KR20230066428A - 미토콘드리아에 비오틴의 전달을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

미토콘드리아에 비오틴의 전달을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

특정 예시적인 실시예는 미토콘드리아에 비오틴의 표적 전달을 위해 구성된 물질의 생물학적 활성 조성물 (및 이의 용도)에 관한 것으로, 조성물은 수용성, 세포-투과성, 펩티드 서열에 접합된 제 1 D-비오틴을 포함하며, 여기서 펩티드 서열은 교대의 방향족-양이온성 모티프를 갖는 폴리펩티드 군으로부터 선택된다.

Description

미토콘드리아에 비오틴의 전달을 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 계류 중인 2020년 9월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 63/075,996 (대리인 문서 번호 1255-003) 및 2020년 9월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 63/076,022 (대리인 문서 번호 1255-004)에 대한 우선권을 주장하며, 전체 참조로 본 명세서에 포함한다.
본 발명은 미토콘드리아에 비오틴의 전달을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
US 특허 2720527 US 특허 4749742 US 특허　5026773 US 특허 5391711 US 특허 5416016 US 특허　7576061 US 특허　9388212 US 특허　9695214 US 특허　10125163 US 특허 출원 공개 2006/0149035 US 특허 출원 공개 2019/0202861 US 특허 출원 공개 2019/0015521 US 특허 출원 공개 2012/0149868
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 비오틴의 세포 및/또는 미토콘드리아 흡수를 향상시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것일 수 있다. 미토콘드리아에 비오틴의 표적 전달은 효능을 개선시키며 고용량의 비오틴의 사용을 피할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 비오틴을 미토콘드리아에 전달하기 위해 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 펩티드 서열을 사용하는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 일반적인 방향족-양이온성 모티프를 갖는 폴리펩티드 군으로부터 선택된 짧은 수용성 펩티드 서열에 관한 것이며, 이는 폴리펩티드 군의 아미노산이 예를 들어, [방향족-양이온성-방향족-양이온성] 또는 [양이온성-방향족-양이온성-방향족]으로 배열될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 자연적으로 발생하는 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 D 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 펩티다제 효소에 의한 가수분해에 대한 펩티드의 내성을 높이는데 도움이 될 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 하나 이상의 비-자연적으로 발생하는 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 살아있는 유기체의 정상적인 대사 과정에서 합성되지 않으며, 단백질에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산이다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 자연적으로 발생하는 아미노산의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 유용한 펩티드는 하나 이상의 비-자연적으로 발생하는 아미노산을 함유할 수 있다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 L-, 우회전성 (dextrorotatory) (D), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 최적으로, 펩티드는 자연적으로 발생하는 아미노산이 없다.
비-자연적으로 발생하는 아미노산은 단백질에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산이다. 또한, 본 발명에서 유용한 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 바람직하게는 일반적인 프로테아제에 의해 인식되지 않는다.
비-자연적으로 발생하는 아미노산은 펩티드 내 임의의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 사이의 임의의 위치에 있을 수 있다.
비-천연 아미노산은 예를 들어 알킬, 아릴, 또는 알킬아릴 기를 포함할 수 있다. 알킬 아미노산의 일 예는 α-아미노부티르산, β-아미노부티르산, γ-아미노부티르산, δ-아미노발레르산, 및 ε-아미노카프로산을 포함한다. 아릴 아미노산의 일 예는 오르토-, 메타-, 및 파라-아미노벤조산을 포함한다. 알킬아릴 아미노산의 일 예는 오르토-, 메타-, 및 파라-아미노페닐아세트산, 및 γ-페닐-β-아미노부티르산을 포함한다.
또한, 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 자연적으로 발생하는 아미노산의 유도체를 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산의 유도체는 예를 들어, 자연적으로 발생하는 아미노산에 하나 이상의 화학 기(chemical group)의 첨가를 포함할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 화학 기는 페닐알라닌 또는 티로신 잔기의 방향족 고리의 2', 3', 4', 5' 또는 6' 위치, 또는 트립토판 잔기의 벤조 고리의 4', 5', 6' 또는 7' 위치 중 하나 이상에 추가될 수 있다. 기는 방향족 고리에 추가될 수 있는 모든 화학 기일 수 있다. 이러한 기의 일 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 또는 t-부틸과 같은 분지형 또는 비분지형 C1-C4 알킬, C1-C4 알킬옥시 (즉, 알콕시), 아미노, C1-C4 알킬아미노 및 C1-C4 디알킬아미노 (예를 들어, 메틸아미노, 디메틸아미노), 니트로, 히드록실, 할로 (즉, 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도)를 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산의 비-자연적으로 발생하는 유도체의 일부 특정 예는 노르발린 (Nva), 노르류신 (Nle), 및 히드록시프롤린 (Hyp)을 포함한다.
본 발명의 방법에서 유용한 펩티드에서 아미노산의 변형의 또 다른 예는 펩티드의 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기의 카복실 기의 유도체화이다. 유도체화의 하나의 예는 암모니아 또는 1차 또는 2차 아민, 예를 들어 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민 또는 디에틸아민을 이용한 아미드화이다. 유도체화의 또 다른 예는 예를 들어, 메틸 또는 에틸 알콜을 이용한 에스터화를 포함한다.
또 다른 이러한 변형은 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘 잔기의 아미노 기의 유도체화를 포함한다. 예를 들어, 이러한 아미노 기는 아실화될 수 있다. 일부 적당한 아실 기는 예를 들어, 아세틸 또는 프로피오닐 기와 같은 상기 언급된 C1-C4 알킬 기 중 어느 하나를 포함하는 벤조일 기 또는 알카노일 기를 포함한다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 펩티드 서열의 C-말단의 아미드화를 포함하며, 이는 카복시펩티다제에 의한 가수분해에 대한 펩티드의 내성을 높이는데 도움이 될 수 있다.
카복실 기, 특히 C-말단 아미노산의 말단 카복실 기는 예를 들어, 암모니아로 아미드화되어 C-말단 아미드를 형성할 수 있다. 대안적으로, C-말단 아미노산의 말단 카복실 기는 임의의 1차 또는 2차 아민으로 아미드화될 수 있다. 1차 또는 2차 아민은 예를 들어, 알킬, 특히 분지형 또는 비분지형 C1-C4 알킬, 또는 아릴 아민일 수 있다. 따라서, 펩티드의 C-말단에 있는 아미노산은 아미도, N-메틸아미도, N-에틸아미도, N,N-디메틸아미도, N,N-디에틸아미도, N-메틸-N-에틸아미도, N-페닐아미도 또는 N-페닐-N-에틸아미도 기로 전환될 수 있다.
또한, 본 발명의 방향족-양이온성 펩티드의 C-말단에서 발생하지 않는 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 및 글루탐산 잔기의 유리 카복실레이트 기는 펩티드 내에서 발생하는 모든 곳에서 아미드화될 수 있다. 이들 내부 위치에서의 아미드화는 암모니아 또는 상기 기재된 임의의 1차 또는 2차 아민 중 어느 하나에 의한 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 최소 4 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 6 이하의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 교대의 방향족-양이온성 모티프를 갖는 4-6 아미노산 (D 또는 L 배열)으로 구성된 폴리펩티드로부터 선택된 수용성 펩티드 서열에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 수용성 펩티드 서열에 관한 것이다:
D-Arg-L-(2'6'-디메틸Tyr)-L-Lys-L-Phe-NH2 (SS-31);
D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys-NH2 (SPN02);
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH (SPN07);
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys-NH2 (SPN10);
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-NH2 (SPN13); 및
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys-OH (SPN14).
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 미토콘드리아에 비오틴의 표적 전달을 위해 짧은 (즉, 4 내지 6 아미노산), 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 펩티드 서열에 D-비오틴을 접합시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 펩티드 서열은 N-말단 및 C-말단에 의해 정의되며, N-말단에 α-아민을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 N-말단 α-아민에 D-비오틴을 접합시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 펩티드 서열은 이들의 C-말단에 ε-아민을 갖는 리신 잔기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단에서 리신 잔기의 ε-아민 (ε-N-[d-비오티닐]-L-리신)에 D-비오틴을 접합시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 N-말단 α-아민 및 C-말단에서 리신 잔기의 ε-아민 둘다에 D-비오틴을 접합시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 물질의 적어도 하나의 치료적으로 효과적인 조성물 및/또는 이러한 조성물 및/또는 하나 이상의 이의 성분의 제조 방법 및/또는 사용 방법에 관한 것이며, 조성물은 하기로 이루어진 폴리펩티드 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함한다:
D-비오틴-D-Arg-L-(2'6'-디메틸Tyr)-L-Lys-L-Phe-NH2 (SPN05);
D-비오틴-D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH (SPN08);
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys(비오티닐)-OH (SPN09);
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN11);
D-비오틴-L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN12);
D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN15); 및
D-비오틴-D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN16).
본 명세서에 기재된 하나 이상의 예시적인 조성물은 세포 ATP 생산을 자극하도록 적응된 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함할 수 있다. 예시적인 조성물은 ATP 합성을 촉진하는 유효 농도의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 예시적인 조성물은 미토콘드리아 전위를 보존하도록 적응된 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 세포가 혈청 없이 ex vivo에서 배양될 때 세포 생존의 촉진에 적합한 신규한 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 예시적인 조성물은 세포 증식을 촉진하는 것과 같이 미토콘드리아 기능을 자극하도록 적응된 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 예시적인 조성물은 세포 성장의 유지에 부가적 또는 상승적 활성을 나타내는 유효 농도의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 포함할 수 있다.
줄기 세포의 적은 수 때문에, 세포 요법을 수행하기 위해서는, 임상 적응증의 치료를 위한 충분한 세포 수를 얻기 위해 광범위한 ex vivo 확장이 필요하다. 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)을 함유하는 배지는 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 지원 환경을 제공한다. FBS는 부착 인자, 성장 인자 및 다수의 기타 영양소를 제공한다. 그러나, FBS의 고유한 가변성과 제한된 국제적 공급 (global supply) 이외에, 혈청 제품도 병원체의 원인이 될 수 있으며 및/또는 인간 수용자(recipients)에서 면역 반응을 이끌어낼 가능성이 있는 혈청 단백질을 함유할 수 있다.
혈청 고갈은 임상적 사용을 위한 줄기 세포 또는 1차 세포의 수율을 심각하게 제한하는 세포 주기 정지 및 아폽토시스를 야기한다. 줄기 세포 확장을 허용하기 위해 혈청-없는 배지에 다양한 성장 인자를 첨가해야 하며, 이것은 종종 인간 병원체로 오염될 수 있는 인간-공급된 보충제의 사용을 포함한다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 배지는 인간 1차 세포의 성장 및 부착 및 계대 배양을 지원하여 임상적 사용을 위한 1차 포유류 세포의 대규모 생산을 가능하게 하는 화학적으로 정의되었지만 혈청-없는 및 이종-없는(xeno-free) 성분을 포함한다.
1차 포유류 세포의 대규모 생산은 종래의 가축-유래 육류에 대한 대안으로서 육류의 실험실 생산에 매우 중요할 수 있다. FBS로 동물 근아세포(myoblasts)의 배양은 지속가능하지 않다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 배지는 실험실-성장한 (lab-grown) 육류의 대규모 생산을 위해 동물 근아세포의 증식을 지원하는 화학적으로 정의된, 혈청-없는 성분을 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 인간에서 이식을 위한 세포 또는 조직 생존의 촉진에 적합한 신규한 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 예시적인 조성물은 세포 생존을 촉진하기 위해 미토콘드리아 세포 ATP 생산을 자극하도록 적응된 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 예시적인 조성물은 장기 생존의 유지에 부가적 또는 상승적 활성을 나타내는 유효 농도의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 포함할 수 있다.
췌도 이식은 제 1 형 당뇨병 환자를 위한 β-세포 대체 요법에 대한 방법이다. 수확 및 정제 과정 전반에 걸쳐 세포 생존율을 개선시킬 수 있는 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자의 첨가는, 췌도 수율을 크게 개선시킬 수 있으며, 및/또는 수용자의 혈당 조절(glycemic control)의 성공을 증가시킬 수 있다.
허혈 및 저산소증은 이식 전에 장기의 보존 동안 불가피한 현상이다. 장기에 정상적인 혈액 공급이 차단되면, 미토콘드리아 ATP 합성의 고갈은 세포 사멸을 야기한다. 저장 기간은 심장 및 폐의 경우 4-6시간, 신장의 경우 최대 36시간까지 다양하다. 장기 보존 용액에서 세포 생존율을 개선시킬 수 있는 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자의 첨가는 장기의 생존 시간을 연장하여 일치하는 수용자에게 더 광범위하게 분배할 수 있다. 또한, 이식 장기의 개선된 품질은 지연된 이식 기능 및 이식 실패를 줄일 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 조직 건강의 촉진 및/또는 조직 손상의 예방에 적합한 신규한 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 방법은 포유류에게 예시적인 조성물의 전신 투여를 제공한다. 조성물은 세포 기능을 촉진하기 위해 미토콘드리아 세포 ATP 생산을 자극하도록 적응된 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 조직 건강의 유지에 부가적 또는 상승적 활성을 나타내는 유효 농도의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 포함할 수 있다.
노화는 피부 및 상피 세포 막을 포함한 많은 세포 유형의 감소된 증식 능력 과 관련이 있다. 장 상피는 5일 이내에 완전히 자가-재생되는 반면, 폐 상피는 재생하는데 6개월이 걸릴 수 있다. 노화는 상피 재생 능력을 감소시키며, 진행성 상피 손상을 야기한다.
대부분의 조직은 나이가 들면서 재생 능력의 점진적인 감소를 나타내어 조직 변성(tissue degeneration), 기능장애(malfunction) 및 병리를 야기한다. 본 명세서에 기재된 특정 방법은 노화 동안 조직 건강을 촉진할 수 있으며, 이러한 노화-관련 기능 장애를 예방 및/또는 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 예시적인 방법은 노화된 조직 및/또는 손상된 조직에서 in vivo 상주 줄기/전구 세포(resident stem/progenitor cells)의 증식을 촉진할 수 있는 조직 건강의 촉진에 적합한 신규한 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 조직 복구 및 재생의 촉진에 적합한 신규한 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 방법은 조직 손상 후 포유류에게 예시적인 조성물의 전신 투여를 제공한다. 조성물은 세포 증식 및/또는 조직 재생을 촉진하기 위해 미토콘드리아 세포 ATP 생산을 자극하도록 적응된 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 조직 건강의 유지에 부가적 또는 상승적 활성을 나타내는 유효 농도의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 포함할 수 있다.
조직 손상은 피부, 및/또는 연조직 (예를 들어, 근육, 힘줄(tendons), 인대 (ligaments), 신경, 혈관), 및/또는 경조직 (예를 들어, 뼈, 치아), 및/또는 고형 장기 (예를 들어, 심장, 신장, 폐, 간, 비장, 장 등)에 대한 손상을 포함할 수 있다. 조직 손상의 원인은 예를 들어, 외상, 저산소증 (즉, 낮은 산소 공급), 허혈 (즉, 낮은 혈류), 감염원(infectious agents), 약물, 화학물질, 및/또는 독소 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 상처 및/또는 조직 손상의 치료, 및/또는 조직 재생의 촉진 및 보다 신속한 상처 복구에 적합한 신규한 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 방법은 상처 주변에 인접한 세포를 자극 (즉, 촉진)하여 증식 (즉, 세포 수의 증가)시키며, 상처 봉합을 촉진 및/또는 달성하는 것과 같이, 상처에 직접 조성물의 적용을 제공한다. 조성물은 세포 증식 및/또는 이동 (즉, 세포 이동)을 촉진하기 위해 미토콘드리아 세포 ATP 생산을 자극하도록 적응된 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 수술 후 상처 및/또는 미-치유(non-healing) 만성 상처, 예를 들어 환자에서 욕창(pressure ulcers) 및/또는 당뇨병성 궤양 및/또는 정맥 궤양의 경우, 상처 치유의 자극에 부가적 또는 상승적 활성을 나타내는 유효 농도의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 예시적인 실시예는 손상된 조직에서 in vivo 상주 줄기/전구 세포의 증식을 촉진할 수 있는 조직 손상의 치료에 적합한 신규한 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다.
특정 예시적인 실시예는 조직 복구 및/또는 재생의 촉진에 유용할 수 있는 약학 조성물을 제공할 수 있으며, 조성물은
(a) ATP 생산 및 세포 증식을 촉진하는 하나 이상의 화합물;
(b) 적어도 하나의 비타민; 및/또는
(c) 적어도 하나의 아미노산; 및/또는
(d) 적어도 하나의 대사 보충제
를 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 포유류에서 미토콘드리아 ATP 생산을 향상시키는 방법을 제공할 수 있으며, 방법은 하기 화학식을 갖는 화합물의 치료적 유효량을 포유류에게 투여하는 단계를 포함한다:
D-비오틴-D-Arg-L-(2'6'-디메틸Tyr)-L-Lys-L-Phe-NH2 (SPN05);
D-비오틴-D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH (SPN08);
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys(비오티닐)-OH (SPN09);
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN11);
D-비오틴-L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN12);
D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN15);
및/또는
D-비오틴-D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2 (SPN16),
여기서 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서 포유류에게 투여된다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 혈청 없이 ex vivo에서 배양된 1차 세포에 대한 세포 증식을 증가시키기 위해 구성된 조성물을 제공할 수 있으며, 조성물은 미토콘드리아 ATP 생산 및 세포 증식을 자극하는 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함하는 유효 성분, 및 ATP 생산 및 세포 증식을 강화하는 적어도 하나의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 절충하는 (compromises) 제 2 성분을 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 ex vivo에서 세포 및 장기 생존을 증가시키기 위해 구성된 조성물을 제공할 수 있으며, 조성물은 미토콘드리아 ATP 생산 및 세포 증식을 자극하는 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함하는 유효 성분, 및 ATP 생산 및 세포 증식을 강화하는 적어도 하나의 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 대사 보충제를 절충하는 제 2 성분을 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 예를 들어, 상처 부위에서 세포 증식을 증가시키기 위해 구성된 조성물을 제공할 수 있으며, 조성물은 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자를 포함하는 유효 성분 및/또는 세포 증식 및 이동을 강화하는 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제의 혼합물을 절충하는 제 2 성분을 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예와 함께 사용될 수 있는 아미노산의 예는 필수 및 비-필수 아미노산 (이소류신, 류신, 알라닌, 아스파라긴, 리신, 아스파르트산, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 프롤린, 세린, 티로신, 아르기닌, 히스티딘)을 포함하는 모든 천연 아미노산의 L-이성질체, 및 시스테인으로부터 자연적으로 유래된 타우린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예와 함께 사용될 수 있는 대사 보충제의 예는 피루베이트, 카르니틴, 아세틸카르니틴, 크레아틴, α-케토글루타레이트, α-리포산, 코엔자임 Q10, 니코틴아미드 리보시드, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제의 혼합물을 포함하는 제형을 배양 배지에 첨가함으로써, 혈청-없는 화학적으로 정의된 배지에서 1차 포유류 세포의 생존 및 증식을 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 1차 세포는 자가(autologous), 동종(allogeneic), 또는 이종(xenogenic) 재생 의학 적용을 위한 골수 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 1차 세포는 동종 이식을 위한 태반(placenta) 또는 제대혈(umbilical cord blood)로부터 얻은 줄기 세포일 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 1차 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법을 위한 T 세포와 같은 조혈 세포 (hematopoietic cell)일 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 1차 세포는 단일클론 항체 및/또는 바이오의약품과 같은 치료용 단백질의 생산 및/또는 바이러스 백신의 개발 및/또는 생산을 위해 배양된 포유류 세포일 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 1차 세포는 실험실-성장한, 도축-없는(slaughter-free) 육류의 in vitro 생산을 위해 배양된 근아세포와 같은 동물 세포일 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 1차 세포는 공여자 췌장으로부터 수확되며 이식 전에 실험실에서 정제된 췌도 세포일 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 줄기 세포 및/또는 미토콘드리아를 이식 전에 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리함으로써 조직 재생을 위한 줄기 세포 이식 및/또는 미토콘드리아 전달을 최적화 및/또는 개선하는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 세포는 손상된 조직 내 상주 줄기/전구 세포일 수 있으며, 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제의 혼합물은 피험자에게 전신 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제는 미토콘드리아의 생존 및 기능을 최적화하기 위해 미토콘드리아 이식 후 피험자에게 전신 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제는 가축-유래 육류를 대체하기 위해 실험실-성장한 육류의 배양을 위한 혈청-없는 배지에 첨가될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제를 포함하는 제형을 보존 용액에 첨가함으로써 장기 보존 용액을 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 장기는 신장, 간, 심장, 폐, 췌장, 피부, 장, 각막, 기도(trachea), 및/또는 혈관을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제는 이식 수용자에게 전신 투여되어 초기 이식 기능을 개선하고 이식 생존을 개선할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제의 혼합물을 포함하는 미량영양소(micronutrient) 제형을 투여함으로써 피험자에서 조직 건강을 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 아세틸카르니틴 및/또는 α-케토글루타레이트의 혼합물을 포함하는 미량영양소 제형을 투여함으로써 피험자에서 조직 건강을 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 아세틸카르니틴, α-케토글루타레이트, 및/또는 타우린의 혼합물을 포함하는 미량영양소 제형을 제공함으로써 피험자에서 조직 건강을 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 조직 건강은 각질 조직 (예를 들어, 피부, 모발 및/또는 손톱), 및/또는 근육, 및/또는 관절, 및/또는 뼈, 및/또는 심장, 및/또는 폐, 및/또는 신장, 및/또는 뇌, 및/또는 시각, 및/또는 청각의 건강을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 조직 손상은 노화에 의해 야기될 수 있다. 모든 세포는 노화에 따른 변화를 경험할 수 있다. 많은 세포가 기능을 상실할 수 있으며, 노폐물이 세포에 축적될 수 있고, 결합 조직이 뻣뻣해질 수 있으며, 많은 조직은 질량을 잃을 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제를 포함하는 조성물을 투여함으로써 피험자에서 노화-관련 손상을 감소, 완화, 및/또는 역전시키는 방법을 제공할 수 있으며, 투여는 경구, 설하, 및/또는 피하 등으로 발생한다. 경구 투여용 약학 제제는 용액, 현탁액, 또는 정제, 캡슐 및 분말 등과 같은 고체 형태일 수 있다. 설하 투여용 또는 피하 주사용 약학 제제는 이러한 조성물을 설하 및/또는 피하 제제에 통상적으로 사용되는 비-독성, 치료학적-불활성, 및/또는 액체 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제를 포함하는 국소 용액을 상처 부위에 직접 투여함으로써, 피험자에서 피부 상처 치유를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 타우린을 포함하는 국소 용액을 상처 부위에 직접 제공함으로써, 피험자에서 피부 상처 치유를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 상처는 욕창, 수술 상처, 화상 상처, 외상, 및/또는 하나 이상의 화학물질 및/또는 치료용 방사선 등에 노출된 상처일 수 있다.
피부에 국소 투여를 위해, 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 조성물은 스프레이, 연고, 크림, 및/또는 젤로서 제조될 수 있다. 피부에 국소 투여하기 위한 약학 제제는 이러한 조성물을 국소-투여 약학 제제에 통상적으로 사용되는 비-독성, 치료학적-불활성, 고체 및/또는 액체 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제를 포함하는 국소 용액을 상처 부위에 직접 투여함으로써, 피험자에서 치은(gingival) 및/또는 치주(periodontal) 치유를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 타우린을 포함하는 국소 용액을 투여함으로써, 피험자에서 치은 및/또는 치주 치유를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
구강 점막에 국소 투여를 위해, 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 조성물은 스프레이, 연고, 젤, 구강 세정제, 및/또는 치약 등으로 제조될 수 있다. 점막에 국소 투여하기 위한 약학 제제는 이러한 조성물을 국소-투여 약학 제제에 통상적으로 사용되는 비-독성, 치료학적-불활성, 및/또는 액체 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제를 포함하는 국소 용액을 눈에 직접 투여함으로써, 피험자에서 눈의 손상에 대한 복구를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 타우린을 포함하는 국소 용액을 투여함으로써, 피험자에서 눈의 손상에 대한 복구를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 눈에 대한 손상은 예를 들어, 급성 각막 찰과상(acute corneal abrasion), 결막하 출혈 (subconjunctival hemorrhages), 및/또는 망막 박리(retinal detachmen) 등, 및/또는 예를 들어, 노화-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 녹내장, 및/또는 안구 건조증 등을 포함하는 만성 안구 질환 중 하나 이상일 수 있다.
특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제를 포함하는 용액을 상처 부위에 직접 투여함으로써, 피험자에서 뼈 및 연조직 치유를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 손상은 예를 들어, 급성 및/또는 만성의 외상, 관절염, 건염(tendinitis), 하나 이상의 인대 파열, 및/또는 신경 압박 등일 수 있다.
연조직에 직접 적용하기 위해, 본 명세서에 기재된 특정 예시적인 조성물은 하나 이상의 관절, 힘줄, 근육, 및/또는 신경 등에 주사하기 위한 멸균 용액으로 제조될 수 있다. 주사용 약학 제제는 이러한 조성물을 이러한 제제에 통상적으로 사용되는 비-독성, 치료학적-불활성, 및/또는 액체 담체, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 및 히알루론산과 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 실시예는 치료적 유효량의 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 적어도 하나의 비타민 및/또는 하나의 아미노산 및/또는 하나의 대사 보충제를 포함하는 용액을, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 및/또는 경구 등으로 투여함으로써, 피험자에서 장기 복구를 향상시키는 방법을 제공할 수 있다. 주사용 약학 제제는 이러한 조성물을 주사용 약학 제제에 통상적으로 사용되는 비-독성, 치료학적-불활성, 및/또는 액체 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 경구 투여용 약학 제제는 예를 들어, 용액, 현탁액, 및/또는 하나 이상의 정제, 캡슐 및/또는 분말 등과 같은 고체 형태로 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 조직 손상은 급성 질환, 예를 들어 하나 이상의 장기, 구조물, 및/또는 시스템, 예를 들어 심장, 뇌, 신장, 간, 장, 및/또는 수족(limbs) 등에 대한 외상, 감소된 혈류, 감소된 산소 공급, 감염원, 약물 및/또는 독소에 의해 야기될 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 조직 손상은 만성 질환, 예를 들어, 심부전, 만성 신장 질환, 염증성 장 질환, 당뇨병성 합병증, 뇌졸중, 황반 변성, 및/또는 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(Amyotropic Lateral Sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 만성 외상성 뇌병증 (Chronic Traumatic Encephalopathy), 및/또는 알츠하이머병 등을 포함하는 신경퇴행성 질환에 의해 야기될 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자의 혼합물은 진행성 다발성 경화증, 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia), 파킨슨병, 및/또는 알츠하이머병을 앓는 피험자에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 티아민의 혼합물은 비오틴-티아민-반응성 기저핵 질환(biotin-thiamine-responsive basal ganglia disease)을 앓는 피험자에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법의 특정 예시적인 실시예에서, 하나 이상의 펩티드-접합된 비오틴 분자의 혼합물은 염증성 장 질환을 앓는 피험자에게 투여될 수 있다.
다양한 잠재적, 실현가능한, 및/또는 유용한 실시예는 첨부된 예시적인 도면을 참조하여 특정 예시적인 실시예의 본 명세서에 제공된, 비-제한적인, 비-포괄적인 설명을 통해 더 쉽게 이해될 것이다.
도 1a, 1b 및 1c는 비오틴이 미토콘드리아-표적 펩티드 서열에 어떻게 접합될 수 있는지를 나타내는 화학 구조도이다.
도 2는 특정 예시적인 화합물의 세포 흡수와 관련된 형광 현미경 영상이다.
도 3은 예시적인 세포 흡수를 나타내는 그래프이다.
도 4는 특정 예시적인 화합물의 세포 흡수와 관련된 형광 현미경 영상이다.
도 5는 예시적인 세포 흡수를 나타내는 그래프이다.
도 6은 특정 예시적인 화합물의 미토콘드리아-표적과 관련된 형광 현미경 영상이다.
도 7은 예시적인 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 8은 예시적인 세포 수를 나타내는 현미경 영상이다.
도 9는 예시적인 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 예시적인 세포 ATP 수준을 나타내는 그래프이다.
도 11은 예시적인 세포 ATP 수준을 나타내는 그래프이다.
도 12는 예시적인 세포 ATP 수준을 나타내는 그래프이다.
도 13은 미토콘드리아 전위(mitochondrial potential)를 나타내는 형광 현미경 영상이다.
도 14는 예시적인 미토콘드리아 전위를 나타내는 형광 현미경 영상이다.
도 15는 특정 예시적인 화합물과 관련된 스크래치 영역(scratch area)의 현미경 영상이다.
도 16은 예시적인 스크래치 영역을 나타내는 그래프이다.
도 17은 예시적인 스크래치 영역을 나타내는 그래프이다.
도 18은 특정 예시적인 화합물과 관련된 스크래치 영역의 현미경 영상이다.
도 19는 예시적인 스크래치 영역을 나타내는 그래프이다.
도 20은 특정 예시적인 화합물의 세포 증식과 관련된 현미경 영상이다.
도 21은 예시적인 세포 증식을 나타내는 그래프이다.
도 22는 특정 예시적인 화합물의 세포 증식과 관련된 현미경 영상이다.
도 23은 예시적인 세포 증식을 나타내는 그래프이다.
도 24는 특정 예시적인 화합물의 미토콘드리아 전위와 관련된 현미경 영상이다.
도 25는 예시적인 미토콘드리아 전위를 나타내는 그래프이다.
도 26은 특정 예시적인 화합물의 망막 흡수와 관련된 형광 현미경 영상이다.
도 27은 특정 예시적인 화합물의 망막 흡수와 관련된 형광 현미경 영상이다.
실시예 1 - 짧은 방향족-양이온성 펩티드 서열은 비오틴의 세포 흡수를 증가시킨다.
본 명세서에 기재된 특정 펩티드 서열은 일반적인 방향족-양이온성 모티프를 가질 수 있는 4 내지 6 아미노산으로 구성된 수용성 폴리펩티드일 수 있으며, 이는 펩티드 서열이 예를 들어, [방향족-양이온성-방향족-양이온성] 또는 [양이온성-방향족-양이온성-방향족]일 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 기재된 특정 "짧은" 펩티드 서열은 최소 4 아미노산 및 최대 6 아미노산으로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.
아미노산은 자연적으로 발생할 수 있다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 단백질에서 발견되는 20개의 가장 일반적인 아미노산, 즉, 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 리신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr), 및 발린(Val)을 포함한다. 방향족 아미노산은 Phe, Tyr, 및 Trp을 포함할 수 있다. 양이온성 아미노산은 Lys, Arg, 및 His를 포함할 수 있다. 아미노산은 D-배열의 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 펩티드에서, 카복실 말단은 아미드화될 수 있다.
아미노산은 비-자연적으로 발생할 수 있다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 살아있는 유기체의 정상적인 대사 과정에서 합성되지 않으며, 단백질에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산이다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 L- 또는 D-배열로 자연적으로 발생하는 아미노산의 유도체를 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예는 치료 목적을 위해 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 제공할 수 있다. 특정 예시적인 치료적 적용에서, 조성물 및/또는 약제는 질환 및/또는 질병의 발생에서 이의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여, 질환 및/또는 질병의 증상을 치유하거나, 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로, 이러한 질환 및/또는 질병이 의심되거나, 또는 이미 앓고 있는 피험자에게 투여될 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 치료 방법은 하나 이상의 활성제와 함께 조성물의 투여를 포함한다. 특정 예시적인 실시예에서, 펩티드 투여는 만성적이다.
특정 예시적인 실시예에서, 펩티드는 하나 이상의 혈전용해제(thrombolytic agents)와 함께 투여될 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 하나 이상의 혈전용해제는 조직 플라스미노겐 활성제, 우로키나제(urokinase), 프로유로키나제 (prourokinase), 스트렙토키나제(streptokinase), 플라스미노겐의 아실화 형태, 플라스민의 아실화 형태, 및 아실화 스트렙토키나제-플라스미노겐 복합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 치료 방법은 하나 이상의 항고혈압제와 함께 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 하나 이상의 항고혈압제는 이뇨제, 아드레날린 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 레닌 저해제, 안지오텐신 전환 효소 (angiotensin converting enzyme, ACE) 저해제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 알도스테론 길항제, 혈관확장제(vasodilators), 및/또는 알파-2 작용제를 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 이뇨제는 루프 이뇨제, 티아지드 이뇨제, 티아지드-유사 이뇨제, 및/또는 칼륨-보존 이뇨제(potassium-sparing diuretics)를 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 이뇨제는 부메타니드(bumetanide), 에타크린산(ethacrynic acid), 푸로세미드(furosemide), 토르세미드(torsemide), 에피티지드(epitizide), 히드로클로로티아지드(hydrochlorothiazide), 클로로티아지드 (chlorothiazide), 벤드로플루메티아지드(bendroflumethiazide), 인다파미드 (indapamide), 클로르탈리돈(chlorthalidon), 메톨라존(metolazone), 아밀로리드 (amiloride), 트리암테렌(triamterene), 및/또는 스피로노락톤(spironolactone)을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 아드레날린 수용체 길항제는 베타 차단제, 알파 차단제, 또는 혼합된 알파 및 베타 차단제를 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 아드레날린 수용체 길항제는 아테놀롤(atenolol), 메토프롤롤 (metoprolol), 나돌롤(nadolol), 옥스프레놀롤(oxprenolol), 핀돌롤(pindolol), 프로프라놀롤(propranolol), 티몰롤(timolol), 독사조신(doxazosin), 펜톨아민 (phentolamine), 인도라민(indoramin), 페녹시벤자민(phenoxybenzamine), 프라조신 (prazosin), 테라조신(terazosin), 톨라졸린(tolazoline), 부신돌롤(bucindolol), 카베딜롤(carvedilol), 및/또는 라베탈롤(labetalol)을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 칼슘 채널 차단제는 디히드로피리딘 및/또는 비-디히드로피리딘을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 칼슘 채널 차단제는 암로디핀, 펠로디핀, 이스라디핀, 레르카니디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 니모디핀, 니트렌디핀, 딜티아젬, 및/또는 베라파밀을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 레닌 저해제는 알리스키렌(Aliskiren)®을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 저해제는 캅토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 트란돌라프릴, 및/또는 베나제프릴을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 안지오텐신 II 수용체 길항제는 이르베사르탄 (Irbesartan)®을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 알도스테론 길항제는 에플레레논(eplerenone) 및/또는 스피로놀락톤(spironolactone)을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 혈관확장제 길항제는 나트륨 니트로프루시드 (sodium nitroprusside) 및/또는 히드랄라진(hydralazine)을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 알파-2 작용제 길항제는 클로니딘(clonidine), 구아나벤즈(guanabenz), 메틸도파(methyldopa), 목소니딘(moxonidine), 구아네티딘 (guanethidine), 및/또는 레세르핀(reserpine)을 포함할 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 세포, 장기, 및/또는 조직을 펩티드와 접촉시키기 위한 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적당한 방법은 in vitro, ex vivo, 및/또는 in vivo 방법을 포함할 수 있다. 요법을 위해 in vivo에서 사용될 때, 조성물은 유효량 (즉, 원하는 치료 효과를 갖는 양)으로 피험자에게 투여될 수 있다. 용량 및 투여량 요법은 피험자의 손상 정도, 사용된 특정 조성물의 특성, 예를 들어 이의 치료 지수, 피험자 및/또는 피험자의 병력에 따라 달라질 수 있다.
유효량은 전-임상 시험 및/또는 임상 시험 동안 의사 및/또는 임상의에게 친숙한 방법으로 결정될 수 있다. 방법에서 유용한 펩티드의 유효량은 약학 화합물을 투여하기 위한 다수의 잘-알려진 방법 중 어느 하나에 의해 이를 필요로 하는 포유류에게 투여될 수 있다. 펩티드는 전신적으로 및/또는 국소적으로 투여될 수 있다.
펩티드는 약학적으로 허용가능한 염으로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기 및 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 산으로부터 유도될 수 있다. 펩티드가 아민, 피리딘 또는 이미다졸과 같은 염기성 부분, 및 카복실산 또는 테트라졸과 같은 산성 부분을 둘다 함유하는 경우, 양쪽성 이온이 형성될 수 있으며, 본 명세서에서 사용된 용어 "염"에 포함된다. 약학적으로 허용가능한 무기 염기로부터 유도된 염은 암모늄, 칼슘, 구리, 제2철(ferric), 제1철(ferrous), 리튬, 마그네슘, 망간(manganic), 이가망간 (manganous), 칼륨, 나트륨, 및 아연 염 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 유기 염기로부터 유도된 염은 치환된 아민, 고리형 아민, 자연적으로-발생하는 아민 등을 포함하는 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 예를 들어 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모폴린, 피페라진, 피페라딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 무기 산으로부터 유도된 염은 붕산, 탄산, 할로겐화수소산(hydrohalic acid) (브롬화수소산, 염화수소산, 불화수소산 또는 요오드화수소산), 질산, 인산, 설팜산 (sulfamic acid) 및 황산의 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 유기 산으로부터 유도된 염은 지방족 히드록실산 (예를 들어, 시트르산, 글루콘산, 글리콜산, 락트산, 락토바이오닉산(lactobionic acid), 말산, 및 타르타르산), 지방족 모노카복실산 (예를 들어, 아세트산, 부티르산, 포름산, 프로피온산 및 트리플루오로아세트산), 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 방향족 카복실산 (예를 들어, 벤조산, p-클로로벤조산, 디페닐아세트산, 겐티신산(gentisic acid), 히푸르산 (hippuric acid) 및 트리페닐아세트산), 방향족 히드록실산 (예를 들어, o-히드록시벤조산, p-히드록시벤조산, 1-히드록시나프탈렌-2-카복실산 및 3-히드록시나프탈렌-2-카복실산), 아스코르브산, 디카복실산 (예를 들어, 푸마르산, 말레산, 옥살산 및 석신산), 글루코론산, 만델산, 뮤신산(mucic acid), 니코틴산(nicotinic acid), 오로트산(orotic acid), 파모산(pamoic acid), 판토텐산(pantothenic acid), 설폰산 (예를 들어, 벤젠설폰산, 캄포설폰산, 에디실산(edisylic acid), 에탄설폰산, 이세티온산(isethionic acid), 메탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2,6-디설폰산 및 p-톨루엔설폰산), 크시나포산(xinafoic acid) 등의 염을 포함한다. 일 실시예에서, 염은 아세테이트 염 또는 트리플루오로아세테이트 염이다.
본 명세서에 기재된 조성물, 또는 아세테이트 염 또는 트리플루오로아세테이트 염과 같은 이의 약학적으로 허용가능한 염은 본 명세서에 기재된 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 피험자에게 단독으로 또는 조합으로 투여하기 위해 약학 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 활성제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 이는 약학적 투여에 적합한 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 보충 활성 화합물은 특정 예시적인 조성물에 포함될 수 있다.
약학 조성물은 이의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피내, 복강내 또는 피하), 경구, 설하, 비강, 흡입, 경피 (국소), 안구내, 이온영동(iontophoretic), 및 경점막 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용된 용액 또는 현탁액은 하기의 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수, 고정유(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨(sodium bisulfite)과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 장성(tonicity) 조정제. 특정 예시적인 실시예에서, pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기, 및/또는 유리 및/또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 환자 및/또는 치료 의사의 편의를 위해, 투여 제형은 치료 과정 (예를 들어, 7일 치료) 동안 임의의 또는 모든 필요 장비 (예를 들어, 약물 바이알, 희석제 바이알, 주사기 및/또는 바늘 등)를 함유하는 키트로 제공될 수 있다.
주사용에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 및/또는 분산액 및/또는 멸균 주사용 용액 및/또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여에 적합한 담체는 생리식염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.), 및/또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 멸균일 수 있으며 및/또는 쉽게 주사할 수 있도록 유체일 수 있다. 특정 예시적인 조성물은 제조 및/또는 저장의 조건 하에서 안정할 수 있으며 및/또는 박테리아 및/또는 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다.
조성물은 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및/또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및/또는 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 등에 의해 달성될 수 있다. 산화를 방지하기 위해 글루타티온 및/또는 기타 항산화제가 포함될 수 있다. 특정 예시적인 조성물은 등장화제, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 및/또는 염화나트륨과 같은 당 및/또는 폴리알콜을 포함할 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및/또는 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적당한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 포함한 다음, 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것 중 하나 이상과 같은 다른 원하는 성분을 함유하는 멸균 비히클에 포함시켜 제조될 수 있다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 예시적인 제조 방법은 진공 건조 및/또는 동결 건조를 포함하며, 이는 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 유효 성분의 분말과 임의의 추가의 원하는 성분을 생산할 수 있다.
경구 조성물은 불활성 희석제 및/또는 식용 담체를 포함할 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있으며 및/또는 정제, 트로키, 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐 및/또는 물과 같은 희석제에 용해가능한 분말의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 구강세정제로 사용하기 위한 유체 담체를 이용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 예시적인 정제, 환제(pills), 캡슐, 트로키 등은 하기의 성분, 또는 유사한 특성의 화합물 중 어느 하나를 함유할 수 있다: 미결정 셀룰로오스, 트라가칸트 검 및/또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 및/또는 락토오스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔 및/또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 및/또는 스테로테스 (Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로오스 및/또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 및/또는 오렌지 향료와 같은 향미제; 등.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적당한 추진제, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체 및/또는 분무기를 함유하는 가압 용기 및/또는 디스펜서(dispenser)로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달될 수 있다.
본 명세서에 기재된 치료용 화합물의 전신 투여는 경점막 및/또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용될 수 있다. 이러한 침투제는 예를 들어, 경점막 투여의 경우 세제, 담즙산염, 및/또는 푸시딘산(fusidic acid) 유도체를 포함할 수 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이를 사용하여 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 연고, 고약(salves), 젤 및/또는 크림으로 제형화될 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 경피 투여는 이온영동법, 미세바늘, 및/또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있다.
치료용 단백질 및/또는 펩티드는 담체 시스템에서 제형화될 수 있다. 담체는 콜로이드 시스템일 수 있다. 콜로이드 시스템은 리포좀 및/또는 인지질 이중층 비히클일 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 치료용 펩티드는 펩티드 무결성 (integrity)을 유지하면서 리포좀에 캡슐화될 수 있다. 활성제는 가용성, 불용성, 투과성, 불투과성, 생분해성, 및/또는 위체류성(gastroretentive) 고분자 및/또는 리포좀을 포함하나 이에 한정되지 않는 약학적으로 허용가능한 성분으로부터 제조된 입자에 로딩될 수 있다. 이러한 입자는 나노입자, 생분해성 나노입자, 미세입자 (microparticles), 생분해성 미세입자, 나노구(nanospheres), 생분해성 나노구, 미세구(microspheres), 생분해성 미세구, 캡슐, 에멀젼, 리포좀, 미셀, 및/또는 바이러스 벡터 시스템을 포함할 수 있다.
담체는 고분자, 예를 들어, 생분해성 및/또는 생체적합성 고분자 매트릭스일 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 치료용 펩티드는 단백질 무결성을 유지하면서 고분자 매트릭스에 끼워넣을(embedded) 수 있다. 고분자는 폴리펩티드, 단백질 또는 다당류와 같은 천연이거나, 또는 폴리 α-히드록시 산과 같은 합성일 수 있다. 예로는 예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 니트레이트, 다당류, 피브린, 젤라틴, 및 이들의 조합으로 제조된 담체를 포함한다. 특정 예시적인 실시예에서, 고분자는 폴리-락트산 (PLA) 및/또는 코폴리 락트산/글리콜산 (PGLA)일 수 있다. 고분자 매트릭스는 미세구 및 나노구를 포함하는 다양한 형태 및/또는 크기로 제조 및/또는 분리될 수 있다. 고분자 제형은 치료 효과의 지속 시간을 연장시킬 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 치료용 화합물은 체내로부터의 신속한 제거에 대해 치료용 화합물을 보호할 담체, 예를 들어 이식물 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터, 및/또는 폴리아세트산 등과 같은 생분해성 및/또는 생체적합성 고분자가 사용될 수 있다. 이러한 제형은 알려진 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 물질은 예를 들어 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액 (세포-특이적 항원에 대한 단일클론 항체로 특이적 세포를 표적으로 하는 리포좀 포함)은 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다.
치료용 화합물은 세포내 전달을 향상시키기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 전달 시스템 및/또는 융합성 리포좀(fusogenic liposomes)은 in vivo 및/또는 in vitro 내 세포에 단백질을 전달하는데 사용될 수 있다.
치료제의 투여량, 독성, 및 치료 효능은 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량) 및/또는 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 및/또는 실험 동물에서 표준 의약품 절차에 의해 결정될 수 있다. "치료 지수"라고 하는 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량비는 LD50/ED50 비로 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직할 수 있다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있지만, 미감염된 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 줄이기 위해 영향을 받는 조직 부위에 이러한 화합물을 표적으로 하는 전달 시스템을 설계하는데 주의를 기울일 수 있다.
세포 배양 분석 및/또는 동물 연구로부터 얻은 자료는 인간에게 사용할 투여량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50를 포함하는 순환 농도 범위 내에 있을 수 있다. 투여량은 사용된 제형 및/또는 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 특정 예시적인 화합물의 경우, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 IC50 (즉, 증상의 반-최대 저해(half-maximal inhibition)를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피로 측정될 수 있다.
치료 또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 조성물의 유효량은 1일 킬로그램 체중당 약 0.000001 mg 내지 1일 킬로그램 체중당 약 10,000 mg의 범위일 수 있다. 투여량 범위는 1일 킬로그램 체중당 약 0.0001 mg 내지 1일 킬로그램 체중당 약 100 mg일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 매일, 2일마다, 또는 3일마다 약 1 mg/kg 체중 또는 약 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 또는 매주, 2주마다, 또는 3주마다 약 1 내지 약 10 mg/kg의 범위 내일 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 펩티드의 단일 투여량은 체중 kg당 약 0.1 내지 약 10,000 마이크로그램의 범위일 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 전달된 밀리리터당 약 0.2 내지 약 2000 마이크로그램 범위의 담체 내 조성물 농도가 투여될 수 있다. 예시적인 치료 요법은 하루에 한 번 또는 일주일에 한 번 투여를 수반할 수 있다. 특정 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소 및/또는 종료될 때까지, 및/또는 피험자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 요구될 수 있다. 이 후, 환자는 예방 요법을 투여받을 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 조성물의 치료적 유효량은 약 10-12　내지 10-6 몰, 예를 들어 약 10-7 몰의 표적 조직에서의 펩티드의 농도로 정의될 수 있다. 이 농도는 약 0.01 내지 약 100 mg/kg의 전신 용량 또는 체표면적에 의한 등가 용량에 의해 전달될 수 있다. 투여 일정은 단일 매일 또는 매주 투여와 같이 표적 조직에서 치료 농도를 유지하도록 최적화될 수 있으나, 연속 투여 (예를 들어, 비경구 주입 및/또는 경피 적용)도 포함될 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 조성물의 투여량은 "저", "중간" 또는 "고" 용량 수준으로 제공될 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 저용량은 약 0.01 내지 약 0.5 mg/kg/h, 예를 들어 약 0.0001 내지 약 0.1 mg/kg/h로 제공될 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 중간-용량은 약 0.001 내지 약 1.0 mg/kg/h, 예를 들어 약 0.01 내지 약 0.5 mg/kg/h로 제공될 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 고용량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg/h, 예를 들어 약 0.01 내지 약 2 mg/kg/h로 제공될 수 있다.
특정 예시적인 실시예에서, 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 피험자의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및/또는 존재하는 다른 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 인자는, 피험자를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및/또는 시기에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 치료용 조성물의 치료적 유효량으로 피험자의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
특정 예시적인 방법에 따라 치료된 포유류는 예를 들어, 양, 돼지, 소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 애완동물; 및/또는 랫트, 마우스 및 토끼와 같은 실험실 동물을 포함한 모든 포유류일 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 포유류는 인간일 수 있다.
특정 예시적인 실시예는 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단에 위치한 리신에 접합된 제 1 D-비오틴을 포함하는 물질의 생물학적 활성 조성물을 제공하며, 여기서
미토콘드리아-표적 펩티드 서열은 최소 4 아미노산 및 최대 6 아미노산을 포함하고;
미토콘드리아-표적 펩티드 서열은 일반적인 교대의 방향족-양이온성 모티프를 가지며;
미토콘드리아-표적 펩티드 서열은 하기로부터 선택되고:
D-Arg-L-(2'6'-디메틸Tyr)-L-Lys-L-Phe-NH2;
D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys-NH2;
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH;
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys-NH2;
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-NH2; 및/또는
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys-OH;
제 2 D-비오틴은 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 N-말단 α-아민에 접합되며;
조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
D-비오틴-D-Arg-L-(2'6'-디메틸Tyr)-L-Lys-L-Phe-NH2; 및
D-비오틴-D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH;
제 1 D-비오틴은 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단에서 리신의 ε-아민에 접합되며;
조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys(비오티닐)-OH;
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2; 및
D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2;
제 1 D-비오틴은 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단에서 리신의 ε-아민에 접합되며 제 2 D-비오틴은 N-말단 α-아민에 접합되고; 및/또는
조성물은 하기 중 하나 이상을 포함한다:
D-비오틴-L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2; 및
D-비오틴-D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2.
특정 예시적인 실시예는 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 N-말단에 위치한 리신에 접합된 제 1 D-비오틴을 포함하는 물질의 생물학적 활성 조성물을 제공하며, 여기서 미토콘드리아-표적 펩티드 서열은 최소 4 아미노산 및 최대 6 아미노산을 포함하고 일반적인 교대의 방향족-양이온성 모티프를 가진다.
특정 예시적인 실시예는
비오티닐화 폴리펩티드 군으로부터 선택된 하나 이상의 생물학적 활성, 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 화합물;
하나 이상의 생물학적 활성, 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 화합물 각각에 대한 약학적으로 허용가능한 담체;
하기로부터 선택된 하나 이상의 비타민:
비타민 B1 (티아민);
비타민 B2 (리보플라빈);
비타민 B3 (니아신, 니아신아미드);
비타민 B5 (판토텐산(pantothenic acid));
비타민 B6 (피리독신(pyridoxine));
비타민 B7 (비오틴);
비타민 B9 (폴레이트(folate));
비타민 B12 (시아노코발라민(cyanocobalamine)); 및
비타민 C (아스코르브산);
하기로부터 선택된 하나 이상의 대사 보충제:
피루베이트;
카르니틴;
아세틸카르니틴;
크레아틴;
α-케토글루타레이트;
α-리포산;
코엔자임 Q;
니코틴아미드 리보시드; 및
니코틴아미드 모노뉴클레오티드; 및/또는
하기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산:
류신;
이소류신;
발린;
글루타민;
세린;
아르기닌;
메티오닌;
트립토판;
글리신;
트리메틸글리신;
β-히드록시-β-메틸부티레이트; 및
타우린;
을 포함하는 치료적으로 효과적인 제형을 포함하는, 물질의 조성물을 제공하며, 여기서
비오티닐화 폴리펩티드 군에서 각각의 생물학적 활성, 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 화합물은 하기에 의해 정의되고:
일반적인 교대의 방향족-양이온성 모티프로 배열된 다수의 아미노산;
최소 4 아미노산 및 최대 6 아미노산;
비오티닐화 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 위치한 리신에 접합된 제 1 D-비오틴;
비오티닐화 폴리펩티드 군은 하기로 이루어진다:
D-비오틴-D-Arg-L-(2'6'-디메틸ylTyr)-L-Lys-L-Phe-NH2;
D-비오틴-D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH;
D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys(비오티닐)-OH;
L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2;
D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2;
D-비오틴-L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2; 및
D-비오틴-D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2.
표 1은 특정 예시적인 짧은, 수용성, 교대의 방향족-양이온성 펩티드 서열을 확인한다.
SS-31 D-Arg L-2'6'디메틸Tyr L-Lys L-Phe NH2
SPN02 D-Arg L-Tyr D-Arg L-Phe L-Lys NH2
SPN07 D-Trp D-Arg D-Trp D-Lys OH
SPN10 L-Trp L-Arg L-Trp L-Lys NH2
SPN13 D-Trp D-Arg D-Trp D-Lys NH2
SPN14 L-Trp L-Arg L-Trp L-Lys OH
본 명세서에 기재된 특정 예시적인 방법에서 유용한 교대의 방향족-양이온성 펩티드 서열은 하기 US 특허 문서에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 화학적으로 합성될 수 있으며, 이들 각각은 전체 및/또는 펩티드의 합성 및/또는 합성된 펩티드의 이용을 기재하거나 또는 관련된 부분에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다:
US 특허 4749742;
US 특허　5026773;
US 특허　7576061;
US 특허　9388212;
US 특허　9695214;
US 특허　10125163;
US 특허 출원 공개 2019/0202861;
US 특허 출원 공개 2019/0015521; 및
US 특허 출원 공개 2012/0149868.
표 1에 열거된 특정 예시적인 교대의 방향족-양이온성 펩티드 서열은 수용성이다.
표 1에 열거된 특정 예시적인 교대의 방향족-양이온성 펩티드 서열은 수용성이나, 세포막을 침투할 수 있다.
표 1에 열거된 특정 예시적인 교대의 방향족-양이온성 펩티드 서열은 수용성이나, 미토콘드리아 외막을 침투할 수 있다.
비오틴 (도 1a)은 N-말단 α-아민 (도 1b) 또는 C-말단에서 리신의 ε-아미노 기 (도 1c)에서 교대의 방향족-양이온성 펩티드 서열에 접합될 수 있다.
특정 예시적인 실시예에 대해, 화학적 합성을 통해 비오틴은 하기 U.S. 특허 간행물 중 어느 하나에 기재된 하나 이상의 방법을 이용하여 폴리펩티드에 접합될 수 있으며, 이들 각각은 이러한 방법의 교시를 위해 전체 참조로 본 명세서에 포함된다:
U.S. 특허 5,391,711;
U.S. 특허 5,416,016; 및
U.S. 특허 출원 공개 2006/0149035.
특정 예시적인 실시예는 비오틴으로 펩티드에서 α-아미노 N-말단을 우선적으로 표지할 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 비오틴화(biotinylation)는 비오틴의 카복실 기가 펩티드의 유리 아미노 기와 반응하도록 활성화함으로써 용이하게 달성될 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, D-비오틴-N-히드록시-석신이미드 에스터 또는 비오티닐-p-니트로페닐 에스터와 같은 비오티닐화 시약이 사용될 수 있다. 활성화된 에스터는 온화한 조건 하에서 아미노 기와 반응하여 비오틴 잔기를 원하는 분자에 포함시킬 수 있다. 특정 예시적인 실시예는 D-비오틴-N-히드록시-석신이미드 에스터를 사용하여 거대분자를 비오티닐화할 수 있으며 및/또는 비오티닐화 시약으로서 비오티닐-ε-니트로페닐 에스터를 사용하여 외인성 분자를 비오티닐화할 수 있다. D-비오티닐-ε-아미노카프로산 N-히드록시-석신이미드 에스터 (ε-아미노카프로산이 입체 장애를 감소시키기 위한 스페이서 연결로 작용함)와 같은 기타 시약도 특정 예시적인 실시예에 의해 사용될 수 있다.
특정 예시적인 실시예에 대해, 비오틴화를 ε-아미노 기 리신에서 수행하여 비오시틴(biocytin)을 형성할 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 비오시틴-함유 펩티드는 C-말단 위치에서 Fmoc-Lys(ε-비오티닐)을 이용하여 고상 합성을 통해 달성될 수 있으며, 이는 수지의 산 절단을 거친 후 Lys(비오티닐) 또는 비오시틴을 야기할 수 있다. 예를 들어, 비오시틴을 생성하기 위해, 특정 예시적인 실시예는 U.S. 특허 2,720,527에 기재된 하나 이상의 방법을 이용할 수 있으며, 이는 이러한 방법의 교시를 위해 전체 참조로 본 명세서에 포함된다.
특정 예시적인 펩티드-접합된 비오틴 분자 및 상응하는 미토콘드리아-표적 펩티드 서열은 표 2에 열거되어 있다.
Figure pct00001
HK-2 인간 신장 상피 세포 및 ARPE-19 인간 망막 색소 상피 세포 (ATCC, Manassas, VA)에서 펩티드-접합된 비오틴 분자의 세포 흡수 및 국소화를 측정하였다. HK-2 세포를 1 g/L 글루코오스 및 10% 소 태아 혈청 (FBS), 100 단위/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다. ARPE-19 세포를 1 g/L 글루코오스 및 10% 소 태아 혈청 (FBS), 100 단위/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2가 있는 가습 배양기에서 배양하였다. HK-2 세포 및 ARPE-19 세포를 5 x 104 세포의 초기 밀도로 35 mm 디쉬에 씨딩하였다. FBS를 3일 동안 배양 배지로부터 제거하여 세포에서 내인성 비오틴을 고갈시켰다. 그 다음, 세포를 12시간 (HK-2 세포) 또는 1시간 (ARPE-19 세포) 동안 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자를 함유하는 혈청-없는 배지에서 배양하였다. 모든 화합물은 1 uM에서 사용되었다.
스트렙타비딘 결합을 이용하여 비오틴 흡수를 측정하였다. 스트렙타비딘은 비오틴에 대해 높은 친화도를 가진다. Alexa Fluor 594-접합된 스트렙타비딘을 이용하는 경우, 형광 현미경을 이용하여 비오틴 흡수를 시각화하는 것이 가능하다. 세포를 RT에서 10분 동안 4% PFA로 고정시키며, RT에서 10분 동안 0.1% 트리톤 X-100/PBS에서 투과시키고, RT에서 30분 동안 3.2 ug/ml 스트렙타비딘-Alexa Fluor 594 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 및 5 ug/ml Hoechst 33342 (Novus Biologicals, Centennial, CO)와 함께 배양하였다. Hoechst 33342는 DNA 표지용 형광염색제이며, 핵염색에 사용된다. 살아있는 세포 영상 완충제를 첨가하고, Nikon Eclipse Ti2 형광 현미경 (100X 오일 대물렌즈)을 이용하여 Alexa-594 형광 (Ex/Em = 591/614 nm) 및 Hoechst 형광 (Ex/Em = 490/461 nm)을 관찰하였다. 스트렙타비딘 형광에 대해 NIS-Elements Imaging Software (Nikon)로 각 시료의 10개 랜덤 필드를 정량화하고, 필드당 세포 수를 설명하기 위해 Hoechst 형광으로 정규화하였다.
도 2는 1 uM 유리 비오틴 또는 표 2로부터 선택된 펩티드-접합된 비오틴 분자와 함께 12시간 배양 후 HK-2 인간 신장 상피 세포의 대표적인 현미경 영상을 나타낸다. 세포내 비오틴은 스트렙타비딘-AlexaFluor594 (적색 형광)로 시각화된다. 핵은 Hoechst 33342 염료 (청색 형광) (1000x 배율)로 시각화된다. HK-2 세포를 1 uM 비오틴 단독으로 배양하였을 때, 최소의 세포내 스트렙타비딘 형광이 관찰되었다. 대조적으로, 모든 펩티드-접합된 비오틴 화합물 (SPN05, SPN08, SPN09, SPN11 및 SPN12)은 비오틴의 상당한 세포 흡수를 나타내는 강렬한 적색 형광을 나타내었다.
도 3은 1 uM 비오틴 또는 표 2로부터 선택된 펩티드-접합된 비오틴 분자와 함께 12시간 배양 후 HK-2 인간 신장 상피 세포에서 비오틴 흡수를 정량화한 그래프이다. 펩티드-접합된 비오틴 분자는 HK-2 세포에서 유리 비오틴에 비해 상당히 높은 세포내 비오틴 함량을 전달하였다. 세포 수로 정규화된 총 스트렙타비딘 형광 (Hoechst 형광)을 10개의 랜덤 필드로부터 계산하고 각 처리에 대해 평균을 내었다. 그 다음, 모든 자료를 유리 비오틴으로 처리하여 정규화하였으며, 유리 비오틴은 임의로 1.0으로 설정하였다. 모든 펩티드-접합된 비오틴 분자는 유리 비오틴에 비해 상당히 높은 세포내 비오틴을 야기하였다 (*P<0.05, ***P<0.001). 펩티드-접합된 비오틴 분자의 흡수는 유리 비오틴보다 2 내지 2.5배 더 높았다.
도 4는 1 uM 비오틴 또는 표 2로부터 선택된 펩티드-접합된 비오틴 분자와 함께 1시간 배양 후 ARPE-19 인간 망막 색소 상피 세포의 대표적인 현미경 영상을 나타낸다. 세포내 비오틴은 스트렙타비딘-AlexaFluor594 (적색 형광)로 시각화된다. 핵은 Hoechst 33342 염료 (청색 형광) (1000x 배율)로 시각화된다. 모든 펩티드-접합된 비오틴 화합물 (SPN08, SPN09, SPN11, SPN12, SPN15 및 SPN16)은 핵주위(perinuclear) 분포를 갖는 강렬한 적색 형광을 나타내었다.
도 5는 1 uM 비오틴 또는 표 2로부터 선택된 펩티드-접합된 비오틴 분자와 함께 1시간 배양 후 ARPE-19 인간 망막 색소 상피 세포에서 비오틴 흡수를 나타내는 그래프이다. 펩티드-접합된 비오틴 분자는 ARPE-19 세포에서 유리 비오틴에 비해 상당히 높은 세포내 비오틴 함량을 전달하였다. 스트렙타비딘 형광 대 Hoechst 형광의 비는 10개의 랜덤 필드로부터 계산하고 각 처리에 대해 평균을 내었다. 그 다음, 모든 자료를 유리 비오틴으로 처리하여 정규화하였으며, 유리 비오틴은 임의로 1.0으로 설정하였다. 모든 펩티드-접합된 비오틴 분자는 유리 비오틴에 비해 상당히 높은 세포내 비오틴 염색을 야기하였다 (***P<0.001). 펩티드-접합된 비오틴 분자의 흡수는 유리 비오틴보다 1.5 내지 2배 더 높았다.
이러한 펩티드는 단순 확산에 의해 세포에 들어가고, 일단 세포에 들어가면 미토콘드리아에서만 보인다. 확인된 SPN 펩티드의 경우, 도 2 및 도 4에 의해 확인된 바와 같다. 이러한 펩티드 (핵 주위에서 시작하는 사상 네트워크(filamentous network))에 대해 나타낸 분포 패턴은 미토콘드리아에 대해 매우 뚜렷하다. 핵은 염색되지 않았으며, 염색은 세포 내부의 모든 곳에 있지 않다. 이것은 다른 세포소기관(cellular organelles)에 작용하는 화합물에 의한 부작용의 가능성을 크게 줄인다.
이러한 결과는 예시적인 짧은, 수용성, 방향족-양이온성 펩티드 서열에 비오틴의 접합이 비오틴의 세포 흡수를 상당히 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 도 2 및 도 4의 현미경 영상은 SS-31, SPN02, SPN07 및 SPN10에 비오틴의 접합이 2개의 상이한 세포주 (신장 및 망막 상피 세포)로의 비오틴 흡수를 크게 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 이 4개의 짧은 펩티드는 모두 "양이온성-방향족-양이온성-방향족" 서열 순서를 갖는 SS-31 및 SPN02와 "방향족-양이온성-방향족-양이온성" 서열 순서를 갖는 SPN07 및 SPN10와 함께 교대의 방향족-양이온성 모티프를 따른다. 모든 예시적인 펩티드는 수용성이다. SPN02는 펜타펩티드가 테트라펩티드와 마찬가지로 작용할 수 있으며 수용성임을 나타낸다. SS-31은 비-자연적으로 발생하는 아미노산 (2'6'-디메틸Tyr)이 자연적으로 발생하는 아미노산을 대체할 수 있음을 나타낸다. 또한, 이들 펩티드는 방향족 아미노산으로서 Tyr, Phe 또는 Trp의 사용 및 양이온성 아미노산으로서 Arg 또는 Lys의 사용을 지원한다. 예시적인 예는 아미노산이 D- 또는 L-배열일 수 있으며, C-말단의 아미드화가 미토콘드리아-전달에 영향을 미치지 않으나 in vivo에서 카복시펩티다제 분해에 대한 펩티드 안정성을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
C-말단 아미드화가 있는 또는 없는, D- 또는 L-배열의, 자연적으로 발생하는 또는 비-자연적으로 발생하는 아미노산으로 제조된 교대의 방향족-양이온성 모티프를 갖는 4-6 아미노산의 일반 펩티드는, 포유류 세포에서 비오틴의 세포 흡수를 향상시키기 위해 수용성 전달 벡터의 역할을 할 수 있다.
실시예 2 - 짧은 방향족-양이온성 펩티드 서열은 비오틴을 내부 미토콘드리아 막에 선택적으로 전달한다.
표 1에 열거된 특정 예시적인 교대의 방향족-양이온성 펩티드 서열은 내부 미토콘드리아 막을 선택적으로 표적화하며 국소화할 수 있다.
모든 펩티드-접합된 비오틴 분자에 대한 핵주위 분포 패턴 (도 2 및 도 4)은 이들이 사상 미토콘드리아 네트워크에 국소화됨을 시사한다.
펩티드-접합된 비오틴 분자의 미토콘드리아 국소화를 입증하기 위해, ARPE-19 인간 망막 색소 상피 세포를 혈청-없는 DMEM/F12 배지에서 2시간 동안 1 uM SPN05, SPN12 또는 SPN15와 함께 배양하였다. 세포를 10분 동안 RT에서 4% PFA로 고정한 다음, 10분 동안 RT에서 0.1% 트리톤 X-100으로 투과하였다. 세포를 30분 동안 RT에서 2% BSA (bovine serum albumin)로 차단한 다음, 내부 미토콘드리아 막에서 발현되는 주요 단백질 복합체인 시토크롬 c 옥시다제 아단위 4 (cytochrome c oxidase subunit 4, COX4)에 대한 1차 항체와 함께 배양하였다. 토끼 다클론 COX4 항체 (Invitrogen PA5-29992, Waltham, MA)를 밤새도록 4℃에서 2% BSA에 1:500 희석하여 사용하였다. 그 다음, 세포를 RT에서 30분 동안 2차 항체 (염소 항-토끼 Alexa Fluor 488, 1:500 희석, Invitrogen A-11008) 및 스트렙타비딘-Alexa Fluor 594 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 및 5 ug/ml Hoechst 33342 (Novus Biologicals, Centennial, CO)와 함께 배양하였다. 살아있는 세포 영상 완충제를 첨가하고, Nikon Eclipse Ti2 형광 현미경 (100X 오일 대물렌즈)을 이용하여 Alexa-594 형광, Alexa Fluor-488 및 Hoechst 형광을 관찰하였다.
도 6은 시토크롬 c 옥시다제와 함께 펩티드-접합된 비오틴 분자의 공동-국소화를 나타낸다. 상단 패널은 SPN15 (적색 염색), 시토크롬 c 옥시다제 (COX) (녹색 염색), 및 병합된 영상 (황색/주황색)의 대표적인 현미경 영상이다. 하단 패널은 COX 염색 (황색/주황색)과 병합된 SPN05 및 SPN12의 영상을 나타낸다. 모든 영상은 600x 배율로 나타내었다.
이러한 결과는 짧은 방향족-양이온성 펩티드 서열이 미토콘드리아에 비오틴을 표적하기 위한 전달 벡터로서의 역할을 할 수 있음을 나타낸다. COX4는 전자 수송 사슬(electron transport chain)의 말단 복합체 (복합체 IV)인 시토크롬 c 옥시다제의 아단위이다. COX 복합체는 내부 미토콘드리아 막에서 산화적 인산화를 위한 주요 조절 부위이다. COX4 염색을 이용한 SPN05, SPN12 및 SPN15의 비오틴 염색의 공동-국소화는 이러한 짧은 방향족-양이온성 펩티드 서열이 미토콘드리아-표적 서열로 작용하여 내부 미토콘드리아 막에 비오틴을 전달할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3 - 펩티드-접합된 비오틴 분자는 장기간의 혈청 기아에서 세포 성장을 촉진할 수 있다.
혈청 제거는 세포 ATP의 감소, 세포 주기 정지, 및/또는 아폽토시스를 야기할 수 있다. 혈청 결핍은 배양된 세포의 증식 능력을 저해할 수 있다. 특정 예시적인 펩티드-접합된 비오틴 분자와의 배양은 혈청-없는 조건 하에서 세포 생존율 (cell viability)을 촉진할 수 있다.
제 1 모델에서, HK-2 세포를 96-웰 플레이트에서 혈청-없는 DMEM 단독 또는 10 nM의 SPN11 또는 SPN12를 함유하는 혈청-없는 DMEM에서 11일 동안 배양하였다. 배양 배지는 3일마다 교체하였다.
제조사의 프로토콜에 따라, Alamar Blue Cell Proliferation Assay (Bio-Rad)를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. Alamar Blue는 레사주린(resazurin)을 사용하여 살아있는 세포의 환원력을 측정한다. 약한 형광 레사주린은 세포 대사에 의해 환원될 때 고도로 형광인 레사주린으로 환원된다. 간략하게, 알라마르 블루 (alamar blue) 시약 (10 ul)을 배양 배지에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 판독기 (SpectraMax iD3, Molecular Devices)를 이용하여 레조루핀(resorufin) (Ex/Em 530/590 nm)의 형광을 검출하였다.
도 7은 혈청 기아의 11일 후 HK-2 세포에서 세포 생존율을 나타내는 그래프이다. 단지 10 nM의 SPN11 또는 SPN12를 이용한 처리는 혈청이 없을 때 세포 생존율을 35%까지 크게 개선시켰다 (**P<0.005).
제 2 모델에서, ARPE-19 세포를 30일 동안 펩티드-접합된 비오틴 분자의 부재 또는 존재 하에 혈청-없는 DMEM에서 성장시켰다. 혈청-없는 배지에 10 nM의 SPN12, SPN15 또는 SPN16 화합물 (모두 10 nM)을 보충하고, 3일마다 교체하였다. 배양 배지는 3일마다 교체하였다. 도 8은 모든 3개의 SPN 화합물이 장기간 혈청 결핍 후에 세포 수를 증가시켰음을 나타내는 대표적인 현미경 영상이다.
도 9는 SPN12, SPN15 및 SPN16을 이용한 처리가 대조군에 비해 혈청 결핍의 30일 후에 세포 생존율을 유의하게 2배로 증가시켰음을 나타낸다. 자료는 각 처리에 대한 6개 시료의 평균 ± SEM을 나타낸다 (**P<005; ***P<0.001, 대조군에 비해).
이러한 결과는 단지 10 nM의 펩티드-접합된 비오틴 분자의 첨가가 혈청-없는 조건에서 세포 생존을 현저하게 2배로 늘릴 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 예시적인 미토콘드리아-표적 비오틴 분자가 적어도 2개의 상이한 포유류 세포 시스템에서 세포 생존을 보호하기 위해 생물학적으로 활성 (즉, 이들은 세포 생물학을 변경함)임을 나타낸다.
실시예 4 - 펩티드-접합된 비오틴 분자는 혈청-없는 및 영양-결핍된 배양에서 세포 ATP 함량을 증가시켰다.
혈청 제거는 세포 ATP의 감소를 야기할 수 있다. 특정 예시적인 펩티드-접합된 비오틴 분자는 혈청-결핍 및/또는 영양-결핍 조건에서 세포 ATP 수준을 증가시킬 수 있다.
인간 신장 상피 세포 (HK-2)를 1 g/L 글루코오스 및 10% 소 태아 혈청 (FBS), 100 단위/ml 페니실린, 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2가 있는 가습 배양기에서 배양하였다. HK-2 세포를 5 x 103 세포의 초기 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 씨딩하였다. FBS를 배양 배지로부터 제거하였으며, 세포를 혈청-없는 DMEM 단독 (대조군) 또는 10 nM의 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자를 함유하는 혈청-없는 DMEM에서 7일 동안 배양하였다. 모든 처리는 각 실험에서 N=6으로 수행되었다. 배양 배지는 3일마다 교체하였다.
인간 망막 색소 상피 세포 (ARPE-19)를 1 g/L 글루코오스 및 10% 소 태아 혈청 (FBS), 100 단위/ml 페니실린, 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2가 있는 가습 배양기에서 배양하였다. ARPE-19 세포를 5 x 103 세포의 초기 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 씨딩하였다. FBS를 배양 배지로부터 제거하였으며, 세포를 혈청-없는 DMEM/F12 단독 (대조군) 또는 10 nM의 비오틴 또는 상이한 펩티드-접합된 비오틴 분자를 함유하는 혈청-없는 DMEM/F12에서 7일 동안 배양하였다. 모든 처리는 각 실험에서 N=5-6으로 수행되었다. 배양 배지는 3일마다 교체하였다.
제조사의 프로토콜에 따라 ApoSENSOR ATP Bioluminescence Assay Kit (BioVision)를 이용하여 ATP를 측정하였다. 이 키트는 루시페라제(luciferase)를 이용하여 ATP 및 루시페린(luciferin)으로부터 빛의 형성을 촉매한다. 간략하게, 세포를 100 ul의 핵 방출 완충제로 RT에서 5분 동안 부드럽게 흔들면서 처리하였다. 10 ul의 ATP 모니터링 효소를 세포 용해물에 첨가하고 마이크로플레이트 판독기 (SpectraMax iD3, Molecular Device)를 이용하여 발광을 측정하였다. ATP 수준은 혈청-없는 DMEM 대조군 (임의로 1.0으로 설정됨)으로 정규화되었다.
모든 펩티드-접합된 비오틴 분자는 혈청-없는 조건에서 7일 후 HK-2 세포에서 유리 비오틴에 비해 더 높은 ATP 농도를 야기하였다 (도 10). 나타낸 자료는 처리당 6개 시료의 평균 ± SEM이다. SPN08, SPN09, SPN11, SPN12, SPN15, 및 SPN16은 혈청-없는 조건에서 유리 비오틴에 비해 ATP 수준을 35% - 100%까지 증가시켰다 (**P<0.005; ***P<0.001).
또한, 펩티드-접합된 비오틴 분자는 혈청 기아의 7일 후 ARPE-19 세포에서 ATP 농도를 유의하게 증가시켰다. 나타낸 자료는 처리당 6개 시료의 평균 ± SEM이다. 펩티드-접합된 비오틴 분자는 유리 비오틴에 비해 ATP 수준을 60-75%까지 증가시켰다 (***P<0.001) (도 11).
제 2 모델은 HK-2 세포가 PBS (인산염 완충 식염수) 내 혈청-없는 5% DMEM에서 3일 동안 96-웰 플레이트에서 배양되는 극도의 기아 모델을 사용한다. 세포를 10 nM 유리 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자로 처리하였다. 모든 처리는 각 실험에서 N=6으로 수행되었다.
모든 펩티드-접합된 비오틴 분자는 극도의 기아에서 유리 비오틴에 비해 상당히 높은 ATP 농도를 야기하였다. 나타낸 자료는 처리당 6개 시료의 평균 ± SEM이다. (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001), SPN11 및 SPN12는 ATP 함량을 2배로 늘렸다 (도 12).
이러한 결과는 예시적인 미토콘드리아-표적 비오틴 분자가 적어도 2개의 상이한 포유류 세포 시스템에서 혈청-결핍 및 영양-결핍 조건 하에서 미토콘드리아 ATP 합성을 촉진하는 생물학적으로 활성임을 나타낸다.
실시예 5 - 펩티드-접합된 비오틴 분자는 미토콘드리아 전위를 회복시킬 수 있으며, 혈청 기아로 인한 미토콘드리아 단편화를 방지할 수 있다.
혈청 결핍은 ATP 합성의 감소에 선행하는 미토콘드리아 탈분극을 유발할 수 있다. 특정 예시적인 펩티드-접합된 비오틴 분자는 혈청-없는 배지에서 배양된 세포에서 미토콘드리아 전위를 회복시킬 수 있다.
내부 미토콘드리아 막의 전자 수송 사슬을 따라 전자 전달은 미토콘드리아 매트릭스로부터 막간(inter-membrane) 공간으로 양성자의 펌핑을 야기한다. 이것은 내부 미토콘드리아 막을 가로지르는 전위를 생성하며, 양성자 구배는 ADP로부터 ATP를 생산하기 위해 ATP 합성효소 (복합체 V)를 구동하는 역할을 한다. 혈청 또는 영양소의 회수는 미토콘드리아 전위의 감소 및 ATP 생산의 감소를 야기한다.
인간 망막 색소 상피 세포 (ARPE-19)를 1 g/L 글루코오스 및 10% FBS, 100 단위/ml 페니실린, 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2가 있는 가습 배양기에서 배양하였다. ARPE-19 세포를 5 x 104 세포의 초기 밀도로 35 mm 유리 플레이트에 씨딩하였다. FBS를 3일 동안 배양 배지로부터 제거하여 내인성 비오틴을 고갈시켰다. 그 다음, 세포를 혈청-없는 DMEM/F12 단독 (대조군) 또는 1 uM의 SPN12 또는 SPN15를 함유하는 DMEM/F12에서 2시간 동안 배양하였다.
미토콘드리아 전위를 결정하기 위해, 살아있는 세포를 페놀 레드가 없는 DMEM에서 5 nM 테트라메틸로다민 메틸 에스터 (TMRM, #70017, Biotium, Fremont, CA)와 함께 배양하였다. TMRM은 전위-의존적 형광 염료이다 (Ex/Em = 548/573). TMRM은 음전하를 띤 분극(negatively charged polarized) 미토콘드리아에 축적되며, 적색 형광으로 검출될 수 있다. 총 미토콘드리아는 미토콘드리아 전위-독립적 형광 염료 (100 nM MitoView Green; Ex/Em = 490/523; #70054, Biotium, Fremont CA)로 영상화되었다. Hoechst 33342 (10 ug/ml, Novus Biologicals, Centennial, CO)를 염색 핵에 첨가하였다. 살아있는 세포를 인산염 완충제로 덮고, 60x 물 대물렌즈를 이용한 Nikon Eclipse Ti 형광 현미경을 이용하여 영상화하였다.
도 13 (상단 패널)은 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12에서 3일 동안 배양된 ARPE-19 세포의 대표적인 형광 현미경 영상이다. 도 13 (하단 패널)은 혈청-없는 DMEM/F12에서 3일 동안 배양된 ARPE-19 세포의 대표적인 영상이다. TMRM (적색)은 혈청 대조군과 비교할 때 혈청-없는 조건에서 미토콘드리아 전위의 극적인 손실을 나타낸다. 또한, 미토그린 (녹색) 염색은 혈청-없는 조건으로 인해 미토콘드리아가 명확한 사상 네트워크 없이 핵주위 패턴으로 단편화되고 응집됨을 나타낸다. 영상을 병합하면, 혈청이 없는 모든 세포에서 미토콘드리아 탈분극을 볼 수 있다.
도 14는 10% FBS (혈청 대조군) 또는 혈청-없는 배지 (serum-free) 단독 또는 1 uM의 SPN12 또는 SPN15와 함께 2시간 배양 후 혈청-없는 배지에서, 3일 동안 배양된 ARPE-19 세포의 대표적인 형광 현미경 영상이다. 나타낸 영상은 TMRM (적색) 및 MitoGreen (녹색)의 병합된 영상이다. SPN 화합물과의 2시간 배양은 모든 세포에서 미토콘드리아 전위를 회복시키며, 혈청 기아의 3일 후 ARPE-19 세포에서 사상 미토콘드리아 네트워크를 회복시키기에 충분하였다.
이러한 결과는 미토콘드리아가 혈청 기아의 3일 후에 완전히 탈분극되며, 세포의 미토콘드리아 네트워크가 단편화됨을 나타낸다. 펩티드-접합된 비오틴 분자 (SPN12 및 SPN15)는 혈청 기아에서 약 2시간 내에 미토콘드리아 전위를 구조할 수 있다. 이러한 결과는 방향족-양이온성 펩티드 서열에 접합된 비오틴이 내부 미토콘드리아 막을 표적으로 하며, 내부 미토콘드리아 막을 가로지르는 전위를 보호하는데 생물학적으로 활성임을 확인한다.
실시예 6 - 펩티드-접합된 비오틴 분자는 상처 복구에서 유리 비오틴보다 더 효과적이다.
특정 예시적인 펩티드-접합된 비오틴 분자는 세포 배양에서 상처 치유를 가속화할 수 있다. in vitro 스크래치 분석은 in vitro "상처 부위"에서 세포 증식 및 이동을 측정하는 쉽고 잘 개발된 방법이다. 이 분석은 피펫 팁으로 세포 단층에 "스크래치"를 생성한 다음, 세포가 증식하고 스크래치를 닫기 위해 이동하는 속도를 검사하는 것을 포함한다.
HK-2 세포를 10% FBS, 100 단위/ml 페니실린, 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM (1 g/L 글루코오스)에서 배양하였다. 실험 전 하루 동안, 5% CO2가 있는 가습 배양기에서 37℃에서 DMEM 내 6-웰 플레이트에 3x105 세포를 웰당 플레이팅하였다. in vitro에서 상처의 미세환경을 모방하기 위해, 스크래치 분석에 혈청-없는 배지를 사용하였다. 스크래치 분석 당일, 배지를 혈청-없는 DMEM으로 교체하고 p1000 피펫 팁을 이용하여 세포 단층을 가로질러 선을 긁었다. 세포를 세척하여 세포 잔해(cell debris)를 제거하고, DMEM 단독 (대조군), 또는 10 nM 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자를 함유하는 DMEM으로 교체하였다.
Nikon Eclipse Ti2 형광 현미경을 이용하여 스크래치 영역을 즉시 (0일) 검사하였다. 4x 대물렌즈를 이용하여 각 시료에 대해 6개의 상이한 필드를 포획하였다. NIH Image (National Institute of Health)에서 영감을 받은 오픈 소스 Java 영상 처리 프로그램인 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 스크래치 영역 (세포-없는 구역(zone))을 계산하였다. 스크래치 영역을 24시간 (1일) 후 재검사하였으며, 영역은 동일한 시료에 대해 0일에 결정된 영역으로 정규화되었다. 모든 결과는 무-처리 대조군으로부터의 변화로 계산되었으며, 6개 필드에 대해 평균을 내었다.
도 15는 10 nM SPN11 또는 SPN12로 처리하여 기계적 스크래치 후 24시간에 HK-2 세포에서 스크래치의 폐쇄를 크게 가속화한 것을 나타내는 대표적인 현미경 영상이다. 24시간 후 결정된 스크래치 영역은 각 처리군에 대해 스크래치의 적용 직후 (0일) 결정된 영역으로 정규화된다. 비오틴은 스크래치 영역을 줄이는데 약간의 영향을 미쳤지만, 스크래치 영역은 24시간 내에 SPN11 및 SPN12에 의해 거의 완전히 닫혔다.
도 16은 HK-2 세포에서 기계적 스크래치의 적용 후 24시간에, 비오틴, SPN11 및 SPN12가 스크래치 영역의 감소에 미치는 영향을 요약한다. 모든 처리는 스크래치 영역의 폐쇄를 상당히 가속화하였다 (***P<0.001, 대조군에 비해). 비오틴-접합된 펩티드 (SPN11 및 SPN12)는 비오틴에 비해 스크래치 영역의 감소에 2배 효과적이다 (P<0.001).
도 17은 다른 펩티드-접합된 비오틴 분자인 SPN15 및 SPN16도 HK-2 세포의 또 다른 실험에서 24시간 후 스크래치 영역의 폐쇄를 상당히 가속화하였으며 (***P<0.001), 유리 비오틴 (P<0.001)에 비해 3배 더 효과적임을 나타낸다.
또한, 펩티드-접합된 비오틴 분자 (SPN12, SPN15 및 SPN16)는 ARPE-19 세포에서 상처 치유를 가속화하였다 (도 18). 도 19는 펩티드-접합된 비오틴 분자가 스크래치 영역에 미치는 영향을 요약한 그래프이다 (**P<0.01; ***P<0.001). 펩티드-접합된 비오틴 분자는 유리 비오틴 (P<0.001)에 비해 상당히 더 효과적 (1.5 내지 2배)이었다.
이러한 결과는 펩티드-접합된 비오틴 분자가 생물학적으로 활성일 뿐만 아니라, in vitro에서 상처 치유를 촉진하는데 유리 비오틴보다 우수함을 나타낸다.
실시예 7 - 펩티드-접합된 비오틴 분자는 상처 부위에서 세포 증식을 촉진할 수 있다.
상처 부위의 재-상피화는 상처 가장자리에서 세포의 증식을 필요로 하며, 이는 세포 증식에 필요할 수 있는 영양소 및/또는 성장 인자(들)을 전달하기 위한 혈류의 부족으로 인해 대부분의 상처에서 손상될 수 있다. 상처 가장자리의 세포 증식은 증식 세포 핵 항원 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 염색으로 모니터링될 수 있다. in vitro에서 상처의 미세환경을 모방하기 위해, 혈청-없는 배지를 세포 배양의 스크래치 분석에 사용하였다.
IHC World에 제시된 표준 절차에 따라 증식 세포 핵 항원 (PCNA)에 대한 항체로 면역염색하여 증식 세포를 확인하였다. 스크래치 영역의 결정 후, 동일한 세포 플레이트를 이용하여 PCNA 염색을 수행하였다. HK-2 세포를 -20℃에서 30분 동안 에탄올:메탄올 (1:1)로 고정하고, RT에서 10분 동안 0.1% 트리톤 X-100/PBS로 투과하며, RT에서 30분 동안 2% 염소 혈청으로 차단하고, RT에서 30분 동안 1차 마우스 항-PCNA 항체 (Dako Agilent, Santa Clara, CA) 및 2차 염소 항-마우스 IgG-BI와 함께 배양하였다. 그 다음, 세포를 스트렙타비딘-Alexa Fluor 594 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 및 Hoechst (Novus Biologicals, Centennial, CO)와 함께 배양하고, Nikon Eclipse Ti2 형광 현미경 (20x 대물렌즈)으로 영상화하였다. 모든 세포 핵은 Hoechst로 청색으로 염색되나, 증식 세포의 핵은 적색으로 염색된다. 필드당 증식 세포의 수를 적색 핵 염색의 강도로 정량화하고, 청색 핵 염색의 강도로 정규화하였다 (Nikon NIS-Elements Imaging Software로 결정됨).
도 20은 혈청-없는 배지 단독 (대조군), 또는 예시적인 SPN 화합물 (10 nM)을 함유하는 혈청-없는 배지에서 기계적 스크래치 후 24시간에 HK-2 인간 신장 상피 세포 단층의 대표적인 현미경 영상 (x40 배율)을 나타낸다. 증식 세포 핵 항원에 양성인 세포는 적색으로 나타낸다. 다른 모든 핵은 청색으로 나타낸다. 유리 비오틴에 비해, SPN11 및 SPN12는 스크래치의 가장자리에서 증식 세포의 수를 증가시켰다.
도 21은 혈청-없는 배지 단독 (대조군), 또는 10 nM 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자가 보충된 혈청-없는 배지에서 기계적 스크래치 후 24시간에 HK-2 인간 신장 상피 세포 단층에서 증식 세포의 수를 요약한 그래프이다. 증식 세포의 수는 모든 핵에 대해 정규화되었다. 비오틴의 효과는 작았으며, 통계적 유의성에 도달하지 못하였다. SPN11 및 SPN12와의 배양은 대조군 또는 비오틴에 비해 스크래치의 가장자리에서 증식 세포의 수를 2배로 늘렸다 (***P<0.001).
도 22는 혈청-없는 배지 단독 (대조군), 또는 10 nM 유리 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자가 보충된 혈청-없는 배지에서 기계적 스크래치 후 24시간에 ARPE-19 인간 망막 색소 상피 세포 단층의 대표적인 현미경 영상 (x40 배율)을 나타낸다. 증식 세포 핵 항원에 양성인 세포는 적색으로 나타낸다. 다른 모든 핵은 청색으로 나타낸다. SPN08, SPN09, SPN11, 또는 SPN12와의 배양은 스크래치의 가장자리에서 증식 세포의 수를 증가시킨 반면, 10 nM 비오틴은 세포 증식에 영향을 미치지 않았다.
도 23은 혈청-없는 배지 단독 (대조군), 또는 10 nM 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자를 함유하는 혈청-없는 배지에서 기계적 스크래치 후 24시간에 ARPE-19 인간 망막 색소 상피 세포 단층에서 증식 세포의 수를 요약한 그래프이다. 증식 세포의 수는 모든 핵에 대해 정규화되었다. SPN09, SPN11, SPN12, SPN15, 및 SPN16 각각과의 배양은 스크래치의 가장자리에서 증식 세포의 백분율을 35-100%까지 상당히 증가시켰으나, 비오틴 자체는 효과가 없었다 (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, 대조군에 비해).
이러한 결과는 펩티드-접합된 비오틴 분자가 상처 부위에서 세포 증식을 촉진하는데 비오틴 단독보다 더 효과적이며, 이는 미토콘드리아에 비오틴의 전달 증가로 인한 것일 수 있음을 나타낸다.
실시예 8 - 펩티드-접합된 비오틴 분자는 상처 가장자리에서 세포의 미토콘드리아 전위를 보호한다.
신속하게 분열하는 세포는 중요한 빌딩 블록의 합성을 지원하기 위해 ATP를 필요로 할 수 있다. 조직 손상은 ATP 생산을 손상시키며 및/또는 세포 사멸을 야기하는 신속한 미토콘드리아 탈분극을 야기할 수 있다. ATP의 손실은 세포 증식 및/또는 조직 복구를 더 손상시킬 수 있다. 미토콘드리아 전위는 세포-투과성 전위-의존적 염료 TMRM (테트라메틸로다민 메틸 에스터)을 이용하여 스크래치 영역의 가장자리에 있는 세포에서 모니터링될 수 있다. TMRM은 음전하를 띤 분극 미토콘드리아에 축적될 수 있으며, 적색 형광으로 검출될 수 있다.
in vitro에서 상처의 미세환경을 모방하기 위해, 스크래치 분석에 혈청-없는 배지를 사용하였다. 스크래치 분석 당일, 배지를 혈청-없는 DMEM으로 교체하고 p1000 피펫 팁을 이용하여 HK-2 세포 단층을 가로질러 선을 긁었다. 세포를 세척하여 잔해를 제거하고, 24시간 동안 DMEM 단독 (대조군), 또는 10 nM 유리 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자가 보충된 DMEM으로 교체하였다. 그 다음, HK-2 세포를 페놀 레드가 없는 DMEM에서 5 nM TMRM과 함께 배양하고 30분 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 살아있는 세포 영상 완충제로 덮고, Nikon Eclipse Ti2 형광 현미경 (20x 대물렌즈)을 이용하여 영상화하였다.
도 24는 혈청-없는 배지 단독 (대조군), 또는 10 nM 비오틴, SPN11, 또는 SPN12를 함유하는 혈청-없는 배지에서 기계적 스크래치 후 24시간에 HK-2 세포에서 미토콘드리아 전위의 대표적인 현미경 영상 (200x 배율)을 나타낸다. 미토콘드리아 전위는 TMRM으로 검출되며, 이는 적색으로 염색하고, 핵은 Hoechst로 청색으로 염색된다. 대조 조건 하에서, 스크래치의 가장자리에 있는 소수의 세포는 TMRM 염색을 나타내었으며, 이는 많은 세포가 미토콘드리아 탈분극을 겪었음을 나타낸다. 10 nM SPN11 또는 SPN12의 첨가는 우수한 미토콘드리아 전위를 가진 세포의 수를 증가시킨 반면, 비오틴은 효과가 없었다.
도 25는 혈청-없는 배지 단독 (대조군), 또는 10 nM 비오틴 또는 펩티드-접합된 비오틴 분자를 함유하는 혈청-없는 배지에서 기계적 스크래치 후 24시간에 HK-2 세포에서 핵 수(nuclear number) (청색 형광)로 정규화된 미토콘드리아 전위 (적색 형광)의 비를 요약한 그래프이다. SPN11, 또는 SPN12와의 배양은 스크래치의 가장자리에 있는 세포의 미토콘드리아 전위를 상당히 증가시켰다 (***P<0.001, 대조군에 비해). 유리 비오틴의 효과는 통계적 유의성에 도달하지 않았다.
이러한 결과는 비오틴-접합된 펩티드 (SPN11 및 SPN12)가 내부 미토콘드리아 막으로의 이들의 표적 전달 때문에 상처 부위에서 미토콘드리아 전위를 보존하는데 유리 비오틴보다 우수함을 나타낸다. 이는 ATP 생산 및 세포 증식의 더 나은 증가로 해석될 수 있다.
실시예 9 - 복강내 투여 후 마우스 망막에 대한 SPN15의 흡수 및 분포
펩티드-접합된 비오틴 분자가 in vivo에서 투여될 수 있음을 나타내기 위해, 복강내 (ip) 투여 후 마우스에서 SPN15의 흡수 및 분포를 결정하였다.
SPN15 (30 mg/kg)를 13-월령 수컷 마우스 (C57BL/6J 계통)에 ip 투여하였다. 투여 후 2시간에, 과량의 케타민/자일라진으로 마우스를 마취시키고 눈을 적출하였다. 각막과 수정체(lens)를 제거한 후, 세안컵(eyecup)을 0.1M Tris 완충제 내 4% 파라포름알데히드에 1.25시간 동안 고정시켰다. 그 다음, 세안컵을 Tris 완충제에서 각각 10분 동안 3회 헹군 다음, Leica 3050 저온유지장치(cryostat)로 30 um에서 절편화하기 전에 10%, 20%, 및 30% 수크로오스로 동결보호하였다. 절편을 사용할 때까지 -200℃에서 저장하였다.
SPN15에 비오틴을 표지하기 위해, 절편을 Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA로부터의 스트렙타비딘 접합된 AlexaFluor 594 (1:500)와 함께 배양하였다. ToPro 3 (핵 염색, 1:1000, Molecular Probes)를 사용하여 세포 핵을 염색하였다. Cox IV (시토크롬 c 옥시다제 아단위 4; PA529992, 1:300, Invitrogen) 및 Mitotracker Red (1:1500 in Tris, Invitrogen)에 대한 항체를 이용하여 미토콘드리아 국소화를 결정하였다. 모든 배양은 Cox IV 및 Mitotracker 표지를 제외하고 마이크로파 (150W)에서 수행되었으며, 이는 4℃에서 밤새도록 1차 항체로 수행된 후 2차 항체 (AF488 접합된 당나귀 항-토끼, Jackson Immunoresearch)로 수행되었다. 1024 x 1024의 해상도에서 40x 오일 침지 수정체를 이용하여, 헬륨, 아르곤 및 네온 레이저와 함께 Olympus Fluoview 300을 이용하여 절편을 영상화하였다.
도 26 (좌측 패널)은 망막의 상이한 층에서 TOPRO (청색)로 표지된 핵을 나타내는 펩티드 투여가 없는 대조군 마우스로부터의 저온유지장치 절편이며, 여기서 OS = 외부 절편; IS = 내부 절편; ONL = 외핵층; OPL = 외망상층(outer plexiform layer); INL = 내핵층; IPL = 내망상층; RGC = 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell).
도 26 (우측 패널)은 내부 미토콘드리아 막에서 발현된 단백질인 COX4 (녹색), 미토콘드리아를 표지하는 형광물질인 Mitotracker Red (적색), 및 핵을 표지하는 TOPRO (청색)에 대해 염색된 대조군 마우스로부터의 저온유지장치 절편이다. 미토콘드리아에 대한 COX4 염색은 이의 풍부한 미토콘드리아가 있는 광수용체 IS, 및 INL, IPL 및 RGC에서 명확하게 볼 수 있다. 광수용체 OS에서 Mitotracker Red의 염색은 OS에 미토콘드리아가 없기 때문에 놀랍다.
도 26 (중간 패널)은 SPN15 투여 후 2시간에 마우스로부터의 저온유지장치 절편이다. SPN15는 스트렙타비딘 Alexa Fluor 594 (적색) 염색에 의해 시각화된 망막의 상이한 층에서 명확하게 흡수된다. SPN15 염색은 내핵층 (INL) 및 광수용체에서 신경절, 양극성 및 무축삭(amacrine) 세포 사이의 시냅스가 있는 내망상층 및 외망상층 (IPL 및 OPL)에 집중되어 있다. 스트렙타비딘 염색은 RGC, IPL, INL, 및 광수용체 IS에서 COX4 염색과 함께 공동-국소화한다. 예외는 COX4 염색이 없는 광수용체 OS의 강렬한 스트렙타비딘 염색이다. SPN15가 광 변환(light transduction)을 담당하는 조밀하게 채워진 디스크를 함유하는 OS에 너무 많이 분포되는 이유는 불분명하다.
도 27은 광수용체 IS 및 OS의 확대도이다. 망막 색소 상피 (RPE)는 OS 위의 단일 세포층이다. SPN15 염색은 RPE 세포에서 명확하게 볼 수 있다.
이러한 결과는 SPN15가 살아있는 마우스에서 ip 투여 후 신속하게 흡수되며 망막 전체에 널리 분포됨을 나타낸다. 포유류 망막에 공급하는 2개의 혈액 공급원이 있다: 중심 망막 동맥(central retinal artery) 및 맥락막 혈관(choroidal blood vessels). 중심 망막 동맥은 시신경에서 시작하여 내부 망막 층에 공급한다. 맥락막 혈류는 외부 망막 (광수용체 및 망막 색소 상피 (RPE))의 유지에 필수적이다. 스트렙타비딘 염색은 SPN15가 두 혈관 시스템을 통해 분포됨을 나타낸다.
SPN15 염색은 내망상층 및 외망상층 (IPL 및 OPL)에 집중되어 있다. 외핵층 (ONL)은 간상체 및 원추체의 세포체를 함유하며, 내핵층 (INL)은 신경절 세포, 수평 세포 및 무축삭 세포의 세포체를 함유한다. OPL은 간상체와 원추체 사이의 시냅스, 및 수직으로 실행되는 양극성 세포 및 수평 방향 세포가 발생하는 곳이다. IPL은 양극성 세포에서 신경절 세포로의 중계소(relay station) 역할을 하며, 이는 시각 영상에 관한 메시지가 시신경을 따라 뇌로 전달되는 곳이다.
SPN15는 간상체 및 원추체 광수용체의 대사를 지원하기 위해 매우 길고 얇은 미토콘드리아 집합체를 함유하는 내부 절편 (IS)에도 집중되어 있다. 미토콘드리아의 밀도로 인해 IS에서 SPN15의 높은 농도가 예상된다. 이 미토콘드리아는 시각적 변환을 위한 시각적 색소 분자 (로돕신)를 함유하는 외부 절편 (OS)에 있는 수많은 지질 디스크의 생합성에서 역할을 한다. OS에서 SPN15의 매우 높은 농도는 미토콘드리아가 완전히 없기 때문에 예상치 못한 것이다. 이것은 OS에서 COX4에 대한 염색 부족으로 확인된다. Mitotracker에 의한 OS의 염색은 보고되었으나, 그 이유는 불분명하며 추가 조사가 필요하다. OS에서 SPN15의 농도는 디스크 안정성 유지에 중요할 수 있다.
OS 디스크는 광-유도 산화적 손상을 겪으며, 일반적으로 망막 색소 상피 (RPE)에 의해 식균되고(phagocytized), 리소좀 분해에 의해 분해되어, 로돕신이 재활용되며 광수용체에 의해 대사 연료로 사용될 수 있는 케톤체가 생성된다. RPE는 혈액-망막 장벽을 형성하는 맥락막과 OS 사이의 단일 세포층이다. RPE 층에서 SPN15의 분포는 도 27에서 강조된다.
이러한 결과는 SPN15가 전신 투여 후 망막의 높은 미토콘드리아 밀도의 영역에 분포될 수 있음을 확인한다. 이들은 SPN15 및 기타 펩티드-접합된 비오틴 분자가 수많은 안과 질환에 유익할 수 있음을 시사한다. RPE의 표적화는 SPN15가 노화에서 미토콘드리아 생체에너지를 개선하고 노화-관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막증을 퇴치할 수 있음을 시사한다. 이것은 SPN 화합물이 인간 망막 색소 상피 세포주인 ARPE-19 세포에서 미토콘드리아 전위를 보존하며, ATP 합성을 증가시키고, 세포 생존율을 개선하며, 세포 증식을 증가시킨다는 결과에 의해 뒷받침된다. 또한, SPN15는 녹내장(glaucoma)으로 인한 압력 증가 하에서 망막 신경절 세포의 생존율을 증가시켜 시신경 손상을 야기할 수 있다.
정의
본 명세서에서 하기의 문구가 실질적으로 사용되는 경우, 수반되는 정의를 적용한다. 이러한 문구 및 정의는 편견 없이 제시되며, 출원과 일치하게, 본 출원 또는 우선권을 주장하는 모든 출원의 절차 동안 보정을 통해 이러한 문구를 재정의할 수 있는 권리가 있다. 우선권을 주장하는 특허의 청구항을 해석할 목적으로, 해당 특허의 각 정의는 해당 정의 이외의 주제에 대한 명확하고 모호하지 않은 부인 (disavowal)으로 기능한다.
a - 적어도 하나.
활성 - 작용(action), 작용(act), 단계, 및/또는 공정 또는 이의 일부.
적응시키다 - 특정 목적, 기능, 사용, 및/또는 상황에 맞게 설계하며, 제조하고, 설정하며, 배열하고, 형상화하며, 구성하고, 및/또는 적합하게 하다.
첨가하다 - 크기, 양, 효과, 및/또는 범위를 증가시키기 위하여 (무언가를) 다른 것에 결합 및/또는 통합하다.
투여하다 - 제공하다 및/또는 적용하다.
알콜 - 메틸알콜 (CH3OH) 또는 에틸알콜 (C2H5OH)에서와 같이, R은 알킬 기를 나타내며 -OH는 히드록실 기를 나타내는 일반식 ROH를 갖는 화합물의 종류 중 하나.
교대의 - 시리즈의 다른 모든 것을 지정하거나 또는 관련시키는 것.
아민 - 하나 이상의 수소 원자가 탄화수소 기로 대체된 암모니아 유도체로 간주될 수 있는, 에틸아민 C2H5NH2와 같은 질소의 유기 화합물 군 중 하나.
아미노산 - 적어도 하나의 아미노 기 및 적어도 하나의 카복실 기가 동일한 탄소 골격에 결합되며, 아미노 기의 질소 원자가 고리의 일부를 형성할 수 있는 화합물, 이러한 화합물은 천연 아미노산의 L- 및 D-이성질체를 포함한다.
및 -　~와 함께.
및/또는 - 함께 또는 대안으로.
항생제 - 다른 미생물, 특히 박테리아의 성장을 파괴하거나 또는 저해할 수 있는 균류(fungi) 및 박테리아를 포함하여, 특정 미생물에 의해 생산된 및/또는 특정 미생물로부터 유래된, 페니실린 또는 에리트로마이신과 같은 물질. 항생제는 감염성 질환(infectious diseases)의 예방 및 치료에 널리 사용된다.
항경련제(anticonvulsant) - 경련을 예방하거나 또는 없애기 위해 사용되는 약물의 종류 중 하나.
항산화제 - 활성 산소 종의 생성을 감소시키는 물질, 다른 물질의 산화를 저해하는 물질, 산화에 의한 다른 물질의 변패(deterioration)를 지연시키는 물질, 및/또는 자유 라디칼 종, 활성 산소 종, 히드록실 라디칼 종, 산화 지질, 및/또는 지질 과산화 생성물의 스캐빈저.
임의의(any) - 명세서 없이 하나, 일부, 모든, 및/또는 모두.
장치 - 특정 목적을 위한 기기 또는 장치.
대략 - 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용가능한 오차 이내 (이는 부분적으로 값이 측정되거나 또는 결정되는 방법에 따라 달라짐); 하나의 표준 편차 이내; 특정 오차 범위 (예를 들어, 차트 또는 자료 표에 제공된 평균값에 대한 표준 편차)가 열거되지 않은 경우, 열거된 값을 포함하고, 유효 숫자(significant figures)를 고려하여 열거된 값으로 반올림 또는 내림하여 포함되는 범위; 및/또는 지정된 값(specified value)의 ± 20%, 15%, 10% 또는 5% 이내;의 일련의 2 이상의 수치 값의 각각의 값을 포함하여 약 및/또는 거의 동일함.
방향족 - 벤젠 고리를 갖는 화합물을 포함하여, 교대의 이중 결합 및 단일 결합을 함유하는 불포화 고리를 갖는 유기 화합물.
배열하다 - 특정 순서로 처리하다.
연관시키다(associate) - 결합하다, 함께 연결하다, 및/또는 관련되다.
~에서(at) - 안에, 위에, 및고/또는 근처에 (in, on, and/or near)
적어도 - 문구 "적어도"가 선행하는 임의의 일련의 값의 각각의 값에 적용되는 것보다 적지 않고(not less than), 가능하게는 그 이상이다.
있다(be) - 실제로 존재하다.
생물학적 활성 - 세포 생물학을 변경하도록 구성된다.
비오틴 - 비타민 B 복합체의 결정질, 수용성 비타민 C10H16O3N2S로, 때때로 비타민 B7 및/또는 비타민 H라고 한다.
비오티니다제(biotinidase) - 인간에서 비오틴 아미드를 쉽게 절단 및/또는 분해하여 유리 비오틴 및 아민을 방출하는 BTD 유전자에 의해 인코딩되며, 주요 기질이 비오시틴 또는 리신에 연결된 비오틴인 효소; 또한, 비오티니다제는 비오틴 에스터를 분해할 수 있다.
비오티닐화 - 하나 이상의 말단에 위치한 비오틴 분자를 갖는 폴리펩티드.
C-말단 - (카복실-말단, 카복시-말단, C-말단 꼬리, C-말단 끝, 또는 COOH-말단으로도 알려짐) 자유 카복실 기 (-COOH)로 끝나는 아미노산 사슬 (단백질 또는 폴리펩티드)의 끝.
할 수 있다(can) - 적어도 일 실시예에서 할 수 있다.
담체 - 유효 성분 및/또는 제제를 적용 및/또는 전달하는 방식으로 유효 성분 및/또는 제제가 첨가되는 물질.
양이온성 - 양전하를 가지며, 특징적으로 전기분해에서 음극(negative electrode)을 향해 이동하는 이온 또는 이온 군.
야기하다 - 초래하다, 유발하다, 촉진시키다, 생산하다, 이끌어내다, 이유가 되다, 결과를 초래하다, 및/또는 영향을 미치다.
~에 의해 야기된(caused by) - 기인한(resulting from)
세포 - 모두 반투과성 세포막으로 둘러싸인, 세포질, 일반적으로 하나의 핵, 및 다양한 기타 소기관으로 이루어진, 독립적으로 기능할 수 있는 유기체의 가장 작은 구조 단위.
세포-투과성 - 수동적으로 세포 안팎으로 자유롭게 이동할 수 있다.
세포의(cellular) - 세포의, 세포와 관련된, 또는 세포로 이루어진.
화학적으로-정의된 배지 - 배지 내 모든 성분이 정확한 농도로 확인되며, 배지에 동물 또는 인간 혈청, 성장 인자, 호르몬 등이 첨가되지 않은 배지.
물질의 조성물 - 2 이상의 물질 및/또는 요소로부터 인간 및/또는 자동화에 의해 형성된 조합물, 반응 생성물, 화합물, 혼합물, 제형, 물질 및/또는 합성물 (composite).
화합물 - 물리적 수단으로 분리될 수 없는 명확한 비율의 2 이상의 상이한 원소의 원자 또는 이온으로 이루어진 순수하고, 거시적으로 균질한 물질. 화합물은 일반적으로 구성 요소와 다른 특성을 가진다.
포함하는 - 포함하나 이에 한정되지 않는.
구상하다(conceive) - 마음 속에서 상상하며, 개념화하고, 형성하며, 및/또는 발전시킨다.
구성하다 - 특정 목적, 기능, 사용, 및/또는 상황에 맞게 설계하며, 배열하고, 설정하며, 형상화하고, 및/또는 적합하게 하다.
접합하다(conjugate) - 공유 결합을 통해 2개의 화합물을 함께 연결한다.
보존적 치환(conservative substitution) - 기능적으로, 구조적으로, 및/또는 화학적으로 유사한 천연 또는 비천연 아미노산으로 폴리펩티드 내 아미노산의 치환, 예를 들어 하기 군 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 천연 아미노산을 함유한다:
1) 글리신 (Gly/G), 알라닌 (Ala/A);
2) 이소류신 (Ile/I), 류신 (Leu/L), 메티오닌 (Met/M), 발린 (Val/V);
3) 페닐알라닌 (Phe/F), 티로신 (Tyr/Y), 트립토판 (Trp/W);
4) 세린 (Ser/S), 트레오닌 (Thr/T), 시스테인 (Cys/C);
5) 아스파라긴 (Asn/N), 글루타민 (Gln/Q);
6) 아스파르트산 (Asp/D), 글루탐산 (Glu/E); 및/또는
7) 아르기닌 (Arg/R), 리신 (Lys/K), 히스티딘 (His/H).
및/또는 하기 군 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 천연 아미노산을 함유한다:
1) 비-극성: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro (프롤린/P), Phe, Trp;
2) 소수성: Val, Leu, Ile, Phe, Trp;
3) 지방족: Ala, Val, Leu, Ile;
4) 방향족: Phe, Tyr, Trp, His;
5) 비하전(uncharged) 극성 또는 친수성: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr;
6) 지방족 히드록실- 또는 설프히드릴-함유: Ser, Thr, Cys;
7) 아미드-함유: Asn, Gln;
8) 산성: Asp, Glu;
9) 염기성: Lys, Arg, His; and/or
10) 작은: Gly, Ala, Ser, Cys.
및/또는 하기 군:
1) 소수성: Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp;
2) 방향족: Phe, Tyr, Trp, His;
3) 중성 친수성: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln;
4) 산성: Asp, Glu;
5) 염기성: Lys, Arg, His; and/or
6) 백본 방향에 영향을 미치는 잔기: Pro, Gly.
이루어진(consisting) - 열거되지 않은 것을 제외하는 폐쇄군(closed group) (및 이 법적 등가물)과 관련된.
소비하다 - 먹다 및/또는 마시다; 소화 및/또는 흡수를 위해 입을 통해 체내로 섭취한다.
함유하는 - 포함하나 이에 한정되지 않는.
전환하다(convert) - 변형하다(transform), 적응하다(adapt), 및/또는 변경하다.
상응하는 - 목적 및/또는 위치와 관련된, 연관된, 수반하는, 유사한, 모든 면에서 준수하는, 및/또는 양, 수량, 크기, 품질 및/또는 정도에 있어서 동등한 및/또는 일치하는.
생성하다(create) - 생기게 하다
배양 배지 - 박테리아, 균류, 동물 세포, 또는 식물 세포의 배양물이 과학적 목적을 위해 성장 및/또는 배양되는 한천 겔 또는 액체 배지와 같은 영양 물질.
결핍 - 원하는 상태 및/또는 조건에서 벗어난 상태 및/또는 조건.
정의하다 - ~의 의미, 관계, 개요, 형태 및/또는 구조를 확립하다; 및/또는 정확하게 및/또는 명확하게 기재 및/또는 명시한다.
전달 - 이송(conveying) 및/또는 전달하는 행위.
유래하다(derive) - 공급원 및/또는 기원(origin)으로부터 수신하며, 얻고 및/또는 생산하다.
결정하다 - 일반적으로 조사, 추론 및/또는 계산에 의해 알아내며, 얻고, 계산하고, 결정하며, 추론하고, 확인하며, 및/또는 결정에 이르다.
장치 - 기계, 제조물 및/또는 이들의 집합체.
각각 - 개별적으로 고려되는 군의 모든 것.
효과적인 - 초래하며, 유발하고, 이끌어내며, 및/또는 야기하기에 충분한.
실시예 - 시행(implementation), 표명(manifestation), 및/또는 구체적인 표현.
추정하다 - (n) 실제 값에 근접한 계산된 값; (v) 대략적으로 및/또는 잠정적으로 계산 및/또는 결정한다.
과도한(excessive) - 정상적, 일반적, 합리적, 및/또는 적당한 한도를 초과한.
예시적인 - 예, 사례 및/또는 예시로서 제공되나, 반드시 다른 실시예 또는 특징보다 바람직하거나 또는 유리한 것은 아님.
제 1 (first) - 세트의 초기 인용 요소.
제형 - 정제, 기침약(linctus), 연고, 또는 주사제와 같은 특정 형태로 투여된 의약 제제.
~로부터 - 공급원, 기원, 및/또는 이의 위치를 나타내는데 사용됨.
일반적인 교대의 - 확인된 서열 또는 그 반대를 갖는, 예를 들어, A-C-A-C-A-C 또는 C-A-C-A-C-A 잔기 (여기서, A는 방향족을 나타내며, C는 양이온성을 나타냄)를 갖는 펩티드 서열과 같은 방향족-양이온성 또는 양이온성-방향족.
생성하다 - 생성하다, 생산하다, 야기하다, 및/또는 생기게 하다.
보다 큰 - 적어도.
군 - (n.) 하나 이상의 유사성으로 인해 함께 고려되는 여러 개체 및/또는 사물; (v.) 함께 고려되거나 및/또는 유사한 속성을 갖도록 야기되는 여러 개체 또는 사물을 연관시키다.
갖는 - 포함하나 이에 한정되지 않는.
건강 - 주어진 시간에 유기체의 전반적인 상태; 특히 신체 및/또는 정신의 건전성(soundness); 질환, 부상, 장애, 및/또는 이상(abnormality)이 없음.
개선하다 - 더 나은 상태 및/또는 조건으로 변경하다.
부적당한 - 불충분한
포함하는 - 하기의 것을 가지나, 이에 한정되지 않는.
초기화하다(initialize) - 사용 및/또는 향후 결과를 위해 무언가를 준비하다.
부상 - 사람 및/또는 사물에 가해진 및/또는 입은 손상 및/또는 상해(harm).
설치하다 - 위치에 연결하거나 또는 설정하고 사용 준비를 하다.
섭취하다 - 섭취(taking in), 섭취(ingesting), 및/또는 수령(receiving)의 행위 및/또는 사례.
장 흡수장애(intestinal malabsorption) - 장관으로부터 영양소의 결함 및/또는 부적당한 흡수.
근육내 - 근육 내에
비강내 - 코 안에.
정맥내 - 정맥 내에.
이다(is) - 실제로 존재하다.
리신 - 주로 가수분해에 의해 많은 단백질로부터 생산되는 결정질, 염기성, 필수 아미노산, H2N(CH2)4CH(NH2)COOH.
유지 - 항목 및/또는 시스템의 성능을 회복 및/또는 보존하는 것과 관련된 활성.
포유류 - 피부에 털로 덮여 있으며, 암컷의 경우 새끼에게 영양을 공급하기 위한 젖-생산 유선을 특징으로 하는, 인간을 포함하여 포유류 강(class)의 다양한 온혈 척추 동물.
포유류의 - 포유류의 및/또는 포유류와 관련된.
최대 - 가장 큰 값을 가짐.
할 수 있다(may) - 적어도 일 실시예에서 허용 및/또는 허가된다.
질병 - 신체 및/또는 정신의 질환, 부상, 장애, 및/또는 이상.
약물(medication) - 질병의 적어도 하나의 증상을 완화 및/또는 치유하기 위해 적응된 물질.
대사의(metabolic) - 대사의 및/또는 대사와 관련된.
대사 보충제 - 에너지 생산을 향상시키는 자연적으로 발생하는 화합물.
대사(metabolism) -　생명 유지에 필요한 살아있는 세포 또는 유기체 내에서 발생하는 화학적 과정. 대사에서, 일부 물질은 생명 과정에 필요한 에너지를 얻기 위해 분해되는 반면, 생명에 필요한 다른 물질은 합성된다.
방법 - 상이한 상태 또는 사물로 변형될 주제에 대해 수행되며 및/또는 특정 장치에 연결되는 하나 이상의 행위로서, 상기 하나 이상의 행위는 기본 원칙이 아니며 기본 원칙의 모든 사용을 선점하지 않음.
최소 - 가장 낮은 값을 가짐.
완화하다(mitigate) - 덜 심각하게, 덜 중하게, 또는 덜 아프게 하다.
미토콘드리아 - 식품을 사용가능한 에너지로 전환시키는 역할을 하는 것을 포함하여 세포 대사에 중요한 유전 물질 및 많은 효소를 함유하는, 거의 모든 진핵 세포의 세포질에 있는 구형 또는 가늘고 긴(elongated) 소기관.
미토콘드리아-표적 - 표시된 물질 (예를 들어, 비오틴)은 미토콘드리아로 수송되어 일단 세포 내부에 들어가면 물질이 미토콘드리아에 우선적으로 국소화되며, 다른 세포 소기관 또는 막에 실질적으로 분포되지 않음을 나타낸다.
더(more) - 크기, 양, 범위, 및/또는 정도가 더 큰 것을 의미하는 수량사 (quantifier).
모티프 - 일반적으로 단백질에서 뉴클레오티드 또는 아미노산의 분자 서열의, 또는 일반적으로 특정 생물학적 활성에 상응하는 분자 구조의 순환 패턴 (recurrent pattern).
N-말단 - (아미노-말단, NH2-말단, N-말단 끝 또는 아민-말단이라고도 함)은 폴리펩티드의 끝에 위치한 유리 아민 기 (-NH2)를 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드의 시작이다. 펩티드 내에서, 아민 기는 단백질 내 다른 카복실 기와 결합하여 사슬을 형성하나, 단백질의 말단 아미노산은 카복시- 말단에만 연결되어 있기 때문에. 나머지 유리 아민 기를 N-말단이라고 한다.
없는(no) - 어떤 것의 부재 및/또는 결여.
하나(one) - 단일 단위, 개별 및/또는 전체 사물, 항목, 및/또는 대상 (object)이 되는 것 및/또는 이에 해당하는 것.
작동가능한(operable) - 의도된 용도 및/또는 서비스에 적용할 수 있도록 실행 가능 및/또는 적합, 준비 및/또는 적응.
또는 - 일반적으로 대안 항목 군의 마지막 항목 앞에만 나타나는 대안을 나타내는데 사용되는 접속사.
경구 - 입의 및/또는 입과 관련된.
장기 - 특정 기능을 수행하는 눈, 날개, 또는 잎과 같은 유기체의 차별화된 부분.
환자 - 인간 피험자와 같은 포유류 피험자.
펩티드 - 하나의 아미노산의 카복실 기를 다른 아미노산의 아미노 기에 연결하는 적어도 하나의 펩티드 및/또는 아미드 결합에 의해 공유 결합된 2 이상의 아미노산을 함유하는 다양한 천연 또는 합성 화합물 (약학적으로 허용가능한 염과 같은 아미노산 염 포함).
당(per) - 각각에 대해 및/또는 ~에 의하여.
약학적으로 허용가능한 -　과도한 자극, 알러지 반응, 면역원성, 및/또는 독성 없이 피험자의 조직 및 장기에 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익/위험 비에 상응하고, 의도된 용도에 효과적이며, 및/또는 물질을 포함하는 임의의 조성물의 다른 성분과 호환가능하고; 약학 조성물을 제조하는데 유용하며 일반적으로 안전하고, 비-독성이며, 생물학적으로도 아니고 달리 바람직하지도 않으며, 수의학적 용도 및 인간 의약 용도에 허용가능한 것을 포함하고; 및/또는 연방 규제 기관 및/또는 주 정부 및/또는 미국 이외의 국가의 해당 기관에서 승인한 및/또는 승인할 수 있는, 및/또는 미국 약전 및/또는 기타 일반적으로 인정되는 동물용, 특히 인간용 약전에 열거된 물질 (예를 들어, 유효 성분 또는 부형제).
복수 - 복수 및/또는 하나 이상인 상태.
폴리펩티드 - 펩티드 결합에 의해 함께 연결되며 최대 약 10,000의 분자량을 갖는 아미노산 사슬.
폴리펩티드들 - 일반적으로 펩티드 및 단백질, 여기서 폴리펩티드 서열의 좌측 끝은 "아미노 (N)-말단"이라고 하며, 서열의 우측 끝은 "카복실 I-말단"이라고 한다.
부분(portion) - 큰 전체보다 적은 부분, 구성요소, 절편, 백분율, 비, 및/또는 양.
미리(pre) - 사전에(beforehand) 및/또는 미리(in advance) 발생한 활성에 선행하는 접두사.
미리 결정하다(predetermine) - 미리 결정하며(determine), 결정하고 (decide) 및/또는 확립하다.
보존하다 - 나중에 사용하기 위해 안전하게 저장하다.
방지하다 - 방해하다, 회피하다(avert), 저항하다(resist), 방해하다 (hinder), 멈추다, 및/또는 일어나는 것을 막다.
확률 - 발생 가능성의 정량적 표현.
생성물 - 인간 및/또는 기계적인 노력으로 생산된 것.
계획하다(project) - 계산, 추정, 또는 예측하다.
촉진하다 - ~의 발전 및/또는 성장에 기여하다; 촉진, 전진, 조장 및/또는 마케팅하다.
단백질 - 50 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 잔기의 연결된 서열.
제공하다 - 비치하다(furnish), 공급하다(supply), 주다, 및/또는 이용가능하게 하다.
범위 - 일련의 값의 범위 및/또는 변동의 양 및/또는 범위의 측정.
비(ratio) - 하나를 다른 것으로 나눈 몫(quotient)으로 표현되는 두 양 사이의 관계.
받다 - 신호로 받다, 받다, 획득하다, 및/또는 얻다.
권고하다(recommend) - 제안, 칭찬, 추천, 및/또는 보증하다(endorse).
줄이다 - 더 적게 및/또는 더 작게 만들며 및/또는 되다.
재생 - 손실된 및/또는 파괴된 부분 및/또는 장기의 재성장.
제거하다 - 없애다(eliminate), 제거하다, 및/또는 삭제하다, 및/또는 점유한 장소 또는 위치에서 이동하다.
복구(repair) - 원하는 상태로 회복
반복하다 - 다시 하다 및/또는 다시 수행하다.
반복적으로 - 되풀이해서(again and again); 반복해서(repetitively).
요청하다 - 소망을 나타내다 및/또는 요구하다.
결과 - (n.) 특정 행위, 작업 및/또는 과정의 결과(outcome) 및/또는 결과 (consequence); (v.) 특정 행위, 작업 및/또는 과정의 결과 및/또는 결과를 야기하는 것.
상기(said) - 시스템 또는 장치 청구항에 사용될 때, 이전에 도입된 후속 청구항 용어를 나타내는 관사.
제 2 (second) - 초기 요소 다음에 오는 세트의 인용 요소.
선택하다 - 대안으로부터 선택 또는 선발하다.
선택된 - 다수의 대안 중에서 선택된.
서열 - 순서 세트.
혈청-없는 - 전혈을 응고시킨 후 고체 및 액체 성분으로 분리할 때 얻은 맑은 황색 유체가 결여된.
세트 - 관련 복수(related plurality).
용액 - 고체, 액체, 기체, 또는 이들의 조합일 수 있는 2 이상의 물질의 균질한 혼합물.
종 - 공통 속성에 의해 그룹화되며 공통 이름이 할당된 개체 및/또는 대상의 종류; 속에 종속된 분류.
저장 - 저장하는 행위 또는 저장되는 상태
저장하다 - 향후 사용을 위해 따로 보관, 비축, 예치, 보안 및/또는 남겨두다.
피하 - 피부 약간 아래.
피험자 -　영장류 (예를 들어, 인간, 침팬지, 또는 원숭이), 설치류 (예를 들어, 랫트, 마우스, 기니피그, 게르빌루스쥐(gerbil) 또는 햄스터), 토끼류 (lagomorph) (예를 들어, 토끼), 소 (예를 들어, 소), 돼지(suid) (예를 들어, 돼지), 염소(caprine) (예를 들어, 양), 말(equine) (예를 들어, 말), 개(canin) (예를 들어, 개) 및/또는 고양이(feline) (예를 들어, 고양이)와 같은 포유류를 포함하나, 이에 한정되지 않는 동물.
설하 - 혀의 아래 및/또는 밑면에 위치.
실질적으로 - 대부분 및/또는 상당한 정도로.
고통받다 - 고통 또는 괴로움(distress)을 느끼다; 부상 및/또는 상해를 입다; 견디다, 앓다(be afflicted with), 및/또는 병을 앓다(be ill with); 정확하게 진단받다.
보충제 - (n.) 부족한 영양소를 제공하여 식이를 보충하기 위해 섭취하는, 하나 이상의 비타민, 허브, 효소, 아미노산 및/또는 기타 성분을 함유하는 제품.
시스템 - 하나 이상의 특정 기능을 수행하도록 설계된 집합체인, 메커니즘, 장치, 기계, 제조 물품, 공정, 물질의 조성물, 자료, 및/또는 사용설명서의 집합체.
표적하다 - 상호작용하다.
치료적으로 - 질환, 부상, 장애, 및/또는 이상의 의학적 치료의 또는 이와 관련된.
치료적 유효량 -　피험자에게 투여되었을 때, 치료 중인 질병의 예방, 발생 위험의 감소, 발병 지연, 진행 늦추기, 및/또는 퇴행 유발, 및/또는 적어도 해당 물질을 복용하는 피험자의 일부에서 질병 및/또는 해당 질병의 하나 이상의 증상 및/또는 합병증을 어느 정도 완화, 및/또는 연구자, 수의사, 의사 및/또는 임상의가 찾는 세포, 조직, 장기, 시스템, 동물 및/또는 인간의 생물학적 및/또는 의학적 반응을 유도해 내는데 충분한 물질의 양.
조직 - 신체에서 하나 이상의 특정 기능을 수행하기 위해 함께 작용하는 형태학적으로 유사한 세포 및 관련 세포간 물질의 응집.
조직 재생 - 손상된 조직의 일부를 정상 상태로 완전히 회복하는 세포 증식을 통한 조직의 재-성장.
조직 복구 - 손상 후 조직 구조 및 기능의 회복, 상기 회복은 조직 재생 및 조직 대체를 포함한다.
조직 대체 - 결합 조직 또는 반흔 조직(scar tissue)을 내려놓음으로써 손상된 조직이 복구되는 유형의 치유.
국소 - 신체의 국소 부위, 일반적으로 피부.
경피 - 피부를 통해 또는 피부를 경유하여.
변형하다 - 측정가능한 변화: 형태, 외관, 성질, 및/또는 특성.
전달하다 - 신호로 보내다, 제공하다, 비치하다, 및/또는 공급하다.
수송하다 - 한 장소에서 다른 장소로 이송 및/또는 이동하다.
치료하다 - 질병 및/또는 질병과 관련된 하나 이상의 원인, 증상 및/또는 합병증을 완화, 개선, 진행 저해, 역전, 예방, 및/또는 폐지하다; 어떤 사람 및/또는 어떤 것을 다루거나 또는 처리하다.
흡수 - 섭취, 소비 및/또는 사용.
사용하다 - 사용하기 시작하다(put into service).
사용된 - 어떤 것을 성취하는데 사용된.
통해 - 경유하여 및/또는 이용하여.
비타민 - 박테리아 및/또는 식물에 의해 합성되며 및/또는 주로 동물의 식이에서 동물에 의해 얻은 물질인, 살아있는 유기체의 정상적인 성장 및 활성에 미량으로 필수적인 다양한 지용성 또는 수용성 유기 물질; 및/또는 비타민이 투여되는 동물 사료의 필수 성분인 단백질, 탄수화물 또는 지방 이외의 유기 물질 중 어느 하나, 예를 들어, B1 (티아민), B2 (리보플라빈), B3 (니아신, 니아신아미드), B5 (판토텐산), B6 (피리독신), B7 (비오틴), B9 (폴레이트), 및 B12 (시아노코발라민), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D 및 비타민 K.
수용성 - 물에 용해될 수 있는.
중량(weight) - 물체의 질량 및 중력 가속도의 곱과 동일한, 신체가 지구 또는 다른 천체(celestial body)에 끌리는 힘; 및/또는 계산에 대한 숫자의 영향이 중요성, 중요도, 선호도, 영향 등을 반영하도록 하기 위해 평균을 결정하는 것과 같은 계산에서 숫자에 할당된 계수(factor) 및/또는 값.
여기서 - ~에 관하여; 및; 및/또는 이외에.
함께 - 수반된
구역 - 적어도 하나의 미리결정된 경계를 갖는 영역 및/또는 용적.
비고
청구된 주제의 다양한 실질적으로 및 구체적으로 실용적이고 유용한 예시적인 실시예는 문자 그대로 및/또는 생생하게 본 명세서에 기재되어 있으며, 통상의 기술자에 의해 청구된 주제를 시행하기 위해, 발명자(들)에게 알려진 최상의 모드 (있는 경우)를 포함한다. 본 명세서에서 "일 실시예에서", "실시예에서" 등의 언급은 반드시 동일한 실시예를 나타내는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 실시예의 다양한 가능한 변화 (예를 들어, 변형, 증가, 장식(embellishments), 정제, 및/또는 향상 등), 세부 사항 (예를 들어, 종(species), 측면, 뉘앙스 및/또는 정교화 등), 및/또는 등가물 (예를 들어, 치환, 대체, 조합, 및/또는 대안 등) 중 어느 하나는, 과도한 실험을 하지 않고 자신의 전문지식 및/또는 해당 기술 전체에 대한 지식에 의존하여 통상의 기술자가 이 문서를 읽을 때 명백해질 수 있다. 발명자(들)은 발명자(들)로부터 승인을 얻은 후 통상의 기술자가 이러한 변화, 세부 사항 및/또는 등가물을 적당하게 시행하기를 기대하며, 따라서 발명자(들)은 청구된 주제가 본 명세서에 구체적으로 기재된 것 이외의 방식으로 실행되도록 의도한다. 따라서, 법이 허용하는 한, 청구된 주제는 청구된 주제의 모든 변화, 세부 사항 및 등가물을 포함하고 포괄한다. 또한, 법이 허용하는 한, 본 명세서에 기재된 특성, 기능, 활성, 물질, 및/또는 구조적 요소의 모든 조합, 및 이들의 모든 가능한 변화, 세부 사항, 및 등가물은, 본 명세서에서 달리 명확하게 나타내거나, 명확하고 구체적으로 부인하거나, 또는 달리 분명히 부적절하거나, 작동불가능하거나, 또는 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 청구된 주제에 포함된다.
본 명세서에 제공된 모든 예 또는 예시적인 언어 (예를 들어 "~와 같은")의 사용은, 단지 하나 이상의 실시예를 더 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 명시되지 않는 한 청구된 주제의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 주제를 청구된 주제의 실행에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
따라서, 이 문서의 모든 부분 (예를 들어, 명칭, 기술분야, 배경기술, 개요, 설명, 요약, 도면 등)의 내용과 관계없이, 명시적 정의, 주장 또는 논쟁을 통해 명백히 반대되거나 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 모든 청구항과 관련하여, 이 문서 및/또는 우선권을 주장하는 모든 문서의 청구 여부, 및 원래 제시되었는지 여부에 관계없이:
특정한 기재된 특성, 기능, 활성, 물질, 또는 구조적 요소의 포함, 활성의 특정 순서, 물질의 특정 조합, 또는 요소의 특정 상호관계에 대한 요구사항이 없으며;
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임의의 기재된 실시예 내에서, 중에서, 및 사이에서:
2 이상의 기재된 물질은 혼합, 조합, 반응, 분리, 및/또는 격리될 수 있다;
기재된 특성, 기능, 활성, 물질, 성분, 및/또는 구조적 요소, 또는 이들의 임의의 조합은, 구체적으로 포함, 복제, 제외, 조합, 재정렬, 재구성, 통합 및/또는 격리될 수 있다;
기재된 특성, 기능, 활성, 물질, 성분 및/또는 구조적 요소 사이의 기재된 상호관계, 순서, 및/또는 의존성은 생략, 변화, 변경 및/또는 재정렬될 수 있다;
기재된 모든 활성은 수동, 반-자동, 및/또는 자동으로 수행될 수 있다;
기재된 모든 활성은 반복되거나, 다수의 물질에 의해 수행되거나, 및/또는 다수의 관할권에서 수행될 수 있다.
다양한 실시예를 기재하는 문맥에서 (특히 하기의 청구항의 문맥에서) 용어 "a", "an", "said", "the" 및/또는 이와 유사한 지시대상의 사용은, 본 명세서에서 달리 나타내거나 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 둘다 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)", 및 "함유하는"은 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어 (즉, "포함하나, 이에 한정되지 않는"을 의미)로 해석되어야 한다.
임의의 수 또는 범위가 본 명세서에서 기재된 경우, 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 그 수 또는 범위는 근사치이다. 본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은, 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법(shorthand method)으로 사용하기 위한 것일 뿐이며, 각각의 별도의 값 및 이러한 별도의 값에 의해 정의된 각각의 별도의 하위-범위는 본 명세서에서 개별적으로 열거된 것처럼 명세서에 포함된다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위가 기재되어 있는 경우, 그 범위는 예를 들어 1.1, 2.5, 3.335, 5, 6.179, 8.9999 등과 같이 그 사이의 모든 값을 포함하며, 이러한 특정 값 또는 특정 하위-범위가 명시적으로 언급되지 않은 경우에도, 예를 들어, 1 내지 3.65, 2.8 내지 8.14, 1.93 내지 9 등과 같이 그 사이의 모든 하위-범위를 포함한다.
청구항에 나타나는 임의의 문구 (즉, 하나 이상의 단어) 뒤에 도면 요소 번호가 오는 경우, 해당 도면 요소 번호는 예시적이며 청구 범위에 대해 비-제한적이다.
이 문서의 청구항 또는 청구항 요소는 정확한 문구 "~을 위한 수단" 뒤에 동명사가 오지 않는 한, 35 USC 112(f)를 원용하지 않는다.
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출원인은 본 출원의 절차 동안 어느 시점에서, 및 본 출원에 우선권을 주장하는 모든 출원에서, 본 명세서에 제시된 각 청구항은 별개의 특허가능한 발명을 정의하며, 해당 발명의 범위는 해당 청구 범위가 절차 중에 변경되는 경우 그에 따라 변경되어야 한다는 것을 의도한다. 따라서, 이 문서 내에서, 및 이와 관련된 특허 출원의 절차 동안, 청구된 주제에 대한 모든 언급은, 해당 특정 시점에서만 당시 계류 중인 청구된 주제의 정확한 언어를 참조하기 위한 것이다.
따라서, 청구항 자체 및 본 명세서에 사용된 문구에 대해 제공된 정의 이외에, 이 문서의 모든 부분 (예를 들어, 명칭, 기술분야, 배경기술, 개요, 설명, 요약, 도면 등)은, 사실상 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 제한적이지 않아야 한다. 이 문서를 기반으로 발행하는 모든 특허의 청구항에 의해 보호되는 주제의 범위는, 관련 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 합리적으로 해석할 때 이 문서의 문맥에 의해 알 수 있는 바와 같이, 해당 청구항의 정확한 언어 (및 이의 모든 법적 등가물) 및 해당 청구항에 사용된 모든 문구의 제공된 정의에 의해서만 정의되고 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> SZETO, HAZEL <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF BIOTIN TO MITOCHONDRIA <130> 1255-005 <140> PCT/US2021/049068 <141> 2021-09-03 <150> 63/075,996 <151> 2020-09-09 <150> 63/076,022 <151> 2020-09-09 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cell-penetrating peptide sequence <220> <223> C term NH2 <400> 1 Trp Arg Trp Lys 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cell-penetrating peptide sequence <220> <223> C term OH <400> 2 Trp Arg Trp Lys 1

Claims (14)

  1. 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단에 위치한 리신에 접합된 제 1 D-비오틴을 포함하는 물질의 생물학적 활성 조성물로서,
    미토콘드리아-표적 펩티드 서열은
    최소 4 아미노산 및 최대 6 아미노산을 포함하며;
    일반적인 교대의 방향족-양이온성 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 미토콘드리아-표적 펩티드 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    D-Arg-L-(2'6'-디메틸Tyr)-L-Lys-L-Phe-NH2;
    D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys-NH2;
    D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH;
    L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys-NH2;
    D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-NH2; 및
    L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys-OH.
  3. 제 1항에 있어서, 제 2 D-비오틴은 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 N-말단 α-아민에 접합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    D-비오틴-D-Arg-L-(2'6'-디메틸Tyr)-L-Lys-L-Phe-NH2; 및
    D-비오틴-D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH
  5. 제 1항에 있어서, 제 1 D-비오틴은 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단에서 리신의 ε-아민에 접합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys(비오티닐)-OH;
    L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2; 및
    D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2.
  7. 제 1항에 있어서, 제 1 D-비오틴은 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단에서 리신의 ε-아민에 접합되며 제 2 D-비오틴은 N-말단 α-아민에 접합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    D-비오틴-L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2; 및
    D-비오틴-D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2.
  9. 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 펩티드 서열의 C-말단 또는 N-말단에 위치한 리신에 접합된 제 1 D-비오틴을 포함하는 물질의 생물학적 활성 조성물로서,
    미토콘드리아-표적 펩티드 서열은 최소 4 아미노산 및 최대 6 아미노산을 포함하며;
    일반적인 교대의 방향족-양이온성 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 비오티닐화 폴리펩티드 군으로부터 선택된 하나 이상의 생물학적 활성, 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 화합물; 및
    하나 이상의 생물학적 활성, 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 화합물 각각에 대한 약학적으로 허용가능한 담체
    를 포함하는 치료적으로 효과적인 제형을 포함하는, 물질의 조성물로서,
    비오티닐화 폴리펩티드 군에서 각각의 생물학적 활성, 수용성, 세포-투과성, 미토콘드리아-표적 화합물은
    일반적인 교대의 방향족-양이온성 모티프로 배열된 다수의 아미노산;
    최소 4 아미노산 및 최대 6 아미노산; 및
    비오티닐화 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 위치한 리신에 접합된 제 1 D-비오틴
    에 의해 정의되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 비오티닐화 폴리펩티드 군은 하기로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    D-비오틴-D-Arg-L-(2'6'-디메틸ylTyr)-L-Lys-L-Phe-NH2;
    D-비오틴-D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys-OH;
    D-Trp-D-Arg-D-Trp-D-Lys(비오티닐)-OH;
    L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2;
    D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2;
    D-비오틴-L-Trp-L-Arg-L-Trp-L-Lys(비오티닐)-NH2; 및
    D-비오틴-D-Arg-L-Tyr-D-Arg-L-Phe-L-Lys(비오티닐)-NH2.
  12. 제 10항에 있어서, 하기로 이루어진 비타민 군으로부터 선택된 하나 이상의 비타민을 더 포함하는, 조성물:
    비타민 B1 (티아민);
    비타민 B2 (리보플라빈);
    비타민 B3 (니아신, 니아신아미드);
    비타민 B5 (판토텐산(pantothenic acid));
    비타민 B6 (피리독신(pyridoxine));
    비타민 B7 (비오틴);
    비타민 B9 (폴레이트(folate));
    비타민 B12 (시아노코발라민(cyanocobalamine)); 및
    비타민 C (아스코르브산).
  13. 제 10항에 있어서, 하기로 이루어진 대사 보충제 군으로부터 선택된 하나 이상의 대사 보충제를 더 포함하는, 조성물:
    피루베이트;
    카르니틴;
    아세틸카르니틴;
    크레아틴;
    α-케토글루타레이트;
    α-리포산;
    코엔자임 Q;
    니코틴아미드 리보시드; 및
    니코틴아미드 모노뉴클레오티드.
  14. 제 10항에 있어서, 하기로 이루어진 아미노산 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는, 조성물:
    류신;
    이소류신;
    발린;
    글루타민;
    세린;
    아르기닌;
    메티오닌;
    트립토판;
    글리신;
    트리메틸글리신;
    β-히드록시-β-메틸부티레이트; 및
    타우린.
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