KR20230070201A - 혈청 알부민-결합 폴리펩티드 - Google Patents

혈청 알부민-결합 폴리펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20230070201A
KR20230070201A KR1020237006891A KR20237006891A KR20230070201A KR 20230070201 A KR20230070201 A KR 20230070201A KR 1020237006891 A KR1020237006891 A KR 1020237006891A KR 20237006891 A KR20237006891 A KR 20237006891A KR 20230070201 A KR20230070201 A KR 20230070201A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lys
amino acid
ala
gly
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020237006891A
Other languages
English (en)
Inventor
엠마 젠킨스
에스텔레 아담
엠마 스탠리
암릭 바스란
매튜 피. 빈센트
브루노 고메스
Original Assignee
아박타 라이프 사이언시스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아박타 라이프 사이언시스 리미티드 filed Critical 아박타 라이프 사이언시스 리미티드
Publication of KR20230070201A publication Critical patent/KR20230070201A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57545—Neuropeptide Y
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

일부 실시양태에서, 인간 혈청 알부민과 결합하고 스테핀 폴리펩티드의 반감기를 연장시키는 스테핀 폴리펩티드의 재조합적으로 조작된 변이체 (아피머® 폴리펩티드)가 본원에 제공된다. 또한, 일부 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 폴리펩티드를 사용하는 방법, 및 폴리펩티드를 생산하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

혈청 알부민-결합 폴리펩티드
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2021년 7월 30일에 출원된 US 63/059,026을 우선권 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
인간 혈청 알부민은 인간 혈장에 존재하는 주요 단백질이다. 이는 건강한 인간 내의 총 단백질 함량의 대략 50%로 존재한다. 인간 알부민은 작은 구형 단백질 (분자량: 66.5 kDa)로, 3개의 반복된 상동체 도메인 (부위 I, II 및 III)으로 구성된 585개 아미노산의 단일 쇄로 이루어진다. 각각의 도메인은 2개의 별도의 서브-도메인 (A 및 B)을 포함한다. 인간 혈청 알부민은 다수의 소분자 및 단백질을 위한 비히클이며, 종양 압력을 조절하고 신체에서 대부분의 항산화 작용을 수행한다. 종종, 이는 약물 전달을 증진시키고 세포 배양을 유지하는데 사용된다.
일부 측면에서, 혈청 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA))과 결합하는 스테핀 폴리펩티드의 재조합적으로 조작된 변이체 (아피머(AFFIMER)® 폴리펩티드)에 기초한 반감기 연장 플랫폼이 본원에 제공된다. 다양한 결합 친화성을 갖는 다양한 인간 혈청 알부민-결합 아피머® 폴리펩티드 (항-HSA 아피머® 폴리펩티드로서 지칭됨)가 개발되었다. 이러한 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 다른 종, 예컨대 마우스 및 시노몰구스 원숭이와 교차-반응한다. 이들 폴리펩티드는 생체내 약동학적 (PK) 연구에서, 예를 들어 박테리아 세포 [예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)]에서 만들어질 수 있는, 그것과 접합되는 (예를 들어, 단일 유전적 융합체로서) 임의의 다른 아피머® 폴리펩티드의 혈청 반감기를 제어된 방식으로 연장하는 것으로 제시된 바 있다. 본원에 제공된 혈청 알부민-결합 아피머® 폴리펩티드는 또한 다른 폴리펩티드, 예컨대 치료용 단백질의 반감기를 연장하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA)과 결합하는 아피머® 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4에서 1x10-6 M 이하의 Kd로 HSA와 결합하고, pH 6에서는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1/2 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4에서 1x10-7 M 이하의 Kd로, pH 7.4에서 1x10-8 M 이하의 Kd로, 또는 pH 7.4에서 1x10-9 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 6에서의 폴리펩티드는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1 로그 더 적은, pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1.5 로그 더 적은, pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2 로그 더 적은, 또는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 10시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 72시간 초과, 96시간 초과, 120시간 초과, 144시간 초과, 168시간 초과, 192시간 초과, 216시간 초과, 240시간 초과, 264시간 초과, 288시간 초과, 312시간 초과, 336시간 초과, 또는 360시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 HSA의 혈청 반감기의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 또는 80% 초과의 혈청 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 일반식 (I): FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)로 나타내어진 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열식별번호 (SEQ ID NO): 1)와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열식별번호: 2)과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열식별번호: 3)와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고, n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이다. 일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 3과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 아피머® 폴리펩티드의 아미노산 서열은 일반식 (II)로 나타내어진다:
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 166) (II), 여기서 Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고; n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이고; Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, 또는 Glu이고; Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고; Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr이고; Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고; Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이고; Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고; Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 아피머® 폴리펩티드의 아미노산 서열은 일반식 (III)으로 나타내어진다:
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKT
QVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADR
VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 167) (III),
여기서 Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고; n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (IV)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (서열식별번호: 180) (IV), 여기서 aa1은 D, G, N, 및 V로부터 선택된 아미노산이고; aa2는 W, Y, H, 및 F로부터 선택된 아미노산이고; aa3은 W, Y, G, W, 및 F로부터 선택된 아미노산이고; aa4는 Q, A, 및 P로부터 선택된 아미노산이고; aa5는 A, Q, E, R, 및 S로부터 선택된 아미노산이고; aa6은 K, R, 및 Y로부터 선택된 아미노산이고; aa7은 W 및 Q로부터 선택된 아미노산이고; aa8은 P 및 H로부터 선택된 아미노산이고; aa9는 H, G, 및 Q로부터 선택된 아미노산이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나의 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 일반식 (IV)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (서열식별번호: 181) (IV), 여기서 aa1은 Y, F, W, 및 N으로부터 선택된 아미노산이고; aa2는 K, P, H, A, 및 T로부터 선택된 아미노산이고; aa3은 V, N, G, Q, A, 및 F로부터 선택된 아미노산이고; aa4는 H, T, Y, W, K, V, 및 R로부터 선택된 아미노산이고; aa5는 Q, S, G, P, 및 N으로부터 선택된 아미노산이고; aa6은 S, Y, E, L, K, 및 T로부터 선택된 아미노산이고; aa7은 S, D, V, 및 K로부터 선택된 아미노산이고; aa8은 G, L, S, P, H, D, 및 R로부터 선택된 아미노산이고; aa9는 G, Q, E, 및 A로부터 선택된 아미노산이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나의 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 110-116 및 138 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 110-116 및 138 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (IV)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV), 여기서 aa1은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa2는 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa4는 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa5는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa6은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa7은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa8은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa9는 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 일반식 (IV)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV), 여기서 aa1은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa2는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa4는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa5는 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa6은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa7은 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa8은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa9는 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 시스테인 (C 또는 Cys) 및 글리신 (G 또는 Gly)으로부터 선택되고; 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 알라닌 (A 또는 Ala), 이소류신 (I 또는 Ile), 류신 (L 또는 Leu), 메티오닌 (M 또는 Met), 페닐알라닌 (F 또는 Phe), 프롤린 (P 또는 Pro), 트립토판 (W 또는 Trp), 및 발린 (V 또는 Val)으로부터 선택되고; 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 아스파라긴 (N 또는 Asn), 글루타민 (Q 또는 Gln), 세린 (S 또는 Ser), 트레오닌 (T 또는 Thr), 및 티로신 (Y 또는 Tyr)으로부터 선택되고; 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌 (R 또는 Arg), 히스티딘 (H 또는 His), 및 리신 (K 또는 Lys)으로부터 선택되고; 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 아스파르테이트 (D 또는 Asp) 및 글루타메이트 (E 또는 Glu)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 아피머® 폴리펩티드의 아미노산 서열은 일반식 (III)으로 나타내어진다:
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKT
QVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADR
VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 167) (III),
여기서 (Xaa)n은 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열이고/거나 (Xaa)m은 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 임의로 화학적 접합에 이용가능한 시스테인을 포함하고, 임의로 여기서 시스테인은 폴리펩티드의 C-말단 단부 또는 N-말단 단부에 위치한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 연속 융합 단백질을 형성하기 위해 아미드 결합을 통해 공유적으로 연결된 이종 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 호르몬, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 지혈 활성 폴리펩티드, 효소 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 호르몬, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 지혈 활성 폴리펩티드, 효소 또는 독소의 길항제이다.
일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 수용체 트랩 및 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 수용체 트랩 또는 수용체 리간드의 길항제이다.
일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 서열은 혈관형성제 및 항혈관형성제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 혈관형성제 또는 항혈관형성제의 길항제이다.
일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 서열은 신경전달물질, 예를 들어 뉴로펩티드 Y이다.
일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 서열은 적혈구생성-자극제, 예를 들어 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 모방체이다.
일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 인크레틴이다. 예를 들어, 인크레틴은 글루카곤, 위 억제성 펩티드 (GIP), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2), 펩티드 YY (PYY) 또는 옥신토모듈린 (OXM)일 수 있다.
추가 예시를 위해, 일부 실시양태에서 본 발명의 치료용 단백질은 적어도 하나의 HSA 결합 아피머® 서열에 더하여, 에리트로포이에틴 (EPO) 폴리펩티드 서열, 예컨대 서열식별번호: 133에 제시된 것을 포함한다.
Figure pct00001
예시적인 XT/EPO 융합을 위한 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 134로서 제시되며, 여기서 첫 번째 밑줄친 서열은 분비 신호 서열이고 두 번째 밑줄친 서열은 (G4S)n 연결된 EPO 폴리펩티드 서열이다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 글리코실화를 위한 부위로서 작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 글리코실화를 위한 부위로 작용하지 않는 아미노산 잔기로 대체된 EPO에 대한 변이체 서열이 사용된다. 예를 들어, 서열식별번호: 133의 아미노산 잔기 Asn24, Asn38, Asn83 및 Ser126 중 하나 이상이 변경될 수 있으며, 예를 들어 Asn 또는 Ser 이외의 아미노산 잔기, 예를 들어 Ala로 대체될 수 있다. 예시적인 XT/변이체 EPO 융합을 위한 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 135로서 제시되며, 여기서 첫 번째 밑줄친 서열은 분비 신호 서열이고 두 번째 밑줄친 서열은 (G4S)n 연결된 변이체 EPO 폴리펩티드 서열이다:
Figure pct00003
인크레틴-XT 융합의 예로서, 둘라글루티드 또는 엑센딘-4에 사용되는 GLP-1 유사체는 서열식별번호: 136 또는 137에 제시된 바와 같은 HSA 결합 아피머® 서열을 갖는 융합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있으며, 여기서 첫 번째 밑줄친 서열은 분비 신호 서열이고 두 번째 밑줄친 서열은 GLP-1 변이체 폴리펩티드 서열과 HSA 결합 아피머® 폴리펩티드 서열을 분리하는 연결된 (G4S)n이다:
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 생체내 이종 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장시킨다. 예를 들어, 이종 폴리펩티드는 아피머® 폴리펩티드에 연결되지 않은 이종 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배 또는 적어도 30배 더 큰 연장된 반감기를 가질 수 있다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 아피머® 폴리펩티드 중 임의의 것, 및 제약상 허용되는 부형제 (예를 들어, 담체, 완충제 및/또는 염 등)를 포함하는, 예를 들어 인간 환자에서의 치료 용도를 위한 제약 제제를 제공한다.
본 개시내용의 추가 측면은 본원에 기재된 아피머® 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열은, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 다른 전사 조절 서열이 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 복제 기점, 미니염색체 유지 요소 (MME) 및/또는 핵 국재화 요소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되고 그로 전사된 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 인트론 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 서열로 전사된 적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 (DNA)이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 리보핵산 (RNA)이다.
본 개시내용의 추가 측면은 본원에 기재된 아피머® 폴리펩티드를 포함하는 바이러스 벡터, 플라스미드 및/또는 미니서클을 제공한다.
본 개시내용의 부가의 측면은 본원에 기재된 아피머® 폴리펩티드의 치료상 유효량을, 자가면역 질환이 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 강성 링커이다. 일부 실시양태에서, 강성 링커는 서열식별번호: 161의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 가요성 링커이다. 일부 실시양태에서, 가요성 링커는 서열식별번호: 165의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 본원에 기재된 폴리펩티드 중 임의의 것 2개를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 치료용 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료용 분자는 치료용 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 호르몬, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 지혈 활성 폴리펩티드, 효소 및 독소로부터 선택되거나, 또는 호르몬, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 지혈 활성 폴리펩티드, 효소 및 독소의 길항제로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 110의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 113의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 116의 아미노산 서열을 포함한다.
도 1 파지 디스플레이를 사용하여 선택된 아피머® 9개 아미노산 결합 루프 (루프 2 및 4) 서열의 정렬. 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 및 위에서 아래로 서열식별번호: 22, 75, 45, 98, 26, 79, 48, 101, 23, 76, 40, 93, 41, 94, 24, 77, 33, 86, 36, 89, 35, 88, 38, 91, 50, 103, 56, 및 109에 상응한다.
도 2 혈청 알부민 파지 선택으로부터의 유사한 모티프의 아피머® 결합 루프 서열 패밀리. 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 및 위에서 아래로 서열식별번호: 169-178에 상응한다.
도 3a 및 3b 정제된 단량체성 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드의 SEC-HPLC (도 3a) 및 SDS-PAGE (도 3b) 분석.
도 4a-4d pH 6.0 및 pH 7.4에서 상이한 종의 혈청 알부민에 대한 정제된 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드의 옥텟 동역학적 결합 분석. HSA-20 (도 4a), HSA-31 (도 4b), HSA-36 (도 4c) 및 HSA-41 (도 4d)이 제시된다.
도 5 pH 6.0 및 pH 7.4에서 다양한 종의 혈청 알부민에 대한 정제된 혈청 알부민 결합 아피머® 단백질의 비아코어(BIACORE)™ 동역학적 분석.
도 6 pH 7.4에서 상이한 종으로부터의 혈청 알부민에 대한 아피머® 폴리펩티드 결합 ELISA.
도 7 pH 6.0에서 상이한 종으로부터의 혈청 알부민에 대한 아피머® 폴리펩티드 결합 ELISA.
도 8 마우스에서 5개의 리드 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드의 약동학적 프로파일.
도 9a 및 9b pH 7.4 (도 9a) 및 pH 6.0 (도 9b)에서 C-말단 His 태그 절단된 아피머® 리드 클론의 옥텟 분석.
도 10 마우스에서 C-말단 His 태그 절단된 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드의 약동학 프로파일.
도 11 HSA의 FcRn 결합이 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증하는 비아코어™ 조정된 센서그램.
도 12a PD-L1/혈청 알부민 결합 인라인 융합 (ILF) 아피머® 단백질의 도식적 표현.
도 12b 정제 후 PD-L1/혈청 알부민 결합 ILF 아피머® 단백질의 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 13 PD-L1/혈청 알부민 결합 삼량체 ILF 아피머® 단백질의 도식적 표현.
도 14 정제된 PD-L1/혈청 알부민 결합 삼량체 ILF 아피머® 단백질의 생산 및 SDS-PAGE 분석.
도 15 ILF 아피머® 삼량체가 PD-L1 표적 항원 및 혈청 알부민 둘 다에 대한 결합을 유지한다는 것을 제시하는 비아코어™ 동역학적 분석.
도 16 ELISA에 의해 인간 PD-L1과 결합하고 모 분자 AVA04-251과 유사한 결합을 나타내는 반감기 연장된 아피머® ILF 삼량체를 제시하는 그래프.
도 17 반감기 연장된 ILF 아피머® 폴리펩티드의 효능이 PD-1/PD-L1 차단 생물검정 (프로메가(PROMEGA)®)에서 모 분자와 유사하다는 것을 제시하는 그래프.
도 18 인간 혈청 알부민에 대한 반감기 연장된 ILF 아피머® 폴리펩티드 결합이 pH 7.4에서 ELISA에 의해 동등하다는 것을 제시하는 그래프.
도 19 ILF 삼량체 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드 (AVA04-251 XT14)가 기능적이며 모 분자와 비교하여 포맷화될 때 효능을 유지한다는 것을 제시하는 혼합 림프구 반응 (MLR).
도 20 마우스에서 ILF 반감기 연장된 삼량체의 약동학적 프로파일.
도 21a-21c A375 이종이식편 모델에서 ILF AVA04-251 XT14의 생체내 효능. 시간 경과에 따른 개별 트레이스가 도 21a에 제시되어 있다. 도 21b는 군별로 통합된 도 21a의 결과를 제시한다. 도 21c는 각각의 군에서의 종양 용적을 제시한다.
도 22 이. 콜라이(E. coli)로부터 AVA04-251 XT14-cys의 발현 및 정제.
도 23 이중 인간화 신생아 Fc 수용체 (FcRn)/알부민 마우스 모델에서 HSA-41의 약동학적 프로파일.
도 24 시노몰구스 원숭이에서 HSA-41, HSA-18 및 HSA-31의 약동학적 프로파일.
도 25a 항-마우스 PD-L1 아피머® 반감기 연장된 삼량체 생산 및 특징규명.
도 25b 비아코어™를 사용한 마우스 PD-L1 Fc에 대항한 AVA04-182 XT20 KD 결정.
도 26a 및 26b pH 7.4 (도 26a) 및 6.0 (도 26b)에서 MSA에 대한 AVA04-182 XT20 결합을 제시하는 ELISA.
도 26c AVA04-182 및 AVA04-182 XT20 둘 다의 mPD-L1 경쟁 ELISA.
도 27 마우스에서 AVA04-182 XT20 삼량체, AVA04-182 Fc 포맷화된 아피머® 폴리펩티드의 약동학적 프로파일.
도 28a-28c AVA04-251 BH cys ILF 이량체 단백질의 개략도 (도 28a) 및 특징규명. 도 28b는 순도 분석을 제시하고 도 28c는 SDS-PAGE 분석을 제시한다.
도 29a 및 29b huPD-L1에 대한 결합 ELISA를 사용한 모 분자와 비교하여 형광 표지된 아피머® 폴리펩티드, AVA04-251 BH cys800 (도 29a) 및 AVA04-251 XT14 cys800 (도 29b)의 결합 능력 평가.
도 30 처리 후 4시간에 2개의 A375 흑색종 이종이식편 모델에서 형광 표지된 아피머® 항-huPD-L1 폴리펩티드의 생체분포의 대표적인 영상.
도 31a HSA 및 항-HSA 아피머® 폴리펩티드 HSA-41 복합체로부터 형성된 결정의 영상.
도 31b 단백질 복합체의 결정화로부터 유래된 HSA와의 복합체에서 항-HSA 아피머® 폴리펩티드 HSA-41의 계산된 3차원 구조.
도 31c 및 31d HSA와의 접촉 계면에서 아피머® 폴리펩티드의 루프 2 (도 31c) 및 루프 4 (도 31d) 잔기 간의 아미노산 상호작용.
도 32a ILF 동종이량체 HSA-41 포맷의 개략도.
도 32b 단량체와 비교하여 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 KD 값의 표.
도 32c 유전적으로 연결되어 이량체를 형성할 때 HSA-41 단량체의 HSA에 대한 결합력 효과를 제시하는 비아코어™ 센서그램.
도 33a-33c 혈청 알부민과의 HSA-41 단량체 인큐베이션, SEC-HPLC 특징규명 (도 33a, 1:1 비율; 도 33b, 1:2 비율; 도 33c, 1:1 오버레이).
도 34 혈청 알부민과의 HSA-41 인라인 융합 (ILF) 이량체 인큐베이션의 SEC-HPLC 특징규명.
도 35 C57BL/6 마우스에서 HSA-41 단량체 및 ILF 이량체의 약동학적 분석.
도 36 HSA-41 루프 4 녹아웃 돌연변이체의 혈청 알부민 비아코어 동역학적 분석.
도 37 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정을 사용하여 HSA-41에 대항한 리드 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드 에피토프 비닝.
도 38a 및 38b HSA-41 유리 C-말단 시스테인 포맷 (CQ)의 SEC-HPLC 및 SDS-PAGE 특징규명.
도 39 pH 7.4에서 HSA에 대한 HSA-41 유리 C-말단 시스테인 포맷 (CQ) 결합에 관한 비아코어 동역학적 분석.
도 40 HSA-18 반감기 연장 아피머® 폴리펩티드를 포함하는 AVA04-251 XT ILF (2가지 상이한 포맷: XT60 및 XT61)의 품질 관리 분석 (순도).
도 41a 및 41b pH 7.4 (도 41a) 및 pH 6.0 (도 41b)에서 HSA에 대한 XT60 및 XT61 ILF 결합에 관한 비아코어 동역학적 분석.
도 42 pH 7.4에서 HSA 및 MSA에 대한 XT60 및 XT61 ILF 결합에 관한 결합 ELISA.
도 43 pH 6.0에서 MSA에 대한 결합에 관한 XT60 및 XT61 ILF 비아코어 동역학적 분석.
도 44 인간 PD-L1 Fc에 대한 XT60 및 XT61 ILF 폴리펩티드 결합에 관한 비아코어 동역학적 분석.
본 개시내용은 인간 혈청 알부민 (HSA)과 결합하여 제어된 방식으로, 그것과 접합되는 임의의 다른 치료용 분자 (예를 들어, 치료용 아피머® 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 약물)의 혈청 반감기를 연장시키는 아피머® 폴리펩티드의 생성을 기반으로 한다. 본원에서의 실험 데이터는 아피머® 폴리펩티드의 혈청 반감기가 생체내에서 알부민과 결합함으로써 상당히 증가될 수 있음을 입증한다.
결합 표면을 생성하는 2개의 루프를 안정적으로 표시하도록 조작된 자연적으로 발생하는 단백질 (시스타틴)에 기초하여, 본 개시내용의 혈청 알부민-결합 아피머® 폴리펩티드는 항체, 항체 단편 및 다른 비-항체 분자-결합 단백질에 비해 다수의 이점을 제공한다. 그 중 한 가지는 아피머® 폴리펩티드 자체의 작은 크기이다. 그것의 단량체 형태에서는 약 14 kDa이거나, 또는 항체 크기의 1/10이다. 이러한 작은 크기로 인해, 특히 혈관이 잘 형성되지 않고/거나 섬유화된 표적 조직 (종양과 같음)에서 조직 침투가 증가할 가능성이 더 크다. 아피머® 폴리펩티드는 단순한 단백질 구조 (다중 도메인 항체에 비해)를 가지며, 아피머® 폴리펩티드는 디술피드 결합 또는 기능을 위한 기타 번역 후 변형을 필요로 하지 않기 때문에, 이러한 폴리펩티드는 원핵 및 진핵 시스템에서 제조될 수 있다.
아피머® 폴리펩티드의 라이브러리 (예컨대 첨부된 실시예에 기재된 파지 디스플레이 기술) 뿐만 아니라 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여, 아피머® 폴리펩티드는 치료 용도에 이상적인 범위의 조정가능한 결합 동역학으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 아피머® 폴리펩티드는 HSA에 대해 높은 친화성, 예컨대 단량체성 아피머® 폴리펩티드에 대한 한 자릿수 나노몰 또는 더 낮은 Kd, 및 다가 포맷에서의 피코몰 Kd 및 결합력을 가질 수 있다. 아피머® 폴리펩티드는 HSA에 대한 밀착 결합 동역학으로, 예컨대 10-4 내지 10-5 (s-1) 범위의 느린 Koff 속도로 생성될 수 있으며, 이는 표적 조직 국재화에 도움이 된다.
본 개시내용의 혈청 알부민-결합 아피머® 폴리펩티드는 정교한 선택성을 갖는 아피머® 폴리펩티드를 포함한다.
더욱이, 혈청 알부민-결합 아피머® 폴리펩티드는 Fc 융합체, 전체 항체 융합체 및 인라인 다량체와 같은 포맷을 용이하게 생성하고 제조할 수 있도록 쉽게 포맷화될 수 있다.
디술피드 결합 및 번역 후 변형에 대한 필요성의 결여는 또한 혈청 알부민-결합 아피머® 폴리펩티드를 포함한 단백질의 많은 실시양태가, 환자의 조직으로 도입되는 유전자 전달 구축물의 발현에 의해 치료적으로 전달되도록 허용하며, 단백질이 전신적으로 전달되거나 (예컨대 근육 조직으로부터의 발현) 또는 국소적으로 전달되는 (예컨대 종양내 유전자 전달을 통함) 포맷을 포함한다.
아피머® 폴리펩티드 (간단히 아피머®로서 지칭되기도 함)는 스테핀 폴리펩티드의 재조합적으로 조작된 변이체인 작고 매우 안정적인 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질)이다. 따라서, 용어 "아피머® 폴리펩티드"는 본원에서 용어 "스테핀 폴리펩티드의 재조합적으로 조작된 변이체"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 스테핀 폴리펩티드는 시스타틴 슈퍼패밀리 (여러 시스타틴 유사 서열을 함유하는 단백질을 포괄하는 패밀리) 내의 단백질의 하위 군이다. 시스타틴 패밀리의 스테핀 하위 군은 상대적으로 작은 (~100개 아미노산) 단일 도메인 단백질이다. 그들은 공지된 번역 후 변형을 받지 않으며, 디술피드 결합이 결여되며, 이는 광범위한 세포외 및 세포내 환경에서 동일하게 폴딩할 수 있을 것임을 시사한다. 스테핀 A는 98개의 아미노산으로 구성된 단량체성, 단일 쇄, 단일 도메인 단백질이다. 스테핀 A의 구조가 해결되어, 스테핀 A의 아피머® 폴리펩티드로의 합리적 돌연변이를 용이하게 한다. 시스타틴의 유일하게 공지된 생물학적 활성은 카텝신 활성의 억제이며, 조작된 단백질의 잔류 생물학적 활성에 대한 철저한 시험을 가능하게 했다.
아피머® 폴리펩티드는 모노클로날 항체와 유사한 방식으로 높은 친화성과 특이성으로 원하는 표적 단백질과 결합하도록 모두 무작위화될 수 있는 2개의 펩티드 루프와 N-말단 서열을 표시한다. 스테핀 A 단백질 스캐폴드에 의한 두 펩티드의 안정화는 펩티드가 취할 수 있는 가능한 입체형태를 제한하여, 유리 펩티드 라이브러리에 비해 결합 친화성 및 특이성을 증가시킨다. 이러한 조작된 비-항체 결합 단백질은 상이한 적용 분야에서 모노클로날 항체의 분자 인식 특징을 모방하도록 설계된다. 스테핀 A 폴리펩티드 서열의 다른 부분에 대한 변이가 수행될 수 있으며, 이러한 변이는 이러한 친화성 시약의 특성을 개선시켜, 예컨대 안정성을 증가시켜, 예를 들어 다양한 온도 및 pH에 걸쳐 이들을 견고하게 만든다. 일부 실시양태에서, 아피머® 폴리펩티드는 스테핀 A 야생형 서열, 예컨대 인간 스테핀 A와 실질적인 동일성을 공유하는, 스테핀 A로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아피머® 폴리펩티드는 인간 스테핀 A에 상응하는 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55% 또는 60% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 아피머® 폴리펩티드는 예를 들어, 서열 변이가 원하는 표적과 결합할 수 있는 스캐폴드의 능력에 악영향을 미치지 않는 경우, 및 예를 들어, 야생형 스테핀 A에 의해 보유되긴 하지만 본원에 기재된 돌연변이 변화에서 폐지되는 것과 같은 생물학적 기능을 회복 또는 생성하지 않는 경우, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
인간 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드
본 개시내용의 한 측면은 인간 혈청 알부민 (HSA)과 결합하는 아피머® 폴리펩티드 (항-HSA 아피머® 폴리펩티드로서 지칭됨)를 제공한다. 인간 혈청 알부민 (HSA)은 ALB 유전자에 의해 코딩된 단백질이다. HSA는 약 20일의 혈청 반감기를 갖는 585개 아미노산 폴리펩티드 (대략 67 kDa)이며 주로 콜로이드 삼투압 혈압, 혈액 pH의 유지, 및 수많은 내인성 및 외인성 리간드의 수송 및 분포를 담당한다. HSA는 3개의 구조적으로 상동인 도메인 (도메인 I, II 및 III)을 가지며 거의 전적으로 알파-나선 입체형태이며, 17개의 디술피드 브릿지에 의해 고도로 안정화된다. 대표적인 HSA 서열은 유니프로트KB 기본 수탁 번호 P02768에 의해 제공되며 그의 다른 인간 이소형을 포함할 수 있다.
항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 용매 접근가능한 루프 중 적어도 하나가 선택적으로 및 일부 실시양태에서, 아피머® 폴리펩티드가 10-6 M 이하의 Kd로 HSA와 결합할 수 있게 하는 아미노산 서열을 갖는 야생형 스테핀 A 단백질로부터 유래되는 것인 아피머® 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-9 M 내지 1x10-6 M의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-6 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-7 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-8 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-9 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4에서 1x10-9 M 내지 1x10-6 M의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4에서 1x10-6 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4에서 1x10-7 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4에서 1x10-8 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 pH 7.4에서 1x10-9 M 이하의 Kd로 HSA와 결합한다.
일부 실시양태에서, pH 5.8 내지 6.2에서의 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 1/2 로그 내지 2.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 5.8 내지 6.2에서의 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1/2 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 5.8 내지 6.2에서의 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 5.8 내지 6.2에서의 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 5.8 내지 6.2에서의 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 5.8 내지 6.2에서의 폴리펩티드는 pH 7.4 내지 7.6에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 6에서의 폴리펩티드는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 1/2 로그 내지 2.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 6에서의 폴리펩티드는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1/2 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 6에서의 폴리펩티드는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 6에서의 폴리펩티드는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 6에서의 폴리펩티드는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다. 일부 실시양태에서, pH 6에서의 폴리펩티드는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 10시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 24시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 48시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 72시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 96시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 120시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 144시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 168시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 192시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 216시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 240시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 264시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 288시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 312시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 336시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 360시간 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 24 내지 360시간, 48 내지 360시간, 72 내지 360시간, 96 내지 360시간, 또는 120 내지 360시간의 혈청 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 HSA의 혈청 반감기의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과 또는 80% 초과의 혈청 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 환자에서 HSA의 혈청 반감기의 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 또는 50% 내지 100%의 혈청 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 백본 서열을 갖는 야생형 인간 스테핀 A 단백질로부터 유래되고, 여기서 루프 2 ((Xaa)n으로 지명됨) 및 루프 4 ((Xaa)m으로 지명됨) 중 하나 또는 둘 다는 대안적 루프 서열 (Xaa)n 및 (Xaa)m으로 대체되어 일반식 (I)을 갖는다:
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I),
여기서 FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열식별번호: 1)와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열식별번호: 2)과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열식별번호: 3)와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고; n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이다.
일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1과 80%-98%, 82%-98%, 84%-98%, 86%-98%, 88%-98%, 90%-98%, 92%-98%, 94%-98%, 또는 96%-98% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1과 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 또는 95% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1의 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2와 적어도 80%-96%, 84%-96%, 88%-96%, 또는 92%-96% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 84%, 88%, 92%, 또는 96% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2의 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 3과 적어도 80%-95%, 85%-95%, 또는 90%-95% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 3의 폴리펩티드 서열이다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 일반식 (II)로 나타내어진 아미노산 서열을 포함한다:
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 166) (II),
여기서 Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고; n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이고; Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, 또는 Glu이고; Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고; Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr이고; Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고; Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이고; Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고; Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이다.
일부 실시양태에서, Xaa1은 Gly, Ala, Arg 또는 Lys이다. 일부 실시양태에서, Xaa1은 Gly 또는 Arg이다. 일부 실시양태에서, Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이다. 일부 실시양태에서, Xaa2는 Gly 또는 Ser이다. 일부 실시양태에서, Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr이다. 일부 실시양태에서, Xaa3은 Arg, Lys, Asn 또는 Gln이다. 일부 실시양태에서, Xaa3은 Lys 또는 Asn이다. 일부 실시양태에서, Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이다. 일부 실시양태에서, Xaa4는 Gly 또는 Ser이다. 일부 실시양태에서, Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이다. 일부 실시양태에서, Xaa5는 Ile, Leu 또는 Pro이다. 일부 실시양태에서, Xaa5는 Leu 또는 Pro이다. 일부 실시양태에서, Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이다. 일부 실시양태에서, Xaa6은 Ala, Val, Asp 또는 Glu이다. 일부 실시양태에서, Xaa6은 Ala 또는 Glu이다. 일부 실시양태에서, Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이다. 일부 실시양태에서, Xaa7은 Ile, Leu 또는 Arg이다. 일부 실시양태에서, Xaa7은 Leu 또는 Arg이다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 일반식 (III)으로 나타내어진 아미노산 서열을 포함한다:
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKT
QVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADR
VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 167) (III),
여기서 Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고; n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 일부 실시양태에서, n은 8 내지 10, 7 내지 11, 6 내지 12, 5 내지 13, 4 내지 14, 또는 3 내지 15이다. 일부 실시양태에서, m은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 일부 실시양태에서, m은 8 내지 10, 7 내지 11, 6 내지 12, 5 내지 13, 4 내지 14, 또는 3 내지 15이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (IV)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV),
여기서 aa1은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa2는 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa4는 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa5는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa6은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa7은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa8은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa9는 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 일반식 (V)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (V),
여기서 aa1은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa2는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa4는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa5는 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa6은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa7은 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa8은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고; aa9는 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이다.
중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 시스테인 (Cys) 및 글리신 (Gly)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Cys이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Gly이다.
중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 알라닌 (Ala),이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 트립토판 (Trp), 및 발린 (Val)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ala이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ile이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Leu이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Met이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Phe이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Pro이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Trp이다. 일부 실시양태에서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Val이다.
중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아스파라긴 (Asn), 글루타민 (Gln), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 및 티로신 (Tyr)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Asn이다. 일부 실시양태에서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Gln이다. 일부 실시양태에서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ser이다. 일부 실시양태에서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Thr이다. 일부 실시양태에서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Tyr이다.
양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아르기닌 (Arg), 히스티딘 (His), 및 리신 (Lys)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Arg이다. 일부 실시양태에서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 His이다. 일부 실시양태에서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Lys이다.
음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아스파르테이트 (Asp) 및 글루타메이트 (Glu)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Asp이다. 일부 실시양태에서, 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Glu이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (IV)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (서열식별번호: 180) (IV),
여기서 aa1은 Asp, Gly, Asn, 및 Val로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa2는 Trp, Tyr, His, 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa3은 Trp, Tyr, Gly, Trp, 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa4는 Gln, Ala, 및 Pro로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa5는 Ala, Gln, Glu, Arg, 및 Ser로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa6은 Lys, Arg, 및 Tyr로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa7은 Trp 및 Gln으로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa8은 Pro 및 His로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa9는 His, Gly, 및 Gln으로부터 선택된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Asp이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Asn이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa2는 His이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Pro이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Glu이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa7은 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa7은 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa8은 Pro이다. 일부 실시양태에서, aa8은 His이다. 일부 실시양태에서, aa9는 His이다. 일부 실시양태에서, aa9는 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa9는 Gln이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 일반식 (IV)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (서열식별번호: 181) (IV),
여기서 aa1은 Tyr, Phe, Trp, 및 Asn으로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa2는 Lys, Pro, His, Ala, 및 Thr로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa3은 Val, Asn, Gly, Gln, Ala, 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa4는 His, Thr, Lys, Trp, Lys, Val, 및 Arg로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa5는 Gln, Ser, Gly, Pro, 및 Asn으로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa6은 Ser, Tyr, Glu, Leu, Lys, 및 Thr로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa7은 Ser, Asp, Val, 및 Lys로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa8은 Gly, Leu, Ser, Pro, His, Asp, 및 Arg로부터 선택된 아미노산이고/거나; aa9는 Gly, Gln, Glu, 및 Ala로부터 선택된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Asn이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Pro이다. 일부 실시양태에서, aa2는 His이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Thr이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Val이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Asn이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa4는 His이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Thr이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Val이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Pro이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Asn이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Glu이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Leu이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Thr이다. 일부 실시양태에서, aa7은 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa7은 Asp이다. 일부 실시양태에서, aa7은 Val이다. 일부 실시양태에서, aa7은 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa8은 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa8은 Leu이다. 일부 실시양태에서, aa8은 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa8은 Pro이다. 일부 실시양태에서, aa8은 His이다. 일부 실시양태에서, aa8은 Asp이다. 일부 실시양태에서, aa8은 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa9는 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa9는 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa9는 Glu이다. 일부 실시양태에서, aa9는 Ala이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (V)로 나타내어진다:
Asn-aa1-aa2-Gln-Gln-Arg-Arg-Trp-Pro-Gly (서열식별번호: 179) (V),
여기서 aa1은 Trp 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고; aa2는 Tyr 및 Phe로부터 선택된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Phe이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (VI)으로 나타내어진다:
aa1-aa2-Trp-aa3-aa4-Lys-Trp-Pro-aa5 (VI),
여기서 aa1은 Asp 및 Gly로부터 선택된 아미노산이고; aa2는 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고; aa3은 Gln 및 Ala로부터 선택된 아미노산이고; aa4는 Ala 및 Ser로부터 선택된 아미노산이고; aa5는 His 및 Gly로부터 선택된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Asp이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa5는 His이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Gly이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (VII)로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-Trp-Pro-Gly (VII),
여기서 aa1은 Gly 및 Asn으로부터 선택된 아미노산이고; aa2는 Tyr, Phe, Trp, 및 His로부터 선택된 아미노산이고; aa3은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고; aa4는 Ala 및 Gln으로부터 선택된 아미노산이고; aa5는 Ala, Ser, Gln, 및 Arg로부터 선택된 아미노산이고; aa6은 Lys, Arg, 및 Tyr로부터 선택된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Gly이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Asn이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa2는 His이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Tyr이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (IX)로 나타내어진다:
Gly-aa1-aa2-Ala-aa3-aa4-Trp-Pro-Gly (IX),
여기서 aa1은 Tyr, Phe, 및 His로부터 선택된 아미노산이고; aa2는 Trp 및 Tyr로부터 선택된 아미노산이고; aa3은 Ala, Ser, 및 Arg로부터 선택된 아미노산이고; aa4는 Lys 및 Tyr로부터 선택된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa1은 His이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Ser이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Tyr이다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 일반식 (X)으로 나타내어진다:
aa1-aa2-aa3-Gln-aa4-aa5-Trp-Pro-aa6 (X),
여기서 aa1은 Asp 및 Asn으로부터 선택된 아미노산이고; aa2는 Trp 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고; aa3은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택된 아미노산이고; aa4는 Ala, Gln, 및 Arg로부터 선택된 아미노산이고; aa5는 Lys 및 Arg로부터 선택된 아미노산이고; aa6은 His 및 Gly로부터 선택된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Asp이다. 일부 실시양태에서, aa1은 Asn이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa2는 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Trp이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Tyr이다. 일부 실시양태에서, aa3은 Phe이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Ala이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Gln이다. 일부 실시양태에서, aa4는 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Lys이다. 일부 실시양태에서, aa5는 Arg이다. 일부 실시양태에서, aa6은 His이다. 일부 실시양태에서, aa6은 Gly이다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-56 중 어느 하나로부터 선택된 루프 2 아미노산 서열을 포함한다 (표 1). 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 57-109 중 어느 하나로부터 선택된 루프 4 아미노산 서열을 포함한다 (표 1).
표 1. HSA 아피머® 루프 서열의 예
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 35의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 40의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 35의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 40의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 35의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 40의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 77의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 79의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 88의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 93의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 94의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 98의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 77의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 79의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 88의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 93의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 94의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 98의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 75의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 77의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 79의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 88의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 93의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 94의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 98의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 110-116, 및 138 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다 (표 2).
표 2. HSA 아피머® 폴리펩티드 서열의 예
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 110-116 및 138 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 110의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 111의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 112의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 113의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 114의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 115의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 116의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 138의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 110의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 111의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 112의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 113의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 114의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 115의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 116의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 138의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 110-116 및 138 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 110-116 및 138 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 110의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 111의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 112의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 113의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 114의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 115의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 116의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 138의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 일부 실시양태에서, 또 다른 분자에 연결되고 그 분자 (예를 들어, 치료용 폴리펩티드)의 반감기를 연장시킨다. 예를 들어, 다른 종, 예컨대 마우스 및 시노몰구스 (시노) 원숭이와 교차-반응하는 다양한 결합 친화성을 갖는 다양한 항-HSA 아피머® 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 이들 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 일부 실시양태에서, 아피머 XT™ 플랫폼으로서 지칭된 것을 구성한다. 이들 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 생체내 약동학적 (PK) 연구에서, 예를 들어 이. 콜라이에서 만들어질 수 있는, 단일 유전적 융합으로 그것과 접합되는 임의의 다른 아피머® 치료제의 혈청 반감기를 제어된 방식으로 연장하는 것으로 제시된 바 있다. 아피머 XT™는 또한 다른 펩티드 또는 단백질 치료제의 반감기를 연장하기 위해 사용될 수 있다.
용어 반감기는 치료용 아피머® 폴리펩티드와 같은 물질이 약리학적 또는 생리학적 활성 또는 농도의 절반을 상실하는데 걸리는 시간을 지칭한다. 생물학적 반감기는 그러한 물질의 제거, 배설, 분해 (예를 들어, 효소적 분해), 또는 신체의 특정 기관 또는 조직에서의 흡수 및 농축에 의해 영향을 받을 수 있다. 생물학적 반감기는 예를 들어, 물질의 혈장 농도가 정상 상태 수준의 절반에 도달하는데 걸리는 시간 ("혈장 반감기")을 결정함으로써 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 생체내에서 분자 (예를 들어, 치료용 폴리펩티드)의 혈청 반감기를 연장시킨다. 예를 들어, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 항-HSA 아피머® 폴리펩티드에 연결되지 않은 분자의 반감기에 비해 특정 분자의 반감기를 적어도 1.2배만큼 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 항-HSA 아피머® 폴리펩티드에 연결되지 않은 분자의 반감기에 비해 특정 분자의 반감기를 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 적어도 30배만큼 연장시킨다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 항-HSA 아피머® 폴리펩티드에 연결되지 않은 분자의 반감기에 비해 특정 분자의 반감기를 1.2배 내지 5배, 1.2배 내지 10배, 1.5배 내지 5배, 1.5배 내지 10배, 2배 내지 5배, 2배 내지 10배, 3배 내지 5배, 3배 내지 10배, 15배 내지 5배, 4배 내지 10배, 또는 5배 내지 10배만큼 연장시킨다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 항-HSA 아피머® 폴리펩티드에 연결되지 않은 분자의 반감기에 비해, 생체내 투여 후 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 예를 들어, 적어도 1주만큼 특정 분자의 반감기를 연장시킨다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 연장된 혈청 반감기를 가지며 서열식별번호: 117-127, 139, 및 140 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다 (표 3).
표 3: 반감기 연장 인라인 융합 아피머® 폴리펩티드 서열의 예
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 117-127, 139, 및 140 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 117의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 118의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 119의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 120의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 121의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 122의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 123의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 124의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 125의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 126의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 127의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 139의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 140의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 117의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 118의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 119의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 120의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 121의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 122의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 123의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 124의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 125의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 126의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 127의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 139의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 140의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 117-127, 139, 및 140 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 117-127, 139, 및 140 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 117의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 118의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 119의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 120의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 121의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 122의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 123의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 124의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 125의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 126의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 127의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 139의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 서열식별번호: 140의 아미노산 서열과 80% 내지 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩티드
폴리펩티드는 임의의 길이의 아미노산 (자연적으로 발생하는 또는 비-자연적으로 발생하는, 예를 들어 아미노산 유사체)의 중합체이다. 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 달리 언급되지 않는 한 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 단백질은 폴리펩티드의 한 예이다. 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있고, 자연적으로 발생하는 및/또는 비-자연적으로 발생하는 (예를 들어, 변형된) 아미노산을 포함할 수 있고/거나 비-아미노산을 포함할 수 있음 (예를 들어, 중합체 전체에 산재됨)을 이해해야 한다. 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩티드는 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지화 성분과의 접합을 통해 변형 (예를 들어, 자연적으로 또는 비-자연적으로)될 수 있다. 폴리펩티드는 일부 경우에, 아미노산 (예를 들어, 비-자연 아미노산 포함)의 적어도 하나의 유사체 및/또는 다른 변형을 함유할 수 있다.
아미노산 (아미노산 잔기로서 지칭되기도 함)은 폴리펩티드의 펩티드 결합에 참여한다. 일반적으로, 아미노산을 지명하기 위해 본원에서 사용되는 약어는 생화학 명명법에 관한 IUPAC-IUB 위원회의 권고에 기초한다 (문헌 [Biochemistry (1972) 11:1726-1732] 참조). 예를 들어, Met, Ile, Leu, Ala 및 Gly는 각각 메티오닌, 이소류신, 류신, 알라닌 및 글리신의 "잔기"를 나타낸다. 잔기는 카르복실 기의 OH 부분과 α-아미노 기의 H 부분을 제거함으로써 상응하는 α-아미노산으로부터 유래된 라디칼이다. 아미노산 측쇄는 문헌 [K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, pages 2 and 33]에 정의된 바와 같이, --CH(NH2)COOH 부분을 제외한 아미노산 부분이다.
본원에 사용된 아미노산은, 일부 실시양태에서, 예를 들어 단백질에서 발견되는 자연적으로 발생하는 아미노산, 또는 아미노 및 카르복실 기를 함유하는 이러한 아미노산의 자연적으로 발생하는 단백 동화 또는 이화 산물이다. 아미노산 측쇄의 예는 하기 아미노산의 것으로부터 선택된 측쇄를 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, 및 펩티딜글리칸 박테리아 세포 벽의 구성 요소로서 확인된 아미노산 및 아미노산 유사체.
염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 Arg, Lys 및 His를 포함한다. 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 Glu 및 Asp를 포함한다. 중성 극성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ser, Thr, Asn, Gln, Cys 및 Tyr을 포함한다. 중성 비극성 측쇄를 갖는 아미노산은 Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro, Trp 및 Phe를 포함한다. 비극성 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 Gly, Ala, Val, Ile 및 Leu를 포함한다. 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp를 포함한다. 작은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ala 및 Val을 포함한다. 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 Tyr, Trp 및 Phe을 포함한다.
용어 아미노산은 본원에 언급된 임의의 특이적 아미노산의 유사체, 유도체 및 동질체를 포함하며; 예를 들어, 아피머® 폴리펩티드 (특히 화학적 합성에 의해 생성된 경우)는 아미노산 유사체, 예컨대 예를 들어, 시아노알라닌, 카나바닌, 젠콜산, 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 디히드록시-페닐알라닌, 5-히드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 디아미니오피멜산, 오르니틴 또는 디아미노부티르산을 포함할 수 있다. 본원에 적합한 측쇄를 갖는 다른 자연적으로 발생하는 아미노산 대사산물 또는 전구체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이며 본 개시내용의 범주에 포함된다.
아미노산의 구조가 입체이성질체 형태를 허용할 때 이러한 아미노산의 (D) 및 (L) 입체이성질체도 본원에 포함된다. 본원에서 아미노산 및 아미노산의 배열은 적절한 기호 (D), (L) 또는 (DL)로 지명되며; 더욱이, 그러한 배열이 지명되지 않은 경우, 아미노산 또는 잔기는 배열 (D), (L) 또는 (DL)을 가질 수 있다. 본 개시내용의 화합물 중 일부의 구조는 비대칭 탄소 원자를 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 이러한 비대칭성으로부터 발생하는 이성질체가 본 개시내용의 범주 내에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 이러한 이성질체는 고전적인 분리 기술 및 입체적으로 제어된 합성에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 달리 명확히 명시되지 않는 한, 명명된 아미노산은 (D) 또는 (L) 입체이성질체 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여, 동일성 퍼센트는, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고 최대 상응도를 위해 비교 및 정렬 (필요한 경우 갭 도입)될 때, 동일하거나 (동일/100% 동일성) 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율 (예를 들어, 적어도 70% 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들은 BLAST, ALIGN, 메갈라인(Megalign), 베스트피트(BestFit), GCG 위스콘신 패키지 및 그의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 2개의 핵산 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일하며, 이는 이들이 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 상응도를 위해 비교 및 정렬될 때, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 일부 실시양태에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가진다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개의 잔기, 적어도 약 20개의 잔기, 적어도 약 40-60개의 잔기, 적어도 약 60-80개의 잔기 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 아미노산 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개의 잔기보다 더 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-100개의 잔기에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서 서열은 비교되는 서열의 전체 길이, 예컨대 표적 단백질 또는 항체의 코딩 영역에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개의 염기, 적어도 약 20개의 염기, 적어도 약 40-60개의 염기, 적어도 약 60-80개의 염기 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 뉴클레오티드 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개의 염기보다 더 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-1000개 이상의 염기에 걸쳐 존재하며, 일부 실시양태에서 서열은 비교되는 서열의 전체 길이, 예컨대 관심 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에 일반적으로 정의되어 있다. 예를 들어, 티로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것은 보존적 치환이다. 일반적으로, 본 개시내용의 폴리펩티드, 가용성 단백질 및/또는 항체의 서열에서의 보존적 치환은 표적 결합 부위에 대한, 그러한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드, 가용성 단백질 또는 항체의 결합을 폐지하지 않는다. 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원에서, 단리된 분자 (예를 들어, 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 단백질, 항체 등), 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 벡터), 세포, 또는 다른 조성물)는 자연에서 발견되지 않는 형태임을 이해해야 한다. 단리된 분자는, 예를 들어 자연에서 불가능한 정도로 정제되었다.
일부 실시양태에서, 단리된 분자 (예를 들어, 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 단백질, 항체 등), 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 벡터), 세포 또는 다른 조성물)는 실질적으로 순수하며, 이는 적어도 50% 순수한 (예를 들어, 분자의 정제되지 않은 형태와 연관된 오염 물질이 50% 없음), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 단리된 분자를 지칭한다.
폴리펩티드 융합체를 포함한 접합체
동사 접합하다 (동사 연결하다와 상호교환가능하게 사용됨)는 본원에서 2개 이상의 분자 (예를 들어, 폴리펩티드 및/또는 화학적 모이어티)를 함께 연결하여 또 다른 분자를 형성하는 것을 지칭한다. 따라서, 또 다른 분자 (예를 들어, 또 다른 아피머® 폴리펩티드, 약물 분자, 또는 다른 치료용 단백질 또는 핵산)와 접합된 하나의 분자 (예를 들어, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드)는 접합체를 형성한다. 2개 이상의 분자의 연결은, 예를 들어 비-공유 결합 또는 공유 결합을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 화학적 모이어티 또는 또 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 이종 폴리펩티드)에 직접 또는 간접적으로 연결된 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 본원에 제공된 바와 같은 접합체를 형성한다. 접합체의 비-제한적 예는 화학적 접합체 (예를 들어, "클릭" 화학 또는 또 다른 화학 반응을 통해 연결됨) 및 융합체 (연속 펩티드 결합에 의해 연결된 2개의 분자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합체는 융합 폴리펩티드, 예를 들어 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 2개 이상의 다른 분자와 접합된다. 예를 들어, 이중 (또는 다중) 작용 방식의 약물 접합체가 본 개시내용의 항-HSA 아피머® 폴리펩티드와 접합될 수 있다. 이러한 이중 작용 방식의 약물 접합체는 TMAC (종양 미세환경-활성화 접합체) 플랫폼의 것을 포함한다 (예를 들어, avacta.com/therapeutics/tmac-affimer-drug-conjugates 참조).
융합 폴리펩티드 (예를 들어, 융합 단백질)는 적어도 2개의 별도의 분자 (예를 들어, 2개의 유전자)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 적어도 2개의 도메인 (예를 들어, 단백질 도메인)을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미드 결합을 통해 (폴리펩티드의 아미노산에) 공유 연결되어 연속 융합 폴리펩티드 (예를 들어, 융합 단백질)를 형성하는 이종 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 항-HSA 아피머® 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에서 연속적인 펩티드 결합을 통해 이종 폴리펩티드와 접합된다.
링커는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, 아피머® 폴리펩티드)와 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 또 다른 아피머® 폴리펩티드, Fc 도메인, 리간드 결합 도메인 등) 사이에 삽입된 분자이다. 링커는 임의의 분자, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드, 아미노산, 화학적 작용기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커 (예를 들어, 2개 이상의 아미노산)이다. 링커는 폴리펩티드의 발현, 분비 또는 생체 활성에 악영향을 미치지 않아야 한다. 일부 실시양태에서, 링커는 항원성이 아니며 면역 반응을 유발하지 않는다. 면역 반응은 선천 면역 체계 및/또는 적응 면역 체계로부터의 반응을 포함한다. 따라서, 면역 반응은 세포-매개 반응 및/또는 체액성 면역 반응일 수 있다. 면역 반응은 예를 들어, T 세포 반응, B 세포 반응, 자연 살해 (NK) 세포 반응, 단핵구 반응 및/또는 대식세포 반응일 수 있다. 다른 세포 반응이 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 링커는 비-단백질 코딩이다.
일부 실시양태에서, 접합체는 치료용 또는 진단용 분자에 연결된 아피머® 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합체는 또 다른 단백질, 핵산, 약물 또는 다른 소분자 또는 거대분자에 연결된 아피머® 폴리펩티드를 포함한다.
예를 들어, 문헌 [Hunter, et al., (1962) Nature 144:945]; [David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219]; 및 [Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407]에 의해 기재된 방법을 포함하여, 분자를 본 개시내용의 아피머® 폴리펩티드에 연결시키기 위해 임의의 접합 방법이 사용될 수 있거나 용이하게 적응될 수 있다.
치료제
일부 실시양태에서, 치료용 분자는 자가면역 질환 (대상체의 면역 체계가 착오로 자신의 신체를 공격하는 병태)의 치료를 위한 것이다. 자가면역 질환의 비-제한적 예는 중증 근무력증, 심상성 천포창, 시신경 척수염, 길랭-바레 증후군, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (루푸스), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 항인지질 증후군 (APS), 자가면역 두드러기, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 건선, 굿파스쳐 증후군, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 크론병, 쇼그렌 증후군, 용혈성 빈혈, 호중구 감소증, 부신생물성 소뇌 변성, 파라단백질혈증성 다발신경병증, 원발성 담즙성 간경변, 경직 인간 증후군, 백반증, 온난 특발성 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 유형 1 진성 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 자가면역성 혈관염, 악성 빈혈, 및 복강 질환을 포함한다. 다른 자가면역 질환이 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 치료용 분자는 암 치료를 위한 것이다. 암의 비-제한적 예는 피부암 (예를 들어, 흑색종 또는 비-흑색종, 예컨대 기저 세포 또는 편평 세포), 폐암, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 신장 (신)암, 방광암, 비-호지킨 림프종, 갑상선암, 자궁내막암, 외분비암, 및 췌장암을 포함한다. 다른 암이 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 아피머® 폴리펩티드는 치료용 분자에 연결된다. 본원에서, 치료용 분자는 예를 들어, 대상체, 예컨대 인간 대상체 또는 다른 동물 대상체에서 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 용어 치료하다는 질환과 연관된 적어도 하나의 증상을 완화시키는 프로세스를 지칭한다. 증상은 질환의 신체적, 정신적 또는 병리학적 징후일 수 있다. 다양한 질환과 연관된 증상은 공지되어 있다. 특정한 병태를 치료하거나 예방하기 위해, 본원에 제공된 바와 같은 접합체 (예를 들어, 치료용 분자에 연결된 항-HSA 아피머® 폴리펩티드)는 유효량으로 투여되어야 하며, 이는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 임의의 양일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 유효량은 치료 중인 특정한 질환과 연관된 증상을 완화시키기 위해 사용되는 양이다. 예를 들어, 다양한 치료용 분자의 유효량을 결정하는 방법이 공지되어 있다.
대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이 및 설치류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유류)일 수 있다. "환자"는 인간 대상체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 특정한 관심 분자 (예를 들어, 수용체)의 효능제에 연결된다. 다른 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드는 특정한 관심 분자의 길항제에 연결된다. 본원에서 효능제는 생물학적 반응을 초래하기 위해 또 다른 분자와 결합하고 이를 활성화시키는 분자를 지칭한다. 대조적으로, 길항제는 효능제의 작용을 차단하고, 역 효능제는 효능제의 작용과 반대의 작용을 유발한다. 따라서, 본원에서 길항제는 또 다른 분자와 결합하고 또 다른 분자의 활성화를 불활성화시키거나 방지하는 분자를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 아피머® 폴리펩티드는 "제약상 허용되는" 것으로 간주되며, 일부 실시양태에서는 제약상 허용되는 부형제와 함께 제형화된다. 특정 분자 또는 다른 물질/작용제가 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인될 수 있거나, 또는 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재된 경우, 그러한 분자 또는 다른 물질/작용제는 "제약상 허용되는" 것으로 간주된다. 부형제는 아피머® 폴리펩티드와 조합하여 투여되는 임의의 비활성 (불활성) 무독성 작용제일 수 있다. 부형제의 비-제한적 예는 완충제 (예를 들어, 멸균 식염수), 염, 담체, 보존제, 충전제 및 착색제를 포함한다.
본원에서 사용하기 위한 치료용 분자는 예를 들어, 공식 미국 약전, 공식 미국 동종요법 약전, 공식 국가 처방집 또는 그의 임의의 증보판에서 인정되는 것을 포함하고, 소분자 화학물질/약물, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, RNA 간섭 분자, 예컨대 miRNA, siRNA, shRNA 및 안티센스 RNA), 및 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 치료용 분자의 클래스는 재조합 단백질, 항체, 세포독성제, 항대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자 (예를 들어, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 각질세포 성장 인자), 시토카인, 케모카인, 인터페론 (예를 들어, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마), 혈액 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 VIIa, 인자 IX, 트롬빈, 항트롬빈), 항유사분열제, 독소, 아폽토시스 작용제 (예를 들어, DNA 알킬화제), 토포이소머라제 억제제, 소포체 스트레스 유도제, 백금 화합물, 항대사물질, 빈카알카로이드, 탁산, 에포틸론, 효소 억제제, 수용체 길항제, 티로신 키나제 억제제, 방사선감작제, 화학요법 조합 요법, 수용체 트랩, 수용체 리간드, 혈관형성제, 항혈관형성제, 항응고제 및 혈전용해제 (예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성화제, 히루딘, 단백질 C), 신경전달물질, 적혈구생성-자극제, 인슐린, 성장 호르몬 (예를 들어, 인간 성장 호르몬 (hGH), 난포-자극 호르몬), 대사 호르몬 (예를 들어, 인크레틴), 재조합 IL-1 수용체 길항제 및 이중특이적 T-세포 결속 분자 (BITEs®)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항-인간 FcRn 아피머® 폴리펩티드에 연결될 수 있는 (예를 들어, 분자의 반감기를 연장하기 위함) 치료용 분자의 구체적 예는 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21), 인슐린, 인슐린 수용체 펩티드, GIP (글루코스 의존성 인슐린 분비 촉진 폴리펩티드), 뼈 형태형성 단백질 9 (BMP-9), 아밀린, 펩티드 YY (PYY3-36), 췌장 폴리펩티드 (PP), 인터루킨 21 (IL-21), 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 플렉타신, 프로그래눌린, 오스테오칼신 (OCN), 아펠린, GLP-1, 엑센딘 4, 아디포넥틴, IL-1Ra (인터루킨 1 수용체 길항제), VIP (혈관활성 장 펩티드), PACAP (뇌하수체 아데닐레이트 시클라제-활성화 폴리펩티드), 렙틴, INGAP (섬 신생 연관 단백질), BMP (뼈 형태형성 단백질) 및 오스테오칼신 (OCN)을 포함한다.
항체
일부 실시양태에서, 항-HSA 아피머® 폴리펩티드에 연결된 이종 폴리펩티드는 항체 (예를 들어, 항체의 가변 영역)이다. 따라서, 본 개시내용은 일부 실시양태에서, 아피머® 폴리펩티드-항체 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아피머® 폴리펩티드-항체 융합 단백질은 예를 들어, VH 및/또는 VL 쇄 중 적어도 하나의 C-말단 또는 N-말단에 부착된 적어도 하나의 아피머® 폴리펩티드 서열을 포함하는 완전한 길이의 항체를 포함한다 (어셈블리된 항체의 적어도 하나의 쇄는 아피머® 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성한다). 아피머® 폴리펩티드-항체 융합 단백질은 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 아피머® 폴리펩티드 및 항체 단편의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함한다.
항체는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 통해 표적, 예컨대 폴리펩티드 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질), 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 지질 또는 전술한 것 중 임의의 것의 조합을 인식하고 그와 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자이다. 항원-결합 부위는 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 있다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 그의 단편이 Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 포맷화된 단일 쇄 Fv (scFv) 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 (Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 포맷화됨)의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다.
항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 정체에 기초하여, 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 그의 서브클래스 (이소타입) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다.
항체의 가변 영역은 단독으로 또는 조합하여, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역일 수 있다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어지되며, 이는 초가변 영역으로서 공지되기도 한다. 각각의 쇄 내의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하는데 적어도 2가지 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기초한 접근 방식 (문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.]), 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근 방식 (문헌 [Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948]). 또한, 이러한 2가지 접근 방식의 조합이 때때로 관련 기술분야에서 CDR을 결정하기 위해 사용된다.
인간화 항체는 최소한의 비-인간 서열을 함유하는 특이적 이뮤노글로불린 쇄, 키메라 이뮤노글로불린, 또는 그의 단편인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태이다. 전형적으로, 인간화 항체는 CDR의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기가 비-인간 종으로부터의 항체 내의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화성 및/또는 결합 능력을 개선하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 및/또는 교체된 비-인간 잔기 내의 부가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 인간화 항체는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하는 CDR의 전부 또는 실질적으로 전부를 함유하는 가변 도메인을 포함할 수 있는 반면, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 영역이다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 이뮤노글로불린 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 통상적으로 키메라 항체와 뚜렷이 구별되는 것으로 간주된다.
에피토프 (항원 결정인자로서 지칭되기도 함)는 특정한 항체, 특정한 아피머® 폴리펩티드 또는 기타 특정한 결합 도메인에 의해 인식되고 그와 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 일부분이다. 항원이 폴리펩티드일 때, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 연속 아미노산 및 비-연속 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로서 지칭되기도 함)는 전형적으로 단백질 변성 시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체 형태적 에피토프로서 지칭되기도 함)는 전형적으로 단백질 변성 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 입체 형태로 적어도 3개, 보다 통상적으로, 적어도 5, 6, 7 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
용어 "와 특이적으로 결합하는" 또는 "에 대해 특이적"은 측정가능하고 재현 가능한 상호작용, 예컨대 표적과 아피머® 폴리펩티드, 항체 또는 다른 결합 파트너 간의 결합을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함한 분자의 이종 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정한다. 예를 들어, 표적과 특이적으로 결합하는 아피머® 폴리펩티드는 다른 표적과 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력 (다량체 포맷화된 경우), 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속기간으로 상기 표적과 결합하는 아피머® 폴리펩티드이다.
본 개시내용의 항-HSA 아피머® 폴리펩티드와 접합될 수 있는 항체의 비-제한적 예는 3F8, 8H9, 아바고보맙, 압식시맙, 아비투주맙, 아브레제키맙, 아브릴루맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아파세비쿠맙, 아펠리모맙, 알라시주맙 페골, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 안데칼릭시맙, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 안루킨주맙 (IMA-638), 아폴리주맙, 아프루투맙 익사도틴, 아르시투모맙, 아스크린바쿠맙, 아셀리주맙, 아테졸리주맙, 아티도르톡수맙, 아티누맙, 아토롤리무맙, 아벨루맙, 아진툭시주맙 베도틴, 바피네우주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, BCD-100, 벡투모맙, 베겔로맙, 벨란타맙 마포도틴, 벨리무맙, 베마리투주맙, 벤랄리주맙, 베를리마톡수맙, 베르메키맙, 베르산리맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비르타미맙, 비바투주맙 메르탄신, 블레셀루맙, 블리나투모맙, 블론투베트맙, 블로소주맙, 보코시주맙, 브라지쿠맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론틱투주맙, 부로수맙, 카비랄리주맙, 카미단루맙 테시린, 캄렐리주맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데티드, 칼루맙, 카로툭시맙, 카투막소맙, cBR96-독소루비신 면역접합체, 세델리주맙, 세미플리맙, 세르구투주맙 아무날루킨, 세르톨리주맙 페골, 세트렐리맙, 세툭시맙, 시비사타맙, 심투주맙, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레노릭시맙, 클리바투주맙 테트라세탄, 코드리투주맙, 코페투주맙 펠리도틴, 콜툭시맙 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, 코스프로빅시맙, CR6261, 크레네주맙, 크리잔리주맙, 크로테두맙, 쿠사투주맙, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피롤리주맙 페골, 다라투무맙, 덱트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데노수맙, 데파툭시주맙 마포도틴, 데를로툭시맙 비오틴, 데투모맙, 데자미주맙, 디누툭시맙, 디리다부맙, 도마그로주맙, 도를리모맙 아리톡스, 도스타리맙, 드로지투맙, DS-8201, 둘리고투주맙, 두필루맙, 더발루맙, 두시기투맙, 두보툭시주맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펀구맙, 엘델루맙, 엘레자누맙, 엘젬투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에마팔루맙, 에미베투주맙, 에미시주맙, 에나포타맙 베도틴, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 엡티네주맙, 에레누맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에티길리맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파리시맙, 파레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피바투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리부맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 플로테투주맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레마네주맙, 프레솔리무맙, 프로보시맙, 프루네베트맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈카네주맙, 갈릭시맙, 간코타맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가티포투주맙, 가빌리모맙, 게디부맙, 겜투주맙 오조가미신, 게보키주맙, 길베트맙, 김실루맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고미릭시맙, 고수라네맙, 구셀쿠맙, 이아나루맙, 이발리주맙, IBI308, 이브리투모맙 티욱세탄, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, 이파보투주맙, 이고보맙, 일라다투주맙 베도틴, IMAB362, 이말루맙, 이마프렐리맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 이네빌리주맙, 인플릭시맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 인테투무맙, 이오맙-b, 이필리무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이스칼리맙, 이스티라투맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 락노투주맙, 라디라투주맙 베도틴, 람팔리주맙, 라나델루맙, 란도그로주맙, 라프리툭시맙 엠탄신, 라르카빅시맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌달리주맙, 렌버비맙, 렌질루맙, 레르델리무맙, 레론리맙, 레소파부맙, 레톨리주맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파스투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트라세탄, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키베트맙, 론카스툭시맙 테시린, 로보투주맙 메르탄신, 로사툭시주맙 베도틴, 루카투무맙, 루리주맙 페골, 루미릭시맙, 룸레투주맙, 루파르투맙 아마도틴, 루티키주맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마르스타시맙, 마스리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미리키주맙, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미투모맙, 모도툭시맙, 모가물리주맙, 모날리주맙, 모롤리무맙, 모수네투주맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나라툭시맙 엠탄신, 나르나투맙, 나탈리주맙, 나비치식주맙, 나비부맙, 낙시타맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, NEOD001, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 네타키맙, 니모투주맙, 니르세비맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올레클루맙, 올렌달리주맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 옴부르타맙, OMS721, 오나투주맙, 온툭시주맙, 온바틸리맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틸리맙, 오틀러투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파지박시맙, 팔리비주맙, 팜레블루맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, pdr001, 펨브롤리주맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 플로잘리주맙, 포갈리주맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 포르가빅시맙, 프라시네주맙, 프레잘리주맙, 프릴릭시맙, 프리톡사시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라네베트맙, 라니비주맙, 라바갈리맙, 라불리주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, 렐라틀리맙, 렘톨루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리누쿠맙, 리산키주맙, 리툭시맙, 리바바주맙 페골, rmab, 로바투무맙, 롤레두맙, 로밀키맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로스만투주맙, 로발피투주맙 테시린, 로벨리주맙, 로자놀릭시주맙, 루플리주맙, SA237, 사시투주맙 고비테칸, 사말리주맙, 삼로타맙 베도틴, 사릴루맙, 사트랄리주맙, 사투모맙 펜데티드, 세쿠키누맙, 셀리크레루맙, 세리반투맙, 세톡삭시맙, 세트루수맙, 세비루맙, SGN-CD19A, SHP647, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시르트라투맙 베도틴, 시루쿠맙, 소피투주맙 베도틴, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소네프시주맙, 손투주맙, 스파르탈리주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수프타부맙, 수팀리맙, 수비주맙, 수브라톡수맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트라세탄, 타도시주맙, 탈라코투주맙, 탈리주맙, 탐투베트맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스투맙, 타볼리맙, 테피바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 텔리소투주맙 베도틴, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테포디타맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, 테툴로맙, 테제펠루맙, TGN1412, 티불리주맙, 티가투주맙, 틸드라키주맙, 티미구투주맙, 티몰루맙, 티라고투맙, 티스렐리주맙, 티소투맙 베도틴, TNX-650, 토실리주맙, 토무조툭시맙, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토시투모맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 트레보그루맙, 투코투주맙 셀몰루킨, 투비루맙, 유블리툭시맙, 울로큐플루맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 우토밀루맙, 바다스툭시맙 탈리린, 바날리맙, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바리사쿠맙, 바릴루맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 보바릴리주맙, 볼로식시맙, 본레롤리주맙, 보프라텔리맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 부나키주맙, 젠투주맙, XMAB-5574, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 제노쿠투주맙, 지랄리무맙, 졸베툭시맙 (IMAB362, 클라우딕시맙) 및 졸리모맙 아리톡스를 포함한다.
기타 치료용 분자
시토카인의 비-제한적 예는 IL-2, IL-12, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF 베타, LT-베타, CD-40 리간드, Fas-리간드, TGF-베타, IL-1알파 및 IL-1 베타를 포함한다.
케모카인의 비-제한적 예는 IL-8, GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1알파, MIP-1 베타, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MCP-1-5, 에오탁신, 에오탁신-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포탁틴 및 프랙탈킨을 포함한다.
DNA 알킬화제의 비-제한적 예는 질소 머스타드, 예컨대 메클로레타민, 시클로포스파미드 (이포스파미드, 트로포스파미드), 클로람부실 (멜팔란, 프레드니무스틴), 벤다무스틴, 우라무스틴 및 에스트라무스틴; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴 (bcnu), 로무스틴 (세무스틴), 포테무스틴, 니무스틴, 라니무스틴 및 스트렙토조신; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판 (만노술판, 트레오술판); 아지리딘, 예컨대 카르보쿠온, 티오테파, 트리아지쿠온, 트리에틸렌멜라민; 히드라진 (프로카르바진); 트리아젠, 예컨대 다카르바진 및 테모졸로미드; 알트레타민 및 미토브로니톨을 포함한다.
토포이소머라제 I 억제제의 비-제한적 예는 문헌 [Pommier Y. (2006) Nat. Rev. Cancer 6(10):789-802] 및 미국 특허 공개 번호 200510250854에 기재된 바와 같은 CPT-11 (이리노테칸), SN-38, APC, NPC, 캄포테신, 토포테칸, 엑사테칸 메실레이트, 9-니트로캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 루르토테칸, 루비테칸, 실라테칸, 기마테칸, 디플로모테칸, 엑스타테칸, BN-80927, DX-8951f 및 MAG-CPT를 포함한 캄포테신 유도체; 문헌 [Li et al. (2000) Biochemistry 39(24):7107-7116] 및 [Gatto et al. (1996) Cancer Res. 15(12):2795-2800]에 기재된 바와 같은 베르베르루빈 및 코랄린을 포함한 프로토베르베린 알칼로이드 및 그의 유도체; 문헌 [Makhey et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11 (8): 1809-1820]에 기재된 바와 같은 벤조[i]페난트리딘, 니티딘 및 파가로닌을 포함한 페난트롤린 유도체; 문헌 [Xu (1998) Biochemistry 37(10):3558-3566]에 기재된 바와 같은 테르벤즈이미다졸 및 그의 유도체; 및 문헌 [Foglesong et al. (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 30(2):123-125, Crow et al. (1994) J. Med. Chem. 37(19):31913194], 및 [Crespi et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 136(2):521-8]에 기재된 바와 같은 독소루비신, 다우노루비신 및 미톡산트론을 포함한 안트라사이클린 유도체를 포함한다. 토포이소머라제 II 억제제는 에토포시드 및 테니포시드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이중 토포이소머라제 I 및 II 억제제는 문헌 [Denny and Baguley (2003) Curr. Top. Med. Chem. 3(3):339-353]에 기재된 바와 같은 사인토핀 및 기타 나프테세네디온, DACA 및 기타 아크리딘-4-카르복사미드, 인토플리신 및 기타 벤조피리도인돌, tas-103 및 기타 7h-인데노[2,1-c]퀴놀린-7-온, 피라졸로아크리딘, XR 11576 및 기타 벤조페나진, XR 5944 및 기타 이량체 화합물, 7-옥소-7H-디벤즈[f,ij]이소퀴놀린 및 7-옥소-7H-벤조[e]페리미딘, 및 안트라세닐-아미노산 접합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 작용제는 토포이소머라제 II를 억제하고 DNA 삽입 활성을 가지며, 이는 예컨대 안트라사이클린 (아클라루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 암루비신, 피라루비신, 발루비신, 조루비신) 및 안트라세네디온 (미톡산트론 및 픽산트론)이나 이에 제한되지는 않는다.
소포체 스트레스 유도제의 비-제한적 예는 디메틸-셀레콕시브 (DMC), 넬피나비르, 셀레콕시브 및 붕소 방사선감작제 (즉, 벨케이드 (보르테조밉))를 포함한다.
백금-기반 화합물의 비-제한적 예는 카르보플라틴, 시스플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 사트라플라틴, 아로플라틴, 로바플라틴 및 JM-216을 포함한다 (문헌 [McKeage et al. (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237] 및 일반적으로, 문헌 [CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, in the Series Basic and Clinical Oncology, Angioli et al. Eds., 2004] 참조).
항대사물질 작용제의 비-제한적 예는 엽산-기반, 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 페메트렉세드; 티미딜레이트 신타제 억제제, 예컨대 랄티트렉세드, 페메트렉세드; 퓨린 기반, 예를 들어 아데노신 데아미나제 억제제, 예컨대 펜토스타틴, 티오퓨린, 예컨대 티오구아닌 및 메르캅토퓨린, 할로겐화/리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 클라드리빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 또는 구아닌/구아노신; 티오퓨린, 예컨대 티오구아닌; 또는 피리미딘 기반, 예를 들어 시토신/시티딘; 저메틸화제, 예컨대 아자시티딘 및 데시타빈, DNA 폴리머라제 억제제, 예컨대 시타라빈, 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 젬시타빈, 또는 티민/티미딘; 티미딜레이트 신타제 억제제, 예컨대 플루오로우라실 (5-FU)을 포함한다. 5-FU에 대한 등가물은, 예를 들어 문헌 [Papamicheal (1999) The Oncologist 4:478-487]에 기재된 바와 같이, 그의 전구약물, 유사체 및 유도체, 예컨대 5'-데옥시-5-플루오로우리딘 (독시플루오로이딘), 1-테트라히드로푸라닐-5-플루오로우라실 (에프토라푸르(FTORAFUR)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), S-I (테가푸르 및 2개의 조정제, 5-클로로-2,4-디히드록시피리딘 및 옥소산칼륨으로 이루어진 MBMS-247616), 랄티트렉세드 (토무덱스(TOMUDEX)®), 놀라트렉세드 (티미타크, AG337), LY231514 및 ZD9331을 포함한다.
빈카알칼로이드의 비-제한적 예는 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈플루닌, 빈데신 및 비노렐빈을 포함한다.
탁산의 비-제한적 예는 도세탁셀, 라로탁셀, 오르타탁셀, 파클리탁셀 및 테세탁셀을 포함한다. 에포틸론의 예는 익사베필론이다.
효소 억제제의 비-제한적 예는 파르네실트랜스퍼라제 억제제 (티피파밉); CDK 억제제 (알보시딥, 셀리시클립); 프로테아솜 억제제 (보르테조밉); 포스포디에스테라제 억제제 (아나그렐리드; 롤리프람); IMP 데히드로게나제 억제제 (티아조푸린); 및 리폭시게나제 억제제 (마소프로콜)를 포함한다. 수용체 길항제의 예는 ERA (아트라센탄); 레티노이드 X 수용체 (벡사로텐); 및 성 스테로이드 (테스토락톤)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
티로신 키나제 억제제의 비-제한적 예는 ErbB에 대한 억제제: HER1/EGFR (에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 반데타닙, 수니티닙, 네라티닙); HER2/neu (라파티닙, 네라티닙); RTK 클래스 III: C-kit (악시티닙, 수니티닙, 소라페닙), FLT3 (레스타우르티닙), PDGFR (악시티닙, 수니티닙, 소라페닙); 및 VEGFR (반데타닙, 세막사닙, 세디라닙, 악시티닙, 소라페닙); bcr-abl (이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙); Src (보수티닙) 및 야누스 키나제 2 (레스타우르티닙)를 포함한다.
화학요법제의 비-제한적 예는 암사크린, 트라벡테딘, 레티노이드 (알리트레티노인, 트레티노인), 삼산화비소, 아스파라긴 고갈제 (아스파라기나제/페가스파르가제), 셀레콕시브, 데메콜신, 엘레스클로몰, 엘사미트루신, 에토글루시드, 로니다민, 루칸톤, 미토구아존, 미토탄, 오블리메르센, 템시롤리무스 및 보리노스타트를 포함한다.
본 개시내용의 아피머® 폴리펩티드에 연결될 수 있는 부가의 치료용 분자의 비-제한적 예는 플로목세프; 포티마이신(들); 겐타마이신(들); 글루코술폰 솔라술폰; 그라미시딘 S; 그라미시딘(들); 그레파플록사신; 구아메사이클린; 헤타실린; 이세파마이신; 조사마이신; 카나마이신(들); 플로목세프; 포티마이신(들); 겐타마이신(들); 글루코술폰 솔라술폰; 그라미시딘 S; 그라미시딘(들); 그레파플록사신; 구아메사이클린; 헤타실린; 이세파마이신; 조사마이신; 카나마이신(들); 바시트라신; 밤버마이신(들); 비아페넴; 브로디모프림; 부티로신; 카프레오마이신; 카르베니실린; 카르보마이신; 카루모남; 세파드록실; 세파만돌; 세파트리진; 세프부페라존; 세프클리딘; 세프디니르; 세프디토렌; 세페핌; 세페타메트; 세픽심; 세피네녹심; 세피니녹스; 클라드리빈; 아팔실린; 아피사이클린; 아프라마이신; 아르베카신; 아스폭시실린; 아지담페니콜; 아즈트레오남; 세포디짐; 세포니시드; 세포페라존; 세포르아미드; 세포탁심; 세포테탄; 세포티암; 세포조프란; 세프피미졸; 세프피라미드; 세프피롬; 세프프로질; 세프록사딘; 세프테람; 세프티부텐; 세푸조남; 세팔렉신; 세팔로글리신; 세팔로스포린 C; 세프라딘; 클로람페니콜; 클로르테트라사이클린; 클리나플록사신; 클린다마이신; 클로모사이클린; 콜리스틴; 시클라실린; 답손; 데메클로사이클린; 디아티모술폰; 디베카신; 디히드로스트렙토마이신; 6-메르캅토퓨린; 티오구아닌; 카페시타빈; 도세탁셀; 에토포시드; 젬시타빈; 토포테칸; 비노렐빈; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 테니포시드; 멜팔란; 메토트렉세이트; 2-p-술파닐아닐리노에탄올; 4,4'-술피닐디아닐린; 4-술파닐아미도살리실산; 부토르판올; 날부핀; 스트렙토조신; 독소루비신; 다우노루비신; 플리카마이신; 이다루비신; 미토마이신 C; 펜토스타틴; 미톡산트론; 시타라빈; 플루다라빈 포스페이트; 부토르판올; 날부핀; 스트렙토조신; 독소루비신; 다우노루비신; 플리카마이신; 이다루비신; 미토마이신 C; 펜토스타틴; 미톡산트론; 시타라빈; 플루다라빈 포스페이트; 아세디아술폰; 아세토술폰; 아미카신; 암포테리신 B; 암피실린; 아토르바스타틴; 에날라프릴; 라니티딘; 시프로플록사신; 프라바스타틴; 클라리트로마이신; 시클로스포린; 파모티딘; 류프롤리드; 아시클로버; 파클리탁셀; 아지트로마이신; 라미부딘; 부데소니드; 알부테롤; 인디나비르; 메트포르민; 알렌드로네이트; 니자티딘; 지도부딘; 카르보플라틴; 메토프롤롤; 아목시실린; 디클로페낙; 리시노프릴; 세프트리악손; 캅토프릴; 살메테롤; 지나포에이트; 이미페넴; 실라스타틴; 베나제프릴; 세파클로르; 세프타지딤; 모르핀; 도파민; 비알라미콜; 플루바스타틴; 페나미딘; 포도필린산 2-에틸히드라진; 아크리플라빈; 클로로아조딘; 아르스페나민; 아미카르빌리드; 아미노퀴누리드; 퀴나프릴; 옥시모르폰; 부프레노르핀; 플록수리딘; 디리트로마이신; 독시사이클린; 에녹사신; 엔비오마이신; 에피실린; 에리트로마이신; 류코마이신(들); 린코마이신; 로메플록사신; 루센소마이신; 라임사이클린; 메클로사이클린; 메로페넴; 메타사이클린; 마이크로노마이신; 미데카마이신(들); 미노사이클린; 목살락탐; 무피로신; 나디플록사신; 나타마이신; 네오마이신; 네틸마이신; 노르플록사신; 올레안도마이신; 옥시테트라사이클린; p-술파닐릴벤질아민; 파니페넴; 파로모마이신; 파주플록사신; 페니실린 N; 피파사이클린; 피페미드산; 폴리믹신; 프리마이신; 퀴나실린; 리보스타마이신; 리파미드; 리팜핀; 리파마이신 SV; 리파펜틴; 리팍시민; 리스토세틴; 리티페넴; 로키타마이신; 로리테트라사이클린; 로사라마이신; 록시트로마이신; 살라조술파디미딘; 산사이클린; 시소마이신; 스파르플록사신; 스펙티노마이신; 스피라마이신; 스트렙토마이신; 숙시술폰; 술파크리소이딘; 술파록산; 술파미도크리소이딘; 술파닐산; 술폭손; 테이코플라닌; 테마플록사신; 테모실린; 테트록소프림; 티암페니콜; 티아졸술폰; 티오스트렙톤; 티카르실린; 티게모남; 토브라마이신; 토수플록사신; 트리메토프림; 트로스펙토마이신; 트로바플록사신; 투베락티노마이신; 반코마이신; 아자세린; 칸디시딘(들); 클로르페네신; 더모스타틴(들); 필리핀; 풍기크로민; 메파르트리신; 니스타틴; 올리고마이신(들); 페리마이신 A; 투베르시딘; 6-아자우리딘; 6-디아조-5-옥소-L-노르류신; 아클라시노마이신(들); 안시타빈; 안트라마이신; 아자시타딘; 아자세린; 블레오마이신(들); 에틸 비스쿠마아세테이트; 에틸리덴 디쿠마롤; 일로프로스트; 라미피반; 타프로스텐; 티오클로마롤; 티로피반; 아미프릴로스; 부실라민; 구스페리무스; 젠티스산; 글루카메타신; 글리콜 살리실레이트; 메클로페남산; 메페남산; 메살라민; 니플룸산; 올살라진; 옥사세프롤; S-에노실메티오닌; 살리실산; 살살레이트; 술파살라진; 톨페남산; 카루비신; 카르지노필린 A; 클로로조토신; 크로모마이신(들); 데놉테린; 독시플루리딘; 에다트렉세이트; 에플로르니틴; 엘립티늄; 에노시타빈; 에피루비신; 만노무스틴; 메노가릴; 미토브로니톨; 미토락톨; 모피다몰; 미코페놀산; 노갈라마이신; 올리보마이신(들); 페플로마이신; 피라루비신; 피리트렉심; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프테로프테린; 퓨로마이신; 라니무스틴; 스트렙토니그린; 티아미프린; 미코페놀산; 프로코다졸; 로무르티드; 시롤리무스 (라파마이신); 타크롤리무스; 부테타민; 페날코민; 히드록시테트라카인; 나에파인; 오르토카인; 피리도카인; 살리실 알콜; 3-아미노-4-히드록시부티르산; 아세클로페낙; 알미노프로펜; 암페낙; 브롬페낙; 브로모살리제닌; 부마디존; 카르프로펜; 디클로페낙; 디플루니살; 디타졸; 엔페남산; 에토돌락; 에토페나메이트; 펜도살; 페프라디놀; 플루페남산; 토무덱스 (N-[[5-[[(1,4-디히드로-2-메틸-4-옥소-6-퀴나졸리닐)메틸]메틸아미노]-2-티에닐]카르보닐]-L-글루탐산), 트리메트렉세이트, 투베르시딘, 유베니멕스, 빈데신, 조루비신; 아르가트로반; 쿠메타롤 및 디쿠마롤을 포함한다.
세포독성 인자의 비-제한적 예는 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질 및 화합물 (예를 들어, 지방산), 디안틴 단백질, 피토이아카 아메리카나(Phytoiacca americana) 단백질 PAPI, PAPII 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신을 포함한다.
신경전달물질의 비-제한적 예는 아르기닌, 아스파르테이트, 글루타메이트, 감마-아미노부티르산, 글리신, D-세린, 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린 (노르아드레날린), 에피네프린 (아드레날린), 세로토닌 (5-히드록시트립타민), 히스타민, 페네틸아민, N-메틸페네틸아민, 티라민, 옥토파민, 시네프린, 트립타민, N-메틸트립타민, 아난다미드, 2-아라키도노일글리세롤, 2-아라키도닐 글리세릴 에테르, N-아라키도노일 도파민, 비로다민, 아데노신, 아데노신 트리포스페이트, 브래디키닌, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 유로코르틴, 갈라닌, 갈라닌-유사 펩티드, 가스트린, 콜레시스토키닌, 부신피질자극 호르몬, 프로오피오멜라노코르틴, 멜라닌세포-자극 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 뉴로피신 I, 뉴로피신 II, 뉴로메딘 U, 뉴로펩티드 B, 뉴로펩티드 S, 뉴로펩티드 Y, 췌장 폴리펩티드, 펩티드 YY, 엔케팔린, 디노르핀, 엔도르핀, 엔도모르핀, 노시셉틴/오르파닌 FQ, 오렉신 A, 오렉신 B, 키스펩틴, 뉴로펩티드 FF, 프로락틴 방출 펩티드, 피로글루타밀화 파미드 펩티드, 세크레틴, 모틸린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드-1, 글루카곤-유사 펩티드-2, 혈관활성 장 펩티드, 성장 호르몬 방출 호르몬, 뇌하수체 아데닐레이트 시클라제-활성화 펩티드, 소마토스타틴, 뉴로키닌 A, 뉴로키닌 B, 물질 P, 뉴로펩티드 K, 아구티 관련 펩티드, N-아세틸아스파르틸글루타메이트, 코카인- 및 암페타민-조절된 전사체, 봄베신, 가스트린 방출 펩티드, 성선자극호르몬 방출 호르몬, 멜라닌-농축 호르몬, 산화질소, 일산화탄소 및 황화수소를 포함한다.
대사 호르몬, 예컨대 인크레틴 (혈당 수준의 감소를 자극함)의 비-제한적 예는 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 위 억제성 펩티드 (GIP) 및 그의 유사체, 예컨대 둘라글루티드 (트루리시티(TRULICITY)®), 엑세나티드 (바이에타(BYETTA)®), 리라글루티드 (빅토자(VICTOZA)®) 및 엑세나티드 연장 방출 (바이두레온(BYDUREON)®)을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드 (핵산으로서 지칭되기도 함)는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체이며, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드, 예컨대 항-HSA 아피머® 폴리펩티드를 코딩한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 내의 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 코딩된 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질)를 따라 아미노산의 순서를 결정한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드의 임의의 서열일 수 있고, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 길이는 다양할 수 있으며 제한되지 않는다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 2 내지 1,000,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 100 내지 100,000개의 길이, 100 내지 10,000개의 길이, 100 내지 1,000개의 길이, 100 내지 500개의 길이, 200 내지 100,000개의 길이, 200 내지 10,000개의 길이, 200 내지 1,000개의 길이, 또는 200 내지 500개의 길이의 뉴클레오티드를 갖는다.
본원에서의 벡터는 분자를 세포로 전달하기 위한 비히클을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 (예를 들어, 유도성 또는 구성적)를 포함하는 발현 벡터이다. 벡터의 비-제한적 예는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터), 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터, 양이온 축합제와 연합된 DNA 및/또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜에 캡슐화된 DNA 및/또는 RNA 발현 벡터를 포함한다. 벡터는 예를 들어, 인산칼슘-DNA 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공법, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 또는 바이오리스틱 기술 (바이오리스틱)을 포함한 임의의 형질감염 방법을 사용하여 세포 내로 형질감염될 수 있다.
실시예
실시예 1. 인간 혈청 알부민 ( HSA ) 및 마우스 혈청 알부민 ( MSA ) 아피머® 결합제 선택
아피머® 라이브러리로부터 HSA 또는 MSA 결합 파지의 선택은 대략 6 x 1010 다양성 크기의 라이브러리로부터 부가된 대략 1 x 1012개의 파지를 사용하여 수행되었다.
본 개시내용의 HSA 결합 펩티드는 SQT에 대한 서열에 기초하여 불변 아피머® 프레임워크 백본에 표시된 9개 아미노산 길이의 무작위 루프 서열을 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 선택에 의해 확인되었다. 파지의 현탁액을 표적 항원 (스트렙타비딘 비드 상에 포획된 비오티닐화 항원 또는 플레이트 상에 포획된 비오티닐화되지 않은 항원)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음, 결합되지 않은 파지를 세척하고, 이어서 결합된 파지를 낮은 pH에 이어 높은 pH로 항원을 인큐베이션함으로써 용출시켰다. 그런 다음, 방출된 pH 중화 파지로 이. 콜라이를 감염시키고 제1 라운드 파지의 제제를 수득하였다. 사이클을 2회 또는 3회 반복하였다. 파지 표적화를 강화하기 위해, 선택의 나중 라운드에서 엄격성 조건을 증가시켰다. 증가된 엄격성 조건은 세척 단계 수 증가, 항원 농도 감소 및/또는 차단 시약으로 코팅된 차단된 스트렙타비딘 비드 또는 웰을 사용한 사전선택을 포함하였다.
파지 선택을 위해 본원에서 사용된 항원은 HSA [시그마(Sigma); A3782] 및 MSA [알파 다이아그노스틱스(Alpha Diagnostics); ALB13-N-25]였다. 항원 비오티닐화는 EZ 링크 술포-NHS-LC 비오틴 키트 [피어스(Pierce)]를 사용하여 사내에서 수행되었다.
파지 증폭의 연속적인 라운드에 의한 선택에 이어, HSA 및 MSA 결합 클론은 하기 기재된 바와 같은 파지 ELISA에 의해 확인되었다. 파지 선택 후, 파지미드 벡터를 함유하는 개별 박테리아 클론을 적정 플레이트에서 96 웰 세포 배양 포맷으로 옮겼다. 유전자-III 마이너 코트 단백질에 융합된 HSA 아피머® 폴리펩티드를 표시한 재조합 파지 입자는 헬퍼 파지 구제 및 밤새 성장 후에 배양 상청액으로 방출되었다. 상청액에 함유된 파지는 ELISA에 의해 항원에 대한 결합에 관하여 후속적으로 스크리닝되었다. 플레이트 상에 고정화된 항원과 결합하는 파지-디스플레이 아피머®은 HRP-접합된 항-M13 모노클로날 항체 [지이 헬스케어(GE Healthcare)]로 검출되었고, ELISA는 1-단계 울트라 TMB-ELISA 기질 [써모 사이언티픽(Thermo Scientific)]을 사용하여 전개되었다.
파지 선택으로부터 확인된 아피머® 폴리펩티드 루프 2 및 루프 4의 정렬을 수행하였다 (도 1). 이러한 정렬로부터, HSA 및 MSA 파지 선택으로부터의 서열 모티프 패밀리가 확인되었다 (도 2).
실시예 2. 아피머® 폴리펩티드 이. 콜라이 단백질 생산
이. 콜라이에서 발현된 모든 아피머® 폴리펩티드는 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 수지 (IMAC 수지)로 단백질 정제를 단순화하기 위해 C-말단 헥사-HIS 태그 (HHHHHH; 서열식별번호: 168)로 클로닝되었다. 필요한 경우, 아피머® 폴리펩티드와 HIS 태그, 예컨대 검출을 위한 MYC (EQKLISEEDL; 서열식별번호: 162) 또는 TEV 프로테아제 절단 부위 (ENLYFQ(G/S); 서열식별번호: 163) 사이에 부가의 펩티드 서열을 부가하여 태그를 제거할 수 있다. 아피머® 단백질은 이. 콜라이로부터 발현되었고 IMAC, IEX 및 SEC를 사용하여 정제되었다. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 발현 플라스미드 pD861 [아툼(Atum)]을 BL21 이. 콜라이 세포 [밀리포어(Millipore)]로 형질전환시킴으로써 이. 콜라이로부터의 아피머® 단량체 정제를 수행하였다. 전체 형질전환된 세포 혼합물을 50 μg/ml 카나마이신 [애플리켐(AppliChem)]을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 형질전환된 이. 콜라이 잔디를 1x 테리픽 브로스 배지 [멜포드(Melford)] 및 50 μg/ml 카나마이신의 멸균 플라스크에 옮기고 30℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션하였다. 세포가 대략 0.8-1.0의 광학 밀도 OD600에 도달하면 10 mM 람노스 [알파 에이사(Alfa Aesar)]로 발현을 유도하였다. 배양물을 37℃에서 추가로 5시간 더 인큐베이션하였다. 그 결과로 생성된 세포 펠릿을 원심분리하고 용해시켜 세포를 채취하였다. 아피머® 폴리펩티드 정제는 His-태그부착된 단백질의 배치 결합 친화성 정제를 사용하여 수행되었다. 구체적으로는, 니켈 아가로스 친화성 수지 [슈퍼-NiNTA500; 제네론(Generon)]가 사용되었다. 수지를 NPI20 완충액 (50 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸)으로 세척하고 결합된 단백질을 NPI400 완충액의 5 칼럼 용적 (CV)으로 용출시켰다. 이어서 용출된 단백질을, 클론 HSA-31 (서열식별번호: 113)의 경우 20 mM 아세트산나트륨 pH 5.2를 가지며 클론 HSA-41 (서열식별번호: 116)의 경우 25 mM MES pH 6.0를 갖는 실행 완충액에서 CM FF 이온 교환 칼럼 (GE)을 사용하여 양이온 교환에 의해 정제하였다. 두 단백질 정제 모두는 0.1% 트리톤 114x (시그마) 세척 단계를 추가로 포함하였고 단백질을 1 M NaCl 선형 구배로 용출하였다. 세 번째 단계 정제는 PBS 1x 완충액에서 실행되는 하이로드 26/600 슈퍼덱스 75pg (지이 헬스케어)를 사용하여 수행된 정제용 SEC에서 수행되었다. 클론 HSA-41 (서열식별번호: 116) 및 HSA-31 (서열식별번호: 113)의 발현 및 순도는 PBS 1x 이동상을 사용하는 아클라임(Acclaim) SEC-300 칼럼 (써모)과 함께 SEC-HPLC (도 3a)를 사용하여 분석하였다. 단백질 수율은 나노드롭 (써모) A280 판독값을 사용하여 추정되었고 최종 산물은 환원 완충액에서 가열된 샘플과 함께 200볼트에서 노벡스(Novex)™ 20X 볼트(Bolt)™ MES SDS 실행 완충액 (써모) 중 SDS-PAGE 볼트 비스 트리스 플러스 4-12% 겔 (써모)에서 실행되었다. 겔 상의 단백질 밴드는 퀵 쿠마시 (제네론)로 염색되었다. 페이지룰러(PageRuler) 사전염색된 단백질 분자량 마커 (써모)를 겔 상에서 실행하여 3-단계 정제 후 융합 단백질의 분자량을 추정하였다 (도 3b).
실시예 3. 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드 특징규명
정제된 HSA-20 (서열식별번호: 111), HSA-31 (서열식별번호: 113), HSA-36 (서열식별번호: 114), HSA-41 (서열식별번호: 116) 아피머® 단백질의 인간, 마우스 및 시노몰구스 혈청에 대한 결합 친화성을 pH 6.0 및 pH 7.4 둘 다에서 생물층 간섭계 [옥텟(Octet)]에 의해 평가하였다. HSA 결합 친화성 범위는 pH 6.0에서 7.1 nM 내지 135.5 nM이고, MSA 친화성 범위는 pH 6.0에서 3.7 nM 내지 833.7 nM이며, CSA 친화성 범위는 pH 6.0에서 18.5 nM 내지 1.15 uM이다 (데이터는 도 4a-4d, 표 4에 제시됨). pH 6.0 또는 7.4에서 PBS-T (0.01% 트윈 20) + 1% 카세인을 포함하는 완충액에서 600초 동안 1 μg/ml로 비오티닐화 항원을 SA 센서 상에 포획하였다. 연합은 300초 동안 수행되었고, 해리는 600초 동안 수행되었으며, 재생은 10 mM 글리신 pH 1.5 (지이 헬스케어)를 사용하여 3 x 5초 동안 수행되었다. 모든 단계는 1000 rpm 및 25℃에서 수행되었다. 2배 연속 희석액 중의 정제된 아피머® 폴리펩티드는 대략 10x KD 값의 시작 농도에서 분석되었다. 동역학 분석은 옥텟 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 참조 센서 (항원이 로딩됨)를 빼고, Y축을 기준선에 정렬하고, 단계 간 보정을 사용하여 연합과 해리를 정렬하여 수행되었다. 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 필터링이 적용되었고 데이터가 처리되었다. 데이터 분석은 센서와 연결되지 않은 1:1 모델, 전역 맞춤, Rmax로 수행되었다.
표 4. pH 6.0 및 7.4에서 인간, 마우스 및 시노몰구스 혈청 알부민 단백질에 대한 아피머® 단백질 결합에 관한 K D 값.
Figure pct00013
표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여 4개의 아피머® 결합제에 대해 pH 7.4에서 마우스, 인간 및 시노몰구스 혈청에 대한 친화성을 또한 측정하였다 (도 5, 표 5). 비아코어 T200 동역학적 분석은 아민 커플링 시약 (지이 헬스케어)을 사용하여 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 (지이 헬스케어) 중에서, HSA (시그마; A37812), MSA (시그마; A3559) 또는 시노 혈청 알부민 (CSA) [압캠(Abcam); Ab184894]으로 각각 표면 Fc2, Fc3 및 Fc4 상에 고정화된 시리즈 S 센서 CM5 칩 (지이 헬스케어) 및 실행 완충액 HBS-EP+ (지이 헬스케어)을 사용하여 수행되었다. 아피머® 단량체의 농도 적정은 30 μl/min 또는 60 μl/min의 유속에서 분석물로서 실행되었다. Fc2-1, Fc3-1 및 Fc4-1 동역학적 데이터를 블랭크 감산하고 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어; GE)에 맞추어 KD 값을 계산하였다.
표 5. pH 7.4에서 측정된 비아코어 SPR을 사용하여 측정된 4개의 아피머® 결합제의 인간, 마우스 및 시노몰구스 혈청 알부민에 대한 결합 동역학
Figure pct00014
실시예 4. 아피머® 혈청 알부민 종 교차 반응성
HSA에 대한 친화성이 가장 높은 5개의 아피머® 단백질은 pH 6.0 및 pH 7.4 둘 다에서 결합 ELISA에 의해 인간, 시노몰구스, 말, 개, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트 혈청 알부민에 대한 교차 반응성에 대해 분석되었다 (도 7a-7b, 표 6). 간단히 언급하면, ELISA는 하기와 같이 수행되었다:
인간 [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]; 시노몰구스 및 마우스 (압캠); 말 (압캠); 개 (압캠); 마우스 (시그마-알드리치); 토끼 (시그마-알드리치); 돼지 (시그마-알드리치); 및 래트 (시그마-알드리치) 혈청 알부민을 적절한 pH (pH 6.0 또는 7.4)에서 PBS 중 1 μg/ml로 96 웰 플레이트 (코닝 코스타르)에 밤새 코팅하였다. PBS 중 5% 카세인 (시그마-알드리치) 완충액을 사용하여 플레이트를 포화시켰다. 차단 후, 희석된 5개의 리드 결합제 (HSA-18 (서열식별번호: 110), HSA-20 (서열식별번호: 111), HSA-36 (서열식별번호: 114), HSA-31 (서열식별번호: 113) 및 HSA-41 (서열식별번호: 116))를 플레이트에 부가하고 90분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 세척하고 아피머® 단백질을 비오티닐화 폴리클로날 항체 항-시스타틴 (R&D 시스템)을 사용하여 90분 동안 검출하였다. 세척 후, 스트렙타비딘-HRP (써모 피셔 사이언티픽)를 부가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, TMB (써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 반응 전개를 수행하고 450 nm에서 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다 (도 6).
표 6. pH 7.4에서 혈청 알부민 종 교차-반응성 결합 - EC 50 (nM)
Figure pct00015
실시예 5. 마우스에서 5개의 리드 혈청 알부민 결합제의 약동학적 프로파일
다양한 상이한 친화성과 MSA에 대한 연합 및 해리 상수를 가지는 5개의 아피머® 단백질, HSA-18 (서열식별번호: 110), HSA-20 (서열식별번호: 111), HSA-31 (서열식별번호: 113), HSA-36 (서열식별번호: 114), HSA-41 (서열식별번호: 116)을 선택하여 생체 내에서 시험하였다. 아피머® 단백질을 I-125를 사용하여 방사성 표지하고 시점당 3마리의 마우스에게 볼루스 정맥내 주사로서 10 mg/kg을 투여하였다. 아피머® 단백질의 혈청 농도는 방사능 측정에 의해 7일에 걸쳐 8개의 시점 (0.25 내지 168시간) 동안 결정되었다 (도 8, 표 7). 모든 아피머® 단백질은 SQT gly His 대조군 단량체 아피머® 단백질과 비교하여 증가된 반감기를 가졌고, 모든 클론은 생체내 내약성이 우수하였다.
표 7. 아피머® 단백질의 마우스에서의 약동학적 파라미터: 비-구획 분석에서 (반감기, t 1/2 ) 및 노출 (AUC 0-t)
Figure pct00016
실시예 6. 마우스에서 C-말단 His 태그 절단된 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드의 약동학 프로파일
C-말단 6x His 태그의 존재가 생체 내에서 아피머® 폴리펩티드의 약동학적 프로파일에 영향을 미치지 않았다는 것을 확실히 하기 위해, 단백질과 정제 태그 사이에 TEV 절단가능한 링커를 도입하였다. 리드 클론 HSA-41 (서열식별번호: 116)의 C-말단 6x His 태그의 절단은 아피머® 폴리펩티드-Myc C-말단 유전자 삽입물 다음에 TEV 절단 부위, 아미노산 서열 ENLYFQG (서열식별번호: 164)가 포함되었기 때문에 가능하였다. 아피머® 폴리펩티드는 제조업체 [인비트로젠(Invitrogen)]의 권장 사항에 따라 30℃에서 1시간 동안 AcTEV와 함께 인큐베이션하고, NiNTA 수지 (제네론)를 결합하고 절단된 단백질 통과액을 수집함으로써 절단된 His 태그를 제거하였다. His 태그를 더 이상 검출할 수 없음을 확인하기 위해 항-His (R&D 시스템즈) 웨스턴 블롯을 수행하였다. 아피머® 폴리펩티드 결합 동역학은 실시예 3에 기재된 바와 같이 옥텟을 사용하여 측정되었고, 아피머® 폴리펩티드가 C-말단 6x His 태그의 절단 후 pH 7.4에서 HSA 및 MSA에 대한 결합 특성을 유지하고 있음을 제시한다 (도 9). C-말단 His-태그부착된 아피머® 단백질과 비교하여 IV-주사된 His 태그 절단된 아피머® 단백질의 약동학적 프로파일을 평가하였다. 시점당 3마리의 마우스로부터 풀링된 혈청에 대해 항-시스타틴 샌드위치 ELISA를 사용하여 8개의 시점을 분석하였으며, 그 결과는 단백질이 C-말단 His 태그의 존재 유무에 관계없이 유사한 연장된 PK를 가진다는 것을 제시한다 (도 10).
실시예 7. 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드의 존재 하에 HSA의 FcRn 결합
재조합 FcRn에 대한 HSA의 결합의 예는 500 nM 아피머® 폴리펩티드가 pH 6.0에서 HSA와 사전-인큐베이션될 때 영향을 받지 않는다 (도 11). 제조업체의 프로토콜 (지이 헬스케어)에 따라 비오틴 캡쳐 칩을 사용하여 FcRn 비아코어 결합 분석을 수행하였다. 간단히 언급하면, 비오틴 캡쳐 시약은 표면 Fc1 및 Fc2 위로 2 μl/min 유속으로 300초 동안 실행한 후, 50초의 접촉 시간으로 10 μg/mL에서 비오티닐화 FcRn을 포획하고, 10 μl/min으로 실행하여 Fc2에만 전달되었다. 2.5 μM의 일정한 HSA 농도를 PBS-T pH 6.0 중 500 nM에서 HSA-20 (서열식별번호: 111)과 미리 혼합한 경우 및 미리 혼합하지 않은 경우 표면 Fc1 및 Fc2 위로 유동시켰다. 알부민 단독과 비교하여 아피머® 폴리펩티드가 HSA와 결합되었을 때 FcRn에 대한 HSA의 결합에서는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 제조업체의 프로토콜에 따라 표면 Fc1 및 Fc2 재생을 수행하였다.
실시예 8. PD-L1 결합 아피머® 반감기 연장된 인라인 융합 ( ILF ) 이량체
3개의 PD-L1 결합 아피머® 폴리펩티드, AVA04-236 (서열식별번호: 117 및 118), AVA04-261 (서열식별번호: 119 및 120), 및 AVA04-269 (서열식별번호: 121 및 122)의 반감기는 N- 또는 C-말단에서 HSA-41 (서열식별번호: 116)과 유전적으로 융합함으로써 연장되었다. 강성 A(EAAAK)6 (서열식별번호: 161) 또는 가요성 (G4S)6 (서열식별번호: 165) 반복 유전적 링커를 사용하여 이량체 유전적 융합체로서 포맷화된 반감기 연장된 PD-L1 아피머® 폴리펩티드의 도식적 표현이 도 12a에 제공되며, ILF 정위 및 명명법의 표는 표 8에 제시되어 있다. 이. 콜라이로부터의 ILF 이량체 생산은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었다. 간단히 언급하면, 친화성 포획, IEX 및 정제용 SEC의 3가지 단계를 사용하여 단백질을 정제하였다. 최종 ILF 단백질 순도는 SEC-HPLC를 사용하여 평가되었고 >95% 순도인 것으로 제시되었다 (도 12b). 비아코어 동역학적 분석은 유전적으로 융합된 두 개의 아피머® 폴리펩티드 모두가 표적 항원인 인간 PD-L1-Fc (R&D 시스템즈) 및 HSA (시그마)에 연결될 수 있었다는 것을 제시하였다 (표 9). HSA 결합을 분석하기 위해 비아코어를 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. PD-L1-Fc 결합 동역학을 분석하기 위해, 아민 커플링 시약 (지이 헬스케어)을 사용하여 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0 중에서 PD-L1-Fc (R&D 시스템즈)로 고정화된 시리즈 S 센서 CM5 (지이 헬스케어) 칩 Fc2 및 실행 완충액 HBS-EP+를 사용하여 비아코어 T200 동역학적 분석을 수행하였다. ILF 아피머® 폴리펩티드의 농도 적정은 30 μl/min의 유속에서 분석물로서 실행되었다. 재생된 PD-L1-Fc를 20μl/min 유속 하에 20초 동안 3 mM NaOH (지이 헬스케어)로 표면 상에 고정화시켰다. Fc2-1 데이터 블랭크를 감산하고 1:1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어; GE)에 맞추어 겉보기 KD 값을 계산하였다.
표 8. HSA 결합 아피머® 단백질로 반감기 연장된 PD-L1 ( AVA04 ) 결합 아피머® ILF 단백질의 명명법
Figure pct00017
표 9. 아피머® 단백질의 비아코어™ 동역학적 분석
Figure pct00018
실시예 9. PD-L1 결합 아피머® 이량체 반감기 연장된 인라인 융합 삼량체
도 13은 HSA-41 (서열식별번호: 116)에 대한 강성 링커 A(EAAAK)6 (서열식별번호: 161)와 유전적으로 융합된 PD-L1 결합 아피머® 이량체 (서열식별번호: 129의 2개 단량체)의 도식적 표현을 제시한다. 이. 콜라이에서의 ILF 생산은 친화성 포획, IEX 및 정제용 SEC를 사용하여 정제된 단백질을 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었다. 단백질 순도는 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC를 사용하여 평가되었다. 아피머® 폴리펩티드는 99.8% 내지 100% 순수한 것으로 밝혀졌다 (도 14). 비아코어 동역학적 분석은 유전적으로 융합된 아피머® 이량체가 이들의 표적 단백질 둘 다에 연결될 수 있음을 제시하였다 (도 15a). AVA04 아피머® 폴리펩티드는 PD-L1 및 HSA-41 (서열식별번호: 116)과 결합하고 HSA에 연결되는 것으로 밝혀졌다. 비아코어 분석이, HSA 결합을 분석하기 위해 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었고 PD-L1-Fc 결합을 분석하기 위해 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행되었다 (표 10).
아피머® 인라인 융합체 포맷에서의 다양한 위치에 HSA-41을 부가하는 것이 인간 PD-L1에 대한 AVA04-251의 결합에 영향을 미쳤는지를 평가하기 위해, 3개의 ILF 포맷화된 아피머® 폴리펩티드로 PD-L1 결합 ELISA를 수행하였다 (도 16). 간단히 언급하면, 인간 PD-L1-Fc (R&D 시스템즈) 키메라 단백질을 탄산염 완충액 중의 0.5 mg/ml로 96 웰 플레이트 상에 코팅하였다. 5% 카세인/PBS 완충액으로 포화시킨 후, 플레이트를 세척하고 아피머® 폴리펩티드 또는 대조군의 희석액을 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 비오티닐화 폴리클로날 항체 항-시스타틴 A (R&D 시스템즈)를 1시간 동안 부가하였다. 플레이트를 세척하고 아피머® 폴리펩티드를, 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 검출하였다. 마지막 세척 단계 후, 실험 전개를 위해 TMB를 부가하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 시험된 3개의 구축물은 유사한 EC50 (0.03 내지 0.1 nM 범위)을 나타내며 항-PD-L1 모 ILF 이량체 분자 (AVA04-251 BH (서열식별번호: 129))와 동일하다. 이것은 모 분자와 비교하여 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드의 PD-1/PD-L1 차단 생물검정 [프로메가(Promega)]이 수행되었을 때 확인되었다 (도 17). PD-1/PD-L1 차단 생물검정 (프로메가) 검정은 제조업체 지침에 따라 이중으로 실행되었으며 시험된 3개의 구축물이 유사한 EC50 값 (2배 차이 이내)을 가지며 모 이량체 분자 (AVA04-251 BH; 서열식별번호: 129)와 동일하다는 것을 제시하였다.
유사하게, pH 7.4에서 ELISA를 사용하여 3개의 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드에 관하여 인간 혈청 알부민에 대한 결합을 평가하였다. 간단히 언급하면, HSA는 pH 7.5에서 1 mg/ml로 96 웰 플레이트에서 코팅되었다. 5% PBS 카세인 pH 7.5로 포화시킨 후, 플레이트를 세척하고 아피머® 폴리펩티드 또는 대조군의 희석액을 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고, 비오티닐화 폴리클로날 항체 항-시스타틴 A (R&D 시스템즈)를 1시간 동안 부가하였다. 플레이트를 세척하고 아피머® 폴리펩티드를, 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 검출하였다. 마지막 세척 단계 후, 실험 전개를 위해 TMB를 부가하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 시험된 3개의 구축물은 유사한 EC50 (0.03 내지 0.06 nM 범위)을 나타내고 모 분자 (HSA-41; 서열식별번호: 116)와 동일하다 (도 18).
표 10. 아피머® 폴리펩티드 (PD-L1- Fc , HSA )의 비아코어™ 동역학적 분석
Figure pct00019
실시예 10. 반감기 연장된 ILF 삼량체의 혼합 림프구 반응
AVA04-251 XT 인라인 융합체 포맷화된 아피머® 폴리펩티드를 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정으로 시험하였다 (도 19). 간단히 언급하면, 단핵구로부터 유래된 수지상 세포 (DC)는 7일 동안 배양된 CD14+ 단핵구로부터 제조되었다. 미성숙 DC를 제7일에 사용하고 동종이계 T-세포 (음성 단리) 및 참조 물질 또는 비히클 대조군 (RPMI-10 배지)과 함께 배양하였다. 세포를 4일 동안 배양하고 배양 기간 말기에 상청액에서 ELISA에 의해 IFNγ를 측정하였다. 데이터는 평균 +/- S.E.M. pg/ml로서 나타내거나 또는 비히클 대조군으로 정규화된다 (n=6). 점선은 평균 비히클 (RPMI-10) 값을 나타낸다. 반감기 포맷화된 아피머® 폴리펩티드 AVA04-251 XT14 (서열식별번호: 123)는 대조군 (비-반감기 연장됨)과 유사하게 IFNγ 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (도 21).
실시예 11. 마우스에서 PD-L1 결합 반감기 연장된 인라인 융합 아피머® 폴리펩티드의 약동학 프로파일
반감기가 연장된 ILF AVA04-251 삼량체는 C57/Bl6 마우스에서의 약동학적 연구에서 시험되었다. 도 20에 기재된 바와 같이, 마우스에게 10 mg/kg을 정맥내 (IV) 주사하였다. 6마리의 마우스가 사용되었고 9개의 시점 (0, 0.25, 6, 24, 72, 120, 168 및 336시간)에서 혈청을 수집하였다. 각각의 시점에 대한 혈청 샘플을 풀링하고, 주사된 정제된 분자를 참조 표준으로서 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 그 결과는 15분에 초기 용량의 백분율로서 표현되었다. 반감기 연장이 없는 아피머® ILF 단백질 (AVA04-251 BH 서열식별번호: 129)은 신속한 청소율 (t1/2 3.2시간)을 제시한 반면, ILF AVA04-251 XT 포맷 모두는 베타 단계에서 추정했을 때, 반감기 연장을 제시하였다 (23.8-24.2시간 범위).
실시예 12. 아피머® ILF 삼량체의 마우스 이종이식편 모델 시험
PBMC는 한 명의 건강한 기증자로부터 단리되었다. 전체 T-세포를 단리하고 IL-2가 보충된 완전 배지에서 7 내지 10일 동안 2회 A375 세포 상에서 확장시켰다. 마우스 (n=10)에 A375 종양 세포 및 활성화된 T-세포 (PBS 중 0.2 ml)를 오른쪽 옆구리 부위에 피하 접종하여 종양을 발생시켰다. 처리는 세포 접종 후 1시간에 시작되었다. AVA04-251 XT14 (서열식별번호: 123) 정제된 단백질을 3주 동안 매주 2회 투여하였다. 전반적으로, 무작위화 후 제13일에 대조군과 비교했을 때, 두 처리 모두에서 종양 성장 억제가 나타났다. AVA04-251 XT14 (서열식별번호: 123)로 처리된 마우스의 70% 초과가, 비-결합 아피머® 폴리펩티드 ILF SQT gly XT28 (서열식별번호: 128)을 투여한 대조군과 비교하여 종양 크기 감소를 나타냈다 (도 21a-21c).
실시예 13. AVA04 반감기 연장된 ILF 삼량체 C-말단 cys 아피머® 폴리펩티드 발현
반감기 연장된 삼량체는 AVA04-251 XT14 cys (서열식별번호: 126)를 생성하기 위해 빠른 변화 돌연변이 유발 [애질런트(Agilent)]에 의해 C-말단 6xHis 태그 다음에 C-말단 시스테인 아미노산을 추가로 포함하도록 합성되었다. 아피머® 단백질은 이. 콜라이로부터 생산되었고 실시예 3에 기재된 바와 같이 친화성, IEX 및 정제용 크기 배제로 정제되었다. 2 mM TCEP를 사용한 환원 조건 하에서 정제된 단백질의 특징규명은 최종 단백질의 순도가 >97%임을 제시하였다 (도 22). 따라서 아피머® ILF 단백질은 아피머® 단백질-약물 접합체의 생성을 가능하게 하는 말레이미드 화학을 사용한 후속 접합을 위해 유리 시스테인으로 생산될 수 있다.
실시예 14: FcRn 및 혈청 알부민에 대해 인간화된 이중 트랜스제닉 마우스에서 HSA-41의 약동학적 프로파일
이전에 입증된 바와 같이, HSA 아피머® 단백질의 반감기는 혈청 알부민에 대한 그의 결합 친화성과 상관관계가 있다. HSA-41 (서열식별번호: 116)은 마우스보다 인간 혈청 알부민에 대해 상당히 더 높은 친화성을 갖는다. 따라서, 리드 분자 HSA-41 (서열식별번호: 116)의 PK 프로파일은 인간에서 발견되는 생리학적 상호작용을 보다 밀접하게 모방하기 위해 이중 트랜스제닉 인간화 신생아 Fc 수용체 (FcRn)/인간 혈청 알부민 마우스 모델에서 평가되었다. 도 23에 기재된 바와 같이, 마우스에게 10 mg/kg을 정맥내 (IV) 주사하였다. 9마리의 마우스에게 주사하였고, 10개의 시점에서 혈청을 수집하였다 (최대 336h). 각각의 시점에 대한 혈청 샘플을 풀링하고, 주사된 분자를 참조 표준으로서 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 그 결과는 최대 농도의 백분율로서 표현된다. HSA-41 아피머® 폴리펩티드 (서열식별번호: 116) 단백질의 반감기는 이러한 트랜스제닉 마우스 모델에서 대략 145시간으로 베타 단계에서 추정되었다.
실시예 15: 시노몰구스에서 3개의 리드 아피머® 폴리펩티드의 약동학적 프로파일
3개의 아피머® 단백질, HSA-18 (서열식별번호: 110), HSA-31 (서열식별번호: 113) 및 HSA-41 (서열식별번호: 116)은 마우스에서 상이한 PK 프로파일을 제시하였다. 군당 2마리의 동물 (수컷 1마리 및 암컷 1마리)에게 아피머® 폴리펩티드를 볼루스 정맥내 (IV) 주사로서 5 mg/kg으로 투여하였다. 아피머® 단백질의 혈청 농도는 ELISA에 의해 28일에 걸쳐 14개의 시점 (0.25-672시간)에 대해 결정되었다. 시험된 모든 아피머® 단백질은 생체 내에서의 내약성이 우수하였다 (도 24 및 표 11).
표 11. 아피머® 단백질의 마우스에서의 약동학적 파라미터 (반감기, t 1/2 )
Figure pct00020
실시예 16. 항-마우스 PD-L1 결합제 반감기 연장된 인라인 융합 아피머® 삼량체
AVA04-182 XT20 (서열식별번호: 127) 반감기 연장된 ILF 삼량체가 이. 콜라이로부터 생산되었다. SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석이 실시예 2에 기재된 바와 같이 실행되었고 >98% 초과의 최종 단백질 순도를 제시하였다 (도 25a). 정제된 단백질을 비아코어에서 실행하여 마우스 PD-L1-Fc 태그부착된 재조합 항원 (R&D 시스템즈)에 대한 친화성을 평가하였다. 항원을 단백질 A 칩 (지이 헬스케어)을 사용하여 포획하고, 최대 농도 1 nM으로부터 적정하고 10 mM 글리신 pH 1.5 (지이 헬스케어)를 사용하여 재생하는 단일 사이클 동역학을 사용하여 아피머® ILF 포맷을 분석물로서 실행하였다. Fc2-1 동역학적 데이터를 블랭크 감산하고 1:1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어; 지이 헬스케어)에 맞추어 90.6 pM의 KD 값을 계산하여, 반감기 연장 아피머® 폴리펩티드를 이러한 포맷으로 부가하는 것이 마우스 PD-L1 표적 항원에 대한 AVA04-182 결합에 영향을 미치지 않았다는 것을 확인하였다 (도 25b).
AVA04-182 XT20 (서열식별번호: 127) ILF는 ELISA에서 pH 7.4 및 pH 6.0에서 HSA와 결합할 수 있는 능력에 관하여 평가되었다 (실시예 4에 기재된 바와 같음). 도 26a 및 26b는 AVA04-182 XT20이 MSA와 결합할 수 있는 HSA-41의 능력을 유지하였다는 것을 제시한다. 또한, 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드가 기능적인지를 평가하기 위해, 경쟁적 ELISA (mPD-1/mPD-L1)를 수행하였다. 간단히 언급하면, PD-1를 탄산염 완충액 중의 1 μg/ml로 플레이트 상에 밤새 코팅하였다. 그런 다음 플레이트를 5% 카세인/PBS 완충액을 사용하여 포화시켰다. 한편, mPD-L1은 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드 및 그의 대조군의 희석액과 함께 사전-인큐베이션되었다. 포화시킨 후, 혼합물을 플레이트에 부가하고 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 검출 폴리클로날 항체인 비오티닐화 항-PD-L1을 부가하였다. 플레이트를 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP를 30분 동안 부가하였다. 최종 세척 후, TMB (피어스)를 사용하여 반응 전개를 수행하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다 (도 26c). 상기 도면은 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드가 그의 모 분자와 유사한 중화 능력을 가지고 있음을 제시한다.
개념의 증명으로서, 약동학적 연구를 마우스에서 수행하였다. 군당 12마리의 동물에게 25 mg/kg 아피머® 폴리펩티드를 복강내 (IP) 주사하였다. 시점당 3마리의 동물을 사용하였다. 주사 후 336시간까지, 8개의 시점에서 혈청을 채취하였다. 풀링된 혈청을 ELISA를 사용하여 분석하여 혈청 내 아피머® 폴리펩티드의 수준을 정량화하였다. 반감기 연장된 아피머® 폴리펩티드의 약동학적 프로파일은 본 연구에서 ~17시간의 반감기를 제시하였다 (도 27).
실시예 17: A375 마우스 이종이식편 모델에서 AVA04 -251 BH- 800CW의 생체분포
형광 영상화를 사용하여 시간 경과에 따른 IR 염료-접합된 아피머® 폴리펩티드의 생체분포를 검사하는 마우스 이종이식편 모델에서, 항-PD-L1 아피머® 폴리펩티드가 인간 PD-L1을 발현하는 종양을 표적으로 하는지의 여부를 평가하였다. AVA04-251 BH cys (서열식별번호: 130) 및 AVA04-251 XT14 cys (서열식별번호: 126)를 말레이미드 화학으로 IRDye 800CW (LI-COR)와 접합시켜 단백질 상의 접근가능한 아미노 기를 변형시켰다. 아피머® 폴리펩티드를 50 mM MES pH 6, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP에서 1 mg/ml로 희석시키고 9:1 염료:단백질의 화학량론에서 IRDye 800CW (수 중 4 mg/mL)와 함께 2시간 동안 실온 (~23℃) 하의 어두운 조건에서 인큐베이션하였다. 제조업체의 지침에 따라 5 mL 제바 스핀 탈염 칼럼 (MWCO 7000; 피어스)을 사용하여 염료-접합된 아피머® 폴리펩티드로부터 유리 염료를 분리하였다. 염료:단백질 비율은 하기 방정식에 따라 280 및 780 nm에서의 흡광도를 기반으로 계산되었다:
염료:단백질 비율 = (A780/ε염료)/(A280-(0.03 x A780))/ε 단백질
여기서 0.03은 280 nm에서 IRDye 800CW의 흡광도에 대한 보정 계수이며, ε염료 및 ε 단백질은 각각 AVA04-251 BH Cys (서열식별번호: 130)의 경우 염료 270,000 M- 1 cm-1 및 단백질 39871 M- 1 cm-1에 대한 몰 흡광 계수이고 AVA04-251 XT14 cys (서열식별번호: 126)의 경우 37626 M- 1 cm-1에 대한 몰 흡광 계수이다. 도 28a-28c는 SEC-HPLC 및 SDS-PAGE 분석 방법 (실시예 2에 상세히 기재된 바와 같음)을 사용하여 접합된 물질의 포맷 개략도 및 순도를 제시한다.
재조합 인간 PD-L1에 대한 염료-접합된 AVA04-251 BH-800 또는 AVA04-251 XT14-800의 결합을 PD-L1 결합 ELISA를 사용하여 비-접합된 아피머® 폴리펩티드와 비교하였다.
간단히 언급하면, 인간 PD-L1 Fc (R&D 시스템즈) 키메라 단백질을 탄산염 완충액에서 0.5 μg/mL로 96 웰 플레이트 상으로 코팅하였다. 5% 카세인/PBS 완충액으로 포화시킨 후, 플레이트를 세척하고 접합된 아피머® 폴리펩티드 또는 비접합된 대조군의 희석액을 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고, 비오티닐화 폴리클로날 항-시스타틴 A 항체 (R&D 시스템즈)를 부가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 결합된 아피머® 폴리펩티드를 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 검출하였다. 마지막 세척 단계 후, TMB를 부가하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 접합된 아피머® 폴리펩티드는 모 분자와 비교하여 유사한 EC50을 나타냈다. 따라서, 데이터는 염료 접합이 비슷한 결합 곡선을 기반으로 PD-L1 표적에 대한 접합된 포맷화된 두 분자의 친화성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다 (도 29).
A375 마우스 이종이식편 모델은 이러한 동물의 옆구리에 A375 세포 (100 μL 멸균 PBS 중 5x106개의 세포 [ATCC])를 피하 주사한 후 암컷 무흉선 누드 마우스 [찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)]에서 확립되었다. 종양을 주당 3회 모니터링하고, 발생하는 종양을 캘리퍼스로 측정하였다. AVA04-251 BQ-800 및 BH-800 (1 nmole에서)을 3마리 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 투여하기 전에 종양이 500 내지 1000 mm3로 성장하도록 하였다. 주사 직후 (시간 0) 및 투여 후 1, 2, 4, 8, 24 및 48시간에 크세노겐(Xenogen) IVIS 200 바이오포토닉 영상화기로 형광 영상을 기록하였다. 4시간 시점에서, 종양에 대한 반감기 연장을 갖는 항-PD-L1 아피머® 폴리펩티드의 표적화가 검출되었다. 데이터는 도 30에 제시되어 있으며, 화살표는 종양의 대략적인 위치를 나타낸다.
실시예 18: HSA와의 복합체에서 HSA - 41 아피머 ® 폴리펩티드의 결정화
HSA-41 (서열식별번호: 116)은 실시예 2에 기재된 바와 같이 NiNTA 및 BL21 이. 콜라이 세포로부터의 정제용 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 발현 및 정제되었다. HSA는 시그마 Cat. No. A3782로부터 구입하였고 50 mg/ml로 재구성하였다. 정제된 아피머® 폴리펩티드를 1:1.5 몰 비로 HSA와 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 혼합하였다. 형성된 단백질 복합체를 10 mM 트리스 pH 7.4 및 150 mM NaCl 완충액을 이동상으로서 사용하는 정제용 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 올바른 분자량의 용출된 복합 분획을 105.3 mg/ml로 농축시키고, 액체 질소에서 급속 동결하고 -80℃에서 저장하였다. 결정학을 수행하기 위해, 여러 상업용 스크린을 +4℃ 및 +18℃의 2가지 온도로 설정하였다. 저장소 용액에 100:100 nl 단백질을 사용하는 시팅 드롭 증기 확산법을 수행하였다. 결정화 스크린 설정은 MD JCSG +, MD PACT, MD 프로플렉스, MD 구조 및 햄프턴 솔트(Hampton Salt) RX였다. 회절 데이터세트는 10 mM 염화니켈 (II) 6수화물, 0.1 M 트리스-HCl pH 8.5 및 20% w/v PEG 2000 MME-생산된 결정으로부터 수득된 결정 (도 31a) 상에서 수집하였다. 데이터는 영국 다이아몬드 광원으로 수집되었다. 회절 데이터세트는 3.05 Å2에 거의 완전하다 (단백질 복합체의 3D 결정 구조; 도 31b). HSA-41 (서열식별번호: 116)은 주로 아피머® 폴리펩티드 루프 2 상호작용을 통해 HSA의 도메인 II와 결합하는 것으로 제시되었으며, 이는 전자 밀도가 단백질 표면 상의 Ni2 + 이온에 의한 공유 변형을 나타내며 아마도, 결정화를 촉진할 가능성이 있기 때문이다. 880 Å2의 전체 상호작용 영역은 주로 루프 내에서 알파 나선 구조를 형성하는 것으로 밝혀진 결합 루프 2를 통해 이루어지며, 계면은 친수성 상호작용과 소수성 상호작용이 혼합되어 있는 것이 특징이다. 루프 4는 몇 가지 상호작용을 선택한다. 도 31c, 31d 및 표 12는 아피머® 폴리펩티드와 HSA 간의 특이적 아미노산 상호작용을 제시한다.
표 12. HSA -41 아피머® 폴리펩티드와 HSA의 결정 구조 예측 아미노산 상호작용
Figure pct00021
실시예 19: 루프 2 & 4의 HSA -41 알라닌 스캐닝 돌연변이체 요약
아피머® 폴리펩티드 HSA-41 (서열식별번호: 116)을 루프 2 및 루프 4 내의 각각의 아미노산 전체에 걸쳐 알라닌 잔기로 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 돌연변이시켜, 어떤 아미노산이 표적 항원에 연결되었는지를 확인하였다. 최종 클론을 서열 검증하고, 이. 콜라이로부터 생산하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 친화성 정제하였다. 총 18개의 알라닌 돌연변이체를 50 nM (표준 아피머® 단백질 농도)에서 비아코어에서 pH 7.4에서 단백질 순도 및 HSA에 대한 결합 반응에 관하여 SEC-HPLC 상에서 1 단계 정제 후 비교하였다. 데이터는 루프 2가 알라닌으로 돌연변이될 때 결합 신호를 상실하는 잔기 51, 52, 55, 56 및 58을 갖는 표적과 결합하는데 크게 관여한다는 것을 제시하였다. 루프 4에서, 첫 번째 위치 84는 알라닌으로 돌연변이될 때 결합 능력을 상실하며, 루프의 나머지 부분은 결합에 덜 관여한다 (표 13). SEC-HPLC 데이터는 루프 2 위치 50 및 55가 알라닌으로 대체될 때 단백질 순도가 감소함에 따라 자기 연합에 관여할 수 있음을 제시하였다.
표 13. 알라닌 돌연변이체 스크리닝의 결과
Figure pct00022
실시예 20: HSA -41 루프 4 녹아웃 돌연변이체
HSA-41 (서열식별번호: 116) (실시예 18) 및 알라닌 스캐닝 (실시예 19) 실험의 해결된 결정 구조로부터, HSA-41은 주로 루프 2를 통해 HSA와 결합하는 것으로 제시되었다. 아피머® 폴리펩티드는 결실 (서열식별번호: 141)로 루프 4를 녹아웃시키거나 또는 루프를 9개의 글리신 잔기 (서열식별번호: 142)로 교체함으로서 녹아웃시키도록 설계되었다. 이들 돌연변이체는 표적 항원와 결합할 수 있는 능력을 상실하였으며, 이는 HSA-41이 표적에 연결되고 반감기 연장을 위해 루프 4가 필요하다는 것을 입증하였다 (도 36).
실시예 21: HSA -41의 ILF 동종이량체의 결합력
아피머® 폴리펩티드는 강성 (HSA-41 BK; 서열식별번호: 131) 또는 가요성 (HSA-41 DI; 서열식별번호: 132) 반복 링커를 갖는 ILF 동종이량체를 형성하도록 유전적으로 융합되었다 (개략도 도 32a). 아피머® 폴리펩티드는 실시예 3에 기재된 바와 같이 이. 콜라이로부터 생산되고 정제되었다. 고정화된 HSA에 대한 결합에 관하여 pH 7.4에서 비아코어 동역학적 분석을 수행하였다 (실시예 3에 기재된 바와 같음). 이러한 분석은 아피머® 폴리펩티드가 융합되었을 때, HSA에 대한 nM 단량체 결합과 비교하여 pM KD 값으로 결합력을 제시하였다 (도 32b 및 32c).
실시예 22: 혈청 알부민과의 HSA -41 인큐베이션 , SEC- HPLC 특징규명
아피머® 폴리펩티드인 HSA-41 (서열식별번호: 116)을 HSA (시그마)와 함께 1:1 또는 1:2 비율로 1 내지 4시간에 걸쳐 인큐베이션하였다. HSA-41 아피머®:HSA 복합체의 총 질량을 SEC-HPLC 아클라임-300 칼럼 (써모)에서 실행된 아피머®-Fc 융합 단백질 (80.5 kDa)의 질량 대조군과 비교하였다. 그 결과는 1시간 후 1:1 결합 화학량론을 가지는 복합체의 83 kDa의 예상 분자량 (MW)을 제시한다 (도 33a- 33c). 이량체 인라인 융합 (ILF) 단백질 포맷: HSA-41 DI (서열식별번호: 132) 또는 HSA-41 BK (서열식별번호: 131)의 인큐베이션으로 동일한 실험을 수행하였다. ILF 단백질을 4시간에 걸쳐 HSA와 함께 인큐베이션하였다 (도 34). 이들 샘플의 SEC-HPLC 분석은 야라(Yarra)-3000 [페노메넥스(Phenomenex)] 칼럼에서 수행되었으며, 데이터는 동시에 HSA에 연결되는 ILF 포맷의 두 아피머® 폴리펩티드를 갖는 HSA:아피머® ILF 이량체의 2:1 결합 화학양론을 제시하였다. ILF 이량체:HSA 복합체는 칼럼 상에서 150 kDa의 모노클로날 항체 질량 대조군보다 더 높은 MW에서 실행되는 ~160 kDa의 질량으로 실행되었다 (도 34).
실시예 23: C57BL /6 마우스에서 HSA -41 단량체 및 ILF 이량체의 약동학적 분석
9마리의 야생형 C57BL/6 마우스에게 10 mg/kg 아피머® 폴리펩티드를 정맥내 주사하고, 혈액 샘플을 10개의 시점 (0.25분 및 2, 6, 12, 24, 72, 120, 168, 336 및 504시간)에서 수집하였다. 혈청을 준비하고 분석할 때까지 동결시켰다. 각각의 시점에 대해, 혈청을 풀링하고 아피머® 폴리펩티드를 검출하고 항-시스타틴 샌드위치 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 분석된 데이터는 아피머® 단량체의 베타 단계로부터 계산된 반감기 연장 (72h)이 야생형 마우스에서 ILF 이량체 HSA-41 DI (103h)로 추가로 증가되었음을 제시하였다 (도 35).
실시예 24: 항-혈청 알부민 결합제의 에피토프 비닝
균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정이 에피토프 비닝에 사용되었다. 이러한 검정은 HSA-41 Myc His와 결합된 비오티닐화 인간 혈청 알부민과의 결합에 관하여 혈청 알부민-결합 아피머® 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되었다. HSA-41 Myc His와 비오티닐화 HSA 간의 상호작용은 테르븀 크립테이트 공여자로 표지된 스트렙타비딘과 d2 수용자로 표지된 항-Myc를 사용하여 수행되었다. 경쟁 검정에서 시험된 모든 아피머® 단백질은 Myc 태그 없이 생산되었으며 (HSA-18, -20, 및 -36), HSA-41 Myc His와 비오티닐화 HSA (HSA-31 제외) 간의 상호작용 억제를 제시하였으며, 이는 상이한 에피토프와 결합한다는 것을 시사한다 (도 37).
실시예 25: HSA -41 유리 C-말단 시스테인 포맷 ( CQ ) 특징규명
아피머® 폴리펩티드 HSA-41 (서열식별번호: 116)은 HSA-41의 C-말단 태그 영역에 유리 시스테인 잔기를 삽입하도록 유전적으로 조작되어, C-말단 태그 Myc Cys TEV His로 발현되는 HSA-41 CQ (서열식별번호: 138)를 생성한다. HSA-41 CQ는 예를 들어, 폴리펩티드의 반감기를 부가하기 위해, 말레이미드 화학을 통한 접합에 사용될 수 있다. Cys 변이체 아피머® 폴리펩티드 (HSA-41 CQ)를 환원제 5 mM TCEP의 존재 하에 정제하고 환원 조건 하에 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에서 특징규명하였다 (도 38a- 38b). pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 관한 비아코어 동역학적 분석을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. HSA-41 CQ는 ~3 nM의 KD를 갖는, 유리 C-말단 Cys가 없는 단량체와 비슷한 것으로 밝혀졌다 (도 39).
실시예 26: HSA -18 반감기 연장 아피머® 폴리펩티드를 사용한 AVA04 -251 XT ILF 포맷화
2개의 아피머® 삼량체 인라인 융합 (ILF) 포맷이 설계되었다. 각각은 2개의 융합된 AVA04-251 인간 PD-L1 결합 아피머® 폴리펩티드를 포함하고, 이는 반감기를 연장하기 위해 HSA-18 (서열식별번호: 110)과 추가로 융합되었다. AVA04-251 XT60 (서열식별번호: 139)은 C-말단에 위치하는 반감기 연장 아피머® 폴리펩티드를 포함하는 반면, AVA04-251 XT61 (서열식별번호: 140)은 2개의 항-PD-L1 아피머® 폴리펩티드를 분리하는, 포맷의 중간에 반감기 연장 아피머® 폴리펩티드를 포함하였다 (개략도, 도 40). 포맷은 아피머® 폴리펩티드 사이의 반복적인 강성 유전적 링커 A(EAAAK)6 (서열식별번호: 161)로 설계되었다. 아피머® 삼량체는 이. 콜라이로부터 생산되었고 친화성 NiNTA 수지로 정제된 후, 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제용 크기 배제가 뒤따랐다. 환원 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석은 단백질 포맷의 최종 순도가 >98%임을 제시한다 (도 40).
실시예 27: 혈청 알부민에 대한 반감기 연장된 AVA04 -251 XT60 및 AVA04 -251 XT61 ILF 포맷 결합
인간 혈청 알부민 (HSA) 비아코어 동역학적 분석은 이전에 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 pH 6.0 및 pH 7.4 실행 완충액으로 수행되었다. 데이터는 pH 7.4에서 세 자릿수 nM 친화성 및 pH 6.0에서 두 자릿수 nM 친화성의 KD로 HSA와 결합된 (이는 109-152 nM의 HSA-18 단량체 친화성의 2-4배 이내임) 반감기 연장 아피머® 폴리펩티드 HSA-18 (서열식별번호: 110)을 함유하는 ILF 포맷을 제시하였다 (도 41a- 41b). pH 6.0 조건에서 마우스 혈청 알부민 (MSA)의 경우, ILF 포맷의 결합 친화성은 단량체 혈청 알부민 결합 아피머® 폴리펩티드의 대략 2배 이내였다 (도 43).
실시예 28: 혈청 알부민에 대한 반감기 연장된 AVA04 -251 XT60 및 AVA04 -251 XT61 ILF 포맷 결합
인간 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 대한 결합은 ELISA를 사용하여 pH 7.4에서 2개의 반감기 연장된 ILF 아피머® 포맷 (AVA04-251 XT60, 서열식별번호: 139; AVA04-251 XT61, 서열식별번호: 140)에 대해 평가되었다. 간단히 언급하면, HSA 또는 MSA는 pH 7.5에서 1 mg/ml로 96 웰 플레이트에서 코팅되었다. 5% PBS 카세인 pH 7.5로 포화시킨 후, 플레이트를 세척하고 아피머® 삼량체 또는 대조군의 희석액을 플레이트 상에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 비오티닐화 폴리클로날 항체 항-시스타틴 A (R&D 시스템즈)를 1시간 동안 부가하였다. 플레이트를 세척하고 아피머® ILF를 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 검출하였다. 마지막 세척 단계 후, 실험 전개를 위해 TMB를 부가하고, 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 시험된 2개의 ILF인 AVA04-251 XT60 및 AVA04-251 XT61은 HSA (5.7 내지 8.8 범위) 및 MSA (133.6 내지 60.8 범위) 둘 다에 대해 유사한 EC50 값을 나타냈다 (도 42).
실시예 29: 인간 PD-L1- Fc에 대한 AVA04 -251 XT60 및 AVA04 -251 XT61 ILF 포맷 결합
실시예 3에 기재된 바와 같이 AVA04-251 XT60 및 AVA04-251 XT61 (각각 서열식별번호: 139 및 140)의 결합을 평가하기 위해 단일 사이클 동역학으로 비아코어 동역학적 분석을 수행하였다. 아피머® 삼량체를 HSA-41과 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 결합 친화성 KD 값은 반감기 연장 아피머® 폴리펩티드가 포맷의 중간 또는 C-말단 단부에 있는지의 여부에 관계없이, 유사한 온/오프 비율이 관찰된 세 자릿수 nM 범위에 있었다 (도 44).
본원에 개시된 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 이들은 일부 경우에 문서 전체 내용을 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 단수 형태는 달리 명백히 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한 명백히 그 반대를 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 그 방법의 단계 또는 행위의 순서는 방법의 단계 또는 동작이 나열되는 순서로 반드시 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
상기 본 명세서 뿐만 아니라 청구범위에서, 모든 이행 문구, 예컨대 "포함하는", "포함한", "운반하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "로 구성된" 등은 개방형인 것으로, 즉 포함하나 그에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 명시된 바와 같이, 이행 문구 "로 이루어지는" 및 "로 본질적으로 이루어지는" 만이 각각 폐쇄형 또는 반폐쇄형 이행 문구일 것이다.
수치 앞의 용어 "약" 및 "실질적으로"는 나열된 수치의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상단과 하단 사이의 각각의 값이 본원에서 구체적으로 고려되고 기재된다.
SEQUENCE LISTING <110> Avacta Group PLC <120> SERUM ALBUMIN-BINDING AFFIMERS <130> A1224.70002WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/059,026 <151> 2020-07-30 <160> 181 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met 1 5 10 15 His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu 20 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Glu Asp Leu Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Gly Phe 20 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 Trp Thr Gln Pro Lys Asn Glu His His 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 His Leu Lys His Thr Asp Ala Gln Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 6 His Asp Gln Asp Val Leu His Ala Trp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 7 Lys Phe His Arg Gln Glu Trp Ala Asp 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 8 Pro Glu Asp Phe Trp Asp Pro Glu His 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 9 Val Val Arg Thr Thr Gly His Val Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 10 Tyr Trp Trp Phe Cys Thr Gly Gln Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 11 Ile His His Arg Gln Ala Arg Ser Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 12 Ser His Arg Arg Arg Ala Tyr Ile Trp 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 13 Trp Asp Ser His His Trp Arg Ala Pro 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 14 Asp Lys Arg Val Lys Tyr Gly Gln 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 15 Ser Asp Trp Val Tyr Ala Leu Gln Leu 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 16 Phe Trp Trp Phe Trp Tyr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 17 Val Arg Asp Trp Pro Trp Asn Thr Phe 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 18 Gln Lys Lys Arg Asp Glu Asp Tyr Ile 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 19 Gly Val His Glu Glu Pro Arg Lys Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 20 Glu Trp Trp Gln Lys His Trp Pro Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 21 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 22 Asp Trp Trp Gln Ala Lys Trp Pro His 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 23 Gly Ile Trp Gln Ser Arg Trp Pro Gly 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 24 Gly Tyr Trp Ala Ala Lys Trp Pro Gly 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 25 Gly Phe Tyr Ala Asp His Trp Pro Gly 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 26 Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Trp Pro Gly 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 27 Gly Phe Tyr Ala Arg His Trp Pro Gly 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 28 Asp Phe Trp Lys Ala His Trp Pro Gly 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 29 Asp Phe Tyr Ser Val Arg Trp Pro Gly 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 30 Tyr Trp Ala Ala Asn His Ala Ser Lys 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 31 Ile Lys Arg Leu Glu His Trp Glu Tyr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 32 Glu Trp Asp Ser Pro Trp Ser Glu Asn 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 33 Lys His Lys Asn Leu Arg Trp Pro Phe 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 34 Arg His Phe Pro Lys Gln Thr Asn Trp 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 35 Val Trp Gly Pro Glu Tyr Gln His Gln 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 36 Thr Trp Lys Asn Asn Gly Gln Asp Val 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 37 Ala Thr Trp Leu Asn Tyr Tyr Leu Pro 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 38 Asp Gln Glu Ser Leu Phe Leu Asn Asn 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 39 Gly Phe Tyr Ala Gln His Trp Pro Asp 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 40 Gly His Tyr Ala Arg Tyr Trp Pro Gly 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 41 Gly Phe Trp Ala Ser Lys Trp Pro Gly 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 42 Gly Phe Trp Gln Arg Lys Trp Pro Asn 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 43 Val Trp Pro Ala Asp Asn Asp Leu Lys 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 44 His Trp Ala Trp Thr Ser Pro Gly Tyr 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 45 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 46 His His Ser His Arg Leu Lys Gly Gln 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 47 Tyr Gln Asn Thr Ile Phe Leu Ser Ile 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 48 Phe Gln Asp Gln Phe Thr Trp Ser Gln 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 49 Gly Glu Pro His Trp Pro Trp Gln Ala 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 50 Ala Asp Pro Arg His Pro Trp Val Glu 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 51 Phe His Lys Arg Phe Gln Ser Gln Gly 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 52 Glu Trp Trp Gln Asn Arg Trp Pro Asn 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 53 Glu Trp Tyr Gln Thr Arg Trp Pro Gly 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 54 Glu Phe Trp Gln Arg His Trp Pro Gly 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 55 Lys Phe Tyr Glu Arg His Trp Pro Gly 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 56 Gly Trp Trp Gln Arg Arg Trp Pro Gly 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 57 Arg Phe Lys Tyr Phe Ala His Tyr Gln 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 58 Phe His Asp Phe Trp His Arg Arg Trp 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 59 Asp Trp Tyr His Tyr Trp Trp Glu Val 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 60 Ser Thr Arg Ser Ile His Val Thr Thr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 61 Lys Gln His His His Tyr Leu Asp Lys 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 62 His Ser Ala Gln Asp Arg Glu Ile Pro 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 63 Trp Val Gln Ser Gly Tyr Asn Ser Gln 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 64 Ala Val Phe Trp Gly Lys Trp Ser Asp 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 65 Gln Ser Phe Asp Lys Pro Trp Thr Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 66 His Tyr Pro Leu Lys Tyr Ser Phe Glu 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 67 Trp His His Pro Trp His Arg Asn Arg 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 68 Asp Pro Trp Trp Ala Trp Val Val Trp 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 69 Phe Asp Asn Gln Asp Leu Ile Gln Tyr 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 70 Glu Lys Lys Asn Trp Tyr Lys Trp Asp 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 71 Asp Arg His Lys Ser Arg Trp Gly Ile 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 72 Leu Asn Pro Phe Thr Pro Ser Val Thr 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 73 Tyr Lys Gly Ala Leu Leu Asn His Asp 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 74 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Glu Arg Gly 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 75 Tyr Lys Val His Gln Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 76 Phe His Pro Ile Ala Gly Arg Pro Trp 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 77 Phe Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Leu Gln 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 78 Phe Ala His Tyr Asn Leu Lys Ser Gly 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 79 Trp His Asn Tyr Gly Glu Ser Ser Gly 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 80 Lys Phe Tyr Tyr Ala Asp His Gln Trp 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 81 Tyr Thr His Ala Asp Pro His Ser Gln 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 82 Phe Gly Val Pro Gln Leu Gly Ala Gly 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 83 Tyr Ser Gly Phe Pro Phe Ala Gly Phe 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 84 Trp Phe Ser Trp Pro Tyr Thr Pro Leu 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 85 Tyr Tyr His Pro Ser Ile Gln Ser Thr 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 86 Phe Leu Gly Trp Lys Asp Thr Val Val 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 87 Asp Trp Trp Lys Trp Trp Trp Ala Lys 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 88 Asn Ala Gly Trp Pro Leu Val Pro Glu 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 89 Tyr Ala Leu Asp Pro Phe Gly Gly Lys 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 90 Gly Tyr Lys Phe Trp Gly Val Ser Asp 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 91 Gln Gly Lys Gln Tyr Ile Leu Leu Arg 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 92 Tyr Lys Arg His Ser Ala His Asp Tyr 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 93 Trp Ala Gln Lys Ser Lys Val His Gln 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 94 Phe Thr Ala Val Ser Lys Lys Asp Ala 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 95 Trp Gly Asp Lys Glu Asn Ile Trp Phe 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 96 Trp Ser Gly His Pro Trp Val Gln Lys 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 97 Tyr Ala Asp Tyr Pro Leu Ser Pro Lys 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 98 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 99 Gln Thr Val Ala Thr His Tyr His Tyr 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 100 Trp His Ala Lys His Leu Leu Ser His 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 101 Ser Gly Ile Lys Lys Ala Asp Ser Val 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 102 Lys Ala Asn Leu Ile Asn Val Lys Ser 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 103 Trp Lys Ser His Val Glu Val Arg Ser 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 104 Trp Val Thr Gln Lys Tyr Ile Ile Gln 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 105 Trp Glu His Ala Lys Asp Trp Pro Thr 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 106 Phe His Ser Lys Val Leu Asp Lys Ala 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 107 Tyr Gly Ala Gln Lys Gln Ala Val Trp 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 108 Phe Ser Ala Ser His Phe Thr Ser Gln 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 109 Xaa Xaa Ala Xaa Lys Xaa Asp Xaa Gln 1 5 <210> 110 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 110 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asp Trp Trp Gln Ala Lys Trp Pro His Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Tyr Lys Val His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 111 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 111 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Gly Tyr Trp Ala Ala Lys Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Phe Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Leu Gln Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 112 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 112 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp His Asn Tyr Gly Glu Ser Ser Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 113 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 113 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Val Trp Gly Pro Glu Tyr Gln His Gln Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Asn Ala Gly Trp Pro Leu Val Pro Glu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 114 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 114 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Gly His Tyr Ala Arg Tyr Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Ala Gln Lys Ser Lys Val His Gln Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 115 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 115 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Gly Phe Trp Ala Ser Lys Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Phe Thr Ala Val Ser Lys Lys Asp Ala Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 116 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 116 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 117 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 117 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Lys Glu His Gly Pro Asp Ser Trp Trp Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Gln Glu Lys Asn Gln Trp Val Glu Glu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ile 130 135 140 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 145 150 155 160 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 165 170 175 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 180 185 190 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 195 200 205 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 210 215 220 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 <210> 118 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 118 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Lys Glu His Gly Pro Asp Ser Trp Trp Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Gln Glu Lys Asn Gln Trp Val Glu Glu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 255 <210> 119 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 119 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala His Ala Tyr Gly Pro Arg Asp Trp Asp Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Pro Ala Asp His Val Leu Glu Glu Ala Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ile 130 135 140 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 145 150 155 160 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 165 170 175 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 180 185 190 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 195 200 205 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 210 215 220 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 <210> 120 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 120 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala His Ala Tyr Gly Pro Arg Asp Trp Asp Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Pro Ala Asp His Val Leu Glu Glu Ala Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 255 <210> 121 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 121 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Lys Glu Tyr Gly Pro Glu Glu Trp Trp Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Gly Asp Tyr Glu Gln Val Leu Ile His Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ile 130 135 140 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 145 150 155 160 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 165 170 175 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 180 185 190 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 195 200 205 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 210 215 220 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 <210> 122 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 122 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Lys Glu Tyr Gly Pro Glu Glu Trp Trp Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Gly Asp Tyr Glu Gln Val Leu Ile His Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 255 <210> 123 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 123 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 325 330 335 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 385 390 395 <210> 124 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 124 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Arg 325 330 335 Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 385 390 395 <210> 125 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 125 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Arg 325 330 335 Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 385 390 395 <210> 126 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 126 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 325 330 335 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Cys 385 390 395 <210> 127 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 127 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Phe Ala Leu Pro Glu Phe Glu Tyr Met Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Pro Met Ile Arg Arg Lys Asn Glu Val Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Phe Ala Leu Pro Glu Phe Glu Tyr Met Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Pro Met Ile Arg Arg Lys Asn Glu Val Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 325 330 335 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 385 390 395 <210> 128 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 128 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 325 330 335 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 385 390 395 <210> 129 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 129 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 255 <210> 130 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 130 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Cys 245 250 255 <210> 131 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 131 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 255 <210> 132 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 132 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ile 130 135 140 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 145 150 155 160 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 165 170 175 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn 180 185 190 Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 195 200 205 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 210 215 220 Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 245 250 <210> 133 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 133 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 115 120 125 Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr 130 135 140 Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys 145 150 155 160 Arg Thr Gly Asp <210> 134 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 134 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 20 25 30 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 35 40 45 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 50 55 60 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 65 70 75 80 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 85 90 95 Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 100 105 110 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 115 120 125 Ala Ala Gly Gly Arg Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 135 140 Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ala Pro Pro 165 170 175 Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala 180 185 190 Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu 195 200 205 Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 210 215 220 Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu 225 230 235 240 Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn 245 250 255 Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val 260 265 270 Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln 275 280 285 Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr 290 295 300 Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe 305 310 315 320 Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly 325 330 335 Asp <210> 135 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 135 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 20 25 30 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 35 40 45 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 50 55 60 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 65 70 75 80 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 85 90 95 Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 100 105 110 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 115 120 125 Ala Ala Gly Gly Arg Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 135 140 Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ala Pro Pro 165 170 175 Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala 180 185 190 Lys Glu Ala Glu Ala Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu 195 200 205 Asn Glu Ala Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 210 215 220 Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu 225 230 235 240 Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Ala 245 250 255 Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val 260 265 270 Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln 275 280 285 Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr 290 295 300 Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe 305 310 315 320 Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly 325 330 335 Asp <210> 136 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 136 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Leu Glu 20 25 30 Glu Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 65 70 75 80 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 85 90 95 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 100 105 110 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 115 120 125 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 130 135 140 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 165 170 175 Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 180 185 190 Leu Gly Ala Ala 195 <210> 137 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 137 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 20 25 30 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 35 40 45 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 50 55 60 Val Ser Ser Tyr Leu Leu Glu Glu Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 65 70 75 80 Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala 100 105 110 Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro 115 120 125 Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val 130 135 140 Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro 145 150 155 160 Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr 165 170 175 Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp 180 185 190 Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys 195 200 205 Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ala Glu Gln 210 215 220 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala Ala 225 230 235 <210> 138 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 138 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Ala Ala Gly Gly Arg Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 115 120 125 Leu Gly Cys Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ala Ala Gly His 130 135 140 His His His His His 145 <210> 139 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 139 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Asp 325 330 335 Trp Trp Gln Ala Lys Trp Pro His Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Tyr Lys Val His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 385 390 395 <210> 140 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 140 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala 180 185 190 Asp Trp Trp Gln Ala Lys Trp Pro His Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys 195 200 205 Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly 210 215 220 Pro Tyr Lys Val His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Asp Arg Val Leu Thr 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe Ala 245 250 255 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ile 275 280 285 Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu 290 295 300 Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn Glu Thr 305 310 315 320 Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu Ala Arg 325 330 335 Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val 340 345 350 Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro 355 360 365 Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly 370 375 380 Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 385 390 395 <210> 141 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 141 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 142 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 142 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys 85 90 95 Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 143 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Ala Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 144 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 144 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Ala Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 145 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 145 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Ala Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 146 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 146 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Ala Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 147 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 147 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Ala Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 148 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 148 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Ala Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 149 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 149 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Ala Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 150 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 150 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 151 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 151 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Ala Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 152 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 152 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Ala Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 153 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 153 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Ala Phe Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 154 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 154 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Ala Arg Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 155 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 155 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Ala Asn Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 156 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 156 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Ala Thr Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 157 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 157 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Ala Asp Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 158 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 158 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Ala Arg Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 159 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 159 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 160 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 160 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Lys Phe Arg Asn Thr Asp Arg Ala Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 161 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 161 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 20 25 30 Ala Ala Ala Lys 35 <210> 162 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 162 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 163 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> X may be G or S <400> 163 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Xaa 1 5 <210> 164 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 164 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 165 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 165 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 166 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, or Glu <220> <221> misc_feature <222> (50)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(70) <223> May be absent <220> <221> SITE <222> (71)..(71) <223> Xaa may be Gly, Ala, Val, Ser or Thr <220> <221> SITE <222> (92)..(92) <223> Xaa may be Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr <220> <221> SITE <222> (93)..(93) <223> Xaa may be Gly, Ala, Val, Ser or Thr <220> <221> SITE <222> (94)..(94) <223> Xaa may be Ala, Val, Ile, Leu, Gly or Pro <220> <221> misc_feature <222> (95)..(115) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(115) <223> May be absent <220> <221> SITE <222> (116)..(116) <223> Xaa may be Gly, Ala, Val, Asp or Glu <220> <221> SITE <222> (118)..(118) <223> Xaa may be Ala, Val, Ile, Leu, Arg or Lys <400> 166 Met Ile Pro Xaa Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala 65 70 75 80 Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn 115 120 125 Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 130 135 <210> 167 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (50)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(70) <223> May be absent <220> <221> misc_feature <222> (95)..(115) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(115) <223> May be absent <400> 167 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala 65 70 75 80 Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn 115 120 125 Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 130 135 <210> 168 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 168 His His His His His His 1 5 <210> 169 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 169 Gly Ile Trp Ala Ser Lys Trp Pro Gly Phe Xaa Xaa Xaa Ser Lys Xaa 1 5 10 15 Xaa Gln <210> 170 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 170 Gly Tyr Tyr Gln Arg Arg Trp Pro Gly Trp Xaa Xaa Xaa Ala Gly Xaa 1 5 10 15 Xaa Trp <210> 171 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 171 Gly Phe Trp Ala Ala Ala Trp Pro Gly Phe Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala <210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 172 Gly His Trp Ala Ser Lys Trp Pro Gly Phe Xaa Xaa Xaa Ser Lys Xaa 1 5 10 15 Xaa Gln <210> 173 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 173 Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Trp Pro Gly Trp His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Gly <210> 174 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 174 Asn Phe Phe Gln Arg Arg Trp Pro Gly Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Gly <210> 175 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 175 Glu Trp Trp Gln Xaa Arg Trp Pro Gly Tyr Xaa Xaa His Lys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 176 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 176 Asp Phe Tyr Gln Xaa Lys Trp Pro Asn Phe Xaa Xaa Lys Gln Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 177 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 177 Glu Trp Trp Gln Xaa His Trp Pro His Trp Xaa Xaa Ala Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 178 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 178 Glu Trp Trp Gln Xaa Arg Trp Pro Gly Tyr Xaa Xaa Gln Lys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be Trp or Phe <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be Trp or Phe <400> 179 Asn Xaa Xaa Gln Gln Arg Arg Trp Pro Gly 1 5 10 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be D, G, N, or V <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be W, Y, H, or F <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be W, Y, G, W, or F <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be Q, A, or P <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be A, Q, E, R, or S <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be K, R, or Y <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be W or Q <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be P or H <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be H, G, or Q <400> 180 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be Y, F, W, or N <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be K, P, H, A, or T <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be V, N, G, Q, A, or F <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be H, T, Y, W, K, V, or R <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be Q, S, G, P, or N <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be S, Y, E, L, K, or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be S, D, V, or K <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be G, L, S, P, H, D, or R <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be G, Q, E, or A <400> 181 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (60)

  1. pH 7.4에서 1x10-6 M 이하의 Kd로 인간 혈청 알부민 (HSA)과 결합하고, pH 6에서는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1/2 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 pH 7.4에서 1x10-7 M 이하의 Kd로, pH 7.4에서 1x10-8 M 이하의 Kd로, 또는 pH 7.4에서 1x10-9 M 이하의 Kd로 HSA와 결합하는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, pH 6에서의 폴리펩티드가 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1 로그 더 적은, pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 1.5 로그 더 적은, pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2 로그 더 적은, 또는 pH 7.4에서의 HSA와의 결합에 대한 Kd보다 적어도 2.5 로그 더 적은 Kd로 HSA와 결합하는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 환자에서 10시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 72시간 초과, 96시간 초과, 120시간 초과, 144시간 초과, 168시간 초과, 192시간 초과, 216시간 초과, 240시간 초과, 264시간 초과, 288시간 초과, 312시간 초과, 336시간 초과, 또는 360시간 초과의 혈청 반감기를 갖는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 환자에서 HSA의 혈청 반감기의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 또는 80% 초과의 혈청 반감기를 갖는 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식 (I)로 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
    FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I),
    여기서
    FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열식별번호: 1)와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
    FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열식별번호: 2)과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
    FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열식별번호: 3)와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
    Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고,
    n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이다.
  7. 제6항에 있어서,
    FR1이 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 또는 적어도 98% 동일성을 갖고/거나;
    FR2가 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 적어도 84%, 적어도 88%, 적어도 92%, 또는 적어도 96% 동일성을 갖고/거나;
    FR3이 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 것인
    폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서,
    FR1이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고/거나;
    FR2가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고/거나;
    FR3이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    폴리펩티드.
  9. 제6항에 있어서, 아미노산 서열이 일반식 (II)로 나타내어진 것인 폴리펩티드:
    MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 166) (II),
    여기서
    Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고;
    n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이고;
    Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, 또는 Glu이고;
    Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
    Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr이고;
    Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
    Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이고;
    Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고;
    Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이다.
  10. 제9항에 있어서, 아미노산 서열이 일반식 (III)으로 나타내어진 것인 폴리펩티드:
    MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKT
    QVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADR
    VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 167) (III),
    여기서
    Xaa는, 각 경우에 개별적으로, 아미노산이고; n은 3 내지 20의 정수이고, m은 3 내지 20의 정수이다.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 일반식 (IV)로 나타내어진 것인 폴리펩티드:
    aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (서열식별번호: 180) (IV),
    여기서
    aa1은 D, G, N, 및 V로부터 선택된 아미노산이고;
    aa2는 W, Y, H, 및 F로부터 선택된 아미노산이고;
    aa3은 W, Y, G, W, 및 F로부터 선택된 아미노산이고;
    aa4는 Q, A, 및 P로부터 선택된 아미노산이고;
    aa5는 A, Q, E, R, 및 S로부터 선택된 아미노산이고;
    aa6은 K, R, 및 Y로부터 선택된 아미노산이고;
    aa7은 W 및 Q로부터 선택된 아미노산이고;
    aa8은 P 및 H로부터 선택된 아미노산이고;
    aa9는 H, G, 및 Q로부터 선택된 아미노산이다.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, (Xaa)n이 서열식별번호: 4-55 중 어느 하나의 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, (Xaa)n이 서열식별번호: 22, 24, 26, 35, 40, 41, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)m이 일반식 (IV)로 나타내어진 것인 폴리펩티드:
    aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (서열식별번호: 181) (IV),
    여기서
    aa1은 Y, F, W, 및 N으로부터 선택된 아미노산이고;
    aa2는 K, P, H, A, 및 T로부터 선택된 아미노산이고;
    aa3은 V, N, G, Q, A, 및 F로부터 선택된 아미노산이고;
    aa4는 H, T, Y, W, K, V, 및 R로부터 선택된 아미노산이고;
    aa5는 Q, S, G, P, 및 N으로부터 선택된 아미노산이고;
    aa6은 S, Y, E, L, K, 및 T로부터 선택된 아미노산이고;
    aa7은 S, D, V, 및 K로부터 선택된 아미노산이고;
    aa8은 G, L, S, P, H, D, 및 R로부터 선택된 아미노산이고;
    aa9는 G, Q, E, 및 A로부터 선택된 아미노산이다.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)m이 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, (Xaa)m이 서열식별번호: 57-108 중 어느 하나의 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  19. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)m이 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, (Xaa)m이 서열식별번호: 75, 77, 79, 88, 93, 94, 및 98 중 어느 하나의 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 110-116 및 138 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 110-116 및 138 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  23. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 일반식 (IV)로 나타내어진 것인 폴리펩티드:
    aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV),
    여기서
    aa1은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa2는 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa4는 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa5는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa6은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa7은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa8은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa9는 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이다.
  24. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)m이 일반식 (IV)로 나타내어진 것인 폴리펩티드:
    aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV)
    여기서
    aa1은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa2는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa4는 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa5는 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa6은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa7은 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa8은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이고;
    aa9는 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이다.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이 시스테인 (C) 및 글리신 (G)으로부터 선택되고;
    중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이 알라닌 (A), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 프롤린 (P), 트립토판 (W), 및 발린 (V)으로부터 선택되고;
    중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 티로신 (Y)으로부터 선택되고;
    양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 및 리신 (K)으로부터 선택되고;
    음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이 아스파르테이트 (D) 및 글루타메이트 (E)로부터 선택되는 것인
    폴리펩티드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 시스테인을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서, 시스테인이 화학적 접합에 이용가능하고, 임의로 시스테인이 폴리펩티드의 C-말단 단부 또는 N-말단 단부에 위치하고, 임의로 폴리펩티드가 서열식별번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 융합 단백질을 형성하기 위해 아미드 결합을 통해 공유적으로 연결된 이종 폴리펩티드를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 치료용 폴리펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서, 치료용 폴리펩티드가 폴리펩티드 호르몬, 폴리펩티드 시토카인, 폴리펩티드 케모카인, 성장 인자, 지혈 활성 폴리펩티드, 효소 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  31. 제29항에 있어서, 치료용 폴리펩티드가 수용체 트랩 및 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  32. 제29항에 있어서, 치료용 폴리펩티드 서열이 혈관형성제 및 항혈관형성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  33. 제29항에 있어서, 치료용 폴리펩티드 서열이 신경전달물질이고, 임의로 신경전달물질이 뉴로펩티드 Y인 폴리펩티드.
  34. 제29항에 있어서, 치료용 폴리펩티드 서열이 적혈구생성-자극제이고, 임의로 적혈구생성-자극제가 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 모방체인 폴리펩티드.
  35. 제29항에 있어서, 치료용 폴리펩티드가 인크레틴이고, 임의로 인크레틴이 글루카곤, 위 억제성 펩티드 (GIP), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2), 펩티드 YY (PYY) 또는 옥신토모듈린 (OXM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 인간 환자에서 치료 용도로 적합한 제약 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  38. 제37항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  39. 제38항에 있어서, 전사 조절 서열이 프로모터 및 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 복제 기점, 미니염색체 유지 요소 (MME) 및/또는 핵 국재화 요소를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되고 그로 전사된 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 적어도 하나의 인트론 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열로 전사된 적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 데옥시리보핵산 (DNA)인 폴리뉴클레오티드.
  45. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 리보핵산 (RNA)인 폴리뉴클레오티드.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 미니서클.
  48. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  49. 제48항에 있어서, 링커를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 링커가 강성 링커인 융합 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 강성 링커가 서열식별번호: 161의 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  52. 제49항에 있어서, 링커가 가요성 링커인 융합 단백질.
  53. 제50항에 있어서, 가요성 링커가 서열식별번호: 165의 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 2개의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 분자를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  56. 제55항에 있어서, 치료용 분자가 치료용 폴리펩티드인 융합 단백질.
  57. 제56항에 있어서, 치료용 폴리펩티드가 호르몬, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 지혈 활성 폴리펩티드, 효소 및 독소로부터 선택되거나, 또는 호르몬, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 지혈 활성 폴리펩티드, 효소 및 독소의 길항제로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
  58. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 110의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  59. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  60. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
KR1020237006891A 2020-07-30 2021-07-30 혈청 알부민-결합 폴리펩티드 KR20230070201A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063059026P 2020-07-30 2020-07-30
US63/059,026 2020-07-30
PCT/EP2021/071421 WO2022023540A1 (en) 2020-07-30 2021-07-30 Serum albumin-binding polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230070201A true KR20230070201A (ko) 2023-05-22

Family

ID=77543465

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237006891A KR20230070201A (ko) 2020-07-30 2021-07-30 혈청 알부민-결합 폴리펩티드

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230272011A1 (ko)
EP (1) EP4188957A1 (ko)
JP (1) JP2023536584A (ko)
KR (1) KR20230070201A (ko)
CN (1) CN116419926A (ko)
AU (1) AU2021314982A1 (ko)
BR (1) BR112023001588A2 (ko)
CA (1) CA3187453A1 (ko)
IL (1) IL300243A (ko)
MX (1) MX2023001261A (ko)
TW (1) TW202221030A (ko)
WO (1) WO2022023540A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202332694A (zh) * 2021-10-07 2023-08-16 英商阿凡克塔生命科學公司 血清半衰期延長之ｐｄ－ｌ１結合多肽
WO2023218243A1 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 Avacta Life Sciences Limited Lag-3/pd-l1 binding fusion proteins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0807065D0 (en) * 2008-04-18 2008-05-21 Univ Leeds Novel scaffolds
GB201805963D0 (en) * 2018-04-11 2018-05-23 Avacta Life Sciences Ltd PD-L1 Binding Affirmers and Uses Related Thereto
WO2019236567A2 (en) * 2018-06-04 2019-12-12 Trustees Of Tufts College Tumor microenvironment-activated drug-binder conjugated, and uses related thereto
WO2021074683A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Avacta Life Sciences Limited Bispecific anti-pd-l1 and anti-fcrn polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023536584A (ja) 2023-08-28
TW202221030A (zh) 2022-06-01
BR112023001588A2 (pt) 2023-04-04
IL300243A (en) 2023-03-01
MX2023001261A (es) 2023-07-19
EP4188957A1 (en) 2023-06-07
WO2022023540A1 (en) 2022-02-03
AU2021314982A1 (en) 2023-03-02
US20230272011A1 (en) 2023-08-31
CN116419926A (zh) 2023-07-11
CA3187453A1 (en) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11859000B2 (en) Anti-CCR8 antibodies and uses thereof
TWI654201B (zh) Ｐｄ－１抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CA3188142A1 (en) Chemokine receptor antibodies binding sulfated trd motifs
KR20130056870A (ko) 피브로넥틴 ⅲ형 도메인에 기초한 다량체 스캐폴드
US20230272011A1 (en) Serum albumin-binding polypeptides
RU2749712C2 (ru) IL-17A-связывающие полипептиды
CN116063509A (zh) Cd40l-特异性tn3-衍生的支架及其使用方法
US20230272089A1 (en) Il2rg binding molecules and methods of use
JP2023538518A (ja) ＩＬ１０Ｒｂ結合分子および使用方法
US20210009706A1 (en) Anti-CD27 Antibody, Antigen-binding Fragment Thereof, and Medical Use Thereof
US20230322936A1 (en) Il10 receptor binding molecules and methods of use
US20230272090A1 (en) Il2rb binding molecules and methods of use
CN113045659B (zh) 抗cd73人源化抗体
RU2817008C9 (ru) Аффимеры, связывающиеся с неонатальным fc рецептором
RU2817008C1 (ru) Аффимеры, связывающиеся с неонатальным fc рецептором
US11485781B2 (en) Multiple specificity binders of CXC chemokines
US20230097573A1 (en) Neonatal fc receptor binding affimers
KR20220088428A (ko) 글리코실화된 ctla-4에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법
KR20220003562A (ko) 항-cd38 항체 및 제형
TW201102086A (en) Antibodies against human CCN1 and uses thereof
US20230279092A1 (en) Immunocytokines for treatment of autoimmune and inflammatory conditions
CA3238784A1 (en) Stapled peptide-antibody conjugates (spacs) and uses thereof
CN117835999A (zh) 用于增强治疗性抗体的方法和方式
CN116723859A (zh) IL27Rα结合分子及使用方法