KR20230074125A - 락토오스 불내성의 검출을 위한 유용한 도구 및 방법 및 이의 용도 - Google Patents

락토오스 불내성의 검출을 위한 유용한 도구 및 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 측면 유동 면역분석법에 의해 샘플에서 락토오스 내성 마커를 검출하는 방법, 측면 유동 면역분석 장치, 프라이머 및 추출 버퍼 및 이의 용도 및 상기 방법에 유용한 관련 도구 및 분석법에 관한 것이다.

Description

락토오스 불내성의 검출을 위한 유용한 도구 및 방법 및 이의 용도
본 발명은 LFA에 의해 생물학적 샘플에서 락토오스 불내성 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 방법에 유용한 관련 도구 및 분석법에 관한 것이다.
락타아제 비지속성 또는 락토오스 불내성으로도 알려진 성인형 저유당분해효소증은 장 세포에서 락타아제-플로리진 가수분해효소(LPH)의 생리학적 활성 감소로 인해 발생하는 광범위한 상염색체 열성 상태이다(Enattah et al., 2002, Nature Genetics, 30, 233-237; Misselwitz et al., 2019, Gut, 68:2080-2091).
락토오스 불내성은 소장에 위치한 이 전용 효소의 활성이 부족하여 락토오스를 소화할 수 없는 상태를 의미한다. 따라서, 소화되지 않은 락토오스 분자는 결장 세균총에 존재하는 박테리아에 의해 처리되어 복통, 팽창, 고창, 설사 및 가스 팽창과 같은 임상 증상을 초래하는 부산물을 생성한다. 불내성이 진단되면, 락토오스 함유 식품은 잠재적으로 영양 결함, 예를 들어, 골 무기질 최고 골량 변경 및 중증 골다공증 소인에 대한 위험을 증가시키는 식단에서 제외된다(Mattar et al., 2012, Clinical and Experimental Gastroenterology, 5 113-121; Misselwitz et al., 2019, supra).
이 상태는 세계 인구의 약 68%(95% CI 64-72)에 영향을 미치는 것으로 평가되었으며, 이는 락토오스 불내성(LI)으로 이어질 수 있다(Storhaug et al., 2017, Lancet Gastroenterol Hepatol, 2: 738-46). 유병률은 매우 다양하며 북서부 유럽(덴마크)의 5%에서 일부 아시아 및 아프리카 인구의 거의 100%에 이르는 지리적 영역과 관련이 있다(Di Stefano et al., 2009, Digestive and Liver Disease, 41, 474-479; Harrington et al., 2008, Int J Clin Pract, October, 62, 10, 1541-1546; Storhaug et al., 2017, supra). 세계 락토오스 불내성 치료제 시장(식품 보조제, 식료품, 효소 및 치료/진단제 포함)은 7.10%의 CAGR을 기록하고 2025년까지 USD 410억 달러에 이를 것으로 예상된다.
현행 표준법은 락토오스 50g 섭취 후 호기 수소 테스트로 소화되지 않은 락토오스이 장내세균총에 의해 발효되는 것을 시간간격으로 호기 수소를 측정하여 관찰하는 방식이다(Enko et al., 2014, Gastroenterology Research and Practice, 464382; Marton et al., 2012, Aliment Pharmacol Ther, 35: 429-440). 널리 사용되고 있음에도 불구하고, 이 테스트는 항생제에 의해 변경될 수 있는 세균총의 활동 또는 또는 위음성 결과로 이어지는 산성 결장 pH에 의존한다. 또한, 많은 양의 수소, 이산화탄소 및 메테인의 생성 때문에 테스트는 환자에게 매우 고통스러울 수 있다. 유전적 다형성 C/T-13910과 비교한 진단 성능은 전체 민감도 88% 및 특이도 85%로 좋은 상관관계를 나타냈다(Marton et al., 2012, supra).
대변의 총당과 환원당 및 대변 pH 측정은 소아의 락토오스 흡수 장애에 대한 간접적인 테스트이다. 락토오스 불내성이 있는 유아의 대변 pH는 일반적으로 5.5 내지 6.0 미만이다. 총당/환원당의 최대 0.25%는 정상으로 간주된다. 생리적 락토오스 흡수 장애가 있는 어린 모유 수유 유아의 경우, 농도가 더 높을 수 있다. 테스트는 위음성 결과의 비율이 높기 때문에 2세 이상의 어린이에게는 권장되지 않는다(Heine et al., 2017, World Allergy Organization Journal, 10:41).
다른 잘 확립된 분석법은, 매우 침습적이지만, 환자 소장의 생검 샘플에서 수행되는 락타아제 활성의 직접 측정에 의존한다. 10U/g 단백질의 컷오프 값을 갖는 신속 락타아제 테스트(Biohit)는 C/T-13910 다형성과 대비하여 각각 민감도 95% 및 특이도 100%로 중증 십이지장 저유산증 환자를 효과적으로 식별할 수 있다(Kuokkanen et al., 2006, Endoscopy, 38 (7): 708-712).
유전적으로, 락타아제 암호화 유전자(LCT)의 발현은 MCM6 유전자에 위치한 조절 영역인 약 14kb 업스트림 LCT의 영향을 받는다. 뉴클레오타이드의 여러 변이체, 특히 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 락타아제 지속성 및 비지속성과 관련이 있다. SNP는 가장 단순한 형태의 DNA 서열 가변성이다(오직 하나의 변형된 뉴클레오타이드).
유럽에서는 주요 변이가 -13910C > T로 확인되었다. -13907C > G 및-13915T > G와 같은 다른 변이는 아프리카와 중동에서 온 이민자에게서 발견된다(Abildgaard et al., 2018, Clinica Chimica Acta, 482, 50-56). 실제로, 이 유전자좌(-13910C > T)에서 T 대립유전자(C/T 또는 T/T)의 하나 또는 둘 모두의 사본을 보유하고 있는 개체는 충분한 락타아제 활성을 가지고 있다. 반대로, T 대립 유전자(C/C)의 사본이 없는 개체는 락토오스을 소화할 수 없으며 락토오스 불내성으로 분류된다(상기 도 1에 제공된 Carlos et al., 2017, Biotechnology Reports, 16, 21-25; Enattah et al., 2002). 여러 그룹이 호흡 검사를 통해 유전자 검사와 락타아제 활성 사이의 상관 관계를 조사하여 두 방법 사이의 좋은 일치를 찾았다(상기 Di Stefano et al., 2009; 상기 Marton et al., 2011). 양성 유전자 검사는 환자가 락타아제 비지속성의 유전적 소인이 있는지를 나타내지만 실제 환자 증상에 대한 정보를 제공하지 않는다(상기 Di Stefano et al., 2009).
현재, 유전자 검사는 DNA의 고충실도 PCR 증폭을 수행하기 위해 오염 물질이 없는 잘 갖추어진 실험실에서 수행된다. 등온 증폭 기술은 새로운 DNA 증폭 분석법이다. 루프-매개 등온 증폭(LAMP)은 50-70℃에서 DNA 증폭을 위해 노토미 등(Notomi et al., 2000, Nucleic Acids Res., 28(12):E63)이 2000년에 개발한 방법이다. 이 방법은 DNA 중합효소와 표적 DNA에서 총 6개의 별개의 서열을 인식하도록 특별히 설계된 4개의 프라이머 세트를 사용한다. 표적 DNA의 센스 및 안티센스 가닥의 서열을 포함하는 내부 프라이머가 LAMP를 개시한다. 외부 프라이머에 의해 프라이밍된 다음 가닥 변위 DNA 합성은 단일 가닥 DNA를 방출한다. 이것은 스템-루프 DNA 구조를 생성하는 표적의 다른 쪽 끝에 혼성화하는 두 번째 내부 및 외부 프라이머에 의해 프라이밍된 DNA 합성을 위한 주형 역할을 한다. 후속 LAMP 사이클링에서, 하나의 내부 프라이머가 제품의 루프에 혼성화하고 변위 DNA 합성을 시작하여 원래 스템-루프 DNA와 스템이 두 배 긴 새로운 스템-루프 DNA를 생성한다. 순환 반응은 1시간 이내에 표적 사본 109개를 축적하면서 계속된다. 최종 생성물은 표적의 역반복이 여러 개 있는 스템-루프 DNA와 동일한 가닥에서 교대로 역전된 표적 반복 사이의 어닐링에 의해 형성된 다중 루프가 있는 콜리플라워와 같은 구조이다. LAMP 방법은 박테리아, 기생충 및 바이러스 감염; 항생제 내성과 세균성 독소에 널리 사용되었다(Schoepp et al., 2017, Sci. Transl. Med. 9, eaal3693; Modak et al., 2016, Infectious Diseases: Research and Treatment, 9, 1-9; Yin et al., 2016, Letters in Applied Microbiology, 63, 16-24; Li et al., 2019, Infection and Drug Resistance, 12, 2343-2353; Wang et al., 2017, Front. Microbiol., 8:192). 최근 상기 칼로스 등., 2017은 협측 세포 DNA 샘플을 사용하여 락토오스 불내성과 관련된 단일 뉴클레오타이드 다형성의 특성화를 위해 LAMP를 사용하였다. 상기 아빌드가드 등., 2018은 혈액에서 용융 곡선 분석을 사용하여 락토오스 불내성 및 검출을 위해 상업적으로 LAMP 키트를 사용하였다. 이러한 테스트는 안타깝게도 현장 진료로 간주되지 않으며 고도로 숙련된 직원을 필요로 한다.
결과적으로, 현장 진료 테스팅에서 수행할 수 있는 락토오스 불내성을 쉽게 검출하기 위한 정확하고 비용 효율적인 방법 및 도구를 개발할 필요성이 매우 높다.
본 발명은 가정 테스트에 적합한 전통적인 골드 표준 유전자 분석보다 더 빠르고 수행하기 쉬운 등온 DNA 증폭(LAMP)과 결합된 차세대 측면 흐름 분석(LFA)을 기반으로 락토오스 불내성을 확인하기 위한 매우 정확한 방법의 발견에 관한 것이다. 이는 고전적인 검출 방법(형광, 비색, 용융 곡선 또는 겔 전기영동)이 특정 실험실 장비를 필요로 하고 더 많은 시간이 소요되므로 현장 진료용으로 적합하지 않기 때문에 특히 유리하다. 특히, 본 발명의 방법은 (i) 본 발명의 추출 버퍼를 사용한 신속한 DNA 분리, (ii) 본 발명의 프라이머를 사용한 분리된 DNA의 LAMP 증폭 및 (iii) 측면 유동 면역 분석으로 증폭된 DNA의 탐지를 조합하는 예상외로 유리한 신속한 분석법을 제공한다. 락토오스 불내성의 검출은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 특정 유전적 다형성 C/T-13910 및/또는 G/A-22018 변이체의 존재 또는 부재 및 특히 (락타아제 지속성에 특이적인) T 대립유전자 또는 A 대립유전자의 존재 또는 부재의 검출을 기초로 한다. 본 발명의 방법은 락토오스 불내성에 관한 간접적인 정보를 제공한다: 하나 또는 둘 모두의 대립유전자가 존재하는 경우, 이는 락타아제 지속성을 나타내므로 락토오스 내성을 나타낸다. T 또는 A 대립유전자 부재의 경우, 이는 락타아제 결핍(락토오스 소화를 담당하는 효소인 락타아제를 생성할 수 없음) 및 따라서 락토스 불내성을 나타낸다.
본 발명의 목적은 대상의 락토오스 불내성을 민감하고 특이적으로 검출하기 위한 비침습적(예를 들어, 면봉 또는 손가락 찌르기 혈액 샘플을 사용한 타액 샘플링에 기초함) 방법을 제공하는 것이다.
혈액 또는 타액 샘플과 같은 샘플에서 락타아제 지속성 바이오마커의 민감성(예를 들어, >90%) 및 특이성(예를 들어, >90%) 검출을 위한 방법을 제공하는 것이 유리하다.
적어도 하나의 락타아제 지속성 바이오마커, 특히 유전자 다형성 C/T-13910 변이체 및/또는 G/A-22018의 존재 또는 부재를 간단하고 민감하며 특이적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이 유리하며, 여기서 상기 방법은 T 대립유전자(-13910 C/T)의 사본 존재 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재를 검출한다.
1시간 이내에 락타아제 지속성 바이오마커의 존재 또는 부재를 간단하고 민감하며 특이적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이 유리하다.
생물학적 샘플, 특히 혈액 또는 타액 샘플로부터 효율적인 방식으로 DNA를 추출할 수 있게 하는 DNA 추출 버퍼를 제공하는 것이 추가로 유리하다.
락타아제 지속성에 특이적인 LAMP에 의해 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)에 대해 특이적으로 효율적인 DNA 증폭을 가능하게 하는 프라이머를 제공하는 것이 유리하다.
본 발명의 다른 목적은 샘플 내 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재 유무를 민감하고 특이적으로 검출하기 위한 테스트 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 샘플, 특히 혈액 또는 타액 샘플로부터 효율적인 방식으로 DNA를 추출할 수 있는 DNA 추출 버퍼를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효율적인 방식으로 LAMP에 의해 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)에 대해 특이적으로 DNA 증폭을 허용하는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 청구항 1에 따른 측면 유동 면역분석법, 청구항 10에 따른 방법 또는 청구항 15 또는 16에 따른 키트를 제공함으로써 달성되었다.
본 발명의 제 1 측면에 따라 생물학적 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재를 정성적으로 검출하기 위한 측면 유동 면역분석 장치가 개시되며, 상기 측면 유동 면역분석 장치는 보강 지지체 및 상기 보강 지지체 상에 모세관 유동 어레이 및 위킹 패드를 포함한다. 모세관 유동 어레이는 i) 보강 지지체의 한 말단에 위치한 샘플 수용 패드; ii) 샘플 수용 패드와 구별되거나 샘플 수용 패드에 통합되고 샘플 수용 패드와 모세관 접촉하고 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터 선택되는 적어도 하나의 표지된 대립유전자에 특이적이고 결합하는 제 1 결합제를 포함하는 적어도 하나의 검출 시약이 함침된 접합체 방출 패드, 상기 제 1 결합제는 제 1 표지 모이어티에 접합된다; iii) 접합체 방출 패드와 구별되고 접합체 방출 패드와 모세관 접촉하고 검출 막, 적어도 하나의 시약 테스트 라인을 포함하는 포획 테스트 시약 어레이 및 적어도 하나의 대조군 시약 라인을 포함하는 포획 대조군 시약 어레이를 포함하는 검출 패드를 포함하며, 상기 포획 시약 및 대조군 시약 어레이는 검출 막 상에 고정되고, 위킹 패드는 보강 지지체의 다른 말단에 위치하고 검출 패드와 모세관 접촉하고, 상기 적어도 하나의 시약 테스트 라인은 상기 표지된 증폭 대립유전자의 표지에 대한 항체를 포함하고 상기 적어도 하나의 대조군 시약 라인은 검출 시약의 제 1 결합제에 대한 특이적 친화도를 갖는 대조군 시약을 포함한다. 상기 적어도 하나의 검출 시약은 접합체 방출 패드로부터 확산적으로 방출될 수 있다. 접합체 방출 패드는 상기 적어도 상기 하나의 검출 시약이 모세관 방출 가능 방식으로 결합되는 검출 시약 지지체를 포함하며, 샘플 수용 패드로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 또는 타액으로부터 증폭된 DNA)을 수용하고 검출 시약 지지체로부터 검출 시약을 방출하고 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A) 분석물이 샘플에 존재하고 검출 시약과 결합될 때 제 1 면역 복합체가 형성된다. 제 1 면역 복합체는 상기 대립유전자에 대한 표지에 대한 상기 적어도 하나의 항체를 포함하는 상기 적어도 하나의 시약 테스트 라인에 결합하는 검출 패드로 이동한다. 과량의 검출 시약은 상기 대조군 시약 라인에 의해 포획된다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 생물학적 샘플에서 락토오스 내성 마커를 검출하는 방법이 본 발명에 개시되며, 이 방법은 LFA에 의해 생물학적 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재(또는 부재)를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 락토오스 불내성 검출용 키트가 제공되며, 상기 키트는 본 발명에 따른 적어도 하나의 측면 유동 면역분석 장치를 포함한다.
본 발명의 제 1 양태에 따라, DNA 추출 버퍼가 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 제 1 양태에 따라, T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터 선택되는 적어도 하나의 락타아제 지속성 바이오마커의 특이적 증폭을 위한 LAMP 프라이머 세트가 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 상기 Enattah et al. 2002에 기술된 바와 같이 조절 영역이 있는 성체 락타아제 비지속성 유전자좌의 물리적 지도를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 LAMP 프라이머(5'-3')의 디자인 및 단계(A) LAMP용으로 디자인된 프라이머(프라이머 디자인)의 표현 ref: https://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html , primer design; (B) 표적 DNA의 6-8개 영역을 인식하는 4-6개의 프라이머를 사용하는 루프 매개 등온 증폭(LAMP)를 개략적으로 나타낸 것이다. 가닥 치환 DNA 중합효소가 합성을 개시하고, 후속 증폭을 용이하게 하기 위해 프라이머 형태 루프 구조 중 2개가 Alhassan et al., 2015, Trends in Parasitology, 31(8)에 기술된 바와 같이 사용되며 얻은 증폭된 DNA 생성물(앰플리콘), 증폭된 T-대립유전자(-13910C/T)는 DIG 및 비오틴으로 표지되고 증폭된 A-대립유전자(-22018G/A)는 FAM 또는 FITC 및 비오틴(C)으로 표지될 것이다.
도 3은 본 발명의 측면 유동 면역분석법(A), 본 발명의 LFA 검출 단계(B) 및 그 판독(C)에 사용되는 주요 단계의 개략도이다. B: 본 발명의 방법에서, 특히 표지된 앰플리콘의 검출을 위해 A에 기술된 바와 같은 본 발명의 측면 유동 면역분석법을 사용하여, 분석물(표지된 증폭 DNA 대립유전자 마커(들)(9))을 함유하는 샘플(8)은 샘플 수용 패드에 적용되고 상기 표지된 증폭 대립유전자 마커(제 1 표지 모이어티를 갖는 제 1 결합제)에 대한 검출 시약을 포함하는 접합체 방출 패드로 이동한 다음 방출되어 샘플과 함께 증폭된 DNA 대립유전자 마커에 대한 표지에 대한 적어도 하나의 항체가 결합되며(T1: 테스트 라인 1) 및 선택적으로 또 다른 증폭된 DNA 대립유전자 마커에 대한 다른 표지에 대한 적어도 하나의 추가 항체(T2: 테스트 라인 2) 및 제 1 결합제에 특정한 대조군 제제(C: 대조군 라인)가 결합된 검출 막을 포함하는 검출 패드로 이동한다. 분석물이 없는 경우(테스트 음성), 검출 시약은 대조군 라인에만 결합하고(도 3Bb), 분석물이 있는 경우(테스트 양성), 분석물(증폭된 표지된 DNA 대립 유전자 마커(들))은 검출 패드 표면의 제 1 결합제에 결합하고 검출 시약(예를 들어, 첫 번째 표지 모이어티가 있는 제 1 결합제(예를 들어, 스트렙타비딘))이 검출 패드 상의 분석물(테스트 라인에 고정된 항체)에 부착되고 대조군 라인(예를 들어 BSA-비오틴)은 과량의 검출 시약을 포획한다(도 3Bc); C: 판독값은 분석물(예를 들어, 증폭된 표지된 DNA 대립유전자 마커), 포획 테스트 시약(예를 들어, 상기 표지된 DNA 대립유전자 마커(들)의 표지) 및 검출 시약(예를 들어, 스트렙타비딘과 접합된 금 나노입자)에 의해 형성된 면역 복합체에 형성된 테스트 라인(T) 형태이고 검출 시약은 포획 대조군 시약(예를 들어, BSA- 비오틴 복합체) 및 검출 시약(예를 들어, 스트렙타비딘과 접합된 금 나노입자)에 의해 형성된 면역 복합체에 의해 형성된다. 판독값의 여러 예가 예로 제공된다.
도 4는 실시예 1에 상세하게 기술된 바와 같이 LFA(상단) 또는 겔 전기영동(하단)에 의한 탐지 후 T-ASO와 C-ASO에 의한 혼합 DNA 증폭(A) 또는 LFA에 의한 사용한 유전자형 검출 후 T-ASO(a) 및 C-ASO(b)에 의한 개별 DNA 증폭(B)의 결과를 도시한다.
"생물학적 샘플"이라는 용어는 구강 면봉 샘플 및 전혈 샘플과 같은 타액 샘플을 포함한다.
"전혈 샘플"라는 용어는 희석되거나 희석되지 않은 및/또는 수용액에 담긴 모든 혈액 샘플을 의미한다. 전혈 샘플은 전혈 손가락 찌름일 수 있다.
"수성 용액"이라는 용어는 물을 함유하거나 물에 놓이는 것, 예를 들어, 정제수, 증류수, 멸균수 또는 주사용수를 의미하는 것으로 의도된다.
"용기"라는 표현은 바이알, 원심분리기 튜브, 플라스크, 에펜도르프 튜브, 마이크로 원심분리기 튜브, U자형 튜브, 채혈 튜브, 엉겅퀴 튜브, 혼성화 튜브, 모세관, 윈트로브 튜브, 배양 튜브, 마이크로 역가 튜브, 헤마토크릿 튜브 및 마이크로 헤마토크릿 튜브와 같은 샘플 수집, 샘플 희석 및 샘플 준비에 적합한 모든 수용자를 의미한다.
"DNA 추출 버퍼"라는 표현은 생물학적 샘플로부터 DNA 물질을 분리하는 데 적합한 버퍼를 의미한다. 적합한 DNA 추출 버퍼의 참조 또는 예는 Walker et al., 2019, Biosensors, 9, 117; doi:10.3390/bios9040117; Erlichster et al., 2018, The Journal of Molecular Diagnostics, 20(3); Soejima et al., 2011, The Journal of Molecular Diagnostics, 13(3); Komatsu et al., 2013, J. Infect. Chemother., DOI 10.1007/s10156-013-0630-9; Yamamoto et al., 2015, PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0133204에서 찾을 수 있다.
"DNA 증폭 버퍼"라는 표현은 특히 LAMP에 의한 분리된 DNA 물질의 증폭에 적합한 버퍼를 의미한다. 적합한 DNA 증폭 버퍼의 참조 또는 예는 Abbasi et al., 2016, Acta Trop., 162: 20-26, doi: 10.1016/j.actatropica.2016.06.009; Noden et al., 2018, PLoS One., 13(2): e0192331.; Becherer et al., 2020, Anal. Methods, 12, 717에서 찾을 수 있다.
"휴대용 가열기"라는 표현은 예를 들어 Curtis et al., 2012, PLoS One, 7(2): e31432.; Singleton et al., 2014, PLoS One, 9(11): e113693에 기술된 것과 같이 LAMP 반응 매질을 가열하기에 적합한 휴대용 가열 시스템 또는 ThermoFisher Scientific(Fisher Scientific AG, Neuhofstrasse 11 - CH 4153 Reinach - Suisse)에서 공급하는 것과 같은 실험실 튜브용 전기 드라이 블록 히터를 지칭한다.
발명의 분석
도면, 특히 먼저 도 3a를 참조하면, 생물학적 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재를 정성적으로 검출하기 위한 측면 유동 면역분석 장치는 다음을 포함한다:
- 보강 지지체(2)
- 상기 보강 지지체 상의 모세관 유동 어레이(3),
- 위킹 패드(4),
모세관 유동 어레이(3)는 i) 보강 지지체의 한 말단에 위치한 샘플 수용 패드(5); ii) 샘플 수용 패드와 구별되거나 샘플 수용 패드에 통합되고 샘플 수용 패드(5)와 모세관 접촉하고 제 1 표지 모이어티(611b)에 접합된 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터 선택되는 적어도 하나의 표지된 대립유전자에 특이적이고 결합하는 제 1 결합제를 포함하는 적어도 하나의 검출 시약(61)이 함침된 접합체 방출 패드(6); iii) 접합체 방출 패드와 구별되고 접합체 방출 패드와 모세관 접촉하고 검출 막(73), 적어도 하나의 시약 테스트 라인(711a)을 포함하는 포획 테스트 시약 어레이(71) 및 하나의 대조군 시약 라인(721)을 포함하는 포획 대조군 시약 어레이(72)를 포함하는 검출 패드(7)를 포함하며, 상기 포획 시약 및 대조군 시약 어레이는 검출 막(73) 상에 고정되고, 위킹 패드(4)는 보강 지지체(2)의 다른 말단에 위치하고 검출 패드(7)와 모세관 접촉하고, 상기 적어도 하나의 시약 테스트 라인(711a)은 상기 표지된 대립유전자의 표지에 대한 항체를 포함하고 상기 대조군 시약 라인은 제 1 결합제(61)에 대한 특이적 친화도를 갖는 대조군 시약을 포함한다. 선택적으로, 포획 테스트 시약 어레이(71)는 추가로 표지된 대립유전자의 다른 표지에 대한 다른 항체와 같은 추가 시약 테스트 라인(711b,...n)을 포함할 수 있다.
접합체 방출 패드(6)는 검출 시약 지지체(62)를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 검출 시약(61)은 모세관 방출 가능 방식으로 결합되고, 샘플 수용 패드(5)로부터 샘플(8)(예를 들어, 전혈 또는 타액)을 수용하고 검출 시약 지지체(62)로부터 검출 시약(61)을 방출하고 제 1 면역 복합체는 대립유전자 분석물(9)(예를 들어, T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A))가 샘플에 존재하고 결합될 때 형성된다. 제 1 면역복합체는 대립유전자 분석물의 표지에 대한 항체를 포함하는 포획 시약 어레이(71)로부터 상기 적어도 하나의 시약 테스트 라인(711a 또는 711b, 711n)(샘플에 존재하는 대립유전자에 따라 다름)에 결합하는 검출 패드(7)로 이동한다. 과량의 검출 시약(61)은 포획 대조군 시약 어레이(72)로부터 상기 하나의 대조군 시약 라인(721a)에 의해 포획된다.
특정 실시태양에 따르면, 보강 지지체는 폴리바이닐 클로라이드(PVC)와 같은 비다공성 재료로 제조된다.
다른 특정 실시태양에 따르면, 샘플 수용 패드는 생물학적 샘플을 수용하기 위한 기공을 갖는다. 전형적으로, 샘플 수용 패드는 샘플이 적용되는 흡수 패드를 포함하고 전형적으로 직물 메쉬 또는 셀룰로오스 필터로 구성된다. 어떤 재료를 선택하든, 샘플 수용 패드는 균일한 위킹 속도가 분석 재현성을 보장할 수 있도록 일관된 흡수성, 두께 및 밀도를 나타내야 한다. 샘플 수용 패드는 또한 분석물의 손실을 방지하기 위해 낮은 단백질 결합을 가져야 한다. 단백질(예를 들어, BSA, 우유 단백질, 젤라틴 등) 또는 폴리머/계면활성제로 차단하는 것과 같은 전처리는 분석물의 비특이적 결합을 줄이기 위해 샘플 수용 패드에 적용될 수 있다. 샘플 수용 패드는 적혈구 보유 특성을 갖도록 설계될 수 있다.
다른 특정 실시태양에 따르면, 접합체 패드는 샘플 수용 패드와 동일한 재료/지지체로 제조될 수 있다.
다른 특정 실시태양에 따르면, 접합체 방출 패드의 검출 시약 지지체는 전형적으로 검출 시약이 건조된 부직포 유리 섬유로 구성된다. 샘플 수용 패드가 포화되면, 샘플은 접합체 방출 패드로 흘러 들어가 검출 시약을 방출하고 다시 접합체 방출 패드를 떠나 검출 시약 지지대에서 샘플과 함께 검출 패드의 검출 막으로 이동한다.
다른 특정 실시태양에 따르면, 검출 시약은 유색 또는 형광 입자(표지 모이어티)에 접합된 스트렙타비딘(대립유전자 분석물에 특이적이고 결합하는 제 1 결합제)과 같은 대립유전자 마커(예를 들어, 비오틴)에 특이적이다.
특정 양태에 따르면, 표지 모이어티는 금 나노입자, 라텍스 비드, 셀룰로오스 비드, 형광 표지/입자 및 다른 콜로이드 금속 및 유색/형광 판독을 생성하는 자성 입자 또는 측면 유동 분석에서 일반적으로 사용되는 임의의 다른 입자일 수 있다. 추가 실시태양에 따르면, 표지 모이어티는 금, 셀룰로오스 또는 라텍스 입자이다.
특정 양태에 따르면, 검출 막은 나이트로셀룰로오스 막 또는 셀룰로오스 아세테이트, 폴리바이닐리덴 플루오라이드(PVDF), 전하 변형 나일론, 폴리에터설폰(PES) 또는 처리/비처리 셀룰로오스의 막으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 나이트로셀룰로오스 막은 기공 크기 범위(0.05 내지 12μm)를 나타내며 본 분석법에 적합하다.
특정 양태에 따르면, 90 내지 180 사이의 정제수(s/40 mm)에 대한 모세관 속도 감소 웹으로 표현되는 모세관 유동 값이 본 분석법에 적합하다.
포획 시약은 일반적으로 각각 2개의 포획 시약 어레이(테스트 및 대조군 시약)에서 검출 막을 가로질러 고정되며 각각의 포획 시약 어레이는 하나 이상의 라인을 포함한다. 테스트 라인(들)은 샘플 대상 분석물(예를 들어, 항체)을 결합하는 데 사용되며, 대조군 라인은 종 특이적 항체(예를 들어, 항마우스/항토끼 항체)와 같은 제 1 결합제의 검출에 특이적인 제제로 이루어지며 측면 유동 면역측정법이 정상적으로 수행되고 있음을 입증하는 데 사용된다.
특정 양태에 따르면, 위킹 패드는 셀룰로오스/면 섬유로 구성된다.
특정 양태에 따르면, 측면 유동 면역분석법은 모세관 유동 어레이 및 위킹 패드를 보호하고 상기 샘플 수용 패드 상에 샘플을 로딩하기 위한 샘플 수용 패드 위에 개구부 및 테스트의 시각적 해석(컬러 라인의 존재/부재)을 위한 포획 시약 어레이 위의 한 개구부를 갖는 강성 하우징(예를 들어, 플라스틱 카세트)에 삽입될 수 있다.
특정 실시태양에 따르면, 검출 패드는 포획 테스트 시약 어레이에 하나 이상의 시약 테스트 라인을 포함할 수 있다. 특히, 포획 테스트 시약 어레이는 적어도 항-DIG 항체를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 포획 테스트 시약 어레이는 적어도 항-FAM 및/또는 항-FITC 항체를 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 포획 테스트 시약 어레이는 적어도 하나의 항-DIG 항체 및 적어도 하나의 항-FAM 및/또는 항-FITC 항체를 포함한다.
특정 실시태양에 따르면, 제 1 결합제에 특이적인 대조군 제제는 BSA-비오틴이다.
본 발명의 면역분석법의 준비
샘플 수용 패드는 Ref. A1660, A8950 또는 A8951과 같은 증폭된 DNA 진단을 위한 고순도 천연 또는 합성 섬유로 이루어진 단층 플라즈마 분리 매체로서 Ahlstrom-Munksjo®로부터 구입할 수 있다. 사전 처리된 또는 접합되지 않은 패드는 Ahlstrom-Munksjo Ref. A8964 또는 A8914과 같은 유리 및/또는 폴리에스터 섬유로 제조될 수 있다. 특정 실시태양에 따르면, 검출 막은 모세관 유동 시간(sec/4cm)을 나타내는 밀리포어의 Hi-FlowTM Plus, HF-120, HF-135 또는 HF-180과 같은 나이트로셀룰로오스로 제조될 수 있다. BSA, 카제인, 젤라틴, 우유 단백질 또는 폴리머/계면활성제와 같은 차단 단백질로 검출 막을 처리하면 배경 신호를 줄이고 분석물의 비특이적 결합을 줄일 수 있다. 위킹 패드는 과도한 액체를 흡수하는 역할을 하며 우수한 흡수 특성을 가져야 한다. 예를 들어, Ahlstrom-Munksjo Ref. A222 또는 A237로부터의 면 섬유가 사용될 수 있다.
테스트 라인용 포획 시약은 PBS 또는 기타 저염 버퍼에서 0.1 내지 2.0 mg/ml 농도로 사용될 수 있다. 차단/운반체 단백질, 계면활성제 또는 알코올(에탄올)의 첨가는 검출 막에 대한 테스트 라인의 결합 및 건조를 최적화하는 데 사용될 수 있다. 혈청 단백질 및 기타 종에 대한 최소한의 교차 반응을 갖는 BSA-비오틴 접합체는 PBS 또는 기타 저염 버퍼에서 0.5 내지 2.0mg/ml의 농도로 희석되어 대조군 제제로 사용될 수 있다.
모든 종이와 막(샘플 수용 패드, 접합체 패드, 검출 막 및 위킹 패드)은 전처리될 수 있으며 모세관 흐름 배열의 길이와 다른 막의 중첩에 따라 각각의 너비로 절단된다. 차단 용액으로 전처리하는 경우, 처리된 막은 특정 조건(예를 들어, 37℃, 10% RH(상대 습도), 실온 및 10% RH에서 2시간 또는 밤새)에서 건조될 필요가 있다. 접합제 방출 패드로부터 검출 시약 지지대에 검출 시약을 분무하는 것은 공기압(예를 들어, 2 PSI), 예를 들어 1μl/cm의 펌프 분배 유동 및 예를 들어 5cm/초의 층 속도를 가진 분배 장치(BioDot 또는 Kinematic Automation)로 구현될 수 있다. 분무된 검출 시약 지지체는 위와 동일한 조건으로 건조될 수 있다. 항체(포획 테스트 시약 어레이의 테스트 라인) 및 포획 대조 비오티닐화된 단백질(예를 들어, BSA-비오틴)(대조군 라인)을 희석하고 유사한 분배 기계(1μl/cm의 펌프 분배 유동 및 5cm/초의 층 속도를 가짐)를 사용하여 검출 막의 다른 위치에 적용된다. 검출 막은 위에서 언급한 것과 동일한 조건에서 건조된다. 분석의 모든 구성요소의 조립은 손으로 또는 자동화된 프로세스로 이루어진다. 종이와 막이 다른 조립된 카드는 분석 무결성을 보호하기 위해 커버 테이프(투명 접착 플라스틱)로 덮을 수 있다. 그런 다음 조립된 카드는 분석에 적합한 스트립으로 절단된다(예를 들어, 너비 3.0 내지 7.0mm). 절단된 스트립은 스트립을 보호하기 위해 플라스틱 카세트에 조립되고, 알루미늄 파우치에 건조제로 채워지고 열 밀봉 기계로 밀봉될 수 있다. 모든 생산 및 조립 단계는 온도(<25℃) 및 습도(<40% RH)가 제어되는 클린룸에서 일어난다. 액세서리(선택 사항)와 최종 키트의 조립, 밀봉된 파우치에서 테스트, 키트 박스에서 사용 지시는 제어되지 않은 환경에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법
본 발명의 특정 양태에 따르면, 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 수용액에 DNA 물질(앰플리콘)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 상기 DNA 물질은 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터의 DNA를 표적으로 하는 특이적 증폭 및 표지화 처리되었다;
b) 상기 샘플을 i) 상기 표지된 증폭 대립유전자에 대한 검출 시약을 포함하는 접합체 방출 패드 및 ii) 상기 증폭된 대립유전자(들)의 표지에 대한 적어도 하나의 항체가 결합된 검출 막을 포함하는 검출 패드를 포함하는 측면 유동 면역분석법으로 처리하는 단계;
c) 상기 증폭된 대립유전자(들)의 표지에 대한 상기 적어도 하나의 항체가 결합된 위치에서 검출 막 상의 검출 라인의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 상기 검출 라인의 존재는 상기 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)를 나타낸다.
본 발명의 다른 특정 양태에 따르면, 샘플에서 락토오스 내성 마커를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
i. 수용액에 DNA 물질(앰플리콘)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 상기 DNA 물질은 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터의 DNA를 표적으로 하는 특이적 증폭 및 표지화 처리되었다;
ii. 상기 샘플을 i) 상기 표지된 증폭 대립유전자에 대한 검출 시약을 포함하는 접합체 방출 패드 및 ii) 상기 증폭된 대립유전자(들)의 표지에 대한 적어도 하나의 항체가 결합된 검출 막을 포함하는 검출 패드를 포함하는 측면 유동 면역분석법으로 처리하는 단계;
iii. 상기 증폭된 대립유전자(들)의 표지에 대한 상기 적어도 하나의 항체가 결합된 위치에서 검출 막 상의 검출 라인의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 상기 검출선의 부재는 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 부재를 나타내며, 이것이 락토오스 내성 마커가 된다.
특정 양태에 따르면, 본 발명의 방법 또는 본 발명의 면역분석법에 의한 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재 검출은 락토오스 내성이라고도하는 락타아제 지속성을 나타낸다.
특정 양태에 따르면, 본 발명의 방법 또는 본 발명의 면역분석법에 의한 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 부재의 검출은 락타아제 비지속성 또는 락토오스 불내성을 나타낸다.
특정 양태에 따르면, 증폭된 DNA 물질(앰플리콘)은 LAMP 증폭으로부터 얻어진다.
다른 특정 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 증폭된 DNA 물질(앰플리콘)은 생물학적 샘플로부터 추출된 DNA의 LAMP 증폭에 의해 얻어졌다.
추가의 다른 특정 양태에 따르면, 생물학적 샘플(예를 들어, 전혈 또는 타액)이 본 발명에 따른 추출 버퍼의 존재하에서 DNA 추출 단계를 거치는 추출 단계에서 LAMP 증폭 전에 생물학적 샘플로부터 DNA 물질이 추출되며, 상기 추출 버퍼는 약 0.1 내지 약 0.5mM EDTA(예를 들어, 0.2mM) 및 약 20 내지 약 50mM NaOH(예를 들어, 25mM)를 포함한다.
다른 추가 특정 양태에 따르면, DNA 추출 단계는 약 95-100℃(예를 들어, 약 98℃)에서 약 2-5분 동안 수행된다.
특정 양태에 따르면, 증폭은 동일한 추출 버퍼를 사용하여 실온에서도 수행될 수 있다(예를 들어, 실온에서 5분, 20-25℃).
특정 양태에 따르면, 본 발명에 따른 DNA 추출 버퍼는 특정 장비 없이 10분 이내에 생물학적 샘플로부터 DNA 추출을 달성할 수 있게 한다.
특정 양태에 따르면, 증폭된 DNA 물질(앰플리콘)은 LAMP 증폭으로부터 얻어지며 T 대립 유전자(-13910 C/T)로부터의 DNA는 다음 그룹에서 선택된 다음 프라이머 세트를 사용하여 특이적으로 증폭되고 표지된다:
- SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
- SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
- 생성된 증폭 DNA를 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지된다.
추가의 특정 양태에 따르면, FIP 프라이머는 표지화 그룹으로 표지된다.
추가의 특정 양태에 따르면, FIP 프라이머가 표지화 그룹으로 표지되는 경우, 상기 프라이머는 5' 또는 3' 말단에(또는 이의 F1c 부분 또는 B1c 부분 상에), 특히 5'에서 표지된다.
다른 특정 양태에 따르면, BIP 프라이머는 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 표지화 그룹으로 표지된다.
추가의 특정 양태에 따르면, T 대립유전자(-13910 C/T)로부터 DNA의 LAMP 증폭에 사용되는 LB 프라이머는 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함한다. 이 프라이머는 스트렙타비딘으로 표지된 검출 입자로 검출하기 위해 비오틴으로 5' 말단에서 증폭된 DNA의 표지화를 허용한다. LB 프라이머 자체는 LB 프라이머의 3' 또는 5' 말단에 표지될 수도 있다.
다른 특정 양태에 따르면, 증폭된 DNA 물질(앰플리콘)은 LAMP 증폭으로부터 얻어지며 A 대립유전자(-22018G/A)로부터의 DNA는 다음 그룹에서 선택된 다음 프라이머 세트를 사용하여 특이적으로 증폭되고 표지된다:
- SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
- SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 9의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
- 생성된 증폭 DNA를 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지화된다.
추가의 특정 양태에 따르면, A 대립유전자(-22018G/A)로부터 DNA의 LAMP 증폭에 사용되는 LB 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함한다. 이 프라이머는 스트렙타비딘으로 표지된 검출 입자로 검출하기 위해 비오틴으로 증폭된 DNA의 표지화를 허용한다.
특정 양태에 따르면, DNA 물질(앰플리콘)은 전술한 바와 같이 FIP, FOP 또는 F3, BIP, BOP 또는 B3 및 LB 프라이머 중 적어도 하나의 세트를 사용하여 LAMP 증폭으로부터 얻어진다.
다른 특정 양태에 따르면, DNA 물질(앰플리콘)은 전술한 바와 같이 FIP, FOP 또는 F3, BIP, BOP 또는 B3 및 LB 프라이머의 두 세트를 사용하여 LAMP 증폭으로부터 얻어진다. 이 경우, 한 세트의 FIP 또는 BIP 프라이머의 표지는 다른 세트의 FIP 또는 BIP 프라이머의 표지와 다르다. 특정 실시태양에 따르면, 각각의 세트는 테스트될 환자의 특정 인종에 따라 유용할 수 있다. 예를 들어, 유럽의 백인 인구는 -13910 C/T일 가능성이 높고 중동 또는 아프리카 인구는 -22018G/A일 가능성이 높다.
유리하게는, 두 세트의 프라이머를 모두 포함하는 키트는 인구의 모든 민족에 유용할 것이다.
특정 양태에 따르면, LAMP 증폭은 약 70 내지 약 80℃의 증폭 온도에서 수행된다.
특정 양태에 따르면, LAMP 증폭은 약 20분 내지 약 30분 동안 증폭 온도에서 수행된다.
특정 양태에 따르면, 수용액에 제공된 DNA 물질(앰플리콘)은 -13910C/T의 T 대립유전자(TT 또는 TC 대립유전자 변이체)로부터의 DNA를 표적으로 하는 특이적 증폭 및 표지화를 거친 DNA 물질이다.
다른 추가의 특정 양태에 따르면, 예를 들어 Jackson Immuno Research Europe 또는 Biotechne AG 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-DIG 항체가 시약 테스트 라인으로서 측면 유동 면역분석법의 검출 막에 결합되고 DIG 표지된 T 대립유전자(-13910 C/T)의 존재 검출은 단계 c)에서 수행되는 본 발명에 따른 방법이 제공된다.
다른 추가의 특정한 양태에 따르면, 예를 들어 Jackson Immuno Research Europe 또는 Biotechne AG 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 항-FAM 또는 항-FITC 항체가 시약 테스트 라인으로서 측면 유동 면역분석법의 검출 막에 결합되고 FAM 또는 FITC 표지된 T 대립유전자(-13910 C/T)의 존재 검출은 단계 c)에서 수행되는 본 발명에 따른 방법이 제공된다.
특정 양태에 따르면, 수용액에 제공된 DNA 물질(앰플리콘)은 -22018 G/A로부터의 A 대립유전자로부터 DNA를 표적으로 하는 특이적 증폭 및 표지화를 거친 DNA 물질이다.
다른 추가의 특정 양태에 따르면, 적어도 하나의 항-DIG 항체가 시약 테스트 라인으로서 측면 유동 면역분석의 검출 막에 결합되고 DIG 표지된 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재 검출은 단계 c)에서 수행되는 본 발명에 따른 방법이 제공된다.
다른 추가의 특정 양태에 따르면, 적어도 하나의 항-FAM 또는 항-FITC 항체가 시약 테스트 라인으로서 측면 유동 면역분석의 검출 막에 결합되고, FAM 또는 FITC A 대립유전자(-22018 G/A)는 단계 c)에서 수행된다.
다른 추가의 특정 양태에 따르면, T 대립유전자(-13910 C/T) 및 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재(또는 부재)가 모두 검출되는 본 발명에 따른 방법이 제공된다. 이 경우, 측면 유동 면역분석법의 검출막은 A-대립유전자(예를 들어, FAM/FITC 또는 DIG)에 대한 제 1 표지를 검출하기 위한 제 1 시약 테스트 라인 및 T-대립유전자(예를 들어, DIG 또는 FAM/FITC)에 대한 제 2 표지를 검출하기 위한 제 2 시약 테스트 라인을 포함하며, 여기서 첫 번째 표지와 두 번째 표지는 동일하지 않다.
다른 추가의 특정 양태에 따르면, 고전적 방법(>1h)에 비해 30-45분 미만으로 수행될 수 있는 락토오스 내성 마커 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 키트
본 발명의 한 실시태양에 따르면, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 락타아제 지속성 바이오마커를 검출하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 본 발명에 따른 적어도 하나의 측면 유동 면역분석 장치를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 상기 적어도 하나의 측면 유동 면역분석 장치는 건조제와 함께 파우치에 밀봉된다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 상기 적어도 하나의 측면 유동 면역분석 장치는 플라스틱 카세트에 조립된다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 발명의 키트는 다음 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다:
- 샘플 수집 장치(예를 들어, 손가락 찌르기 혈액 샘플을 채취하기 위한 피펫 또는 자동 랜싯 또는 협측 세포에서 DNA 샘플링을 위한 모세관 튜브, 모세관 피펫 또는 면봉);
- 샘플을 희석하거나 순수한 샘플로 테스트를 실행하기 위한 버퍼 용액이 담긴 용기(예를 들어, 캡과 드로퍼가 있는 저밀도 폴리에틸렌(LDPE) 플라스틱 병 또는 드로퍼가 있는 기타 밀폐된 플라스틱 병)
- 사용 지침.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 본 발명의 키트가 제공된다:
- 소독 패드;
- 반창고;
- 분석 결과를 판독하고 선택적으로 데이터베이스(예를 들어, 환자 입원 데이터 세트)로 전송하기 위한 데이터 판독기;
- LAMP 반응 매질을 70-80℃로 가열하기 위한 휴대용 히터.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 생물학적 샘플로부터 DNA 추출을 위한 용해/추출 버퍼를 추가로 포함하는 본 발명의 키트가 제공된다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, DNA 증폭(LAMP) 버퍼를 추가로 포함하는 본 발명의 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 락타아제 지속성 바이오마커를 검출하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 본 발명에 따른 적어도 하나의 프라이머를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터 DNA를 증폭 및 표지하기 위한 LAMP 키트가 제공되며, 상기 LAMP 키트는 본 발명의 적어도 하나의 프라이머를 포함한다:
본 발명의 특정 측면에 따르면, T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터 DNA를 증폭 및 표지하기 위한 LAMP 키트가 제공되며, 상기 LAMP 키트는 다음 프라이머의 세트를 포함한다:
- SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
- SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
- 생성된 증폭 DNA를 비오틴으로 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출/포획될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지된다;
및/또는
- SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
- SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
- SEQ ID NO: 9의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
- 생성된 증폭 DNA를 비오틴으로 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출/포획될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지화된다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 추출 버퍼를 포함하는 DNA 추출 키트를 제공하는 것이다.
추가 양태에 따르면, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 본 발명에 따른 키트 및 본 발명에 따른 방법에서의 이의 용도가 제공된다.
추가 양태에 따르면, 본 발명에 따른 분석법, 방법, 프라이머 또는 키트는 생물학적 샘플에서 유전적 다형성 C/T-13910 변이체 및/또는 G/A-22018 및 따라서 락토오스 내성 마커의 존재 또는 부재의 검출에 유용하다.
추가 양태에 따르면, 본 발명에 따른 분석법 또는 키트는 락토오스 불내성의 검출에 유용하다.
특정 실시태양에 따르면, 본 발명에 따른 방법, 프라이머 및 분석법은 높은 선택성 및 높은 민감성(예를 들어, >90%)으로 매우 빠른 방식(30분 미만)으로 락토오스 불내성의 검출을 가능하게 한다. 본 발명의 프라이머는 증상이 필요한 다른 방법에 비해 명확한 증상 없이도 유전적으로 락토오스 불내성을 검출한다. 또한, 이 테스트는 침습적이지 않으며 배팽창 및 기타 증상을 유발하는 다량의 락토오스 섭취(예를 들어, 호흡 테스트)가 필요하지 않다.
본 발명을 예시하는 실시예는 도면에 나타낸 실시태양을 참조하여 보다 상세한 방식으로 이하에서 설명될 것이다.
실시예
다음 약어는 각각 아래 정의를 나타낸다.
BSA(소 혈청 알부민); PBS(인산염 버퍼 식염수); TBS(트리스 버퍼 식염수); TBST(트윈을 포함한 트리스 버퍼 식염수).
실시예 1: 본 발명에 따른 프라이머
본 발명의 프라이머의 효능 및 본 발명에 따른 방법에서의 이의 유용성을 확인하기 위해, 본 발명의 프라이머를 사용하여 분리된 DNA의 증폭을 다음과 같이 분석하였고 여기서 -13910C/T의 C-대립유전자 변이체를 증폭하고 -13910C/T의 T-대립유전자 변이체를 증폭하는 것은 동시에 사용하였다:
a) 대상으로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공
면봉으로 협측 세포의 샘플을 채취한다. 환자는 DNA 샘플 채취 약 2시간 전에는 먹거나 마시거나 담배를 피워서는 안 된다.
b) 상업적으로 이용 가능한 방법으로 DNA 분리
구강 면봉에서 DNA 추출은 NucleoSpin Tissue(Macherey-Nagel) 방법이라는 상업적 방법으로 대상으로부터 얻었다. 표준 DNA 샘플(Promega)을 양성 대조군으로 사용하였다.
c) DNA 증폭
분리된 DNA는 샘플의 대립유전자 변이체를 완전히 특징화하기 위해 -13910C/T 다형성의 T 대립유전자(C/T 또는 T/T) 또는 C 대립유전자(C/C 또는 C/T)를 증폭하도록 특별히 설계된 프라이머와 함께 LAMP 기술(LavaLAMP, Lucigen)(75℃, 1h)을 사용하여 증폭한다. 특히, 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 다이곡시게닌(DIG) 및 비오틴으로 표지된다.
증폭 단계는 하기 표 1에 기술된 바와 같이 5개의 주형-특이적 프라이머를 사용하며, 그 중 하나는 -13910 C 대립유전자 변이체(C-ASO 프라이머) 또는 -13910 T 대립유전자 형태(T-ASO 프라이머)만을 인식할 수 있는 대립유전자 특이적 올리고(ASO)이다. 다른 3개의 프라이머(FIP, BIP 및 B3)는 C- 및 T-대립유전자 변이체 모두에 대해 공통이다. 마지막 프라이머(LB)는 비오티닐화되고 측면 유동 분석에서 앰플리콘의 검출에 사용되며 C- 및 T-대립유전자 변이체 모두에 대해 유사하다.
프라이머 명칭 DNA 서열 (5'-3')
F3 (-13910T)
(T-ASO)		 GGC AAT ACA GAT AAG ATA ATG TAG T
F3 (-13910C)(C-ASO) GGC AAT ACA GAT AAG ATA ATG TAT C
B3 TAA AAC TAG GAA AAC GCA GG
FIP TGC AGG GCT CAA AGA ACA ATC TAA CTG GCC TCA AAG GAA CTC
BIP (DIG or FAM)TCC ACG AGG ATA GGT CAG TGG AAG ATG GGA CGC TTG AA
LB (Biotin)GGG GAG TAG TAC GAA AGG G
LAMP는 도 2a에 기술된 바와 같이 -13910 C/T의 C-대립유전자 또는 T-대립유전자 변이체를 인식하도록 특별히 디자인된 2개의 다른 F3 프라이머와 C- 및 T-대립유전자 변이체 모두의 증폭을 위한 4개의 다른 프라이머: B3, FIP, BIP 및 LB를 동시에 사용하여 수행하였다.
따라서 각각의 DNA 샘플에 대해 두 가지 증폭을 동시에 하나는 C-ASO 프라이머로, 다른 하나는 T-ASO로 실행함으로써, 두 개의 대립유전자 변이체를 구별하는 것이 가능하였다. DNA 증폭은 Da Silva et al., 2019, Sci Rep. 2019; 9: 4494; Yang et al., 2018, Foodborne Pathogens and Disease. Jun 2018.309-331에 기술된 바와 같이 제조업체 프로토콜(lavaLAMP, Lucigen 또는 Bst3.0 DNA 중합효소 LAMP(NEB))에 따라 수행하였다.
-13910C/T 다형성의 T 대립유전자 변이체를 검출하기 위해 다음 LAMP 프라이머를 사용하였다:
- 정방향 내부 프라이머(FIP): 3' 말단의
Figure pct00001
영역과 5' 말단의 F1c 영역으로 이루어진다. 사용된 FIP 서열은 다음과 같다: F1c 부분에 FAM 표지를 가진
Figure pct00002
(SEQ ID NO: 1). FIP 프라이머의 F1c 부분은 3'-5' 상보적 DNA 서열을 취하고 서열을 반전시켜 5'-3' 상보적 프라이머 서열을 갖도록 디자인된다. 프라이머 FIP의
Figure pct00003
부분은 F3 프라이머 직후 관심 유전자의 5'-3' 서열을 선택하여 디자인된다.
- 정방향 외부 프라이머(FOP, F3 프라이머라고도 함): 주형 서열의 F3c 영역에 상보적인 영역으로 이루어진다. 이 프라이머는 FIP보다 길이가 짧고 농도가 낮다. 사용된 F3 서열(돌연변이형, T-대립유전자)은 다음과 같고: ggcaatacagataagataatgtagt(SEQ ID NO: 2)(T-ASO 프라이머로 불림) 관심 SNP 직전의 DNA 서열에 해당한다.
- 역방향 내부 프라이머(BIP): 3'말단의 B2 영역과 5'말단의 B1c 영역으로 이루어진다. 사용된 BIP 서열은 다음과 같다:
Figure pct00004
(SEQ ID NO: 3). 프라이머 BIP의
Figure pct00005
부분은 관심 유전자의 5'-3' 서열을 선택하여 형성된다. BIP 프라이머의 B2 부분은 3'-5' 상보적 DNA 서열을 취하여 5'-3' 상보적 프라이머 서열을 갖도록 서열을 반전시킴으로써 형성된다. BIP는 FIP에 사용된 것과 동일한 표지로 표지될 수 있지만(B1c 부분) FIP가 표지되지 않은 경우에만 가능하다.
- 역방향 외부 프라이머(BOP, B3이라고도 함). 사용된 BOP 서열은 다음과 같다: 관심 서열의 말단에서 3'-5' 상보적 DNA 서열에 해당하는 taaaactaggaaaacgcagg(SEQ ID NO: 4);
- 비오틴 표지 프라이머(LB). 사용된 LB 서열은 다음과 같다: 비오틴 표지를 갖는 B1c와 B2 사이의 DNA 서열에 해당하는 ggggagtagtacgaaaggg(SEQ ID NO: 5);
-13910C/T 다형성의 C 대립유전자 변이체를 검출하기 위해 동일한 LAMP 프라이머를 사용했으며, F3 프라이머와 FIP 또는 BIP의 표지화만 다음과 같이 수정하였다:
- 정방향 내부 프라이머(FIP): 3' 말단의
Figure pct00006
영역과 5' 말단의 F1c 영역으로 이루어진다. 사용된 FIP 서열은 F1c 부분에 DIG 표지가 있는 SEQ ID NO: 1이다.
- 역방향 외부 프라이머(BIP): 3'말단의 B2 영역과 5'말단의 B1c 영역으로 이루어진다. 사용된 BIP 서열은 SEQ ID NO: 3이다. BIP는 FIP에 사용된 것과 동일한 표지로 표지될 수 있지만(B1c 부분) FIP가 표지되지 않은 경우에만 가능하다.
- 정방향 외부 프라이머(FOP, F3 프라이머라고도 함): 주형 서열의 F3c 영역에 상보적인 영역으로 이루어진다. 이 프라이머는 FIP보다 길이가 짧고 농도가 낮다. 사용된 F3 서열(야생형, C-대립유전자)은 다음과 같고: ggcaatacagataagataatgtatc(SEQ ID NO: 11), (C-ASO 프라이머로 불림) 관심 SNP 직전의 DNA 서열에 해당한다.
먼저, 비주기적 단계를 수행하여 위에서 정의한 프라이머로 양쪽 말단에 아령 모양의 구조를 가진 스템 루프 DNA를 생성한 다음 얻은 DNA 구조가 도 2b에 기술된 바와 같이 LAM 순환의 개시자 역할을 한다.
특히, 25μl의 LAMP 반응 버퍼를 함유하는 튜브는 특정 LAMP 식염수 버퍼, MgCl2 및 DNA 폴리머라아제 효소 및 위에서 설명한 대로 특별히 디자인된 DNA 프라이머가 있는 데옥시리보뉴클레오타이드 삼인산(dNTPs)을 함유한다.
LAMP 반응에서 프라이머의 최종 농도는 F3/B3의 경우 0.2μM이고 BIP/FIP 및 LB의 경우 1.0μM이다. LAMP 반응은 아래 표 2에 요약된 제조업체 프로토콜(lavaLAMP, Lucigen)에 따라 수행된다:
구성요소 최종 농도 1 반응에 대한 부피(μl)
LAMP 버퍼(2x) 1x 12.5
프라이머 믹스(10x) 1x 2.5
물 - 9
추출된 DNA - 1
모든 LAMP 반응 성분은 멸균된 1.5ml 튜브에 첨가한다. LAMP 증폭은 65-72℃에서 20-60분 동안 실행된다(제조업체에 따름). 테스트 개발 중에 온도가 최적화되었다. 2개의 측면 흐름(LFA) 테스트를 동시에 하나는 -13910C/T의 C-대립유전자 변이체를 증폭하는 C-ASO 프라이머로, 다른 하나는 -13910C/T의 T-대립유전자 변이체를 증폭하는 T-ASO 프라이머로 실행하였다. 아래 기술된 바와 같이 LFA 테스트 라인 1(항-DIG 항체) 및 LFA 테스트 라인 2(항-FAM 항체)에서 검출되도록 C-ASO 프라이머를 DIG 및 비오틴으로 표지하고 T-ASO 프라이머를 FAM 및 비오틴으로 표지하였다:
d) 증폭된 DNA 검출
얻은 증폭된 DNA(앰플리콘)는 선택된 결합 파트너, FAM 및 비오틴뿐만 아니라 DIG 및 비오틴을 함유하는 이중 가닥 증폭 생성물을 포획하고 이의 시각화를 허용하는 항체를 포함하는 핵산 측면 흐름 분석법(LFA)에 의해 희석 및 검출한다. 앰플리콘 검출은 5-10분 밖에 걸리지 않으며 결과는 아래에 기술된 대로 포획 라인에서 검철 시약 입자의 응집으로 인해 눈으로 감지할 수 있다:
본 발명의 측면 유동 면역분석법은 다음과 같이 준비하였다:
"측면 유동 분석법"의 연출
측면 유동 분석법의 연출은 온도(<25℃) 및 습도(<40% RH)의 깨끗하고 제어된 방(EU GMP Class D)에서 수행하였다. 스트립을 5mm(±0.5mm)의 너비로 절단하고 실온에서 건조제와 함께 알루미늄 파우치에 보관하였다.
측면 유동 분석법은 접합체 방출 패드로도 사용되는 샘플 수용 패드(Ahlstrom-Munksjo Ref. A8964와 같은 20mm의 유리 섬유 재료)로 구성되며, 여기서 검출 시약은 패드의 상단에 위치한다(예를 들어, 분석물에 대한 제 1 결합제로서 스트렙타비딘 표지된 금, 셀룰로오스, 라텍스, 금속 나노입자로 분사됨). 이 샘플/접합체 방출 패드는 보강 지지대에 붙여져 있고 다른 라인(포획 테스트 시약 어레이 및 포획 대조군 시약 어레이)가 위치되는 나이트로셀룰로스 막(너비 25mm) HF-180(Merck Millipore)을 포함하는 검출 패드와 직접 접촉(2mm)한다. 위킹 패드는 나이트로셀룰로스 막의 말단에 위치하여 과도한 액체를 흡수한다. 폭 21mm의 흡수패드 A222(Ahlstrom-Munksjo) 밴드를 재단하여 지지대 상부에 붙여 위킹 패드로 사용하였다.
하프 스틱의 검출 막에 테스트 시약의 점적
여러 테스트 시약이 포획 시약 어레이에서 테스트 시약 라인으로 사용되었다.
- 첫 번째 테스트 라인(T1)은 마우스, 토끼 등 다양한 소스에서 유래할 수 있는 다이곡시게닌(DIG)에 특이적인 항-DIG 항체로 구성된다(예를 들어, Abcam ab76907; R&D System MAB7520; Jackson Immuno Research Europe 200-002- 156);
- 테스트 라인 2(T2)는 마우스, 토끼 등과 같은 다양한 소스에서 유래할 수 있는 플루오레세인(FAM 또는 FITC)에 특이적인 항-FAM 항체이다(예를 들어, Abcam ab19491; Jackson Immuno Research Europe 200-002-037).
테스트 시약은 TBS 1X에서 아래 표 3에 표시된 특정 농도로 각각 희석되었다. 그런 다음, 희석된 각각의 테스트 시약 0.5μL를 나이트로셀룰로스 막(검출 막)에 점적하고 25℃, <40% RH에서 2시간 동안 건조시켜 테스트 시약 라인을 형성하였다.
테스트 시약 공급체 ref. 농도[mg/ml]
항-DIG 항체 JIR 200-002-156 0.5
항-FAM 항체 JIR 200-002-037 0.5
대조군 제제로서 비오티닐화 소혈청 알부민(BSA) 단백질을 갖는 대조군 시약 라인을 포획 대조군 시약 어레이에서 사용하여 검출 시약(스트렙타비딘 표지된 검출 입자)을 검출하였다.
LFA 분석 실행
증폭된 DNA 3 내지 4 방울(예를 들어, 약 200μl)을 러닝 버퍼(인산염 버퍼 식염수, 1-2% 트윈 20 포함)에 희석한다. 비특이적 결합을 줄이기 위해 BSA 또는 기타 단백질과 같은 차단제를 실행 버퍼에 첨가할 수 있다.
그런 다음 희석된 증폭 DNA를 LFA의 샘플 수용 패드에 첨가하고 측면 유동 분석을 통해 흡수 및 이동하도록 한다. LFA에 대한 DNA 검출은 도 3b 및 c에 따라 10분 안에 최종 결과를 제공한다.
증폭에 사용되는 프라이머의 표지화로 인해 검출이 가능해진다: -13910C/T 프라이머 또는 C-ASO 프라이머의 C-대립 유전자 변이체는 증폭된 DNA 제 1 대립유전자 마커에 대한 표지로 사용될 다이곡시게닌으로 표지되고 -13910C/T 프라이머 또는 T-ASO 프라이머의 T-대립유전자 변이체는 증폭된 DNA 제 2 대립유전자 마커의 표지로 사용될 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 또는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 비오틴으로 표지된다. 표지된 앰플리콘은 측면 유동 장치의 검출 패드(테스트 라인 1 및 2)에 점적된 표지(항-DIG 및 항-FITC 또는 항-FAM)에 특이적인 항체에 의해 검출될 것이고 앰플리콘의 비오틴 표지 부분은 검출 시약으로 스트렙타비딘 표지 검출 나노입자를 사용하여 포획된 DNA의 시각적 검출을 가능하게 한다. 양성 신호는 증폭된 DNA가 -13910C/T 다형성의 C-대립유전자(유색선 T1) 또는 T-대립유전자(유색선 T2)를 포함하고 있음을 나타낸다. 샘플의 전체 유전자형(-13910 C/T)을 결정할 수 있다(C/C, C/T 또는 T/T). 라인 T1의 음성 결과는 C-대립유전자(C/C)의 부재로 인해 증폭이 없음을 나타내며 락타아제 비지속성(락토오스 불내성)에 대해 특이적이다. 라인 T2의 양성 결과는 T-대립유전자(T/T)의 존재를 나타낸다. 두 라인이 모두 양성인 경우(T1 및 T2), 이는 C- 및 T-대립유전자 모두의 존재를 나타내며 이형접합체 다형성(C/T)에 대해 특이적이다. T2의 음성 결과는 T-대립 유전자의 부재를 나타낸다. T2가 음성이고 T1이 양성이면, 테스트는 동형접합체 다형성 C/C(락토오스 불내성)에 대해 특이적이다. 두 테스트 라인(T1 및 T2)이 분석에서 부재한 경우, 이는 가능한 -13910 다형성이 C/C, C/T 또는 T/T(T 또는 C 대립유전자는 적어도 한 번 존재한다)이기 때문에 무효한 결과를 나타낸다.
-13910T 및 -13910C 대립유전자 모두를 함유할 것으로 예상되는 여러 개인의 DNA 풀을 나타내는 양성 대조군으로 정의된 상업적 공급원(Promega)으로부터 얻은 인간 게놈 DNA를 본 발명의 방법에서 테스트 샘플로 사용하여 제 1 세트의 실험을 수행하였다. 사실상, 본 발명의 방법은 -13910T/C 대립유전자 둘 모두의 존재를 확인하였다(도 4a). DNA 없이 프라이머만 함유하는 음성 대조군은 신호를 생성하지 않았다.
이러한 데이터는 LFA 샘플 수신 패드가 -13910T 및 -13910C 대립유전자(T-ASO 또는 C-ASO)에 대한 각 개별 LAMP 반응 생성물 또는 -13910T 및 -13910C 대립유전자(T-ASO + C-ASO)에 대한 풀링된 동시 LAMP 반응과 함께 로드될 수 있음을 입증한다. 이러한 결과를 더 검증하기 위해, 모든 LAMP 반응을 아가로스 겔 전기영동으로 두 번 확인하였다(도 4a의 하단 패널). 전형적인 멀티머 앰플리콘 패턴은 DNA를 함유하는 증폭에서 볼 수 있지만 증폭 밴드는 NO-DNA 대조군에 존재하지 않는다.
두 번째 실험 세트는 본 발명의 방법에서 5명의 대상으로부터 얻은 표적 인간 게놈 DNA로서 사용하여 수행하였다. 시판되는 방법(NucleoSpin Tissue, Marcherey-Nagel) LAMP를 사용하여 DNA를 추출한 후 모든 5개 샘플에 대한 LFA 검출을 도 4b에 나타내었다. DNA가 없는 프라이머만 함유하는 대조군은 신호를 생성하지 않았다. 이러한 결과를 기초로, 유전자형은 도 4b에서 분석된 모든 샘플에 할당될 수 있다(1: T/C, 2: T/C; 3 및 4: T/T 및 5: T/C).
이러한 결과는 C-ASO 프라이머와 조합된 본 발명의 프라이머(T-ASO 프라이머)가 샘플이 동시에 실행될 때(C-대립유전자 및 T-대립유전자(-13910C/T)가 동시에 증폭됨) 심지어 시판되는 DNA 추출 및 증폭 키트를 사용하는 경우에도 샘플(C/C, C/T 또는 T/T)의 전체 유전형 분석을 제공할 수 있음을 뒷받침하고 본 발명의 방법에서 이들 프라이머의 이점에 대한 검증을 제공하였다.
실시예 2: DNA 추출 및 증폭의 최적화
본 발명의 프라이머는 추출 및 증폭 단계가 최적화된 본 발명의 방법을 개발하는 데 사용되었다.
a1) 대상로부터 채취한 생물학적 샘플 제공
면봉으로 협측 세포에서 또는 손가락 찌르기 전혈(예를 들어, < 50μl)에서 샘플을 채취한다. 환자는 DNA 샘플 채취 약 2시간 전에는 먹거나 마시거나 담배를 피워서는 안 된다.
a2) 샘플에서 DNA 추출
그런 다음 세포를 탈염수에 25mM NaOH + 0.2mM EDTA를 포함하는 용해/추출 버퍼에 용해하고 상업적으로 이용 가능한 멸균 필터 장치를 사용하여 멸균 여과(0.2μm)한다. 혈액 샘플은 추출 버퍼에서 1:50으로 희석되며, 이는 735μl의 추출 버퍼에서 15μl의 혈액에 해당한다. 타액 면봉을 1ml 추출 버퍼에 혼합한다. 그런 다음 샘플을 98℃에서 약 5분 동안 가열하고 실온에서 식히거나 대안적으로 DNA를 실온(예를 들어, 5분)에서 추출하거나 필요한 경우 가열하면서 추출할 수 있다.
a3) DNA 증폭
분리된 DNA는 -13910C/T 다형성의 T 대립유전자(C/T 또는 T/T)만을 증폭하도록 특별히 디자인된 프라이머에 의해 LAMP 기술(LavaLAMP, Lucigen)을 사용하여 증폭되며, 락타아제 지속성에 대해 특이적이며 빠른 LFA에서 증폭된 DNA의 이후의 검출을 위해 표지된다. 특히, 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 다이곡시게닌(DIG) 및 비오틴으로 표지된다. 증폭 단계는 5개의 주형 특이적 프라이머를 사용하며, 그 중 하나는 -13910 T 대립유전자 형태(T-ASO 프라이머)를 인식할 수 있는 대립유전자 특이적 올리고(ASO) 프라이머이다. 마지막 프라이머(LB)는 비오티닐화되고 실시예 1에 기술된 바와 같이 측면 유동 분석에서 앰플리콘의 검출을 위해 사용된다.
-13910C/T 다형성의 T 대립유전자 변이체를 증폭하고 표지하기 위해 다음 LAMP 프라이머를 사용하였다:
- 정방향 내부 프라이머(FIP): 3' 말단의
Figure pct00007
영역과 5' 말단의 F1c 영역으로 이루어진다. 사용된 FIP 서열은 F1c 부분(프라이머의 5' 말단)에 FAM 또는 DIG 표지가 있는 SEQ ID NO: 1이다.
- 정방향 외부 프라이머(FOP, F3 프라이머라고도 함)는 주형 서열의 F3c 영역에 상보적인 영역으로 이루어진다. 이 프라이머는 FIP보다 길이가 짧고 농도가 낮다. 사용된 F3 서열(돌연변이형, T-대립유전자)은 T-ASO 프라이머로 불리는 SEQ ID NO: 2이며 관심 SNP 바로 앞의 DNA 서열에 해당한다.
- 역방향 내부 프라이머(BIP)는 3'말단의 B2 영역과 5'말단의 B1c 영역으로 이루어진다. 사용된 BIP 서열은 실시예 1에 기술된 바와 같이 SEQ ID NO: 3이다. BIP는 또한 FIP에 대해 사용된 동일한 표지로 (B1c 부분에) 표지될 수 있지만 FIP가 표지되지 않은 경우에만 가능하다.
- 역방향 외부 프라이머(BOP, B3이라고도 함). 사용된 BOP 서열은 SEQ ID NO: 4이다.
- 비오틴 표지 프라이머(LB). 사용된 LB 서열은 5' 말단에 비오틴 표지가 있는 B1c와 B2 사이의 DNA 서열에 해당하는 SEQ ID NO: 5이다.
- 22018 G/A 다형성의 A-대립유전자 변이체를 증폭하고 표지하기 위해 표 4에 기술된 바와 같은 LAMP 프라이머를 사용하였다:
프라이머 명칭 DNA 서열 (5'-3')
-22018 SNP
22018-F3(A) CCT TAA AAA CAG CAT TCT CAG CTG GGC A
22018-FIP-FAM (FAM) CAG GCT GGT CTC GAA CTC CTG ACC TCA GTG GCT CAC ACC TTT GTC
22018-BIP CCA ACA TGG CGA AAA CCC ATT CTG GGA CCA CAA GCA CCC GC
22018-B3 CCT GGG CTC AGT GAT CCT CC
22018-LB-Bio (Biotin)TAA AAA TAC AAA AAT TAG CC
- 사용된 정방향 내부 프라이머(FIP) 서열은 다음과 같다:
F1c 부분에 FAM 표지가 있는 caggctggtctcgaactcctgacctcagtggctcacacctttgtc (SEQ ID NO: 6);
- 사용된 정방향 외부 프라이머(FOP, F3 프라이머라고도 함) 서열(A-대립유전자)은 다음과 같다: ccttaaaaacagcattctcagctgggca (SEQ ID NO: 7);
- 사용된 역방향 내부 프라이머(BIP) 서열은 다음과 같다:
Figure pct00008
(SEQ ID NO: 8);
- 사용된 역방향 외부 프라이머(BOP, B3이라고도 함) 서열은 다음과 같다:
cctgggctcagtgatcctcc (SEQ ID NO: 9);
- 사용된 [완성 요청](LB) 서열은 다음과 같다: 비오틴 표지를 갖는 taaaaatacaaaaattagcc(SEQ ID NO: 10).
프라이머 믹스(10x 농축)는 2개의 개별 튜브(13910에 대해 하나 및 22018에 대해 하나)에서 검출될 각 대립유전자에 대해 준비하였다. 총 부피 100μl에 다음 프라이머를 혼합하여 멸균수로 완성한다:
- 2μl의 F3 프라이머(농도 100μM)
- 2μl의 B3 프라이머(농도 100μM)
- 10μl의 FIP 프라이머(농도 100μM)
- 10μl의 BIP 프라이머(농도 100μM)
- 10μl의 LB 프라이머(농도 100μM)
그 후, 두 프라이머 믹스를 DNA 증폭 버퍼에서 사용한다(위의 표 2에 따름).
프라이머 믹스(10배 농축)의 최종 농도는 2μM F3 및 B3 프라이머와 10μM FIP/BIP 및 LB 프라이머였다. 그런 다음 프라이머 믹스를 LA의 최종 농도로 LAMP 반응을 위해 10배 희석하였다.
F3/B3의 경우 0.2μM 및 BIP/FIP 및 LB의 경우 1.0μM의 MP 반응.
전술한 바와 같은 LAMP 키트를 사용하여 T 함유 대립유전자(TT 또는 CT)만을 또는 A 함유 대립유전자(AA 또는 AG)만을 개별적으로 및 결합하여 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 함께 72℃에서 20-60분 동안 실시예 1에 기술된 바와 같이 LAMP 증폭을 수행하였다.
b) 증폭된 DNA 검출
얻은 증폭된 DNA(앰플리콘)는 선택된 결합 파트너, FAM 및 비오틴뿐만 아니라 DIG 및 비오틴을 함유하는 이중 가닥 증폭 생성물을 포획하고 이의 시각화를 허용하는 항체를 포함하는 핵산 측면 흐름 분석법(LFA)에 의해 희석 및 검출한다. 앰플리콘 검출은 5-10분 밖에 걸리지 않으며 결과는 실시예 1 이하에 설명된 바와 같이 포획 라인에서 검출 시약 입자의 응집으로 인해 눈으로 감지할 수 있다.
LFA 분석 실행
증폭된 DNA 3 내지 4 방울(예를 들어, 약 200μl)을 러닝 버퍼(인산염 버퍼 식염수, 1 내지 2% 트윈 20 포함)에 희석한다. 비특이적 결합을 줄이기 위해 BSA 또는 기타 단백질과 같은 차단제를 러닝 버퍼에 첨가할 수 있다.
그런 다음 희석된 증폭 DNA를 LFA의 샘플 수용 패드에 첨가하고 측면 유동 분석을 통해 흡수 및 이동하도록 한다. LFA에 대한 DNA 검출은 도 3b 및 c에 따라 10분 안에 최종 결과를 제공한다.
증폭에 사용되는 프라이머의 표지으로 인해 검출이 가능해지며, -13910C/T 프라이머(T-ASO 프라이머)의 T-대립유전자 변이체는 DIG 및 비오틴으로 표지된다(도 2c 및 3ba). 표지된 앰플리콘은 측면 유동 장치의 검출 패드(시약 테스트 라인 1)에 점적된 표지(항-DIG)에 특이적인 항체에 의해 검출될 것이며 앰플리콘의 비오틴 표지 부분은 검출 시약으로서 스트렙타비딘 표지 검출 나노입자에 의한 포획된 DNA의 시각적 검출을 허용한다. 양성 신호는 증폭된 DNA가 -13910C/T 다형성(T/T 또는 T/C)의 T-대립 유전자(유색선 T1)를 포함하고 락타아제 지속성에 대한 특징임을 나타낸다. 라인 T1의 음성 결과는 T-대립 유전자(유전자형 C/C)의 부재로 인해 증폭이 없음을 나타내며 락토스 불내성이라고 하는 락타아제 비지속성에 대해 특이적이다.
-13910C/T 프라이머의 조합은 우수한 검출 성능을 보였다(항체 항-DIG에 해당하는 테스트 라인 1). 샘플은 락토오스 내성에 특이적인 T/T 또는 C/T의 T-대립유전자를 함유한다. 이 샘플의 이전 특징화는 양성 샘플이 C/T 유전자형을 가지고 있음을 보여주었다.
이런 데이터는 본 발명의 개발된 DNA 추출 방법이 빠른 추출 방법, LAMP 증폭 및 LFA 증폭 DNA 검출을 사용하여 락토오스 불내성을 정확하고 신속하고(<5-10분) 쉬운 측정을 가능하게 한다.
실시예 3 : 표준 방법과의 발명 방법 비교
본 발명의 방법은 다음과 같이 표준 방법과 비교하였다.
1. 표준 DNA 추출 방법(NucleoSpin TissueTM, Macherey-NagelTM, MACHEREY-NAGEL AG, Hirsackerstr. 7 - Postfach 255, 4702 Oensingen)(비교 방법)을 14개의 협측 면봉 샘플에 적용한 다음 LAMP 프라이머를 사용한 본 발명의 LAMP 증폭 방법을 사용하여 추출된 DNA를 증폭시켰다: 분리된 DNA는 락타아제 지속성에 특이적이고 빠른 LFA에서 증폭된 DNA의 이후의 검출을 위해 표지된 -13910C/T 다형성의 T 대립유전자(C/T 또는 T/T)만 증폭시키도록 특별히 디자인된 프라이머로 LAMP 기술(Lavalamp, Lucigen)을 사용하여 증폭한다. 특히, 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 다이곡시게닌(DIG) 및 비오틴으로 표지된다. 증폭 단계는 5개의 주형 특이적 프라이머를 사용하며, 그 중 하나는 -13910 T 대립유전자 형태(T-ASO 프라이머)를 인식할 수 있는 대립유전자 특이적 올리고(ASO) 프라이머이다. 마지막 프라이머(LB)는 비오티닐화되고 증폭의 기준 방법(LaCAR MDx)과 비교하여 아래 기술된 바와 같이 측면 유동 분석에서 앰플리콘의 검출을 위해 사용된다. LaCAR MDx는 -13910 C/T 다형성, -13915 T/G 다형성, -14010 G/C 다형성, -14009 T/G 다형성 및 주변 돌연변이의 정량적 검출을 위한 시험관내 진단 테스트이다. 이 테스트는 용융 곡선 분석기(Prime Pro 48 Real-Time PCR system, Witec AG, Industriestrasse 12, CH-6210 Sursee)가 있는 완비된 실험실이 필요하였다. 용융 곡선 분석은 가열 동안 이중 가닥 DNA의 해리 특징을 분석한다. 온도가 높아짐에 따라, 이중 가닥은 분리하기 시작하여 흡광도 강도의 상승을 유도한다. 수집된 정보는 락토오스 불내성과 같이 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재와 정체성을 유추하는 데 사용될 수 있다.
2. 본 발명에 따른 추출 방법(본 발명의 빠른 추출 방법, 본 발명의 빠른 추출 버퍼, 타액 면봉을 1mL의 추출 버퍼에 혼합한다. 그런 다음 샘플을 98℃에서 5분 동안 가열하고 실온에서 냉각한다)을 동시에 사용하여 추출 성능이 기준 추출 방법과 비교하여 유의한 차이가 있는지 확인하였다. 그런 다음, 추출된 DNA를 본 발명의 방법 및 기준 방법(LaCAR MDx)을 사용하여 증폭시켰다.
DNA 추출의 제어
260nm에서 흡광도를 사용하여 DNA 농도를 평가하고 흡광도 비율 260/280nm을 사용하여 본 발명의 빠른 추출 방법과 비교 참조 추출 방법 사이의 추출 순도를 결정하였다. 결과는 아래 표 5에 제공된다.
빠른 DNA 추출
(본 발명) 		기준 DNA 추출
(비교)
샘플 # DNA 농도[ng/μl] A260/A280 비 DNA 농도 [ng/μl] A260/A280 비
1 10,3 1,93 19,8 2,55
2 18,7 2,05 22,3 4,89
3 12,7 1,98 29,6 3,21
4 13,9 3,45 52,3 3,92
5 15,5 3,67 45,7 3,74
6 25,7 5,01 39,6 4,45
7 20,1 3,89 56,8 4,76
8 20,3 2,23 52,0 4,51
9 33,2 2,45 49,7 5,93
10 18,6 3,09 37,6 3,87
11 23,9 2,55 29,8 4,55
12 20,4 3,68 50,4 4,19
13 26,8 2,34 33,3 5,04
14 22,9 2,97 39,8 4,48
알 수 있는 바와 같이, DNA의 양 및 추출의 순도는 정제 단계를 갖는 기준 상업적 추출 키트에 의해 상당히 높았다. 그러나, DNA 추출에 소비되는 시간은 본 발명의 방법에 의해 상당히 낮았다(30분에 비해 5분).
비교 방법 LaCAR MDx와 발명의 락토오스 불내성 검출 방법의 비교
상기 얻은 추출된 DNA 샘플을 두 방법, 빠른 DNA 추출 테스트 및 LaCAR MDx 기준 테스트를 사용하여 증폭시켰다.
본 발명의 빠른 DNA 추출 방법으로 추출된 DNA의 증폭:
결과는 아래 표 6에 제공되며 본 발명의 방법의 경우, 샘플이 락토오스 불내성에 양성이면, 이는 락타아제 지속성에 특이적인 유전자 다형성 C/T-13910의 T-대립유전자 또는 A-대립유전자(-22018 G/A)를 함유하지 않는다는 것을 의미하고 및 LaCAR MDx 결과의 경우, 샘플이 락토오스 불내성에 양성이면, 이는 락타아제 지속성에 특이적인 유전자 다형성 C/T-13910의 T-대립유전자를 함유하지 않는다는 것을 의미한다.
샘플 # 빠른 락토오스 테스트
(본 발명) 		LaCAR MDx
(비교)
1 + +
2 + +
3 - -
4 + +
5 - -
6 - -
7 - -
8 - ?
9 - -
10 + +
11 - -
12 - -
13 - -
14 - -
+: 락토오스 불내성에 대해 양성, T-대립유전자(C/T-13910) 및/또는 A-대립유전자(-22018 G/A)를 함유하지 않는다
-: 락토오스 불내성에 대해 음성, T-대립유전자(C/T-13910) 및/또는 A-대립유전자(-22018 G/A)를 함유한다
?: 명확하지 않은 결과.
본 발명의 방법으로 분석된 모든 샘플은 기준 방법(LaCAR MDx)과 상관관계가 있었다. 하나의 샘플(#8)은 LACAR MDX 테스트에 의해 명확하지 않았으며 진단 성능 계산에 포함될 수 없다. 본 발명의 빠른 락토오스 테스트의 진단 성능은 기준 테스트 LaCAR MDx와 비교하여 100%의 민감상과 100%의 특이성이었다. 두 테스트 사이의 상관관계는 1.00이었다.
기준 추출 방법으로 추출한 DNA의 증폭:
동일한 테스트를 기준 추출 방법(NucleoSpin TissueTM, Margery-NegelTM)으로 추출된 DNA로 수행하였다. 추출된 DNA를 기준 방법(LaCAR MDx) 및 본 발명의 빠른 락토오스 테스트로 증폭시켰다. 결과는 아래 표 7에 제공된다.
샘플 # 빠른 락토오스 테스트
(본 발명) 		LaCAR MDx
(비교)
1 + +
2 + +
3 - -
4 + +
5 - -
6 - -
7 - -
8 - -
9 - -
10 + +
11 - -
12 - -
13 - -
14 - -
+: 락토오스 불내성에 대해 양성, T-대립유전자(C/T-13910) 및/또는 A-대립유전자(-22018 G/A)를 함유하지 않는다
-: 락토오스 불내성에 대해 음성, T-대립유전자(C/T-13910) 및/또는 A-대립유전자(-22018 G/A)를 함유한다
?: 명확하지 않은 결과.
기준 추출 방법으로 추출하고 본 발명의 방법으로 분석된 모든 샘플은 기준 방법(LACAR MDX)과 상관관계가 있었다. LaCAR MDx 및 본 발명에 따른 빠른 추출 방법으로 명확하지 않은 샘플(#8)은 기준 추출 방법으로 음성이었다. 기준 추출 방법에 의해 추출된 DNA의 순도는 빠른 추출 방법(A260/280 비 4.51 vs 2.24)에 비해 더 높았다. 빠른 락토오스 테스트의 진단 성능은 기준 테스트 LaCAR MDx와 비교하여 100%의 민감성과 100%의 특이성이었다. 두 테스트 사이의 상관관계는 1.00이었다.
종합하면 상기 데이터는 본 발명에 따른 빠른 DNA 추출 방법에 의한 본 발명의 락토오스 불내성 테스트/방법이 정제 단계를 갖는 더 긴(1.5 시간) 추출 방법(NucleoSpin TissueTM, Margery-NegelTM)을 필요로 하는 기준 방법과 완전히 상관관계가 있다. 따라서, 본 발명의 락토오스 불내성 시험/방법은 본 발명의 빠른 추출 방법과 잘 작용하며 고순도 DNA가 필요하지 않다. 기준 방법은 DNA 순도에 더 민감한 것으로 보인다. 본 발명의 빠른 락토오스 분석/방법을 사용하는 이점은 아래 표 8에 요약되어있다.
빠른 락토오스 테스트
(본 발명) 		LaCAR MDx
(비교)
견고성
순도가 낮은 모든 유형의 샘플을 지원한다		 샘플의 순도가 낮기 때문에 하나의 샘플이 진단되지 않았다(2.51의 A260/280).
신속성
45분 후 결과		 2 시간 후 결과
긴 DNA 추출 절차가 필요하다
해석 용이함
특정 장비, 시각적 판독이 필요없다		 특정 장비
결과 해석이 필요하다
현장 진단
훈련과 실험실이 필요없다		 실험실과 훈련된 스태프
DNA 추출 및 결과 해석이 필요하다
적절한 가격 3-4배 더 비싸다
1 측면 유동 면역분석법
2 보강 지지체
3 모세관 유동 어레이
5 샘플 수용 패드
6 접합체 방출 패드
61 검출 시약
611a 분석물에 대한 제 1 결합제
611b 제 1 표지 모이어티
62 검출 시약 지지체
7 검출 패드
71 포획 테스트 시약 어레이
711a 테스트 시약(분석물의 표지에 대한 항체)
711b 선택적 추가 테스트 시약(예를 들어, 분석물의 다른 표지에 대한 다른 항체)
72 포획 대조군 시약 어레이
721a 제 1 결합제에 특이적인 대조군 제제(예를 들어, 검출 시약을 위한 특이적 항체)
73 검출 막
4 위킹 패드
서열 목록
-13910C/T 다형성의 T 대립유전자 변이체의 LAMP에 대한 프라이머 서열(5' -3 'DNA 서열)
SEQ ID NO: 1 - 표지되지 않은 정방향 내부 프라이머(FIP) 서열
tgcagggctcaaagaacaatctaactggcctcaaaggaactc
SEQ ID NO: 2 - 정방향 외부 프라이머(FOP 또는 F3 프라이머)
ggcaatacagataagataatgtagt
SEQ ID NO: 3 - 표지되지 않은 역방향 내부 프라이머(BIP)
tccacgaggataggtcagtggaagatgggacgcttgaa
SEQ ID NO: 4 - 역방향 외부 프라이머(BOP 또는 B3)
taaaactaggaaaacgcagg
SEQ ID NO: 5 - 비오틴 표지(5' 말단) 프라이머(LB)
ggggagtagtacgaaaggg
-22018G/A 다형성의 A 대립유전자 변이체의 LAMP에 대한 프라이머 서열(5' -3 'DNA 서열)
SEQ ID NO: 6 - 표지되지 않은 정방향 내부 프라이머(FIP) 서열
caggctggtctcgaactcctgacctcagtggctcacacctttgtc
SEQ ID NO: 7 - 정방향 외부 프라이머(FOP 또는 F3 프라이머)
ccttaaaaacagcattctcagctgggca
SEQ ID NO: 8 - 표지되지 않은 역방향 내부 프라이머(BIP)
ccaacatggcgaaaacccattctgggaccacaagcacccgc
SEQ ID NO: 9 - 역방향 외부 프라이머(BOP 또는 B3)
cctgggctcagtgatcctcc
SEQ ID NO: 10 - 비오틴 표지(5' 말단) 프라이머(LB)
taaaaatacaaaaattagcc
-13910C/T 다형성의 C 대립유전자 변이체의 LAMP에 대한 프라이머 서열(5' -3 'DNA 서열)
SEQ ID NO: 11 - 정방향 외부 프라이머(FOP 또는 F3 프라이머)
ggcaatacagataagataatgtatc

Claims (19)

  1. 보강 지지체 및 상기 보강 지지체 상에 모세관 유동 어레이 및 위킹 패드를 포함하는 생물학적 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재를 정성적 또는 정량적으로 검출하기 위한 측면 유동 면역분석 장치로서, 여기서 모세관 유동 어레이는 i) 보강 지지체의 한 말단에 위치하고 샘플을 수용하기 위한 구멍을 가진 샘플 수용 패드; ii) 샘플 수용 패드와 구별되거나 샘플 수용 패드에 포함되고 샘플 수용 패드와 모세관 접촉하고 제 1 표지 모이어티에 접합된 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A) 분석물로부터 선택되는 적어도 하나의 표지된 대립유전자에 특이적이고 결합하는 제 1 결합제를 포함하는 적어도 하나의 검출 시약이 함침된 접합체 방출 패드; iii) 접합체 방출 패드와 구별되고 접합체 방출 패드와 모세관 접촉하고 검출 막, 적어도 하나의 시약 테스트 라인을 포함하는 포획 테스트 시약 어레이 및 하나의 대조군 시약 라인을 포함하는 포획 대조군 시약 어레이를 포함하는 검출 패드, 상기 포획 시약 및 대조군 시약 어레이는 검출 막 상에 고정되고, iv) 보강 지지체의 다른 말단에 위치하고 검출 패드와 모세관 접촉하는 위킹 막을 포함하며, 상기 적어도 하나의 시약 테스트 라인은 상기 표지된 대립유전자의 표지에 대한 적어도 하나의 항체를 포함하고 상기 대조군 시약 라인은 제 1 결합제에 대한 특이적 친화도를 갖는 대조군 시약을 포함하는 것인 측면 유동 면역분석 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    접합체 방출 패드는 상기 적어도 상기 하나의 검출 시약이 모세관 방출 가능 방식으로 결합되는 검출 시약 지지체를 포함하며, 샘플 수용 패드로부터의 샘플을 수용하고 검출 시약 지지체로부터 검출 시약을 방출하고 T 대립유전자(-13910 C/T) 또는 A 대립유전자(-22018 G/A) 분석물로부터 선택된 표지된 대립유전자가 샘플에 존재하고 검출 시약과 결합될 때 제 1 면역 복합체가 형성되며, 상기 1 면역 복합체는 상기 표지된 대립유전자의 표지에 대한 항체를 포함하는 상기 적어도 하나의 시약 테스트 라인에 결합하는 검출 패드로 이동하는 것인 측면 유동 면역분석 장치.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    검출 패드는 포획 테스트 시약 어레이에 하나 초과의 시약 테스트 라인을 추가로 포함하는 것인 측면 유동 면역분석 장치.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포획 테스트 시약 어레이는 항-DIG 항체, 항-FAM 및/또는 항-FITC 항체 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 항체를 포함하는 것인 측면 유동 면역분석 장치.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 시약은 분석물에 대한 제 1 결합제로서 스트렙타비딘 단백질을 포함하는 것인 측방 유동 면역분석 장치.
  6. 다음 단계를 포함하는 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재를 검출하는 방법:
    a) 수용액에 DNA 물질(앰플리콘)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 상기 DNA 물질은 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터의 DNA를 표적으로 하는 특이적 증폭 및 표지화 처리되었다;
    b) 상기 샘플을 i) 상기 표지된 증폭 대립유전자에 대한 검출 시약을 포함하는 접합체 방출 패드 및 ii) 상기 증폭된 대립유전자(들)의 표지에 대한 적어도 하나의 항체가 결합된 검출 막을 포함하는 검출 패드를 포함하는 측면 유동 면역분석법으로 처리하는 단계;
    c) 상기 증폭된 대립유전자(들)의 표지에 대한 상기 적어도 하나의 항체가 결합된 위치에서 검출 막 상의 검출 라인의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 상기 검출 라인의 존재는 상기 샘플에서 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)를 나타낸다.
  7. 제 6 항에 있어서,
    적어도 하나의 항-DG 항체 또는 이의 혼합물이 상기 측면 유동 면역분석법의 검출 막에 추가로 결합되고 DG 표지된 T 대립유전자(-13910 C/T)의 존재 검출은 단계 c)에서 수행되는 것인 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    적어도 하나의 항-FAM 또는 항-FITC 항체 또는 이들의 조합이 상기 측면 유동 면역분석법의 검출 막에 결합되고 FAM 및/또는 FITC A 대립유전자(-22018 G/A)의 존재 검출은 단계 c)에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)의 부재가 락토스 불내성을 나타내는 것인 방법.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)에서 제공된 DNA 물질은 상기 생물학적 샘플이 약 0.1 내지 약 0.5mM EDTA 및 약 20 내지 약 50mM NaOH를 포함하는 추출 버퍼의 존재하에서 DNA 추출 단계를 거치는 추출 단계에서 LAMP 증폭 전에 생물학적 샘플로부터 추출된 DNA의 LAMP 증폭에 의해 얻어진 것인 방법.
  11. 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증폭된 DNA 물질(앰플리콘)은 LAMP 증폭으로부터 얻어지며 T 대립 유전자(-13910 C/T)로부터의 DNA는 다음 그룹에서 선택된 다음 프라이머 세트를 사용하여 특이적으로 증폭되고 표지되는 것인 방법:
    - SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
    - SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
    - 생성된 증폭 DNA를 비오틴으로 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 면역 또는 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지된다.
  12. 제 11 항에 있어서,
    T 대립유전자(-13910 C/T)로부터 DNA의 LAMP 증폭에 사용되는 LB 프라이머는 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 것인 방법.
  13. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    증폭된 DNA 물질(앰플리콘)은 LAMP 증폭으로부터 얻어지며 A 대립유전자(-22018G/A)로부터의 DNA는 다음 그룹에서 선택된 다음 프라이머 세트를 사용하여 특이적으로 증폭되고 표지된다:
    - SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
    - SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 9의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
    - 생성된 증폭 DNA를 비오틴으로 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 면역 또는 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지화된다.
  14. 제 13 항에 있어서,
    A 대립유전자(-22018G/A)로부터의 DNA의 LAMP 증폭에 사용되는 LB 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 것인 방법.
  15. 프라이머의 다음 세트를 포함하는 T 대립유전자(-13910 C/T) 및/또는 A 대립유전자(-22018 G/A)로부터의 DNA를 증폭 및 표지하기 위한 LAMP 키트:
    - SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
    - SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
    - 생성된 증폭 DNA를 비오틴으로 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 면역 또는 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지된다;
    및/또는
    - SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 FIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 FOP 또는 F3 프라이머;
    - SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 BIP 프라이머;
    - SEQ ID NO: 9의 서열을 포함하는 BOP 또는 B3 프라이머;
    - 생성된 증폭 DNA를 비오틴으로 표지하기 위한 LB 프라이머, 여기서 생성된 표지된 증폭 DNA는 측면 흐름 분석의 검출 시약에 의해 검출될 수 있고; FIP 또는 BIP 프라이머는 플루오레세인 아미다이트(FAM) 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 표지와 같은 형광 검출을 위한 또는 다이곡시게닌(DIG) 표지와 같은 면역 검출을 위한 표지화 그룹으로 표지화된다.
  16. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 측면 유동 면역분석 장치 또는 제 15 항에 기술된 적어도 하나의 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 생물학적 샘플에서 락토오스 불내성의 정성적 검출을 위한 키트.
  17. 제 16 항에 있어서,
    하기 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 키트:
    - 샘플 수집 장치;
    - 샘플을 희석하거나 순수한 샘플로 테스트를 실행하기 위한 버퍼 용액이 담긴 용기;
    - 소독 패드;
    - 반창고;
    - 분석 결과를 판독하고 선택적으로 데이터베이스(예를 들어, 환자 입원 데이터 세트)로 전송하기 위한 데이터 판독기;
    - LAMP 반응 매질을 70-80℃로 가열하기 위한 휴대용 히터.
  18. 약 0.1 내지 약 0.5mM EDTA 및 약 20 내지 약 50mM NaOH를 포함하는 DNA 추출 버퍼.
  19. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 18 항에 따른 DNA 추출 버퍼를 추가로 포함하는 키트.
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