KR20230066022A - 조성물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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에리카 엠. 밀제크
윌 쉰델
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큐리 컴퍼니 인코포레이티드
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Abstract

광범위 미생물 제어 및/또는 보존을 위한 효소-기반 조성물이 본원에 개시된다. 개시된 조성물은, 임의적으로 효소원의 형태인, 가교결합 효소를 포함하고, 항미생물성 펩티드, 단백질, 중합체를 포함하고, 임의적으로 화학적 보존제를 포함할 수 있다.

Description

조성물 및 그의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 9월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 63/075,763의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부 후원 연구에 관한 진술
본 발명은 부분적으로 국립 과학 재단에 의해 수여된 승인 번호 2026057 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
참조로 포함
XXXXXX에 생성되었고, 본원에 제출된, XXKB의 크기를 갖고 XXXXX로 명명된 파일에 제공된 서열 목록은 그 전문이 참조로 포함된다.
분야
분야는 보존성 및/또는 항미생물성 작용제로서 사용하기 위한 활성 가교결합 효소 및 그의 제제와 관련한다.
박테리아 또는 진균 공격에 대해 제제를 보호하고 보존하기 위한 보존성 조성물은 관련 기술분야에 공지되어 있고 개인 관리 제품, 가정용 및 산업용 제품, 건강 및 위생 제품, 및 제약과 같은 분야에서 광범위한 적용을 갖는다. 종래의 보존성 블렌드는, 이들 유형의 화합물에 의해 달성된 우수한 살박테리아성 및 살진균성 특성으로 인해, 전통적인 활성 성분, 예컨대 포름알데히드, 포름알데히드-방출제, 페놀계 화합물, 4차 암모늄 화합물, 할로겐화 화합물, 및/또는 파라벤을 포함하였다 (미국 특허 번호 9,661,847 B2). 화학물질 및 소분자에 더하여, 살생물성 효소 및 단백질이 생체적합성 보존제로서 식품 (Malhotra, et al. (2015) Frontiers in Microbiology 6:611), 건강관리 (Kaplan, et al. (2010) Journal of Dental Research 89:205-218), 및 해양 (Olsen, et al. (2007) Biofouling 23:369-383) 산업에서 사용되었다. 이들 효소의 예는 하기를 포함한다: 살생물성 활성을 위한 산화종을 생성하는 옥시다제 및 퍼옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 락카제); 프로테아제, 히드롤라제, 및 리아제 (예를 들어, 리소자임, 리소스타핀, 서브틸리신, 아밀라제, 셀룰라제, 키티나제, 리파제)를 포함하는, 미생물 (예를 들어, 진균, 바이러스, 박테리아)의 표면을 분해하는 용해 효소; 핵산, 예컨대 RNA 또는 DNA를 가수분해하는 뉴클레아제 (예를 들어, 락토페린, DNase, RNase); 및 세포 파열 및 세포 내용물의 누출을 초래하는 기공을 세포벽에 생성함으로써 미생물을 살해하는 항미생물성 펩티드 (예를 들어, 니신, 페디오신). 보존성 블렌드에서의 항미생물제 사이의 상가작용적 효과는 개별 성분의 농도를 낮추는 것을 허용할 뿐만 아니라, 유기체가 다수의 작용 기구에 의해 공격되기 때문에 항미생물성 내성을 저해하며, 이는 광범위 항미생물성 작용을 제공한다.
효소 기반 항미생물성 조성물은 다른 사람들에 의해 확인되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,326,561은 용해 효소, 예컨대 키틴용해 효소, 글루칸용해 효소 및 셀룰라제를 사용하는 항진균성 조성물을 개시한다. 그러나, 용해 효소의 사용은 문제가 있을 수 있으며, 이는 이러한 효소가 하기를 함유하는 소비자 제품 제제를 파괴할 수 있기 때문이다: (a) 컨디셔너 및 광택 증가 작용제로서 사용되는 에스테르, (b) 단백질 (예를 들어, 케라틴 및 펩티드 모발/피부 컨디션), 및/또는 (c) 탄수화물 (예를 들어, 검 및 다른 증점제). 따라서, 유해한 부작용이 없는 항미생물성 (예를 들어, 살박테리아성 및 살진균성) 활성을 갖는 작용제에 대한 필요가 여전히 존재한다.
알킬화제 및 가교결합 화학적 작용제는 광범위 미생물 제어를 위해 성공적으로 이용되어 왔다. 이들 중 최고는 알데히드-기반 살생물제, 예컨대 포름알데히드 및 글루타르알데히드이며, 이는 수년 동안 광범위 항미생물성 활성을 갖는 것으로 공지되었다. 이들 알데히드가 세포 기능에 필요한 필수적인 세포 구성요소, 예컨대 단백질, 효소, 및 핵산을 가교결합시킨다는 것은 널리 공지되어 있다. 이 작용은 미생물 성장의 억제 또는 세포 사멸을 초래한다. 그러나, 알데히드의 반응성 특성은 이들이 목적하지 않는 화학적 반응을 통해 제제 내에서 빠르게 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 추가적으로, 포름알데히드는 카테고리 3 CMR (발암성, 돌연변이유발, 및 생식 독성)로서 분류된다.
포름알데히드를 천천히 방출하는 몇몇의 항미생물제가 여전히 사용되고 있고 상업적으로 제조된다. 효과적이고 널리 허용되는 항미생물제의 부족으로 인해, 업계는 DMDM 히단토인, 이미다졸리디닐 우레아, 및 디아졸리디닐 우레아와 같은 포름알데히드 공여체를 계속 사용할 것을 강요받는다. 이들 물질에 의해 방출된 포름알데히드는 그의 반응성 알데히드 작용기를 통해 여러 화장품 성분과 반응할 수 있다. 예를 들어, 유일하게 이용가능하고 전 세계적으로 승인된 UV-A 흡수제인 아보벤존은 포름알데히드 유도체에 의해 방출되는 포름알데히드와 반응한다. 이는 선스크린 제제에 대한 약점이다.
국제 공개일 2020년 9월 10일을 갖는 PCT 공개 번호 WO 2020/181099는 가교결합 효소를 활성 형태 또는 효소원의 형태로 가질 수 있는 항미생물성 조성물을 개시하며, 여기서 이러한 조성물은 제품의 저장-수명을 개선시키는데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 알데히드-기반, 가교결합 화학적 보존제에 대한 대안을 예시한다. 구체적으로, 본 개시내용은 미생물 제어를 위한 가교결합 효소의 사용을 통한 효소-기반 메커니즘을 제공한다. 가교결합 효소는 특정 작용기 또는 펩티드 서열에 대해 고도로 정확하며, 이는 화학적 보존제 또는 생물학적 기반 항미생물제 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 및 효소)와의 적합성을 허용한다. 본원에 제시된 효소는 분자량이 10 kDa보다 더 크며, 이는 피부 침투의 낮은 위험이 존재한다는 것을 의미한다. 추가적으로, 본원에 제시된 효소는 핵산과 반응하지 않으면서 가교결합 아미노산 잔기에 고도로 특이적이며, 이는 안전성, 및 포름알데히드와 같은 화학적 가교결합 작용제와 연관된 돌연변이유발 및 발암성 특성의 주요 걱정을 완화시킨다. 가교결합 효소는 광범위 미생물 제어를 위한 화학적 가교결합 작용제에 대한 환경친화적인, 지속가능한 대안을 제공한다.
제1 실시양태에서, (a) 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 (b) 임의적으로 항미생물성 활성을 갖는, 효소, 펩티드, 및/또는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 구성요소와 조합하여, 및 임의적으로 추가로 (c) 적어도 1종의 화학적 보존제와 조합하여 포함하는 조성물로서, 여기서 (a)를 (b)와 조합하여, 및 임의적으로 추가로 (c)와 조합하여 포함하는 조성물은 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 것인 조성물이 개시된다.
제2 실시양태에서, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 및 술프히드릴 옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제이다. 가장 바람직하게는, 적어도 1종의 가교결합 효소는 서열식별번호(SEQ ID NO): 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다.
제3 실시양태에서, 항미생물성 활성을 갖는, 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것의 적어도 1종의 구성요소가 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신, 및 데펜신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 개시된다.
제4 실시양태에서, 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것의 적어도 1종의 화학적 보존제가 4차 암모늄 화합물, 세제, 카오트로픽 작용제, 유기 산, 알콜, 글리콜, 알데히드, 산화제, 파라벤, 이소티아졸리논, 및 양이온성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 개시된다.
제5 실시양태에서, (a) 적어도 1종의 가교결합 효소가 효소원의 형태이고 (b) 적어도 1종의 구성요소가 효소를 포함하며, 추가로 여기서 효소원 및 효소는 상호작용하여 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 활성 효소를 생산하는 것이 개시된다.
제6 실시양태에서, 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 코딩하는 적어도 1종의 이종성 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 상기 이종성 핵산 서열은 임의적으로 적어도 1개의 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 여기서 발현 벡터는 적어도 1종의 가교결합 효소를, 세포내로 또는 세포외로, 발현하도록 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주 세포가 불활성화되거나, 억제되거나, 또는 살해되도록 할 수 있는 것인 발현 벡터가 개시된다. 추가적으로, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 및 술프히드릴 옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제이다. 가장 바람직하게는, 적어도 1종의 가교결합 효소는 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다.
서열의 간단한 설명
서열식별번호: 1은 스트렙토미세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis) 성숙 형태의 트랜스글루타미나제 (Tgase) 서열에 상응한다.
서열식별번호: 2는 서열식별번호: 1 성숙 형태의 서열의 변이체에 상응한다.
서열식별번호: 3은 스트렙토미세스 모바라엔시스 Tgase 효소원 형태 (프로-Tgase)의 변이체의 서열에 상응한다.
서열식별번호: 4는 C-말단 헥사-His-태그를 함유하는 스트렙토미세스 모바라엔시스 효소원 형태의 야생형 프로-TAMEP 서열 (프로-TAMEP; UniProt P83543)에 상응한다.
서열식별번호: 5는 C-말단 헥사-His-태그를 함유하는 스트렙토미세스 모바라엔시스 효소원 형태의 야생형 프로-SM-TAP 서열 (프로-SM-TAP; UniProt P83615)에 상응한다.
서열식별번호: 6은 N-말단 메티오닌 및 C-말단 펩티드 링커 및 헥사-His-태그를 포함하는, 서열식별번호: 2, 성숙 형태의 스트렙토미세스 모바라엔시스의 변이체 트랜스글루타미나제 서열에 상응한다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공개문헌은 이들의 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용에서, 많은 용어 및 약어가 사용된다. 하기 정의가 달리 구체적으로 명시되지 않는 한 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 1종의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다. 단수형 용어, "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 예를 들어, 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "및/또는" 및 "또는"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 다른 하나와 함께 또는 없이 2개의 명시된 특색 또는 구성요소 각각의 특정 개시내용을 지칭한다. 따라서, 본원에서 어구 예컨대 "A 및/또는 B"에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 어구 예컨대 "A, B 및/또는 C"에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 각각의 하기 측면을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 단수형을 사용하는 단어는 복수형을 포함하고, 그 반대도 마찬가지이다.
용어 "포함한다", "포함하는", "수반한다", "수반하는", "갖는" 및 이들의 활용형은 상호교환적으로 사용되고 "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미한다. 측면이 표현 "포함하는"으로 본원에 기재된 어디든지, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 측면에서 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공된다는 것이 이해된다.
용어 "로 이루어진"은 "포함하고 이에 제한되는"을 의미한다.
용어 "로 본질적으로 이루어진"은 조성물의 명시된 물질, 또는 방법의 명시된 단계, 및 물질 또는 방법의 기본 특징에 물질적으로 영향을 미치지 않는 이들 추가적인 물질 또는 단계를 의미한다.
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 실시양태는 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 기재가 단지 편의 및 간결성을 위한 것이고 본원에 기재된 실시양태의 범주에 대한 변경할 수 없는 제한으로서 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 범위의 기재, 예컨대 1 내지 6은 하위범위, 예컨대 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4 및 1 내지 5, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6 등 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 값 또는 범위에서, 예를 들어, 언급된 값 또는 범위의 언급된 한계의 10% 내, 5% 내, 또는 1% 내에서, 소정의 가변성을 허용할 수 있다.
용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 지칭한다. "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체 서열을 포함한다. IUPAC-IUB 생화학적 명명법에 관한 공동 위원회 (JCBN)에 따라 정의된 바와 같은 아미노산에 대한 단일 및 3-문자 코드가 본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된다. 단일 문자 X는 20개 아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. 또한 폴리펩티드가 유전자 코드의 축퇴로 인해 1개 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것이 이해된다. 돌연변이는 모 아미노산에 대한 1 문자 코드에 이어 위치 번호 및 이어서 변이체 아미노산에 대한 1 문자 코드에 의해 명명될 수 있다. 예를 들어, 위치 87에서의 글리신 (G)을 세린 (S)으로 돌연변이시키는 것은 "G087S" 또는 "G87S"로서 표현된다. 변형의 기재할 때, 위치에 이어 괄호에 열거된 아미노산은 열거된 아미노산 중 임의의 것에 의한 해당 위치에서의 치환 목록을 나타낸다. 예를 들어, 6(L,I)는 위치 6이 류신 또는 이소류신으로 치환될 수 있다는 것을 의미한다. 때로는, 서열에서, 슬래시 (/)가 치환을 정의하는데 사용되고, 예를 들어 F/V는 위치가 해당 위치에서 페닐알라닌 또는 발린을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
용어 "가교결합 효소"는 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 작용기, 예컨대 글루타민 또는 아스파라긴의 아미드 작용기, 리신의 아민 기, 또는 티로신의 페놀계 작용기와, (a) 단백질 또는 폴리펩티드 아미노산 잔기의 상이한 반응성 작용기, 예를 들어, 리신의 아민 작용기, 세린의 히드록실 기, 또는 티로신의 페놀계 히드록실 기 (분자간 또는 분자내 반응에 의함), 또는 (b) 관심 분자 또는 물질의 반응성 작용기 사이의 반응을 촉매하는 효소를 지칭한다. "가교결합 효소"의 하나의 예는 1차 아민, 예를 들어 리신 분자의 엡실론-아민과, 단백질- 또는 펩티드-결합된 글루타민의 아실 기 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 촉매하는 트랜스글루타미나제 (Tgase, EC2.3.2.13)이다. "가교결합 효소"의 두 번째 예는 페놀, 예컨대 티로신 및 도파민을 산화시켜, 용매-노출된 리실, 티로실, 및 시스테이닐 잔기 뿐만 아니라 수많은 소분자와 가교결합을 용이하게 형성하는 반응성 o-퀴논을 형성하는 구리-함유 옥시다제인, 티로시나제 (EC 1.14.18.1)이다. "가교결합 효소"의 세 번째 예는 1-전자 산화를 수행하여 페놀계 기질을 산화시켜, 가교결합을 초래하는, 식물, 진균 및 박테리아에서 발견되는 다중-구리 옥시다제인, 락카제이다. "가교결합 효소"의 네 번째 예는 다른 단백질 및 펩티드 뿐만 아니라 수많은 소분자와의 가교결합을 형성하는 반응성 알데히드로의 리신 분자의 전환을 촉매하는 구리 의존적 옥시다제인, 리실 옥시다제이다.
용어 "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 성숙 또는 전구체 형태의 단백질의 분비에 참여하거나 또는 수송을 지시할 수 있는 아미노산 잔기의 서열을 지칭한다. 신호 서열은 전형적으로 전구체 또는 성숙 단백질 서열에 대해 N-말단에 위치된다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 일반적으로 성숙 단백질에 부재한다. 신호 서열은 전형적으로 단백질이 수송된 후 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다.
용어 "효소원" 및 "전구효소"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 효소의 불활성 전구체를 지칭하며, 이는 촉매 작용에 의해, 예컨대 프로-서열의 단백질 가수분해 절단을 통해 활성 또는 성숙 효소로 전환될 수 있다.
단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 용어 "성숙 또는 활성" 형태는 신호, 침묵, 또는 샤페론 프로펩티드 서열이 없는 단백질, 폴리펩티드, 또는 효소의 기능적 형태를 지칭한다. 추가적으로, 성숙 효소는 목적하는 활성 (예를 들어, 항미생물성 및/또는 보존성)을 유지하면서 성숙 서열에 비해 말단절단될 수 있다.
아미노산 서열 또는 핵산 서열과 관련하여 용어 "야생형"은 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 본래의 또는 천연-발생 서열인 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "천연-발생"은 천연에서 발견되는 임의의 것 (예를 들어, 단백질, 아미노산, 또는 핵산 서열)을 지칭한다. 반대로, 용어 "비-천연 발생"은 천연에서 발견되지 않는 임의의 것 (예를 들어, 실험실에서 생산된 재조합체/조작된 핵산 및 단백질 서열 또는 야생형 서열의 변형)을 지칭한다.
용어 "로부터 유래된"은 용어 "로부터 비롯하는", "로부터 수득된", "로부터 수득가능한", "로부터 단리된", "로부터 정제된", 및 "로부터 생성된"을 포함하고, 일반적으로 하나의 명시된 물질이 또 다른 명시된 물질에서 그의 기원을 발견하거나 또는 또 다른 명시된 물질과 관련하여 기재될 수 있는 특색을 갖는다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된", "정제된", "분리된", 및 "회수된"은 그가 천연적으로 연관된 적어도 1종의 구성요소로부터 제거된 물질 (예를 들어, 단백질, 핵산, 또는 세포)을 지칭한다. 예를 들어, 이들 용어는 그의 본래의 상태, 예컨대, 예를 들어, 무손상 생물학적 시스템에서 발견될 때 일반적으로 그를 동반하는 구성요소가 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 보통 핵산 분자를 발현하는 세포에 함유되나, 염색체외로 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에서 존재하는 핵산 분자를 포함한다.
아미노산 잔기 위치와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은, "상응하는" 또는 "상응한다"는 단백질 또는 펩티드에 열거된 위치에서의 아미노산 잔기, 또는 단백질 또는 펩티드에 열거된 잔기와 유사하거나, 상동성이거나, 또는 동등한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "상응하는 영역"은 일반적으로 관련된 단백질 또는 참조 단백질에서의 유사한 위치를 지칭한다.
용어 "아미노산"은 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드의 기본 화학적 구조 단위를 지칭한다. 본원에서 특정 아미노산을 확인하는데 사용된 하기 약어는 표 1에서 찾아볼 수 있다.
표 1. 1 및 3 문자 아미노산 약어
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관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 아미노산 서열의 변형이 개시된 아미노산 서열과 연관된 기능을 유지하면서 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 제공된 부위에서 화학적으로 동등한 아미노산의 생산을 초래하나, 코딩된 단백질의 기능적 특성에 영향을 미치지 않는 유전자에서의 변경이 흔하다는 것이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원에서 용어 "돌연변이"는 치환, 삽입, 및 결실 (말단절단을 포함함)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모 서열로 도입되며, 이로써 "돌연변이체"를 생성하는 변화를 지칭한다. 돌연변이의 결과는 모 서열에 의해 코딩된 단백질에서 발견되지 않는 새로운 특징, 특성, 기능, 표현형 또는 형질의 생성을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
관련된 (및 유도체) 단백질은 "변이체" 또는 "돌연변이체" 단백질을 포함하며, 이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 변이체 단백질은 소수의 아미노산 잔기만큼 또 다른 (즉, 모) 단백질 및/또는 서로와 상이하다. 변이체는 그가 유래된 모 단백질과 비교하여 1개 이상의 아미노산 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 결실, 삽입 또는 치환)를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 변이체는, 예를 들어, 서열 정렬 도구, 예컨대 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL을 사용하여 결정된 바와 같이, 참조 단백질 또는 핵산과 명시된 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체 단백질 또는 핵산은 참조 서열과 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 심지어 99.5% 및 이들 사이의 정수 백분율의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역을 지칭하는 바와 같은, 용어 "코돈 최적화된"은 DNA가 코딩하는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하기 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역의 코돈의 변경을 지칭한다.
용어 "유전자"는 코딩 서열에 선행 (5' 비-코딩 서열) 및 후행 (3' 비-코딩 서열)하는 조절 서열을 포함하는, 특정 단백질을 발현하는 핵산 분자를 지칭한다. "본래의 유전자"는 자신의 조절 서열과 함께 천연에서 발견되는 바와 같은 유전자를 지칭한다. "키메라 유전자"는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 본래의 유전자가 아닌 임의의 유전자를 지칭한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되나, 천연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열되는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 천연 위치에서의 본래의 유전자를 지칭한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 일반적으로 발견되지 않으나, 유전자 전달에 의해 숙주 유기체로 도입되는 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 비-본래의 유기체 내로 삽입된 본래의 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스진"은 형질전환 절차에 의해 게놈으로 도입된 유전자이다.
용어 "코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치된 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 이는 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 프로모터, 번역 선도 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 하는 단일 핵산 분자 상 핵산 서열의 연관을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 해당 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때, 즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어 하에 있을 때 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
용어 "조절 서열" 또는 "제어 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 유기체 내의 특정 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열의 분절을 지칭한다. 조절 서열의 예는 프로모터, 신호 서열, 작동자 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 유의된 바와 같이, 조절 서열은 관심 코딩 서열/유전자에 대해 센스 또는 안티센스 배향으로 작동가능하게 연결될 수 있다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 유전자의 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제에 결합하는데 수반되는 조절 서열을 지칭한다. 프로모터는 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터일 수 있다.
"3' 비-코딩 서열"은 코딩 서열의 하류에 위치된 DNA 서열을 지칭하고 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호, 예컨대 전사의 종결을 코딩하는 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 숙주 유기체로의 핵산 분자의 전달 또는 도입을 지칭한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형 형태의 DNA로서 도입될 수 있다. 핵산 분자는 자율적으로 복제하는 플라스미드일 수 있거나, 또는 그는 생산 숙주의 게놈 내로 통합될 수 있다. 형질전환된 핵산을 함유하는 숙주는 "형질전환된" 또는 "재조합체" 또는 "트랜스제닉" 유기체 또는 "형질전환체"로서 지칭된다.
용어 "재조합체" 및 "조작된"은, 예를 들어, 화학적 합성 또는 유전적 조작 기술에 의한 핵산의 단리된 분절의 조작에 의한 핵산 서열의 2개의 달리 분리된 분절의 인공적인 조합을 지칭한다. 예를 들어, 1개 이상의 분절 또는 유전자가, 천연적으로 또는 실험적 조작에 의해, 상이한 분자, 동일한 분자의 또 다른 부분, 또는 인공 서열로부터 삽입된 DNA는 유전자에서 및 후속적으로 유기체에서 새로운 서열의 도입을 초래한다. 용어 "재조합체", "트랜스제닉", "형질전환된", "조작된", "유전적으로 조작된" 및 "외인성 유전자 발현을 위해 변형된"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "벡터"는 핵산을 1종 이상의 세포 유형으로 도입하도록 설계된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 입자, 박테리오파지, 카세트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "발현 벡터"는 적합한 숙주에서 DNA의 발현을 초래할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축물을 의미한다. 이러한 제어 서열은 전사를 초래하는 프로모터, 전사를 제어하는 임의적인 작동자 서열, mRNA 상의 적합한 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 인핸서 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현"은 전구체 또는 성숙 형태의 기능적 최종-산물 (예를 들어, mRNA 또는 단백질)의 생산을 지칭한다. 발현은 또한 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 지칭할 수 있다.
유전자의 발현은 유전자의 전사 및 전구체 또는 성숙 단백질로의 mRNA의 번역을 수반한다.
"성숙" 단백질은 번역-후 프로세싱된 폴리펩티드, 즉, 1차 번역 산물에 존재하는 임의의 신호 서열, 프리- 또는 프로펩티드가 제거된 것을 지칭한다.
"전구체" 단백질은 mRNA의 번역의 1차 산물; 즉, 프리- 및 프로펩티드가 여전히 존재하는 것을 지칭한다. 프리- 및 프로펩티드는 세포내 위치 신호일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
"안정한 형질전환"은 유전적으로 안정한 유전을 초래하는, 핵 및 소기관 게놈 둘 다를 포함하는 숙주 유기체의 게놈으로의 핵산 단편의 전달을 지칭한다.
대조적으로, "일시적인 형질전환"은 통합 또는 안정한 유전 없이 유전자 발현을 초래하는 숙주 유기체의 핵, 또는 DNA-함유 소기관으로의 핵산 단편의 전달을 지칭한다.
용어 "재조합체 구축물", "발현 구축물", "재조합체 발현 구축물" 및 "발현 카세트"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 재조합체 구축물은 핵산 단편, 예를 들어, 모두 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열의 인공적인 조합을 포함한다. 예를 들어, 구축물은 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되나, 천연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구축물은 그 자체로 사용될 수 있거나 또는 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우, 벡터의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 방법에 의존한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시키고, 선택하고 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전적 요소를 잘 알고 있다. 통상의 기술자는 또한 상이한 독립적 형질전환 사건이 상이한 수준 및 패턴의 발현을 초래할 수 있고 (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411- 2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86), 따라서 다수의 사건이 전형적으로 목적하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 세포주를 수득하기 위해 스크리닝된다는 것을 인식할 것이다. 이러한 스크리닝은 DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 실시간 정량적 PCR (qPCR), 역전사 PCR (RT-PCR), 단백질 발현의 면역블롯팅 분석, 효소, 또는 활성 검정, 및/또는 표현형 분석을 포함하는 표준 분자 생물학, 생화학, 및 다른 검정을 사용하여 달성될 수 있다.
용어 "숙주" 및 "숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 인간이든 또는 비-인간이든, 재조합 구축물이 유전자를 발현하기 위해 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포, 예컨대 식물, 유기체, 또는 임의의 식물 또는 유기체의 세포를 지칭한다. 이 용어는 증식 동안 발생하는 돌연변이로 인해 모 세포와 동일하지 않은, 모 세포의 임의의 자손을 포함한다.
용어 "항미생물제"는 임의의 미생물, 예컨대 박테리아, 진균, 바이러스, 효모, 곰팡이 등의 성장을 살해하거나, 불활성시키거나 또는 억제하는 것으로 의도되는 임의의 작용제 또는 작용제들의 조합을 지칭한다. 용어 "항미생물제" 및 "살생물제"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다 .
용어 "광범위 항미생물제"는 다양한 마이크로유기체, 예를 들어 그람-양성 박테리아, 그람-음성 박테리아, 효모, 곰팡이, 바이러스 등에 대해 작용하는 것이다.
용어 "강화한다"는 효과적이거나 또는 활성으로 또는 보다 효과적이거나 또는 활성으로 만드는 것을 지칭한다.
용어 "마이크로유기체" 및 "미생물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 너무 작아서 오직 현미경으로만 볼 수 있는 생물, 즉, 미시적인 유기체를 지칭한다. 미생물은 단일-세포 형태 또는 세포의 콜로니 또는 생물막으로 존재할 수 있다. 미생물은 진핵생물 및 원핵생물, 예컨대 박테리아, 고세균, 원생동물, 진균, 조류, 아메바, 바이러스 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제품"은 본원에 기재된 바와 같은 항미생물성 효소 조성물의 보존 또는 사용을 필요로 할 수 있는 구체적인 유용성을 갖는 제제, 조성물, 또는 제조 물품, 예컨대 소비자 포장 제품을 지칭하는 것으로 의도된다. 예는 개인 관리 제품, 가정용 제품, 화장품, 일반의약품 치료제, 제약 제제, 페인트, 코팅, 접착제, 식품, 및 소비자 구매용 제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "조성물"은 본원에 기재된 바와 같은 효소 (예를 들어, 보존성 및/또는 항미생물성) 조성물을 포함하는, 2종 이상의 물질의 조합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "유효량"은 미생물 성장을 방지하거나 또는 억제하는데 충분한 본원에 개시된 바와 같은 보존성 조성물의 양 (예를 들어, 최소 억제 농도 (MIC))을 지칭한다. 본원에 기재된 보존성 조성물은 그람-양성 박테리아, 그람-음성 박테리아, 효모, 진균, 및/또는 곰팡이에 대한 활성일 수 있다.
용어 "병원체"는 질환을 야기할 수 있는 임의의 유기체 또는 물질을 지칭한다. 질환-야기 유기체의 예는 박테리아, 진균, 바이러스, 원생동물 및 기생충을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"제약상 허용되는"은 동물 및, 보다 특히, 인간에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 열거된 것을 의미한다.
"제약상 허용되는 비히클" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터 또는 항미생물성 조성물이 함께 투여될 수 있는 임의의 희석제, 아주반트, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
용어 "보존제"는 미생물 성장 또는 바람직하지 않은 화학적 변화에 의한 분해를 방지하기 위해 제품에 첨가되는 물질 또는 작용제를 지칭한다. 또한 항산화제 및 산소 제거 물질이 "보존제"에 포함된다. 이러한 항산화제 및 산소 제거 물질의 예는 아스코르브산, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 보존제가 첨가될 수 있는 제품의 예는 식품 제품, 음료, 제약 약물, 페인트, 생물학적 샘플, 화장품, 목재, 가정용 세정 제품, 개인 관리 제품 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"임의적인" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기재된 사건, 상황 또는 물질이 발생하거나 또는 존재할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 기재가 사건, 상황, 또는 물질이 발생하거나 또는 존재하는 경우 및 그가 발생하거나 또는 존재하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "저장 수명"은 품목 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 제품)이 여전히 사용가능하거나, 소비용으로 적합하거나, 또는 판매가능한 시간의 길이를 지칭한다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 종래의 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 관련하여 사용된 명명법, 및 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 달리 지시되지 않는 한 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같은 종래의 방법에 따라 수행된다.
제1 실시양태에서, (a) 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 (b) 임의적으로 항미생물성 활성을 갖는, 효소, 펩티드, 또는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 구성요소와 조합하여, 및 임의적으로 추가로 (c) 적어도 1종의 화학적 보존제와 조합하여 포함하는 조성물로서, 여기서 (a)를 (b)와 조합하여 및 임의적으로 (c)와 추가로 조합하여 포함하는 조성물은 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 것인 조성물이 개시된다.
본원에 사용될 수 있는 적합한 가교결합 효소의 예는 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 및 술프히드릴 옥시다제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 유의된 바와 같이, "가교결합"은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 작용기, 예컨대 글루타민 또는 아스파라긴의 아미드 작용기, 리신의 아민 기, 또는 티로신의 페놀계 작용기와, (a) 단백질 또는 폴리펩티드 아미노산 잔기의 상이한 반응성 작용기, 예를 들어, 리신의 아민 작용기, 세린의 히드록실 기, 또는 티로신의 페놀계 히드록실 기 (분자간 또는 분자내 반응에 의함), 또는 (b) 관심 분자 또는 물질의 반응성 작용기 사이의 반응을 촉매하는 효소를 지칭한다. "가교결합 효소"의 하나의 예는 1차 아민, 예를 들어 리신 분자의 엡실론-아민과, 단백질- 또는 펩티드-결합된 글루타민의 아실 기 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 촉매하는 트랜스글루타미나제 (Tgase, EC 2.3.2.13)이다. "가교결합 효소"의 두 번째 예는 페놀, 예컨대 티로신 및 도파민을 산화시켜, 용매-노출된 리실, 티로실, 및 시스테이닐 잔기 뿐만 아니라 수많은 소분자와 가교결합을 용이하게 형성하는 반응성 o-퀴논을 형성하는 구리-함유 옥시다제인, 티로시나제 (EC 1.14.18.1)이다. "가교결합 효소"의 세 번째 예는 1-전자 산화를 수행하여 페놀계 기질을 산화시켜, 가교결합을 초래하는, 식물, 진균 및 박테리아에서 발견되는 다중-구리 옥시다제인, 락카제이다. "가교결합 효소"의 네 번째 예는 다른 단백질 및 펩티드 뿐만 아니라 수많은 소분자와 가교결합시키는 고도로 반응성 알데히드로의 리신 분자의 전환을 촉매하는 구리 의존적 옥시다제인, 리실 옥시다제이다.
일부 실시양태에서, 조성물은, 예를 들어, 보존될 제품에서 적어도 1종의 가교결합 효소를, 미생물 (예를 들어, 박테리아, 진균) 성장을 억제하는데, 예를 들어, 미생물 성장의 50% 내지 100%, 또는 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 임의의 것의 억제에 효과적인 양으로 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 적어도 1종의 가교결합 효소를 포함한다.
바람직하게는, 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 및 티로시나제로부터 선택될 수 있으며, 이는 통상적으로 활성 효소 형태에서 세포 독성을 나타낸다.
가장 바람직하게는, 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제, 예를 들어, 스트렙토미세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제 (서열식별번호: 1), 또는 그의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 2)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 가장 구체적으로, 가교결합 효소는 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 효소는 가교결합 효소, 예컨대, 트랜스글루타미나제, 예를 들어, 스트렙토미세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제 (서열식별번호: 1), 또는 그의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 2)이나, 이에 제한되지는 않으며, 항미생물성 및/또는 보존성 활성 및 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
트랜스글루타미나제 (Tgase, EC2.3.2.13)는 1차 아민, 예를 들어, 리신 분자의 ε-아민과, 단백질- 또는 펩티드-결합된 글루타민의 아실 기 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 촉매하는 효소이다. 트랜스글루타미나제는 표적 단백질의 글루타밀과 리실 측쇄 사이에 아미드교환 반응을 촉매할 수 있다. Tgase 활성을 보유하는 단백질이 마이크로유기체, 식물, 무척추동물, 양서류, 어류 및 조류에서 발견되었다. 진핵 Tgase와 대조적으로, 미생물 기원의 Tgase는 칼슘-독립적이며, 이는 이들의 실용적인 사용을 위한 주요 이점을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 미생물 트랜스글루타미나제, 예를 들어 스트렙토미세스 모바라엔시스의 변이체의 Ca2+-독립적 미생물 트랜스글루타미나제 (Tgase)이다. 일부 특히 바람직한 실시양태에서, Tgase는 미생물 Tgase이고 바람직하게는 스트렙토미세스 모바라엔시스의 변이체의 Ca2+-독립적 미생물 트랜스글루타미나제 (Tgase)이다. 일부 특히 바람직한 실시양태에서, Tgase는 스트렙토미세스 모바라엔시스 Tgase의 보다 안정한 돌연변이 변이체, 예컨대 서열식별번호: 2이다. 문헌 [Zhang, et al. (2010) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 26:205-222]로부터 재현되고, 문헌 [Steffen, et al. (2017) J. Biol. Chem. 292(38):15622-15635]로부터 추가된, 널리 정의된 미생물 Tgase는 표 2에 제시된다.
트랜스글루타미나제는 트랜스퍼라제 부류의 효소에 속한다 (Heck et al. (2013) Applied Microbiology and Biotechnology 97:461-475). 트랜스퍼라제는 친핵성 치환 반응에 의한 작용기, 예컨대 메틸, 히드록시메틸, 포르말, 글리코실, 아실, 알킬, 포스페이트, 및 술페이트 기의 전달을 촉매한다. 트랜스퍼라제는 전달된 기(들)에 기반하여 10개의 카테고리로 나누어질 수 있다. 전달된 상이한 기는 단일-탄소 기, 알데히드 또는 케톤 기, 아실 기 또는 전달 동안 알킬 기가 되는 기, 글리코실 기 뿐만 아니라 헥소스 및 펜토스, 메틸 기 이외의 알킬 또는 아릴 기, 질소함유 기, 및 인-함유 기를 포함하고; 하위부류는 수용체 (예를 들어 알콜, 카르복실 등), 황-함유 기, 셀레늄-함유 기, 및 몰리브데넘 또는 텅스텐에 기반한다.
표 2. 널리 정의된 미생물 Tgase
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일반적으로 안전한 것으로 인식된 (GRAS) 자격이 해산물, 육류, 유제품, 및 곡물 제품에서의 단백질 가교결합을 위한 에스. 모바라엔시스로부터의 Tgase 제제에 대해 부여되었다 (FDA/CFSAN 기관 응답 서신: GRAS 통지 번호 000004 (1998), 000029 (1999), 000055 (2001), 및 000095 (2002)). 상업적으로 이용가능한 미생물 트랜스글루타미나제는 대규모로 생산되고 아지노모토 유에스, 인크.( Ajinomoto US, Inc.)에 의해 상표명 액티바(ACTIVA)® 하에 유통된다.
리실 옥시다제 (LOX, EC 1.4.3.13, 또한 단백질-리신 6-옥시다제로서 공지됨)는 1차 아민 기질을 반응성 알데히드로 산화시키는 구리-의존적 효소이다. 5종의 상이한 LOX 효소, LOX 및 LOX-유사(LOXL) 1 내지 4가 포유동물에서 확인되었으며, 이는 고도로 보존된 촉매성 카르복시 말단 도메인 및 서열의 나머지에서 보다 많은 분기를 나타낸다. 추가적으로, LOX 단백질은 많은 다른 진핵생물 뿐만 아니라 박테리아 및 고세균에서 확인되었으며, 이는 문헌 [Grau-Bove, et al. (2015) Scientific Reports 5: Article number: 10568]에서 검토되었다.
티로시나제 (EC 1.14.18.1)는 페놀, 예컨대 티로신 및 도파민을 산화시켜, 용매-노출된 리실, 티로실, 및 시스테이닐 잔기 뿐만 아니라 수많은 소분자와 가교결합을 용이하게 형성하는 반응성 o-퀴논을 형성하는 구리-함유 옥시다제이다. 천연에서, 티로시나제는 경화 및 멜라닌화에 중대한 역할을 하고, 아마도 과실 및 식물의 효소적 갈변을 담당하는 효소로서 가장 널리 공지되어 있다. 티로시나제는 유청 단백질 α-락트알부민 및 β-락토글로불린의 가교결합을 유도하는 것으로 입증되었다. 티로시나제는 광범위한 식물, 동물, 및 진균 종으로부터 단리되고 연구되어 왔다.
가장 널리 공지되고 특징규명된 티로시나제는 포유류 기원의 것이다. 구조적 및 기능적 관점 둘 다로부터의 가장 광범위하게 조사된 진균 티로시나제는 아가리쿠스 비스포러스(Agaricus bisporus) (Wichers, et al. (1996) Phytochemistry 43(2):333-337) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (Lerch (1983) Mol Cell Biochem 52(2):125-128)로부터의 것이다. 몇몇의 박테리아 티로시나제가 보고되었으며, 그 중 스트렙토미세스 티로시나제가 가장 철저히 특징규명되어 있다 (미국 특허 번호 5,801,047 및 5,814,495). 또한, 예를 들어, 바실루스(Bacillus) 및 미로테슘(Myrothecium) (EP919628), 뮤코르(Mucor) (JP61115488), 미리오코쿰(Miriococcum) (JP60062980), 아스페르길루스(Aspergillus), 카에토토마스티아(Chaetotomastia), 및 아스코바기노스포라(Ascovaginospora) (Abdel-Raheem and Shearer (2002) Fungal Diversity 11(5):1-19), 및 트라메테스(Trametes) (Tomsovsky and Homolka (2004) World Journal of Microbiology and Biotechnology 20(5):529-530)로부터의 티로시나제가 개시되었다.
락카제는 1-전자 산화를 수행하여 페놀계 기질을 산화시켜, 가교결합을 초래하는, 식물, 진균, 및 박테리아에서 발견되는 다중-구리 옥시다제이다. 락카제에 의해 단백질을 가교결합시키는 방법은, 예를 들어, US2002/009770에 개시되었다. 콩, 곡물 유래된 식물 단백질, 및 우유, 알, 고기, 혈액, 및 힘줄을 포함하는 동물 단백질이 적합한 기질로서 열거된다. 진균 락카제는 US2002/019038에 개시되어 있다.
소르타제는 그람-양성 박테리아의 막에 매립된 칼슘-의존적 효소의 그룹을 구성한다. 이들의 1차 아미노산 서열에 기반하여, 소르타제는 현재 박테리아 세포 표면에서 고도로 부위-특이적 펩티드전이 반응을 발휘하는 6개의 상이한 부류 (A-F)로 지정된다 (Spirig, et al. (2011) Mol Microbiol 82:1044-1059). 이들은 소르타제 A에 의한 성장하고 있는 세포벽에의 다양한 기능적 단백질의 고정 (Marraffini, et al. (2006) Microbiol Mol Rev 70:192-221; Mazmanian, et al. (1999) Science 285:760-763) 및 소르타제 C에 의한 개별 필린 서브유닛으로부터의 선모의 조립 (Hendrickx, et al. (2011) Nat Rev Microbiol 9:166-176)을 포함한다.
포르밀글리신-생성 효소 (FGE, EC 1.8.3.7)는 진핵생물 및 호기성 미생물에서 유형 I 술파타제의 번역동시 또는 번역후 활성화를 촉매하는 구리-함유 옥시다제이다 (Appel et al. (2019) Proc Natl Acad Sci 116(12): 5370-5375). 이는 포르밀글리신 (fGly)으로의 술파타제 활성-부위 시스테인 잔기의 산화에 의해 달성된다. FGE의 난잡은 생명공학 및 치료적 적용에서의 그의 용도, 예컨대 모노클로날 항체에서의 fGly에의 부위-특이적 약물 부착을 가능하게 하였다.
술프히드릴 옥시다제 (SOX, EC 1.8.3.2)는 전자 수용체로서 분자 산소를 사용함으로써 단백질 및 티올-함유 소분자에서의 유리 술프히드릴 기를 산화시킨다 (Faccio et al. (2011) App Microbiol Biotechnol 91(4) 957-966). SOX는 많은 유기체의 세포내 구획으로부터 단리되었으며, 여기서 이들은 단백질 사이에 디술피드 브릿지를 형성한다. 추가적으로, SOX는 많은 산업적으로 관련이 있는 유기체의 분비체에서 발견되었다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "퍼센트 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같은, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 관련 기술분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라, 이러한 서열의 스트링 사이의 매치하는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수에 의해 결정된 바와 같은, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 하기에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk, AM., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, AM., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991).
동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 체계화되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "% 동일성" 또는 "퍼센트 동일성" 또는 "PID"는 단백질 서열 동일성을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 유용한 알고리즘은 BLAST 알고리즘을 포함한다 (문헌 [Altschul, et al., J Mol Biol, 215:403-410, 1990]; 및 [Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 프로그램은 여러 검색 파라미터를 사용하며, 그 중 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. NCBI BLAST 알고리즘은 생물학적 유사성의 측면에서 가장 관련이 있는 서열을 찾으나, 20개 미만의 잔기의 질의 서열에 대해 권장되지 않는다 (Altschul, et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997; 및 Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2994-3005, 2001). 핵산 서열 검색을 위한 예시적인 디폴트 BLAST 파라미터는 하기를 포함한다: 이웃 단어 역치= 11; E-값 컷오프= 10; 점수화 매트릭스= NUC.3.1 (매치= 1, 미스매치= -3); 갭 개방= 5; 및 갭 연장= 2. 아미노산 서열 검색을 위한 예시적인 디폴트 BLAST 파라미터는 하기를 포함한다: 단어 크기= 3; E-값 컷오프= 10; 점수화 매트릭스= BLOSUM62; 갭 개방= 11; 및 갭 연장= 1. 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성 값은 "참조" 서열의 잔기의 총 수로 나눈 매치하는 동일한 잔기의 수에 의해 결정된다. BLAST 알고리즘은 "질의" 서열로서 "참조" 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "상동성 단백질"은 1차, 2차, 및/또는 3차 구조에서 구별되는 유사성을 갖는 단백질을 지칭한다. 단백질 상동성은 단백질이 정렬될 때 선형 아미노산 서열에서의 유사성을 지칭할 수 있다. 단백질 서열의 상동성 검색은 0.001에서의 역치 (E-값 컷-오프)를 사용한 NCBI BLAST로부터의 BLASTP 및 PSI-BLAST를 사용하여 수행될 수 있다. 갭형 BLAST 및 PSI BLAST는 단백질 데이터베이스 검색 프로그램의 새로운 세대이다 (Altschul SF, Madde TL, Shaeffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ, Nucleic Acids Res (1997) 25(17):3389-402). 이 정보를 사용하여, 단백질 서열은 그룹화될 수 있다.
서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 레이저진(LASERGENE) 생물정보학 컴퓨팅 제품군의 Megalign 프로그램 (디엔에이스타 인크.(DNASTAR Inc.), 위스콘신주 매디슨), VectorNTI v. 7.0 (인포맥스, 인크.(Informax, Inc.), 메릴랜드주 베데스다)의 AlignX 프로그램, 또는 EMBOSS 오픈 소프트웨어 제품군 (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000))을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 유럽 생물정보학 연구소를 통해 유럽 분자 생물학 실험실로부터 이용가능한, 디폴트 파라미터를 사용한 CLUSTAL 정렬 방법 (예컨대 CLUSTALW; 예를 들어, 버전 1.83)을 사용하여 수행될 수 있다 (Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994); 및 Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500 (2003)). CLUSTALW 단백질 정렬을 위한 적합한 파라미터는 갭 존재 패널티=15, 갭 연장 =0.2, 매트릭스= Gonnet (예를 들어, Gonnet250), 단백질 ENDGAP = -1, 단백질 GAPDIST=4, 및 KTUPLE=l을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 고속 또는 저속 정렬이 사용되며, 저속 정렬이 디폴트 설정이다. 대안적으로, CLUSTALW 방법을 사용하는 파라미터 (예를 들어, 버전 1.83)는 또한 KTUPLE =l, 갭 패널티=l0, GAP 연장=l, 매트릭스= BLOSUM (예를 들어, BLOSUM64), 윈도우=5, 및 저장된 상단 대각=5를 사용하는 것으로 변형될 수 있다.
대안적으로, 다중 서열 정렬은 디폴트 설정, 점수화 매트릭스 BLOSUM62, 갭 개방 패널티 1.53 및 오프셋 값 0.123을 사용한 지니어스(Geneious)® 버전 10.2.4의 MAFFT 정렬을 사용하여 유래될 수 있다.
MUSCLE 프로그램 (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput (Nucl. Acids Res. (2004) 32(5):1792-1797))이 다중 서열 정렬 알고리즘의 또 다른 예이다.
임의적으로 항미생물성 활성을 갖는 구성요소의 예는 프로테아제, 히드로리아제 및 리아제, 예컨대 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 서브틸리신, 아밀라제, 셀룰라제, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, 아밀라제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신, 및 데펜신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 조성물에 사용하기에 적합한 화학적 보존제의 예는 4차 암모늄 화합물, 세제, 카오트로픽 작용제, 유기 산, 알콜, 글리콜, 알데히드, 산화제, 파라벤, 이소티아졸리논, 및 양이온성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, 가교결합 효소는 효소원의 형태이고 조성물은 효소를 포함하며, 여기서 효소원 및 효소는 상호작용하여 보존성 및/또는 항미생물성 활성을 갖는 활성 또는 성숙 효소 (예를 들어, 효소원 및 효소는 효소원이 효소원의 성숙 형태로 전환되도록 상호작용함)를 생산한다.
또 다른 실시양태에서, 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 코딩하는 적어도 1종의 이종성 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 상기 이종성 핵산 서열은 임의적으로 적어도 1개의 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 여기서 발현 벡터는 상기 적어도 1종의 가교결합 효소를, 세포내로 또는 세포외로, 발현하도록 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주 세포가 불활성화되거나, 억제되거나 (예를 들어, 형질전환된 숙주 세포의 성장이 억제됨), 또는 살해되도록 할 수 있는 것인 발현 벡터가 개시된다.
보존제는 미생물 오염물의 성장을 억제하고 그의 양을 감소시킴으로써 제품의 미생물학적 안전성을 유지하기 위해 제품 제제에 첨가된 항미생물성 성분이다. 미국 약전은 화장품 및 개인 관리 제품에서 보존제에 대해 허용되는 미생물 생존에 대한 프로토콜을 공개하였다. 이들 시험은 USP 51 (항미생물성 유효성 시험) 및 USP 61 (미생물 한계 시험)을 포함한다 (https://www.fda.gov/files/about%20fda/published/Pharmaceutical-Microbiology-Manual.pdf).
본원에 개시된 보존성 시스템의 유효성은, 그람-양성 박테리아, 그람-음성 박테리아, 효모 및/또는 곰팡이 (예를 들어, 에스. 아우레우스(S. aureus) ATCC 6538, 이. 콜라이(E. coli) ATCC 8739, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) ATCC 9027, 씨. 알비칸스(C. albicans) ATCC 10231, 및 에이. 브라실리엔시스(A. brasiliensis) ATCC 16404)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 미생물에 대한 MIC (최소 억제 농도)에 기반하여 결정된다. 최소 억제 농도 (MIC)는 마이크로유기체의 성장을 억제할 항미생물제의 가장 낮은 농도로서 정의된다. 미생물 성장은, 예를 들어, 분광광도계적 방법 (600-650 nm에서의 광학 밀도)에 의해 또는 세포 생존율 검정 (예를 들어, 백타이터-글로(BacTiter-Glo)™, 프로메가(Promega)®)으로 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물에 이용된 적어도 1종의 가교결합 효소는 초기에 효소원의 형태이다. 상기 논의된 바와 같이, 효소원은 목적하는 항미생물성 및/또는 보존성 활성을 갖는 활성 효소를 제공하기 위해 절단되어야 하는 프로-서열과 함께 발현되는 불활성 효소 전구체 (전구효소)이다. 프로-서열의 절단은 보통 세포에 고도로 독성인 활성 또는 성숙 효소 (즉, 효소원의 성숙 형태)를 제공한다. 전구효소는 세포에 대한 관련된 효소 독성으로 인해, 효소의 활성을 억제하기 위한 절단가능한 선도 서열과 함께 발현된다. 따라서, 효소원은 이들의 성숙 형태가 항미생물성 특성을 나타내는 경우에 항미생물성 또는 보존성 작용제로서 사용하기 위한 유용한 부류의 효소를 제시한다. 성숙 활성 효소 형태 (즉, 프로-서열이 없음)가 항미생물성 및/또는 보존성 조성물의 제제를 위해 개시된 조성물에 사용될 수 있다. 이 카테고리 내 유용한 효소는 용해 효소 (예를 들어 프로테아제, 히드롤라제, 리아제, 뉴클레아제) 및 가교결합 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은, 불활성 효소원 (예를 들어, 가교결합 효소, 예컨대 트랜스글루타미나제, 락카제, 퍼옥시다제, 트랜스퍼라제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 또는 술프히드릴 옥시다제의 효소원)은 조성물 또는 제품에서 또는 보존성 또는 항미생물성 사용 방법에서 적어도 1종의 효소, 예컨대 프로테아제와 조합된다. 효소원은 효소와 함께 조성물 중에 저장될 수 있거나 또는 사용 부위에서 조합될 수 있다. 효소는, 예를 들어, 제품의 보존을 위해 또는 항미생물성 적용 용도에서 (예를 들어, 미생물 제어를 위해) 효소원을 활성화시키는 (예를 들어, 효소원과 상호작용하여 효소원을 효소원의 성숙 형태로 전환시키는) 역할을 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 항미생물성 작용제, 예컨대 효소, 펩티드 등을 포함한다. 항미생물성 작용제의 예는 키토산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이론에 얽매이지 않고, 항미생물성 작용제의 사용은 존재하는 가교결합 효소 또는 효소들의 항미생물성 활성과 함께 상가작용적 효과를 가질 수 있으며, 이는 광범위 미생물 제어를 전달한다. 키토산은, 예를 들어, 세포막을 파열시키고 세포 내용물의 유출을 야기한다. 본원에 기재된 바와 같은, 가교결합 효소는 세포의 표면 상 및 세포 내부 둘 다에서 세포 기능에 필수적인 단백질을 가교결합시킬 수 있다. 두 물질의 이 조합은 함께 (즉, 항미생물성 효소 및 항미생물성 작용제 (예를 들어, 키토산)) 요구되는 물질의 양을 감소시키고 (즉, 보다 적은 항미생물성 화학물질 (예를 들어, 키토산) 및 보다 적은 가교결합 효소) 효소에 대한 추가적인 안정성을 제공하며, 이는 시간이 지나면서 보다 큰 활성을 허용하고, 항미생물성 화학물질, 예컨대 키토산의 사용을 동반할 수 있는 바람직하지 않은 효과를 감소시킨다. 본원에 기재된 조성물에 포함될 수 있는 공지된 항미생물성 효소, 펩티드, 및 단백질의 비제한적인 예는 표 3에 제시된다.
표 3. 공지된 항미생물성 특성을 갖는 효소, 펩티드 및 단백질
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일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 또는 술프히드릴 옥시다제와 같으나, 이에 제한되지는 않는, 본원에 개시된 가교결합 효소 중 임의의 것은 광범위 미생물 제어를 제공하기 위해 표 3에 기재된 항미생물성 효소, 펩티드, 또는 단백질 중 1개 이상과 조합하여 항미생물성 및/또는 보존성 조성물에 이용될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 항미생물성 화학물질을 포함할 수 있다. 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 또는 술프히드릴 옥시다제와 같으나, 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 바와 같은, 항미생물성 가교결합 효소는, 예를 들어, 항미생물성 조성물로서 사용하기 위해, 키토산, 폴리리신, 또는 4차 암모늄 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 항미생물성 화학물질(들)과 제제화될 수 있다. 항미생물성 화학물질의 비제한적인 예는 하기 표 4에 제시된다.
표 4. 항미생물성 적용을 위한 항미생물성 화학물질의 예
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양이온성 생물중합체 및 4차 암모늄 화합물은 세포막을 파괴하는 이들의 능력 때문에 보존제 또는 보존성 강화제로서 성공적으로 이용되었다. 키토산과 같은 천연 양이온성 생물중합체는 이들의 항미생물성 활성에 대해 널리 공지되어 있다 (Kong, et al. (2010) Int. J. of Food Microbiol. 144: 51-63). 상이한 그룹의 마이크로유기체, 예컨대 박테리아, 효모, 및 진균에 대한 키토산의 항미생물성 활성은 공지되어 있다. 4차 암모늄 화합물 (비-제한적인 예는 세틸 피리디늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 및 폴리아미노프로필 비구아니드를 포함함)은 유사하게 주목할 만한 항미생물성 특성을 갖는다. 그러나, 이들 4차 암모늄 화합물은 다른 화장품 성분과의 특정 부적합성으로 인해 개인 관리 산업을 위한 제한된 용도를 갖는다. 예를 들어, 벤즈에토늄 클로라이드는 국소 개인 관리 제제의 중요한 부분을 형성하는 많은 음이온성 성분, 예컨대 음이온성 계면활성제에 의해 불활성화된다.
가교결합제, 예컨대 포름알데히드 및 DMDM 히단토인 (CAS 6440-58-0), 이미다졸리디닐 우레아, 및 디아졸리디닐 우레아 (CAS 39236-46-9)와 같은 포름알데히드 공여체가 또한 사용된다. 이들 물질에 의해 방출된 포름알데히드는 포름알데히드의 광범위한 사용을 제한하는 건강 걱정에 더하여 그의 반응성 알데히드 카르보닐 작용기를 통해 여러 화장품 성분과 반응할 수 있다. 예를 들어, 아보벤존은 포름알데히드 유도체에 의해 방출되는 포름알데히드와 반응한다.
파라벤은 p-히드록시벤조산의 에스테르이다. 파라벤 화합물은 메틸-파라벤 (CAS 99-76-3), 에틸-파라벤 (CAS 120-47-8), 프로필-파라벤 (CAS 94-13-3), 부틸-파라벤 (CAS 94-26-8), 이소프로필-파라벤 (CAS 4191-73-5), 및 벤질-파라벤 (CAS 94-18-8)을 포함한다. 파라벤은 페놀 유도체이며, 유기 작용기와 반응할 수 있는 10의 pKa를 갖는 페놀계 '히드록실' 기를 갖는다. 추가적으로, 파라벤은 내분비 교란물질로서의 이들의 가능한 역할 때문에 소비자 선호를 잃었다.
할로겐화 분자, 예컨대 클로로티아졸리논, 2,4-디클로로벤질-알콜, 클로로크실레놀, 메틸 디브로모 글루타로니트릴, 2-브로모-2-니트로-1,3-디올, 클로르페네신, 및 클로르헥시딘은 고도로 반응성 화합물이고 이들의 사용량 수준은 독성 및 감작화를 제한하기 위해 개인 관리 산업에 걸쳐 고도로 조절되었다. 예를 들어, IPBC는 그의 아이오딘 함량으로 인해 갑상선 호르몬 교란의 위험이 있다. 그는 일본에서 허용되지 않았고 EU에서 리브-온 산물에서 단지 최대 0.02 %가 허용된다. 유사하게, EU는 오직 린스-오프 산물에서만 단지 최대 0.1 % 메틸 디브로모 글루타로니트릴의 사용량을 허용한다. 브로노폴, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올은 질소 함유 화장품 성분의 일부와의 상호작용에 대한 발암성 니트로소아민의 생성에 연루된다. 메틸클로로이소티아졸리논의 항미생물성 효능은 오직 린스-오프 산물에서만 15 ppm 농도로 허용된다.
본원에 개시된 광범위 항미생물성 및/또는 보존성 조성물이 개인 관리, 가정용, 산업용, 기관, 석유 및 가스, 해양, 식음료, 농업, 동물, 및 인간 영양, 정수 등과 같은 다양한 적용에 사용될 수 있다는 것이 유의되어야 한다.
상기 본원에 개시된 비-제한적인 실시양태는 하기를 포함한다:
1. (a) 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 (b) 임의적으로 항미생물성 활성을 갖는, 효소, 펩티드, 및/또는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 구성요소와 조합하여, 및 임의적으로 추가로 (c) 적어도 1종의 화학적 보존제와 조합하여 포함하는 조성물로서, 여기서 (a)를 (b)와 조합하여, 및 임의적으로 추가로 (c)와 조합하여 포함하는 조성물은 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 것인 조성물.
2. 실시양태 1에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 및 술프히드릴 옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제인 조성물.
4. 실시양태 1, 2 또는 3에 있어서, 트랜스글루타미나제는 서열식별번호: 2에서의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
5. 실시양태 1, 2, 3 또는 4에 있어서, 항미생물성 활성을 갖는 적어도 1종의 구성요소가 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신, 및 데펜신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
6. 실시양태 1, 2, 3, 4 또는 5에 있어서, 적어도 1종의 화학적 보존제가 4차 암모늄 화합물, 세제, 카오트로픽 작용제, 유기 산, 알콜, 글리콜, 알데히드, 산화제, 및 파라벤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
7. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 있어서, (a)는 효소원이고 (b)는 효소를 포함하며 추가로 여기서 효소원 및 효소는 상호작용하여 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 효소원의 활성 효소를 생산하는 것인 조성물.
8. 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 코딩하는 적어도 1종의 이종성 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 상기 이종성 핵산 서열은 임의적으로 적어도 1개의 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 여기서 발현 벡터는 상기 적어도 1종의 가교결합 효소를, 세포내로 또는 세포외로, 발현하도록 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주 세포가 불활성화되거나, 억제되거나, 또는 살해되도록 할 수 있는 것인 발현 벡터.
9. 실시양태 8에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 및 술프히드릴 옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
10. 실시양태 8 또는 9에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제인 발현 벡터.
11. 실시양태 8, 9 또는 10에 있어서, 트랜스글루타미나제는 서열식별번호: 2에서의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 발현 벡터.
12. 실시양태 8, 9, 10 또는 11에 있어서, 항미생물성 활성을 갖는 적어도 1종의 구성요소가 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신, 및 데펜신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
13. 실시양태 8, 9, 10, 11 또는 12에 있어서, 적어도 1종의 화학적 보존제가 4차 암모늄 화합물, 세제, 카오트로픽 작용제, 유기 산, 알콜, 글리콜, 알데히드, 산화제, 파라벤, 이소티아졸리논, 및 양이온성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
14. 실시양태 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13에 있어서, (a)는 효소원이고 (b)는 효소를 포함하며 추가로 여기서 효소원 및 효소는 상호작용하여 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 활성 효소를 생산하는 것인 발현 벡터.
15. 실시양태 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14에 있어서, 트랜스글루타미나제는 서열식별번호: 2에서의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 발현 벡터.
하기 실시예는 본 발명을 예시하나, 제한하지 않는 것으로 의도된다.
실시예
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)], 및 [Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 제공한다.
본 개시내용은 하기 실시예에 추가로 정의된다. 이들 실시예가 특정 실시양태를 나타내지만, 단지 예시로서 제공된다는 것이 이해되어야 한다. 상기 논의 및 실시예로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 그의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서, 다양한 용도 및 조건에 적응하기 위해 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다.
실시예
실시예 1. 야생형 Tgase (서열식별번호: 1)의 항미생물성 특성
서열식별번호: 1에 도시된 아미노산 서열을 갖는 상업적으로 이용가능한 야생형 스트렙토미세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제 (TI 제제)는 아지노모토로부터 공급되었다. Tgase는 아지노모토 USA로부터 상표명 액티바®-TI 하에 이용가능하다. 이 제품은 99% 말토덱스트린 및 1% 미생물 효소의 고체 제제로서 판매된다. 아지노모토는 효소 활성이 81-135 U/g인 것으로 보고한다. 액티바®-TI는 받은 대로 사용될 뿐만 아니라 효소를 농축시키기 위해 접선 유동 여과 또는 정용여과에 의해 말토덱스트린으로부터 정제되었다. 추가적으로, 야생형 Tgase 서열식별번호: 1은 이전에 기재된 바와 같이 문헌 방법에 의해 제조되었다 (Javitt, et al. (2017) BMC Biotechnol. 17:23). Tgase 활성은 비색 히드록사메이트 활성 검정을 사용하여 측정되었다 (Folk and Cole (1965) J Biol Chemistry 240(7):2951-2960). 두 제제는 유사한 결과를 제공하였다.
이. 콜라이 ATCC 8739 및 씨. 알비칸스 ATCC 10231을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC) (버지니아주 매너서스)으로부터 획득하고 -80 ℃ 동결된 글리세롤 스톡으로서 유지하였다. 비. 서브틸리스(B. subtilis) BGSC 1A1276을 바실루스 제네틱 스톡 센터(Bacillus Genetic Stock Center) (BGSC) (오하이오주 콜럼버스)로부터 구매하고 -80 ℃ 동결된 글리세롤 스톡으로서 유지하였다. 이. 콜라이 DH5-알파 및 이. 콜라이 DH10-베타를 뉴잉글래드 바이오랩스(New England Biolabs) (NEB) (매사추세츠주 입스위치)로부터 구매하고 -80 ℃ 동결된 글리세롤 스톡으로서 유지하였다.
박테리아 배양물의 MIC 결정을 위해, 이. 콜라이 ATCC 8739, DH5-알파, DH10-베타, 및 비. 서브틸리스 BGSC 1A1276을 LB 브로스에서 37 ℃에서 밤새 (16-18시간) 성장시켰다. 다음 날, 포화 배양물의 세포 밀도를 OD600을 사용하여 계산하였고 배양물을 멸균 LB 배지에서 104 내지 106 CFU/mL로 희석하여 접종물을 생성하였고, 90 μL의 접종물을 0.003% 리소자임 (효과적인 농도보다 100-배 더 낮음)의 존재 또는 부재 하에 0.0001-0.01 중량 퍼센트의 범위에서 10 μL의 연속 희석된 Tgase 서열식별번호: 1과 조합하였다. 성장 곡선을 바이오텍(BioTek)® 시너지 플레이트 리더 상에서 OD600에 의해 측정하였다. 임의적으로, 다음 날, 세포 생존율 검정, 예컨대 백타이터-글로™(프로메가®) (제조업체의 프로토콜에 따름)가 세포 생존율을 평가하는데 사용될 수 있다. OD600 또는 발광에서의 감소는 세포 생존율에서의 감소를 나타냈다. 결과는 비처리된 배양물에 대한 세포 계수에서의 퍼센트 감소로서 제시된다. 모든 시험 조건은 삼중으로 수행되었다.
효모 배양물의 MIC 결정을 위해, 씨. 알비칸스 ATCC 10231을 YPD 배지에서 30 ℃에서 밤새 (24시간) 성장시켰다. 다음 날, 포화 배양물의 세포 밀도를 OD600을 사용하여 계산하였고 배양물을 멸균 YPD 배지에서 104 내지 106 CFU/mL로 희석하여 접종물을 생성하였고, 90 μL의 접종물을 0.0001-0.01 중량 퍼센트의 범위에서 10 μL의 연속 희석된 Tgase 서열식별번호: 1과 조합하였다. 배양물을 30 ℃에서 밤새 성장시켰고 성장 곡선을 바이오텍® 시너지 플레이트 리더 상에서 OD600에 의해 측정하였다. 임의적으로, 다음 날, 세포 생존율 검정, 예컨대 백타이터-글로™ (프로메가®) (제조업체의 프로토콜에 따름)가 세포 생존율을 평가하는데 사용될 수 있다. OD600 또는 발광에서의 감소는 세포 생존율에서의 감소를 나타냈다. 결과는 비처리된 배양물에 대한 세포 계수에서의 퍼센트 감소로서 제시된다. 모든 시험 조건은 삼중으로 수행되었다.
Tgase 서열식별번호: 1의 존재 또는 부재 하에 그람 음성 이. 콜라이 (ATCC 8739, DH5-알파, 및 DH10-베타)를 성장시켰을 때, Tgase 서열식별번호: 1은 평가된 농도 하에 검출가능한 항미생물성 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 클로닝 균주, DH5-알파 및 DH10-베타가 이들 균주가 취약한 세포 기질을 갖고 보다 거대분자, 예컨대 DNA에 의한 세포막의 침투에 보다 도움이 되기 때문에, 보다 접근가능한 세포막을 갖는 세포를 대표하는데 이용되었다.
그람-양성 박테리아 클로닝 균주, 비. 서브틸리스 BGSC 1A1276을 사용할 때, Tgase 서열식별번호: 1의 항미생물성 활성이 관측되었다. 비. 서브틸리스 BGSC 1A1276 성장의 완전 억제가 세포막 파괴제, 리소자임을 첨가할 시 관측되었다. 씨. 알비칸스 및 비. 서브틸리스 둘 다의 성장은 Tgase 서열식별번호: 1에 의해 부분적으로 억제된다. 결과는 표 5에 열거된다.
실시예 2. Tgase 변이체 (서열식별번호: 6)의 항미생물성 특성
서열식별번호: 6에 도시된 아미노산 서열을 갖는 스트렙토미세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제의 변이체 형태는 이전에 기재된 바와 같이 문헌 방법에 의해 제조되었다 (Javitt, et al. (2017) BMC Biotechnol. 17:23). Tgase 활성은 비색 히드록사메이트 활성 검정을 사용하여 측정되었다 (Folk and Cole (1965) J Biol Chemistry 240(7):2951-2960). Tgase 세포독성 활성을 OD600 또는 상업적으로 이용가능한 키트 (백타이터-글로™, 프로메가®, 제조업체의 프로토콜에 따름)를 사용하여 평가하였다.
효모 또는 박테리아 종균 배양물을 이전에 기재된 바와 같이 성장시켰다. Tgase (서열식별번호: 6)를 0.001-1 중량 퍼센트에서 각각의 배양물에 첨가하였다. 배양물을 30 ℃ - 37 ℃에서 밤새 성장시켰고 성장 곡선을 바이오텍® 시너지 플레이트 리더에 의해 측정하였다. Tgase 서열식별번호: 6은 Tgase 서열식별번호: 1보다 10-배 더 강력한 것으로 발견되었으며 여기서 살생물성 활성은 두 효소에서 관측될 수 있다. 표 5를 참조한다.
표 5. 리소자임과 조합된 야생형 Tgase의 항미생물성 효능
Figure pct00011
실시예 3. 서열식별번호: 6 최소 억제/살진균제 농도
서열식별번호: 6에 도시된 아미노산 서열을 갖는 스트렙토미세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제의 변이체 형태는 정제를 돕기 위해 헥사-his-태그와 함께 문헌 방법에 의해 제조되었다 (Javitt, et al. (2017) BMC Biotechnol. 17:23). 세포를 진탕 플라스크에서 성장시키고, 균질화에 의해 용해시켰고, Tgase 변이체 (서열식별번호: 6)를 원심분리에 의해 세포 잔해로부터 단리하였다. 생성된 반-정제된 효소 (정화된 용해물)를 SDS-PAGE 겔 상에서, 분광법, 및 활성 효소의 농도에 대한 활성에 의해 비교하였다. Tgase 변이체 (서열식별번호: 6)는 MIC 검정 전에 Ni-IMAC 수지 상 친화도 칼럼에 의해 추가로 정제되었다. Tgase 활성을 본원 실시예에서 비색 히드록사메이트 활성 검정을 사용하여 측정하였다 (Folk and Cole (1965) J Biol Chemistry 240(7):2951-2960). 효소를 CAMHB 또는 RPMI 배지 (박테리아 또는 진균 배지)에서 2 mg/mL의 작업 스톡 농도로 희석하였다. 이를 이어서 96-웰 마스터 플레이트에서 적절한 배지에서 10회 2-배 연속 희석하여 MIC 시험을 위해 2X 시작 농도를 생성하였다.
벤즈알코늄 클로라이드 (BZK)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)®로부터 공급되었고 벤조산나트륨은 에메랄드 칼라마 케미컬(Emerald Kalama Chemical)로부터 상표명 칼라가드(Kalaguard) SB 하에 공급되었다.
균주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (버지니아주 매너서스)으로부터 획득하고 -80 ℃ 동결된 글리세롤 스톡으로서 유지하였다: 에스. 아우레우스 ATCC 6538, 이. 콜라이 ATCC 8739, 피. 아에루기노사 ATCC 9027, 씨. 알비칸스 ATCC 10231, 및 에이. 브라실리엔시스 ATCC 16404. 비. 서브틸리스 BGSC 1A1276을 바실루스 제네틱 스톡 센터 (BGSC) (오하이오주 콜럼버스)로부터 구매하고 -80 ℃ 동결된 글리세롤 스톡으로서 유지하였다. pH 7.3에서의 양이온-조정된 뮐러-힌튼 브로스 (CAMHB)를 (달리 유의되지 않는 한) 박테리아 종으로의 시험에 사용하였지만, pH 7.0에서 0.165 M MOPS로 완충된 RPMI 1640 배지를 모든 진균 종으로의 시험에 사용하였다.
MIC 결정을 위해, 박테리아 균주 (에스. 아우레우스 ATCC 6538, 이. 콜라이 ATCC 8739, 피. 아에루기노사 ATCC 9027)를 37 ℃에서 트립틱 소이 아가 (TSA) 플레이트 상에서 밤새 성장시켰다. 각각의 균주의 몇몇의 콜로니를 멸균 면봉으로 수집하고 멸균 PBS 중에 맥파랜드(McFarland) 0.5 표준 용액 (대략 1x108 CFU/mL)을 만드는데 사용하였다. 맥파랜드 용액을 이어서 CAMHB에서 1:100 희석하여 접종물을 생성하였고, 50 μL의 이 접종물을 1X의 최종 농도를 위해 96-웰 플레이트에서 50 μL의 2X 시험 물품과 조합하였다. 모든 시험 조건은 이중으로 수행되었다. 박테리아-균주 MIC 96-웰 플레이트를 37 ℃에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. MIC는 가시적인 성장이 관측되지 않은 화합물의 가장 낮은 농도로서 정의된다. 결과는 표 6 및 7에 제시된다.
진균 균주의 MIC 결정을 위해, 에이. 브라실리엔시스 및 씨. 알비칸스를 사부로 덱스트로스 아가 (SDA) 플레이트 상에서 성장시켰다. 에이. 브라실리엔시스를 25 ℃에서 5 내지 7일 동안 성장시켰지만, 씨. 알비칸스를 37 ℃에서 24 내지 48시간 동안 성장시켰다.
에이. 브라실리엔시스는 성장의 7일 후 PBS로 멸균 면봉으로 SDA 플레이트로부터 수거하였다. 이 현탁액을 이어서 현탁액 중 포자를 수집하고 멸균 PBS 중에 맥파랜드 0.5 (대략 2x106 CFU/mL)로 조정하기 전에 5 내지 10분 동안 정치되도록 하였다. 이를 이어서 RPMI 배지에서 1:50 희석하여 접종물을 생성하였고, 180 μL의 접종물을 1X의 최종 농도를 위해 96-웰 플레이트에서 20 μL의 10X 시험 물품과 조합하였다.
씨. 알비칸스 콜로니를 멸균 면봉으로 수집하고 멸균 PBS 중에 맥파랜드 0.5 표준 용액 (대략 1x106 CFU/mL)을 만드는데 사용하고, 이어서 RPMI 배지에서 1:180 희석하여 접종물을 생성하였다. 90 μL의 접종물을 이어서 1X의 최종 농도를 위해 96-웰 플레이트에서 10 μL의 10X 시험 물품과 조합하였다. 모든 시험 조건은 이중으로 수행되었다.
씨. 알비칸스 MIC 96-웰 플레이트를 37 ℃에서 24 내지 48시간 동안 인큐베이션하였다. 에이. 브라실리엔시스 MIC 96-웰 플레이트를 대조군 웰에서의 성장이 관측될 때까지, 최대 7일 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 모든 96-웰 플레이트를 시각적으로 및 흡광도 OD650에서 분광광도계 상에서 검사하였다. MIC는 가시적인 성장이 관측되지 않은 시험 물품의 가장 낮은 농도로서 정의된다. 결과는 표 6 및 7A에 제시된다.
최소 살진균 농도 (MFC)를 각각의 MFC 시험 용액으로부터의 10 마이크로리터의 액체를 각각의 시험 균주에 적절한 아가 배지 상에 플레이팅함으로써 결정하였다. 액체를 생물안전 작업대에서 공기 건조되도록 하였고, 이어서 아가 플레이트를 적절한 조건 하에 인큐베이션하였다: 에이. 브라실리엔시스 및 씨. 알비칸스를 사부로 덱스트로스 아가 (SDA) 플레이트 상에서 성장시켰다. 에이. 브라실리엔시스를 25 ℃에서 5 내지 7일 동안 성장시켰지만, 씨. 알비칸스를 37 ℃에서 24 내지 48시간 동안 성장시켰다. 콜로니 형성을 이어서 평가하였다. MFC는 콜로니가 회수되지 않은 Tgase (서열식별번호: 6)의 가장 낮은 농도로서 정의된다. 결과는 표 7B에 제시된다.
표 6. 화학적 보존제의 MIC 값.
Figure pct00012
표 7A. Tgase 변이체 (서열식별번호: 6)의 MIC 값
Figure pct00013
표 7B. Tgase 변이체 (서열식별번호: 6)의 MFC 값
Figure pct00014
실시예 4. 화학적 보존제로의 Tgase의 적합성
이전에 계산된 MIC 값을 사용하여 (표 6 참조), 공통 화학적 보존제의 존재 하에 이. 콜라이의 성장에서의 퍼센트 감소를 측정하였다 (표 8). 항미생물성 조합의 마이크로플레이트 검정을 실행하여 상이한 농도에서의 Tgase의 존재가 보존제의 효능을 감소시키는 지 여부를 결정하였다.
이. 콜라이 ATCC 8739를 LB 브로스에서 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 포화 배양물의 세포 밀도를 OD600을 사용하여 계산하였고 배양물을 멸균 LB 배지에서 104 내지 106 CFU/mL로 희석하여 접종물을 생성하였고, 90 μL의 접종물을 계산된 MIC 값 초과 및 미만의 농도에서의 화학적 보존제의 존재 또는 부재 하에 0.001-0.1 중량 퍼센트의 범위에서 10 μL의 연속 희석된 Tgase 서열식별번호: 6과 조합하였다. (MIC에서의) 화학적 보존제의 단일 농도 및 Tgase 서열식별번호: 6의 정적 농도 (400 μg/mL, 0.04% w/v)는 대표적인 예로서 표 8에 제시된다. 성장 곡선을 바이오텍® 시너지 플레이트 리더 상에서 OD600에 의해 측정하였고 세포 생존율 검정 (백타이터-글로™, 프로메가®, 제조업체의 프로토콜에 따름)을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. OD600 또는 발광에서의 감소는 세포 생존율에서의 감소를 나타냈다. 결과는 비처리된 배양물에 대한 세포 계수에서의 퍼센트 감소로서 제시된다. Tgase의 추가는 보존제의 효능을 감소시키지 않았다.
표 8. 이. 콜라이 ATCC 8739의 MIC 값 및 성장 억제
Figure pct00015
*400 (μg/mL) Tgase 서열식별번호: 6의 존재 하에서
유사한 실험을 이전에 기재된 배양 조건을 사용하여 에스. 아우레우스 ATCC 6538, 피. 아에루기노사 ATCC 9027, 씨. 알비칸스 ATCC 10231, 및 에이. 브라실리엔시스 ATCC 16404에 대해 수행한다. 이들 균주를 멸균 배지에서 104 내지 106 CFU/mL로 희석하여 접종물을 생성하고, 90 μL의 접종물을 계산된 MIC 값 초과 및 미만의 농도에서의 화학적 보존제의 존재 또는 부재 하에 0.001-0.1 중량 퍼센트의 범위에서 10 μL의 연속 희석된 Tgase 서열식별번호: 6과 조합한다. 성장 곡선을 바이오텍® 시너지 플레이트 리더 상에서 OD600에 의해 측정한다. 임의적으로, 다음 날, 세포 생존율 검정 예컨대 백타이터-글로™ (프로메가®, 제조업체의 프로토콜에 따름)이 세포 생존율을 평가하는데 사용될 수 있다. OD600 또는 발광에서의 감소는 세포 생존율에서의 감소를 나타낸다. 모든 시험 조건은 효모 및 곰팡이에 대한 Tgase 효능이 박테리아 균주에 대한 보존성 효능이 또한 유지되는 동안 유지된다는 것을 입증하기 위해 삼중으로 수행된다.
실시예 5. 키토산 및 Tgase 서열식별번호: 6의 상가작용적 항미생물성 거동
이. 콜라이 ATCC 8739를 LB 브로스에서 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 포화 배양물의 세포 밀도를 OD600을 사용하여 계산하였고 배양물을 멸균 LB 배지에서 104 내지 106 CFU/mL로 희석하여 접종물을 생성하였고, 90 μL의 접종물을 키토산 (250 μg/mL 또는 0.025% w/v)의 존재 또는 부재 하에 0.044% w/v (440 μg/mL)의 농도에서 10 μL의 연속 희석된 Tgase 서열식별번호: 6과 조합하였다. 성장 곡선을 바이오텍® 시너지 플레이트 리더 상에서 OD600에 의해 16시간 동안 측정하였고, 세포 생존율 검정 (백타이터-글로™, 프로메가®, 제조업체의 프로토콜에 따름)을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. OD600 또는 발광에서의 감소는 세포 생존율에서의 감소를 나타냈다. 결과는 표 9에서 비처리된 배양물에 대한 세포 계수에서의 퍼센트 감소로서 제시된다.
표 9. 이. 콜라이 ATCC 8739의 MIC 값 및 성장 억제
Figure pct00016
실시예 6. 항미생물성 활성을 위한 효소원 및 프로테아제의 공동-제제
이. 콜라이 균주 BL21(DE3)를 뉴잉글래드 바이오랩스 (매사추세츠주 입스위치)로부터 구매하고, 관련 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 에스. 모바라엔시스 프로-Tgase 변이체 서열식별번호: 3을 생산하도록 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 10% 글리세롤, 0.75% 소이 펩톤, 0.75% 효모 추출물, 0.5% 황산마그네슘 7수화물, 및 0.15% 제1 인산칼륨을 함유하는 배지에서 30-34 ℃에서 최대 10시간 동안 진탕시킴으로써 배양하였다. 배양물을 이어서 0.1-0.4 mM 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 유도하고 20-25 ℃에서 최대 24시간 동안 교반으로 인큐베이션하였다. 배양물을 8000 x g에서 최대 60분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였고, 펠릿을 50 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris), 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), pH 8 중에 20% w/v로 재현탁시켰다.
세포를 15000- 20000 psi의 압력에서 고압 균질기를 사용하여 용해시켰다. 조 용해물을 원심분리를 통해 15000 x g에서 최대 60분 동안 정화시켰다. 프로-Tgase 서열식별번호: 3을 함유하는 정화된 용해물을 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 분광법 (A280nm)에 의해 평가하였다. 정화된 용해물을 Ni-IMAC 수지 상 친화도 칼럼에 의해 추가로 정제하고 탈염시켰다. 프로-Tgase 서열식별번호: 3 활성은 비색 히드록사메이트 활성 검정을 사용하여 측정되었고 (Folk and Cole (1965) J Biol Chemistry 240(7):2951-2960) 프로-Tgase의 활성이 거의 내지 전혀 없는 것으로 밝혀졌다.
야생형 에스. 모바라엔시스 Tgase 프로테아제, 트랜스글루타미나제 활성화 메탈로프로테아제 (TAMEP) 서열식별번호: 4 및 에스. 모바라엔시스 트리펩티딜 아미노펩티다제 (SM-TAP) 서열식별번호: 5를 코딩하는 유전자를, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies) (아이오와주 코랄빌)에 의해 합성하였다. TAMEP 및 SM-TAP를 위한 발현 구축물을 N-말단 SacB 신호 서열 및 헥사-His 태그와 함께 설계하고, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 클로닝하였다. 비. 서브틸리스 SCK6 델타-AlaR (바이오테크니컬 리소시스(BioTechnical Resources) (위스콘신주 매니토웍)로부터 구매함)를 40 mg/mL D-알라닌으로 보충된 5 mL의 LB 배지에서 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 배양물을 1.0의 OD600으로 희석하였고 크실로스를 1%의 최종 농도로 첨가하였다. 2시간 후, 250 μL의 글리세롤 및 라이게이션된 DNA를 첨가하였고 배양물 튜브를 추가적인 90분 동안 인큐베이터로 반환하였다. 인큐베이션 후, 10-1000 μL의 배양물을 LB 아가 플레이트 상으로 펼쳤다. 플레이트를 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 2-8개의 콜로니를 각각의 플레이트로부터 선택하고 3 mL의 LB 브로스로 접종하엿다. 배양물을 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였고 상청액 샘플을 주기적으로 채취하였다. SDS-PAGE을 사용하여 분자량에 의해 결정된 바와 같이 배지로의 활성 형태의 효소의 분비를 확인하였다. 활성을 관련 기술분야에 널리 공지된 프로테아제 활성 검정을 사용하여 확인하였다. 프로테아제, TAMEP 및 SM-TAP 둘 다를 8000 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 이들의 각각의 세포 배양물로부터 단리하였다. 상청액을 추가 정제 없이 단리된 것으로서 사용하였다. 임의적으로, TAMEP 및 SM-TAP는 Ni-IMAC 수지 상 친화도 칼럼에 의해 정제되고 사용 전에 탈염된다.
프로테아제 TAMEP 및 SM-TAP와 조합된 프로-Tgase 서열식별번호: 3의 항미생물성 특성은 96-웰 플레이트에서 매트릭스를 생성함으로써 평가되며 여기서 프로테아제 (0.0001-0.1% w/v, 발현 배지의 총 단백질 농도를 사용함) 및 효소원 (0.001-1% w/v)의 농도는 플레이트에 걸쳐 다양하다. 박테리아 균주 (에스. 아우레우스 ATCC 6538, 이. 콜라이 ATCC 8739, 피. 아에루기노사 ATCC 9027) 및 진균 균주, 씨. 알비칸스 ATCC 10231, 및 에이. 브라실리엔시스 ATCC 16404에 대한 MIC는 실시예 3에 기재된 프로토콜을 사용하여 결정된다. 항미생물성 특성은 성장의 가시적인 감소가 흡광도 OD650에서 분광광도계 상에서 관측된 2개의 프로테아제의 존재 하에 효소원 (프로-Tgase 변이체 서열식별번호: 3)의 가장 낮은 농도에 의해 평가된다.
실시예 7. 티로시나제의 항미생물성 특성
상업적으로 이용가능한 야생형 버섯 티로시나제 (T3824, 동결건조된 분말, ≥1000 단위/mg 고체)를 시그마-알드리치로부터 구매하였고 받은 대로 사용한다. 티로시나제의 항미생물성 특성은 실시예 3에 기재된 배양 조건 하에 에스. 아우레우스 ATCC 6538, 이. 콜라이 ATCC 8739, 피. 아에루기노사 ATCC 9027, 씨. 알비칸스 ATCC 10231, 및 에이. 브라실리엔시스 ATCC 16404를 티로시나제 (100 - 10,000 U)로 처리함으로써 평가된다. 항미생물성 특성은 흡광도 OD650에서 분광광도계 상에서 박테리아 또는 진균 균주의 가시적인 성장에서의 감소에 의해 평가된다.
실시예 8. 리실 옥시다제의 항미생물성 특성
상업적으로 이용가능한 재조합체 인간 리실 옥시다제 (LOX-608H, 1 g/L 완충 용액)를 크리에이티브 바이오마트(Creative Biomart) (뉴욕주 셜리)로부터 구매하였고 받은 대로 사용한다. 리실 옥시다제의 항미생물성 특성은 실시예 3에 기재된 배양 조건 하에 에스. 아우레우스 ATCC 6538, 이. 콜라이 ATCC 8739, 피. 아에루기노사 ATCC 9027, 씨. 알비칸스 ATCC 10231, 및 에이. 브라실리엔시스 ATCC 16404를 리실 옥시다제 (0.0001-0.1% w/v)로 처리함으로써 평가된다. 항미생물성 특성은 흡광도 OD650에서 분광광도계 상에서 박테리아 또는 진균 균주의 가시적인 성장에서의 감소에 의해 평가된다.
실시예 9. 락카제의 항미생물성 특성
상업적으로 이용가능한 야생형 아스페르길루스 종 락카제 (SAE0050, 액체 제제)를 시그마-알드리치로부터 구매하고 패키징에서 보존제를 제거하기 위해 사용 전에 투석한다. 락카제의 항미생물성 특성은 실시예 3에 기재된 배양 조건 하에 개시자 분자, 예컨대 2, 2'-아지노-비스-3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산 (ABTS) (시그마-알드리치, 10102946001) (0.0001-0.001% w/v)의 존재 및 부재 하에 에스. 아우레우스 ATCC 6538, 이. 콜라이 ATCC 8739, 피. 아에루기노사 ATCC 9027, 씨. 알비칸스 ATCC 10231, 및 에이. 브라실리엔시스 ATCC 16404를 락카제 (0.0001-0.1% w/v)로 처리함으로써 평가된다. 항미생물성 특성은 흡광도 OD650에서 분광광도계 상에서 박테리아 또는 진균 균주의 가시적인 성장에서의 감소에 의해 평가된다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> CURIE CO. INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 12527.008WO1 <140> PCT/US2021/049326 <141> 2021-09-07 <150> 63/075,763 <151> 2020-09-08 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 331 <212> PRT <213> Streptomyces mobaraensis <400> 1 Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met 1 5 10 15 Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn 20 25 30 Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg 35 40 45 Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys 50 55 60 Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu 65 70 75 80 Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn 85 90 95 Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val 100 105 110 Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala 145 150 155 160 Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn 165 170 175 Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg 180 185 190 Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg 195 200 205 Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg 210 215 220 Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile 225 230 235 240 Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr 245 250 255 Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp 260 265 270 Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met 275 280 285 His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp 290 295 300 Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn 305 310 315 320 Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro 325 330 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Asp Pro Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu 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220 Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile 225 230 235 240 Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr 245 250 255 Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp 260 265 270 Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met 275 280 285 His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp 290 295 300 Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn 305 310 315 320 Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro 325 330 <210> 3 <211> 385 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr 1 5 10 15 Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser 20 25 30 Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Pro 35 40 45 Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp 50 55 60 Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn 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275 280 285 Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp 290 295 300 Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His 305 310 315 320 Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val 325 330 335 Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp 340 345 350 Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala 355 360 365 Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro Leu Glu His His His His His 370 375 380 His 385 <210> 4 <211> 733 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Gly Gln Asp Lys Ala Ala His Pro Ala Pro Arg Gln Ser Ile His Lys 1 5 10 15 Pro Asp Pro Gly Ala Glu Pro Val Lys Leu Thr Pro Ser Gln Arg Ala 20 25 30 Glu Leu Ile Arg Asp Ala Asn Ala Thr Lys Ala Glu Thr Ala Lys Asn 35 40 45 Leu Gly Leu Gly Ala Lys Glu Lys Leu Val Val Lys Asp Val Val Lys 50 55 60 Asp Lys Asn Gly Thr Leu His Thr Arg Tyr Glu Arg Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80 Leu Pro Val Leu Gly Gly Asp Leu Val Val Asp Ala Thr Arg Ser Gly 85 90 95 Gln Val Lys Thr Ala Ala Lys Ala Thr Lys Gln Arg Ile Ala Val Ala 100 105 110 Ser Thr Thr Pro Ser Leu Ala Ala Ser Ala Ala Glu Lys Asp Ala Val 115 120 125 Lys Ala Ala Arg Ala Lys Gly Ser Lys Ala Gly Lys Ala Asp Lys Ala 130 135 140 Pro Arg Lys Val Val Trp Ala Ala Lys Gly Thr Pro Val Leu Ala Tyr 145 150 155 160 Glu Thr Val Val Gly Gly Val Gln Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gln Leu 165 170 175 His Val Ile Thr Asp Ala Lys Thr Gly Lys Lys Leu Phe Glu Phe Gln 180 185 190 Gly Val Lys Gln Gly Thr Gly Asn Ser Gln His Ser Gly Gln Val Gln 195 200 205 Ile Gly Thr Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr Gln Met Asn Asp Thr Thr 210 215 220 Arg Gly Gly His Lys Thr Tyr Asn Leu Asn His Gly Ser Ser Gly Thr 225 230 235 240 Gly Thr Leu Phe Thr Asp Ser Asp Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Asn 245 250 255 Ser Asp Pro Ala Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Gln Leu 260 265 270 Thr Trp Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Gly Arg Asn Gly Ile Arg Gly 275 280 285 Asp Gly Val Gly Ala Tyr Ser 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Claims (17)

  1. (a) 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 (b) 임의적으로 항미생물성 활성을 갖는, 효소, 펩티드, 및/또는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 구성요소와 조합하여, 및 임의적으로 추가로 (c) 적어도 1종의 화학적 보존제와 조합하여 포함하는 조성물로서, 여기서 (a)를 (b)와 조합하여, 및 임의적으로 추가로 (c)와 조합하여 포함하는 조성물은 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 및 술프히드릴 옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 트랜스글루타미나제인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
  6. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항미생물성 활성을 갖는 적어도 1종의 구성요소가 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신, 및 데펜신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 항미생물성 활성을 갖는 적어도 1종의 구성요소가 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신, 및 데펜신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 항미생물성 활성을 갖는 적어도 1종의 구성요소가 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신, 및 데펜신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  9. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 화학적 보존제가 4차 암모늄 화합물, 세제, 카오트로픽 작용제, 유기 산, 알콜, 글리콜, 알데히드, 산화제, 파라벤, 이소티아졸리논, 및 양이온성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제3항에 있어서, 적어도 1종의 화학적 보존제가 4차 암모늄 화합물, 세제, 카오트로픽 작용제, 유기 산, 알콜, 글리콜, 알데히드, 산화제, 파라벤, 이소티아졸리논, 및 양이온성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  11. 제4항에 있어서, 적어도 1종의 화학적 보존제가 4차 암모늄 화합물, 세제, 카오트로픽 작용제, 유기 산, 알콜, 글리콜, 알데히드, 산화제, 파라벤, 이소티아졸리논, 및 양이온성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, (a)가 효소원이고 (b)가 효소를 포함하며, 추가로 여기서 효소원 및 효소가 상호작용하여 보존성 및 항미생물성으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 활성을 갖는 활성 효소를 생산하는 것인 조성물.
  13. 임의적으로 효소원의 형태인, 적어도 1종의 가교결합 효소를 코딩하는 적어도 1종의 이종성 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 상기 이종성 핵산 서열은 임의적으로 적어도 1개의 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 여기서 발현 벡터는 상기 적어도 1종의 가교결합 효소를, 세포내로 또는 세포외로, 발현하도록 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환된 숙주 세포가 불활성화되거나, 억제되거나, 또는 살해되도록 할 수 있는 것인 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 트랜스글루타미나제, 리실 옥시다제, 티로시나제, 락카제, 소르타제, 포르밀글리신-생성 효소, 및 술프히드릴 옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 트랜스글루타미나제인 발현 벡터.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 발현 벡터.
  17. 제15항에 있어서, 적어도 1종의 가교결합 효소가 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 발현 벡터.
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