가림 판(112) 및 제1 여과막(14)은 함께 제1 챔버(15)를 형성한다. 제2 측면 커버(12)는, 제2 커버 본체(120)와, 제2 커버 본체(120)의 양측에 위치하는 제3 가림 판(121)과 제4 가림 판(122)을 포함하며, 제3 가림 판(121)은 제1 가림 판(111)과 마주하고 있고, 제4 가림 판(122)은 제2 가림 판(112)과 마주하고 있다. 제2 여과막(16)은 제3 가림 판(121)과 제4 가림 판(122) 사이에 고정되고 또한 제2 커버 본체(120)와 마주하고 있으며, 제2 커버 본체(120), 제3 가림 판(121), 제4 가림 판(122) 및 제2 여과막(16)은 함께 제2 챔버(17)를 형성한다. 샘플 셀(13)은 제1 여과막(14)과 제2 여과막(16) 사이에 위치한다. 여기서, 제2 진동자(30)는 제1 커버 본체(110) 또는 제2 커버 본체(120)의 외면에 고정된다.

또한, 제1 가림 판(111)과 제3 가림 판(121)은 샘플 셀(13)과 연결된 샘플 첨가 구멍(131)을 제한하기 위해 서로 간격을 두고 배치되어 있다. 분리 칩(10)에는 샘플 첨가실(18)이 더 포함되어 있으며, 샘플 첨가실(18)과 샘플 셀(13)은 샘플 첨가 구멍(131)을 통해 연결되어 있다. 조작 시에, 액체 샘플을 샘플 첨가실(18)에 넣고, 샘플 첨가 구멍(131)은 샘플 첨가실(18) 내의 액체 샘플이 샘플 첨가실(18) 밖으로 유출되어 샘플 셀(13)로 들어가도록 한다.

도 4를 참조하면, 본 발명의 실시예에서 분리 칩 조립체(1), 진공 시스템(50), 주파수 변환 모듈(40), 제어기(60)를 포함하는 분리 장치(100)를 제공한다.

진공 시스템(50)은 분리 칩(1)의 제1 챔버(15) 및 제2 챔버(17)에서 각각 음압을 발생시키도록 한다. 진공 시스템(50)은 2개의 독립적인 진공 시스템일 수 있거나 설계된 진공 시스템일 수 있다. 진공 시스템(50)은 또한 마이크로 진공 펌프 또는 마이크로 흡입 펌프와 같은 장치를 포함할 수 있다. 진공 시스템(50)과 분리 칩(10)은 기밀성이 높은 파이프에 의해 연결될 수 있음을 이해할 수 있다. 일 실시예에서, 진공 시스템(50)은 제1 진공 펌프(510)와 제2 진공 펌프(520)를 포함하며, 제1 진공 펌프(510)와 분리 칩(10)의 제1 개구부(152)가 서로 연결되고, 제2 진공 펌프(310)와 분리 칩(10)의 제2 개구부(172)가 서로 연결되어 있다.

주파수 변환 모듈(40)은 진공 시스템(50)과 전기적으로 연결되고, 주파수 변환 모듈(40)은 진공 시스템(50)에 공급되는 전원 전압을 제어하여 제1 챔버(15)와 제2 챔버(17)에서 음압이 교대로 발생되도록 한다. 일 실시예에서, 주파수 변환 모듈(40)은 주파수 변환기(410) 및 주파수 변환기(410)에 연결된 제어 밸브(420)를 포함한다. 제어 밸브(420)는 솔레노이드 밸브 및 로터리 밸브를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 액체 회로 변환기일 수도 있다. 제2 제어 밸브(420)는 제1 진공 펌프(510) 및 제2 진공 펌프(520) 중 어느 하나와 각각 연통되어, 제1 진공 펌프(510) 및 제2 진공 펌프(520)가 교대로 반복적으로 작동하도록 한다. 예를 들어, 제어 밸브(420)는 제1 진공 펌프(510)에 연통되어, 주파수 변환기(410)가 제1 진공 펌프(510)의 작동을 제어하도록 함으로써, 제1 개구부(152)를 통해 공기를 흡입하여 제1 챔버(15)에 음압이 발생되도록 한다. 샘플 셀(13) 내의 액체 샘플 중에서 입경이 제1 여과막(14)의 공경보다 작은 성분은 음압의 작용 하에 제1 여과막(14)을 통과하여 제1 챔버(15)로 진입한다. 다음에, 주파수 변환기(410)는 제1 진공 펌프(510)가 작동을 중지하도록 제어한다. 그 후, 제어 밸브(420)가 제2 진공 펌프(520)와 연통하도록 전환되고, 주파수 변환기(410)는 제2 진공 펌프(520)가 작동하도록 제어함으로써, 제2 개구부(172)를 통해 공기를 흡입하여 제2 챔버(17)에 음압을 발생시키도록 한다. 샘플 셀(13) 내의 액체 샘플 중에서 입경이 제2 여과막(16)의 공경보다 작은 성분은, 음압의 작용 하에 제2 여과막(16)을 통과하여 제2 챔버(18)로 진입한다. 그 다음에, 주파수 변환기(420)는 제2 진공 펌프(520)가 중지하도록 제어한다. 그 후, 상기 단계를 여러번 반복한다.

제1 챔버(15)에서 공기 흡입이 중지되면, 제어기(60)는 제1 진동자(20)와 제2 진동자(30)의 진동을 제어하여 각각 제1 진동파와 제2 진동파를 발생시킨다. 제2 챔버(17)에서 공기 흡입이 중지되면, 제어기(60)는 제1 진동자(20)와 제2 진동자(30)의 진동을 제어하여 각각 제1 진동파와 제2 진동파를 발생시킨다. 이 때, 제어기(60)는 제1 진공 펌프(510) 및 제2 진공 펌프(520)와 전기적으로 연결될 수 있는바, 제1 진공 펌프(510) 또는 제2 진공 펌프(520)가 작동을 중지하면, 제어기(60)는 제1 진공 펌프(510)가 제1 챔버(15)에서 흡입을 중지하였다고 판단하거나, 제2 진공 펌프(520)가 제2 챔버(17)에서 흡입을 중지하였다고 판단하고, 대응하는 제1 진동자(20)와 제2 진동자(30)에 대하여 진동을 시작하도록 통지할 수 있다.

본 발명의 실시예는 또한, 상술한 분리 칩 조립체(1)를 응용하여 액체 샘플에서 대상 입자를 분리하는 분리 방법을 제공하는바, 이 분리 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.

단계 1: 본 발명의 분리 칩 조립체(1)를 제공하고, 분리 칩 조립체(1)의 샘플 셀(13)에 액체 샘플을 제공한다.

단계 2: 제1 개구부(152)를 통해 제1 챔버(15)의 공기를 흡입하여 제1 챔버(15)에 음압을 발생시킨다.

여기서, 흡입을 수행하기 전에, 제1 개구부(152) 및 제2 개구부(172)는 각각 분리 장치(100)의 진공 시스템(50)에 연결된다. 이러한 방식으로, 진공 시스템(50)은 제1 개구부(152)를 통해 제1 챔버(15)의 공기를 흡입하여, 제1 챔버(15)에 음압을 발생시킨다. 샘플 셀(13) 내의 액체 샘플 중에서 입경이 제1 여과막(14)의 공경보다 작은 성분은, 음압의 작용 하에 제1 여과막(14)으로 이동하고, 제1 여과막(14)을 통해 제1 챔버(15)로 진입한다.

단계 3: 제1 챔버(15)의 공기 흡입을 중지하고, 제1 진동자(20)와 제2 진동자(30)의 진동을 제어하여, 각각 제1 진동파와 제2 진동파를 발생시킨다. 동시에, 제2 개구부(172)를 통해 제2 챔버(17)의 공기를 흡입하여, 제2 챔버(17)에 음압을 발생시킨다.

여기서, 제1 진동파는 제1 여과막(14)에서 고주파 진동을 일으켜 여과막의 막공에 흡착된 대상 입자가 신속하게 여과막의 막공으로부터 분리되어, 역류하는 액체 샘플에 다시 현탁될 수 있도록 한다. 제2 진동파는 대상 입자가 한 곳에 집적되는 것을 방지할 수 있다. 동시에, 진공 시스템(50)은 제2 개구부(172)를 통해 제2 챔버(17)의 공기를 흡입하여, 제2 챔버(17)에 음압을 발생시킨다. 제1 여과막(14)의 표면에 부착된 성분은 기류 및/또는 액체 흐름으로 인해 샘플 셀(13)로 다시 흐를 수 있고, 샘플 셀(13) 내의 액체 샘플 중에서 입경이 제2 여과막(16)의 공경보다 작은 성분은, 음압의 작용 하에 제2 여과막(16)으로 이동하여, 제2 여과막(16)을 통해 제2 챔버(17)로 진입한다.

단계 4: 제2 챔버(17)의 공기 흡입을 중지하고, 제1 진동자(20)와 제2 진동자(30)의 진동을 제어한다.

그 후, 단계 2∼5를 여러 번 반복하여 액체 샘플 중의 여과막 공경보다 작은 성분을 제거하고, 여과막 공경보다 큰 성분은 샘플 셀(13)에 포획함으로써, 더 나은 분리 및 정제 효과를 실현할 수 있다.

이하, 실시예와 비교예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하기로 한다.

실시예

본 발명에서 제공된 분리 칩 조립체를 이용하여 2 mL의 소변 샘플에 대해 엑소좀 분리 정제를 수행했다. 제1 진동자의 주파수는 6250Hz(여과막의 공진주파수와 대략 동일)이고, 제2 진동자의 주파수는 200Hz이었다.

비교예 1

분리 칩 조립체를 사용하여 2 mL의 소변 샘플에 대해 엑소좀 분리 정제를 수행했다. 실시예의 분리 칩 조립체와는 달리, 비교예1의 분리 칩에는 제1 진동자와 제2 진동자는 포함되지 않았다.

비교예 2

분리 칩을 사용하여 2 mL의 소변 샘플에 대해 엑소좀 분리 정제를 수행했다. 실시예의 분리 칩 조립체와는 달리, 비교예2의 분리 칩에는 제2 진동자(주파수는 200Hz)만 포함되고, 제1 진동자는 포함되지 않았다.

비교예 3

분리 칩을 사용하여 2 mL의 소변 샘플에 대해 엑소좀 분리 정제를 수행했다. 실시예의 분리칩 조립체와는 달리, 비교예 3의 분리 칩에는 제1 진동자(주파수는 6250Hz)만 포함되고, 제2 진동자는 포함되지 않았다.

비교예 4

데드-엔드 필터(dead-end filtration)를 사용하여 2 mL의 소변 샘플에 대해 엑소좀 분리 정제를 수행했다. 데드-엔드 필터는 실시예의 분리칩과 동일한 여과막을 채택하며, 다른 점은 액체 샘플을 여과막의 상류에 위치시켜 압력 차이에 의해 액체 성분과 입경이 막공보다 작은 입자가 여과막을 투과하도록 하고 있는 점이다.

실시예 및 비교예 1∼4에서 얻은 엑소좀의 시간 경과에 따른 함량을 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예는 10분 이내에 거의 30μm에 달하는 엑소좀을 분리할 수 있고, 분리 효율은 비교예 1∼4에 비해 훨씬 높았다. 또한, 실시예에서 얻은 엑소좀을 투과형 전자현미경(눈금자 눈금은 250nm이다)으로 측정하였는바, 측정 결과는 도 6에 나타낸 바와 같았다. 이 때, 분리된 엑소좀의 입경은 50nm∼200nm으로, 엑소좀의 이론적인 입경과 일치하며, 모양은 원형 또는 컵모양으로 완성도가 높았다.

또한, 동일한 분리 칩 조립체를 사용하여 동일한 방법으로 서로 다른 엑소좀 농도를 가진 4가지의 소변 샘플에 대해 분리 정제를 수행하였는바, 각 소변 샘플의 체적는 1mL로부터 20mL까지 다양하였다. 다음에, 미량의 자외-가시광 분광 광도계를 사용하여 각각 분리하여 얻은 엑소좀에 대하여 단백질 함량을 검사한 결과는, 도 7에 나타낸 바와 같았다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 각각의 엑소좀 농도에서, 정제된 엑소좀 함유량은 소변 샘플의 체적 증가에 따라 양이 선형적으로 증가하는 추세를 보이고 있는바, 이는 다양한 체적의 소변 샘플이나 소변 샘플의 다양한 함량의 엑소좀을 테스트하는 경우에, 본 발명의 실시예의 분리 칩 조립체를 사용한 분리 정제는 모두 높은 구조적 안정성을 가지고 있다는 것을 나타낸다. 또한, 동일한 분리 칩 조립체를 사용하여 10mL 체적의 소변 샘플을 분리 정제한 결과는, 20회 반복한 결과 얻어진 엑소좀 함량 간의 변동계수(CV)가 9.9% 미만인바, 이는 분리 칩 조립체를 이용한 분리 정제가 높은 반복성을 가지고 있음을 나타낸다.

또한, 본 발명에 제공된 분리 칩 조립체를 이용하여 다른 액체 샘플에 대해서도 엑소좀 분리 정제를 수행할 수 있는바, 혈장(plasma), 세포 배양액(culture medium), 눈물(tear), 타액(saliva), 뇌척수액(CSF) 등이 포함된다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 이들 액체 샘플로부터 고농도의 엑소좀이 분리되었는데, 이는 본 발명에서 제공되는 분리 칩 조립체가 다양한 액체 샘플의 분리 및 정제에 적합함을 나타낸다. 또한, 분리된 엑소좀의 입자 크기도 50 nm 내지 200 nm 범위에 있다.

비교예 5

동일한 소변 샘플에서 각각 종래의 초원심분리(UC), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)침전, 포스파티딜세린(PS) 친화성, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 막 친화성(MA)등 방법을 사용하여 엑소좀을 분리했다.

구체적으로는, 웨스턴 블롯 방법을 사용하여, 실시예와 비교예 5의 각 분리 정제 방법으로 얻은 엑소좀 중 ALIX, CD63, TSG101, CD81 단백질 표지물에 대해 측정했다. 이 중 유로모듈린(Uromodulin, UMOD)은 소변 샘플에 많이 들어 있는 단백질로, 엑소좀을 정제한 후 순도를 평가하는 데 사용할 수 있다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 종래의 분리 정제 방법과 비교하면, 본 발명의 분리 칩 조립체(도 9에서 EXODUS로 표기)를 이용하여 소변 샘플을 분리 정제하여 얻은 엑소좀에서는, 비교적 높은 농도의 4가지 단백질 표지물을 동시에 검출할 수 있으며, 정제 생산량이 비교적 높다는 것을 나타낸다. 또한, 엑소좀에는 대량의 유로모듈린이 부착되어 있지 않으며, 이는 정제 정밀도가 비교적 높다는 것을 나타낸다.

그 중 정제 소요시간, 엑소좀 생산량, 엑소좀 순도는 서로 다른 분리 정제 방법을 평가하는 데 사용되는 3차원의 매개변수이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 비교예 5의 다양한 종래 분리 정제 방법과 비교할 때, 실시예의 분리 칩 조립체(도 10에서 EXODUS로 표기)는 분리 정제 소요 시간이 짧고(95% 감소), 엑소좀 생산량이 높으며(526% 향상), 엑소좀 순도가 비교적 높다(259% 향상). 이는 분리 칩 조립체가 시판중인 각종 엑소좀 분리수단에 비해 경쟁력이 높다는 것을 의미한다.

상기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예이지만, 본 발명의 실시예는 상기 실시예에 의해 제한되지 않으며, 상기 실시예는 청구범위를 설명하기 위한 것일 뿐이다. 그러나, 본 발명의 보호 범위가 명세서에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 기술적 범위 내에서 당업자가 용이하게 생각할 수 있는 모든 변경 또는 대체는 본 발명의 보호 범위에 포함되는 것이다.

분리 칩 조립체 1
분리 칩 10
제1 측면 커버 11
제2 측면 커버 12
샘플 셀 13
제1 여과막 14
제1 챔버 15
제2 여과막 16
제2 챔버 17
샘플 첨가실 18
제1 진동자 20
제2 진동자 30
주파수 변환 모듈 40
진공 시스템 50
제어기 60
분리 장치 100
제1 커버 본체 110
제1 가림 판 111
제2 가림 판 112
제2 커버 본체 120
제3 가림 판 121
제4 가림 판 122
샘플 첨가 구멍 131
제1 개구부 152
제2 개구부 172
주파수 변환기 410
제어 밸브 420
제1 진공 펌프 510
제2 진공 펌프 520

Claims

액체 샘플로부터 대상 입자를 분리 및 정제하기 위한 분리 장치로서, 상기 분리 장치는 분리 칩 조립체, 진공 시스템, 주파수 변환 모듈, 제어기를 포함하며,
상기 분리 칩 조립체는 분리 칩, 제1 진동자 및 제2 진동자를 포함하고, 상기 분리 칩은 샘플 셀과 상기 샘플 셀의 대향하는 양측에 위치하는 제1 여과막과 제2 여과막을 포함하며, 상기 제1 여과막과 제2 여과막의 공경은 모두 상기 대상 입자의 입경보다 작고, 상기 분리 칩은 제1 챔버와 제2 챔버를 포함하며, 상기 제1 챔버는 상기 제1 여과막을 통하여 상기 샘플 셀과 연통되고, 상기 제2 챔버는 상기 제2 여과막를 통하여 상기 샘플 셀과 연통되며, 상기 제1 진동자는 상기 제1 여과막과 상기 제2 여과막에 고정되고, 상기 제2 진동자는 상기 제1 챔버의 외면 및 상기 제2 챔버의 외면에 고정되며,
상기 주파수 변환 모듈은 상기 진공 시스템을 통하여 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버에 각각 연결되고, 상기 주파수 변환 모듈은 상기 진공 시스템을 제어하여 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버에 교대로 음압을 발생시키며,
상기 제어기는, 상기 진공 시스템이 상기 제1 챔버에서의 음압 발생을 중지하면, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하고, 상기 진공 시스템이 상기 제2 챔버에서의 음압 발생을 중지하면, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하되, 상기 제1 진동자 및 상기 제2 진동자는 각각 진동 시에 제1 진동파 및 제2 진동파를 발생시키며, 상기 제1 진동파의 주파수는 상기 제2 진동파의 주파수보다 크고, 상기 제1 진동파의 진폭은 상기 제2 진동파의 진폭보다 작은 것을 특징으로 하는 분리 장치.
제1항에 있어서,
상기 제1 진동파의 진동 주파수는 5000Hz∼8000Hz이고, 상기 제2 진동파의 진동 주파수는 100∼500Hz인 것을 특징으로 하는 분리 장치.
제2항에 있어서,
상기 제1 진동파의 진동 주파수는 상기 제1 여과막 또는 상기 제2 여과막의 공진 주파수와 같은 것을 특징으로 하는 분리 장치.
제1항에 있어서,
상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자는 동일한 수평면에 위치하는 것을 특징으로 하는 분리 장치.
제1항에 있어서,
상기 제1 진동자는 고조파 발진기이고, 상기 제2 진동자는 진동 모터인 것을 특징으로 하는 분리 장치.
액체 샘플로부터 대상 입자를 분리 및 정제하기 위한 분리 방법으로서,
청구항 제1항에 기재된 상기 분리 장치를 제공하여 액체 샘플을 상기 샘플 셀에 제공하는 단계;
상기 제1 챔버에서 음압을 발생시켜, 상기 샘플 셀 내의 액체 샘플 중에서 입경이 상기 제1 여과막의 공경보다 작은 성분이 음압의 작용 하에 상기 제1 챔버에 들어가도록 하는 단계;
상기 제1 챔버에서의 음압 발생을 중지하고, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하는 단계;
상기 제2 챔버에서 음압을 발생시켜, 상기 샘플 셀 내의 액체 샘플 중에서 입경이 상기 제2 여과막의 공경보다 작은 성분이 음압의 작용 하에 상기 제2 챔버에 들어가도록 하는 단계;
상기 제2 챔버에서의 음압 발생을 중지하고, 상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자의 진동을 제어하는 단계를 포함하되,
상기 제1 진동자 및 상기 제2 진동자는 각각 진동 시에 제1 진동파 및 제2 진동파를 발생시키며, 상기 제1 진동파의 주파수는 상기 제2 진동파의 주파수보다 크고, 상기 제1 진동파의 진폭은 상기 제2 진동파의 진폭보다 작은 것을 특징으로 하는 분리 방법.
제6항에 있어서,
상기 제1 진동파의 진동 주파수는 5000Hz∼8000Hz이고, 상기 제2 진동파의 진동 주파수는 100∼500Hz인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
제7항에 있어서,
상기 제1 진동파의 진동 주파수는 상기 제1 여과막 또는 상기 제2 여과막의 공진 주파수와 같은 것을 특징으로 하는 분리 방법.
제6항에 있어서,
상기 제1 진동자와 상기 제2 진동자는 동일한 수평면에 위치하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
제6항에 있어서,
상기 제1 진동자는 고조파 발진기이고, 상기 제2 진동자는 진동 모터인 것을 특징으로 하는 분리 방법.