KR20230072891A - 디니트라민을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
디니트라민을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 조성물은 정소 세포주의 증식을 억제하고, 생식샘자극호르몬 억제 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있는바, 정소 세포주의 비정상적 증식에 의한 남성 생식기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품, 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 조성물은 정소 세포주의 증식을 억제하고, 생식샘자극호르몬 억제 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있는바, 정소 세포주의 비정상적 증식에 의한 남성 생식기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품, 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
고환염, 음낭수종, 고환암 등의 남성 생식기관 질환은 정소 세포의 비정상적 증식, 과도한 염증반응으로 인해 발병하는 질병이다. 정소 세포인 라이디히 세포(Leydig cell)와 세르톨리 세포 (Sertoli cell)는 남성 호르몬을 만들어 내고 정자를 생산하는 핵심 세포로서, 손상이 발생하는 경우 생식 세포의 사멸, 세포 주기 조절 단백질 감소, 세포내 활성 산소 증가에 따른 불임이 야기될 수 있다 (Rindone, G.M., et al., Reproduction, 2018. 156(2): p. 93-101. / Kirk, D. and U. Mittwoch, Humangenetik, 1975. 26(2): p. 105-11. / Pan, B., et al., Cancer Med, 2016. 5(11): p. 3214-3222).
상기 남성 생식기관 질환 중 고환암은 국내 10만명당 0.45명이 발병하는 드문 암이고 병기가 낮은 경우 90%이상의 완치율을 보이지만, 20-40세 사이의 청장년층에서 발병률이 전 세계적으로 증가하고 있으며 정상 남성보다 불임을 일으킬 확률이 세배 이상 높으며 (Scott M., et al. , Urologic Clinics of North America, 2015. 42(3): p.269-275), 고환암 환자는 통증이 없기 때문에 진행된 병기에서 발견하는 경우가 많고, 림프절을 따라 전이가 쉽게 일어나는 것으로 알려져있다 (Mariotto A.B., et al., CA Cancer J Clin 2014; 64: pp. 252-271).
한편, 디니트라민(dinitramine)은 디니트로아닐린계열 화합물로 잡초의 성장을 억제하는 성분으로 알려져 있으나, 현재까지 남성 생식기 질환 치료 효과에 대해서는 보고된 바 없다.
전술한 기술적 배경하에서 본 발명자들은 남성 생식기 질환 치료 물질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 디니트라민이 비정상적으로 증식된 정소 세포주의 증식을 억제하고, 생식샘자극호르몬 억제 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 조성물은 비정상적으로 증식된 정소 세포주의 증식을 억제하고, 세포 사멸 효과를 향상시키는 효과가 있는바, 정소 세포주의 비정상적 증식에 의한 남성 생식기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품, 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 디니트라민이 정소 세포주의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 디니트라민이 정소 세포주 내 세포주기에 관한 유전자 발현 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 디니트라민이 세포내 칼슘항상성 조절에 미치는 효과 및 칼슘 억제제인 2-APB와 BAPTA-AM와의 병용처리시 칼슘 항상성 조절 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 디니트라민에 의한 마우스 정소 세포주 내 소포체 스트레스 유발 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 디니트라민이 정소 세포주 내 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달 기전에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 디니트라민 및 2-APB, BAPTA의 병용처리가 마우스 정소 세포주 내 세포증식에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 디니트라민의 정소 세포주 내 작용 기전을 나타낸 것이다.
도 2는 디니트라민이 정소 세포주 내 세포주기에 관한 유전자 발현 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 디니트라민이 세포내 칼슘항상성 조절에 미치는 효과 및 칼슘 억제제인 2-APB와 BAPTA-AM와의 병용처리시 칼슘 항상성 조절 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 디니트라민에 의한 마우스 정소 세포주 내 소포체 스트레스 유발 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 디니트라민이 정소 세포주 내 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달 기전에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 디니트라민 및 2-APB, BAPTA의 병용처리가 마우스 정소 세포주 내 세포증식에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 디니트라민의 정소 세포주 내 작용 기전을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 디니트라민에 의한, 비정상적으로 증식된 정소 세포주의 증식 억제 및 세포 사멸 기전을 밝혔다(도 7).
본 발명은 일 관점에서 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 담체는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 긴장성 조정제, 방부제, 증점제 및 점도 개질제로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔 및 분말로 구성된 군에서 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여시간 등과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률 제6722호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 식품을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있고, 과립제, 정제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 껌, 차, 젤리, 각종 음료수, 드링크제, 알코올 음료 등으로 제조될 수 있으며, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기 적합한 임의의 생약 형태, 더욱 구체적으로는 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료, 식품 또는 사료의 첨가제 및 보조제, 강화된 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물 등과 같은 고체 형태 또는 용액, 현탁액, 유화액, 음료, 페이스트 등과 같은 액체형태 일 수 있고, 영양제, 비타민, 전해질, 감미제, 착색제, 유기산, 방부제 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 디니트라민이 정소 세포주의 증식과 관련된 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 디니트라민이 세포 내 칼슘 항상성을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 디니트라민이 스테로이드 생합성, 세포주기, 호르몬 수용체 및 정자형성과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 남성 생식기 질환은 라이디히(Leydig) 세포 또는 세르톨리(Sertoli) 세포의 과증식에 의해 유발되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 상기 남성 생식기 질환은 라이디히 세포 종양, 세르톨리 세포 종양, 고환염, 부고환염, 고환암 및 음낭수종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 디니트라민을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 디니트라민을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<실험 방법>
실험 재료
후보 조성물질인 디니트라민과, 2-APB, BAPTA-AM은 Sigma-Aldrich, Inc로부터 구매하여 사용하였으며, 디니트라민에 의한 신호전달메커니즘을 확인하기 위하여 Grp78/Bip, Chop, Tuba 단백질에 대한 항체를 Santa Cruz Biotechnology사에서 구매하였다. 또한, phospho-Eif2a, p-ERK1/2, p-AKT, p-P38, p-Rps6kb1, p-JNK, p-Rps6 및 total-Eif2a, ERK1/2, Akt, P38, Rps6kb1, JNK, Rps6에 대한 항체를 Cell Signaling Techonology사로부터 구매하였다.
세포배양
라이디히 세포주 TM3(immature mouse leydig cell), 세르톨리 세포주 TM4 (immature mouse sertoli cell) 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 구매하여 사용하였으며, 세포의 단층배양을 위해서 high glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)에 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함께 혼합하여 사용하였다.
세포 생존 및
BrdU를
이용한 세포 증식 능력 분석
트립판 블루 염색을 통해, 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하여 라이디히 및 세르톨리 세포의 생존 능력을 측정하였다. 60-mm 배양접시에 1.5×105 cells/ml로 분주하고, FBS 기아 조건에서 24시간, 디니트라민을 처리한 배지에서 24시간 배양 후, 상층액과 부착세포 모두 회수하여 트립판 블루로 염색하였다. 트립판 블루에 염색된 살아있는 세포와 전체 세포의 비율을 계산하여 퍼센트 비율로 나타내었다. 마우스 고환 세포주의 증식 능력에 디니트라민이 미치는 영향을 확인하기 위하여 FBS 기아 조건으로 배양한 5×103개의 세포와 배지 100 ㎕를 96 well에 분주하고 디니트라민을 용량의존적으로 (0, 2, 5, 10, 20 μM) 처리하여 24시간 동안 배양한 다음, BrdU 키트 (Cat No: 1167229001, Roche)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험을 수행하였다. 48시간 인큐베이션 후, 10 μM BrdU를 각 well에 추가적으로 넣어 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양하였다. 라이디히 세포와 세르톨리 세포에 BrdU를 labeling 하고 세포를 고정하여 anti-BrdU-POD 용액을 상온에서 90분 인큐베이션 시킨 이후 3차례 씻어주었다. 마지막으로 100 μl의 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine substrate으로 세포를 반응시키고, ELISA 리더기를 사용하여 370 nm, 492 nm 내 흡광도를 측정하여 세포 증식 능력을 분석하였다.
스페로이드
형성 분석
스페로이드 형성 능력을 평가하기 위해, TM3와 TM4 세포를 10% FBS-DMEM 배지에 2.4×105 cells/ml 농도로 희석하여, 비히클(DMSO) 또는 디니트라민을 20 μM 처리하였다. 배양 접시의 뚜껑에 25 μl씩 drop을 분주하고, 뒤집어 PBS를 채운 dish에 덮어37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 6일까지 배양하였다. 분석을 위해 적어도 3개의 다른 스페로이드 이미지를 Leica DM2500으로 촬영하였으며, Image J software로 분석을 시행하였다.
Propidium
iodide (PI)를 이용한 세포주기 분석
디니트라민의 마우스 고환 세포주의 세포주기의 정지 효과를 확인하기 위하여 BD Biosicences사의 Propidium iodide (PI) 시약을 사용하여 실험을 진행하였다. 먼저 5×105 세포를 6 well에 배양하고 70 ~ 80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 디니트라민을 용량의존적으로 (0, 2, 5, 10, 20 μM) 처리하여 24시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 PBS로 2번 워싱을 진행하고 70%의 에탄올로 고정시켜 4℃에 하루 동안 보관하였다. 다음으로 PBS로 2번 워싱을 진행하고 10 mg/ml의 RNase A 5 μL, 50 mg/ml PI 5 μL을 PBS에 함께 혼합하여 실온에 30분 동안 빛을 차단한 채 염색하였다. 이후, PBS를 400 μL 추가하여 5 mL FACS 튜브에 염색된 용액을 옮겨 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하여 세포주기의 변화를 측정하였다.
정량적
역전사
중합효소 연쇄반응
라이디히 및 세르톨리 세포를 Trizol reagent를 통해 제조사의 매뉴얼 대로 RNA 추출을 시행하였다. cDNA는 total RNA 1 μg과 AccuPower premix로 합성하였으며, 유전자 발현은 SYBR Green (Sigma-Aldrich)과 StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)로 측정하였다. 타겟 유전자의 발현은 CT값으로 계산하였으며, GAPDH 발현을 기준으로 표준화하였다. PCR 조건은 95℃로 3분 진행한 후, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 조건을 40회 증폭하였다.
Fluo
-4 AM 염색을 통한 세포질 내
칼슘농도
변화 측정
세포질 내 칼슘농도를 측정하기 위해 Fluo-4 AM을 사용하여 측정하였다. 5×105 개의 라이디히 및 세르톨리 세포를 6 well에 배양하고 70 ~ 80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 디니트라민을 용량의존적으로 처리하여 24시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 원심분리 하여 세포 pellet을 얻었다. 세포는 Fluo-4 staining solution에 풀어준 후 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 20분 간 인큐베이션 하였다. 염색된 세포는 다시 원심분리하여 PBS로 워싱한 후 다시 원심분리로 세포 pellet을 얻었다. 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
Rhod
-2 AM 염색을 통한 미토콘드리아 기질 내 칼슘 농도 측정
세포질 내 칼슘농도를 측정하기 위해 Rhod2-AM을 사용하여 측정하였다. 5×105 개의 마우스 정소 세포주를 6 well에 배양하고 70 ~ 80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 디니트라민을 용량의존적으로 처리하여 24시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 원심분리 하여 세포 pellet을 얻었다. 세포는 Rhod2 staining solution에 풀어준 후 빛을 차단시켜 4℃ 냉장상태 내에서 30분 간 인큐베이션 하였다. 염색된 세포는 다시 원심분리하여 HBSS (w/o Ca2+, Mg2+) 500 μl로 세포 pellet을 풀어준 후 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 10분 배양하였다. 이후, 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
단백질 발현 분석 (
웨스턴블롯
)
마우스 고환 세포에 프로필 갈레이트 또는 세포신호전달 억제제와의 혼합물을 처리한 다음 고환 세포주로부터 전체 단백질을 추출하여 Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 단백질을 정량하였다. 이후, 추출한 단백질을 95℃에서 5분간 변성하였으며 10% SDS/PAGE 젤을 이용하여 전기영동 수행한 뒤, nitrocellulose membrane으로 옮겨주고, 1차 항체와 2차 항체를 차례로 인큐베이션 시킨 다음 chemiluminescence detection (SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA) 시약, ChemiDoc EQ system과 Quantity One software (Bio-Rad) 기기를 사용하여 타겟 단백질의 발현을 분석하였다.
통계분석
본 실험결과는 SAS (statistical analysis system) 통계프로그램을 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. P < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
<결과 및 고찰>
디니트라민의
마우스
라이디히
(TM3) 및
세르톨리
(TM4) 세포에 대한 세포 생존 및 증식 억제 효과
마우스 정소 세포주인 라이디히 세포 (TM3) 및 세르톨리 세포 (TM4)에 다양한 농도의 디니트라민 (0, 2, 5, 10, 20 μM)을 처리하여 세포 생존 및 증식 수준을 측정하였다. TM3 세포의 생존능은 20 μM의 디니트라민을 처리하였을 때, 대조군 대비 78.7% 수준으로 감소하였으며, TM4 세포 역시 84.7%까지 감소하였다 (도 1A). 상대적인 세포의 증식능 역시, 두 세포주 모두에서 용량의존적(0, 2, 5, 10, 20 μM)으로 처리하였을 시, TM3 세포주에서 최대 49.6%, TM4 세포주에서 47.5% 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 1B-C). 2D 배양의 한계를 극복하기 위해, drop-hanging 방법으로 스페로이드 배양을 진행하였다 (도 1D). 배양 6일차 기준, TM3 스페로이드의 밀도와 크기는 20 μM의 디니트라민 처리에 따라 각각 22%, 12% 감소하였다 (도 1E). TM4 스페로이드 역시 10, 20 μM의 디니트라민 처리에 따라, 경계선이 무너지는 모양을 보였으며, 밀도와 크기 역시 대조군 대비 최대 60%, 46.76% 감소함을 확인할 수 있었다 (도 1D, 1F).
디니트라민의
마우스 정소 세포주 내 세포주기에 관한 유전자 발현 억제 효과
디니트라민 처리에 의한 세포주기 진행 정지에 대한 효과 유무를 확인하였다. TM3, TM4 두 세포주 모두에서 디니트라민 처리 시 sub-G1 상태의 세포 수가 각각 1.81배, 2.04배 증가한 것을 확인하였다 (도 2A-B). 또한, G0/G1기에 해당하는 TM4의 세포 수가 최대 18% 감소하였으며, TM3에서는 감소하는 경향을 보였지만 통계적 유의성은 보이지 않았다 (면 2A-B). 추가로, Ccnd1, Cdk4, Ccne1의 유전자 발현 또한 두 세포주 모두에서 디니트라민 처리에 따라 감소함을 확인하였다 (도 2C-E). Ccnd1의 발현은 디니트라민 처리시 TM3와 TM4 세포에서 대조군 대비 0.46배, 0.20배 감소하였고, Cdk4는 0.69배, 0.25배, Ccne1의 발현은 각각 0.58배, 0.18배 감소하였다 (도 2C-E). 이를 통해, 디니트라민이 마우스 정소 세포주 내 세포주기 진행을 억제하는 효과를 보임을 확인하였다.
세포내
칼슘항상성 조절에 관한
디니트라민의
효과 및 칼슘 억제제인 2-
APB
와
BAPTA
-AM과의 칼슘 항상성 조절 효과
세포내 칼슘의 상대적 농도를 측정하기 위해, TM3, TM4 세포에 디니트라민을 용량의존적 (0, 2, 5, 10, 20 μM)으로 처리하였다. TM3세포에서는 10 μM, 20 μM의 디니트라민에 따라 각각 2배, 2.3배까지 증가함을 확인하였고 (도면 3A), TM4 세포에서는 20 μM의 디니트라민 처리에 따라 3.16배 증가함을 확인하였다 (도 3B). 또한, 미토콘드리아 내 칼슘 축적을 유발하는지 확인하기 위해, Rhod2 염색을 수행하였으며, 그 결과 두 세포주에서 모두 디니트라민에 의해 240%, 230%까지 증가함을 확인하였다 (도 3C-D). 이러한 결과를 통해, 디니트라민은 마우스 정소 세포주 내에서 세포질과 미토콘드리아 내 칼슘 축적을 일으킴을 확인하였다. 추가로, 세포 내 기전을 좀 더 명확히 하기 위해, 칼슘 이온 농도를 억제하는 2-APB (1 μM)와 BAPTA-AM (2 μM)을 디니트라민과 병용처리 하였다. IP3R(Inositaol tri-phosphate receptor)의 저해제인 2-APB의 단독 처리는 TM3 세포내 칼슘이온 농도를 46%까지 감소시키는 효과를 보였으며, TM4에서는 유의미한 변화는 없었다 (도 3E). 세포질 내 디니트라민에 유도된 칼슘 이온 농도의 증가는 2-APB와의 병용처리를 통해 대조군 대비 85%수준으로 억제되었다 (도 3E). TM4 세포에서는 디니트라민에 의해 413%까지 증가하였던 세포질 내 칼슘 이온 농도를 2-APB와의 병용처리 시 267%까지 감소시켰다 (도 3F). 디니트라민에 의해 증가한 미토콘드리아 내 칼슘 이온 농도 또한 2-APB와 병용 처리시 TM3 세포에서는 대조군 대비 269%에서 178%로 감소하였고, TM4 세포에서는 305%에서 235%으로 감소함을 확인하였다 (도 3G-H). BAPTA와의 병용처리에서는 두 세포주에서 모두 유의미한 결과를 보이지 않았다 (도 3G-H). 이를 통해, 디니트라민에 의한 정소 세포주 내 칼슘 축적은 IP3R을 주로 통하는 것임을 확인하였다.
디니트라민에
의한 마우스 정소 세포주 내 소포체 스트레스 유발 효과
소포체 (Endoplasmic reticulum, ER)은 칼슘이온을 주로 저장하는 장소로서, IP3R이 발현되는 장소 중 하나이다. 웨스턴 블랏 분석을 통해 디니트라민이 마우스 정소 세포주 내 소포체 스트레스 유발 효과가 있는지 확인하였다. 먼저 GRP78/Bip 단백질의 발현은 디니트라민에 의해 TM3 및 TM4세포주에서 농도의존적으로 (0, 5, 10, 20 μM) 2.9배 및 1.8배까지 증가하는 양상을 보였다 (도 4A). 소포체 스트레스 신호 전달의 개시인자인 IRE1α의 발현은 TM3에서 최대 1.45배, TM4 세포에서 최대 2.4배까지 유의적으로 증가하였다 (도 4B). 그 하위 인자인 Eif2α의 인산화 또한, 각 세포주에서 2.3배 및 1.5배 증가하였고, Chop 단백질의 발현은 20 μM의 디니트라민 처리에 의해 2.2배 증가하였다 (도 4C-D). 상기 결과를 통해, 디니트라민이 마우스 정소 세포주 내에서 소포체 항상성을 방해해 칼슘 이온의 조절을 와해시킴을 확인하였다.
디니트라민에
의한
MAPK
및
PI3K
/
AKT
신호전달 기전의 조절 효과
세포 생존과 여러 기능에 관여하는 세포내 신호전달 기전에 대해 확인하기 위해, MAPK 및 PI3K/AKT 신호전달 경로에 대해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 마우스 정소 세포주에 디니트라민을 0, 5, 10, 20 μM 농도로 30분간 처리 후 분석을 진행하였다. ERK1/2의 인산화는 20 μM의 디니트라민 처리에 의해 TM3 세포에서는 1.7배, TM4 세포에서는 1.9배까지 증가하였다 (도 5A). 이와 유사하게, P38 및 JNK 단백질의 인산화 역시 각 세포주에서 2.9배, 2.6배 (P38) 및 1.5배, 2.4배 (JNK)까지 세포주에서 모두 유의적으로 증가하는 양상을 보였다 (도 5C, 5E). 이와는 반대로, AKT의 인산화와 하위 신호전달 인자들인 Rps6kb1 및 Rps6의 발현은 TM3 세포에서 모두 20 μM의 디니트라민 처리에 의해 대조군 대비 0.6배 수준으로 감소하는 경향을 보였다 (도 5B, 5D, 5F). TM4 세포에서도 20 μM의 디니트라민 처리에 의해 AKT 및 Rps6kb1의 인산화가 대조군에 비해 각각 0.75배, 0.59배 감소한 것을 확인하였다 (도 5B, 5D, 5F). 상기 결과를 통해, 디니트라민이 MAPK의 인산화를 증가시키고, Akt 및 그 하위 신호전달 인자의 발현을 억제함을 확인하였다.
디니트라민의
항증식효과에
대한 칼슘억제제의
증식능
복원 효과
소포체 스트레스로 인한 칼슘 항상성 와해 효과가 세포의 증식능에 미치는지에 대해 확인하기 위해, 디니트라민과 칼슘 저해제인 2-APB 및 BAPTA와의 병용처리 조건에서 세포 증식능을 측정하였다 (도 6). TM3 세포에서는 2-APB나 BAPTA와의 병용처리가 세포의 증식능에는 유의적인 변화를 주지 못했다 (도 6A). 하지만, TM4에서는 DN 단독처리 (45.4%) 보다 2-APB와 병용처리한 조건에서 세포의 증식능이 63.1%로 약 18% 가까이 증가함을 확인하였다 (도 6B). 추가로, 디니트라민과 BAPTA와의 병용처리 역시 TM4의 증식능을 대조군 대비 65.4%수준으로 증가시켰다 (도 6B). 상기 결과를 통해, 2-APB 및 BAPTA는 증가하는 칼슘 이왼 농도를 억제하여, 마우스 세르톨리 세포 (TM4)의 증식능을 회복시킴을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 디니트라민이 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전을 조절하는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 디니트라민이 세포 내 칼슘 항상성을 조절하는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 남성 생식기 질환은 라이디히(Leydig) 세포 또는 세르톨리(Sertoli) 세포의 과증식에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 남성 생식기 질환은 라이디히 세포 종양, 세르톨리 세포 종양, 고환염, 부고환염, 고환암 및 음낭수종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 디니트라민을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 디니트라민을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법.
- 디니트라민을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210159572A KR20230072891A (ko) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 디니트라민을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210159572A KR20230072891A (ko) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 디니트라민을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230072891A true KR20230072891A (ko) | 2023-05-25 |
Family
ID=86541946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210159572A KR20230072891A (ko) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 디니트라민을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230072891A (ko) |
-
2021
- 2021-11-18 KR KR1020210159572A patent/KR20230072891A/ko not_active Application Discontinuation
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