KR20230082628A

KR20230082628A - 인터루킨 1 알파에 특이적인 실제 인간 항체

Info

Publication number: KR20230082628A
Application number: KR1020237012354A
Authority: KR
Inventors: 존 시마드; 수쉬마 시바스와미; 갈리나 쿠즈미체바
Original assignee: 엑스바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2020-10-07
Filing date: 2021-10-04
Publication date: 2023-06-08
Also published as: AU2021356341A9; CA3196189A1; CN116406376A; AU2021356341A1; US20230287103A1; MX2023004002A; IL301887A; CA3095679A1; JP2023545005A; EP4225369A1; WO2022073104A1

Abstract

완전 인간 단일클론 항체(fully human monoclonal Ab)는 (i) IL-1α에 대해 매우 높은 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 항원-결합 가변 영역(antigen-binding variable region) 및 (ii) C1q 결합, 및 수 개의 상이한 Fc 수용체에 대한 결합을 통해 보체계(complement system)를 둘 다 활성화시키는데 효과적인 불변 영역(constant region)을 포함한다.

Description

인터루킨 1 알파(IL-1α)에 특이적인 실제 인간 항체

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2020년 10월 7일자로 출원된 캐나다 특허 출원 제 3,095,679호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.

연방 지원 연구에 관한 진술

해당 사항 없음

본 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 면역학 및 항체(Ab)의 분야에 관한 것이다.

배경

IL-1α는 염증(inflammation), 면역 반응, 종양 전이(tumor metastasis), 및 조혈(hematopoiesis)을 포함하는 다수의 다양한 활동(activity)에서 역할을 하는 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)이다. IL-1α에 대한 IgG 자가항체(autoantibody)는 일반적인 인간 집단(human population)에서 자연적으로 발생하고, 무균성 염증(sterile inflammation)을 포함하는 다수의 다양한 질병에 유익할 것으로 고려된다.

요약

인간 IL-1α에 높은 친화성(affinity)으로 결합하는 단일클론 Ab(mAb)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역(light and heavy chain variable region)을 암호화(encoding)하는 아미노산 서열이 발견되었다. 따라서, (i) 인간 IL-1α에 대해 매우 높은 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 항원-결합 가변 영역(antigen-binding variable region) 및 (ii) 서열 번호 1(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열(amino acid sequence)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 2(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 정제된 인간 mAb가 본원에 기술되어 있다.

또한 IL-1α에 특이적으로 결합하는 인간 mAb의 중쇄를 암호화하는 제1 핵산, 및 인간 IL-1α에 특이적으로 결합하는 인간 mAb의 경쇄를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 단리된(isolated) 핵산의 세트가 본원에 기술되어 있다. 제1 핵산은 서열 번호 1(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화할 수 있고 제2 핵산은 서열 번호 2(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

또 다른 양태에서, 서열 번호 1(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 및 서열 번호 2(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 둘 다를 포함하는 발현 벡터(expression vector)가 본원에 기술되어 있다. 또한, 서열 번호 1(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화하는 제1 발현 벡터 및 서열 번호 2(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화하는 제2 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터의 세트가 본원에 기술되어 있다.

추가로, 서열 번호 1(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 및 서열 번호 2(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포(CHO 세포와 같은 포유동물 세포(mammalian cell))가 본원에 기술되어 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어는 본 발명이 속하는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 같이 동일한 의미를 가진다. 통상적으로 이해되는 생물학적 용어의 정의는 문헌: Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; 및 Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994에서 찾을 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 명사 앞의 단어 "하나(a 또는 an)"는 하나 이상의 특정 명사를 나타낸다. 예를 들어, 어구 "하나의 항체(an antibody)"는 "하나 이상의 항체"를 나타낸다.

"항체" 또는 "Ab" 라는 용어는 임의의 면역글로불린(immunoglobulin)(예를 들어, 인간, 설치류, 연골 어류, 또는 낙타과 항체), 또는 항원(예를 들어, 인간 IL-1α)에 특이적으로 결합하는 이의 접합체(conjugate)를 의미한다. 다양한 Ab는 당업자에게 공지되어 있다. Ab의 비-제한적 예는: 단일클론 Ab(예를 들어, 전장(full-length) Ab를 포함), 다중클론(polyclonal) Ab, 다중-특이적(multi-specific) Ab(예를 들어, 이중-특이적(bi-specific) Ab), 단일-쇄 Ab(예를 들어, 단일-도메인 Ab, 낙타과 Ab, 및 연골 어류 Ab), 키메릭(chimeric)(예를 들어, 인간화) Ab, 및 인간(즉, 실제 인간 Ab)에서 발견되거나 유도될 수 있는 것들을 포함하는 완전 인간 Ab를 포함한다. 용어 항체는 또한 Ab 접합체(예를 들어, 안정화(stabilizing) 단백질에 접합된 Ab, 표지(label), 또는 치료제(therapeutic agent)(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 치료제)를 포함한다.

"항원-결합 단편" 이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 가변 도메인[예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간, 마우스, 랫트(rat), 토끼, 또는 염소) 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린의 가변 도메인, 낙타과 가변 항원-결합 도메인(VHH), 또는 연골 어류 면역글로불린의 새로운 항원 수용체(Ig-NAR) 도메인]을 함유하는 전장 Ab의 임의의 부분을 의미한다. 예를 들어, 본원에 기술된 항원-결합 단편은 포유동물(예를 들어, 인간)에서 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존성(complement-dependent) 세포독성(CDC)을 매개하기에 충분하고/하거나 치료제(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 치료제)에 접합되는 Ab Fc 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 기술된 항원-결합 단편은 포유동물(예를 들어, 인간)에서 ADCC 및/또는 CDC를 매개하지 않는 Ab FC 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. Ab 단편의 비-제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 및 Ab 단편으로부터 형성된 다중-특이적 Ab를 포함한다. 적어도 하나의 낙타과 VHH 도메인 또는 적어도 하나의 연골 어류 Ig-NAR 도메인을 함유하는 추가의 Ab 단편은 미니-바디(mini-body), 마이크로-항체, 서브나노-항체(subnano-antibody), 및 나노-항체, 및 미국 특허 출원 공보 제 2010/0092470호에 기술된 임의의 다른 형태의 Ab를 포함한다.

"인간 항체" 라는 용어는 인간의 게놈 내 존재하는 핵산(예를 들어, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자자리(locus))에 의해 암호화된 Ab를 의미한다. 일부 구현예에서, 인간 Ab는 포유동물(예를 들어, 인간) 세포 배양(예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포주(Chinese hamster ovary cell line)에서 생산된다. 일부 구현예에서, 인간 Ab는 비-인간 세포(예를 들어, 마우스 또는 햄스터 세포주)에서 생산된다. 일부 구현예에서, 인간 Ab는 박테리아 또는 효모 세포에서 생산된다.

"단일-쇄 항체" 라는 용어는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 가변 결합 도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드를 의미한다. 단일-쇄 Ab의 비-제한적인 예는 본원에 기술되어 있고, 당해 분야에 알려져 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 공고 제 2010/0092470호에 기술된 항체).

Ab 또는 이의 항원-결합 단편은 특정 항원, 예를 들어, 인간 IL-1α(경쇄 및 중쇄 가변 영역의 혼입을 포함하는 전장 항체가 본원에 기술된 에피토프(epitope)를 통하여)에 "특이적으로 결합" 또는 "특이적이게 결합" 하지만, 이 항원에 결합했을 때, 샘플 내 다른 분자에 대해서는 더 적은 정도(extent)로 인식하고 결합한다(예를 들어, 인식 및 결합하지 않는다). 일부 구현예에서, Ab 또는 이의 항원-결합 단편은 인산염 완충된 염수(phosphate buffered saline) 내에서 1x 10^-10 M 이하(예를 들면, 1 x 10^-11 M 미만 또는 1 x 10^-12 M 미만)의 친화도(affinity)(KD)(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정됨)를 가진 에피토프(epitope)에 선택적으로 결합한다. 단백질 에피토프에 특이적으로 결합하는 Ab 또는 항원-결합 단편의 능력(ability)은 당해 분야에 공지된 임의의 방법 또는 본원에 기술된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

"상보성 결정 부위" 또는 "CDR" 이라는 용어 Ab 또는 이의 항원-결합 단편 내 항원-결합 부위의 일부를 형성하는 Ig(중쇄 또는 경쇄 Ig) 이내의 영역을 의미한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 Ig는 3개의 CDR: 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 함유하고, 경쇄 Ig는 3개의 CDR: CDR1, CDR2, 및 CDR3를 함유한다. 임의의 Ab 또는 이의 항원-결합 단편에서, 중쇄 Ig로부터 3개의 CDR 및 경쇄 Ig로부터 3개의 CDR은 함께 Ab 내 항원-결합 부위 또는 이의 항원-결합 단편을 형성한다. 카밧 데이타베이스(Kabat Database)는 경쇄 Ig 또는 중쇄 Ig에 존재하는 CDR 서열을 넘버링(numbering)하기 위해 당해 분야에 사용된 하나의 시스템이다.

본원에 기술된 것들과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시(practice) 또는 시험(testing)에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 출원 및 공보는 이의 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 통제(control)할 것이다. 추가로, 하기에 논의된 특정 구현예는 단지 예시일 뿐이며, 제한하려는 의도가 아니다.

본 개시의 구현예는 이제 첨부된 도면을 참조하여 오직 예로서만 기술될 것이다.
도 1은 Octet Red 96 분석의 결과를 보여주는 그래프이며, XIA13의 IL-1α에 대한 결합 친화도(KD)가 6.25 X 10^-11이었음을 나타내었다.
도 2는 Octet Red 96 분석의 결과를 보여주는 그래프이며, XIA13의 신생아(neonatal) Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도(KD)가 2.08 X 10^-7 이었음을 나타내었다.

IL-1α에 대해 매우 높은 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 항원-결합 가변 영역을 포함하는 완전 (실제) 인간 mAb에 관한 조성물 및 방법이 본원에 기술되어 있다. 하기 기술된 바람직한 구현예는 이러한 조성물 및 방법의 적용(adaptation)을 예시한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 구현예의 설명으로부터, 본 발명의 다른 양태는 하기 제공된 설명을 기반으로 하여 이루어지고/거나 실시된다.

통상적인 면역학적 및 분자 생물학적 기술을 포함하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 면역학적 방법(예를 들어, 항원-Ab 복합체(complex)의 검출 및 위치 측정(localization)을 위한 분석, 면역침강법(immunoprecipitation), 면역 블롯팅(immunoblotting) 등)은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌: Current Protocols in Immunology, Coligan et al., ed., John Wiley & Sons, New York과 같은 방법론 논문에 기술되어 있다. 분자 생물학의 기술이 문헌: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York과 같은 논문에 상세히 기술되어 있다. Ab 방법이 문헌: Handbook of Therapeutic Abs, Dubel, S., ed., Wiley-VCH, 2007에 기술되어 있다. 세포 배양 기술은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th edition, by R Ian Freshney, Wiley-Liss, Hoboken, N.J., 2000; 및 General Techniques of Cell Culture, by Maureen A Harrison and Ian F Rae, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1994와 같은 방법론 논문에 상세하게 기술되어 있다. 단백질 정제 방법은 문헌: Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology, Vol. 182, Deutscher M P, ed., Academic Press, San Diego, Calif., 1990에서 논의된다.

완전 인간 mAb는 (i) 인간 IL-1α에 대해 매우 높은 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 항원-결합 가변 영역(antigen-binding variable region) 및 (ii) 서열 번호 1(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 2(또는 이의 CDR)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 본원에 기술된(함께 Fab를 형성하는) 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 Fab 또는 항원-결합 단편에 원하는 Fc 부분을 융합(fusing)시키는 통상적인 분자 생물학 기술을 이용하여 Fc 또는 이의 부분에 연결(join)될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 기술된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 혼입하는 전장 면역글로불린, 예를 들어 인간 IgG1(예를 들어, IgG1a 또는 IgG1b), IgG2(예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b), IgG3(예를 들어, IgG3a 또는 IgG3b), IgG4(예를 들어, IgG4a 또는 IgG4b), IgD, IgA(예를 들어, IgA1, 및 IgA2), IgE, 또는 IgM(예를 들어, 2량체, 5량체, 및 6량체)(및 앞선 것의 다른 동종이형(allotype))이 만들어질 수 있다.

본원에 기술된 mAb는 공지된 방법, 예를 들어 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)(Marks et al. Bio/Technology 10:779-783, 1992), 과가변 영역(hypervariable regions; HVRs)의 무작위 돌연변이 및/또는 프레임워크 잔기(framework residue)(Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al. Gene 169:147-155, 1995; Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9, 1995; 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896, 1992)에 의해 이들의 결합 특이성을 향상시키거나 그렇지 않으면 변화(alter)시키기 위해 성숙된 친화성일 수 있다. Ab의 아미노산 서열 변이체(variant)는 Ab를 암호화하는(encoding) 뉴클레오티드 서열로의 적절한 변화를 도입함으로서 제조될 수 있다. 게다가, mAb를 암호화하는 핵산 서열로의 변형(modification)은 특정한 발현 시스템(예를 들어, 주어진 발현 시스템을 위한 인트론(intron) 제거 및/또는 코돈(codon) 최적화)에서 mAb의 생산을 향상시키기 위해 (예를 들어, mAb의 아미노산 서열의 변화 없이)변화될 수 있다. 본원에 기술된 mAb는 또 다른 단백질(예를 들어, 또 다른 mAb) 또는 비-단백질 분자에 접합함으로서 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, mAb는 수용성 폴리머(water-soluble polymer), 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 또는 탄소 나노튜브(carbon nanotube)(참조: 예를 들어, Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605, 2005)에 접합될 수 있다. 참조: 미국 특허 출원 제 11/754,899호.

아미노산 돌연변이는 이러한 IgG 서브클래스(subclass)의 불변 영역(constant region)으로 도입될 수 있다. 도입될 수 있는 아미노산 돌연변이는, 예를 들어, FcK 수용체(예를 들어, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(11):4005-4010, 2006; MAbs 1(6): 572-579, 2009; US 2010/0196362; US 2013/0108623; US 2014/0171623; US 2014/0093496; 및 US 2014/0093959에 기술된 바와 같이)에 대한 결합을 향상시키거나, FcRn(예를 들어, J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604, 2001; Int Immunol. 18(12):1759-1769, 2006; 및 J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524, 2006에 기술된 바와 같음)에 대한 결합을 감소시키는 것들일 수 있다.

2가지 유형의 H 쇄가 이종으로(heterologously) 연결되어(associated) 이중특이적 Ab를 생산한다. 노브-인투-홀(knobs-into-hole) 기술(예를 들어, J. Immunol. Methods 248(1-2):7-15, 2001; 및 J. Biol. Chem. 285(27): 20850-20859, 2010에 기술된 바와 같음), 정전기적 반발력(electrostatic repulsion) 기술(예를 들어, WO 06/106905에 기술된 바와 같이), 씨드바디(SEEDbody) 기술(예를 들어, Protein Eng. Des. Sel. 23(4):195-202, 2010에 기재된 바와 같음) 등은 CH3 도메인을 통한 2가지 유형의 H 쇄의 이종 연결을 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 Ab는 변형되거나 결손된 당 사슬(sugar chain)을 가진 Ab일 수 있다. 변형된 당 사슬을 가진 Ab의 예는 글리코실화-조작된 항체(예를 들어, WO 99/54342에 기술된 바와 같음), 디퓨코실화된 당 사슬을 가진 Ab(예를 들어, WO 00/61739, WO 02/31140, WO 06/067847, 및 WO 06/067913에 기재된 바와 같음), 및 이등분된 GlcNAc를 지닌 당 사슬을 가진 Ab(예를 들어, WO 02/79255에 기재된 바와 같음)를 포함한다. 당 사슬-결손 IgG 항체를 생산하기 위한 방법의 공지된 예는 중쇄 내의 EU 넘버링 위치 297에서 아스파라긴에 돌연변이를 도입하는 방법(J. Clin. Pharmacol. 50(5): 494-506, 2010), 및 이. 콜라이(E. coli)를 이용하여 IgG를 생산하는 방법(J. Immunol. Methods 263(1-2):133-147, 2002; 및 J. Biol. Chem. 285(27):20850-20859, 2010)을 포함한다. 더욱이, IgG에서 C-말단 리신의 결실을 동반하는 이질성(heterogeneity), 및 IgG2의 힌지(hinge) 영역에서 이황화결합(disulfide bond)의 미스페어링(mispairing)을 동반하는 이질성은 아미노산 결실/치환(예를 들어, WO 09/041613에 기재된 바와 같음)을 도입함으로서 감소될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 Ab 또는 항원-결합 단편은 상응하는 인간 Ab에서 존재하지 않는 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)의 아미노산(예를 들어, 부가, 삽입, 또는 치환된 아미노산, 예를 들어, CDR 내에서가 아님)을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 Ab 또는 항원-결합 단편은 또한 적어도 하나의 결실된 아미노산(예를 들어, 상응하는 인간 Ab와 비교하여), 예를 들어, 경쇄 또는 중쇄의 N- 또는 C-말단으로부터 결실, 또는 불변 도메인(예를 들어, Fc 도메인)으로부터 아미노산의 결실을 가질 수 있다.

바람직하게는, 인간 IL-1α-특이적 mAb의 높은 역가(titer)가 최소한의 부작용으로 대상체(subject)에 투여될 수 있도록 하기 위해서, 본 발명의 mAb 조성물은 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9 중량% 이상의 순도(pure)(임의의 부형제(excipient) 제외)이다. 본 발명의 mAb 조성물은 단지 단일 유형의 mAb(즉, 단일 클론 B 림프구 라인으로부터 생산된 mAb)를 포함한다. 인간 IL-1α mAb 뿐만 아니라, 본 발명의 Ab 조성물은 또한 인간 IL-1α 외에 특이적으로 항원에 결합하는 다른 mAb도 포함한다.

이의 기능을 변형시키거나 향상시키기 위해, mAb는 세포독소(cytotoxin) 또는 검출가능한 표지(detectable label)와 같은 또 다른 분자와 접합될 수 있다. 인간 IL-1α-특이적 mAb는 IL-1α를 발현하는 세포를 더욱 효과적으로 사멸시키기 위해 하나 이상의 세포독소와 접합될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 세포독소는 인간 IL-1α-특이적 mAb에 접합될 수 있는 임의의 세포독성제(cytotoxic agent)(예를 들어, 세포와 접촉 후 세포를 사멸시킬 수 있는 분자)일 수 있다. 세포독소의 예는, 제한없이, 방사성 핵종(radionuclide)(예를 들어, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁸⁹Zr, ²⁰¹Tl, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁵⁷Cu, ²¹³Bi, 및 ²¹¹At), 접합된 방사성 핵종, 및 화학요법제(chemotherapeutic agent)를 제한없이 포함한다. 세포독성의 추가의 예는, 항대사물질(antimetabolite)(예를 들어, 5플루오로유라실(5-FU), 메토트렉세이트(MTX), 플루다라빈 등), 항-미세소관 제제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 탁산(예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀) 등), 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 비스클로로에틸니트로수레아(BCNU) 등), 백금제(예를 들어, 시스플라틴(cDDP 라고도 함), 카보플라틴, 옥살리플라틴, JM-216, CI-973 등), 안트라사이클린(예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신 등), 항생제(예를 들어, 미토마이신-C), 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 에토포시드, 테노포시드, 및 캄토테신), 또는 다른 세포독성제, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소(DT), 슈도모나스 외독소(PE) A, PE40, 아브린, 사포린, 자리공 바이러스 단백질, 브로민화 에티듐, 글루코코르티코이드, 탄저 독소 및 기타를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 참조: 예를 들어, 미국 특허 제 5,932,188호.

인간 IL-1α 특이적 mAb는 검출가능한 표지에도 접합될 수 있다. 본 발명에서 유용한 검출가능한 표지는 바이오틴 또는 스트렙트아비딘, 자기 비드(magnetic bead), 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등), 방사성 표지(radiolabel)(예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P, ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, 또는 ⁷²As), 방사선 비투과성 물질, 예를 들어 방사선 영상을 위한 금속, 자기공명영상을 위한 상자성 제제(paramagnetic agent), 효소(예를 들어, 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼린 포스파타제, 및 ELISA에 일반적으로 사용되는 기타물질), 및 발색 표지, 예를 들어 콜로이드금(colloidal gold) 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스테린, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다. 이러한 표지를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 방사성 표지는 사진 필름 또는 섬광 계수기(scintillation counter)를 사용하여 검출될 수 있다. 형광 마커는 또한 방사된 조명(emitted illumination)을 검출하는 사진검출기(photodetector)를 이용하여 사용되고 검출될 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 효소에 기질(substrate)을 제공하여 기질에서 효소의 작용(action)에 의해 생산된 반응 생산물(product)을 검출함으로서 검출되고, 발색 표지는 착색된 표지를 단순히 시각화함으로써 검출된다.

본 발명은 또한 인간 IL-1α에 특이적인 mAb를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 동일한 핵산 분자가 인간 IL-1α-특이적 mAb의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호할 수 있지만, 2개의 다른 핵산 분자의 세트, 중쇄를 암호화하는 핵산 분자와 경쇄를 암호화하는 다른 핵산 분자가 또한 사용될 수 있다. 본원에 기술된 mAb의 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 다른 적합한 핵산이 또한 사용될 수 있다.

mAb의 생산을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 이러한 핵산 분자가 발현 조절(control) 서열, 예를 들어 전사 및 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 방향으로 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 발현 벡터의 예는 플라스미드로부터 유래된 벡터 및 바이러스로부터 유래된 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 레트로바이러스를 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산 분자는 단일 벡터 또는 상이한(different) 벡터로 혼입될 수 있다. 본 발명의 벡터는 또한 조절 서열, 예를 들어 프로모터(promoter) 및/또는 인핸서(enhancer)(참조: 미국 특허 제 5,168,062호, 미국 특허 제 4,510,245호 및 미국 특허 제 4,968,615호), 선택가능한 마커, 또는 (용이한 정제를 위한)친화성 태그(tag)를 암호화하는 서열 또는 검출가능한 표지를 포함할 수도 있다.

mAb의 생산을 위해, 본 발명의 벡터는 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아와 같은 원핵 세포 또는, 바람직하게는, 포유동물, 식물, 또는 효모 숙주 세포와 같은 진핵 세포로 도입될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입하기 위한 방법의 예는 바이러스 벡터, 전기천공(electroporation), 리소좀 내 폴리뉴클레오티드의 캡슐화, 덱스트란-매개 형질감염(dextran-mediated transfection), 인산 칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합(protoplast fusion), 아그로박테리움-매개 형질전환(transformation), 유전자총법 형질전환(biolistic transformation), 및 핵으로의 DNA 직접 미세 주입의 용도를 포함한다. 포유동물 세포주는 벡터로부터 mAb의 발현을 위해 현재 바람직하다. 포유동물 숙주 세포의 예는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, DG44 CHO 세포주 또는 CHO-K1 세포주), HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간암 세포(hepatocellular carcinoma cell)(예를 들어, Hep G2), NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 자유형 세포(Freestyle cell), 및 NIH-3T3 세포를 포함한다. mAb는 또한 형질전환 동물(transgenic animal) 또는 식물에 발현될 수 있다. 참조: 예를 들어, 미국 특허 제 5,827,690호; 제 5,756,687호; 제 5,750,172호; 제 5,741,957호; 제 6,046,037호; 및 제 5,959,177호.

본원에 기술된 Ab 및 항원-결합 단편은 Ab 및 항원-결합 단편 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)(예를 들어, 비-천연의 약제학적으로 허용되는 담체)를 함유하는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 비-제한적인 예는 멸균수, 생리식염수(physiological saline), 안정화제, 부형제, 항산화제(예를 들어, 아스코르브산), 완충제(buffer)(예를 들어, 인산염, 시트르산염, 히스티딘, 및 기타 유기산), 방부제(antiseptics), 계면활성제(예를 들어, PEG 및 트윈(Tween)), 킬레이트제(예를 들어, EDTA 또는 EGTA), 및 결합제(binder)를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 추가적 예는 또한 저-분자량(low-molecular-weight) 폴리펩티드, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민 및 젤라틴), 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 메티오닌, 아르기닌, 및 리신), 당 및 탄수화물(예를 들어, 다당류 및 단당류), 및 당 알콜(예를 들어, 만니톨 및 소르비톨)을 포함한다. 주입을 위한 수용액을 준비할 때, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화나트륨과 같은 포도당 및 다른 보조제(adjuvant)를 포함하는 생리식염수 및 등장액(isotonic solution)이 사용될 수 있고, 필요한 경우, 적절한 가용화제(solubilizer), 예를 들어, 알콜(예를 들어, 에탄올), 폴리알콜(예를 들어, 프로필렌 글리콜 및 PEG), 및 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, 및 HCO-50)와 조합하여 사용될 수 있다. 제형에 히알루로니다제를 혼합함으로써, 더 많은 유체 용적(fluid volume)이 피하 투여될 수 있다(참조로, 예를 들어, Expert. Opin. Drug. Deliv. 4(4): 427-440, 2007).

본원에 제공된 Ab 및 항원-결합 단편은 예를 들어, 마이크로캡슐(예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스, 젤라틴, 및 폴리(메타크릴산메틸)로 만들어진 것들)에 캡슐화될 수 있거나, 또는 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자, 및 나노캡슐)의 성분으로서 혼입될 수 있다(참조: 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)). 조절-방출성(controlled-release) 약제학적 제제로서 약제학적 조성물을 준비하기 위한 방법 또한 잘 알려져 있고, 이러한 방법은 본 발명의 Ab 및 항원-결합 단편에 적용될 수 있다(참조: 예를 들어, Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277, 1981; Langer, Chemtech. 12: 98-105, 1982,; U.S. Patent No. 3,773,919; European Patent Application Publication No. EP 58,481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556, 1983; and EP 133,988).

본원에 제공된 약제학적 조성물은 정맥 내(intravenous), 동맥 내(intraarterial), 피부 내(intradermally), 피하(subcutaneous), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal), 또는 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다.

실시예

실시예 1- 항-인간 IL-1α Ab의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열의 발견.

혈장 및 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 건강한 인간 공여체(donor)에서 단리한다. 혈장에서 항-IL-1α 항체의 존재는 바이오틴화된(biotinylated) 재조합 인간 IL-1α와 접합된 스트렙타아비딘 자기 비드(magnetic bead)를 사용하여 비드-기반의 유세포 분석(flow cytometric analysis)으로 확인되었다. PBMC를 Histopaque™ 1077 및 Accuspin™ 튜브를 사용하여 공여체의 혈액으로부터 단리하고, 세포를 PBMC의 일부로부터 단리한다. RNA를 PBMC 뿐만 아니라 기존의 방법을 이용한 B 세포로부터 추출하고, cDNA는 RNA로부터 준비하였다. PCR은 미국 특허 제 9,453,217호에 기재된 절차 및 프라이머를 사용하여 cDNA에서 수행하였다. 사용된 역방향 프라이머(reverse primer)는 IgG4 및 IgG1를 특이적으로 증폭시키기 위해 선택되었는데, 그 이유는 혈장 내 반응성이 IgG1 서브클래스로부터의 일부 신호와 함께 대부분 IgG4 서브클래스로 동형화되었기 때문이다. 카파 및 람파 경쇄 라이브러리(library) 둘 모두 만들어졌다. 파지 라이브러리는 IgG4-카파 중첩(overlap)으로부터 생성되었고, 3가지 패닝(panning) 소리가 라운드(round) 사이 내에서 임의의 파지 증폭 없이 수행되었다. 입력(input) 라이브러리 다양성은 0.65e12인 것으로 밝혀졌다. 라운드 2 후에, 클론의 절반은 플레이트(plate)에서 계수되고, 나머지는 추가 라운드의 패닝을 받았다. 3개 라운드의 패닝 후, 38개 클론이 남았다. ELISA-기반 스크리닝(screening)은 결합된 파지의 검출을 위한 항-FLAG 항체와 함께, 재조합 인간 IL-1α로 코팅된 ELISA 플레이트에서 파지 상층액(supernatant)으로 수행되었고, 양성 클론(positive clone)이 식별되었다. 이러한-지정된 XIA13- 중 하나를 선택하고 서열분석(sequencing)하였다. XIA13로 지정된 인간 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같으며 CDR(IMGT/DomainGapAlign; Ehrenmann, F., Lefranc, M.-P. Cold Spring Harb Protoc., 2011(6):737-749 (2011). DOI:10.1101/pdb.prot5636. PMID:21632775에 의해 결정됨)은 굵게 밑줄쳐서 나타내어져 있다.

>XIA13_경쇄

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS QSVLYSSNNKNY LAWYQQKPGQPPKLLIY WAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYSTPST FGQGTKVEIKR

>XIA13_중쇄

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GGRFTNYA ILWVRQAPGQGLQWLGG IIPIFDET DHAQDFQDRLTITVDESMTTAYMELSSLRPEDTAIYYC ATGSNSYYGLY WGQGTLVTVSS

따라서, XIA13 경쇄는 아미노산 서열 QSVLYSSNNKNY[서열 번호: 3]을 갖는 CDR1, 및 아미노산 서열 WAS[서열 번호: 4]를 갖는 CDR2, 및 아미노산 서열 QQYYSTPST[서열 번호: 5]를 갖는 CDR3를 갖는다. 유사하게, 이와 같이 XIA13 중쇄는 아미노산 서열 GGRFTNYA[서열 번호: 6]를 갖는 CDR1, 아미노산 서열 IIPIFDET[서열 번호: 7]를 갖는 CDR2, 및 아미노산 서열 ATGSNSYYGLY [서열 번호: 8]를 갖는 CDR3를 갖는다.

실시예 2- XIA13의 특성화(Characterization)

Octet Red 96 분석의 결과는 XIA13의 IL-1α에 대한 결합 친화도(KD)가 6.25 X 10^-11(참조 도 1)임을 나타내었다. Octet Red 96 분석의 결과는 XIA13의 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도(KD)가 2.08 X 10^-7(참조 도 2)이었음을 나타내었다.

HUVEC-기반 효능(potency) 분석은 XIA13 IC₅₀가 3.7 ng/ml 이었음을 나타내었다. 요약하면, 0.2 x 10⁶ HUVEC 세포 (Corning™ 354151)/ml를 96 웰 평평한 바닥 플레이트(96 well flat bottom plate)에서 씨딩(seeding)하였다. XIA13 분자를 610 pg/ml 내지 100 ㎍/ml 범위의 농도로 희석하였다. 희석된 XIA13가 61 pg/ml 내지 10 ㎍/ml의 최종 농도 범위에서 96 웰 플레이트에서 HUVEC 세포에 투여(dosing)되었다. 0.5ng/ml hIL-1α를 96 웰 플레이트에서 각 웰에 적용하고, 18시간 동안 37^oC/5% CO₂에서 인큐베이팅(incubating)하였다. HUVEC 세포를 항-ICAM-1 항체(eBioscience 12-0549, 클론 HA58)로 염색하고, 유세포 분석법을 이용하여 ICAM-1 발현 수준을 결정하였다. FlowJo를 사용하여 데이터 분석을 수행하였고, Kaleidagraph를 사용하여 IC 50을 계산하였다.

기타 구현예

본 발명은 발명의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 앞선 설명은 첨부된 청구범위의 영역에 의해 정의되는 본 발명의 영역을 예시하기 위한 것일 뿐 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 양태, 이점 및 수정은 다음 청구범위의 영역 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> XBIOTECH INC. <120> TRUE HUMAN ANTIBODY SPECIFIC FOR INTERLEUKIN 1 ALPHA (IL-1ALPHA) <130> PAT 109600W-90 <150> CA 3,095,679 <151> 2020-10-07 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Leu 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Thr Asp His Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Leu Thr Ile Thr Val Asp Glu Ser Met Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Ser Asn Ser Tyr Tyr Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Ala Ser 1 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ser Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Gly Arg Phe Thr Asn Tyr Ala 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Thr 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Thr Gly Ser Asn Ser Tyr Tyr Gly Leu Tyr 1 5 10

Claims

인터루킨 1 알파(interleukin 1 alpha; IL-1α)에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열(light chain variable region amino acid sequence), 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열(heavy chain variable region amino acid sequence)을 포함하는, 정제된 인간 단일클론 항체(purified human monoclonal antibody)를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.