KR20230062343A - 고심도 초고해상도 이미징을 위한 파면 측정 방식의 적응광학에 기반하는 현미경 시스템 및 그 동작방법 - Google Patents

고심도 초고해상도 이미징을 위한 파면 측정 방식의 적응광학에 기반하는 현미경 시스템 및 그 동작방법 Download PDF

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조용현
박상현
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Abstract

본 발명은 현미경 시스템 및 그 동작방법에 관한 것으로서, 일실시예에 따른 현미경 시스템은 샘플에 조사되는 제1 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제1 수신 빔을 수신하고, 제1 수신 빔과 제1 송신 빔에 기초하는 참조 빔을 이용하여 샘플에 대한 수차 보정정보를 생성하는 제1 모드로 동작하는 제1 동작부 및 샘플에 조사되는 제2 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제2 수신 빔을 수신하고, 수차 보정 맵을 공간 광 변조기에 띄움으로써 수차 보정정보 및 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정된 빔을 생성하며, 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정되지 않은 빔을 생성하고, 수차가 보정된 빔과 수차가 보정되지 않은 빔에 기초하여 샘플에서 단일분자 형광 이미지를 획득하고 이 원시 데이터를 분서하여 초고해상도 형광 이미지를 생성하는 제2 모드로 동작하는 제2 동작부를 포함한다.

Description

고심도 초고해상도 이미징을 위한 파면 측정 방식의 적응광학에 기반하는 현미경 시스템 및 그 동작방법{MICROSCOPY SYSTEM BASED ON WAVEFRONT SENSING ADAPTIVE OPTICS FOR SUPER-RESOLUTION IMAGING AND OPERATING METHOD THEREOF}
본 발명은 현미경 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고심도 초고해상도 이미징을 위해 파면 측정 방식 적응광학을 이용하여 단일분자 형광 이미지를 복원하는 기술적 사상에 관한 것이다.
현미경 시스템의 이미징 방식으로 SMLM(single-molecule localization microscopy) 방식, CASS(collective accumulation of single-scattered waves) 방식 및 CLASS(closed-loop accumulation of single scattering) 방식이 있다.
SMLM은 초고해상도 형광 현미경 기법 중 하나로서 회절한계를 넘어서는 형광 이미지를 얻을 수 있는 방법이고, CASS는 시분해 홀로그램 이미징을 통해 매질에 의한 산란 노이즈를 대폭 줄여주는 방법이며, CLASS는 생체 조직을 이미징할 때 겪는 수차를 계산 및 보정하는 방법이다.
생체 조직 깊은 곳을 이미징할 때 가장 큰 문제 중 하나는 빛의 산란이다. 생체 조직은 다양한 생체분자들이 모여 복잡한 구조를 이룬다. 따라서 생체 조직을 통과하는 빛은 쉽게 흩어져 방향을 잃고 퍼져나가며, 이러한 산란을 겪은 빛은 샘플 정보를 잃는다. 따라서 생체 조직 깊은 곳을 이미징할 때 카메라에서 측정되는 빛은 대부분 의미없는 산란 노이즈로 구성된다.
시분해 이미징 기법은 이러한 노이즈에 묻혀 있는 샘플 정보만 추출하는 기술로, 빛의 간섭을 이용하면 이러한 일이 가능하다. 즉, 두 빔의 길이 차이가 간섭 길이(coherence length) 이내일 때만 간섭이 발생하므로 짧은 간섭 길이를 갖는 광원을 사용하면 특정 시간에 카메라에 도달하는 신호만 선택적으로 획득할 수 있다.
CASS 이미징의 과정은 다음과 같다. 먼저 빔의 입사각을 바꾸어 가며 시분해 이미징 방법으로 획득한 이미지를 2차원 퓨리에 변환한다. 그러면 위상과 크기를 갖는 복소 이미지들이 얻어진다. 이 복소 이미지들의 공간 스펙트럼을 결맞은 방향으로 누적하고 역 퓨리에 변환하면 산란이 제거된 CASS 이미지를 얻을 수 있다. 이러한 이미징 방법을 CASS라고 한다. 실제로 CASS 현미경을 이용하여 평균 산란거리의 10배 정도 깊이에 있는 대상의 이미지를 회절한계 해상도로 얻은 바 있다. 또한 이 기술은 반사 신호를 이용한 방법이기 때문에 일반 형광 이미징과 달리 형광표지가 필요하지 않다는 장점도 있다.
생체 조직 깊은 곳을 이미징할 때 겪는 또 다른 어려움은 광학적 수차이다. 생체 조직의 굴곡이나 조직 내 비균질한 굴절률 분포에 의해 생체 조직을 지나는 빛의 파면이 왜곡되는데 이를 수차라고 한다. 그런데 반사 현미경에서는 입사 및 반사 이미지 정보가 서로 얽혀있어 복잡한 수차를 입사 및 반사 방향에 따라 나누어 측정하기 어렵다.
이를 해결하기 위해 CLASS 현미경에서는 각 빔의 입사 방향에 따른 복소장 공간 스펙트럼들의 위상 차이와 빛의 시간 역전 대칭 특성에 기반한 연산을 반복 수행하여 CASS 이미지의 세기가 최대가 되도록 만든다. 이를 통해 입사 및 반사의 매우 복잡한 수차를 각각 계산할 수 있다. 또한 이렇게 얻은 반사 신호의 수차를 후처리 방식으로 보정할 수 있다. 이를 통해 단일 산란 신호가 누적된 CASS 이미지의 세기가 극대화되며 이미지 분해능과 SNR(signal to noise ratio)이 향상된다. 실제로 이러한 특징을 바탕으로 곰팡이균이 감염된 토끼 각막을 각각 CLASS 현미경과 기존의 이미징 방법으로 얻은 후 비교하여 CLASS의 우수성을 입증한 바 있다.
한편, SMLM과 같은 다양한 초고해상도 형광현미경 기법들의 등장 이후 가시광선으로 회절한계를 넘어선 해상도를 갖는 형광 이미지를 얻는 것이 가능해졌다. 이에 따라 샘플 파괴가 거의 없는 가시광선으로 생체분자의 미세구조를 관찰하는 것이 가능해짐으로써 생물학 및 의학 연구에 새로운 지평이 열렸다.
하지만 공초점 현미경이나 다중광자 형광 현미경 등 생체 조직 이미징을 위한 전형적인 방법들에 비해 기존의 SMLM은 이미징 가능 깊이가 매우 얕다. 이는 근본적으로 SMLM 이미징에 이용되는 단일분자의 신호 세기가 매우 약하기 때문이다. 즉, 수차에 의해 미약한 단일분자 형광 이미지가 쉽게 흐려져 SNR이 낮아지며 모양 또한 쉽게 왜곡된다. 이 때문에 2차원 가우시안 피팅이 잘 되지 않아 위치결정(localization)이 제대로 이루어지지 않는다. 이러한 이유로 깊은 곳에서 생체 조직의 SMLM 이미지를 얻는 것은 쉽지 않다.
한국등록특허 제10-0483515호, "광학시스템내의 수차를 검출하는 방법 및 장치"
본 발명은 CASS/CLASS 방식을 SMLM 시스템에 결합함으로써, 이를 통해 수차를 보정하여 단일분자 형광 이미지를 복원하고 생체 조직 깊은 곳에서 초고해상도 형광 이미지를 얻을 수 있는 현미경 시스템 및 그 동작방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 CASS/CLASS 방식을 SMLM 시스템에 결합함으로써, 기존 방법으로는 보정이 어려웠던 복잡한 수차를 보정할 수 있는 현미경 시스템 및 그 동작방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 다중산란을 극복하여 샘플의 정보가 담긴 반사 신호만을 수집하여 수차를 계산하기 때문에 기존 기술 대비 더 깊은 곳에서 수차 계산 및 보정이 가능한 현미경 시스템 및 그 동작방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 현미경 시스템은 샘플에 조사되는 제1 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제1 수신 빔을 수신하고, 제1 수신 빔과 제1 송신 빔에 기초하는 참조 빔을 이용하여 샘플에 대한 수차 보정정보를 생성하는 제1 모드로 동작하는 제1 동작부 및 샘플에 조사되는 제2 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제2 수신 빔을 수신하고, 수차 보정정보 및 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정된 빔을 생성하며, 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정되지 않은 빔을 생성하고, 수차가 보정된 빔과 수차가 보정되지 않은 빔에 기초하여 샘플에서 발생하는 단일분자 형광 이미지를 획득하는 제2 모드로 동작하는 제2 동작부를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 현미경 시스템은 모드 전환 거울을 구비하고, 모드 전환 거울을 제어하여 제1 모드에서 제2 모드로 전환하거나, 제2 모드에서 제1 모드로 전환하는 모드 전환부를 더 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 모드 전환부는 제1 모드에서 수차 보정정보가 생성되면, 모드 전환 거울을 제어하여 제2 모드로 전환할 수 있다.
일측에 따르면, 제1 동작부는 광대역폭의 로우-코히런스 광원(low-coherence source)으로부터 생성되는 제1 송신 빔을 샘플에 조사할 수 있다.
일측에 따르면, 제1 동작부는 제1 송신 빔을 제1 경로를 통해 샘플에 조사되는 샘플 빔(sample beam)과, 제2 경로를 통해 조사되는 참조 빔(reference beam)으로 분할하는 제1 빔 스플리터와, 제1 수신 빔을 제3 경로를 통해 제1 이미지 센서로 조사하는 제2 빔 스플리터와, 제2 경로를 통해 조사된 참조 빔에 대한 시분해 이미징을 통해 참조 빔의 경로 길이를 조절하는 참조 거울 및 경로 길이가 조절된 참조 빔을 제4 경로를 통해 조사하는 제3 빔 스플리터를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 제1 동작부는 제4 경로를 통해 조사된 참조 빔에서 회절 격자를 지난 참조 빔의 회절 빔들 중 1차 회절 빔을 제1 이미지 센서로 조사하는 제4 빔 스플리터를 더 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 제1 동작부는 제1 이미지 센서를 통해 수신된 제1 수신 빔과1차 회절 빔에 기초하여 샘플에 대한 수차를 계산하고, 계산된 수차에 기초하여 수차 보정정보를 생성할 수 있다.
일측에 따르면, 제2 동작부는 들뜸 광원(excitation source)과 활성화 광원(activation source)으로부터 생성되는 제2 송신 빔을 샘플에 조사할 수 있다.
일측에 따르면, 제2 동작부는 제2 수신 빔을 제5 경로로 조사되는 제1 분할 빔과 제6 경로로 조사되는 제2 분할 빔으로 분할하는 제1 편광 분리 빔 스플리터와, 수차 보정정보에 기초하여 제1 분할 빔을 물리적으로 보정하여 수차가 보정된 빔을 생성하는 공간 광 변조기 및 수차가 보정된 빔과 수차가 보정되지 않은 빔인 제2 분할 빔을 결합하고, 결합된 빔을 제2 이미지 센서에 제공하는 제2 편광 분리 빔 스플리터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 현미경 시스템의 동작방법은 제1 동작부에서 샘플에 조사되는 제1 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제1 수신 빔을 수신하는 단계와, 제1 동작부에서 제1 수신 빔과 제1 송신 빔에 기초하는 참조 빔을 이용하여 샘플에 대한 수차 보정정보를 생성하는 단계와, 제2 동작부에서 샘플에 조사되는 제2 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제2 수신 빔을 수신하는 단계와, 제2 동작부에서 수차 보정정보 및 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정된 빔을 생성하고, 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정되지 않은 빔을 생성하는 단계 및 제2 동작부에서 수차가 보정된 빔과 수차가 보정되지 않은 빔에 기초하여 샘플에 서 발생하는 단일분자 형광 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
일실시예에 따르면, 본 발명은 CASS/CLASS 방식을 SMLM 시스템에 결합함으로써, 이를 통해 수차를 보정하여 단일분자 형광 이미지를 복원하고 생체 조직 깊은 곳에서 초고해상도 형광 이미지를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 CASS/CLASS 방식을 SMLM 시스템에 결합함으로써, 기존 방법으로는 보정이 어려웠던 복잡한 수차를 보정할 수 있다.
또한, 본 발명은 수차에 의해 쉽게 왜곡되는 미약한 단일분자 형광 이미지에 의존하지 않고 다중산란을 극복하여 샘플의 정보가 담긴 반사 신호만을 수집하여 수차를 계산한다. 따라서 단일분자 형광 이미지에 의존하여 수차를 측정하는 기존 기술 대비 더 깊은 곳에서 수차 계산 및 보정이 가능하다.
도 1은 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 설명하기 위한 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 수차가 보정된 이미지와 수차가 보정되지 않은 이미지를 획득하는 예시를 설명하기 위한 도면이다.
도 3a 내지 도 3f는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 이미징 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 4a 내지 도 4f는 일실시예에 따른 SMLM 현미경 시스템에서 수차 보정 패턴의 위치를 결정하는 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 5a 내지 도 5d는 일실시예에 따른 SMLM 현미경 시스템의 수차 보정 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 6a 내지 도 6f는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득되는 COS-7 세포 샘플의 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 7a 내지 도 7f는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득되는 쥐의 뇌 조직 내 수상돌기의 고심도 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 8a 내지 도 8g는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득되는 온전한 제브라피시의 고심도 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 9a 내지 도 9c는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득한 제브라피시의 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 10a 내지 도 10b는 Zernike 모드에 의한 수차 맵 분해 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 11은 도 6a 내지 도 6f의 세포 데이터로부터 획득한 점 퍼짐 함수의 폭, 각 점 퍼짐 함수에서의 광자 수, 위치결정 수를 설명하기 위한 도면이다.
도 12는 도 6b의 세포 데이터에 대한 최근접 이웃 분석 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 13a 및 도 13b는 세포, 뇌 조직 및 제프라피쉬에 대한 SMLM 이미지의 FRC 분석 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 14는 다수의 샘플의 대표적인 CASS 이미지와 CLASS 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 15는 다양한 샘플에 대한 배경 형광 노이즈의 히스토그램을 설명하기 위한 도면이다.
도 16은 일실시예에 따른 현미경 시스템을 통해 획득된 쥐의 뇌 조직에서의 수상돌기의 추가적인 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 17은 일실시예에 따른 현미경 시스템을 통해 획득된 제프라피쉬에 대한 추가적인 CLASS-SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 18은 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 구현예를 설명하기 위한 도면이다.
도 19는 수차가 없을 때 공간 광 변조기에 의해 변조된 이미지와 변조되지 않은 이미지의 비교 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 20은 수차 보정 맵의 표시 방향 및 각도 결정 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 21은 일실시예에 따른 CLASS 알고리즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 22는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 동작방법을 설명하기 위한 도면이다.
이하, 본 문서의 다양한 실시 예들이 첨부된 도면을 참조하여 기재된다.
실시 예 및 이에 사용된 용어들은 본 문서에 기재된 기술을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 해당 실시 예의 다양한 변경, 균등물, 및/또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
하기에서 다양한 실시 예들을 설명에 있어 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.
그리고 후술되는 용어들은 다양한 실시 예들에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
도면의 설명과 관련하여, 유사한 구성요소에 대해서는 유사한 참조 부호가 사용될 수 있다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다.
본 문서에서, "A 또는 B" 또는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나" 등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다.
"제1," "제2," "첫째," 또는 "둘째," 등의 표현들은 해당 구성요소들을, 순서 또는 중요도에 상관없이 수식할 수 있고, 한 구성요소를 다른 구성요소와 구분하기 위해 사용될 뿐 해당 구성요소들을 한정하지 않는다.
어떤(예: 제1) 구성요소가 다른(예: 제2) 구성요소에 "(기능적으로 또는 통신적으로) 연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 어떤 구성요소가 상기 다른 구성요소에 직접적으로 연결되거나, 다른 구성요소(예: 제3 구성요소)를 통하여 연결될 수 있다.
본 명세서에서, "~하도록 구성된(또는 설정된)(configured to)"은 상황에 따라, 예를 들면, 하드웨어적 또는 소프트웨어적으로 "~에 적합한," "~하는 능력을 가지는," "~하도록 변경된," "~하도록 만들어진," "~를 할 수 있는," 또는 "~하도록 설계된"과 상호 호환적으로(interchangeably) 사용될 수 있다.
어떤 상황에서는, "~하도록 구성된 장치"라는 표현은, 그 장치가 다른 장치 또는 부품들과 함께 "~할 수 있는" 것을 의미할 수 있다.
예를 들면, 문구 "A, B, 및 C를 수행하도록 구성된(또는 설정된) 프로세서"는 해당 동작을 수행하기 위한 전용 프로세서(예: 임베디드 프로세서), 또는 메모리 장치에 저장된 하나 이상의 소프트웨어 프로그램들을 실행함으로써, 해당 동작들을 수행할 수 있는 범용 프로세서(예: CPU 또는 application processor)를 의미할 수 있다.
또한, '또는' 이라는 용어는 배타적 논리합 'exclusive or' 이기보다는 포함적인 논리합 'inclusive or' 를 의미한다.
즉, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 'x가 a 또는 b를 이용한다' 라는 표현은 포함적인 자연 순열들(natural inclusive permutations) 중 어느 하나를 의미한다.
상술한 구체적인 실시예들에서, 발명에 포함되는 구성 요소는 제시된 구체적인 실시 예에 따라 단수 또는 복수로 표현되었다.
그러나, 단수 또는 복수의 표현은 설명의 편의를 위해 제시한 상황에 적합하게 선택된 것으로서, 상술한 실시 예들이 단수 또는 복수의 구성 요소에 제한되는 것은 아니며, 복수로 표현된 구성 요소라 하더라도 단수로 구성되거나, 단수로 표현된 구성 요소라 하더라도 복수로 구성될 수 있다.
한편 발명의 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였으나, 다양한 실시 예들이 내포하는 기술적 사상의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 아니되며 후술하는 청구범위뿐만 아니라 이 청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
도 1은 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 일실시예에 따른 현미경 시스템(100)은 CASS/CLASS 방식을 SMLM 시스템에 결합함으로써, 이를 통해 수차를 보정하여 단일분자 형광 이미지를 복원하고 생체 조직 깊은 곳에서 초고해상도 형광 이미지를 얻을 수 있다.
또한, 현미경 시스템(100)은 CASS/CLASS 방식을 SMLM 시스템에 결합함으로써, 기존 방법으로는 보정이 어려웠던 복잡한 수차를 보정할 수 있다.
또한, 현미경 시스템(100)은 다중산란을 극복하여 샘플의 정보가 담긴 반사 신호만을 수집하여 수차를 계산하기 때문에 기존 기술 대비 더 깊은 곳에서 수차 계산 및 보정을 수행할 수 있다.
구체적으로, 현미경 시스템(100)은 SMLM 시스템과 CLASS 현미경 시스템이 통합된 고심도 초고해상도 현미경 시스템에 관한 것으로, 기존 기술과 비교하였을 때 여러 장점을 갖는다.
기존에는 대부분 단일분자 점 퍼짐 함수의 정보를 수집하여 수차를 찾았는데, 이 경우 수차가 너무 심하면 점 퍼짐 함수의 정보를 제대로 얻을 수 없어서 수차를 찾기 어려우며, 이로 인해 낮은 차수의 Zernike 모드로 구성된 약한 수차만을 보정할 수 있었다.
그러나, CLASS-SMLM 기반의 현미경 시스템(100)은 샘플 고유의 반사 신호를 수집하여 수차를 계산하기 때문에 단일분자 점 퍼짐 함수의 왜곡 정도에 크게 영향을 받지 않고 수차 계산이 가능하다.
또한, 기존 기술은 점 퍼짐 함수의 정보를 모아 수차를 찾는데 이 과정에서 광표백이 진행된다는 문제도 있었는데, 현미경 시스템(100)은 이러한 문제로부터 자유롭다.
또한, 현미경 시스템(100)은 변형거울 대신 공간 광 변조기를 이용하여 수차를 물리적으로 보정하기 때문에 매우 많은 Zernike 모드로 구성된 복잡한 수차도 보정할 수 있다.
이를 위해, 현미경 시스템(100)은 제1 모드로 동작하는 제1 동작부(110)와, 제2 모드로 동작하는 제2 동작부(120)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제1 모드는 CLASS 방식으로 동작하는 모드를 의미하고, 제2 모드는 SMLM 방식으로 동작하는 모드를 의미할 수 있다.
일측에 따르면, 현미경 시스템(100)은 모드 전환 거울을 구비하고, 모드 전환 거울을 제어하여 제1 모드에서 제2 모드로 전환하거나, 제2 모드에서 제1 모드로 전환하는 모드 전환부를 더 포함할 수 있으며, 일례로, 모드 전환 거울은 플립 거울(Flip Mirror)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
모드 전환부는 제1 동작부(110) 및 제2 동작부(120) 사이에서 제1 동작부(110)와 제2 동작부(120)의 광 경로를 분기할 수 있으며, 대물 렌즈(OL)와 연결될 수 있다.
다시 말해, 현미경 시스템(100)은 제1 모드에 따른 이미징에 사용되는 포트와, 제2 모드에 따른 이미징에 사용되는 포트를 구비할 수 있으며, 이 두 포트는 대물 렌즈(OL) 및 모드 전환 거울을 서로 공유할 수 있다.
일실시예에 따른 제1 동작부(110)는 샘플(Sample)에 조사되는 제1 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제1 수신 빔을 수신하고, 제1 수신 빔과 제1 송신 빔에 기초하는 참조 빔을 이용하여 샘플에 대한 수차 보정정보를 생성하는 제1 모드로 동작할 수 있다.
예를 들면, 수차 보정정보는 샘플에 대한 수차 맵(Aberration Map)을 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 제1 동작부(110)는 광대역폭의 로우-코히런스 광원(Low-Coherence Source)(First Beam)으로부터 생성되는 제1 송신 빔을 샘플에 조사할 수 있으며, 이를 통해 초점 평면을 벗어난 곳에서 유입되는 반사 노이즈를 걸러내는 시분해 이미징을 구현할 수 있다.
예를 들면, 광대역폭의 로우-코히런스 광원의 파장은 제2 동작부(120)에서 사용되는 광원의 형광 파장의 중심 근처에 위치하도록 설계될 수 있으며, 바람직하게는 광대역폭의 로우-코히런스 광원은 678 nm의 파장을 갖는 Superluminal Laser Diode일 수 있다.
구체적으로, 제1 동작부(110)는 2축 갈바노미터 거울(GV), 제1 내지 제4 빔 스플리터(BS1 내지 BS4), 참조 거울(Reference Mirror), 회절격자(DG) 및 제1 이미지 센서를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제1 이미지 센서는 sCMOS 센서일 수 있다.
제1 빔 스플리터(BS1)은 제1 송신 빔을 제1 경로를 통해 샘플(Sample)에 조사되는 샘플 빔(sample beam)과 제2 경로를 통해 조사되는 참조 빔(reference beam)으로 분할할 수 있다. 여기서, 제1 경로는 제2 빔 스플리터(BS2)가 위치하는 경로를 의미하고 제2 경로는 제3 빔 스플리터(BS3)가 위치하는 경로를 의미한다.
제2 빔 스플리터(BS2)는 제1 수신 빔을 제3 경로를 통해 제1 이미지 센서로 조사할 수 있다. 여기서, 제3 경로는 제4 빔 스플리터(BS4)가 위치하는 경로를 의미한다.
다시 말해, 샘플 빔은 광시야 조명을 위해 제2 빔 스플리터(BS2), 모드 전환 거울 및 대물 렌즈(OL)를 거쳐 샘플(Sample)에 전달될 수 있으며, 이후 샘플 빔에 의한 샘플(Sample)의 제1 수신 빔은 제2 빔 스플리터(BS2) 및 제4 빔 스플리터(BS4)를 거쳐 제1 이미지 센서로 전달될 수 있다.
참조 거울(Reference Mirror)은 제2 경로를 통해 조사된 참조 빔에 대한 시분해 이미징을 통해 참조 빔의 경로 길이를 조절할 수 있다.
구체적으로, 제2 경로를 통해 조사된 참조 빔은 제3 빔 스플리터(BS3)를 통해 참조 거울(Reference Mirror)을 향하여 진행하며, 시분해 이미징을 위해 참조 거울은 이동 스테이지(translation stage)에 부착되어 참조 빔의 경로 길이를 조정하는 데 이용될 수 있다.
제3 빔 스플리터(BS3)는 참조 거울(Reference Mirror)에 의해 경로 길이가 조절된 참조 빔을 제4 경로를 통해 조사할 수 있다. 여기서, 제4 경로는 회절격자(DG)가 위치하는 경로를 의미한다.
회절격자(DG)는 제4 경로를 통해 조사된 참조 빔을 여러 갈래의 회절 빔들로 나누며, 제4 빔 스플리터(BS4)는 여러 회절 빔들 중 1차 회절 빔만을 제1 이미지 센서로 전달할 수 있다.
구체적으로, 제4 경로를 통해 조사된 참조 빔은 회절격자(DG)를 통과하여 여러 갈래로 회절될 수 있으며, 현미경 시스템(100)은 제1 이미지 센서의 평면에서 참조 빔이 비스듬하게 입사하도록 하기 위해 1차 회절 빔 이외의 빔은 조리개(iris)로 막을 수 있다.
카메라 평면에서는 샘플 빔과 제1 수신 빔과 참조 빔의 1차 회절 빔의 길이차가 간섭 길이보다 짧을 때, 간섭무늬가 형성될 수 있다.
즉, 제1 동작부(110)는 제1 이미지 센서를 통해 수신된 제1 수신 빔과 참조 빔의 1차 회절 빔에 기초하여 샘플에 대한 수차를 계산하고, 계산된 수차에 기초하여 수차 보정정보를 생성할 수 있다.
일측에 따르면, 모드 선택부는 제1 모드에서 수차 보정정보가 생성되면, 모드 전환 거울을 제어하여 제2 모드로 전환할 수 있다.
일실시예에 따른 제2 동작부(120)는 샘플(sample)에 조사되는 제2 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제2 수신 빔을 수신하고, 수차 보정정보 및 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정된 빔(AO on)을 생성하며, 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정되지 않은 빔(AO off)을 생성하고, 수차가 보정된 빔(AO on)과 수차가 보정되지 않은 빔(AO off)에 기초하여 샘플(Sample)에서 발생하는 단일분자 형광 이미지를 획득하는 제2 모드로 동작할 수 있다.
일측에 따르면, 제2 동작부(120)는 들뜸 광원(Excitation Source)(Second Beam)과 활성화 광원(activation source)(Third Beam)으로부터 생성되는 제2 송신 빔을 샘플에 조사할 수 있다.
예를 들면, 들뜸 광원은 637nm의 파장을 갖는 광원이고, 활성화 광원은 405nm의 파장을 갖는 광원일 수 있다. 이 두 광원에 의해 조사되는 제2 송신 빔은 광시야 조명을 위하여 제1 및 제2 다이크로익 거울(DM1 내지 DM2), 모드 전환 거울 및 대물 렌즈(OL)를 거쳐 샘플(Sample)에 조사될 수 있으며, 제2 동작부(120)는 조사된 제2 송신 빔에 의한 샘플(Sample)의 제2 수신 빔을 수신할 수 있다.
구체적으로, 제2 동작부(120)는 제1 및 제2 다이크로익 거울(DM1 내지 DM2), 제1 및 제2 편광 분리 빔 스플리터(PBS1 및 PBS2), 공간 광 변조기(SLM) 및 제2 이미지 센서를 포함할 수 있다. 여기서, 공간 광 변조기(SLM)는 제1 동작부(110)에서 계산한 수차를 물리적으로 보정하는 역할을 수행하며, 제2 이미지 센서는 EMCCD 센서일 수 있다.
제1 다이크로익 거울(DM1)은 제2 수신 빔을 제1 편광 분리 빔 스플리터(PBS1)로 전달할 수 있다.
제1 편광 분리 빔 스플리터(PBS1)는 제2 수신 빔을 제5 경로로 조사되는 제1 분할 빔과 제6 경로로 조사되는 제2 분할 빔으로 분할할 수 있다. 여기서, 제5 경로는 공간 광 변조기(SLM) 및 제2 편광 분리 빔 스플리터(PBS2)가 위치하는 경로를 의미하며, 제6 경로는 공간 광 변조기(SLM) 없이 제2 편광 분리 빔 스플리터(PBS2)만 위치하는 경로를 의미한다.
공간 광 변조기(SLM)는 제1 동작부(110)에 의해 계산된 수차 보정정보에 기초하여 제1 분할 빔을 물리적으로 보정하여 수차가 보정된 빔(AO on)을 생성할 수 있다.
제2 편광 분리 빔 스플리터(PBS2)는 수차가 보정된 빔(AO on)과 수차가 보정되지 않은 빔(AO off)인 제2 분할 빔을 결합하고, 결합된 빔을 제2 이미지 센서에 제공할 수 있다.
즉, 제2 동작부(120)는 수차 보정정보에 기초하는 공간 광 변조기(SLM)에 의해 수차가 보정된(AO on) 이미지와, 수차가 보정되지 않은(AO off) 이미지를 동시에 획득할 수 있으며, 이렇게 획득한 단일분자 형광 이미지들에 대한 위치결정 처리 과정에 기초하여 샘플(Sample)에 대한 초고해상도 이미지를 획득할 수 있다.
도 2a 및 도 2b는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 수차가 보정된 이미지와 수차가 보정되지 않은 이미지를 획득하는 예시를 설명하기 위한 도면이다.
도 2a 및 도 2b를 참조하면, 도면부호 210은 커버글라스에 얇은 막을 발라 인위적인 수차를 만들어낸 COS-7 세포에서 획득한 수차가 보정되지 않은 단일분자 형광 이미지를 도시하고, 도면부호 220은 커버글라스에 얇은 막을 발라 인위적인 수차를 만들어낸 COS-7 세포에서 획득한 수차가 보정된 형광 이미지를 도시한다.
또한, 도면부호 210 및 220에 삽입된 도면은 첫 번째 단일분자 형광 이미지 10000개에서 얻은 단일분자 점 퍼짐 함수의 정규화된 앙상블 평균 이미지를 도시한다(스케일 바: 5 μm).
도면부호 210 및 220에 따르면, 수차 보정이 없는 경우 점 퍼짐 함수의 모양은 심하게 왜곡되어 있고 밝기도 낮으며, 이 때문에 단일분자 신호가 배경 노이즈에 파묻혀 식별이 어려워 위치결정 과정이 정상적으로 진행되기 어려운 것을 확인할 수 있다. 반면, 수차 보정을 하면 이렇게 왜곡된 점 퍼짐 함수가 날카롭고 밝은 점 모양으로 복원이 되는 것을 확인할 수 있다.
이러한 차이는 여러 개의 단일분자 점 퍼짐 함수에 대한 정규화된 앙상블 평균 이미지를 비교하였을 때 더 명백해지며(삽입된 도면), 실제로 점 퍼짐 함수의 앙상블 평균 이미지의 폭이 수차 보정에 의해 1,425nm에서 380nm로 감소한 것을 확인할 수 있다.
380nm는 본 실험 과정에 사용된 현미경 시스템의 분해능 한계인 341nm에 가까운 값으로, 이는 수차 보정이 성공적으로 이루어졌음을 의미한다. 추가로 Strehl 비(수차를 겪은 점 퍼짐 함수와 이상적인 점 퍼짐 함수의 최대 세기의 비)는 4.3배 개선되었으며, 이러한 사실들은 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 수차 보정이 성공적이었음을 의미한다.
도 3a 내지 도 3f는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 이미징 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 3a 내지 도 3f를 참조하면, 도면부호 310 내지 340은 CLASS 모드로 이미징을 수행하는 과정을 예시하고, 도면부호 350 및 360은 SMLM 모드로 이미징을 수행하는 과정을 예시한다.
도면부호 310 내지 340에 따르면, 현미경 시스템은 우선 CLASS 이미징을 수행하는데, 이를 위해 도면부호 310의 (a) 및 (b)에 도시된 바와 같이 두 종류의 간섭 이미지를 획득할 수 있다. 간섭 이미지는 각각 각도 스캔을 하며 얻은 거울과 샘플의 이미지(Mirror Image, Sample Image)일 수 있다.
다음으로, CLASS 현미경 시스템은 도면부호 320에 도시된 바와 같이 이 두 종류의 간섭 이미지들로부터 반사 행렬 R을 계산할 수 있다.
다음으로, CLASS 현미경 시스템은 도면부호 330에 도시된 바와 같이 이 두 종류의 간섭 이미지들로부터 반사 행렬 R에 CLASS 알고리즘을 적용하여 이미지 세기가 최대가 되도록 함으로써 샘플의 수차를 계산할 수 있다.
다음으로, CLASS 현미경 시스템은 도면부호 340에 도시된 바와 같이 계산된 수차를 소프트웨어상에서 후보정할 수 있으며(도면부호 340의 (a)에서 (b)로 후보정), 이를 통해 CASS 이미지가 잘 보정되는 것을 확인할 수 있다.
도면부호 350 및 360에 따르면, CLASS-SMLM 현미경 시스템은 도면부호 340에서 보정에 성공하면 이미징 모드를 SMLM 모드로 전환할 수 있으며, SMLM 모드에서 CLASS로 계산한 수차의 반대 위상을 갖는 패턴을 공간 광 변조기에 띄우고, 이 상태에서 현미경 시스템은 도면부호 350에 도시된 바와 같이 단일분자 형광 이미지를 획득할 수 있으며, 그러면 수차가 보정되지 않은 이미지(AO off, 도면부호 350의 (a))와 수차가 보정된 이미지(AO on, 도면부호 350의 (b))를 동시에 획득할 수 있다.
다음으로, CLASS-SMLM 현미경 시스템은 도면부호 360에 도시된 바와 같이 동시에 획득한 이미지들을 위치결정 처리하여 각각의 단일분자 형광 이미지(도면부호 360의 (a) 및 (b))를 획득할 수 있다.
도 4a 내지 도 4f는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템에서 수차 보정 패턴의 위치를 결정하는 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 4a 내지 도 4f를 참조하면, 도면부호 410은 공간 광 변조기에 띄워진 회절 격자 패턴을 도시하고, 여기서는 작은 거울 조각 패턴이 중앙에 띄워져 있다.
도면부호 420은 도면부호 410에 도시된 상자의 확대 이미지를 도시하며, 여기서 도면부호 420에 도시된 원은 공간 광 변조기 평면에 초점이 맺힌 들뜸 광원의 빔을 나타낸다.
도면부호 430은 거울 조각 스캐닝을 하는 동안 기록된 이미지의 세기를 도시하고, 도면부호 440은 거울 판이 포함된 회절 격자 패턴을 도시하며, 여기서 도면부호 440에 도시된 원은 공간 광 변조기에 맺힌 형광 빔을 나타낸다.
도면부호 450은 거울 판 스캐닝을 하는 동안 기록된 이미지의 세기를 도시하고, 도면부호 460은 수차 보정 패턴이 표시되는 영역을 회색 원으로 표시한 이미지를 도시한다(스케일 바: 2.5nm(도면부호 410, 440, 460), 250μm (도면부호 420)).
구체적으로, 공간 광 변조기에 띄워지는 수차 보정 패턴의 지름, 위치 및 방향은 일련의 과정을 통하여 신중하게 결정되었다. 먼저 원형인 수차 보정 패턴의 중심 위치가 공간 광 변조기의 어느 곳에 위치해야 하는지 결정하였으며, 이를 위해 샘플 위치에 놓인 거울에 수직으로 들뜸 광원을 조명하였다. 그러면 거울에서 반사된 빛이 대물렌즈 퓨필 평면에 초점이 맺히게 되며, 이 때 퓨필 평면에 대응되는 위치에 놓인 공간 광 변조기에도 초점이 맺힐 수 있다. 즉, 공간 광 변조기에 맺힌 초점의 위치가 대물렌즈 중심 위치에 대응되며, 이러한 측정 과정은 다음과 같다.
먼저, SMLM 현미경 시스템은 공간 광 변조기에 회절격자 패턴을 띄울 수 있다(도면부호 410). 그리고 나서 이 회절격자 패턴 내의 작은 정사각형 영역의 위상값을 모두 같게 만들며, 이것은 작은 거울 조각과 같은 역할을 한다. 이 때 회절격자의 간격을 적당히 조절하여 여러 갈래의 회절광들의 간격이 충분히 떨어져서 카메라에 0차 회절 빔만 입사하도록 만든다.
다음으로, SMLM 현미경 시스템은 거울 조각을 움직이면서 적당한 영역을 훑게 하는 동안 카메라로 이미지를 획득한다(도면부호 420). 그러면 거울 조각이 공간 광 변조기에 맺힌 초점과 겹칠 때 카메라 이미지의 세기가 최대가 된다(도면부호 430).
즉, 카메라 이미지 세기가 최대일 때 거울 조각의 위치가 곧 수차 보정 패턴의 중심 위치가 된다. 이 측정에서 거울 조각의 크기는 ~100μm 정도였다. 너무 작거나 큰 거울 조각을 이용할 경우 이미지 세기 변화가 너무 작아서 정확한 위치 결정이 어렵다.
다음으로, SMLM 현미경 시스템은 공간 광 변조기에 띄워질 수차 보정 패턴의 지름을 결정할 수 있으며, 이를 위해 고농도의 형광 비드(bead)를 샘플로 사용할 수 있다. 그러면 카메라에 보이는 형광 비드 이미지가 초점이 잘 맞을 때 형광 비드에서 나온 형광 빔이 공간 광 변조기 평면에 원형으로 선명하게 맺힐 수 있다(도면부호 440).
정확한 수차 보정을 위해서는 수차 보정 패턴의 지름이 이렇게 맺힌 형광 빔의 지름과 같아야 한다. 이 지름을 측정하기 위해 거울 조각을 훑게 하는 방법이 또다시 사용되었다. 하지만 이번에는 거울 조각 대신 거울 판이 이용되었다.
보다 구체적으로, SMLM 현미경 시스템은 왼쪽부터 시작하여 회절격자를 거울 판으로 바꿀 수 있으며(도면부호 440), 이 때 거울 판은 모두 같은 값을 가지는 픽셀들로 구성된다. 그리고 이 거울 판이 왼쪽에서 오른쪽으로 뻗어나가며 점점 커지는 동안 카메라 이미지의 세기가 기록된다. 그러다 어느 순간 형광 빔이 거울 판과 겹치기 시작하면 이미지 세기가 증가하기 시작한다. 그리고 거울 판이 형광 빔을 완전히 뒤덮으면 이미지 세기가 최대가 되어 더 이상 바뀌지 않는다(도면부호 450). 형광 빔의 지름은 이미지 세기 그래프에서 세기가 증가한 구간의 길이로부터 계산해 낼 수 있다.
이상에서 설명한 측정 결과들로부터 현미경 시스템은 수차 보정 패턴이 표시될 영역을 결정할 수 있다(도면부호 460).
도 5a 내지 도 5d는 일실시예에 따른 SMLM 현미경 시스템의 수차 보정 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 5a 내지 도 5d를 참조하면, 도면부호 510은 Zernike 모드 3(도면부호 510의 (a)) 및 Zernike 모드 4(도면부호 510의 (b))에 대한 세기 vs. 모드 계수 그래프를 도시하고, 도면부호 520은 최종적으로 획득한 시스템의 수차를 도시하며, 도면부호 530은 각각 수차 보정하지 않은(AO off) 또는 수차 보정한(AO on) 200nm 지름의 형광 비드의 회절 한계 형광 이미지를 도시하고, 도면부호 540은 수차 보정하지 않은 이미지와 수차 보정한 이미지의 선 프로파일(도 540의 (a): x Profile, 도 540의 (b): y Profile)을 도시한다(스케일 바: 500 nm).
구체적으로, 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템은 SMLM 모드로 동작하는 제2 동작부가 CLASS 모드로 동작하는 제1 동작부와 분리되어 있으므로, 제2 동작부(즉, SMLM 시스템)의 시스템 수차는 CLASS로 측정이 불가하다. 그렇기 때문에 샘플 수차를 보정하기 전에 이 시스템 수차를 따로 보정하는 과정이 필요하다.
이를 위해, 시스템 수차 A를 Zernike 모드 Zn들의 선형 결합으로 쓸 수 있다는 점을 이용했다(
Figure pat00001
). 여기서 cn은 n번째 Zernike 모드 Zn의 계수이다.
공간 광 변조기는 각 Zernike 모드를 차례로 띄우고 그 계수를 바꾸어 가면 공간 광변조기를 통과하는 빛이 겪는 수차의 정도가 바뀐다. 이 때 일반적으로 수차가 최소일 때 점 퍼짐 함수의 세기가 최대이다.
이러한 성질을 이용하여 시스템 수차 A를 구성하는 각 Zernike 모드 Zn의 계수 cn을 결정할 수 있다. 상세 과정은 다음과 같다.
먼저 번째 Zernike 모드를 공간 광 변조기에 띄우고 그 계수를 바꾸어 가며 점 퍼짐 함수의 세기를 기록하였다(이 때 점 퍼짐 함수는 200 nm 지름의 형광 비드를 이미징하여 간접적으로 측정하였다.
또 첫 번째와 두 번째 Zernike 모드는 제외되었다. 이는 이들 모드가 점 퍼짐 함수의 위치만 이동시키고 모양이나 세기를 바꾸지 않기 때문에 수차 측정에 활용될 수 없기 때문이다). 따라서 맨 처음 세번째 Zernike 모드 계수에 대한 점 퍼짐 함수의 세기 그래프를 이중 가우시안 함수에 피팅하여 세기가 최대가 되도록 하는 계수 c3을 찾았다(도면부호 510의 (a)).
그리고 나서 공간 광 변조기에 c3Z3를 띄운 채로 4번째 Zernike 모드를 추가하고 그 계수를 바꾸어 가며 점 퍼짐 함수 세기를 최대로 만드는 c4를 찾았다(도면부호 510의 (b)).
같은 과정을 20번째 Zernike 모드까지 반복하여 SMLM 시스템의 시스템 수차를 찾았다(도면부호 520). 이렇게 찾은 시스템 수차를 보정하여 점 퍼짐 함수의 세기가 증가하고 x, y 방향으로 폭이 줄어드는 것을 확인했다(도면부호 530 및 540). 또한 수차 보정을 하였을 때 점 퍼짐 함수의 반치폭은 이상적인 반치폭인
Figure pat00002
보다 약간 컸다.
이는 보정 후에도 시스템 수차가 약하게 남아있음을 의미하나, 남아있는 시스템 수차가 초고해상도 이미징에 주는 영향은 미미했다. 실제로 수차 보정으로 얻은 SMLM 이미지로부터 계산한 위치결정 정밀도(localization precision)는 샘플의 미세한 구조를 보여줄 정도로 충분히 좋았다.
실시예1
도 6a 내지 도 6f는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득되는 COS-7 세포 샘플의 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 6a 내지 도 6f를 참조하면, 도면부호 610은 각각 수차 보정 없이(도면부호 610의 (a) 또는 수차 보정하여(도면부호 610의 (b)) 얻은 회절한계 형광 이미지를 도시하며, 여기서 이미지들의 세기는 수차 보정한 이미지에 대하여 정규화되어 있다.
도면부호 620은 각각 수차 보정 없이(도면부호 620의 (a)), 그리고 수차 보정하여(도면부호 620의 (b)) 얻은 SMLM 이미지로, 도면부호 620의 (a)에 삽입된 이미지는 수차 보정 패턴을 도시한다.
도면부호 630은 도면부호 621 및 623에 대한 확대 이미지를 각각 도시하고, 도면부호 640은 도면부호 622 및 624에 대한 확대 이미지를 각각 도시한다.
도면부호 650의 (a)는 도면부호 630에 도시된 흰색 상자에 대한 단면 프로파일을 도시하고, 도면부호 650의 (b)는 도면부호 621 및 623와 미세소관이 밀집한 일부 영역들에 대한 최근접 이웃 분석 결과를 도시한다.
도면후보 660의 (a)는 도면부호 640에 도시된 흰 상자에 대한 단면 프로파일을 도시하고, 도면부호 660의 (b)는 도면부호 622 및 624와 미세소관이 밀집한 최근접 이웃 분석 결과를 도시한다(스케일바: 2.5μm (도면부호 610 및 620), 500nm (도면부호 630 및 640).
구체적으로, 실시예1은 COS-7 세포의 미세소관을 이미징한 결과를 나타낸다. 실험에 사용한 세포는 100 nm 지름의 금 나노입자를 붙여둔 커버 글라스 위에서 배양되었다. 또 얇은 막을 커버 글라스와 대물렌즈 사이에 놓아 인위적인 수차를 발생시킨 상태에서 실험이 이루어졌다. 그리고 금 나노입자의 반사 이미지를 일실시예에 따른 CLASS 현미경 시스템으로 획득하고 여기에 CLASS 알고리즘을 적용하여 수차를 계산하였다.
도면부호 620의 (a)에 대한 수차의 RMS 파면 왜곡은 2.2 rad이었다. 이는 기존 기술의 한계인 1 rad 정도보다 2배 정도 더 심한 수준이다. 이 정도의 수차를 보정하려면 적어도 최초 100개의 Zernike 모드를 이용하는 것이 요구된다.
이는 기존 기술에서 최초 20개 정도의 Zernike 모드를 이용하여 수차 보정을 한 것에 비하면 이는 상당히 많은 개수이다. 이렇게 복잡한 수차를 보정할 수 있었던 요인은 먼저 CLASS 모드로 수차를 정확히 측정했기 때문이고 또한 변형거울 대신 공간 광 변조기를 사용하여 수차 보정을 했기 때문이다.
도면부호 610에 도시된 2개의 세포 미세소관의 회절한계 형광 이미지(AO off, AO on)를 비교하면, 수차 보정에 의해 이미지 세기가 증가하고 퍼져 보이던 미세소관이 날카롭게 복원되는 것을 알 수 있다.
도면부호 620에 도시된 같은 관찰 영역에 대한 SMLM 이미지를 보면 이러한 차이는 더욱 심해진다. 특히 수차 보정에 의해 위치결정 개수가 거의 10배 정도 증가함을 확인하였다.
도면부호 650에 따르면, 수차 보정이 없을 경우 미세소관 이미지가 거의 보이지 않아 반치폭을 측정하지 못했음이 확인된다. 반면 수차 보정을 했을 경우 미세소관의 이미지가 잘 형성되며 반치폭이 69 nm로 측정되었다. 미세소관 염색에 사용된 일차 및 이차 항체의 크기가 10~15 nm 정도이고 미세소관의 지름이 25 nm 정도인 것을 고려할 때 측정된 미세소관 반치폭은 신뢰할 수 있는 값이다.
한편, 도면부호 660에 따르면, 수차 보정 없이는 전혀 보이지 않던 두 줄기의 미세소관 및 그 사이의 틈이 수차 보정을 했을 때 잘 복원되는 것을 확인할 수 있다. 노란 상자 및 초록 상자 영역에서 수차 보정 여부에 따른 위치결정 정밀도는 도 5j, 5l에 나타나 있다. 수차 보정 유무에 따라 노란 상자 영역의 위치결정 정밀도는 각각
Figure pat00003
= 57nm,
Figure pat00004
= 22nm이고, 초록 상자 영역의 위치결정 정밀도는 각각
Figure pat00005
= 83nm,
Figure pat00006
= 23nm이다.
도면부호 610 내지 640에서 심한 수차로 인해 수차 보정 없이는 SMLM 이미지에 미세소관 구조가 거의 드러나지 않았음을 고려하면, 수차 보정으로 20nm 정도의 위치결정 정밀도를 회복한 것은 주목할 결과인 것으로 보인다.
실시예2
도 7a 내지 도 7f는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득되는 쥐의 뇌 조직 내 수상돌기의 고심도 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 7a 내지 도 7b를 참조하면, 도면부호 710은 약 150μm 두께의 쥐 뇌 조직 50μm 깊이에서 수차 보정 없이(AO off, 도면부호 710의 (a)), 그리고 수차 보정하여(AO on, 도면부호 710의 (b)) 얻은 수상돌기의 SMLM 이미지를 도시하고, 여기서 우상단에 삽입된 도면은 회절한계 형광 이미지, AO off 이미지의 좌하단에 삽입된 도면은 수차 보정 패턴, 컬러 바는 라디안 단위로 나타낸 위상을 나타낸다.
도면부호 720의 (a) 및 (b)는 도면부호 710에서 도시된 'b' 영역을 확대한 이미지이고, 도면부호 720의 (c) 및 (d)는 도면부호 710에 도시된 'c' 영역을 확대한 이미지로, 도면부호 720에 도시된 흰색 상자 영역의 반치폭 값이 AO on 이미지에 명시되어 있다.
도면부호 730은 점 퍼짐 함수가 방출하는 광자 수의 히스토그램(도면부호 730의 (a))과, 도면부호 710의 (a)에 대한 최근접 이웃 분석 결과(도면부호 730의 (b))를 도시하고, 도면부호 740은 약 200 μm 두께의 쥐 뇌 조직 74 μm 깊이에서 수차 보정 없이(AO off) 또는 수차 보정하여(AO on) 얻은 수상돌기의 SMLM 이미지를 도시하며, 여기서 우하단에 삽입된 도면은 회절한계 형광 이미지, AO off 이미지의 좌상단에 삽입된 도면은 수차 보정 패턴, 컬러 바는 라디안 단위로 나타낸 위상을 나타낸다.
도면부호 750의 (a)는 도면부호 740의 'a' 영역을 확대한 이미지이고, 도면부호 750의 (b)는 도면부호 740의 'b' 영역을 확대한 이미지이며, 도면부호 750의 (c)는 도면부호 740의 'c' 영역을 확대한 이미지이다. 도면부호 750의 (a) 내지 (c)에 표시된 상자 영역의 반치폭 값이 AO on 이미지에 명시되어 있다.
도면부호 760의 (a)는 각 단일분자 점 퍼짐 함수가 방출하는 광자 수의 히스토그램을 도시하고, 도면부호 760의 (b)는 도면부호 710의 (a)에 대한 최근접 이웃 분석 결과(k)를 도시한다(컬러바: 위치결정 수(도면부호 710, 720, 740 및 750) / 스케일 바: 2 μm (도면부호 710 및 도면부호 710의 삽입 도면), 500 nm (도면부호 720), 2.5 μm (도면부호 750 및 도면부호 750의 삽입 도면), 500 nm (도면부호 760)).
구체적으로, 실시예 2는 쥐 뇌 조직 내 수상돌기를 이미징한 결과를 나타낸다. 150 μm 두께의 쥐 뇌 조직 깊이 50 μm에서 조직 자체의 반사 이미지를 얻고 CLASS 알고리즘을 적용하여 이로부터 수차를 계산하고 공간 광 변조기로 보정하였다. 실험 과정에서 금 나노입자와 같은 인위적인 입자를 넣는 과정은 전혀 없었다. CLASS 알고리즘로 계산한 수차(도면부호 710의 삽입된 도면)는 1.3 rad의 RMS 파면 왜곡 정도를 보였다.
분석 결과, 단일분자 점 퍼짐 함수의 정규화된 앙상블 평균 이미지의 폭이 수차 보정에 의해 0.62배로 감소했고 Strehl 비는 2.7배 증가했다. 이러한 개선 정도는 도 5에서보다는 미약한 수준인데 이는 쥐 뇌 조직의 수차(도면부호 710의 좌하단에 삽입된 도면)가 더 약하기 때문이다.
결과적으로, 회절한계 형광 이미지에서 수차 보정 여부에 따른 차이도 도 6a 내지 도 6f에 비하면 그렇게 크지 않다(도면부호 710의 우상단에 삽입된 도면). 반면 SMLM 이미지는 수차 보정 여부에 따라 좀 더 극적인 차이를 보여준다(도면부호 710).
특히 뉴런 구조의 두꺼운 줄기는 수차 보정 없이도 어느 정도 보이는 반면 수상 돌기의 목과 머리는 수차 보정이 되었을 때만 보인다(도면부호 720). 수상 돌기 목의 반치폭은 도에 명시되어 있으며 100 nm 이하 수준이다. 또한 수차 보정에 의해 위치결정 정밀도가
Figure pat00007
= 66nm에서
Figure pat00008
= 38nm로 개선되었다(도면부호 730의 (b)). 이렇게 수차 보정 여부에 따른 차이가 회절한계 이미지에서보다 SMLM 이미지에서 더 두드러지는 것은 수차 보정에 의해 위치결정 수가 극적으로 증가하기 때문이다.
실제로 쥐 뇌 조직 이미징에서 수차 보정이 없을 때 위치결정 수는 수차 보정이 있을 때 대비 90% 수준이었다. 이는 두꺼운 생체 조직 이미징시 문제가 되는 배경 형광 때문일 수 있다. 실제로 뇌 조직 이미징의 경우 세포 이미징 때보다 배경 형광이 1.6배 더 세게 측정되었다. 이 때문에 단일분자 점 퍼짐 함수의 SNR이 낮아져 위치결정 수가 감소한다. 한편 이미지 전체 영역에서 위치결정된 점 사이의 평균 거리는 수차 보정이 없는 경우 9.7 nm이고 수차 보정이 있는 경우 3.2 nm였다. 이는 회절 한계 이미지에서는 수차 보정 없이도 어느 정도 보이던 구조가 왜 SMLM 이미지에서는 수차 보정 없이는 전혀 보이지 않는지 설명해 준다.
다음으로, 이미징 깊이가 CLASS-SMLM에 미치는 영향을 살피기 위하여 약 200μm 두께의 더 두꺼운 쥐 뇌 조직의 더 깊은 위치에서 같은 실험을 반복하였다. 이 실험 결과 얻은 74μm 깊이의 수상돌기 이미지가 도면부호 740에 도시되어 있다. 덧붙이자면 이 깊이는 현재까지 보고된 SMLM 분야에서 달성한 이미징 깊이보다 더 깊은 수준이다.
도면부호 750은 도면부호 740의 이미지에서 일부 수상돌기를 확대한 이미지로, 분석 결과 단일분자 점 퍼짐 함수의 정규화된 앙상블 평균 이미지는 수차 보정했을 때 폭이 0.54배로 줄어들었고 Strehl ratio는 3.9배 증가하였다. 또 수차 보정에 의해 위치결정 정밀도가
Figure pat00009
= 60nm에서
Figure pat00010
= 37nm로 개선되었다(도면부호 760의 (b)).
하지만 수차 보정했을 때 측정된 평균 형광 광자 수는 50 μm 깊이에서 2100개, 74μm 깊이에서 960개로 확연히 달랐다. 이는 더 깊은 곳에서 생체 조직에 의한 빛의 산란이 더 심하기 때문이다.
한편, 더 얕은 50μm 깊이에서 배경 형광 노이즈가 더 심하게 나타났다. 이는 이미징 영역 근처에 있는 매우 밝은 구조물로 인해 이미징 영역으로 형광이 유입되었기 때문일 수 있다. 그리고 이렇게 더 얕은 곳에서 배경 형광 노이즈가 더 심했기 때문에 수차 보정하였을 때 50 μm 깊이에서 얻은 위치결정 정밀도가 더 깊은 74 μm 깊이에서의 위치결정 정밀도와 비슷했던 것으로 확인 되었다.
실시예3
도 8a 내지 도 8g는 일실시예에 따른 현미경 시스템을 통해 획득되는 온전한 제브라피시의 고심도 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 8a 내지 도 8g를 참조하면, 도면부호 810의 (a)는 등을 바닥에 대고 눕힌 제브라피시 샘플을 도시하고, 도면부호 810의 (b)는 도 7b는 희소돌기신경교에 발현된 GFP의 공초점 형광 이미지를 도시하며, 도면부호 810의 (b)의 상단 영역은 제브라피시 전체 모습을 도시하고 하단 영역은 상단 영역에 표시된 상자 영역의 확대 이미지를 도시한다. 또한, 하단 영역에 표시된 상자 영역은 SMLM의 관측 영역을 나타낸다.
도면부호 820은 수정 후 3.5일 된 제브라피시를 고정 처리 후 깊이 52 μm에서 수차 보정 없이(AO off, 도면부호 820의 (a)), 그리고 수차 보정하여(AO on, 도면부호 820의 (b)) 얻은 희소돌기신경교 및 중추신경계의 회절한계 형광 이미지를 도시하고, 도면부호 830은 도면부호 820의 이미지와 같은 관측 영역에서 획득한 SMLM 이미지로, 여기서 삽입된 이미지는 수차 보정 패턴을 의미한다.
도면부호 840은 도면부호 830의 (a) 및 (b)에 도시된 'e' 영역을 확대한 이미지(도면부호 840의 (a) 및 (b))와 이에 따른 단면 프로파일(도면부호 840의 (c))을 도시하고, 도면부호 850은 도면부호 830의 (a) 및 (b)에 도시된 'g' 영역을 확대한 이미지(도면부호 850의 (a) 및 (b))와 이에 따른 단면 프로파일(도면부호 850의 (c))을 도시하며, 도면부호 860은 도면부호 830의 (a) 및 (b)에 도시된 'f' 영역을 확대한 이미지(도면부호 860의 (a) 및 (b))를 도시한다.
도면부호 870은 각 단일분자 점 퍼짐 함수가 방출하는 광자 수의 히스토그램(도면부호 870의 (a))과 도면부호 830에 대한 최근접 이웃 분석 결과(도면부호 870의 (b))를 도시 한다(스케일 바: 500μm (도면부호 810의 (b)의 상단), 100μm (도면부호 810의 (b)의 하단), 5μm (도면부호 820 및 830), 500nm (도면부호 840), 1μm (도면부호 850)).
구체적으로, 실시예 3은 제브라피시에 대한 이미징 결과를 나타낸다. 샘플로는 수정 후 3.5일 된 온전한 제브라피시가 선택되었다. 실험을 위해 제브라피시의 등이 커버 글라스에 닿도록 한 상태에서 머리와 꼬리가 UV 접착제로 커버 글라스에 붙여졌다(도면부호 810의 (a)). 그 후 제브라피시를 붙인 커버 글라스를 자석 이미징 용기에 끼우고 안에 이미징 버퍼를 넣어 SMLM 이미징을 진행했다. 제브라피시의 나이는 수정 후 3.5일 정도로 선택되었는데 이는 희소돌기신경교가 신경세포의 축삭돌기를 감싸는 단계인 초기 수초 형성 과정을 관찰하기 위함이었다. 또 초기 수초 형성 과정을 관찰하기 위하여 제브라피시의 몸통 근처 척수 신경을 선택적으로 이미징하였다(도면부호 810의 (b)).
도면부호 820는 52μm 깊이에서 제브라피시 등뼈(도면부호 810의 (b)의 y 방향)를 따라 초기 단계의 수초를 형성하는 희소돌기신경교를 이미징한 결과를 도시한다. 이 이미지들로부터 수차 보정 없이는 회절한계 형광 이미지가 더 어둡게 보이며 미세한 구조가 잘 드러나지 않는다는 것이 확인된다.
한편, 수차 보정 패턴(도면부호 830의 (a)에 삽입된 도면)은 쥐 뇌 조직의 경우보다 더 심한 것으로 나타난다. 실제로 이 수차의 RMS 파면 왜곡은 1.98 rad이었고 이는 쥐 뇌 조직 수차의 1.5-2배 수준이며, 단일분자 점 퍼짐 함수의 정규화된 앙상블 평균으로부터 계산한 Strehl 비는 3.6배 증가했다.
도면부호 830는 SMLM 이미지에서 수차 보정 없이는 보이지 않는 구조들이 수차 보정에 의해 복원되는 것이 보다 잘 드러나 있다. 특히 초기 단계 수초의 얇은 목과 발은 수차 보정 없이는 전혀 보이지 않지만 수차 보정을 할 경우 보다 잘 보였다(도면부호 840 내지 860). 또 수초 머리의 윗부분에서 위치결정된 점이 더 높은 밀도로 분포한다는 사실은 주목할 만하다(도면부호 860). 이것은 희소돌기신경교 막이 축삭돌기를 감싸는 초기 과정이 포착되었기 때문으로 추정되며, 추가로 수차 보정 없이는 보이지 않는 이중 봉우리 구조가 수차 보정을 했을 때 잘 드러났다(도면부호 840).
도면부호 870의 (a)에 따르면, 이와 같이 수차 보정 여부에 따라 발생하는 단일분자 위치결정 이미지간의 상당한 차이는 대개 위치결정 수의 차이에서 기인하는 것으로 분석된다.
실제로 이미징 영역 전체에서 수차 보정이 없을 때 위치결정 수는 수차 보정을 했을 때의 9.2% 수준에 불과했으며, 수차 보정 여부에 따른 SMLM 이미지의 차이가 위치에 따라 다르게 나타났다. 이는 수차 보정에 의한 위치결정 수 증가율이 위치마다 다르기 때문이다. 예를 들면, 수차 보정을 하지 않아 위치결정 수가 유실되는 비율은 도면부호 840 내지 860의 영역에서 각각 4.7%, 1.3% 및 5.7%였다.
한편 SMLM 이미지에서 위치결정된 점 사이의 평균 거리는 840 내지 860의 영역에서 수차 보정 없을 때 각각 21, 44, 16 nm이었고 수차 보정했을 때 각각 4.5, 5.0 및 3.8 nm였다. 이렇게 위치결정 정밀도와 위치결정된 점 사이의 평균 거리가 수차 보정에 의해 크게 개선됨으로써 최종적으로 얻은 SMLM 이미지의 질이 대폭 개선되었다고 볼 수 있다.
실시예4
도 9a 내지 도 9c는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득한 제브라피시의 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 9a 내지 도 9c를 참조하면, 도면부호 910은 수정 후 5일 된 제브라피시의 깊이 102μm에서 수차 보정 없이(AO off, 도면부호 910의 (a)), 그리고 수차 보정하여(AO off, 도면부호 910의 (b)) 획득한 척수를 감싸는 희소돌기신경교의 SMLM 이미지를 도시하고, 여기서 도면 안의 nm 단위 숫자는 화살표 머리로 표시된 관 모양 구조의 반치폭을 나타내고, 우상단 도삽은 수차 보정 패턴, 좌하단 도삽은 첫 번째 단일분자 형광 이미지 10000개에서 얻은 단일분자 점 퍼짐 함수의 정규화된 앙상블 평균 이미지를 나타낸다.
도면부호 920는 도면부호 910의 이미지에 대응되는 회절한계 형광 이미지를 도시하고, 도면부호 930은 각 단일분자 점 퍼짐 함수가 방출하는 광자 수의 히스토그램(도면부호 930의 (a))과, 도면부호 910에 대한 최근접 이웃 분석 결과(도면부호 930의 (b))를 도시한다(도면부호 910의 컬러 바: 위치결정 수 / 스케일 바: 5μm(도면부호 910), 500nm(도면부호 910의 왼쪽 하단에 삽입된 도면)).
구체적으로, 실시예4는 제브라피시에 대한 추가 이미징 결과를 나타낸다. 샘플로는 수정 후 5일 된 온전한 제브라피시가 선택되었으며, 실험 결과 102μm 깊이에서 2.64 rad의 RMS 파면 왜곡을 갖는 수차(도면부호 910의 (a)의 우상단에 삽입된 도면)가 측정되었다. 이 수차는 세포 실험에서 만든 인위적인 수차(도면부호 620의 (a)에 삽입된 도면)보다 더 심한 수준이었으며, 이렇게 심한 수차에 의하여 단일분자 점 퍼짐 함수는 척수 신경 방향으로 심하게 늘어졌다(도면부호 910의 좌하단에 삽입된 도면). 따라서 수차 보정이 없을 때 위치결정 수가 매우 적었고 이에 따라 SMLM 이미지 역시 거의 알아볼 수 없는 수준이었다(도면부호 910의 (a)).
하지만 수차 보정을 하면 단일분자 점 퍼짐 함수의 폭이 4.1배 감소하며 날카롭게 복원되었다. 이에 따라 수차 보정을 했을 때 위치결정 정밀도는
Figure pat00011
=34 nm로서 더 얕은 깊이에서 얻은 위치결정 정밀도 수준이었다. 하지만 수차 보정이 없을 때는 위치결정 수가 너무 적어서 위치결정 정밀도를 최근접 이웃 분석 방법으로 계산하는 것 자체가 불가능했다(도면부호 930). 실제로 수차 보정했을 때 위치결정 수가 보정 없을 때의 16.2배 수준이었다. 이로 인해 수차 보정했을 때 단일분자 위치결정 이미지에 반치폭 150-160 nm 정도의 관 모양 구조가 잘 드러나 있다(도면부호 910의 (b)).
한편, 수차 보정을 한 회절한계 형광 이미지(도면부호 820의 (b))와 수차 보정을 한 SMLM 이미지(도면부호 810의 (b))에서 축삭 돌기를 따라 균일하지 않은 형광 세기 분포가 관찰되었으며, 이는 수초가 덜 성숙되어 희소돌기신경교가 축삭돌기를 균일하게 감고 있지 않은 상태이기 때문이다.
하지만, 수차 보정 없는 회절한계 형광 이미지에서 축삭 돌기가 늘어진 점 퍼짐 함수 때문에 부드러운 선으로 보이는 것으로 나타났다. 이러한 이미지 왜곡에 의해 완전히 성숙하지 않은 축삭 돌기를 수초 형성 과정이 다 끝난 성숙한 축삭 돌기로 오인될 수 있으며, 이러한 결과는 CLASS-SMLM에 기반하는 일실시예에 따른 현미경 시스템이 생명과학 분야에서 더 정확한 연구 수행을 위해 중요하게 활용될 수 있음을 시사한다.
이하에서는 도 10a 내지 도 21을 통해 실시예에서 상술한 내용들에 대한 부연 설명을 하기로 한다.
도 10a 내지 도 10b는 Zernike 모드에 의한 수차 맵 분해 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 10a 내지 도 10b를 참조하면, 도면부호 1010의 (a)는 도면부호 620의 (a)에 삽입된 이미지(CLASS 이미지)에 의해 식별된 원래의 수차 맵을 도시하고, 도면부호 1010의 (b)는 최초 100개의 Zernike 모드를 사용하여 재구성된 수차 맵을 도시하며, 도면부호 1010의 (c)는 도면부호 1010의 (b)와 동일하지만 최초 1,000개의 Zernike 모드를 사용하여 재구성된 수차 맵을 도시한다.
구체적으로, 도면부호 1010의 (b)에 도시된 수차 맵은 원본 수차 맵과 매우 유사했으며 원본 수차 맵과의 상관도(correlation)는 0.80로 나타났다. 또한, 도면부호 1010의 (b)에 도시된 수차 맵은 원본 수차 맵과 거의 동일하였으며, 원본 수차 맵과의 상관도는 0.93이었다.
도면부호 1020의 (a) 및 (b)는 각각 도면부호 1010의 (b) 및 (c)에 도시된 수차 맵을 구성하는 최초 100개 및 1,000개의 Zernike 모드의 계수로, 20번이 넘는 모드들에서는 여전히 무시할 수 없는 수준이었다. 대부분의 선행 연구에서 처음 20개 정도의 Zernike 모드로 구성된 비교적 약한 수차를 보정했음을 고려할 때 이러한 점은 CLASS-SMLM 기반하는 일실시예에 따른 현미경 시스템의 세포 실험에서 수정된 수차가 얼마나 복잡한지 보여준다.
도면부호 1020의 (c)는 원본 수차 맵과 최초 n개의 Zernike 모드를 사용하여 재구성된 수차 맵 간의 상관도 cn(n = 1, 2, ..., 1000)을 도시하고, 여기서 재구성에 사용된 Zernike 모드의 총 개수 n이 증가함에 따라 상관도 cn이 증가하며, n = 20, 100, 1000에 대한 상관도 cn은 각각 c20 = 0.52, c100 = 0.80, c1000 = 0.93이었다.
도 11은 도 6a 내지 도 6f의 세포 데이터로부터 획득한 점 퍼짐 함수의 폭, 각 점 퍼짐 함수에서의 광자 수, 위치결정 수를 설명하기 위한 도면이다.
도 11을 참조하면, 도면부호 1100은 도 6b에 도시된 수차 보정이 없거나(AO off, 도면부호 620의 (a)) 수차 보정된(AO on, 도면부호 620의 (b)) SMLM 이미지에 대한 다양한 통계 데이터를 도시한다. 구체적으로 도면부호 1100의 (a) 내지 (c)는 도 6b에 도시된 도면부호 621 및 623의 영역에 대한 통계 데이터를 도시하고, 도면부호 1100의 (d) 내지 (f)는 도 6b에 도시된 도면부호 622 및 624의 영역에 대한 통계 데이터를 도시한다.
보다 구체적으로, 도면부호 1100의 (a) 및 (d)는 ThunderSTORM 알고리즘에 의해 식별된 점 퍼짐 함수의 반치폭에 대한 확률 분포를 도시한다. 이 때 수차 보정이 없는 경우 두 경우 모두에서 점 퍼짐 함수의 반치폭이 1μm를 넘는 범위까지 분포하는 반면, 반면 수차 보정한 경우 점 퍼짐 함수의 반치폭 분포는 훨씬 좁았으며, 이는 위치결정 과정이 잘 이루어졌음을 의미한다.
도면부호 1100의 (b) 및 (e)는 수차 보정이 없거나(AO off) 수차 보정된(AO on) 광자 수의 히스토그램을 도시하며, 여기서 광자수는 희소 영역(도면부호 621 및 623)에서는 5.7Х102 개에서 1.1Х103 개(~2.0배 증가)로 증가했고, 밀집 영역(도면부호 622 및 624)에서는 6.8Х102 개에서 1.7Х103 개(~2.5배 증가)로 증가했다.
도면부호 1100의 (c) 및 (f)는 총 위치결정 수에 대한 막대 그래프를 도시하며, 수차 보정한 경우 위치 결정 수가 눈에 띄게 증가했다. 구체적으로, 위치결정 수는 희소 영역(도면부호 1100의 (c))에서는 7.9Х102 개에서 1.4Х104 개(~18배 증가)로 증가하고 밀집 영역(도면부호 1100의 (f))에서는 5.9Х102 개에서 8.6Х104 개(~15배 증가)로 증가했다.
도 12는 도 6b의 세포 데이터에 대한 최근접 이웃 분석 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 12를 참조하면, 도면부호 1200은 선택된 영역에서 수차 보정이 없는(AO off)(도면부호 1200의 (a)), 그리고 수차 보정된(AO on)(도면부호 1200의 (b)) 경우 최근접 이웃 분석에 의해 얻은 확률 밀도 곡선을 도시한다. 구체적으로, 도면부호 1200의 (a) 및 (b)에서 상단 도면은 이미지 시야에서 단일 미세소관의 희소 영역(도면부호 621 및 623)에 대한 데이터를 도시하고, 도면부호 1200의 (a) 및 (b)에서 하단 도면은 이미지 시야에서 단일 미세소관의 밀집 영역(도면부호 622 및 624)에 대한 데이터를 도시한다.
도면부호 1200에 따르면, 이미지는 수차를 보정을 하는 경우(도면부호 1200의 (b)) 개별 단일 분자를 기술하는 비가우스 곡선이 희소 영역 및 밀집 영역 모두에서 확률 밀도 곡선에 지배적으로 기여했으며, 이는 수차 보정이 세포 미세소관의 밀도에 관계없이 잘 작동했음을 의미한다.
그러나, 수차 보정이 없는 경우(도면부호 1200의 (a))에는 다른 경향이 관찰되었다. 구체적으로, 밀집 영역에서 인접해 있는 단일 분자들이 있을 때 야기되는 가우스 곡선은 수차 보정이 없을 때 상당한 기여를 했다.
수차 보정 없는(AO off) 원시 데이터와 수차 보정된(AO on) 원시 데이터를 비교하면 수차 보정이 없는 경우 인접 분자 간의 점 퍼짐 함수의 중첩이 발생했음을 분명히 관찰할 수 있었다. 이는 대부분의 미세소관 구조가 밀집된 영역에서 수차 보정 없이는 잘 식별되지 않는 이유를 설명할 수 있다.
희소 영역에서는 수차 보정된 경우와 같이 비가우시안 곡선이 우세했으며, 이는 희소한 단일 미세소관의 대략적인 형태가 수차 보정 없이도 보이는 이유를 설명한다. 그러나 확률 밀도 곡선의 폭은 수차 보정한 경우(22nm)보다 수차 보정 없는 경우(57nm)가 훨씬 더 넓으며, 결과적으로 수차 보정을 하지 않으면 위치 결정 정밀도가 더 나빠지는 것을 확인할 수 있다.
도 13a 및 도 13b는 세포, 뇌 조직 및 제프라피쉬에 대한 SMLM 이미지의 FRC(Fourier Ring Correlation) 분석 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 13a 및 도 13b를 참조하면, 도면부호 1310의 (a) 내지 (d) 각각은 도면부호 620, 도면부호 710의 (a), 도면부호 740 및 도면부호 830에 도시된 이미지에 대한 로컬 FRC 해상도 향상 결과를 도시하며, 여기서 FRC 해상도는 FRC 값이 1/7인 주파수의 역수로 계산되고, 눈에 띄는 구조체가 없는 영역은 비정상적으로 큰 해상도를 만들어내므로 계산에서 제외되었다.
도면부호 1320의 (a), (b) 및 (c)는 각각 도면부호 1310의 (a), (b) 및 (d) 각각에 표시된 상자 영역에 대한 FRC 스펙트럼을 도시하고, 도면부호 1320의 (d)는 수차 보정이 없거나(AO off) 수차 보정된(AO on) 이미지에 대한 FRC 해상도를 비교하는 상자 플롯을 도시하며, 도면부호 1320의 (e)는 도면부호 1310의 (a), (b), (c) 및 (d) 각각에 대한 102개의 하위 영역의 FRC 해상도의 향상 결과를 도시한다.
구체적으로, 도면부호 730의 (b), 도면부호 760의 (b) 및 도면부호 870의 (b)에 도시된 최근접 이웃 분석 곡선은 수차 보정한 경우 위치결정 정밀도가 약 2배 나빠졌지만 수차 보정 유무에 따라 다소 약한 차이를 보여주었다. 반대로 FRC 곡선은 수차 보정한 경우 스펙트럼이 명백히 확장되었으며, 이는 FRC 분석이 위치결정 정밀도뿐만 아니라 위치결정 수의 기여도까지 포함하기 때문이다.
도면부호 1320의 (d)는 수차 보정이 없거나(AO off) 수차 보정된(AO on) 이미지의 FRC 해상도의 비교 결과를 도시하며, 여기서 이상치(outlier)는 십자가로 표시된다.
구체적으로, 수차 보정한 경우 FRC 분해능은 거의 모든 경우에 100nm 미만이었고 수차 보정하지 않은 경우 FRC 분해능은 100nm에 가깝거나 그 이상이었다. 이것은 100nm보다 작은 구조가 수차 보정한 경우에만 보였던 실험 결과와 일치한다. 개선 사항은 모든 영역에서 대체로 유사했으며, 이는 수차가 모든 영역에서 비교적 균일하게 보정되었음을 시사한다.
도 14는 다수의 샘플의 대표적인 CASS 이미지와 CLASS 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 14를 참조하면, 참조부호 1400의 (a) 내지 (f)는 도 7a 내지 도 9c에 대응되는 CASS 이미지 및 CLASS 이미지를 도시하며, 각 샘플에서 수차 보정하지 않은 이미지(AO off)와 수차 보정한 이미지(AO on)는 수차 보정한 이미지에 대해 정규화 되었다.
참조부호 1400의 (g) 및 (h)는 또 다른 샘플의 수차 보정하지 않은 반사 이미지(AO off) 및 수차 보정한 반사 이미지(AO on)를 도시한다. 여기서 수차 보정하지 않은 이미지는 CASS 이미지에 해당하고 수차 보정한 이미지는 CLASS로 보정한 CASS 이미지에 해당한다.
구체적으로, 도면부호 1400에 따르면, CLASS를 통한 소프트웨어 기반 수차 보정은 CASS 이미지의 이미지 세기와 SNR을 향상시켰다. 그러나 수차 보정의 효과는 SMLM 이미지만큼 두드러지지 않았으며, 이는 SMLM이 매우 약한 단일 분자 신호에 의존하기 때문에 반사 이미징보다 수차에 훨씬 민감하기 때문이다. 대부분의 경우 반사 이미지에서 식별 가능한 수 있는 구조가 거의 나타나지 않아도 조직 수차가 잘 식별되었다.
예를 들면, 일부 반사 이미지는 도면부호 1400의 (a), (c), (e) 및 (f)에서 반점 노이즈(speckle noise)처럼 보였다. 하지만 동일한 영역을 반복적으로 촬영하였을 때 동일한 반사 이미지를 얻었다. 이는 이미지가 비록 노이즈처럼 보이지만 실제 샘플 구조에서 유래했음을 의미한다.
일부 다른 경우에는 반사 이미지가 분명히 식별 가능한 구조를 나타냈다. 예를 들면, 도면부호 1400의 (b), (g)에서 관찰된 어둡고 둥근 구조 중 일부는 LED 투과 조명으로 이미징하였을 때 지면에 수직인 방향으로 뻗어 있는 혈관인 것으로 확인되었다. 때로는 밝은 가지 모양의 선이 관찰되었는데(도면부호 1400의 (b), (d), (g), (h)), 이는 반사율이 높은 축색돌기(axons)를 나타낸다.
도 15는 다양한 샘플에 대한 배경 형광 노이즈의 히스토그램을 설명하기 위한 도면이다.
도 15를 참조하면, 도면부호 1500의 (a) 내지 (d)는 세포(도 6), 뇌 조직(도 7) 및 온전한 제브라피쉬(도 7 및 도 8)에 대한 ThunderSTORM 분석을 통해 획득된 단일분자의 점 퍼짐 함수 당 배경 형광 노이즈를 도시하며, 여기서 다른 샘플과의 비교를 돕기 위해 세포 데이터는 도면부호 1500에 도시된 도면들에 모두 표시되어 있다.
전반적으로 배경 노이즈는 세포보다 뇌 조직과 온전한 제브라피쉬에서 더 높았으며, 조직이나 온전한 동물을 이미징할 때 배경 형광 노이즈는 일반적으로 이미징 깊이가 증가함에 따라 증가하는 것으로 나타났다(도면부호 1500의 (c) 및 (d)).
위치결정 정밀도 및 위치결정 수는 일반적으로 더 깊은 곳에서 나빠지지만, 항상 이러한 결과가 나타나는 것은 아니다. 일례로, 밝은 구조가 이미징 평면 근처에 존재할 때 배경 노이즈는 상대적으로 더 얕은 깊이에서 더 강할 수 있으며, 실제로 쥐의 뇌 조직을 이미징할 때 이러한 경우가 관찰되었다. 74μm 깊이의 쥐의 뇌 조각 이미지의 배경 노이즈는 다른 뇌 조직 조각의 50μm 깊이보다 약했으며(도면부호 1500의 (a) 및 (b)), 그 결과 수집된 광자 수가 74μm 깊이보다 더 적었을 때에도 두 가지 다른 깊이에서의 이미지 품질은 유사하였다.
도 16은 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득된 쥐의 뇌 조직에서의 수상돌기의 추가적인 SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 16을 참조하면, 도면부호 1600의 (a)는 수차 보정이 없거나(AO off) 수차 보정된(AO on) 약 200μm 두께의 쥐의 뇌 조직에 대한 51μm 깊이의 수상돌기에 대한 SMLM 이미지를 도시하고, 여기서 왼쪽 상단에 삽입된 이미지는 수차 보정 맵을 나타낸다.
도면부호 1600의 (b)는 도면부호 1600의 (a)의 SMLM 이미지의 회절 한계 형광 이미지를 도시하고, 도면부호 1600의 (c)는 도면부호 1600의 (a)에서 실선 화살표로 표시된 영역을 확대한 이미지를 도시하며, 여기서 nm 단위 숫자는 화살표 또는 흰색 직사각형 상자로 표시된 수상 돌기 목의 반치폭 을 나타낸다.
도면부호 1600의 (d)는 광자 수의 히스토그램(왼쪽) 및 최근접 이웃 분석 결과(오른쪽)를 도시한다.
도 17은 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템을 통해 획득된 제프라피쉬에 대한 추가적인 CLASS-SMLM 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 17을 참조하면, 도면부호 1700의 (a)는 100 μm 깊이에서 척수를 감싸는 제프라피쉬의 희돌기교세포막에 대한 수차 보정 없는(AO off) 혹은 수차 보정된(AO on) SMLM 이미지를 도시하고, 여기서 왼쪽 하단에 삽입된 이미지는 수차 보정 맵을 나타낸다.
도면부호 1700의 (b)는 도면부호 1700의 (a)에서의 SMLM 이미지의 회절 한계 형광 이미지를 도시하고, 도면부호 1700의 (c)는 도면부호 1700의 (a)에서 실선 화살표로 표시된 영역을 확대한 이미지를 도시하며, 여기서 nm 단위 숫자는 흰색 직사각형 상자에 대응되는 영역의 반치폭을 나타낸다.
도면부호 1700의 (d)는 광자 수의 히스토그램(왼쪽) 및 최근접 이웃 분석 결과(오른쪽)를 도시한다.
도 18은 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 구현예를 설명하기 위한 도면이다.
도 18을 참조하면, PBS1 및 PBS2는 편광 빔 스플리터, BS1 내지 BS6는 빔 스플리터, FM1 및 FM2는 모드 전환 거울, OL1 및 OL2는 대물 렌즈, TL는 튜브 렌즈, GV는 2축 갈바노미터 거울, DM1 내지 DM3는 다이크로익 거울, EF1 내지 EF2는 방출 필터, 이름이 표기 되지 않은 회색 직사각형은 거울, fLf (Lf = 100, 125, ...)는 초점 거리 Lf mm인 렌즈를 나타낸다.
일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템(1800)은 하나의 포트는 CLASS 이미징에 사용되고, 다른 포트는 SMLM 이미징에 사용되며, 두 모드는 샘플, 대물렌즈(OL1) 및 튜브 렌즈(TL)를 공유할 수 있다.
또한 현미경에 내장된 모드 전환 거울(FM2)를 사용하여 모드 전환이 가능하며, 모든 렌즈 쌍은 이미지를 전달하거나 빔 크기를 조정하는 데 사용될 수 있다.
구체적으로, CLASS 설정에서는 superluminal laser diode를 광원으로 사용하고, CLASS 빔 경로는 분홍색으로 표시된다. 이 광원의 짧은 간섭 길이(~40 μm)로 인해 간섭계에서 시분해 이미징이 가능하다.
CLASS 광원의 파장은 678 nm로 SMLM 이미징에 사용된 Alexa Fluor 647의 형광 파장의 중심 근처에 있으며, 678 nm 레이저 빔은 2축 갈바노미터 거울(GV)을 통과할 수 있다.
그 다음 빔은 BS1에서 두 개의 빔으로 분할되며, 그 중 하나는 광시야 조명을 위해 BS2, FM1, FM2, TL 및 OL1을 통해 샘플에 전달될 수 있고 이를 샘플 빔(sample beam, SB)이라 명명한다.
샘플 빔은 OL1, TL, FM2 및 FM1을 지나 동일한 경로를 되돌아갈 수 있다. 이후 BS2와 BS4를 거쳐 sCMOS 카메라 쪽으로 이동할 수 있다.
한편, BS1에서 샘플 빔과 다른 방향으로 나뉘는 빔은 BS3를 통해 참조 거울(reference mirror)을 향하여 진행하며, 이를 참조 빔(reference beam, RB)이라 명명한다. 시분해 이미징을 위해 참조 거울은 이동 스테이지(translation stage)에 부착되어 참조 빔의 경로 길이를 조정하는 데 이용될 수 있다.
참조 거울에서 반사된 후 참조 빔은 동일한 경로를 되돌아가서 BS3에서 반사되어 회절 격자를 향해 이동하고, 회절 격자를 통과 후 RB가 여러 갈래로 회절되며, 그 중 카메라 평면에서 RB이 비스듬하게 입사하도록 하기 위해 1차 회절 빔 이외의 빔은 조리개(iris)로 막는다.
이어서 1차 참조 빔은 BS4에서 반사되어 sCMOS 카메라에 닿는다. 또한 카메라 평면에서 샘플 빔과 참조 빔의 길이 차가 간섭 길이보다 짧을 때 간섭무늬가 형성된다.
한편, CLASS 현미경은 공초점 반사 이미징과 간섭계 반사 이미징이 모두 가능하도록 설계되었다. 공초점 반사 이미징 모드로의 전환은 FM1을 눕히고 BS5를 올리고 sCMOS 카메라를 OL2 앞으로 이동함으로써 가능하다. 이를 위해 sCMOS 카메라를 탈부착이 가능한 자석 베이스에 부착하여 위치를 자유롭게 변경할 수 있도록 하였다.
공초점 이미징 모드에서 BS1에서 분할된 참조 빔은 점 조명을 위해 BS3, FM2, TL 및 OL1을 통해 샘플을 향해 이동하고, 샘플에서 반사된 후 참조 빔은 동일한 경로를 다시 되돌아가서 GV, BS5 및 OL2를 통해 sCMOS 카메라를 향해 이동할 수 있다.
SMLM 이미징 모드에서 파장 405nm, 488nm 및 637nm의 광원 빔은 BS6 및 DM1에 의해 결합된다. 이 빔은 광시야 조명을 위하여 DM2, DM3, FM2, TL 및 OL1를 거쳐 샘플에 닿는다.
샘플에서 나온 형광 빔은 OL1, TL, FM2 및 DM3을 통과하고, 그런 다음 PBS1에서 두 개의 빔으로 나뉜다. 이들 중 수평 편광을 가진 빔은 공간 광 변조기에서 반사되고 수차 보정을 위해 위상 변조된다. 한편 다른 빔은 공간 광 변조기를 거치지 않고 EMCCD로 이동한다.
두 빔은 PBS2에 의해 결합되어 EMCCD 카메라를 향해 이동하며 카메라의 서로 다른 영역에 동시에 도달한다. 이는 수차 보정 없는 이미지와 수차 보정한 이미지의 실시간 비교를 가능하게 한다. 한편 505 nm 파장의 LED 빔은 저배율 투과 이미징에 사용되어 실험 진행 시 이미징 위치를 결정하는데 활용되었다. 후면 조명 LED 빔은 샘플을 통과하고 OL1, TL, FM2, DM3 및 DM2를 통해 CCD 카메라로 이동한다.
도 19는 수차가 없을 때 공간 광 변조기에 의해 변조된 이미지와 변조되지 않은 이미지의 비교 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 19를 참조하면, 도면부호 1900는 5개의 서로 다른 200nm 지름 형광 비드의 SMLM 이미지에 대한 측면 위치결정 정밀도(도면부호 1900의 (a)) 및 광자 수(도면부호 1900의 (b))의 막대 그래프를 도시하며, 각 비드에 대해 2,000개의 프레임이 획득되었다.
구체적으로, 형광 빔은 두 갈래로 나뉘며, 수차 보정하지 않은 이미지와 수차 보정한 이미지의 정확한 비교를 위해서는 두 이미지 모두 유사한 위치 정확도와 광자 수를 가져야 하며, 이를 확인하기 위해 5개의 서로 다른 200nm 지름의 형광 비드 이미지를 수차 보정 유무에 따라 각각 2,000프레임씩 획득했다.
이 과정에서는 인위적인 수차를 만들기 위한 얇은 막이 사용되지 않았으며, 따라서 공간 광 변조기의 모든 픽셀을 동일한 위상 값으로 설정하여 공간 광 변조기를 거울처럼 사용했다. 매 측정마다 공간 광 변조기를 거치지 않은 비변조 이미지("No SLM") 및 공간 광 변조기를 거친 변조 이미지("Through SLM")가 동시에 기록되었기 때문에 ThunderSTORM 분석은 5개의 비드에 대해 총 10개의 SMLM 이미지를 만들어냈으며, 그 중 절반은 변조되지 않은 이미지였고 나머지는 변조된 이미지였다.
분석 결과, 비변조 및 변조 이미지 모두 거의 동일한 위치결정 정밀도(σx 및 σy) 및 광자 수를 산출하였으며, 이는 비변조 및 변조 이미지 비교를 통해 수차 보정 유무에 따른 이미지 변화를 살펴보는 것에 문제가 없음을 의미한다.
도 20은 수차 보정 맵의 표시 방향 및 각도 결정 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 20을 참조하면, 도면부호 2000의 (a) 내지 (d)는 공간 광 변조기에 표시된 수차 보정 맵의 8가지 방향 및 각도에 대한 200nm 지름 비드의 회절 한계 형광 이미지를 도시하고, 여기서 도면부호 2000의 (a) 내지 (d) 각각은 공간 광 변조기에 각
Figure pat00012
(
Figure pat00013
= 0°, 90°, 180°, 270°)만큼 반시계 방향으로 회전시킨 수차 보정 맵을 표시하여 보정하였으며, 각 경우에 대해 수차 보정 맵이 뒤집히지 않았거나(상단 행) 왼쪽에서 오른쪽으로 뒤집힌 상태(하단 행)로 표시되었다.
구체적으로, 공간 광 변조기에 표시되는 수차 보정 맵의 방향과 각도는 간단한 테스트에 의해 결정 되었으며, 수차 보정 맵은 공간 광 변조기에 표시될 때 0°, 90°, 180°, 및 270°만큼 반시계 방향으로 회전될 수 있고, 수평으로 뒤집을 수 있으므로, 경우의 수는 총 8개이다. 이 때 수직 뒤집기는 180° 반시계 방향 회전 및 수평 뒤집기와 동일하기 때문에 중복이 발생함에 유의해야 한다.
그런 다음, 8가지 수차 보정 맵을 표시하면서 수차 보정을 시도하면 올바른 조합을 찾을 수 있다. 본 발명에서는 반전 없이 270° 반시계 방향으로 회전시킨 수차 맵을 공간 광 변조기에 띄웠을 때 수차 보정이 작동함을 확인하였다.
도 21은 일실시예에 따른 CLASS 알고리즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 21을 참조하면, 도면부호 2100의 (a)는 해상도 타겟에 대한 원시 간섭 이미지를 도시하고, 도면부호 2100의 (b)는 간섭 이미지의 푸리에 변환 결과를 도시하며, 도면부호 2100의 (c)는 도면부호 2100의 (b)에 표시된 '원'에 대한 스펙트럼 성분을 도시한다.
도면부호 2100의 (d)는 도면부호 2100의 (c)에 도시된 스펙트럼 성분에 대한 역 푸리에 변환의 진폭을 도시하고, 도면부호 2100의 (e)는 산란 매질에 의해 발생한 다중 산란으로 인해 완전히 덮인 pupil을 도시하며, 도면부호 2100의 (f)는 거울과 샘플의 벡터화된 푸리에 변환된 이미지를 n번째 열로 갖는 행렬 P 및 T를 도시한다.
도면부호 2100의 (g)는 반사행렬 R을 도시하고, 도면부호 2100의 (h)는 CASS 이미지를 도시하며, 도면부호 2100의 (i)는 CLASS 반복 계산 중 이미지 세기가 향상되는 정도를 선 그래프로 도시하고, 도면부호 2100의 (j)는 CLASS에 의해 계산된 수차 맵을 도시하고, 도면부호 2100의 (k)는 수차 보정된 CASS 이미지를 도시한다.
구체적으로, CLASS 현미경은 간섭계 이미지를 사용하여 반사파의 위상과 진폭을 측정한다. CLASS에 대한 설명은 간섭을 수학적으로 표현하는 것에서 시작된다.
이를 위해
Figure pat00014
및
Figure pat00015
을 카메라 평면의 위치
Figure pat00016
에서 각각 샘플빔(SB)과 참조빔(RB)의 전기장이라 정의할 수 있으며, 여기서
Figure pat00017
와
Figure pat00018
은 복소수이고
Figure pat00019
은 각 갈바노미터 거울의 스캐닝 위치에 대한 조명 각도별로 정의되는 파동의 진행 벡터를 의미할 수 있다.
위상 항
Figure pat00020
는 공간 주파수
Figure pat00021
를 갖는 회절 격자에 의해 생긴 회절 빔 중 1차 회절 빔이 RB으로 선택되기 때문에 도입된다. 또한 2축 갈바노미터 거울을 이용하여 각도 스캔 이미징을 하는 동안 RB은 SB와 동기하여(synchronizely) 동시에 회전하므로 RB은
Figure pat00022
로 쓸 수 있다.
카메라 평면에서 SB와 RB의 광로 길이 차이가 광원의 간섭 길이보다 짧으면 간섭이 발생하며, 카메라는 전기장이 아닌 빛의 세기를 감지하기 때문에 SB와 RB로 구성된 카메라 이미지(도 20a)는 전기장 합의 절대값 제곱으로 표현될 수 있다. 즉, 하기 수식1과 같이 표현될 수 있다.
[수식1]
Figure pat00023
간섭 항
Figure pat00024
를 추출하기 위해 간섭 이미지의 2차원 푸리에 변환을 수행하고(도면부호 2100의 (b)), 중심 위치가 벡터
Figure pat00025
인 붉은색 원으로 표시된 스펙트럼 구성 요소
Figure pat00026
를 선택하여 크롭(crop)할 수 있다.
이후, 크롭된 구성 요소는 원점이
Figure pat00027
인 새 좌표계로 보내지고(도면부호 2100의 (c)), 이것은
Figure pat00028
가 새로운 좌표에서 0이 된다는 것을 의미한다.
이 새로운 좌표계에서 선택한 스펙트럼 구성 요소는
Figure pat00029
로 기록될 수 있다(도면부호 2100의 (d)).
다음으로, 측정된 전기장
Figure pat00030
에서
Figure pat00031
를 얻을 수 있으며, 이 때
Figure pat00032
항을 제거하기 위해
Figure pat00033
에 대한 정확한 정보를 얻는 과정이 필요하다.
이 과정은 거울과 샘플의 이미지를 획득할 때 사용되었던 입사각
Figure pat00034
으로 산란 매질을 이미징하여 수행되며, 산란 매질에 의해 다중 산란된 빛은 푸리에 공간에서 pupil을 완전히 덮을 수 있다(도면부호 2100의 (e)). 이 pupil은 입사각
Figure pat00035
이 변화함에 따라 회전하므로 pupil의 중심 위치로부터
Figure pat00036
을 구할 수 있다.
다음으로,
Figure pat00037
를 곱하여 도면부호 2100의 (c)의 측정된 스펙트럼
Figure pat00038
에서 복소항
Figure pat00039
을 제거할 수 있다.
다음으로, 거울 및 관찰하려는 샘플의 이미지를 여러 입사각
Figure pat00040
에 대해 획득한다. 그리고 이 이미지들로부터 두 개의 행렬 P과 T을 구성할 수 있다(도면부호 2100의 (f)). n번째 입사각에 대한 푸리에 변환된 거울 이미지는 벡터화되어 행렬 P의 n번째 열이 되고, 유사하게, n번째 입사각에 대한 푸리에 변환된 샘플 이미지는 벡터화되어 행렬 T의 n번째 열을 구성할 수 있다.
다음으로, 하기 수식2로부터 반사 행렬
Figure pat00041
을 획득할 수 있다.
[수식2]
Figure pat00042
여기서, P-1은 P의 의사 역행렬, 식
Figure pat00043
는 R의 행에서 입사각
Figure pat00044
에 해당하고 열은 출력 각도
Figure pat00045
에 해당함을 의미 한다(도면부호 2100의 (g)).
간단히 말해서,
Figure pat00046
의 j번째 열은 j번째 조명 각도
Figure pat00047
에 대한 벡터화된 푸리에 변환된 샘플 이미지이고,
Figure pat00048
는 각 조명 각도
Figure pat00049
에 대해 가능한 모든 푸리에 변환된 샘플 이미지를 보여주며, 여기서 j=1, 2, ..., N이고 N는 총 이미지 개수와 같다.
CLASS의 마지막 단계는 샘플 유도 수차를 계산하기 위해
Figure pat00050
를 처리하는 것으로, 이를 위해 R의 각 열은
Figure pat00051
만큼 이동된 뒤 모두 더해진다. 이 결맞은 합은 샘플 정보를 보존하는 단일 산란 신호와 다중 산란 잡음을 모두 증가시킨다. 하지만 이미지가 결맞게 더해짐에 따라 단일 산란 신호는 다중 산란 신호보다 입사각의 총 개수 N배만큼 빠르게 증가할 수 있다.
이 결맞은 합의 역 푸리에 변환은 단일 산란 신호가 크게 강화된 이미지를 제공하고(도면부호 2100의 (g)), 이것은 단일 산란파의 집합적 축적(collective accumulation of single-scattered waves, CASS)이라고 하는 과정을 의미한다.
그러나 CASS 이미지는 여전히 흐릿하게 보이며(도면부호 2100의 (h)), 이는 수차로 알려진 각도에 의존하는 위상 지연에 인해 축적된 단일 산란 신호가 왜곡되었기 때문이다 (이 예에서 샘플은 잘 알려진 디포커스 수차를 도입하기 위해 의도적으로 초점이 나간 채로 이미지를 얻었다.).
수차를 보정하기 위해
Figure pat00052
의 각 열에 0에서 2ð 범위의 단일 위상 값을 곱하고, 그런 다음 곱해진 위상 값을 조정하여 CASS 이미지의 전체 세기를 최대화할 수 있다.
모든 열에 대해 이 과정을 반복하면 이미지의 총 세기가 점차 증가하며, 출력 빔 경로의 수차를 보정하기 위해
Figure pat00053
의 행에 유사한 과정이 수행될 수 있다. 이와 같은 과정을 충분히 반복하면 이미지 세기 향상이 포화된다(도면부호 2100의 (i)). 이는 단일 산란의 폐쇄 고리 축적(closed-loop accumulation of single scattering, CLASS) 알고리즘이라는 과정으로 정의될 수 있다.
상술한 과정을 통해
Figure pat00054
의 각 에 적용된 위상 배열을 정사각형 형태로 재구성하여 수차 맵을 얻을 수 있으며(도면부호 2100의 (j)), 마지막으로 이 수차를 보정하면 수차 수정된 CASS 이미지가 생성될 수 있다(도면부호 2100의 (k)).
도 22는 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 동작방법을 설명하기 위한 도면이다.
다시 말해, 도 22는 도 1 내지 도 21을 통해 설명한 일실시예에 따른 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 동작예를 설명하는 도면으로, 이하에서 도 22를 통해 설명하는 내용 중 도 1 내지 도 21을 통해 설명한 내용과 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
도 22를 참조하면, 2210 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제1 동작부에서, 샘플에 조사되는 제1 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제1 수신 빔을 수신할 수 있다.
다음으로, 2220 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제1 동작부에서, 제1 수신 빔과 제1 송신 빔에 기초하는 참조 빔을 이용하여 샘플에 대한 수차 보정정보를 생성할 수 있다.
다음으로, 2230 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제2 동작부에서, 샘플에 조사되는 제2 송신 빔에 대응하여 샘플에 대한 제2 수신 빔을 수신할 수 있다.
구체적으로, 2230 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제2 동작부에서, 공간 광 변조기에 수차 보정 맵을 띄운 채로 샘플에 제2 송신 빔을 조사하여 샘플로부터 발생하는 제2 수신 빔을 수신할 수 있다.
다음으로, 2240 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제2 동작부에서, 수차 보정정보 및 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정된 빔을 생성하고, 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정되지 않은 빔을 생성할 수 있다.
구체적으로, 2240 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제2 동작부에서, 샘플로부터 발생한 단일분자 형광 이미지를 획득할 수 있다. 이 때 수차가 보정되지 않은 빔과 수차가 보정된 빔을 동시에 획득할 수 있다.
다음으로, 2250 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제2 동작부에서, 수차가 보정된 빔과 수차가 보정되지 않은 빔에 기초하여 샘플에 서 발생하는 단일분자 형광 이미지를 획득할 수 있다.
구체적으로, 2250 단계에서 일실시예에 따른 동작방법은 제2 동작부에서, 획득된 원시 데이터를 ThunderSTORM 알고리즘으로 분석하여 초고해상도 형광 이미지를 생성할 수 있다.
이상으로, 도 1 내지 도 22를 통해 설명한 본 발명의 특징을 정리하면, 본 발명은 생체조직 및 훼손 없이 온전한 동물 샘플과 같이 수차가 존재하는 표본을 조사하기 위해 'CLASS-SMLM'이라는 적응광학이 적용된 단일분자 위치결정 현미경 방식(adaptive optics SMLM, AO-SMLM)을 도입하였다. CLASS 현미경은 생체조직의 고유 반사 신호를 기반으로 조직 수차를 결정하기 위해 형광 표지가 없는 파면 감지 적응광학 방법으로 사용되었으며, 초고해상도 형광 이미지를 재구성하기 위해 SMLM 시스템의 형광 경로에서 공간 광 변조기에 수차 보정 맵을 적용하였다.
본 발명은 이전에 제시된 형광 기반 AO-SMLM 방법과 비교하여 RMS 파면 왜곡 측면에서 수정 가능한 수차의 정도를 두 배 이상 증가시키며, 고유한 선형 최적화 알고리즘과 공간 광 변조기로 수차를 물리적으로 보정하기 때문에 복잡한 수차 보정에 특히 적합하다.
실제로, CLASS-SMLM을 이용하여 조직 수차로 인해 손실된 형광 점 퍼짐 함수를 복원하고 위치결정 수를 최대 77배까지 늘리는 데 성공하였고, 생체 조직 샘플에 CLASS-SMLM을 적용하여 최대 102μm 깊이에서 위치결정 정밀도를 38nm 내지 83nm에서 22nm 내지 39 nm로 향상시켰다.
이러한 결과들로 미루어 볼 때 CLASS-SMLM은 기존에 보정이 불가능했던 수준의 수차를 보정하여 우수한 SMLM 이미지 품질을 달성하며, 이것은 쥐 뇌 조직이나 제브라피쉬 배아와 같은 온전한 동물에 대한 고심도 초고해상도 이미징을 가능하게 한다.
수차가 심한 샘플에서 수차의 영향은 회절한계 형광 현미경에서 SMLM에서 훨씬 더 심각하고 복잡했다. 이는 수차에 의한 왜곡으로 인해 단일분자 점 퍼짐 함수의 최대 세기가 낮아지고 너비는 넓어지며 모양은 대칭 가우스 함수에서 벗어나기 때문이다. 또한 단일 형광 분자의 매우 약한 신호가 이러한 왜곡으로 인해 ThunderSTORM 분석 단계에서 위치결정 수가 줄어드는 것을 확인하였다. 이 또한 SMLM 이미지 품질 저하를 야기한다.
또한 수차에 의해 약해진 단일분자 점 퍼짐 함수의 최대 세기가 배경 노이즈보다 충분히 크지 않을 때 충분히 밝은 점들을 찾아내어 단일분자로 분류하는 알고리즘이 단일분자를 제대로 감지할 수 없는 것을 확인하였다. 더욱이 중심 위치를 측정하기 위한 피팅 단계에서 이미지 흐려짐과 같은 점 퍼짐 함수 모양의 왜곡은 높은 피팅 오류에 따른 잘못된 위치결정으로 이어질 수 있다. 특히 근접한 형광분자의 점 퍼짐 함수가 겹칠 때 위치결정 정밀도를 저하되는 것을 확인했다. 또한 동일한 형광 점 퍼짐 함수 원시 이미지에서 만들어낸 수차 보정 없는 SMLM 이미지와 수차 보정한 SMLM 이미지를 직접 비교한 결과, 조직 수차로 인해 발생하는 주요 문제는 위치결정 수의 손실(최대 98.7%)임을 확인하였다.
또한, 위치결정 정밀도는 다소 떨어지지만 기존 기술 대비 그 차이는 상대적으로 적었으며(최대 3.6배 차이), 따라서 점 퍼짐 함수의 너비와 모양은 점 퍼짐 함수의 세기보다 크게 문제되지 않았다. 이는 다른 깊이의 쥐의 뇌 조직에서도 관찰되었다.
따라서 형광 점 퍼짐 함수의 SNR의 저하와 위치결정 수의 손실이 수차가 매우 심한 샘플 깊은 곳에서 SMLM 이미징의 주요 장애물이라고 결론지을 수 있다. 또한 수차의 영향이 관찰 영역 내에서 위치에 따라 변한다는 것을 확인하였다. 이는 배경 노이즈의 공간적 불균일성에 기인할 수 있으며, 그럼에도 불구하고 공간 분해능의 회복은 수차 보정했을 때 모든 위치에 대하여 상당히 균일했다.
또한, CLASS-SMLM으로 얻은 위치결정 정밀도는 수차가 없는 세포 샘플과 동등했다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
100: CLASS-SMLM 현미경 시스템 110: 제1 동작부
120: 제2 동작부 GV: 2축 갈바노미터 거울
BS1: 제1 빔 스플리터 BS2: 제2 빔 스플리터
BS3: 제3 빔 스플리터 BS4: 제4 빔 스플리터
DG: 회절격자 DM1: 제1 다이크로익 거울
DM2: 제2 다이크로익 거울 PBS1: 제1 편광 분리 빔 스플리터
PBS2: 제2 편광 분리 빔 스플리터 SLM: 공간 광 변조기
OL: 대물 렌즈

Claims (10)

  1. 샘플에 조사되는 제1 송신 빔에 대응하여 상기 샘플에 대한 제1 수신 빔을 수신하고, 상기 제1 수신 빔과 상기 제1 송신 빔에 기초하는 참조 빔을 이용하여 상기 샘플에 대한 수차 보정정보를 생성하는 제1 모드로 동작하는 제1 동작부 및
    상기 샘플에 조사되는 제2 송신 빔에 대응하여 상기 샘플에 대한 제2 수신 빔을 수신하고, 상기 수차 보정정보 및 상기 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정된 빔을 생성하며, 상기 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정되지 않은 빔을 생성하고, 상기 수차가 보정된 빔과 상기 수차가 보정되지 않은 빔에 기초하여 상기 샘플에서 발생하는 단일분자 형광 이미지를 획득하는 제2 모드로 동작하는 제2 동작부
    를 포함하는 CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    모드 전환 거울을 구비하고, 상기 모드 전환 거울을 제어하여 상기 제1 모드에서 상기 제2 모드로 전환하거나, 상기 제2 모드에서 상기 제1 모드로 전환하는 모드 전환부
    를 더 포함하는 CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 모드 전환부는,
    상기 제1 모드에서 상기 수차 보정정보가 생성되면, 상기 모드 전환 거울을 제어하여 상기 제2 모드로 전환하는
    CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 동작부는,
    광대역폭의 로우-코히런스 광원(low-coherence source)으로부터 생성되는 상기 제1 송신 빔을 상기 샘플에 조사하는
    CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 동작부는,
    상기 제1 송신 빔을 제1 경로를 통해 상기 샘플에 조사되는 샘플 빔(sample beam)과, 제2 경로를 통해 조사되는 참조 빔(reference beam)으로 분할하는 제1 빔 스플리터;
    상기 제1 수신 빔을 제3 경로를 통해 제1 이미지 센서로 조사하는 제2 빔 스플리터;
    상기 제2 경로를 통해 조사된 참조 빔에 대한 시분해 이미징을 통해 상기 참조 빔의 경로 길이를 조절하는 참조 거울 및
    상기 경로 길이가 조절된 참조 빔을 제4 경로를 통해 조사하는 제3 빔 스플리터
    를 포함하는 CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 동작부는,
    상기 제4 경로를 통해 조사된 참조 빔에서 회절 격자를 지난 상기 참조 빔의 회절 빔들 중 1차 회절 빔을 상기 제1 이미지 센서로 조사하는 제4 빔 스플리터
    를 더 포함하는 CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제1 동작부는,
    상기 제1 이미지 센서를 통해 수신된 상기 제1 수신 빔과 상기 참조 빔의 1차 회절 빔에 기초하여 상기 샘플에 대한 수차를 계산하고, 상기 계산된 수차에 기초하여 상기 수차 보정정보를 생성하는
    CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제2 동작부는,
    들뜸 광원(excitation source)과 활성화 광원(activation source)으로부터 생성되는 상기 제2 송신 빔을 상기 샘플에 조사하는
    CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2 동작부는,
    제2 수신 빔을 제5 경로로 조사되는 제1 분할 빔과 제6 경로로 조사되는 제2 분할 빔으로 분할하는 제1 편광 분리 빔 스플리터;
    상기 수차 보정정보에 기초하여 상기 제1 분할 빔을 물리적으로 보정하여 상기 수차가 보정된 빔을 생성하는 공간 광 변조기 및
    상기 수차가 보정된 빔과 상기 수차가 보정되지 않은 빔인 상기 제2 분할 빔을 결합하고, 상기 결합된 빔을 제2 이미지 센서에 제공하는 제2 편광 분리 빔 스플리터
    를 포함하는 CLASS-SMLM 현미경 시스템.
  10. 제1 동작부에서, 샘플에 조사되는 제1 송신 빔에 대응하여 상기 샘플에 대한 제1 수신 빔을 수신하는 단계
    상기 제1 동작부에서, 상기 제1 수신 빔과 상기 제1 송신 빔에 기초하는 참조 빔을 이용하여 상기 샘플에 대한 수차 보정정보를 생성하는 단계;
    제2 동작부에서, 상기 샘플에 조사되는 제2 송신 빔에 대응하여 상기 샘플에 대한 제2 수신 빔을 수신하는 단계;
    상기 제2 동작부에서, 상기 수차 보정정보 및 상기 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정된 빔을 생성하고, 상기 제2 수신 빔에 기초하여 수차가 보정되지 않은 빔을 생성하는 단계 및
    상기 제2 동작부에서, 상기 수차가 보정된 빔과 상기 수차가 보정되지 않은 빔에 기초하여 상기 샘플에서 발생하는 단일분자 형광 이미지를 획득하는 단계
    를 포함하는 CLASS-SMLM 현미경 시스템의 동작 방법.
KR1020220044555A 2021-10-29 2022-04-11 고심도 초고해상도 이미징을 위한 파면 측정 방식의 적응광학에 기반하는 현미경 시스템 및 그 동작방법 KR20230062343A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100483515B1 (ko) 2000-12-06 2005-04-15 에이에스엠엘 마스크툴즈 비.브이. 광학시스템내의 수차를 검출하는 방법 및 장치

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KR100483515B1 (ko) 2000-12-06 2005-04-15 에이에스엠엘 마스크툴즈 비.브이. 광학시스템내의 수차를 검출하는 방법 및 장치

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