KR20230082584A - Diagnostic biomarkers for use in diagnosis of lymphoma in companion dogs - Google Patents
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- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
Abstract
본 발명은 개의 림프종 진단을 위한 조성물 등에 관한 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 림프종을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 림프종을 앓고 있는 개의 혈장 단백질에 대해 고분해능 질량분석기를 이용한 단백체 분석을 수행하였으며, 정상 대조군과 비교하여 유의한 발현 차이를 보이는 바이오마커들을 선별하였다. 선별된 바이오마커를 이용하여 확립한 림프종 진단 모델은 높은 특이도, 민감도, 및 정확도로 림프종을 진단할 수 있음이 확인되었다. 따라서 본 발명은 소량의 혈액을 이용한 비침습적 방법으로서 통해 반려견의 림프종의 위험도 예측 및 조기 진단을 가능케하는 바, 반려견의 건강 보존과 보호자의 의료비 부담 감소뿐만 아니라, 수의학적 컨설팅의 질적 향상에도 기여할 것으로 기대된다.The present invention relates to a composition for diagnosing canine lymphoma, and was completed by discovering biomarkers capable of diagnosing lymphoma with high accuracy and sensitivity through qualitative and quantitative analysis of canine plasma proteins. Specifically, the present inventors performed proteomic analysis using high-resolution mass spectrometry on plasma proteins of dogs suffering from lymphoma, and selected biomarkers showing significant expression differences compared to normal controls. It was confirmed that the lymphoma diagnosis model established using the selected biomarker can diagnose lymphoma with high specificity, sensitivity, and accuracy. Therefore, the present invention is a non-invasive method using a small amount of blood, which enables the prediction and early diagnosis of the risk of lymphoma in dogs, which is expected to contribute not only to the health preservation of dogs and the reduction of the burden of guardians' medical expenses, but also to improving the quality of veterinary consulting. It is expected.
Description
본 발명은 반려견의 림프종 진단을 위한 바이오마커 및 이를 이용한 개의 림프종 진단 방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for diagnosing canine lymphoma and a method for diagnosing canine lymphoma using the same.
2019년 기준 대한민국의 반려동물 양육 가구 중 6세 이상 노령견을 양육하는 가구는 39.3%, 10세 이상의 노령견을 키우는 가구는 18%를 차지하며, 노령견 수의 증가와 함께 보호자들의 개의 질병에 대한 진단과 치료법에 관한 관심이 급증하고 있다. 특히, 난치성 질병은 질병의 초기 진단이 반려동물의 건강 수명 연장에 중요할 뿐 아니라 보호자의 의료비 지출을 감소시키기 위해서도 필요하다. 또한, 반려동물의 건강 수명 연장을 위해서는 무엇보다 난치성 질병의 치료 또는 진행정도를 완화시키기 위한 기술 개발이 지속적으로 필요하다.As of 2019, among households raising companion animals in Korea, 39.3% of households raising dogs aged 6 years or older and 18% raising dogs aged 10 years or older accounted for 18%. Interest in therapies is growing rapidly. In particular, for incurable diseases, early diagnosis of diseases is important not only for extending the health life span of companion animals, but also for reducing guardians' medical expenses. In addition, in order to extend the healthy lifespan of companion animals, it is necessary to continuously develop technologies to treat or alleviate the progress of intractable diseases.
개의 림프종 (Malignant lymphoma, lymphosarcoma)은 개에서 가장 흔한 조혈성 종양으로, 일반적으로 동물병원의 진단 케이스 중 85% 이상에서 국소적 또는 전신적 임파선염이 관찰된다. 림프종은 치료하지 않을 경우 대부분 진단 후 4-6주 이내 사망할 정도로 사망률이 높지만, 초기에 적절한 치료가 이루어지는 경우 6개월 이상으로 생존기간을 연장할 수 있다. 따라서, 반려견의 림프종 발병 위험을 미리 파악하거나 조기에 진단하는 것이 중요하다. 이처럼, 반려동물의 건강 수명 연장과 보호자의 의료비 부담 감소를 위해 반려견의 난치성 질병의 조기 진단 및 치료 기술 개발이 반드시 필요하다.Malignant lymphoma (lymphosarcoma) is the most common hematopoietic tumor in dogs, and local or systemic lymphadenitis is observed in more than 85% of cases diagnosed in veterinary hospitals. If lymphoma is not treated, the mortality rate is high enough to die within 4-6 weeks after diagnosis, but if appropriate treatment is performed in the early stage, the survival period can be extended to more than 6 months. Therefore, it is important to identify or diagnose the risk of developing lymphoma in your dog in advance. As such, it is absolutely necessary to develop technology for early diagnosis and treatment of intractable diseases in companion dogs to extend the healthy lifespan of companion animals and reduce the burden of medical expenses on guardians.
반려견 림프종 진단은 주로 비대해진 림프절을 세침흡인한 후 이 시료를 현미경적으로 검경하는 방법으로 이루어지고 있으며, 림프종 치료를 위해서는 상기 시료를 면역염색하여 정확한 유래를 확인하여야 한다. 또한, 적절한 치료를 위해 림프종의 Stage를 확인하기 위해서는 추가적인 혈액검사와 영상검사가 필요하다. 그러나, 대부분의 동물은 간 또는 비장에 전이된 Stage 4상태에서 내원하여 일반적으로 3-4주 이내에 질병으로 사망한다.The diagnosis of canine lymphoma is mainly made by microscopically examining the sample after fine needle aspiration of the enlarged lymph node. In order to treat lymphoma, the sample must be immunostained to confirm its exact origin. In addition, additional blood tests and imaging tests are needed to confirm the stage of lymphoma for appropriate treatment. However, most animals visit the hospital with
따라서, 보다 간편하고 비침습적인 방법으로 반려견의 림프종 유무 혹은 위험도를 예측할 수 있게 하는 방법에 대한 요구가 절실하나, 아직까지 높은 정확도를 가지고 반려견의 림프종을 진단할 수 있는 비침습적인 방법은 개발되지 않고 있다.Therefore, there is an urgent need for a method that can predict the presence or risk of lymphoma in dogs in a simpler and non-invasive way, but a non-invasive method that can diagnose lymphoma in dogs with high accuracy has not yet been developed. is not
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 개에서의 림프종을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다.The present invention was made to solve the above problems, and was completed by discovering biomarkers capable of diagnosing lymphoma in dogs with high accuracy and sensitivity through qualitative and quantitative analysis of canine plasma proteins.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 바이오마커들의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 개의 림프종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for diagnosing canine lymphoma, which includes, as an active ingredient, an agent for measuring protein or mRNA levels of the biomarkers.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커들의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 개의 림프종 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing canine lymphoma, including an agent for measuring protein or mRNA levels of the biomarkers.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오마커들의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하여 개의 림프종을 진단하는 방법에 관한 것이다.Another object of the present invention relates to a method for diagnosing canine lymphoma by measuring protein or mRNA levels of the biomarkers.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
본 발명은 Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 개의 림프종 진단용 조성물을 제공한다.The present invention includes, as an active ingredient, an agent for measuring at least one protein or mRNA level selected from the group consisting of Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B). To provide a composition for diagnosing canine lymphoma.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 Pentaxin 또는 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 림프종 개체에서 증가되어 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the protein or mRNA level of Pentaxin or ITIH4 may be increased in a lymphoma subject compared to a normal subject, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 F13B의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 림프종 개체에서 감소되어 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the protein or mRNA level of F13B may be reduced in a lymphoma subject compared to a normal subject, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 및 Fibrinogen gamma chain로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the composition comprises ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin ( TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the agent for measuring the protein level may be an antibody or an aptamer specific to the protein, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the agent for measuring the mRNA expression level may be a primer set or a probe that specifically binds to the mRNA, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 또는 mRNA 수준은 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서의 수준일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the protein or mRNA level may be at least one level selected from the group consisting of blood, whole blood, plasma, serum, and lymph, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제; 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는, 개의 림프종 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention is an agent for measuring the level of at least one protein or mRNA selected from the group consisting of Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B); Or it provides a kit for diagnosing canine lymphoma, including a composition comprising the same.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 개의 림프종 진단 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for diagnosing canine lymphoma, comprising the following steps:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및(S1) Levels of one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B) in a biological sample isolated from a subject measuring; and
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 Pentaxin 또는 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나, F13B의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 림프종으로 진단하거나 림프종이 발병할 위험이 있는 것으로 판단하는 단계.(S2) If the protein or mRNA level of Pentaxin or ITIH4 measured in step (S1) is increased compared to the control group, or the protein or mRNA level of F13B is decreased compared to the control group, it is diagnosed as lymphoma or at risk of developing lymphoma. stage of judgment.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 및 Fibrinogen gamma chain로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the method comprises ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin- Cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the biological sample may be at least one selected from the group consisting of blood, whole blood, plasma, serum, and lymph, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 수준은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry; LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), 및 FACS으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the protein level is measured by protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) assay, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoretic assay, liquid chromatography-mass At least one method selected from the group consisting of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-mass spectrometry/ mass spectrometry (LC-MS/MS), western blotting, enzyme linked immunosorbentassay (ELISA), and FACS It can be measured as, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the mRNA level is measured from the group consisting of PCR, RNase protection assay, northern blotting, southern blotting, in situ hybridization, DNA chip, and RNA chip. It may be measured by one or more selected methods, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 개의 림프종 진단용 제제 또는 키트를 제조하기 위한, Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.In addition, the present invention relates to at least one selected from the group consisting of Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B) for preparing a preparation or kit for diagnosing canine lymphoma. Uses of the agents for measuring protein or mRNA levels are provided.
또한, 본 발명은 개의 림프종 진단을 위한, Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.In addition, the present invention measures the level of at least one protein or mRNA selected from the group consisting of Pentaxin, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B) for the diagnosis of canine lymphoma. The use of the agent to be measured is provided.
본 발명은 개의 림프종 진단을 위한 조성물 등에 관한 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 림프종을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 림프종을 앓고 있는 개의 혈장 단백질에 대해 고분해능 질량분석기를 이용한 단백체 분석을 수행하였으며, 정상 대조군과 비교하여 유의한 발현 차이를 보이는 바이오마커들을 선별하였다. 선별된 바이오마커를 이용하여 확립한 림프종 진단 모델은 높은 특이도, 민감도, 및 정확도로 림프종을 진단할 수 있음이 확인되었다. 따라서 본 발명은 소량의 혈액을 이용한 비침습적 방법으로서 반려견의 림프종의 위험도 예측 및 조기 진단을 가능케하는 바, 반려견의 건강을 보존하고 보호자의 의료비 부담을 절감할 뿐만 아니라, 수의학적 컨설팅의 질적 향상에도 기여할 것으로 기대된다.The present invention relates to a composition for diagnosing canine lymphoma, and was completed by discovering biomarkers capable of diagnosing lymphoma with high accuracy and sensitivity through qualitative and quantitative analysis of canine plasma proteins. Specifically, the present inventors performed proteomic analysis using high-resolution mass spectrometry on plasma proteins of dogs suffering from lymphoma, and selected biomarkers showing significant expression differences compared to normal controls. It was confirmed that the lymphoma diagnosis model established using the selected biomarker can diagnose lymphoma with high specificity, sensitivity, and accuracy. Therefore, the present invention is a non-invasive method using a small amount of blood, which enables risk prediction and early diagnosis of lymphoma in dogs, thereby preserving the health of dogs and reducing the burden of guardians' medical expenses, as well as improving the quality of veterinary consulting. expected to contribute
도 1a는 MARS14 컬럼을 이용하여 상위 14개의 풍부한 혈장 단백질을 제거한 원리를 도식화한 도면이다.
도 1b는 상위 14개의 풍부한 혈장 단백질 및 미량 단백질을 전처리하고 UV 스펙트럼을 확인한 결과이다.
도 1c는 Suspension trap 방법으로 혈장 단백질을 펩티드로 제조한 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 1d는 SWATCH LC-MS 분석에 사용된 파라미터를 나타낸 그림이다.
도 2는 반려견들의 혈장 시료로부터 분리한 혈장 시료에 대해 Nano drop을 이용하여 정량적 분석을 수행한 결과이다.
도 3은 반려견 혈장 시료에서 정량된 단백질의 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 정상 대조군 대비 림프종 개체에서 증가 또는 감소한 단백질들을 나타낸 Volcano plot이다.
도 5는 정상 대조군 대비 림프종 개체에서 증감된 29개 단백질들에 대한 정보를 나타낸 표이다.
도 6a 및 6b는 정상 대조군 대비 림프종 개체에서 감소된 단백질인 F13B (도 6a) 및 정상 대조군 대비 림프종 개체에서 증가된 단백질인 ITIH4 (도 6b)의 Box plot 및 ROC 커브를 나타낸 그림이다.
도 7은 정상 대조군 대비 림프종 개체에서 차별적인 수준을 보이는 15개 단백질들을 이용한 PLS-DA 결과를 나타낸다.
도 8은 Pentaxin 및 F13B를 결합한 림프종 진단 모델의 변별력 (AUC, 특이도, 민감도, P-value 등)을 분석한 결과이다.1a is a diagram illustrating the principle of removing the top 14 abundant plasma proteins using a MARS14 column.
Figure 1b shows the result of pre-processing the top 14 abundant plasma proteins and trace proteins and confirming the UV spectrum.
Figure 1c is a flow chart showing the process of preparing plasma proteins into peptides by the suspension trap method.
1d is a diagram showing parameters used in SWATCH LC-MS analysis.
2 is a result of performing quantitative analysis using a nano drop on plasma samples separated from plasma samples of companion dogs.
3 is a graph showing the number of proteins quantified in canine plasma samples.
Figure 4 is a Volcano plot showing increased or decreased proteins in lymphoma subjects compared to normal controls.
5 is a table showing information on 29 proteins increased or decreased in lymphoma subjects compared to normal controls.
6a and 6b are diagrams showing box plots and ROC curves of F13B (FIG. 6a), a protein decreased in lymphoma subjects compared to normal controls, and ITIH4, protein increased in lymphoma subjects compared to normal controls (FIG. 6b).
7 shows PLS-DA results using 15 proteins showing differential levels in lymphoma subjects compared to normal controls.
8 is a result of analyzing the discrimination power (AUC, specificity, sensitivity, P-value, etc.) of the lymphoma diagnosis model combining Pentaxin and F13B.
본 발명은 개의 림프종 진단을 위한 조성물 등에 관한 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 개에서의 림프종을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 정상 및 질병을 앓고 있는 개들의 혈장 단백질에 대해 고분해능 질량분석기를 통해 정량적, 정성적 분석을 수행하였으며, 이를 통해 개체간에 유의한 차이를 보이는 바이오마커들을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들을 조합하여 확립된 진단 모델은 높은 특이도, 민감도, 및 정확도로 질병 개체와 정상 개체를 구별할 수 있음이 확인되었다. 따라서 상기 바이오마커들 및 이들의 조합을 통해 개의 림프종의 정확한 진단이 가능할 뿐만 아니라, 평상시에도 림프종의 위험도를 손쉽게 스크리닝할 수 있으므로, 반려견의 림프종 조기 진단을 통해 수명을 연장시키고, 보호자의 의료비를 절감할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 본 발명에 따른 진단방법은 기존의 침습적인 진단 및 검사방법의 대안으로서, 채혈이라는 비교적 간단하고 경제적인 방법을 통해 질병의 진단이 가능한 이점이 있다.The present invention relates to a composition for diagnosing canine lymphoma, and was completed by discovering a biomarker capable of diagnosing canine lymphoma with high accuracy and sensitivity through qualitative and quantitative analysis of canine plasma proteins. Specifically, the present inventors performed quantitative and qualitative analysis on plasma proteins of normal and diseased dogs through high-resolution mass spectrometry, and through this, biomarkers showing significant differences between individuals were selected. In addition, it was confirmed that the diagnostic model established by combining the above biomarkers can distinguish between diseased individuals and normal individuals with high specificity, sensitivity, and accuracy. Therefore, through the above biomarkers and their combination, it is not only possible to diagnose lymphoma accurately in dogs, but also to easily screen the risk of lymphoma even in normal times, prolonging the life span and reducing the guardian's medical expenses through early diagnosis of lymphoma in dogs. Expect to be able to do it. In particular, the diagnosis method according to the present invention is an alternative to conventional invasive diagnosis and examination methods, and has the advantage of being able to diagnose diseases through a relatively simple and economical method of blood sampling.
따라서, 본 발명의 주요 목적은, Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 개체의 림프종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Therefore, the main object of the present invention is to measure the level of one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B) It is to provide a composition for diagnosing a subject's lymphoma, comprising the agent as an active ingredient.
본 발명에서 "개체"란 질병의 위험도 예측, 진단, 예후 예측, 또는 치료 등을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미할 수 있으나, 바람직하게는 개 (dogs; 학명, Canis lupus familiaris)를 의미할 수 있다.In the present invention, "subject" means a subject requiring risk prediction, diagnosis, prognosis prediction, or treatment of a disease, and more specifically, non-human primates, mice, rats, dogs , It may mean mammals such as cats, horses, and cows, but preferably means dogs (dogs; scientific name, Canis lupus familiaris).
본 발명에 있어서, “림프종 (Lymphoma, Malignant lymphoma, 또는 Lymphosarcoma)”이란 혈액세포의 하나인 림프구가 악성으로 과다증식하여 생기는 종양으로, 개에서 가장 흔한 조혈성 종양 중 하나이다. 림프계는 전신적으로 연결되어 있으므로, 림프구의 과다증식이 일어나면 하나의 장기가 아닌 전신에서 림프종이 발생할 수 있다. 개의 림프종은 체표 림프절이 커지면서 발견되는 경우가 많은데, 이 때 적절한 치료가 이루어지지 않으면 예후가 최대 50일 이내에 불과하다. 개에서의 림프종은 해부학적 위치를 기준으로 다중심형 림프종, 소화기형 림프종, 피부형 림프종 등으로 나뉘거나, 관련 세포의 종류에 따라 B 세포 림프종, T 세포 림프종, 및 NK 세포 림프종 등으로 구별되는데, 본 발명에 따른 림프종은 상기 세부 유형을 모두 포함한다. 다중심형 림프종은 개에서 가장 흔한 림프종으서, 아래턱, 겨드랑이, 무릎 뒤쪽, 사타구니 등에서 림프절이 부어오르는 것을 특징으로 하며, 무기력증, 식욕부진, 체중감소, 구토, 설사 등을 동반한다. 소화기형 림프종은 소화기관의 림프조직 및 림프절이 붓는 것을 특징으로 하며, 피부형 림프종은 다양한 피부과적 증상 (궤양, 습진, 붉어짐 등)을 동반한다. 림프종은 명확히 밝혀진 원인이 없기 때문에 평상시에 발병 위험도를 스크리닝하거나 조기에 진단하는 것이 중요하다.In the present invention, "lymphoma, Malignant lymphoma, or Lymphosarcoma" is a tumor caused by malignant overproliferation of lymphocytes, one of blood cells, and is one of the most common hematopoietic tumors in dogs. Since the lymphatic system is systemically connected, lymphocyte hyperplasia can cause lymphoma in the body rather than in one organ. Lymphoma in dogs is often discovered as the body surface lymph nodes enlarge, and at this time, if appropriate treatment is not performed, the prognosis is only within 50 days at most. Lymphoma in dogs is divided into multiple deep lymphomas, digestive lymphomas, and cutaneous lymphomas based on anatomical location, or B-cell lymphomas, T-cell lymphomas, and NK-cell lymphomas according to the type of cells involved. Lymphoma according to the present invention includes all of the above subtypes. Multiple heart lymphoma is the most common lymphoma in dogs and is characterized by swollen lymph nodes in the lower jaw, axilla, back of the knee, and groin, accompanied by lethargy, anorexia, weight loss, vomiting, and diarrhea. Digestive lymphoma is characterized by swelling of the lymphatic tissue and lymph nodes of the digestive tract, and cutaneous lymphoma is accompanied by various dermatological symptoms (ulcer, eczema, redness, etc.). Since lymphoma has no clearly identified cause, it is important to screen for the risk of developing it or diagnose it early.
본 발명에 있어서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 림프종의 존재 여부, 림프종의 발병 여부, 림프종의 발병 가능성 여부 (발병 위험도), 림프종의 예후 등을 확인하는 것을 포함하는 의미일 수 있다.In the present invention, "diagnosis" means confirming the presence or characteristics of a pathological condition, and confirms the presence or absence of lymphoma, whether or not lymphoma has occurred, whether or not there is a possibility of developing lymphoma (risk of occurrence), and the prognosis of lymphoma. It can mean including.
보다 구체적으로, 본 발명서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis) (예컨대, 종양 상태의 동정, 종양의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.More specifically, the term "diagnosis" used in the present invention refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or disorder, and determining whether a subject currently has a specific disease or disorder. , determining the prognosis of a subject suffering from a particular disease or condition (e.g., identifying tumor status, determining the staging of a tumor, or determining the responsiveness of a cancer to treatment), or therametrics (e.g., treatment monitoring the state of the object to provide information about efficacy).
본 발명에 있어서, 상기 “Pentaxin”은 “Pentraxin”으로도 지칭되는 단백질로, 펜트락신 단백질 도메인 (Pentraxin protein domain)을 포함하며 급성 면역학적 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. Pentaxin은 감염이나 염증 부위에서 조직세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 등에 의해 생성되며 균, 박테리아, 바이러스 등의 감염을 억제하는 역할을 한다. 그러나 개의 림프종과 Pentaxin의 연관성에 대해서는 알려진 바가 없는데, 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 개체 대비 림프종 개체에서 Pentaxin 수준이 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다. Pentaxin에 대한 구체적인 정보는 Uniprot과 같은 공공 데이터베이스에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: A0A8C0T016).In the present invention, the "Pentaxin" is a protein also referred to as "Pentraxin", which includes a Pentraxin protein domain and is known to be involved in an acute immunological response. Pentaxin is produced by tissue cells, macrophages, monocytes, and dendritic cells at the site of infection or inflammation, and plays a role in suppressing infections such as fungi, bacteria, and viruses. However, nothing is known about the association between lymphoma and Pentaxin in dogs, but the present inventors confirmed that the level of Pentaxin was significantly increased in lymphoma subjects compared to normal subjects through canine plasma proteomic analysis. Specific information on Pentaxin can be found in public databases such as Uniprot (Uniprot registration number: A0A8C0T016).
본 발명에 있어서, 상기 “Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4)”는 혈장 프로테아제 억제 단백질로, 면역과 염증의 조절에 관여하며, 특히 항염 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 개체 대비 림프종 개체에서 ITIH4의 수준이 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다. ITIH4에 대한 구체적인 정보는 Uniprot 등에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: A0A8C0M760).In the present invention, the “Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4)” is a plasma protease inhibitor protein, involved in the regulation of immunity and inflammation, and is known to have an anti-inflammatory effect in particular. The present inventors confirmed that the level of ITIH4 was significantly increased in lymphoma subjects compared to normal subjects through canine plasma proteomic analysis. Specific information on ITIH4 can be found at Uniprot, etc. (Uniprot registration number: A0A8C0M760).
본 발명에 있어서, 상기 “Coagulation factor XIII B chain (F13B)”은 혈액 응고의 마지막 단계에 관여하여 fibrin의 응고물 (혈전; clot)을 안정화시키는 기능을 하는 자이모겐 (zymogen)이다. 상기 단백질의 결핍 혹은 기능 이상은 혈전의 불안정화로 이어지며, 상처 치유의 결함, 계속적인 출혈 등을 초래할 수 있다. 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 개체 대비 림프종 개체에서 F13B의 수준이 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다. F13B에 대한 구체적인 정보는 Uniprot 등에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: A0A8C0P1H6).In the present invention, the “Coagulation factor XIII B chain (F13B)” is a zymogen that functions to stabilize fibrin clots (clots) by being involved in the final stage of blood coagulation. Deficiency or dysfunction of the above protein leads to destabilization of blood clots, and may result in defects in wound healing, continuous bleeding, and the like. The present inventors confirmed that the level of F13B was significantly reduced in lymphoma subjects compared to normal subjects through canine plasma proteomic analysis. Specific information on F13B can be found at Uniprot, etc. (Uniprot registration number: A0A8C0P1H6).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 및 Fibrinogen gamma chain로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다. 상기 단백질 (유전자)들은 정상 개체 대비 림프종을 앓는 개에서 통계적으로 유의하게 증가 또는 감소한 것으로 확인된 마커들이다.In one embodiment of the present invention, the composition is ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF ), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type
예컨대, 상기 ITIH3 또는 SERPINA3는 정상 개체 대비 림프종 개체에서 증가되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 또는 Fibrinogen gamma chain은 정상 개체 대비 림프종 개체에서 감소되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.For example, the ITIH3 or SERPINA3 may be increased in lymphoma subjects compared to normal subjects. In addition, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin ( C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type
본 명세서에 있어서, "수준이 증가되어 있다"는 것은, 검출되지 않던 것이 검출된 것, 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 검출량이 많아지는 것을 의미한다. 예를 들어, 수준이 "증가"되어 있다는 것은, 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다. 구체적으로는, 대조군의 그것에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대 의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.In the present specification, "the level is increased" means that the undetected is detected, or the detected amount is relatively higher than the normal level. For example, a level "increased" means that the level in the experimental group is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% or more, such as 5%, compared to that in the control group. , 10%, 20%, 30%, 40%, or 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or higher, and/or 0.5x, 1.1x, 1.2x, 1.4x, 1.6x , 1.8 times higher or higher. Specifically, compared to that of the control group, 1 to 1.5 times, 1.5 to 2 times, 2 to 2.5 times, 2.5 to 3 times, 3 to 3.5 times, 3.5 to 4 times, 4 to 4.5 times, 4.5 to 5 times, 5 to 5 times. 5.5 times, 5.5 to 6 times, 6 to 6.5 times, 6.5 to 7 times, 7 to 7.5 times, 7.5 to 8 times, 8 to 8.5 times, 8.5 to 9 times, 9 to 9.5 times, 9.5 to 10 times, or 10 times It may mean an increase of more than double, but is not limited thereto. The meaning of the opposite term can be understood as having the opposite meaning according to the above definition by those skilled in the art.
본 명세서에서 사용된 용어, "측정"은 목적하는 물질 (본 발명의 경우 림프종 바이오마커 유전자의 mRNA 또는 단백질)의 존재 (발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것 (즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법 (분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 콜라겐 단백질의 존재 여부의 검출, 또는 상기 단백질 수준의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.As used herein, the term "measurement" refers to measuring and confirming the presence (expression) of a substance of interest (in the case of the present invention, mRNA or protein of a lymphoma biomarker gene), or the presence level (expression of a substance of interest). level) is meant to include both measuring and confirming changes. That is, measuring the expression level of the protein means measuring whether or not it is expressed (that is, measuring whether or not it is expressed) or measuring the level of qualitative or quantitative change of the protein. The measurement can be performed without limitation including both qualitative methods (assays) and quantitative methods. Types of qualitative and quantitative methods for measuring protein levels are well known in the art, and include the experimental methods described herein. Specific protein level comparison methods for each method are well known in the art. Therefore, detecting the target protein means detecting the presence or absence of the collagen protein, or confirming an increase (up-regulation) or decrease (down-regulation) of the protein level.
본 명세서에서 사용된 용어, "분석"은 바람직하게는 "측정"을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.As used herein, the term "analysis" may preferably mean "measurement", and the qualitative analysis may mean measuring and confirming the presence or absence of a target substance, and the quantitative analysis may mean It may mean measuring and confirming changes in the presence level (expression level) or amount of the desired substance. In the present invention, analysis or measurement may be performed without limitation including both qualitative and quantitative methods, and preferably, quantitative measurement may be performed.
상기 조성물이 mRNA의 수준을 측정하기 위한 것인 경우, 상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다. 본 발명에 따른 바이오마커 유전자들의 mRNA에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용함으로써 피검체에서 상기 바이오마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.When the composition is for measuring the level of mRNA, the agent for measuring the level of mRNA may be a primer set or a probe that specifically binds to mRNA. The composition of the present invention including the mRNA-specific primer set or probe of the biomarker genes according to the present invention may further include an agent required for a known RNA detection method. The mRNA level of the biomarkers can be measured in a subject by using a known method for detecting RNA using the composition of the present invention without limitation.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.In the present invention, the "primer" is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes a forward and reverse primer pair, preferably a primer pair that provides an analysis result having specificity and sensitivity. High specificity can be imparted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that the primer amplifies only the target gene sequence containing a complementary primer binding site and does not cause non-specific amplification. .
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.In the present invention, the "probe" means a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and means a substance that can specifically confirm the presence of a target substance in a sample through the binding. The type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but preferably may be peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferably Most likely it is PNA. More specifically, the probe is a biomaterial, including one derived from or similar to a living organism or manufactured in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, nerve cells, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins may include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
본 발명에 따른 바이오마커 (단백질 또는 유전자)의 정보 (아미노산 서열, 핵산 서열 등)는 공지되어 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다. 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.Since the information (amino acid sequence, nucleic acid sequence, etc.) of the biomarker (protein or gene) according to the present invention is known, a primer, probe, or antisense nucleotide that specifically binds to the gene encoding the protein based on this information (amino acid sequence, nucleic acid sequence, etc.) can be easily designed. Primers or probes may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods, and include all functional equivalents. In addition, primers or probes may be variously modified according to methods known in the art to the extent that hybridization with mRNA is not hindered. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of one or more homologs of the natural nucleotide, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc. ) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of fluorescent or enzymatic labeling materials.
본 발명의 조성물이 단백질의 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.When the composition of the present invention is for measuring the level of a protein, the agent for measuring the level of the protein may be an antibody or an aptamer specific to the protein.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.As used herein, the term "antibody" refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody means an antibody that specifically binds to a marker protein, and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. In addition, as long as they have antigen-antibody binding properties, a part of the entire antibody is also included in the antibody of the present invention, and all types of immunoglobulin antibodies that specifically bind to the protein of the present invention are included. For example, complete antibodies with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of antibody molecules, i.e. Fab, F(ab'), F(ab') with antigen-binding
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머 (aptamer)"는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "aptamer" refers to a substance capable of specifically binding to an analyte to be detected in a sample, and a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure in itself. nucleic acid), it is possible to specifically confirm the presence of a target protein in a sample. The aptamer is synthesized by determining the sequence of an oligonucleotide that is selective for the target protein to be identified and has high binding ability according to the general aptamer preparation method, and then the 5' or 3' end of the oligonucleotide is applied. It can be made by modification with -SH, -COOH, -OH or NH 2 so that it can bind to the functional group of the timer chip, but is not limited thereto.
본 발명의 조성물은 상기 바이오마커 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체 (또는 피검체로부터 수득한 생물학적 시료)에서 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.The composition of the present invention may additionally include an agent required for the method of detecting the biomarker protein, and the subject (or biological obtained from the subject) may be used without limitation by using a known protein detection method using the present composition. The expression level of the protein in the sample) can be measured.
본 발명에 따른 조성물은 진단을 필요로 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 분석을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서 "생물학적 시료"란 림프종을 진단하거나 이의 발병 위험도 등을 예측하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료는 액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체 등으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 비침습적 진단을 위한 것으로서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.The composition according to the present invention can be used for analysis of a biological sample isolated from a subject in need of diagnosis. In the present invention, "biological sample" may be included without limitation as long as it is collected from a subject to be diagnosed with lymphoma or to predict the risk of developing the disease. For example, the biological sample may be selected from liquid, whole blood, plasma, urine, saliva, tissue, cell, organ, bone marrow, fine needle aspiration specimen, core needle biopsy specimen, and vacuum aspiration biopsy specimen. can Preferably, the composition according to the present invention is for non-invasive diagnosis, and the biological sample may be at least one selected from the group consisting of blood, whole blood, plasma, serum, and lymph.
상기 생물학적 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화 (homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 피험체로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출 (sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.The biological sample may be pretreated before being used for detection or diagnosis. For example, it may include homogenization, filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like. The sample may be prepared to increase the detection sensitivity of a protein marker, for example, a sample obtained from a subject may be subjected to anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography , it may be pretreated using methods such as sequential extraction or gel electrophoresis.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 개의 림프종 진단용 키트를 제공할 수 있다. In addition, the present invention can provide a kit for diagnosing canine lymphoma, including the composition according to the present invention.
본 발명에 있어서, "키트 (kit)"란 특히 시료 내에 포함되어 있는, 본 발명에 따른 바이오마커들의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하여 림프종을 진단할 수 있는 검진용 기기 또는 세트 등을 의미하며, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 유전자들의 발현량을 측정할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 예컨대, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드 (Rapid) 키트, 질량분석 키트, 마이크로어레이 키트, 또는 MRM (Multiple reaction monitoring) 키트 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 키트에는 표적 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머 세트, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 이때, 상기 유전자, mRNA, 또는 단백질의 발현 수준을 검출하는 물질은 1회 이상 횟수에 제한 없이 작용시킬 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.In the present invention, "kit" refers to a device or set for diagnosis that can diagnose lymphoma by measuring the amount of mRNA or protein of the biomarkers according to the present invention, which are included in a sample. There is no limitation as long as the expression level of the genes can be measured from a biological sample isolated from an individual. For example, the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a Rapid kit, a mass spectrometry kit, a microarray kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is limited thereto. it is not going to be Accordingly, the kit of the present invention may include an antibody recognizing a target protein as a marker, a primer set recognizing mRNA as a marker, or a probe, as well as one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for an analysis method. At this time, the substance for detecting the expression level of the gene, mRNA, or protein can be acted on one or more times without limitation, there is no limitation before and after applying each substance, and the application of each substance may be performed simultaneously or microscopically. may proceed to
또한, 본 발명에 따른 키트는, 본 발명에 따른 진단방법 등이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다.In addition, the kit according to the present invention may further include instructions describing the diagnostic method and the like according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은, 하기 단계를 포함하는, 개체의 림프종 진단 방법 또는 개의 림프종 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다:Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing a lymphoma in an individual or a method for providing information for diagnosing a lymphoma in a dog, including the following steps:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및(S1) Levels of one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B) in a biological sample isolated from a subject measuring; and
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 Pentaxin 및/또는 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나, F13B의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 림프종으로 진단하거나 림프종이 발병할 위험이 있는 것 (발병할 가능성이 높은 것)으로 판단하는 단계.(S2) If the protein or mRNA level of Pentaxin and/or ITIH4 measured in step (S1) is increased compared to the control group or the protein or mRNA level of F13B is decreased compared to the control group, the risk of diagnosis of lymphoma or the development of lymphoma The stage of judging that there is (high probability of developing).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 및 Fibrinogen gamma chain로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the method comprises ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin- Cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type
또한, 상기 방법은 상기 피검체의 ITIH3 및/또는 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가한 경우 림프종으로 진단하거나 림프종이 발병할 위험이 있는 것 (발병할 가능성이 높은 것)으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.In addition, the method includes the step of diagnosing lymphoma or determining that there is a risk of developing lymphoma (high probability of developing) when the protein or mRNA level of ITIH3 and / or SERPINA3 in the subject is increased compared to the control group. can include more.
또한, 상기 방법은 상기 피검체의 Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 및/또는 Fibrinogen gamma chain의 수준이 대조군에 비해 감소한 경우 림프종으로 진단하거나 림프종이 발병할 위험이 있는 것 (발병할 가능성이 높은 것)으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.In addition, the method can be used to detect Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein of the subject. A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type
본 발명에 따른 진단방법은 Receiver operating characteristics 분석시 Area under curve가 0.7 이상, 0.75 이상, 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.93 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 또는 0.99 이상일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 진단방법은 특이도 및/또는 민감도가 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있다.In the diagnostic method according to the present invention, when analyzing receiver operating characteristics, the area under curve may be 0.7 or more, 0.75 or more, 0.8 or more, 0.85 or more, 0.9 or more, 0.93 or more, 0.95 or more, 0.96 or more, 0.97 or more, 0.98 or more, or 0.99 or more. there is. In addition, the diagnostic method according to the present invention has a specificity and / or sensitivity of 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more or more, 98% or more, or 99% or more.
예컨대, 본 발명에 따른 진단방법이 상기 Coagulation factor XIII B chain의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 진단 특이도는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있고, 진단 민감도는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있으며, ROC AUC는 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.93 이상, 0.95 이상, 또는 0.96 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.For example, when the diagnostic method according to the present invention includes the step of measuring the protein or mRNA level of the Coagulation factor XIII B chain, the diagnostic specificity is 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or greater, diagnostic sensitivity greater than 70%, greater than 75%, greater than 80%, greater than 85%, or greater than 90%, ROC AUC greater than 0.8, greater than 0.85, greater than 0.9, greater than 0.93, greater than 0.95; Or it may be 0.96 or more, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 따른 진단방법이 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 진단 특이도는 70% 이상, 75% 이상, 또는 80% 이상일 수 있고, 진단 민감도는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있으며, ROC AUC는 0.7 이상, 0.75 이상, 0.8 이상, 또는 0.85 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, when the diagnostic method according to the present invention includes the step of measuring the protein or mRNA level of ITIH4, the diagnostic specificity may be 70% or more, 75% or more, or 80% or more, and the diagnostic sensitivity is 70% or more, It may be 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more, and the ROC AUC may be 0.7 or more, 0.75 or more, 0.8 or more, or 0.85 or more, but is not limited thereto.
특히, 본 발명에 따른 바이오마커의 조합의 수준을 측정하는 경우, 진단 정확도는 더욱 높아질 수 있다.In particular, when the level of the biomarker combination according to the present invention is measured, the diagnostic accuracy can be further increased.
예컨대, 본 발명에 따른 진단방법이 Pentaxin, ITIH4, 및 Coagulation factor XIII B로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 진단 특이도는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 93% 이상일 수 있고, 진단 민감도는 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있으며, ROC AUC는 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.93 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 또는 0.99 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.For example, when the diagnostic method according to the present invention includes measuring the levels of two or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4, and Coagulation factor XIII B, the diagnostic specificity is 80% or more, 85% or more . or more, 0.85 or more, 0.9 or more, 0.93 or more, 0.95 or more, 0.96 or more, 0.97 or more, 0.98 or more, or 0.99 or more, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 따른 진단방법이 Pentaxin 및 Coagulation factor XIII B chain의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, ROC AUC는 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.93 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 또는 0.99 이상일 수 있고, P-value는 0.001 이하 또는 0.0001 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, when the diagnostic method according to the present invention includes the step of measuring the level of protein or mRNA of Pentaxin and Coagulation factor XIII B chain, ROC AUC is 0.8 or more, 0.85 or more, 0.9 or more, 0.93 or more, 0.95 or more, 0.96 or more, 0.97 or more, 0.98 or more, or 0.99 or more, and the P-value may be 0.001 or less or 0.0001 or less, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 바이오마커, 생물학적 시료, 피검체 등과 관련된 구체적인 설명은 전술하였으므로 생략한다.Since the detailed description related to the biomarker, biological sample, subject, etc. according to the present invention has been described above, it will be omitted.
본 발명에서 사용된 용어, "정보제공방법(method for providing information)"이란, 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 개체의 생물학적 시료를 분석하거나, 본 발명에 따른 바이오마커들의 수준의 증감을 확인하여 질환의 발병이나 발병 가능성(위험성)에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다. 예컨대, 본 발명에 따른 바이오마커의 수준을 측정하고 대조군과 비교하여 개체에서 림프종이 발병할 가능성이 있는지, 또는 림프종이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 림프종이 이미 발병하였는지에 대한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법을 통하여 림프종 발병 위험성, 즉, 고위험군에 대해서도 예측할 수 있으며, 이를 림프종의 예방 및 치료에 관한 정보를 제공하는 방법으로서도 사용할 수도 있다.As used herein, the term "method for providing information" refers to a method for providing information on diagnosis of a disease by analyzing a biological sample of a subject or increasing or decreasing the level of biomarkers according to the present invention. It refers to a method of obtaining information on the onset or onset (risk) of a disease by checking For example, a method for measuring the level of a biomarker according to the present invention and comparing it with a control group to provide information on whether an individual is likely to develop lymphoma, has a relatively high likelihood of developing lymphoma, or has already developed lymphoma. As a result, the risk of developing lymphoma, that is, the high-risk group can be predicted through the method, and it can also be used as a method of providing information on the prevention and treatment of lymphoma.
본 발명에 있어서, "대조군 (control)"은 정상 개체 또는 림프종을 앓는 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. In the present invention, a "control" may be a biological sample isolated from a normal subject or a subject suffering from lymphoma.
본 발명에 있어서, 단백질 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 단백질 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry; LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), 및 FACS 등의 방법에 의해 측정할 수 있다. In the present invention, the method for measuring the protein level is not particularly limited as long as it is by a protein measuring method known in the art, but protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, Complement fixation method, two-dimensional electrophoretic analysis, liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting, ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay), and FACS.
본 발명에 있어서, mRNA 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 mRNA 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및/또는 RNA 칩 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.In the present invention, the method for measuring the mRNA level is not particularly limited as long as it is by a method for measuring mRNA known in the art, but PCR, RNase protection assay, Northern blotting, Southern blotting, It can be measured by methods such as in situ hybridization, DNA chip, and/or RNA chip.
또한, 본 발명은 개체 (예컨대, 개)의 림프종 진단기기를 제공할 수 있다.In addition, the present invention may provide a device for diagnosing lymphoma of an individual (eg, dog).
본 발명의 상기 진단기기의 측정부는 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 본 발명에 따른 바이오마커, 예컨대, Pentaxin, ITIH4, 및, F13B로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 상기 측정부에서 상기 제제를 이용하여 상기 단백질 또는 유전자의 발현 정도를 확인함으로써 림프종을 진단하거나, 림프종의 발병 위험이 높은 것으로 진단할 수 있다. The expression level of the biomarker according to the present invention, for example, at least one protein selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4, and F13B, or the gene encoding the biomarker according to the present invention, with respect to the measuring unit of the diagnostic device of the present invention, obtained from a subject of interest. The expression level of a protein or gene can be measured using an agent that measures. Lymphoma may be diagnosed or a high risk of developing lymphoma may be diagnosed by checking the expression level of the protein or gene using the agent in the measuring unit.
본 발명의 상기 진단기기는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 단백질 또는 유전자의 발현 정도로부터 개체의 림프종의 유무, 병기, 또는 유형 등을 예측하여 출력하는 검출부를 추가로 더 포함할 수 있다.The diagnostic device of the present invention may further include a detection unit that predicts and outputs the presence, stage, or type of lymphoma of an individual based on the expression level of the protein or gene obtained from the measurement unit.
본 발명에서 상기 검출부는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 단백질 또는 유전자의 발현 정도의 범주에 따라 림프종에 관한 정보를 생성하여 분류함으로써 림프종을 진단할 수 있다.In the present invention, the detection unit can diagnose lymphoma by generating and classifying lymphoma-related information according to the category of expression level of the protein or gene obtained by the measurement unit.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 개에서의 림프종 예방 또는 치료방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for preventing or treating lymphoma in dogs, comprising the following steps:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; (S1) Levels of one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B) in a biological sample isolated from a subject measuring;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 Pentaxin 또는 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나, F13B의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 피검체를 림프종을 앓고 있는 것으로 진단하는 단계; 및(S2) When the protein or mRNA level of Pentaxin or ITIH4 measured in step (S1) is increased compared to the control group or the protein or mRNA level of F13B is decreased compared to the control group, the subject is diagnosed as suffering from lymphoma. step; and
(S3) 림프종을 앓는 것으로 진단된 피검체에서 림프종을 치료하는 단계.(S3) treating lymphoma in a subject diagnosed as suffering from lymphoma.
또한, 본 발명은 개의 림프종 치료제에 대한 반응개체 (즉, 개)의 특성화 방법 (즉, 동반진단 방법)으로서, 하기 단계를 포함하고:In addition, the present invention is a method for characterizing a respondent (i.e., dog) to a therapeutic agent for canine lymphoma (i.e., companion diagnostic method), comprising the following steps:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), 및 Coagulation factor XIII B chain (F13B)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및(a) measuring the level of one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), and Coagulation factor XIII B chain (F13B) in a biological sample isolated from a subject; measuring; and
(b) 상기 단계 (a)에서 측정된 Pentaxin 또는 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나, F13B의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 피검체를 개의 림프종 치료제에 대한 반응자로 판단하는 단계,(b) When the protein or mRNA level of Pentaxin or ITIH4 measured in step (a) is increased compared to the control group or the protein or mRNA level of F13B is decreased compared to the control group, the subject is regarded as a responder to a treatment for canine lymphoma. judgment step,
상기 개의 림프종 치료제는 Laverdia-CA1, Rabacfosadine, Prednisone, Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), 및 Oncovin (vincristine)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 치료제에 대한 반응개체의 특성화 방법을 제공한다.The canine lymphoma treatment agent is at least one selected from the group consisting of Laverdia-CA1, Rabacfosadine, Prednisone, Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), and Oncovin (vincristine). .
본 발명에 있어서, 상기 “치료”는 목적하는 질병과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 화학 요법, 방사선 요법, 외과적 수술, 생물학적 요법, 또는 항생제 투여 등의 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 치료는 수액처치, 약물, 혈장수혈, 및 식이조절 등을 통해 이루어질 수 있다.In the present invention, the "treatment" refers to all activities that improve or beneficially change the desired disease and metabolic abnormalities, and include methods such as chemotherapy, radiation therapy, surgical operation, biological therapy, or antibiotic administration. can be used. For example, the treatment may be performed through fluid treatment, drugs, plasma transfusion, and dietary control.
본 발명에 있어서, 상기 화학 요법(Chemotherapy)은 특정 질병의 치료를 위해 화학물질을 사용하는 행위와 그때 사용되는 약물 전체를 의미한다. In the present invention, the chemotherapy (Chemotherapy) refers to the act of using a chemical substance for the treatment of a specific disease and the entire drug used at that time.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 예컨대, Laverdia-CA1, Rabacfosadine, Prednisone, Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), 및 Oncovin (vincristine) 등을 예로 들 수 있다. In the present invention, examples of the drug include Laverdia-CA1, Rabacfosadine, Prednisone, Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), and Oncovin (vincristine).
본 발명에 있어서, 상기 방사선 요법은 x-선, 감마선 및 중성자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 고에너지 방사선을 환자에게 쪼이는 것을 의미한다. 이런 유형의 요법으로는 외부광선 요법, 내부 방사선 요법, 삽입 방사선, 근접 치료, 및 전신 방사선 요법을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the radiation therapy means exposing a patient to high-energy radiation including, but not limited to, x-rays, gamma rays, and neutrons. This type of therapy includes, but is not limited to, external light therapy, internal radiation therapy, implantation radiation, brachytherapy, and whole body radiation therapy.
본 발명에 있어서, 상기 외과적 수술은 치유, 치료 또는 진단 효과를 얻기 위해 개체의 신체에 대하여 손(hand) 혹은 기기와 함께 손의 방법적 작용을 포함하는 어떠한 치료상 또는 진단 처치를 모두 포함한다.In the present invention, the surgical operation includes any therapeutic or diagnostic procedure involving the methodical action of the hands or instruments in conjunction with the body of a subject to achieve a curative, therapeutic or diagnostic effect. .
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 요법은 생물체에서 유래된 물질이나 생물체를 이용하여 생성시킨 물질을 함유한 생물학적 제제를 이용하여 직, 간접적으로 인체의 면역체계를 이용하는 치료법을 의미하며, 상기 생물학적 제제는 물리적, 화학적 시험만으로는 그 역가와 안정성을 평가할 수 없는 백신, 알레르겐, 항원, 호르몬, 사이토카인, 효소, 혈액 및 혈장, 면역 혈청, 단클론 항체, 발효 제품, 항독소, 및 실험실 진단제 등을 포함한다.In the present invention, the biological therapy refers to a treatment method that directly or indirectly uses the body's immune system using a biological agent containing a material derived from a living organism or a material produced using a living organism, and the biological agent is a physical , vaccines, allergens, antigens, hormones, cytokines, enzymes, blood and plasma, immune sera, monoclonal antibodies, fermented products, antitoxins, and laboratory diagnostics for which potency and safety cannot be assessed by chemical testing alone.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 반려견의 혈액 수집Example 1. Dog blood collection
수의사가 각 개체로부터 혈액을 채취하고 혈청분리 후 혈청을 별도의 tube에 채취하여 분석 전까지 -80℃에 보관하였다. 총 114두의 반려견으로부터 혈액 시료를 수집하였다. A veterinarian collected blood from each individual and after serum separation, the serum was collected in a separate tube and stored at -80 ° C until analysis. Blood samples were collected from a total of 114 dogs.
실시예 2. 반려견 혈액 시료의 전처리Example 2. Pretreatment of canine blood samples
고성능 액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)에 연결한 고농도 혈장 단백질 제거 컬럼 MARS14 컬럼 (100×4.6 mm; Agilent Technology, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 혈장 시료에서 14종의 고농도 (high abundant) 혈장 단백질을 제거하고 저농도 (low abundant) 단백질을 분리하였다. 분리된 저농도 단백질은 자동화된 액체 분주 시스템 (Bravo Automated Liquid Handling Platform; Agilent사)을 이용하여 펩티드를 제조하는 전처리 과정을 수행하였다 (도 1a). 14 high concentrations ( High abundant plasma proteins were removed and low abundant proteins were isolated. The isolated low-concentration protein was subjected to a pretreatment process for producing peptides using an automated liquid dispensing system (Bravo Automated Liquid Handling Platform; Agilent) (FIG. 1a).
즉, 40 μL의 혈장시료를 MARS14 컬럼에 주입하여 상위 14 개의 풍부한 단백질 (albumin, IgA, IgG, IgM, α1-antitrypsin, α1-acid glycoprotein, apolipoprotein A1, apolipoprotein A2, Complement C3, transferrin, α2-macroglobulin, transthyretin, haptoglobin, 및 fibrinogen)을 제거하였다 (도 1b). 이를 위해, 혼합물을 Agilent사의 buffer A (#5185-5987)로 4배 희석하고 Shimadzu HPLC LC20AT 시스템의 MARS14 컬럼에 로딩하였다. 결합되지 않은 저농도 혈장 단백질의 분획을 동결건조한 후, 재흡수하여 Suspension trap 방법을 이용해 펩티드로 제조했다 (도 1c). 5% SDS (50mM TEAB) 버퍼로 재흡수하여 10 mM이 되도록 1,4-디티오트레이톨 (1,4-Dithiothreitol)을 첨가하고 95℃에서 10분 동안 반응시켜 이황화결합을 환원시켰다. 그 후, 알킬화를 위해 20 mM이 되도록 아이오도아세트아미드 (iodoacetamide)를 첨가하여 암조건하에 실온에서 30분 동안 반응시키고, 6 μg의 트립신/라이스씨 혼합물로 37℃에서 18시간 동안 분해시켰다. 용출된 페티드는 콜드 트랩 (CentriVap Cold Traps, LABCONCO)으로 동결 건조하고 사용할 때까지 영하 80℃에서 보관했다.That is, 40 μL of plasma sample was injected into the MARS14 column and the top 14 abundant proteins (albumin, IgA, IgG, IgM, α1-antitrypsin, α1-acid glycoprotein, apolipoprotein A1, apolipoprotein A2, Complement C3, transferrin, α2-macroglobulin , transthyretin, haptoglobin, and fibrinogen) were removed (Fig. 1b). To this end, the mixture was diluted 4-fold with Agilent's buffer A (#5185-5987) and loaded onto the MARS14 column of the Shimadzu HPLC LC20AT system. After freeze-drying the unbound low-concentration plasma protein fraction, it was reabsorbed and prepared as a peptide using the suspension trap method (FIG. 1c). The mixture was reabsorbed with 5% SDS (50 mM TEAB) buffer, 1,4-dithiothreitol was added to a concentration of 10 mM, and reacted at 95° C. for 10 minutes to reduce disulfide bonds. Thereafter, for alkylation, iodoacetamide was added to a concentration of 20 mM, reacted for 30 minutes at room temperature under dark conditions, and digested with 6 μg of a trypsin/rice seed mixture at 37° C. for 18 hours. The eluted petide was freeze-dried with a cold trap (CentriVap Cold Traps, LABCONCO) and stored at minus 80°C until use.
실시예 3. LC-MS 분석Example 3. LC-MS analysis
상기 실시예를 통해 확보된 펩티드들에 대해 SWATCH LC-MS 분석을 수행하였다. 이를 위해, 도 1d에 나타낸 파라미터를 이용하여 LC-MS 분석을 수행하여 스펙트럼을 확보했다. SWATCH LC-MS analysis was performed on the peptides obtained through the above examples. To this end, a spectrum was obtained by performing LC-MS analysis using the parameters shown in FIG. 1d.
구체적으로, 제조된 Peptide 시료에 iRT-Kit (Biognosys AG, Schlieren, Switzerland)에서 제공하는 iRT 표준을 1/10 부피로 샘플에 추가하여 공급 업체 지침 (참고논문: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22577012/)에 따라 머무름 시간을 보정하였다. 각 샘플의 총량은 40 μg이며 40 μL의 용액에 용해시켰다. Specifically, the iRT standard provided by the iRT-Kit (Biognosys AG, Schlieren, Switzerland) was added to the prepared Peptide sample in 1/10 volume to the sample, following the supplier instructions (Reference: https://pubmed.ncbi.nlm Retention times were calibrated according to .nih.gov/22577012/). The total amount of each sample was 40 μg and was dissolved in 40 μL of solution.
주입된 4 μL의 샘플은 다음 LC-MS/MS 설정과 함께 SCIEX TripleTOF 5600+ 시스템 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. LC 분리를 위해 nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, USA)를 Eksigent 마이크로 트랩 C18컬럼 (ChromXP C18CL, 5 μm, 120 Å)과 분석 컬럼으로서 Eksigent 컬럼 (C18-CL, 0.3 × 150 mm, 입자 크기 3 μm, 기공 크기 120 Å)을 함께 컬럼 온도가 40℃로 유지되도록 하고 샘플을 버퍼 A를 사용하여 10 μL/min의 유속으로 트랩 컬럼에 로딩하였다. 10분 후, 펩티드 혼합물은 버퍼 A와 버퍼 B (0.1 % formic acid in HPLC acetonitrile)을 사용하여 57분에 의해 5 μL/분으로 유속으로 농도구배를 통한 분리를 수행하였다. 버퍼 B를 38분 동안 3-25% 변경하고, 5분 동안 25-32% 변경하고, 2분 동안 32-80% 변경하고, 3분 동안, 80%로 유지하고, 3분 동안 80-3% 변경하고, 8분 동안 3%로 유지하였다. A 4 μL sample injected was analyzed using a
개별 샘플의 경우 모든 질량 분석 실행은 100개의 가변 창을 사용하여 모든 이론적 질량 스펙트럼 (SWATH) 모드의 순차 창 수집에서 작동시켜 수행했다. SWATH 매개 변수는 다음과 같이 설정하였다: Lower m/z limit 400; m/z 상한선 1250; 윈도우 오버랩 (Da) 1.0; CES는 작은 창에 대해 5, 큰 창에 대해 8, 가장 큰 창에 대해 10. MS2 스펙트럼은 고감도 모드에서 2.5ms 동안 100-1500m/z 범위에서 수집되었으며 총 사이클 시간은 2.8초였다. 다른 MS 파라미터는 다음과 같이 설정하였다: 이온 소스 가스 1 (GS1) 15 psi; 이온 소스 가스 2 (GS2) 20 psi; 커튼 가스 (CUR) 30 psi; 온도 (TEM) 250 ℃; 이온 스프레이 전압 부동 (ISVF) 5500V.For individual samples, all mass spectrometry runs were performed using 100 variable windows and operating in sequential window acquisition in all theoretical mass spectra (SWATH) mode. The SWATH parameters were set as follows: Lower m/z limit 400; m/z upper limit 1250; Window overlap (Da) 1.0; The CES was 5 for the small window, 8 for the large window, and 10 for the largest window. MS2 spectra were collected in the
실시예 4. 통계 분석Example 4. Statistical analysis
상기 실시예를 통해 각 시료에 대해 SWATH LC-MS 분석을 수행하여 스펙트럼 (spectrum) 결과를 획득하고, DIA-NN software와 Pan-human proteome library를 이용하여 상기 스펙트럼들로부터 단백질들에 대한 정량적, 정성적 정보를 추출하였다. 정상대조군과 림프종군의 시료별로 중간값 기반의 정규화된 단백질들의 양 정보를 로그 스케일 (Log scale)로 분석한 결과 재현성을 보이는 것을 확인하고 단백질들의 정량 정보를 이용하여 통계분석을 수행하였다.Through the above example, SWATH LC-MS analysis was performed on each sample to obtain a spectrum result, and quantitative and quantitative analysis of proteins from the spectra was performed using DIA-NN software and Pan-human proteome library. Sexual information was extracted. As a result of analyzing the amount information of normalized proteins based on the median value for each sample of the normal control group and the lymphoma group on a log scale, it was confirmed that reproducibility was shown, and statistical analysis was performed using quantitative information of proteins.
[실험예][Experimental example]
실험예 1. 혈액 시료의 채취Experimental Example 1. Collection of blood samples
동물병원에서 보호자 동의서를 받은 뒤, 수의사에 의해 혈액을 채취하고 혈청분리 후 혈청을 별도의 tube에 채취하여 분석 전까지 -80℃에 보관하였으며 총 116두의 반려견으로부터 혈액 시료를 수집하였다. 수집된 반려견들의 그룹 정보는 아래 표 1에 나타냈다.After receiving consent from the guardian at the veterinary hospital, blood was collected by the veterinarian, and after serum separation, the serum was collected in a separate tube and stored at -80 ° C until analysis, and blood samples were collected from a total of 116 companion dogs. The group information of the collected companion dogs is shown in Table 1 below.
실험예 2. 혈장 시료로부터 분리한 단백질들의 총량 분석Experimental Example 2. Analysis of the total amount of proteins isolated from plasma samples
실시예 2에 따라 S-trap를 기반으로 trypsin/LysC로 116개의 혈장 시료들을 peptide로 제조하고, Nanodrop을 이용하여 펩티드의 양을 정량하였다 (도 2). 그 결과, 최고 1,023 μg에서 최소 214 μg의 펩티드가 수득되었음을 확인하였다. 통상적으로 단백질 분석시 8 μg 정도의 펩티드만 분석하는 것을 감안하면, 연구에 충분한 양의 펩티드가 제조되었음을 알 수 있었다.According to Example 2, based on S-trap, 116 plasma samples were prepared as peptides with trypsin/LysC, and the amount of peptides was quantified using Nanodrop (FIG. 2). As a result, it was confirmed that a minimum of 214 μg of peptide was obtained at a maximum of 1,023 μg. Considering that only about 8 μg of peptide is usually analyzed during protein analysis, it was found that a sufficient amount of peptide was prepared for the study.
실험예 3. 정상 그룹 대비 림프종 개체에서 차별적인 수준을 보이는 단백질들의 선별Experimental Example 3. Selection of proteins showing differential levels in lymphoma subjects compared to normal groups
반려견들의 혈장으로부터 분리한 펩티드 시료들에 대해 Sciex사의 Quadupole Time of Flight (Q-TOF) mass spectrometry를 수행하여 Data-independent acquisition (DIA) 방식으로 스펙트럼을 확보하였다. 확보된 스펙트럼은, 기확보된 개의 pooling된 단백질 시료들로부터 Data dependent acqusition (DDA) 방식으로 확보한 스펙트럼 라이브러리를 활용하여 비교분석하였으며, DIA-NN 알고리즘으로 단백질의 정성 및 정량적 정보를 추출하였다. Sciex's Quadupole Time of Flight (Q-TOF) mass spectrometry was performed on the peptide samples isolated from the plasma of dogs, and the spectrum was obtained by Data-independent acquisition (DIA) method. The obtained spectrum was compared and analyzed using a spectrum library obtained by Data Dependent Acquisition (DDA) method from pooled protein samples of previously secured dogs, and qualitative and quantitative information of the protein was extracted with the DIA-NN algorithm.
SWATH LC-MS 분석 결과 114개 시료에서 총 701개의 단백질들을 정량분석할 수 있었으며, 시료별 정량 가능한 단백질들의 수는 도 3에 나타냈다. 정량된 단백질의 수는 그룹별로 차이가 없었으며 missing value가 있는 경우 80%의 frequency를 기준으로 random normal distribution으로 imputation 하여 분석을 진행하였다. As a result of SWATH LC-MS analysis, a total of 701 proteins could be quantitatively analyzed in 114 samples, and the number of quantifiable proteins for each sample is shown in FIG. 3 . There was no difference in the number of quantified proteins by group, and if there was a missing value, the analysis was performed by imputation with a random normal distribution based on 80% frequency.
정상대조군 대비 림프종 혈액 혈장에서 차별적으로 존재하는 단백질들 (Diffrentially expressed proteins, DEPs)은 총 29개로서, 통계적으로 유의하게 정상 대조군 대비 림프종 혈액 혈장에서 증가한 단백질들은 총 4개, 감소한 단백질들은 25개로 확인됐다 (도 4). 29개 DEP들에 대한 p value와 fold change는 도 5에 나타냈다. A total of 29 proteins (Differentially expressed proteins, DEPs) were differentially expressed in the lymphoma blood plasma compared to the normal control group, and a total of 4 proteins and 25 proteins were decreased in the lymphoma blood plasma compared to the normal control group. was done (Fig. 4). The p value and fold change for 29 DEPs are shown in FIG. 5 .
실험예 4. 반려견의 림프종 진단을 위한 단백질 마커 조합의 선별Experimental Example 4. Screening of protein marker combinations for diagnosis of canine lymphoma
정상 그룹 대비 림프종 그룹에서 차별적인 수준을 보이는 29개 DEP 중 Pentaxin은 C-Reactive protein으로 염증 수준을 반영하는 마커로 알려진 단백질이다. 또한, Coagulation factor XIII B chain (F13B)은 림프종 그룹에서 통계적으로 유의하게 감소한 단백질인데, Receiver operating characterictics 분석 결과 Area under curve (AUC)가 0.966으로, 특이도 및 민감도는 각각 90%에 해당되는 것으로 나타났다 (도 6a). 또한, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4)는 정상 대조군 대비 림프종 그룹에서 증가하는 것으로 나타났으며, 특이도 80%, 민감도 90%, 그리고 ROC AUC가 0.855로 나타났다 (도 6b).Among the 29 DEPs showing differential levels in the lymphoma group compared to the normal group, Pentaxin is a C-Reactive protein known as a marker that reflects the level of inflammation. In addition, Coagulation factor XIII B chain (F13B) is a protein that was statistically significantly decreased in the lymphoma group. As a result of Receiver operating characteristic analysis, the Area under curve (AUC) was 0.966, and the specificity and sensitivity were 90%, respectively. (Fig. 6a). In addition, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4 (ITIH4) was found to increase in the lymphoma group compared to the normal control group, with a specificity of 80%, a sensitivity of 90%, and an ROC AUC of 0.855 (Fig. 6b). ).
이어서, 정상 대조군과 림프종 그룹 간에 차이를 보이는 15개 단백질들을 조합하여 Partial least squre discriminant analysis를 수행한 결과, 18개 림프종 그룹 모두 정상 대조군과 명확히 구별되어 민감도 100%를 나타내는 것을 확인하였다 (도 7).Subsequently, as a result of performing partial least square discriminant analysis by combining 15 proteins showing differences between the normal control group and the lymphoma group, it was confirmed that all 18 lymphoma groups were clearly distinguished from the normal control group and exhibited 100% sensitivity (FIG. 7). .
Logistic regression 분석을 통한 panel로 분석한 결과, Pentaxin과 Coagulation factor XIII B chain을 결합한 모델의 경우, 33개의 정상 대조군 중 32개를 정확하게 구별할 수 있었으며, 18개의 림프종 중 16개를 정확하게 구별하는 것으로 나타났다 (도 8). ROC 분석 결과 AUC는 0.995로서 특이도는 93.9%, 민감도는 100%를 나타냈다. 또한, 이 regression 모델에 대한 통계적 유의성 p value는 <0.0001로 매우 유의적인 것으로 나타났다.As a result of panel analysis through logistic regression analysis, in the case of the model combining Pentaxin and Coagulation factor XIII B chain, it was found that 32 out of 33 normal controls could be accurately distinguished, and 16 out of 18 lymphomas could be accurately distinguished. (FIG. 8). As a result of ROC analysis, AUC was 0.995, indicating 93.9% specificity and 100% sensitivity. In addition, the statistical significance p value for this regression model was <0.0001, which was very significant.
따라서, 본 발명자들은 상기 결과로부터 반려견 혈액 100 μL을 이용하여 본 발명에 따른 마커 단백질들을 정량하면 100%의 민감도로 림프종을 진단할 수 있음을 확인하였다.Therefore, the present inventors confirmed from the above results that lymphoma can be diagnosed with a sensitivity of 100% when the marker proteins according to the present invention are quantified using 100 μL of canine blood.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다. The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
Claims (13)
A dog comprising, as an active ingredient, an agent for measuring at least one protein or mRNA level selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), and F13B (Coagulation factor XIII B chain) A composition for diagnosing lymphoma.
상기 Pentaxin 또는 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 림프종 개체에서 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 진단용 조성물.
According to claim 1,
The composition for diagnosing canine lymphoma, characterized in that the protein or mRNA level of Pentaxin or ITIH4 is increased in lymphoma subjects compared to normal subjects.
상기 F13B의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 림프종 개체에서 감소되어 있는 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 진단용 조성물.
According to claim 1,
The composition for diagnosing canine lymphoma, characterized in that the protein or mRNA level of F13B is reduced in lymphoma subjects compared to normal subjects.
상기 조성물은 ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 및 Fibrinogen gamma chain로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 진단용 조성물.
According to claim 1,
The composition is ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein AI, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III A composition for diagnosing canine lymphoma, further comprising an agent for measuring the level of at least one protein or mRNA selected from the group consisting of, and Fibrinogen gamma chain.
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 진단용 조성물.
According to claim 1,
The composition for diagnosing canine lymphoma, characterized in that the agent for measuring the protein level is an antibody or an aptamer specific to the protein.
상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 진단용 조성물.
According to claim 1,
The composition for diagnosing canine lymphoma, characterized in that the agent for measuring the mRNA expression level is a primer set or a probe that specifically binds to the mRNA.
상기 단백질 또는 mRNA 수준은 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서의 수준인, 개의 림프종 진단용 조성물.
According to claim 1,
The composition for diagnosing canine lymphoma, wherein the protein or mRNA level is at least one level selected from the group consisting of blood, whole blood, plasma, serum, and lymph.
A kit for diagnosing canine lymphoma, comprising the composition of any one of claims 1 to 7.
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), 및 F13B (Coagulation factor XIII B chain)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 Pentaxin 또는 ITIH4의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나, F13B의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 림프종으로 진단하거나 림프종이 발병할 위험이 있는 것으로 판단하는 단계.
A method for diagnosing canine lymphoma, comprising the following steps:
(S1) Levels of one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of Pentaxin, ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family, member 4), and F13B (Coagulation factor XIII B chain) in a biological sample isolated from a subject measuring; and
(S2) If the protein or mRNA level of Pentaxin or ITIH4 measured in step (S1) is increased compared to the control group, or the protein or mRNA level of F13B is decreased compared to the control group, it is diagnosed as lymphoma or at risk of developing lymphoma. stage of judgment.
상기 방법은 상기 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin (TF), Factor XI, Apolipoprotein A-I, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X, Complement factor I, Apolipoprotein C-III, 및 Fibrinogen gamma chain로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인, 개의 림프종 진단 방법.
According to claim 9,
The method includes ITIH3, SERPINA3, Apolipoprotein D, CD5 molecule-like (CD5L), Attractin, Complement C9, Vitronectin (VTN), Complement C7, Lecithin-cholesterol acyltransferase, Peptidase D, Transferrin ( TF), Factor XI, Apolipoprotein AI, Kallikrein B1, Adiponectin (C1Q and collagen domain containing; ADIPOQ), Complement C3 (LOC484960), C-type lectin domain family 3 member B, Phosphodiesterase 4D Interacting Protein (PDE4DIP), Coagulation factor X , Complement factor I, Apolipoprotein C-III, and Fibrinogen gamma chain, further comprising measuring the level of at least one protein or mRNA selected from the group consisting of, the method for diagnosing canine lymphoma.
상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 개의 림프종 진단 방법.
According to claim 9,
The method of diagnosing canine lymphoma, wherein the biological sample is at least one selected from the group consisting of blood, whole blood, plasma, serum, and lymph fluid.
상기 단백질 수준은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry; LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), 및 FACS으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 진단 방법.
According to claim 9,
The protein level is measured by protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) assay, radioimmunoassay, radioimmuno-diffusion method, Oucteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoretic assay, liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC) -MS), LC-MS / MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry / Mass Spectrometry), Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), and FACS, characterized in that measured by one or more methods selected from the group consisting of, Lymphoma Diagnosis Methods.
상기 mRNA 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 개의 림프종 진단 방법.According to claim 9,
The mRNA level is measured by one or more methods selected from the group consisting of PCR, RNase protection assay, northern blotting, southern blotting, in situ hybridization, DNA chip, and RNA chip. A method for diagnosing canine lymphoma.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2022/019273 WO2023101445A1 (en) | 2021-12-01 | 2022-11-30 | Biomarker for diagnosing malignant lymphoma of companion dog |
Applications Claiming Priority (2)
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| KR20210170153 | 2021-12-01 | ||
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|---|---|---|---|---|
| KR20210066725A (en) | 2019-11-28 | 2021-06-07 | 김현숙 | A kit for diagnosing allergen of canine and a method of diagnosing allergy using the same |
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2022
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Patent Citations (1)
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