KR20230067111A - 식후 혈중농도 균형 및 생체내 에너지 대사 조절을 위한 신개념의 지소화성 탄수화물 소재 개발 - Google Patents

식후 혈중농도 균형 및 생체내 에너지 대사 조절을 위한 신개념의 지소화성 탄수화물 소재 개발 Download PDF

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이병호
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가천대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법에 따르면, 종래보다 지소화성이 높은 알파한계덱스트린을 제조할 수 있다. 또한, 시작 기질이 전분이 아닌 자당으로, 전분으로 생산된 알파한계덱스트린보다 수율이 좋고, 분자량이 큰 이점이 있다. 생산된 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린은 분자량이 1.0 x 105 g/mol 이상이고, α-1,6 글리코사이드 결합의 비율이 15% 내지 35%인 것이 특징이다. 본 발명의 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린은 높은 지소화성을 나타내어, 식후 혈당의 증감을 약화시킬 수 있으며, 저혈당식으로 당뇨환자를 위한 환자식에 적용될 수 있다. 또한, 높은 용해도를 가져 물성에 큰 변화를 주지 않으므로, 음료의 첨가물로서 활용될 수 있다.

Description

식후 혈중농도 균형 및 생체내 에너지 대사 조절을 위한 신개념의 지소화성 탄수화물 소재 개발 {Development of novel slowly digestible carbohydrates for balanced postprandial glycemic response and regulation of energy metabolism}
본 발명은 거대분자 크기의 초고분지 알파한계덱스트린의 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는(A) 자당 분자를 아밀로수크라아제 및 글리코겐 분지 효소와 반응시켜 제1혼합물을 수득하는 단계;(B) 상기 두 효소를 실활시키고 제1혼합물로부터 불용성 알파글루칸을 제거하여 제2혼합물을 수득하는 단계;(C) 상기 제2혼합물을 알파-아밀라아제와 반응시켜 제3혼합물을 수득하는 단계;(D) 상기 제3혼합물로부터 고분지 알파한계덱스트린을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법에 관한 것이다.
최근 세계 보건 기구에 의해 심각한 대사성 질환으로 정의된 비만과 제2형 당뇨는 식이 탄수화물의 다량 섭취 후 나타나는 혈중 포도당 농도의 급격한 증감 및 이에 따른 인슐린의 과다분비로 인하여 생체 내 항상성 조절의 불균형이 주요 원인이 되는 대사 장애 질환이다. 정상인의 경우 제대로 된 포도당 대사 및 생체 내에 영양분 공급을 위해 적절한 양의 식이 탄수화물 섭취가 필요하기에, 최근에는 소화 초반의 포도당 스파이크 현상을 억제하고, 지속적으로 에너지를 공급하여 생체 내 항상성 유지에 도움을 줄 수 있는 탄수화물 소재가 주목을 받고 있다.
한편, 종래에는 전분으로부터 알파한계덱스트린(α-limit dextrin)을 제조하여 소장 내에서 서서히 분해되는 지소화성 효과를 얻고자 하였다. 이 경우에도 전분 유래의 알파한계덱스트린의 구조적 특성상 그 분자 크기 및 전분 내에서의 함량의 제한으로 인하여 산업적으로 생산하고 활용하기에는 어려움이 있다. 이와 같이 높은 지소화성을 발휘하는 소재의 개발 및 산업적으로 유용한 제조방법이 요구되는 실정이다.
본 발명은 식후 혈당의 급격한 증감을 억제함과 동시에 에너지를 지속적으로 공급하고, 생체 내에서 천천히 소화됨에 따라 식이조절 호르몬의 분비를 촉진할 수 있는 새로운 형태의 지소화성 소재와 그 제조방법을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는(A) 자당 분자를 아밀로수크라아제 및 글리코겐 분지 효소와 반응시켜 제1혼합물을 수득하는 단계;(B) 상기 두 효소를 실활시키고 제1혼합물로부터 불용성 알파글루칸을 제거하여 제2혼합물을 수득하는 단계;(C) 상기 제2혼합물을 알파-아밀라아제와 반응시켜 제3혼합물을 수득하는 단계;(D) 상기 제3혼합물로부터 고분지 알파한계덱스트린을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법을 제공한다.
여기서, 상기 아밀로수크라아제는 Neisseria polysaccharea로부터 유래한 것이고, 상기 글리코겐 분지 효소는 Rhodothermus obamensis, Synechocytis sp. PCC 6803 및 Bifidobacterium thermophilum 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1혼합물은 pH 6.0 내지 9.5인 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 효소의 실활은 제1혼합물의 온도를 80℃ 이상으로 높여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 불용성 알파글루칸의 제거는 원심분리를 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 단계(D)는 투석 또는 크로마토그래피로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 단계(C)의 알파-아밀라아제와의 반응은 34 내지 39℃에서 20~30시간 동안 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예는 분자량이 1.0 x 105 g/mol 이상이고, α-1,6 글리코사이드 결합의 비율이 15% 내지 35%인 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린을 제공한다.
여기서, 상기 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린은 전술한 제조방법에 따라 제조된 것을 특징으로 할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
본 발명의 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린은 생체 내 소화 모델에서 혈중 포도당 농도의 급격한 증감을 제어함과 동시에 지속적으로 에너지를 공급할 수 있고, 식이조절 호르몬의 분비를 자극시킬 수 있다. 본 발명의 거대분자 크기의 초고분지 알파한계덱스트린은 생체 내 소화모델에서 균형 잡힌 포도당 항상성을 유지할 수 있는 높은 지소화성을 나타내어, 당뇨환자를 위한 환자식에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법에 의하면, 지소화성이 현저히 우수한 알파한계덱스트린을 제조할 수 있다. 또한, 상기 제조방법의 시작 기질은 전분이 아닌 자당으로, 상기 제조방법은 전분으로 제조하는 방법에 비해 수율이 좋고, 수득된 알파한계덱스트린의 분자량이 큰 이점이 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 실시예 1에 따라 제조된 알파글루칸에 실시예 2에 따라 알파-아밀라아제 처리 후 투석 전(실선)과 후(점선) 시료를 고성능 크기배제 크로마토그래피로 비교 분석한 결과이다.
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 초고분지 알파글루칸 및 이에 추가로 실시예 2를 거쳐 제조된 초고분지 알파한계덱스트린의 절대분자량을 고성능 크기배제 크로마토그래피와 레이저 광 산란 검출기로 비교 분석한 결과이다.
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 초고분지 알파글루칸 및 이에 추가로 실시예 2를 거쳐 제조된 초고분지 알파한계덱스트린의 포유류 유래 소장 알파-글루코시다아제에 의한 분해속도를 포도당의 유리 속도로 비교 분석한 결과이다.
도 4는 실시예 1에 따라 제조된 초고분지 알파글루칸 및 이에 추가로 실시예 2를 거쳐 제조된 초고분지 알파한계덱스트린 투여에 따른 혈중 포도당 변화를 비교 분석한 결과이다.
도 5는 실시예 1에 따라 제조된 초고분지 알파글루칸 및 이에 추가로 실시예 2를 거쳐 제조된 초고분지 알파한계덱스트린 투여에 따른 인슐린 변화를 비교 분석한 결과이다.
도 6은 실시예 1에 따라 제조된 초고분지 알파글루칸 및 이에 추가로 실시예 2를 거쳐 제조된 초고분지 알파한계덱스트린 투여에 따른 식이조절 호르몬의 변화를 비교 분석한 결과이다.
도 7은 각기 다른 글리코겐 분지 효소의 적용을 통해 생산된 초고분지 알파글루칸 시료들의 분자크기를 고성능 크기배제 크로마토그래피를 통하여 비교 분석한 결과이다.
도 8은 각기 다른 글리코겐 분지 효소의 적용을 통해 생산된 초고분지 알파글루칸 및 알파한계덱스트린에 탈분지 효소 처리를 통해 가지 사슬 길이의 분포를 분석한 결과이다.
도 9는 각기 다른 글리코겐 분지 효소의 적용을 통해 생산된 초고분지 알파글루칸 및 알파한계덱스트린의 절대분자량을 고성능 크기배제 크로마토그래피와 레이저 광 산란 검출기를 통해 분석한 결과이다.
도 10은 포유류 유래의 소장 알파-글루코시다아제에 의한 분해속도(포도당의 유리 속도)를 갖는 것을 나타낸다.
도 11은 각기 다른 글리코겐 분지 효소의 적용을 통해 생산된 초고분지 알파글루칸 및 알파한계덱스트린에 네 종류의 인간 재조합 소장 알파-글루코시다아제를 각각 처리하여 나타난 양성 대조군(말토덱스트린 덱스트로스 당량:1) 대비 상대적 소화율을 나타낸 그림이다. 이때, A는 말타아제(maltase), B는 글루코아밀라아제(glucoamylase), C는 이소말타아제(isomaltase), D는 수크라아제-이소말타아제 복합체(sucrase-isomaltase complex)를 처리한 결과이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 “글루칸”(glucan)은 글루코스(glucose)의 폴리머인 다당류로, 글루코스 잔기가 서로 글리코시딕 결합(glycosidic bond)으로 연결되어 있는 것을 의미하며, α-글리코시딕 결합만을 포함하는 α-글루칸(알파글루칸)과 β-글리코시딕 결합만을 포함하는 β-글루칸이 있다.
본 명세서에서 “한계덱스트린”(limit dextrin)은 아밀로펙틴, 전분, 글리코겐 등 초고분지 알파글루칸에 아밀라아제를 처리(완전한 가수분해(exhaustive hydrolysis))하고 남은 초고분지 탄수화물 핵(core)를 일컫는 말로, “알파한계덱스트린”(α-limit dextrin)은 알파-아밀라아제를 처리한 경우의 생성물을 의미한다.
이하, 이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일측면은(A) 자당 분자를 아밀로수크라아제 및 글리코겐 분지 효소와 반응시켜 제1혼합물을 수득하는 단계;(B) 상기 두 효소를 실활시키고 제1혼합물로부터 불용성 알파글루칸을 제거하여 제2혼합물을 수득하는 단계;(C) 상기 제2혼합물을 알파-아밀라아제와 반응시켜 제3혼합물을 수득하는 단계;(D) 상기 제3혼합물로부터 고분지 알파한계덱스트린을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법을 제공한다.
여기서 아밀로수크라아제(EC 2.4.1.4, amylosucrase) 및 글리코겐 분지 효소(EC 2.4.1.18, glycogen branching enzyme)는 각각 당전이 효소의 일종인 헥소실전이 효소(hexosyltransferase)에 속한다.
상기 아밀로수크라아제는 하기 식(1)과 같은 반응을 촉매할 수 있다.
G-F+n(G-F)→Gn-G-F+nF 식(1)
상기 식(1)에서, G-F는 자당(sucrose), G는 글루코스(glucose), F는 프럭토스(fructose), Gn-G-F는 α-1,4-글루칸이다.
상기 글리코겐 분지 효소는 글루칸 분지 효소 또는 녹말 분지 효소 등으로 불리며, 이미 존재하는 α-1,4-글루칸의 α-1,4-글리코시딕 연결을 끊고, 이렇게 생성된 비환원 말단 단편을 상기 끊어진 α-1,4-글루칸 또는 다른 α-1,4-글루칸에 α-1,6 연결로 연결시키는 반응을 매개할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 상기 아밀로수크라아제 및 상기 글리코겐 분지 효소는 동시에 투입되어, 상기 아밀로수크라아제는 기질인 자당 유래의 글루코스 잔기를 α-1,4 연결로 다른 글루코스 잔기에 전이시켜 α-1,4-글루칸 사슬을 연장하고, 상기 글리코겐 분지 효소는 이들 α-1,4-글루칸 사슬 일부를 절단하여 가지를 형성하는 반응이 병행하여 진행됨으로써 초고분지, 고분자량의 알파글루칸이 효율적으로 합성될 수 있다.
상기 아밀로수크라아제 및 글리코겐 분지 효소는 바람직하게 10:1 내지 1:10, 바람직하게 5:1 내지 1:5, 더욱 바람직하게 2:1 내지 1:2, 가장 바람직하게 1:1에 가깝게 투입될 수 있다. 참고로, 후술할 실시예에서 데이터를 기재하지는 않았으나, 상기 비율이 1:2인 경우 수율이 높아지고 분자량이 미세한 수준으로 낮아진 것을 확인한 바 있다.
상기 아밀로수크라아제는 바람직하게 원핵생물로부터 유래한 것일 수 있고, 더욱 바람직하게 Neisseria 속에 속한 박테리아로부터 유래한 것일 수 있으며, 가장 바람직하게 Neisseria polysaccharea로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 글리코겐 분지 효소는 바람직하게 원핵생물로부터 유래한 것일 수 있고, 더욱 바람직하게 Rhodothermus obamensis Synechocytis sp. PCC 6803 및 Bifidobacterium thermophilum 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1혼합물은 pH 6.0 내지 9.5인 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 pH는 바람직하게 7.0 내지 9.0, 더욱 바람직하게 7.5 내지 8.5일 수 있으며, 상기 아밀로수크라아제 및 상기 글리코겐 분지 효소가 최적 활성을 가질 수 있는 pH로 선택하는 것이 바람직하다. 상기 완충용액은 pKa가 6.0 내지 9.5, 바람직하게 7.0 내지 9.0, 더욱 바람직하게 7.5 내지 8.0인 염을 포함하는 완충용액이면 사용할 수 있고, 일반적으로 효소 반응에 이용되는 Tris 완충용액, 인산완충용액, HEPES, MOPS, BES 완충용액을 그 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 효소의 실활은 제1혼합물의 온도를 80℃ 이상, 바람직하게 90℃ 이상으로 높여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 실활은 일반적으로 효소의 활성을 떨어뜨리는 방법을 사용할 수 있으나, 이후에 다른 효소(알파-아밀라아제)에 의한 반응이 진행되는 단계가 있으므로, pH, 염 농도 등을 변화시키거나 저해제를 투입하는 등 이후 효소 반응의 효율을 떨어뜨릴 수 있는 물질을 투여하지 않는 방법을 이용하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 불용성 알파글루칸의 제거는 원심분리를 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 외에도 침전 등 불용성 알파글루칸을 분리할 수 있는 방법이 있으나, 공정의 효율 및 확실한 분획을 통한 제거 측면에서 원심분리가 바람직할 수 있다.
상기 알파-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1)는 가수분해효소(hydrolase)의 일종인 글리코시다아제(glycosidase)에 속하는 효소로서, 3개 이상의 글루코스가 연결되어 있는 당 사슬의 말단이 아닌 내부 α-1,4-글리코시딕 연결을 가수분해하는 엔도가수분해효소(endohydrolase)이다.
상기 단계(C)의 알파-아밀라아제와의 반응은 34 내지 39℃에서 20~30시간 동안 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 완전한 가수분해(exhaustive hydrolysis)가 이루어질 수 있도록 알파-아밀라아제가 최적 활성을 가질 수 있는 온도에서 충분한 시간 동안 기질과 반응할 수 있게 하기 위함이며, 이를 통해 알파한계덱스트린이 생성될 수 있다. 상기 온도는 바람직하게 35 내지 37℃일 수 있다. 상기 시간은 지나치게 짧아질 경우 가수분해가 충분히 이루어지지 않을 수 있으며, 지나치게 길어질 경우 제조공정의 효율 및 위생상 바람직하지 않다.
상기 단계(D)는 투석 또는 크로마토그래피로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 투석으로 수행될 수 있다. 크로마토그래피는 샘플을 레진에 통과시키는 과정으로 이루어져 다량의 샘플을 처리하기에는 시간과 비용이 상대적으로 높게 들 수 있는 반면, 투석막은 저렴하며 설비가 간단한 편이며, 목적에 적합한 분자량에 맞게 구매하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 상기 단계(D)는 빠르게 소화되어 혈당을 급격히 상승시킬 수 있는 직쇄 형태를 가지는 말토올리고당 및 분자량이 낮은 산물을 제거하기 위한 단계로, 상기 투석 또는 크로마토그래피 외에도 크기 기반의 분리가 가능한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
이렇게 알파-아밀라아제와 충분히 반응시킨 생성물에서 직쇄형 말토오스 및 기타 저분자 생성물을 크기 기반의 분리방법, 예컨대 투석이나 크로마토그래피 처리함으로써 본 발명의 고분자, 초고분지 알파한계덱스트린을 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면은 분자량이 1.0 x 105 g/mol 이상, 바람직하게 1.0 x 106 g/mol 이상이고, α-1,6 글리코사이드 결합의 비율이 15% 내지 35%인 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린을 제공한다. 상기 알파한계덱스트린은 분자량이 1.0 x 105 g/mol 내지 1.0 x 108 g/mol일 수 있다. 이처럼 분자량이 높고 α-1,6 글리코사이드 결합의 비율이 높은 본 발명의 알파한계덱스트린은 높은 지소화성을 가져 식후 혈당의 증감을 약화시킬 수 있어 당뇨환자를 위한 환자식에 적용될 수 있다. 또한, 높은 용해도를 가져 물성에 큰 변화를 주지 않으므로, 음료의 첨가물로서 활용될 수 있다.
여기서, 상기 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린은 전술한 제조방법에 따라 제조된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 생체 내 소화모델에서 천천히 소화됨에 따라 급격한 혈당의 증감을 억제하며, 지속적인 에너지를 공급할 수 있는 지소화성 탄수화물 소재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 두 당전이 효소에 의해 자당으로부터 초고분지 알파글루칸을 합성한 후, 알파-아밀라아제에 의해 분해될 때 나타나는 초고분지 알파한계덱스트린을 정제하는 단계를 포함하는, 식후 혈당 조절에 효과적인 지소화성 탄수화물 소재의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 탄수화물 소재는, 분자량이 1.0 x 105 g/mol 이상이고, α-1,6 글리코사이드 결합의 비율이 15% 내지 35%인 것을 특징으로 하며, 이러한 소재는 높은 지소화성을 가져 식후 혈당의 증감을 약화시킬 수 있어 당뇨환자를 위한 환자식에 적용될 수 있다. 또한, 높은 용해도를 가져 물성에 큰 변화를 주지 않으므로, 음료의 첨가물로서 활용될 수 있다.
본 발명의 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법에 따르면, 종래보다 지소화성이 높은 알파한계덱스트린을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 그 시작 기질이 전분이 아닌 자당으로, 자당은 저가 원료이며, 상기 제조방법은 전분을 변형하는 것에 비해 용이하다는 장점이 있다. 본 발명에 따라 제조된 알파한계덱스트린은 전분으로 생산된 알파한계덱스트린보다 수율이 좋고, 분자량이 큰 이점이 있다.
[실시예 1: 초고분지 알파글루칸 합성]
본 실시에서는 자당으로부터 아밀로수크라제와 글리코겐분지 효소를 활용하여 초고분지 알파글루칸을 합성하였으며, 그 과정은 아래와 같았다.
1. 50 mM 트리스완충용액(pH 8.0)에서 100 mM 자당을 기질로 하여 Neisseria polysaccharea 아밀로수크라아제(amylosucrase)(NpAS, 1.0 U/mL)와 Rhodothermus obamensis 글리코겐 분지 효소(glycogen branching enzyme)(RoGBE, 1.0 U/mL)을 24시간 반응시켰다.
2. 효소반응을 종결하기 위해 10분간 끓여준 후, 원심분리(10,000 x g, 20 min)를 통해 불용성의 알파글루칸을 제거한 후, 상등액을 dialysis membrane(MWCO: 3500)을 이용하여 투석하여 초고분지 알파글루칸을 수득하여 동결건조하였다.
[실시예 2: 초고분지 알파한계덱스트린 생산]
1. 실시예 1에서 수득한 초고분지 알파글루칸을 deionized water를 이용하여 시료용액을(1%, w/v) 제조한 후, 1.0 U/mL의 human pancreatic 알파-아밀라아제(α-amylase) 또는 1.0 U/mL의 Aspergillus oryzae 알파-아밀라아제를 37°C에서 24시간 처리하였다.
2. 알파한계덱스트린을 얻기 위해 dialysis membrane(MWCO: 3500)을 이용한 투석처리를 통해 직쇄상의 말토올리고당을 제거한 후, 동결건조하였다.
[실험예 1: 알파-아밀라아제에 의한 초고분지 알파글루칸 가수분해 후의 초고분지 알파한계덱스트린의 정제 및 구조특성 분석]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 초고분지 알파글루칸에 알파-아밀라아제를 이용한 가수분해 후 나타나는 초고분지 알파한계덱스트린을 정제하고, 상기 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 구조특성을 분석하였다.
(1-1). 초고분지 알파글루칸으로부터의 초고분지 알파한계덱스트린 생산 및 분리/정제
Aspergillus oryzae 알파-아밀라아제를 이용하여 초고분지 알파글루칸의 분해특성을 고성능 크기배제 크로마토그래피(High performance size exclusion chromatography, HPSEC)를 통해 확인한 결과, 도 1과 같이 상당히 높은 비율의 거대 크기의 알파한계덱스트린이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, dialysis membrane(MWCO: 3500)을 이용한 투석처리를 통해 직쇄상의 말토올리고당 및 저분자 산물이 모두 제거되고 고분자 알파한계덱스트린이 정제되는 것을 확인할 수 있었다.
(1-2) 고성능 크기배제 크로마토그래피와 레이저 광 산란 검출기(Multi-angle laser-light scattering, MALS)를 이용한 분자량 분석
초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 분자량을 HPSEC-MALS를 통해 확인한 결과(도 2), 초고분지 알파글루칸과 초고분지 알파한계덱스트린은 각각 분자량이 4.91 x 107g/mol, 0.55x107g/mol 내외인 것으로 나타났다. 이를 통해 초고분지 알파한계덱스트린은 알파-아밀라아제의 가수분해 반응을 통해 생산되었음에도 불구하고 아주 높은 분자량을 나타내는 것을 알 수 있다.
(1-3) 핵자기공명기법(Nuclear magnetic resonance, NMR) 분석
각각의 다른 분지구조의 알파한계덱스트린에 포함된 α-1,4 결합과 α-1,6 결합의 함량을 핵자기공명기법(Nuclear magnetic resonance, NMR)을 통해 확인하고, 아래 표 1과 같이 각 결합의 상대적인 비율로 나타내었다.
Sample α-1,4 linkages(%) α-1,6 linkages(%) Ratio of α-1,4 to α-1,6
Maltose 100 0 -
Maltodextrins
(DE 10)		 94.6 ± 0.2a 5.4 ± 0.2c 17.5 ± 0.3a
Highly branched
α-glucan		 91.2 ± 0.2b 8.8 ± 0.2b 10.3 ± 0.2b
Macro-sized branched α-limit dextrins 82.3 ± 0.2c 17.7 ± 0.2a 4.6 ± 0.1c
초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 분지 결합 비율을 1H NMR을 이용하여 확인한 결과(표 1), 초고분지 알파글루칸의 α-1,6 결합, 즉 분지결합의 비율(8.8 ± 0.2%)에 비해 초고분지 알파한계덱스트린의 분지결합 비율(17.7 ± 0.2%)이 크게 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 초고분지 알파글루칸이 치밀한 분지구조로 구성됨에 따라 내부의 α-1,4 결합을 절단할 수 있는 엔도형(endo-type) 효소인 알파-아밀라아제의 접근을 구조적으로 저해하여 나타나는 것으로 판단된다.
(1-4) 알파-글루코시다아제에 의한 포도당 생성 속도 확인
초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 소화속도를 포유류 유래의 소화효소를 이용하여 확인한 결과(도 3), 포유류 유래의 소화효소에 의해 초고분지 알파한계덱스트린이 초고분지 알파글루칸에 비해 더 낮은 소화속도를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린은 72시간 후에 완전히 분해되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린이 소화되지 않는 난소화성의 소재가 아니라, 천천히 분해되어 지속적으로 에너지를 공급할 수 있는 지소화성소재임을 의미한다. 즉, 초고분지 알파한계덱스트린은 초고분지 알파글루칸에 비해 더욱 극대화된 지소화성을 나타내며, 이는 탄수화물 기반의 지소화성 소재로서 식품산업에 응용하기 적합한 성질이다.
(1-5) 초고분지 알파글루칸 및 초고분지/고분자 알파한계덱스트린의 체내 동태 특성 연구를 통한 소화패턴 분석 생리적 기능성 연구
초고분지 알파글루칸 및 거대 크기의 알파한계덱스트린에 대한 식후 혈당 반응을 각 샘플을 마우스에 투여하여 확인한 결과, 도 4와 같이 두 샘플 모두 포도당(대조군)과 비교하여 연장된 혈당 반응을 분명히 나타내었다.
그러나 상기 두 샘플은 식사 직후에 나타나는 반응에서 차이를 나타내었는데, 거대 크기의 알파한계덱스트린은 대조군과 비교하여 식후 포도당 스파이크를 30 내지 60 분 사이에서 유의하게 억제한 반면(p<0.05), 알파글루칸의 경우 대조군과 유의미한 차이가 없었다. 이는 초고분지 알파글루칸은 소화 후 다량의 선형 말토올리고당(주로 말토스 및 말토트라이오스)이 방출가능한 상태이기 때문이다. 따라서, 거대 크기 및 고도로 분지 된 특성을 갖는 알파한계덱스트린의 포도당으로의 소화는 위장관을 통과하는 동안 유의미하게 (p<0.05) 조절될 수 있음을 확인할 수 있다.
특히, 두 샘플로부터 120 내지 180 분 사이의 혈당 반응은 대조군보다 유의하게(p<0.05) 높았으며, 이는 포도당, 즉 생물학적 에너지가 신체에 지속적으로 공급될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 거대분자 크기 및 높은 분지밀도를 갖는 알파한계덱스트린이 포도당을 체내로 연장시켜 전달할 수 있으며, 이는 식후 포도당스파이크를 억제하는 중요한 접근법으로 고려될 수 있음을 시사한다.
다음으로, 상기 마우스에서 샘플 투여 후 시간에 따른 인슐린 분비를 확인하였다. 인슐린의 분비 수준은 거대 크기의 알파한계덱스트린의 투여에 따라 효과적으로 조절되었다(도 5). 특히 식후 30 분에서 인슐린 분비 수준은 거대 크기의 알파한계덱스트린의 섭취에 따라 포도당 대조군보다 유의하게(p<0.05) 낮게 나타났으며, 이는 거대 크기의 알파한계덱스트린의 섭취를 통해 초기 소화가 지연됨에 따라 낮은 수준의 혈당 자극이 일어나 인슐린 반응을 조절함에 있어 효과적으로 작용할 수 있음을 의미하는 것으로 판단된다.
따라서, 본 발명의 거대 크기 알파한계덱스트린은 인체에서 균형잡힌 포도당 항상성을 유발하는 혈당 및 인슐린 반응을 조절함으로써 비만 및 제 2 형 당뇨병을 포함한 대사 질환에 대한 치료 전략으로 적용될 수 있을 것으로 예상된다.
다음으로, 상기 마우스에서 샘플 투여 후 시간에 따른 식이조절호르몬인 펩타이드 YY(PYY)의 혈중 농도를 확인하였다. 거대 크기의 알파한계덱스트린은 글루코스를 투여한 대조군에 비해 60 분과 120 분 사이에 PYY의 분비 수준을 유의하게(p<0.05) 자극했으며, 해당 마우스 모델에서 360 분까지 호르몬 분비가 여전히 있는 것으로 보인다(도 6).
기존 연구에서 천천히 소화 가능한 탄수화물이 소장의 회장 부분에 주로 분포된 내분비 L-세포로부터 PYY 및 GLP-1과 같은 식이 관련 호르몬의 분비를 자극할 가능성이 있다고 제안된 바 있다. 이에 따라, 전술한 바와 같이 유익한 생리학적 효과를 갖는 거대 크기의 알파한계덱스트린은 소장 운동성을 감소시킴으로써 균형 잡힌 포도당 항상성 시스템에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
[실시예 3: 글리코겐 분지 효소의 교체를 통한 다양한 초고분지 알파글루칸 합성]
본 실시에서는 실시예 1에 명시된 방법과 동일하게 진행하되, 반응에 첨가되는 당전이 효소 중 Rhodothermus obamensis 글리코겐 분지 효소(RoGBE, 1.0 U/mL)를 Synechocytis sp. PCC 6803 (SsGBE, 1.0 U/mL)과 Bifidobacterium thermophilum (BtGBE, 1.0 U/mL) 유래의 글리코겐 분지 효소로 각각 대체하여 초고분지 알파글루칸을 합성하였다. 이후 실시되는 과정은 실시예 1과 동일하다.
[실시예 4: 글리코겐 분지 효소의 변화를 통한 다양한 초고분지 알파한계덱스트린 생산]
1. 실시예 3에서 생산된 초고분지 알파글루칸을 deionized water를 이용하여 시료용액을(1%, w/v) 제조한 후, Aspergillus oryzae α-amylase를 추가하여 37°C에서 24시간 동안 반응시켰다.
2. 이후 dialysis membrane(MWCO: 3500)을 이용한 투석처리를 통해 직쇄상의 말토올리고당을 제거하여 알파한계덱스트린을 수득하여 동결건조하였다.
[실험예 2: 글리코겐 분지 효소를 교체하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 이의 알파-아밀라아제 가수분해 후 수득된 초고분지 알파한계덱스트린의 정제 및 구조특성 분석]
본 실험예에서는 실시예 3에 따른 초고분지 알파글루칸에 알파-아밀라아제를 이용한 가수분해 후 나타나는 초고분지 알파한계덱스트린에 대하여 상기 실험예 1의 분석 방법을 이용해 구조특성을 분석하였다.
(2-1) 서로 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸에 알파-아밀라아제를 처리하여 생성된 생성물의 상대분자량 분석
실시예 3과 같이 각기 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸에 알파-아밀라아제를 처리하여 알파한계덱스트린을 제조하였다. 서로 다른 글리코겐 분지 효소를 처리하는 단계를 포함하여 제조된 세 알파한계덱스트린 샘플 모두 Region A(알파한계덱스트린 영역) 및 Region B(직쇄상의 말토올리고당 영역)으로 구분됨을 확인하였다. 각 샘플에 추가로 실시예 4와 같은 방법으로 투석을 통하여 직쇄상의 말토올리고당을 제거해 초고분지 알파한계덱스트린 영역만 수득하였다.
(2-2) 서로 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸에 알파-아밀라아제를 처리하여 생성된 생성물의 상대분자량 분석
실시예 3에 따라 제조된 초고분지 알파글루칸 및 이에 실시예 4를 따라 제조된 알파한계덱스트린에 포함된 알파-1,4 결합과 알파-1,6 결합의 함량을 핵자기공명기법(Nuclear magnetic resonance, NMR)을 통해 분석하고, 그 결과를 아래 표 2과 같이 각 결합의 상대적인 비율로 나타내었다.
Microbial source of glycogen branching enzyme Sample type α-1,4
linkages(%)		 α-1,6
linkages(%)		 Ratio of α-1,4 to α-1,6
Rhodothermus obamensis HBαG 91.0 ± 0.1 9.0 ± 0.2 10.1 ± 0.1
Branched
α-LDx		 72.4 ± 0.2 27.6 ± 0.2 2.6 ± 0.1
Synechocytis sp.
PCC 6803		 HBαG 92.0 ± 0.1 8.0 ± 0.1 11.5 ± 0.1
Branched
α-LDx		 69.1 ± 0.2 30.9 ± 0.2 2.2 ± 0.1
Bifidobacterium thermophilum HBαG 89.1 ± 0.2 10.9 ± 0.2 8.2 ± 0.2
Branched
α-LDx		 73.4 ± 0.3 26.6 ± 0.3 2.8 ± 0.1
초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 분지 결합 비율을 1H NMR을 이용하여 확인한 결과(표 2), 초고분지 알파글루칸의 분지결합 비율(8.0-10.9%) 및 초고분지 알파한계덱스트린의 분지결합 비율(26.6-30.9%)이 각각 적용된 글리코겐 분지 효소마다 상이한 것을 확인할 수 있었다. Synechocytis sp. PCC 6803 및 Bifidobacterium thermophilum 유래 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린도 Rhodothermus obamensis와 유래 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린과 동일하게 알파-아밀라아제 처리 후 알파-1,6 결합의 비율이 유의미하게 증가하였다. 이러한 결과는 아밀로수크라아제는 생성물의 분자량과 연관이 있으며, 글리코겐 분지 효소는 유래에 따라 알파글루칸 내부 분지밀도에 영향을 미치는 것으로 해석할 수 있다.
(2-3) 서로 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 가지사슬 분포도 분석
서로 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린에 탈가지효소 처리를 통하여 알파-1,6 결합을 분해하여 선형 말토올리고당으로 변환시키고, 그 가지사슬의 길이를 음이온교환크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography)를 이용하여 분석하였다(도 8). 세 샘플 모두 초고분지 알파한계덱스트린의 가지사슬이 가장 짧은 특성을 보이는 가운데 긴 가지사슬을 가졌던 알파글루칸은 Synecocytis sp. PCC6803의 글리코겐 분지 효소를 처리한 샘플이었으며, 알파글루칸/한계덱스트린의 가지사슬이 제일 짧은 샘플은 Bifidobacterium thermophilum의 글리코겐 분지 효소를 처리한 샘플로 나타났다.
(2-4) 서로 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 절대분자량 분석
각기 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린을 HPSEC-MALS를 통해 분석한 결과(도 9), Rhodothermus obamensis, Synechocytis sp. PCC6803, Bifidobacterium thermophilum 유래 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸의 분자량은 각각 7.53 x 107g/mol, 1.73 x 108 g/mol, 3.29 x 107 g/mol로 나타났다. 추가로 알파-아밀라아제 처리를 통하여 생산된 알파한계덱스트린의 분자량을 확인한 결과 모두 1.07 x 106 내지 1.86 x 107 사이 값으로 나타나, 이 역시 거대분자임을 확인하였다.
(2-5) 서로 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 쥐 소장 유래 알파-글루코시다아제 처리에 의한 분해 속도 확인
각기 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린을 쥐 소장 소화효소를 이용하여 시험관 수준에서 가수분해시켜 포도당 생성속도를 확인하였다(도 10). 말토스(양성대조군) 대비 각 초고분지 알파글루칸이 천천히 분해되었으며 각 알파한계덱스트린도 각 알파글루칸보다 대체로 천천히 분해되는 것으로 나타났다.
(2-6) 서로 다른 글리코겐 분지 효소를 이용하여 제조된 초고분지 알파글루칸 및 초고분지 알파한계덱스트린의 인간 재조합 소장 알파-글루코시다아제 처리에 따른 상대적 가수분해율 분석
네 종류의 인간 재조합 소장 소화효소(Maltase, glucoamylase, isomaltase, sucrase-isomaltase complex) 각각을 이용하여 최종 기질 농도 0,1%(w/v)로 가수분해 반응을 진행하였다. 이때 양성대조군으로 말토덱스트린(덱스트로스 당량:1)을 함께 진행하며 대조군으로부터 생성된 포도당의 양을 100으로 하여 나머지 기질로부터 생성된 포도당의 양을 상대적으로 표현하였다.
그 결과, 모두 초고분지 알파글루칸보다 알파한계덱스트린에서 좀더 낮은 가수분해 특성을 보였으며, 각 기질들은 글리코겐 분지 효소의 유래에 따라 가수분해 속도에 차이가 어느 정도 존재하는 것을 확인하였다(도 11). 특히 Bifidobacterium thermophilum의 효소로부터 생성된 알파한계덱스트린이 모든 효소에서 제일 천천히 분해되었다. 이는 인간 재조합 효소를 사용한 결과이므로, 본 발명의 알파한계덱스트린은 실제 인간의 위장관에서도 천천히 포도당을 방출하는 특성을 가질 것으로 예상할 수 있다.
실험결과를 종합해보면, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 상기 탄수화물 소재인 초고분지 알파한계덱스트린에 쥐 소장 유래의 알파-글루코시다아제 조효소에 의한 포도당 생산율을 통해 지소화성을 평가하였고, 그 결과 상기 초고분지 알파한계덱스트린이 초기 분해속도는 낮고 지속적으로 에너지를 공급할 수 있는 우수한 지소화성을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에서는 쥐에 상기 초고분지 알파한계덱스트린을 투여하여 혈중 포도당 및 인슐린 농도의 변화를 분석하였으며, 이를 통해 상기 초고분지 알파한계덱스트린은 실제 생체 내 소화모델에서 식후 초기의 혈중 포도당 농도의 급격한 증가를 제어함과 동시에 지속적으로 에너지를 공급하며, 조절된 혈당에 의해 인슐린이 분비가 완화된 형태로 나타남을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 초고분지 알파한계덱스트린을 투여한 후 식이조절 호르몬의 변화를 살펴보았으며, 그 결과 상기 초고분지 알파한계덱스트린이 식이조절 호르몬의 분비를 자극하는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. (A) 자당(sucrose) 분자를 아밀로수크라아제 및 글리코겐 분지 효소와 반응시켜 제1혼합물을 수득하는 단계;
    (B) 상기 두 효소를 실활시키고 제1혼합물로부터 불용성 알파글루칸을 제거하여 제2혼합물을 수득하는 단계;
    (C) 상기 제2혼합물을 알파-아밀라아제와 반응시켜 제3혼합물을 수득하는 단계;
    (D) 상기 제3혼합물로부터 고분지 알파한계덱스트린을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아밀로수크라아제는 Neisseria polysaccharea로부터 유래한 것이고,
    상기 글리코겐 분지 효소는 Rhodothermus obamensis. Synechocytis sp. PCC 6803 및 Bifidobacterium thermophilum 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래한 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1혼합물은 pH 6.0 내지 9.5인 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 효소의 실활은 제1혼합물의 온도를 80℃ 이상으로 높여 이루어지는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 불용성 알파글루칸의 제거는 원심분리를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계(D)는 투석 또는 크로마토그래피로 수행되는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계(C)의 알파-아밀라아제와의 반응은 34 내지 39℃에서 20~30시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린의 제조방법.
  8. 분자량이 1.0 x 105 g/mol 이상이고, α-1,6 글리코사이드 결합의 비율이 15% 내지 35%인 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린은 제1항의 제조방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 지소화성 초고분지 알파한계덱스트린.

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