KR20230061098A - 우수한 물성과 생체 안정성, 박테리아 부착 및 생물막 형성 감소, sod 활성 증폭효능을 가지는 치아 교정용 및 치과 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
우수한 물성과 생체 안정성, 박테리아 부착 및 생물막 형성 감소, sod 활성 증폭효능을 가지는 치아 교정용 및 치과 질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 메조포러스 실리카 입자와 양극성 이온물질을 포함하는 치아 교정용 및 치과 장애 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 타액 유래 바이오필름 생물막 두께와 생물량 감소, 곰팡이 및 박테리아에 대한 부착저항에 따른 방오능력 및 생존력 저하, 단백질 흡착방지, 뛰어난 젖음성과 기계적 물성, SOD 활성 증폭을 통한 염증 저항성과 ceria 입자의 응집 방지를 발휘할 수 있다. 이를 통해 기존의 치과소재의 문제를 극복하는 새로운 치과 소재를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 치아 교정용 및 치과 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 더 상세하게는, 메조포러스 실리카 입자와 양극성 이온물질을 이용하여 PMMA 물성을 화학적으로 변하게 함으로써 우수한 물성과 안정성, 박테리아 및 생물막 형성 감소, SOD 활성 증폭효능을 가지는 치아 교정용 및 치과 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
세계 인체적합성 신소재 의료기기 관련 분야(정형외과, 치과 등)의 시장규모는 2020년에는 554억 달러까지 성장할 것으로 전망되며, 국내의 경우 약 2조 72억원의 시장규모 확대가 예상된다. 폴리메틸메타크릴레이트(Poly methyl methacrylate, PMMA)는 보건의료분야에 쓰이는 대표적인 생체재료로써 현재 매년 8~9%의 성장률을 보이며, 전 세계적으로 2018년의 47.2억 달러에서 2025년 76억 달러의 시장규모 확대가 예상된다. 치의학 분야에서는 고령화 시대에 따라 PMMA로 제작되는 틀니(denture) 시장이 전 세계적으로 확대되고 있으며, 국내의 경우 2012년부터 만 75세 이상, 2016년부터 만 65세 이상으로 노인틀니의 보장성 보험이 확대된다.
또한, 연령과 상관없이 삶의 질의 향상을 중시하는 시대적 상황에 따라 안모 심미성의 개선을 위한 치아교정 시장도 빠르게 성장하고 있으며, 대부분의 가철성 치아교정장치는 PMMA로 제작되고 있다. 전 세계 치과교정 시장은 8.9%의 연간 성장률이 예측되며, 2018년의 43억 2,000만 달러에서 2023년까지 66억 3,000만 달러 규모로 성장할 것으로 예측된다. 이러한 추세 속에서 치료용 프리미엄급 PMMA 원천기술의 개발은 상당한 시장 확대 및 성장의 기회를 창출할 것으로 예상된다.
그러나 치과에서 사용되는 대부분의 PMMA는 Ivoclar Vivadent(리히텐슈타인공국) 및 Lang(미국) 등에서 전량 수입에 의존하고 있는 실정이다. 국내외적으로 세계적 경쟁력을 확보하기 위한 항균성 생체재료의 연구개발은 지속되고 있는 상황이지만 여러 제한점으로 인해 상품개발로 이뤄지지 못하고 있으며, 특히 바이오필름 및 구강 세균의 부착 억제 효과를 가진 치료용 PMMA 제품은 전무한 실정이다.
한편, 구강 바이오필름은 700개 이상의 다양한 미생물이 상주하는 구강에 형성됨에 따라 인체 바이오필름 중 가장 복잡한 구조를 가지며, 구강질환 및 관련 전신질환의 원인이다. 또한, 구강 바이오필름은 타액 단백질과 치아우식, 치주염, 치근단 염증 및 임플란트 주위염과 같은 구강 내 국소적 질환뿐만 아니라 소화기관 및 심혈관계를 포함한 감염성 전신질환의 원인으로도 지목된다.
한편, 항박테리아 제재 또는 항생제의 무분별한 사용으로 인해 바이오필름 내 세균의 다제 내성(multi-drug resistance)이 보고되고 있다. 다량의 항박테리아 제재는 정상세포를 파괴하는 독성을 나타낼 수 있어 ISO 규격을 벗어나고 독성이 발현될 가능성이 크다. 또한, 기 개발된 치과재료나 조성물에 적용 시에는 기계적 화학성 물성의 저하와 변이를 일으켜 기계적으로나 화학적으로 적합하지 못한 물성을 나타내게 된다. 틀니 및 가철성 치아교정장치 등은 구강 내 착용시간이 매우 길기 때문에 바이오필름 부착에 따른 세균 증식 및 치석 형성이 빈번히 일어난다. 바이오필름의 단순한 기계적 제거는 사용된 항박테리아 제재의 희석을 야기시키며 제거 과정 중 주위 조직의 손상 또는 감염으로 인한 재발성 감염 질환의 원인이 될 수 있다. 또한, 솔 등을 이용한 세정방법 사용 시 장치 표면의 손상을 가져오며, 장치의 수명 또한 감소시킬 수 있다.
이에 본 발명에서는 구강 세균의 다제 내성을 유발하지 않고, 주위 정상 조직에 독성을 보이지 않으면서, 복잡하고 동적인 구강 내 환경에서 PMMA에 안정적으로 적용되기 위한 새로운 기술을 제공하고자 한다.
본 발명은 메조포러스 실리카 입자와 양극성 이온물질을 이용하여 PMMA 물성을 화학적으로 변하게 함으로써 타액유래 바이오필름, 곰팡이 및 박테리아에 대한 부착저항, 단백질 흡착방지, 방오 능력 및 SOD 활성 증폭효능을 가지고 기존의 젖음성 및 기계적 물성을 유지하면서도 안정성과 기능성이 확인된 치과용 조성물을 제공하고자 한다. 또한, 기존의 조성물에서 물성 저하 및 세포 독성, 자체 응집의 문제가 발생하는 ceria의 문제를 개선하는 치과용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 메조포러스 실리카(Mesoporous Silica)와 양극성 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 치아 교정용 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 치아 교정용 조성물에 있어서, 상기 메조포러스 실리카는, 바람직하게 CeO2가 메조포러스 실리카의 기공 내에 삽입되어 실리카에 결합된 상태인 것이 좋다.
한편, 본 발명의 치아 교정용 조성물에 있어서, 상기 양극성 이온은, 바람직하게 설포베타인 메타크릴레이트(sulfobetaine methacrylate)인 것이 좋다.
본 발명은 메조포러스 실리카(Mesoporous Silica)와 양극성 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 치과 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 치과 질환 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 메조포러스 실리카는, 바람직하게 CeO2가 메조포러스 실리카의 기공 내에 삽입되어 실리카에 결합된 상태인 것이 좋다.
한편, 본 발명의 치과 질환 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 양극성 이온은, 바람직하게 설포베타인 메타크릴레이트(sulfobetaine methacrylate)인 것이 좋다.
본 발명은 메조포러스 실리카 입자와 양극성 이온물질을 포함하는 치과용 조성물을 제공함으로써, 타액 유래 바이오필름 생물막 두께와 생물량 감소, 곰팡이 및 박테리아에 대한 부착저항에 따른 방오능력 및 생존력 저하, 단백질 흡착방지, 뛰어난 젖음성과 기계적 물성, SOD 활성 증폭을 통한 염증 저항성과 ceria 입자의 응집 방지를 발휘할 수 있다. 이를 통해 기존의 치과소재의 문제를 극복하는 새로운 치과 소재를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 기계적 물성 시험(Mechanical testing) 결과 그래프로, (A) 굽힘 강도; (B) 탄성 계수; (C) 비커스 경도 (***P < 0.001)에 대한 것이다.
도 2는 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 젖음성 시험 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 세포독성(Cytotoxicity test) 시험 결과 그래프이다(***P < 0.001).
도 4는 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 단백질 흡착(Protein absorption) 시험 결과 그래프이다(***P < 0.001).
도 5는 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 곰팡이 및 박테리아 부착 및 생존력 시험 결과 그래프로, (A) 샘플 표면에 부착된 Candida albicans 및 Streptococcus mutans의 대표적인 살아있는 죽은/염색 이미지; 물질 표면에 부착된 Candida albicans (B); 및 Streptococcus mutans (C)에서 파생된 WST 계수에 대한 것이다(***P < 0.001).
도 6은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 타액 유래 바이오필름 모델 및 바이오매스 측정 시험 결과 그래프로, (A) 샘플 표면에 부착된 생물막의 대표적인 살아있는 죽은/염색 이미지; (B) 생물막 두께의 정량적 분석; (C) 생물막 바이오매스의 정량적 분석에 대한 것이다(**P < 0.01, ***P < 0.001).
도 7은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 SOD 활성을 측정한 결과 그래프이다(***P < 0.001).
도 8은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 XRD 패턴 (A); 표면 전하 (B)에 대한 결과 그래프로, 입자 표면을 제타전위로 분석하였다.
도 2는 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 젖음성 시험 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 세포독성(Cytotoxicity test) 시험 결과 그래프이다(***P < 0.001).
도 4는 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 단백질 흡착(Protein absorption) 시험 결과 그래프이다(***P < 0.001).
도 5는 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 곰팡이 및 박테리아 부착 및 생존력 시험 결과 그래프로, (A) 샘플 표면에 부착된 Candida albicans 및 Streptococcus mutans의 대표적인 살아있는 죽은/염색 이미지; 물질 표면에 부착된 Candida albicans (B); 및 Streptococcus mutans (C)에서 파생된 WST 계수에 대한 것이다(***P < 0.001).
도 6은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물을 이용한 타액 유래 바이오필름 모델 및 바이오매스 측정 시험 결과 그래프로, (A) 샘플 표면에 부착된 생물막의 대표적인 살아있는 죽은/염색 이미지; (B) 생물막 두께의 정량적 분석; (C) 생물막 바이오매스의 정량적 분석에 대한 것이다(**P < 0.01, ***P < 0.001).
도 7은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 SOD 활성을 측정한 결과 그래프이다(***P < 0.001).
도 8은 본 발명 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 XRD 패턴 (A); 표면 전하 (B)에 대한 결과 그래프로, 입자 표면을 제타전위로 분석하였다.
치의학 분야에서 우수한 물성을 가진 PMMA는 치과재료에 국한되지 않고 사용되나 치료용 재료의 경우 바이오필름 및 구강 세균의 부착 억제 효과를 가진 치료용 PMMA 제품은 전무한 실정이다. 하지만 기존 상용화 PMMA는 자체 높은 침습성으로 인해 구강 내 침습환경에서 변질 및 오염되는 경우가 컸으며, 오염된 PMMA는 각종 바이오필름, 치석, 세균증식, 염증 및 구강질환을 야기시켜왔다. 이에 PMMA에 다양한 항균 방오 성분을 가진 물질이나 화합물을 첨가하는 연구가 있어왔지만 유효성에서 효과가 나타나더라도 높은 세포독성, ISO 규격미달, 기계적/화학적 물성 및 젖음성 감소로 실사용하기 어려운 경우가 대다수였다.
이에 본 발명에서는 세포독성을 감소시키고, 기사용되고 있는 PMMA 조성물과 동등한 기계적 강도를 가지면서 SOD 활성을 증폭시킴과 동시에 ISO 규격에 충족되거나 뛰어난 물성을 나타내는 치과용 조성물을 개발하였다. 이에 더해 양극성이온을 사용함으로써 곰팡이 및 박테리아에 대한 방오능력 및 생존력 감소, 단백질 접착 방지, 바이오필름의 생물막 두께와 생물량 감소효과를 발휘할 수 있게 하였다.
본 발명은 메조포러스 실리카(Mesoporous Silica)와 양극성 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 치아 교정용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 메조포러스 실리카(Mesoporous Silica)와 양극성 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 치과 장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 메조포러스 실리카(Mesoporous Silica)는 메조 기공을 가지고 있는 입자로, 당 업계에 공지되는 것은 어느 것에든 제한되지 않으나, 바람직하게는 분자량 30.0~500.0(m/w)이고 4.0~30.0 나노미터 육각형 배열의 기공을 가지는 SBA-15인 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, CeO2가 메조포러스 실리카의 기공 내에 삽입되어 실리카에 결합된 상태인 것('나노 Ceria(CeO2)로 치환된 SBA-15')이 좋다. '나노 Ceria(CeO2)로 치환된 SBA-15'는 하기의 방법으로 제조된다. SBA-15 0.5~1.0 중량부, Ce(NO3)3 * 6H2O 1.2~1.4 중량부를, 시트르산 1.00~1.50 중량부를 물 2~3 중량부에 녹인 시트르산 수용액에 10~14시간 함침한 후, 100~140℃에서 건조하고 300~500℃에서 2~6시간 소성하여 제조하는 것이 좋다. 이를 통해 20~60wt%의 CeO2의 공칭 로딩을 갖는 나노 Ceria(CeO2)로 치환된 SBA-15를 얻을 수 있다.
양극성 이온은 양전하와 음전하를 동시에 지니고 있는 이온을 말하며, 아미노산은 아미노기(-NH2)와 카복실기(-COOH)를 포함하고 있다. 본 발명에서 상기 양극성 이온은 바람직하게 설포베타인 메타크릴레이트(sulfobetaine methacrylate)인 것이 좋다.
한편, 본 발명의 조성물은 바람직하게 SBA-15-Ceria(CeO2) 1.5%(w/v), 설포베타인 메타크릴레이트 1.5%(w/v), PMMA powder 58.2%(w/v), PMMA liquid 38.8%(w/v)을 함유하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 나노 Ceria(CeO2)로 치환된 SBA-15 1.5%(w/v), 설포베타인 메타크릴레이트 1.5%(w/v)를 PMMA liquid에 첨가하여 1시간의 sonication과 4시간의 stirring을 거쳐 혼합시킨 후, 상온에서 PMMA powder와 혼합하고 60℃, 4.0 bar 기압에서 30분동안 중합하는 것이 좋다. 이때, 혼합 조건은 당업계에서 공지된 조건이라면 어느 것에든 한정되지 않으나 바람직하게 진공상태 또는 질소 환경인 것이 좋다.
한편, 하기 실험에 의하면, 본 발명의 조성물은 기계적 물성 시험에서 ISO 규격보다 높은 값을 나타내고, 젖음성 시험에 일반적 PMMA 기반 치과 재료의 친수성과 동등하거나 개선되었으며, 세포독성 수치도 ISO 기준에 충족하여 안정적이었다. 또한, SOD 활성을 증폭시켜 염증 저항성과 ceria 입자의 응집을 방지할 수 있고, 단백질 접착 방지 능력이 있으며, 곰팡이 및 박테리아에 대한 방오능력 및 생존력 저하가 있고, 바이오필름 생물막 두께와 생물량 감소 효과가 발휘되었다. 이를 통해 기존 PMMA 조성물을 대체하는 새로운 치과용 조성물의 소재로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 용어, "바이오필름(biofilm)"은 치아 및 치료용 치과 교정술 장치의 표면에 형성된 단백질, 곰팡이 및 박테리아 등으로 이루어진 군집을 정의한다. 바이오필름은 구강 내 온도 및 습도와 박테리아의 영양이 되는 음식물 찌꺼기로 인해 계속 크기가 증가하며, 구강내 충치 및 잇몸 염증을 유발하고, 치은염과 치주염의 원인이 된다. 바이오필름 위로 찌꺼기 와 단백질이 쌓여 플라그(plaque)를 형성하고 결과적으로 치석이 되는 결과를 초래한다. 플라그 및 치석 형성차단 구강 건강증진을 위해서는 바이오필름 및 단백질 부착저항, 세균, 곰팡이 등에대한 방오 능력이 필수적이라고 할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 용어, "바이오매스 (biomass)"는 바이오필름에 형성되어 있는 군집의 전체 박테리아 생물량을 의미할 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 경화제, 안정화제, pH 조절제, 난연제, 윤활제, 충전재, 함입 감소제, 형광 중백제 중축제 촉매, 대전방지제, 소포제, 유화제, 증점제, 향료 및 강화재로 이루어진 그룹 중 적어도 하나이상을 더 포함할 수 있다. 그러나, 전술한 것에 제한되지 않고 보다 다양한 첨가물을 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 : SCZ (SBA-15-Ceria(CeO
2
), zwitterion) 조성물 제조]
본 실시예에서는 나노 Ceria(CeO2)로 치환된 SBA-15인 SBA-15-Ceria(CeO2)와 zwitterion을 포함하는 조성물인 'SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물'을 제조하였다.
질산세륨(Ⅲ) 수용액을 포함하는 초기 습윤 함침 기술이 적용되었다. SBA-15 0.8 g(ACS Material, LLC, Pasadena, CA)을 함침시키기 위해 Ce(No3)3*6H20 1.35 g과 시트르산 1.19 g을 물 2.4 ml에 녹인 후, 이 용액에 SBA-15를 첨가하고 12시간 동안 교반하였다. 이때, 1~4 ㎛ particle size, 6~11 나노미터 육각형 배열의 기공을 가지는, 60.08 (m/w)인 SBA-15을 사용하였다. 상기와 같은 함침 후, 샘플을 120℃에서 12시간 동안 건조하고 400℃에서 4시간 동안 소성하였다. 최종적으로 40wt%의 CeO2의 공칭 로딩을 갖는 ceria-modified SBA-15 ('SBA-15-Ceria(CeO2)') 합성을 완료하였다. 이때, CeO2는 질산세륨(Ⅲ) 수용액이 SBA-15 기공 내에서 'Ce(No3)3*6H20=가열=Ce(No3)3+6H20, Ce(No3)3=고온=CeO2+3NO↑+2O2↑'의 화학반응을 거쳐 전환된 것이다.
상기에서 제조한 SBA-15-Ceria(CeO2)를 1.5~3%, SBMA (sulfobetaine methacrylate) 1.5~3%를 PMMA liquid에 첨가하고 1시간의 sonication과 4시간의 stirring 과정을 거쳐 혼합하였다. 혼합된 liquid와 PMMA powder를 상온에서 혼합하여 'SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion)' 조성물을 완성하였다. 이후, 60℃ 가압환경(4.0 bar에서 30분 중합)에서 탈포 및 용도에 맞도록 성형을 진행하였다.
본 발명 'SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물'의 물성 및 유효성 효과를 확인하기 위해 대조군과, 비교실험군을 포함하여 하기 표 1과 같은 조성으로 제조하였으며, 하기 실험에 사용하였다.
Groups | SBA-15 | Ceria(Ce02) | SBA-15-Ceria(Ce02) | Zwitterion (SBMAa) |
PMMAb powder/liquid |
Controlc | - | - | - | - | 60/40 |
S | 1.5 | - | - | - | 59.1/39.4 |
C | - | 1.5 | - | - | 59.1/39.4 |
SC1 | - | - | 1.5 | - | 59.1/39.4 |
SC1Z1 | - | - | 1.5 | 1.5 | 58.2/38.8 |
SC1Z2 | - | - | 1.5 | 3 | 57.3/38.2 |
SC2 | - | - | 3 | - | 58.2/38.8 |
SC2Z1 | - | - | 3 | 1.5 | 57.3/38.2 |
SC2Z2 | - | - | 3 | 3 | 56.4/37.6 |
a: SBMA, sulfobetaine methacrylate, b: PMMA, poly methyl methacrylate (단, SBA-15-ceria 함량이 5%를 초과하면 물성을 보장할 수 없음)
c: control은 일반적으로 상용화된 PMMA의 단독 물성이다.
[실험예 1: 실시예의 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO
2
), zwitterion) 조성물의 기계적 물성, 구조적 안정성 평가, 젖음성, 세포 독성 및 ISO 기준 충족여부 확인]
본 실험예에서는 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 기계적 물성 평가, 구조적 안정성 평가, 젖음성, 세포 독성 및 이에 따른 ISO 기준 충족여부를 확인하였다.
1) 기계적 물성 및 구조적 안정성 평가
기계적 물성은 ISO 20795-2[3]에 따라 평가되었다. 샘플은 3.3(높이) × 10(너비) × 64(길이) mm의 치수로 제작되었다. 3점 굽힘시험은 만능시험기(Model 3366, Instron)를 사용하였으며, 굽힘강도 및 탄성계수는 스팬길이 50 mm, 크로스헤드 속도 5 mm/min에서 측정하였다. 굴곡강도와 탄성계수는 ISO에서 정의한 표준식에 따라 계산하였다. Vickers 경도는 경도계(DMH-2, Matsuzawa Seiki Co. Ltd.)를 사용하여 300gf(2.94N)의 시험하중에서 30초 동안 측정하였다. 각 샘플의 평균값은 세 곳에서 측정하여 계산되었다.
기계적 물성 결과는 도 1과 같았으며, SBA-15('S')를 첨가했을 때 PMMA의 기계적 물성이 크게 향상되었다. 반면, Ceria와 zwitterion의 함량이 증가할수록 기계적 물성에는 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 전체 그룹에서(심지어 가장 낮은 물성인 SC2Z2에서도) 굽힘 강도, 탄성계수, 비커스 경도 경향은 ISO 규격(그래프 상 파란 점선)보다 높은 값을 보이는 것으로 뛰어났으며, 이는 SBA-15의 특성에 기인한 것으로 판단된다.
2) 젖음성 검증
본 발명의 조성물이 기사용되고 있는 조성물에 대비 물성 충족여부를 확인하고자 하였다. 표준화된 폴리아세탈 수지 몰드를 사용하여 디스크 모양의 샘플을 제작했다(직경: 15 mm, 두께: 2 mm). 건조 조건에서 시료 표면에 5 μL의 증류수를 떨어뜨리고 10초 후 비디오 접촉각 측각기(SmartDrop, Femtobiomed Inc.)를 사용하여 접촉각을 측정하였다. 각 샘플에 대해 두 번 측정을 반복하고 평균값을 기록했다. 접촉각을 측정한 결과, 도 2와 같이 Control, S, SC 및 SC2 그룹은 약간의 하향 경향을 나타내지만 그 차이는 크지 않아 SBA-15가 PMMA의 친수성에 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다. Ceria기의 접촉각이 감소하여 친수성이 개선되었음을 알 수 있다. 양극성 이온(SC1Z1,SC1Z2,SC2Z1,SC2Z2)을 추가한 그룹의 접촉각이 크게 감소하였고 이전 연구와 일치되는 값이었다. 이를 통해 본 발명의 조성물은 일반적 PMMA 기반 치과 재료의 친수성에 유사하거나 개선된 것을 확인하였다.
3) 세포 독성 검증
본 발명 조성물의 세포독성 유무를 확인함과 동시에 그 수치가 ISO 기준에 적합한지에 대해 확인하고자 하였다. 세포독성은 MTT분석을 통하여 실시 하였으며 MTT 분석은 ISO 10993-5[4]에 따라 수행되었다. L929 세포(1 x 105 cells/mL)를 96웰 플레이트에 접종한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 샘플 추출은 ISO 10993-12[5]에 따라 준비되었다. 웰에 반-융합 단층이 형성된 후, 배양 배지를 웰에서 제거하고, 100 mL 부피의 100% 추출액을 각 웰에 넣었다. 양성 대조군은 1% 페놀 용액이었고 음성 대조군은 산화알루미늄 세라믹 추출물이었다. 24시간 후, 배지를 50 mL의 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(Sigma) 용액으로 교체했다. MTT 용액을 100 mL의 이소프로판올로 교체한 후 플레이트를 조심스럽게 흔들어 결정을 용해시켰다. 570 nm에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더(Epoch, BioTek Instruments)를 사용하여 측정했다.
그 결과, 도 3과 같이 Control, S, C, SC1, SC1Z1군이 세포독성이 낮았고, 쯔비터를 포함한 군 중 SC1Z1군이 가장 높은 세포생존율을 보였다. 또한, SC1Z2, SC2의 세포 생존율은 ISO 표준(그래프상 파란 점선)에 가까웠으나, Control에 비해 유의성 있는 감소를 보였고, SC2Z1 및 SC2Z2의 세포 생존율은 ISO 표준보다 낮아 잠재적인 세포독성을 나타냈다. 이에 세포독성이 없는 범위 내에서 사용하면 안전한 것으로 확인되었다.
[실험예 2: 실시예의 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO
2
), zwitterion) 조성물의 단백질 흡착 방지 유효성 검증]
본 실험예에서는 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 단백질 흡착 방지에 대한 유효성을 검증하고자 하였다.
샘플 표면의 초기 단백질 흡착평가, 디스크 모양의 샘플을 제작하고(직경: 15 mm, 두께: 2 mm) 상온에서 신선한 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)에 1시간 동안 담궜다. 그런 다음 각 샘플을 소 혈청 알부민(BSA; Pierce Biotechnology) 브로쓰(2 mg의 단백질/mL의 PBS, 100 μL)에 담궜다. 37℃에서 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 샘플에 부착되지 않은 단백질은 PBS로 두 번 세척하여 제거했다. 그런 다음 micro-bicinchoninic acid(200 μL; Micro BCATM Protein Assay Kit, Pierce Biotechnology)를 사용하여 샘플에 부착된 단백질의 양을 측정한 후 37℃에서 30분 동안 배양했다. 표면 흡착 단백질의 양은 마이크로 플레이트 리더(Epoch, BioTek Instruments)를 사용하여 측정한 562 nm에서의 광학 밀도(OD)를 기준으로 정량하였다. 그 결과, 도 4와 같이 흡착된 BSA의 양은 SC1Z1 그룹이 다른 그룹보다 현저히 낮았는데, 이는 단백질 접착에 대한 양쪽성 이온의 기피 특성을 나타내는 결과로 본 발명의 조성물이 단백질 접착 방지 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
[실험예 3: 실시예의 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO
2
), zwitterion) 조성물의 곰팡이, 박테리아 부착 저항 및 생존력 저하 확인]
본 실험예에서는 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 곰팡이, 박테리아 부착 저항 및 생존력 저하를 확인하고자 하였다.
세균 분석은 이전에 확립된 방법에 따라 수행되었다. 디스크 모양의 샘플을 제작했다(직경: 10 mm, 두께: 2 mm). 곰팡이 및 박테리아 분석은 Candida albicans(Korean Collection for Oral Microbiology (KCOM) 1301)와 Streptococcus mutans(ATCC 25175)를 사용하여 수행하였다. 24웰 플레이트를 사용하여 곰팡이 또는 박테리아 현탁액(1mL, 1 x 108 cells/mL)을 각 샘플에 첨가한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 인큐베이션 후 PBS로 2회 세척하여 부착되지 않은 균류 또는 박테리아를 제거하였다. 시료 표면에 부착된 세균을 뇌심장주입액(1 mL)에서 5분간 초음파 처리(SH-2100, Saehan Ultrasonic)하여 채취하였다.
Microbial Viability Assay Kit-WST (Dojindo, Kumamoto, Japan)는 제조사의 기술 매뉴얼에 따라 살아있는 미생물의 수에 정비례하는 비색 지표로 사용했다. 96-well plate를 사용하여 착색 시약(10 μl)을 수확된 세균 현탁액(190 μl)에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음 microplate reader(Epoch, BioTek Instruments)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 3회 수행된 실험의 평균으로 측정했다.
생존/사멸 박테리아 생존력 키트(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)는 제조업체의 프로토콜에 따라 부착 박테리아의 생존력을 조사하는 데 사용되었다. Candida albicans와 Streptococcus mutans를 위와 같은 방법으로 배양하였다. 염색된 샘플은 공초점 레이저 현미경(CLSM; LSM880, Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)으로 관찰하였다. 살아있는 박테리아는 녹색으로, 죽은 박테리아는 빨간색으로 나타났다.
그 결과, 도 5와 같이 모든 그룹은 살아있는 박테리아(녹색으로 염색)로 덮여 있었으며, Control 그룹과 S 그룹은 동일한 수준의 접착력으로 다른 그룹에 비해 높았다. C.albicans 환경에서 SC1 그룹보다 C 그룹의 접착력이 낮았는데, 이는 C.albicans가 소수성 표면에 더 잘 부착되는 경향이 있는 것에 기인한다. S.mutans 환경에서 SC1 그룹의 접착력은 C 그룹보다 낮았는데, 이는 SBA-15-Ceria가 Ceria보다 항균 효과가 더 높은 것에 기인한다. 특히, SC1Z1은 곰팡이(Candida albicans)와 박테리아(Streptococcus mutans) 환경 모두에서 다른 그룹에 비해 가장 낮은 접착력을 보였으며, 이를 통해 본 발명의 조성물이 곰팡이 및 박테리아에 대한 세균 부착 저항성이 우수하여 이에 대한 방오능력 및 생존력을 감소시키는 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
[실험예 4: 실시예의 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO
2
), zwitterion) 조성물의 타액 유래 바이오필름 모델 및 바이오매스에 대한 방오 유효성 확인]
본 실험예에서는 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 타액 유래 바이오필름 모델 및 바이오매스에 대한 방오 유효성을 확인하였다.
타액 유래 바이오필름 모델 및 바이오매스 측정 인간 타액 유래 생물막 분석은 이전에 확립된 방법에 따라 수행되었다. 타액은 제64차 세계의사협회 헬싱키 선언의 윤리 원칙에 따라 연세대학교 치과병원(대한민국 서울) 기관심사위원회(2-2019-0049)의 승인을 받은 절차에 따라 채취하였다. 타액을 기증하기 전에 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었다. 6명의 성인으로부터 얻은 인간 타액을 동일한 비율로 혼합한 다음 멸균 글리세롤에 30%로 희석하고 -80°C에서 보관하였다. 생물막 모델은 타액 환경을 시뮬레이션하고 안정적인 미생물 성장 환경을 얻기 위해 McBain 배지에서 배양되었다. 배양액(1.5 mL)을 각 샘플(직경: 10 mm, 두께: 2 mm)에 떨어뜨리고 생물막을 37℃에서 48시간 동안 배양하고 8, 16 및 24 후에 추가 배양 배지(1.5 mL)를 추가했다. 인큐베이션 시간. 샘플은 제조업체 프로토콜에 따라 살아있는/죽은 박테리아 생존력 키트(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 염색되었다. 샘플 표면의 생물막을 관찰하기 위해 CLSM에서 5개 사이트를 무작위로 선택했다. 생물막 두께는 이미지의 수직 축을 기준으로 Zen 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하여 측정되었다. 평균 바이오매스는 ImageJ 소프트웨어(NIH)와 함께 COMSTAT 플러그인(덴마크 공과 대학)을 사용하여 측정되었다.
그 결과, 도 6과 같이 단일 박테리아에 대해 얻은 것과 일치하는 다른 그룹에 대한 생물막 두께와 생물량을 보여준다. 생물막 바이오매스 및 두께는 Control 및 S 그룹에 대비하여 SC1 및 SC1Z1 그룹에서 크게 감소했으며, SC1 샘플은 생물막 두께 측면에서 Control 샘플과 크게 다르지 않았지만 생물막 생물량은 유의하게 더 낮은 것으로 나타났다. 특히, SC1Z1 그룹은 생물막 두께도 낮으면서, 생물막 형성이 가장 낮았으며, 이를 통해 본 발명의 조성물은 바이오필름 및 바이오매스에서 방오 유효성을 나타내는 것을 확인하엿다.
[실험예 5: 실시예의 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO
2
), zwitterion) 조성물의 SOD 모방 활성 분석(mimetic activity assay)]
본 실험예에서는 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 SOD 모방 활성을 분석하고자 하였다.
SOD 모방 활성은 ISO 10993-12 에 따라 준비된 샘플 추출로 평가되었다. 그룹의 SOD 활성은 제조자의 지시에 따라 Superoxide Dismutase Assay Kit(DoGenBio, Seoul, Korea)로 측정하였다. 간단히 말해서, WST-8은 잔틴 산화효소(xanthine oxidase)에 의해 생성된 슈퍼옥사이드 라디칼 음이온(.O2 -)과 반응하여 수용성 포르마잔 염료를 생성할 수 있다. 반응은 SOD가 .O2 -의 불균일화를 촉매하여 과산화수소(H2O2)와 O2를 생성할 수 있기 때문에 SOD에 의해 차단될 수 있다. 따라서 formazan 염료의 생산은 SOD 활성과 음의 상관관계를 보였다. 인큐베이션 후 450 nm에서 흡광도를 측정했다. 억제율(%)은 각 군의 SOD 활성을 나타낸다.
세포 환경에서 .O2 -는 신호 분자 역할을 하는 정상적인 세포 대사의 결과로 생성된다. 그러나 배경 .O2 - 수준은 염증 반응 동안 빠르게 상승할 수 있다. SOD 활성은 .O2 -를 소거하는 능력을 나타내며 염증에 저항할 수 있는 가능성으로 간주될 수 있다. 그 결과, 도 7과 같이 대조군과 S군은 SOD 활성을 나타내지 않았으나 SC1과 SC1Z1군은 C군보다 높았으며, 특히 SC1Z1이 가장 높은 SOD 활성을 보였다. 이는 나노 Ceria 입자의 응집은 Ce3+-Ce4+의 전환에 영향을 주어 SOD 활성을 감소시키지만, SBA-15는 Ceria의 분산을 도우며 Zwitterion은 이온이 물질 표면으로 확산되는 것을 도와 SOD 활동을 증가시키게 되는 것으로 설명된다. 이와 같이 본 발명의 조성물은 탁월한 SOD 활성을 통해 재생된 활성 산소종(O2 -)을 소거하는 능력을 나타내어 염증 저항성을 발휘하여 염증을 완화하거나 감소시키고 상처 치유를 가속화하며 박테리아 성장을 억제할 수 있게 된다.
[실험예 6: 실시예의 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO
2
), zwitterion) 조성물의 Ceria(CeO
2
)의 응집방지 확인]
본 실험예에서는 SCZ (SBA-15-Ceria(CeO2), zwitterion) 조성물의 Ceria(CeO2)의 응집방지를 확인하고자 하였다.
시중에서 구입한 SBA-15, 나노 ceria, 합성된 SBA-15-Ceria를 특성화하였다. 재료의 상 조성은 Miniflex 600 회절계 Riguku를 사용하여 단색기로 CuKα 방사선(λ=1.5418 Å)을 사용하여 분말 X선 회절(XRD)에 의해 분석되었으며, 2Θ 범위에서 0.2 deg/min의 주사 속도에서 2 ~ 90°. 상 구성 분석은 PCPDFWIN 데이터베이스와 전체 프로필 분석 프로그램 POWDER CELL 2.4를 사용하여 수행되었다. SBA-15, 나노 ceria 및 합성된 SBA-15-Ceria의 표면 전하는 제타 전위 분석기(Zeta-sizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK)로 측정하였다. 1 mg의 물질을 30-40분 동안 초음파 기계를 사용하여 1 mL의 DW에 분산시켰다. 잘 분산된 CNP는 표면 전하를 측정하기 위해 DW에서 10배 더 희석했다.
그 결과, 도 7의 A와 같이 SBA-15, Ceria 및 SBA-15-Ceria에 대한 2~90°의 XRD 패턴을 나타냈으며, XRD에 존재하는 2Θ의 23°에서의 피크와 5° 미만의 소각 반사는 SBA-15에 대해 일반적이다. 28.6, 32.9, 47.2, 56.3, 76.6 및 88.3°의 2θ 영역에서 산화세륨의 반사는 SBA-15-Ceria 샘플에서 관찰되었다. SBA의 소각 반사 강도는 SBA-15의 다공성 공간이 ceria로 채워지기 때문에 규칙적인 다공성 구조의 부분적 감소를 나타내는 산화세륨의 도입으로 감소한다. 입자의 표면 전하는 주로 제타 전위 분석에 의해 조사되었으며, 도 7의 B와 같이 pH = 7 조건에서 SBA-15, Ceria 및 SBA15-Ceria의 표면 전하를 나타내는 조건은 -33.0 ± 6.2 mV, -1.3 ± 6.4 mV 및 -41.3 ± 각각 4.57mV 제타 전위 값이 높다는 것은 전하가 높은 입자를 의미하며, 이는 전기 반발로 인한 입자의 응집을 방지하여 더 나은 분산을 유도한다. 응집은 나노 물질의 기능에 영향을 미치는 주요 문제 중 하나인데, 본 발명의 조성물은 전기 반발로 인한 입자의 응지를 방지하고 SBA-15와 결합하면 ceria가 더 나은 분산 및 활성을 얻을 수 있다.
Claims (6)
- 메조포러스 실리카(Mesoporous Silica)와 양극성 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 치아 교정용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 메조포러스 실리카는,
CeO2가 메조포러스 실리카의 기공 내에 삽입되어 실리카에 결합된 상태인 것을 특징으로 하는 치아 교정용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 양극성 이온은,
설포베타인 메타크릴레이트(sulfobetaine methacrylate)인 것을 특징으로 하는 치아 교정용 조성물.
- 메조포러스 실리카(Mesoporous Silica)와 양극성 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 치과 질환 예방 및 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 메조포러스 실리카는,
CeO2가 메조포러스 실리카의 기공 내에 삽입되어 실리카에 결합된 상태인 것을 특징으로 하는 치과 질환 예방 및 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 양극성 이온은,
설포베타인 메타크릴레이트(sulfobetaine methacrylate)인 것을 특징으로 하는 치과 질환 예방 및 치료용 조성물.
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Publication number | Publication date |
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WO2023074983A1 (ko) | 2023-05-04 |
US20230137422A1 (en) | 2023-05-04 |
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