KR20230062994A - 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제의 스크리닝 방법 및 그 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제 - Google Patents
글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제의 스크리닝 방법 및 그 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 약물 화합물을 포함하는 화학 라이브러리로부터 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R) 및 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 알로스테릭 부위 (allosteric site)에서 활성화되는 리간드(ligand) 사이의 친화도를 단백질 기반 분석 시스템에 따라 분석하는 단계;를 포함하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 방법 및 그 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)에 관한 것이다. 이에 의하여, 이와 같은 스크리닝 방법은 단백질 기반 분석 시스템에 따른 것으로 종래 세포 기반 분석 시스템에 비해 간단하고 경제적이며 대규모 화학 라이브러리의 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제의 스크리닝 방법 및 그 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단백질 기반 분석 시스템을 이용하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제의 스크리닝 방법 및 그 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제, 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 양성 알로스테릭 조절제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
G-단백질 결합 수용체(GPCR)는 인간 게놈 내에서 가장 큰 수용체 단백질 패밀리를 구성하며, 7개의 트랜스멤브레인(transmembrane, TM) 나선을 형성하는 것이 특징이다. GPCR은 서열 상동성과 기능적 유사성에 따라 6개 그룹(Class A ~ F)으로 분류된다. 그 중 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)는 클래스 B 또는 세크레틴 수용체 패밀리에 속하며, 내인성(endogenous) 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)에 의해 활성화되고, 이는 음식 섭취에 대한 반응으로 장 상피의 L 세포에서 분비되는 30개의 아미노산 펩타이드이다. 췌장 섬 세포에서 GLP1R의 활성화는 인슐린 분비를 유도하고, 이는 차례로 혈류에서 포도당이 근육으로 흡수되도록 유도하고 섬 α-세포로부터 글루카곤 분비를 억제한다. GLP1R은 포도당 대사에서 중요한 역할을 하기 때문에 제2형 당뇨병과 비만에 대한 검증된 표적이다.
GLP-1과 엑센딘-4(Ex-4)는 39개의 아미노산으로 구성된 GLP1R의 펩타이드 작용제(peptide agonist)로서 생체 내 반감기가 각각 1~2분, 26분으로 매우 짧다. exenatide, lixisenatide, liraglutide, albiglutide, dulaglutide, semaglutide와 같은 GLP1R의 펩타이드 작용제가 개발되어 치료제로 승인된 바 있다. 이들의 치료 효과에도 불구하고 대부분의 GLP1R 펩타이드 약물은 위장 부작용을 유발하므로 비경구 투여가 필요하다. 이러한 이유로 비펩타이드 작용제(non-peptidic agonist)가 개발되었으며, 그 중 일부는 임상 시험을 진행 중이다.
본 발명은 단백질 기반 분석 시스템에 따른 것으로 종래 세포 기반 분석 시스템에 비해 간단하고 경제적이며 대규모 화학 라이브러리의 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있다. 또한, GLP1R에 대한 리간드 펩티드의 결합을 강화하거나 억제할 수 있는 양성 알로스테릭 조절제(PAM), 음성 알로스테릭 조절제(NAM), 또는 길항제를 상호작용의 강도 측정으로 용이하게 식별할 수 있는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 종래 활성을 알지 못하였던 신규한 벤제토늄과 타목시펜과 같은 상기 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 소분자 화합물인 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 유효성분으로 포함하여 종래 펩타이드 작용제의 경구투여에 따른 위장장애 문제를 해결할 수 있는 당뇨병, 비만 또는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
약물 화합물을 포함하는 화학 라이브러리로부터 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R) 및 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 알로스테릭 부위 (allosteric site)에서 활성화되는 리간드(ligand) 사이의 친화도를 단백질 기반 분석 시스템에 따라 분석하는 단계;를 포함하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 단백질 기반 분석 시스템은 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴블롯, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence-activated cell sorting), 질량분광분석, 및 단백질 마이크로어레이 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
바람직하게는, 상기 단백질 기반 분석 시스템은 ELISA 일 수 있다.
상기 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA 및 샌드위치 ELISA 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 리간드(ligand)는 엑센딘-4(exendin-4) 일 수 있다.
상기 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)와 엑센딘-4(exendin-4)의 친화도의 측정은 P9-GLP1R 융합 단백질과 엑센딘-4-GST(Ex-GST) 융합 단백질을 제조한 후, 항GST 항체를 이용하여 ELISA에 따라 측정될 수 있다.
상기 항GST 항체는 발색 표지체가 결합된 것이고, 상기 발색 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,
상기 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 제공한다.
상기 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)는 벤제토늄 또는 타목시펜 일 수 있다.
상기 벤제노튬 또는 타목시펜은 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1) 의존성의 신호 전달 경로를 증가시키는 것일 수 있다.
상기 벤제노튬 및 타목시펜 중에서 선택된 어느 하나와 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 복합체는 Gα 또는 Gαi 단백질의 α-서브유닛과의 상호작용을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,
상기 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만, 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물이 제공된다.
상기 당뇨병은 제2형 당뇨병일 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구용일 수 있다.
본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,
벤제토늄 또는 타목시펜을 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물이 제공된다.
상기 약학 조성물은 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1) 의존성의 신호 전달 경로를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 방법은 단백질 기반 분석 시스템에 따른 것으로 종래 세포 기반 분석 시스템에 비해 간단하고 경제적이며 대규모 화학 라이브러리의 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있다. 또한, GLP1R에 대한 리간드 펩티드의 결합을 강화하거나 억제할 수 있는 양성 알로스테릭 조절제(PAM), 음성 알로스테릭 조절제(NAM), 또는 길항제를 상호작용의 강도 측정으로 용이하게 식별할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 양성 알로스테릭 조절제(PAM)로서 종래 활성을 알지 못하였던 신규한 벤제토늄과 타목시펜을 발견하였으며, 이와 같은 화합물은 비표적 활성(off-target activity)을 가지므로 이를 이용한 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 추가 개발을 위한 출발 화합물로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물은 유효성분이 소분자 화합물로서 종래 펩타이드 작용제가 경구투여될 때 위장장애를 일으키는 문제를 해결할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 Ex-GST와 GLP1R 간의 상호 작용의 특이성을 입증하기 위하여 다른 형태의 융합 단백질과 비교하여 상호작용의 정도를 비교한 그래프이다.
도 2는 실시예 1에 따른 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에 따라 다양한 농도의 벤제토늄 또는 타목시펜이 존재할 때 Ex-GST와 P9-GLP1R의 결합 정도를 측정한 결과이다.
도 4는 실험예 2의 벤제토늄 또는 타목시펜 GLP1R에 작용제(agonist) 활성 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 2의 벤제토늄과 타목시펜이 GLP1R로 형질전환된 HEK293T 세포에서 cAMP의 상대적인 축적에 Ex-GST가 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 6은 실험예 2의 HEK293T/GLP1R 세포에서 GLP-1과 관련된 cAMP 축적의 효과를 측정한 결과이다.
도 7 및 도 8은 실험예 3에 따른 GLP1R과 Gα 서브유닛 사이의 상호작용을 측정한 결과이다.
도 2는 실시예 1에 따른 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에 따라 다양한 농도의 벤제토늄 또는 타목시펜이 존재할 때 Ex-GST와 P9-GLP1R의 결합 정도를 측정한 결과이다.
도 4는 실험예 2의 벤제토늄 또는 타목시펜 GLP1R에 작용제(agonist) 활성 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 2의 벤제토늄과 타목시펜이 GLP1R로 형질전환된 HEK293T 세포에서 cAMP의 상대적인 축적에 Ex-GST가 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 6은 실험예 2의 HEK293T/GLP1R 세포에서 GLP-1과 관련된 cAMP 축적의 효과를 측정한 결과이다.
도 7 및 도 8은 실험예 3에 따른 GLP1R과 Gα 서브유닛 사이의 상호작용을 측정한 결과이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다. 이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명의 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 방법에 대해 설명하도록 한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 약물 화합물을 포함하는 화학 라이브러리로부터 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R) 및 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 알로스테릭 부위 (allosteric site)에서 활성화되는 리간드(ligand) 사이의 친화도를 단백질 기반 분석 시스템에 따라 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 단백질 기반 분석 시스템은 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴블롯, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence-activated cell sorting), 질량분광분석, 단백질 마이크로어레이 등일 수 있고, 바람직하게는 ELISA 일 수 있다.
상기 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA 및 샌드위치 ELISA 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 알로스테릭 부위(allosteric site)에서 활성화되는 리간드(ligand)는 엑센딘-4(exendin-4) 일 수 있다.
상기 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)와 엑센딘-4(exendin-4)의 친화도의 측정은 P9-GLP1R 융합 단백질과 엑센딘-4-GST(Ex-GST) 융합 단백질을 제조한 후, 항GST 항체를 이용하여 ELISA에 따라 측정되는 것이 바람직하다.
상기 항GST 항체는 발색 표지체가 결합된 것이고, 상기 발색 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등 일 수 있고, 바람직하게는 HRP(horseradish peroxidase) 일 수 있다.
본 발명은 상술한 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 제공한다.
본 발명의 상기 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)는 벤제토늄(benzethonium) 또는 타목시펜(tamoxifen) 일 수 있다.
상기 벤제노튬 또는 타목시펜은 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1) 의존성의 신호 전달 경로를 증가시키는 것을 특징으로 한다.
상기 벤제노튬 및 타목시펜 중에서 선택된 어느 하나와 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 복합체는 Gα 또는 Gαi 단백질의 α-서브유닛과의 상호작용을 향상시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만, 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 당뇨병은 제2형 당뇨병일 수 있다.
제2형 당뇨병은 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 못하는 인슐린저항으로 발생하는 것으로, 인슐린 부족이 발생할 수 있고, 인슐린-비의존 당뇨병 또는 성인 당뇨병이라고도 한다. 체중 과다와 충분하지 못한 운동으로 주로 발명하는 생활 습관병으로 알려져 있다.
상기 약학 조성물은 경구용일 수 있다.
본 발명은 벤제토늄 또는 타목시펜을 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1) 의존성의 신호 전달 경로를 증가시킬 수 있다.
한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물 내에 포함되는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 실시예를 들어 구체적으로 설명하도록 한다.
[실시예]
제조예 1: P9-GLP1R 및 Ex-GST의 발현 벡터의 구축
인간 GLP1R의 cDNA는 GenScript(Piscataway, NJ, USA)로부터 입수하였다. GLP1R의 박테리아 발현 벡터의 구축을 위해, GLP1R(21-463)의 코딩 영역은 5'-프라이머(5'-AAAACCTGTATTTTCAGTCGACGGCCGGCCCGCCCCCAGGGTGCC-3') 및 3'-프라이머(5'-TGATGGTGATGGTGAGAAGCTTCGCTGCAGGAGGCCTGGCAAGTGGC-3')를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 산물을 SalI 및 HindIII로 분해하고 pP9 벡터를 위한 SalI 및 HindIII 부위에 삽입하였다. Ex-GST(exendin-4-GST) 발현 벡터의 구축을 위해 exendin-4의 코딩 서열(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)을 합성하여 pET-GST 벡터(Addgene, MA, USA)의 XbaI 및 NdeI 부위에 삽입하였다. 그 결과 GST의 N-말단에서 엑센딘-4 서열의 융합 단백질이 생성되었다. 모든 구성물의 정확한 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
제조예 2: P9-GLP1R 제조
P9-GLP1R의 박테리아 발현 벡터를 대장균 균주 BL21(DE3)에서 형질전환하고, 형질전환된 세포를 배양하였다. 간단히 살펴보면, 50㎍/㎖ 카베니실린(carbenicillin)을 함유한 LB 배지 1㎖에서 37℃에서 18시간 동안 성장시킨 세포를 YTNC(1% 효모 추출물, 2% 박토 트립톤, 2% NaCl, 50㎍/㎖ 카베니실린) 50㎖에 접종하였고, OD 600nm가 1.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포(15 ㎖)를 150 ㎖의 YTNC 배지에 연속하여 옮기고 OD 600 nm가 1.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포를 최종적으로 발효기에서 본 배양액 3L(0.3% K2HPO4, 0.5% KH2PO4, 2% yeast extract, 2% glucose, 0.06% MgSO4·7H2O, 50 ㎍/㎖ 가베니실린)에 접종하였다. 세포는 암모니아 용액(25%_28%)으로 pH를 6.8로 유지하면서 ~30% 용존 산소의 존재 하에 37℃에서 배지(27.4% yeast extract, 0.15% (NH4)2SO4, 21.1% glucose, and 0.1% MgSO4·7H2O) 에서 성장시켰다. 배양물의 OD 600nm가 60에 도달했을 때, 25℃에서 5시간 동안 1mM IPTG를 첨가하여 P9-GLP1R의 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리하여 수득하고 -80℃에서 보관하였다. P9-GLP1R의 정제를 위해, 수득된 세포 펠렛(15g)의 일부를 1 mM PMSF 및 1x protease inhibitor cocktail (GenDEPOT, Barker, TX, USA)을 포함하는 50 ㎖ 버퍼 A (20 mM HEPES, pH 7.4)에 다시 분산시켰고, microfluidizer(M-110P; Microfluidics, Newton, MA, USA)를 사용하여 세포를 용해시켰다. 12,000g로 30분간 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 100,000g로 1시간 동안 초원심분리하여 막 분획을 회수하였다. 막 분획을 완충액 B(20mM HEPES pH 7.4, 1% 사르코실)로 4℃에서 1시간 동안 가용화시켰다. 12,000g에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 분획을 제거한 후, 상청액을 Ni-NTA 아가로스 컬럼에 로딩하고 완충액 B로 미리 평형화하고 부드럽게 흔들면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 컬럼을 완충액 B로 세척하고, P9-GLP1R을 완충액 B에서 20mM 이미다졸로 용리시켰다.
제조예 3: Ex-GST의 정제
Ex-GST 발현 벡터를 포함하는 BL21(DE3) E.coli 세포를 10 ㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin)이 포함된 LB 배지 20 ㎖에서 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 배양된 세포를 10 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유한 2 L의 Terrific Broth 배지에 접종하고 OD 600nm가 0.6-0.8에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. Ex-GST의 발현은 1mM IPTG를 18℃에서 16시간 동안 첨가하여 유도하였다. 세포를 수득한 후, 세포 펠렛을 100 ㎖의 PBS(8 mM Na2HPO4·7H2O, 1.5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 재현탁시켰고, PBS는 1 mM PMSF and 1x protease inhibitor cocktail을 포함하는 것이다. 세포가 미세유동화기로 용해된 후, 용해물을 GST GraviTrap 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 로딩했다. 컬럼을 PBS로 세척한 후, Ex-GST를 20mM 환원된 글루타티온이 포함된 PBS로 용리시켰다.
실시예 1: GLP1R과 Ex-GST 간의 상호작용 측정 및 화학 라이브러리 스크리닝
P9-GLP1R과 Ex-GST의 상호작용은 화합물의 존재 또는 부재 하에서 GST에 대한 항체를 사용하여 측정하였다. 정제된 P9-GLP1R(완충액 A 중 0.25㎍/웰)을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 고-결합 96웰 플레이트(Sigma)에 고정하였다. 각 웰의 표면을 5%(w/v) 탈지유로 세척하고 차단한 후 PBS에 녹인 Ex-GST(0-600 nM)를 실온에서 1시간 동안 웰에 첨가하였다. 세척 후 플레이트를 HRP 결합된 항GST 항체(1:2000)로 1시간 동안 처리하고, Synergy H1 마이크로플레이트 리더(BioTek, USA)를 사용하여 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 반응시킨 후, 결합된 Ex-GST의 양을 측정하였다. Ex-GST에서 P9-GLP1R에 대한 겉보기 해리 상수(KD)는 PRISM 버전 8.4.1 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시되며 이중으로 수행된 4개의 독립적인 실험에서 나온 것이다. 화학 라이브러리의 스크리닝을 위해 고정된 P9-GLP1R을 30nM Ex-GST를 가하기 전에 실온에서 30분 동안 50μM 화학 물질로 전처리했다. 화학 라이브러리의 화합물을 DMSO에 용해시키고 사용 전에 PBS로 희석했다(최종 1% DMSO). 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 상기와 같이 결합된 Ex-GST의 양을 측정하였다.
한편, 제조예 2에 따라 정제된 P9-GLP1R(~7.5 mg)을 30 mg의 APG와 함께 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. P9-GLP1R 및 APG의 복합체는 Superdex200 10/300 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 추가로 정제되었다. 인간 PGE2 수용체 유형 4(EP4)의 P9-융합 단백질인 P9-EP4는 종래 방법에 따라 제조되었고, P9-GLP1R의 정제 방법으로 P9 단백질을 제조하였다.
GLP1R과 그 리간드 사이의 상호작용을 향상시키는 화합물을 스크리닝하기 위해 APG로 안정화된 P9-GLP1R에 대한 Ex-GST의 결합을 측정하는 분석 시스템이 적용되었다. Ex-GST와 GLP1R 간의 상호 작용의 특이성은 GST와 P9-GLP1R 사이, 또는 Ex-GST 와 P9-EP4 사이의 낮은 비특이적 결합에 의해 입증되었다. 여기서, P9-GLP1R에 대한 Ex-GST의 특이적 결합과 대비하여, PGE2 수용체의 융합 단백질(EP4) 및 P9 단백질을 이용하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
이에 따르면, Ex-GST는 15nM의 겉보기 KD 값으로 농도 의존적으로 P9-GLP1R에 결합하는 것으로 나타났다. 이는 APG에 의해 안정화된 P9-GLP1R이 그의 리간드와 특이적 상호작용을 할 수 있는 고유한 형태에 있음을 시사한다. 1,040개의 약물 화합물(Microsource, London, UK)로 구성된 화학 라이브러리를 분석 방법(Z-prime 값 = 0.5)에 따라 스크리닝하고, 무처리된 P9-GLP1R에 대한 수준과 비교하여 50 μM에서 Ex-GST의 P9-GLP1R에 대한 결합을 2배 이상 증가시키는 것을 먼저 선택하였다.
그 중 두 가지 화학물질 화학식 1로 표시되는 벤제토늄(benzethonium) 또는 화학식 2로 표시되는 타목시펜(tamoxifen)은 구조적 유사성을 공유하지 않는 것으로 보이지만, 두 화합물은 Ex-GST에 대한 P9-GLP1R의 결합을 무처리군에 비하여 3배 이상 향상시키는 것으로 나타났으며 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[실험예]
실험예 1: 벤제토늄 또는 타목시펜의 농도와 GLP1R와 엑센딘-4간의 상호작용 분석
벤제토늄과 타목시펜이 GLP1R과 엑센딘-4의 상호작용에 미치는 영향을 알아보기 위해 다양한 농도의 벤제토늄 또는 타목시펜이 존재할 때 Ex-GST와 P9-GLP1R의 결합을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 (a)는 벤제토늄(■) 또는 타목시펜(▲)의 다양한 농도로 P9-GLP1R와 30분 동안 미리 처리된 경우 결합된 Ex-GST의 비율(%)를 나타낸 것이고, 음성 대조군으로 플레이트에 P9-GLP1R를 결합시키지 않은 경우 벤제토늄(□) 또는 타목시펜(△)을 나타낸 것이다. 이에 따르면, 두 화합물 모두 20 μM 이상의 농도에서 P9-GLP1R에 결합된 Ex-GST의 양을 2배로 증가시켰으며, 두 화합물이 Ex-GST에 대한 GLP1R의 친화도를 향상시켰음을 나타낸다.
도 3의 (b)는 GLP1R에 대한 Ex-GST의 결합 동역학(binding kinetics)에 대한 이들 화합물의 효과를 분석한 것으로, 벤제토늄 또는 타목시펜으로 전처리된 P9-GLP1R에 대한 Ex-GST의 농도 의존적 결합을 측정한 것이다. P9-GLP1R에 대하여 PBS에서 Ex-GST의 결합커브(□) or 1% DMSO를 포함하는 PBS에서 결합커브(△), 30 μM 벤제토늄 처리된 경우(■) or 36 μM 타목시펜 처리된 경우(▲)에 대한 것이다. 이에 따르면, Ex-GST의 결합 곡선은 더 낮은 농도로 유의하게 이동하였고, KD 값은 각각 30 μM의 벤제토늄 또는 36 μM의 타목시펜 존재 하에서 무처리된 P9-GLP1R와 비교하여 25 nM에서 2 nM으로 감소하였다. 두 화합물 사이에서 벤제토늄은 Ex-GST에 대한 GLP1R의 친화도를 높이는 데 더 효과적이었다. 이러한 결과는 이들 화합물의 GLP1R에 대한 결합이 Ex-GST에 대한 고친화성 상태로 형태적 변화를 일으키는 것을 의미한다.
실험예 2: 스크리닝된 화합물에 대한 GLP1R의 GLP-1-의존적 시그널링 분석
벤제토늄 또는 타목시펜의 존재 하에 GLP1R에 대한 Ex-GST의 향상된 친화성은 두 화합물이 GLP1R의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)로 작용할 수 있음을 시사한다. 따라서 이와 같은 화합물이 양성 알로스테릭 조절제(PAM)으로 기능하는지 확인하기 위해 GLP1R의 신호 전달 경로에 대한 화합물의 영향을 조사하였다.
GLP1R-형질전환된 HEK293T 세포(HEK293T/GLP1R)의 제조 및 cAMP 분석은 아래와 같은 방법으로 수행하였다 .
HEK293T 세포는 37℃에서 5% CO2를 포함하는 대기 가습 인큐베이터에서 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM)(Gibco, NY, USA)에서 유지되었다. 세포를 Lipofectamine 3000 시약(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 야생형 인간 GLP1R을 발현하는 GLP1R(pcDNA-GLP1R)의 발현 벡터로 일시적으로 형질전환 시키고 18-20시간 동안 성장시켰다. 형질감염된 세포를 96웰 마이크로플레이트(Greiner Bio-One, Kremsmunster, Austria)에 웰당 3×104 세포의 밀도로 플레이팅하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 성장 배지를 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)(Sigma)을 함유하는 무혈청 DMEM으로 교체하고 15분 동안 인큐베이션하였다. 형질전환된 세포에서 GLP1R의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다. 벤제토늄 또는 타목시펜의 존재 하에 HEK293T/GLP1R 세포의 세포 내 cAMP 수준을 측정하기 위해, 0-30μM 또는 0-5μM의 화학 물질을 세포에 적용하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 내 cAMP 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 cAMP-Glo Assay Kit(Promega)를 사용하여 측정되었다. 발광 값은 Synergy H1(BioTek) 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정되었다. 리간드-의존적 cAMP 축적 분석을 위해 세포를 37℃에서 30분 동안 화합물과 함께 배양한 후 다양한 농도의 Ex-GST 또는 GLP-1을 10분 동안 처리하였다. cAMP 수준을 측정하였다. 벤제토늄을 PBS로 희석하고 타목시펜을 1% DMSO를 함유하는 PBS로 희석하였다. 데이터는 펩티드 리간드에 의해 매개되는 최대 cAMP 수준으로 백분율로 정규화되었으며 PRISM 8.4.2 소프트웨어를 사용하여 log(작용제(agonist)) vs. 반응-변수 기울기에 맞추었다.
한편, GLP1R의 활성화는 Gαs 경로를 통해 전달되기 때문에, GLP1R로 형질전환된 HEK293T 세포에서 cAMP의 세포 수준 증가를 측정하여 벤제토늄 또는 타목시펜의 효과를 조사하였다. cAMP 수준을 측정하기 전에 WST-1 세포 증식 분석법(Roche, Basel, Switzerland)을 사용하여 GLP1R로 형질전환된 HEK293T 세포(HEK293T/GLP1R)에서 벤제토늄 또는 타목시펜의 세포 독성을 조사하였다. 이에 따르면, 벤제토늄은 30μM까지 세포독성 활성을 나타내지 않은 반면, 타목시펜은 10μM 이상의 농도에서 세포독성 활성을 나타냈다.
따라서 HEK293T/GLP1R 세포에서 GLP-1 의존성 cAMP 축적에 대한 화합물의 효과는 각각 0-30μM 및 0-5μM 벤제토늄 및 타목시펜의 농도 범위에서 조사되었다. 먼저, 벤제토늄 또는 타목시펜이 GLP1R에 작용제(agonist) 활성을 나타내는지 여부를 실험하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이에 따르면, 벤제토늄(a)은 30μM까지, 타목시펜(b)은 5μM까지 cAMP의 세포 수준에 영향을 미치지 않았으며, 이와 같은 결과는 두 화합물이 상기 농도 내에서 작용제 활성이 부족하다는 것을 의미한다.
다음으로, 벤제토늄(a)과 타목시펜(b)이 GLP1R로 형질전환된 HEK293T 세포에서 Ex-GST 의존적 신호전달을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이에 따르면, cAMP의 Ex-GST 의존적 축적은 5 또는 15 μM 벤제토늄(a)으로 전처리된 세포에서 크게 향상되었으며 Ex-GST의 EC 50 값은 각각 4 nM에서 1 및 0.6 nM으로 감소하였다. 이에 반해, 5 μM 타목시펜(b)의 존재는 세포 cAMP의 Ex-GST 의존적 축적에 상당한 변화를 유도하지 못했다. 이에 따라 벤제토늄에 대한 실험을 추가 수행하였다.
벤제토늄이 HEK293T/GLP1R 세포에서 내인성 리간드인 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1)의 신호 전달에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. Ex-GST 의존성 신호 전달과 유사하게, GLP-1은 0.8nM의 EC 50 값으로 세포 cAMP의 축적을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 15μM 또는 30μM 벤제토늄으로 전처리된 HEK293T/GLP1R 세포는 GLP-1 매개 cAMP 축적이 향상되었다. GLP-1의 EC 50 값은 처리되지 않은 세포 0.8 nM에서 벤제토늄 처리된 세포에서 0.18 nM 또는 0.08 nM으로 감소하였다. 이와 결과는 특히 벤제토늄이 리간드에 대한 GLP1R의 친화도를 증가시켜 GLP1R의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)로 작용한다는 것을 보여준다.
벤제토늄 및 타목시펜에 의한 HEK293T/GLP1R 세포에서 GLP1R의 GLP-1 의존적 활성화는 종래 확인된 GLP1R PAM인 BETP의 활성과 구별된다. 즉, BETP는 GLP1R의 TM5 및 TM6 근처의 세포질 표면에서 결합하고 GLP-1이 없는 경우에도 작용제 활성(agonist activity)을 나타낸다. 벤제토늄 또는 타목시펜의 존재 하에서 GLP1R은 리간드에 대하여 높은 친화도를 나타내었고, 이에 반해 리간드가 없는 상태에서 작용제 활성을 보이지 않았다. 따라서 GLP1R-벤제토늄(benzethonium) 복합체의 구조는 "활성" 구조와 다른 "의사 활성화" 상태로 나타날 수 있다.
실험예 3: GLP1R과 Gα 단백질 사이의 상호작용 분석
벤제토늄에 의한 GLP1R의 리간드에 대한 친화도의 향상은 벤제토늄이 GLP1R의 구조적 변화를 촉발하여 친화도가 향상되었음을 시사한다. 따라서 GLP1R의 활성화가 Gαs 및 Gαi 단백질을 통해 형질 도입 되었기 때문에 GLP1R의 이러한 구조적 변화가 G-단백질, 특히 Gαs 및 Gαi 단백질의 알파-서브유닛과의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 실험방법은 아래와 같다.
N-말단 His6-tag를 포함하는 인간 Gαs(GI: 20147689) 또는 Gαi1(GI: 20147703) 단백질의 발현 벡터를 준비하였다. PBS 완충액에서 정제된 Gαs 1 마이크로그램을 4℃에서 16시간 동안 96웰 플레이트에 고정하였다. PBS안의 5%(w/v) 탈지유로 플레이트를 블로킹한 후, 순차적으로 희석된 P9-GLP1R 또는 P9 단백질을 플레이트에 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 결합되지 않은 단백질을 PBST(0.05% Tween-20)로 세척한 후, 항-P9 항체(1:5,000)를 이용하여 Gαs에 결합된 P9-GLP1R의 양을 측정한 후, HRP가 결합된 항-마우스 IgG를 이용하였다. 첨가제를 사용한 G 단백질 결합 분석에서, 50 μM의 GDP 또는 GTPγS를 희석된 GLP1R과 동시에 적용하여 처리하였다. Gαs 또는 Gαi1와 P9-GLP1R의 결합에 대한 벤제토늄 또는 타목시펜의 효과를 조사하기 위해, P9-GLP1R을 Gαs 또는 Gαi1 고정 플레이트에 첨가하기 전에 벤제토늄 및 타목시펜과 함께 30분 동안 인큐베이션 하였다. 결합 곡선은 PRISM 8.4.2 소프트웨어에서 하나의 부위 특이적 결합에 맞추었다.
이와 같이, GLP1R과 Gα 서브유닛 사이의 상호작용은 벤제토늄 또는 타목시펜의 존재 또는 부재 하에 정제된 P9-GLP1R 및 Gα 서브유닛을 사용하여 직접 측정되었으며, Gαs 서브유닛에 대한 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 이에 따르면, 벤제토늄은 Gα 서브유닛에 대한 P9-GLP1R의 결합 친화도를 유의하게 향상시켰다. 특히, Gαs 또는 Gαi 단백질에 대한 P9-GLP1R의 KD 값은 15μM 벤제토늄 존재 하에서 200nM에서 10nM으로 감소하였고, 반면에 타목시펜은 15μM에서 Gαs 또는 Gαi 단백질에 대한 GLP1R의 결합 친화도에 거의 영향을 미치지 않았다. 한편, 30μM 벤제토늄이 있는 경우 Gαs 단백질에 대한 P9-GLP1R의 KD 값은 3nM으로 추가로 감소하였고, Gαi 단백질에 대한 P9-GLP1R의 KD 값은 30 μM 타목시펜의 존재 하에서 200 nM에서 10 nM으로 추가로 감소하였다.
이와 같은 결과는 두 화합물 모두 30 μM에서 Gα 단백질에 대한 GLP1R의 결합을 유의하게 향상시켰다. 그러나 벤제토늄은 15μM에서 타목시펜보다 더 높은 효과를 나타내었다. 벤제토늄 또는 타목시펜에 의한 Gα 서브유닛에 대한 GLP1R의 강화된 결합은 GLP1R이 이들 화합물에 결합할 때 구조적 변화가 일어나며, 이는 Gαs or Gαi 단백질에 대한 친화도를 높인다는 것을 의미한다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
<110> Kookmin University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Method for screening positive allosteric modulator of
glucagon-like peptide-1 receptor and positive allosteric
modulator of glucagon-like peptide-1 receptor prepared by the
same
<130> HPC-10164
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLP1R 5' primer
<400> 1
aaaacctgta ttttcagtcg acggccggcc cgcccccagg gtgcc 45
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLP1R 3' primer
<400> 2
tgatggtgat ggtgagaagc ttcgctgcag gaggcctggc aagtggc 47
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> exendin-4
<400> 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
Claims (16)
- 약물 화합물을 포함하는 화학 라이브러리로부터 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R) 및 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체의 알로스테릭 부위 (allosteric site)에서 활성화되는 리간드(ligand) 사이의 친화도를 단백질 기반 분석 시스템에 따라 분석하는 단계;를 포함하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(positive allosteric modulator, PAM)의 스크리닝 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단백질 기반 분석 시스템은 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴블롯, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence-activated cell sorting), 질량분광분석, 및 단백질 마이크로어레이 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
상기 단백질 기반 분석 시스템은 ELISA인 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 스크리닝 방법. - 제3항에 있어서,
상기 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA 및 샌드위치 ELISA 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
상기 리간드(ligand)는 엑센딘-4(exendin-4)인 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 스크리닝 방법. - 제5항에 있어서,
상기 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)와 엑센딘-4(exendin-4)의 친화도의 측정은 P9-GLP1R 융합 단백질과 엑센딘-4-GST(Ex-GST) 융합 단백질을 제조한 후, 항GST 항체를 이용하여 ELISA에 따라 측정되는 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 스크리닝 방법. - 제6항에 있어서,
상기 항GST 항체는 발색 표지체가 결합된 것이고, 상기 발색 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)의 스크리닝 방법. - 제1항 내지 제7항 중에서 선택된 어느 한 항에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM).
- 제8항에 있어서,
상기 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)는 벤제토늄 또는 타목시펜인 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM). - 제9항에 있어서,
상기 벤제노튬 또는 타목시펜은 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1) 의존성의 신호 전달 경로를 증가시키는 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM). - 제9항에 있어서,
상기 벤제노튬 및 타목시펜 중에서 선택된 어느 하나와 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 복합체는 Gα 또는 Gαi 단백질의 α-서브유닛과의 상호작용을 향상시키는 것을 특징으로 하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM). - 제1항 내지 제7항 중에서 선택된 어느 한 항에 따라 스크리닝된 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 양성 알로스테릭 조절제(PAM)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만, 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 비만, 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물. - 제12항에 있어서,
상기 약학 조성물은 경구용인 것을 특징으로 하는 당뇨병, 비만, 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물. - 벤제토늄 또는 타목시펜을 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 비만 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 약학 조성물은 유사 펩타이드-1 수용체(GLP1R)의 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1) 의존성의 신호 전달 경로를 증가시키는 것을 특징으로 하는 당뇨병, 비만 또는 지방간 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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