KR20190119909A - 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 포함하는 상아질 접착제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산성환경에서 구리 이온을 방출할 수 있도록 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 포함하는, 상아질 및 상아질 접착제 계면의 강도 증진 및 접착력 유지용 조성물; 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자 및 광중합성 상아질 접착제를 포함하는, 상아질 접착제 조성물; 이의 제조방법; 및 이를 이용하는 상아질 접착 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상아질 접착제 조성물은 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 포함함으로써, Ca, Si 및 Cu 이온을 상아질-접착제 계면에 전달하여 상아질-접착제 수지 시스템에서 MMP 비활성화 및 재광화를 동시에 수행할 수 있다.

Description

구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 포함하는 상아질 접착제 조성물{Dentin Adhesive Composition Comprising Copper Doped Bioactive Nanoparticles}

본 발명은 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자 함유 치과용 상아질 접착제, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 비활성화 및 상아질의 재광화를 유도하는 것을 특징으로 하는 상아질 접착 방법에 관한 것이다.

상아질은 유기질을 25 부피% 정도 함유하고 있으며, 상아 세관의 노출로 습윤한 상태로 유지되어 접착기전이 복잡하고 다양한 요소가 접착력에 영향을 줄 수 있어 법랑질에 대한 접착과는 달리 상아질 접착은 예측하기 어렵다. 상아질 접착에 영향을 주는 요소로는 치질의 조성, 도말층(smear layer), 수분, pH, 혼성층(hybrid layer), 광개시제의 종류, 잔존 무기질의 양, 필러의 크기와 양, 중합 수축 등이 있다. 치질에 수복물 또는 보철물을 효과적으로 접착시키기 위하여 상아질 접착제는 젖음성(wettability), 산도(pH), 투과도(permeability), 기계적 강도(mechanical property) 등 여러 가지 특성이 요구되어 그에 관한 많은 연구가 보고되었고, 최근까지 여러 세대의 상아질 접착제가 개발되고 있다.

상아질 접착제는 접착기전에 따라 여러 단계로 발전되어 왔고 현재까지 사용되고 있는 제4세대 상아질 접착제부터는 산-부식 처리후 친수성 프라이머를 적용하여 향상된 접착력을 얻을 수 있었으며, 법랑질과 상아질의 일괄부식(total etch) 처리가 가능하게 되었다. 그러나 제4세대 상아질 접착제의 경우 여러 단계(3-step)를 거쳐야 하므로 사용에 다소 불편한 점이 있었고, 시술자에 따라 접착강도에 큰 차이를 보이는 문제가 제기되었었고, 이 후 다양한 세대를 거쳐 현재 제7세대까지 시술의 편리성을 추구한 제품이 개발되어 왔다.

상아질-접착제 복합체의 효소 분해 및 가수 분해는 접착력이 시간에 따라 악화되는 주요 메커니즘이다. 따라서 상아질-접착제 수지 계면의 구조적 완전성을 장기간 유지하는 것이 성공적인 상아질 접착의 핵심이다. 탈회된 상아질 매트릭스에서 상아질의 내인성 프로테아제(예: MMPs)는 콜라겐 매트릭스의 분해에 중요한 역할을 하여 결합 강도와 수복물의 수명을 감소시킨다. MMP는 산성 에칭제 또는 자체 에칭 접착제로 상아질을 탈회시키거나, 박테리아의 산이 상아질에 영향을 주는 경우 활성화된다.

상아질-접착제 수지 계면의 수명을 연장하기 위한 한가지 전략은 광화된 상아질 내에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix metalloproteinase, MMP)와 같은 단백질 분해 효소의 비활성화이다. 이와 관련하여 약물(예: 클로르헥시딘, 졸레드로네이트), 이온성 용액(NaF), 가교 결합제 및 생체 분자를 단독으로 또는 조합으로 사용하여 MMP가 접착제에 결합하는 것을 저해하는 방법 또는 접착제 적용 전에 전처리하는 방법을 사용할 수 있다.

또 다른 전략은 활성 내인성 프로테아제의 화석화를 통해 효소 매개 매트릭스 분해를 감소시키는 상아질(또는 상아질-접착제 계면) 재광화(remineralization)이다. 이와 관련하여 접착제 수지 또는 수지 복합재에서, 방출된 칼슘(Ca^{2 +}), 인산염(PO4^3-) 또는 실리카(Si^{4 +})를 통해 탈회된 상아질 매트릭스를 침전시키는 생체활성(유리) 재료의 혼입이 널리 연구되어 왔다.

한국공개특허 제2004-0078363호

본 발명은 상아질-접착제 수지 계면의 수명을 연장하기 위한, 상아질-접착제 매트릭스에서 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성을 억제하는 동시에 상아질-접착제 수지 계면을 재광화하여, 상아질 접착제의 미세인장 결합강도 및 내구성을 향상시킬 수 있는 상아질 접착제 조성물 및 이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 상기 상아질 접착제 조성물을 이용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 비활성화 및 상아질의 재광화를 유도하는 것을 특징으로 하는 상아질 접착 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1 양태는 산성환경에서 구리 이온을 방출할 수 있도록 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 포함하는, 상아질 및 상아질 접착제 계면의 강도 증진 및 접착력 유지용 조성물을 제공한다.

본 발명의 제2 양태는 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자 및 광중합성 상아질 접착제를 포함하는, 상아질 접착제 조성물을 제공한다.

본 발명의 제3 양태는 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 광중합성 접착제 조성물에 혼입시키는, 치과용 상아질 접착제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제2 양태에 따른 조성물을 상아질에 적용하여 칼슘 이온, 규산염 이온 및 구리 이온을 전달함으로써 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 비활성화 및 상아질의 재광화를 유도하는, 상아질 접착 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 상아질과 상아질 접착제 계면의 강도를 증진시키고 상아질 접착제의 접착력을 유지시켜주는 물질을 개발하고자 연구한 결과, 산성환경에서 구리이온을 방출할 수 있도록 구리가 도핑된 생체활성유리나노입자를 개발하였고, 이를 상아질 접착제와 함께 상아질에 적용시, 칼슘 이온, 규산염 이온 및 구리이온을 전달함으로써, 상아질 내 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성이 억제되고, 미세인장 강도가 증가하며, 상아질의 재광화가 유도되는 것을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명의 생체활성유리나노입자는 부피 비율 대비 향상된 표면적, 분해성을 가지며, 중량 당 더 큰 이온 방출 특성을 나타낼 수 있다. 또한, 구리 도핑된 표면 아민화 생체활성 유리나노입자의 느린 분해로 인해 Ca와 Si 이온의 지속적인 방출이 진행되고(도 2 참조), Cu 이온의 방출에 의해 MMP 비활성도가 향상됨을 확인하였다(도 4B 참조). 또한, 상아질-접착제 계면에서 하이드록시아파타이트(HA) 침전이 검출되었음(재광화(remineralization)가 진행)을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 상아질-상아질 접착제 계면에서 MMP 억제(방출된 구리 이온을 통한)와 재광화(칼슘 이온, 규산염 이온 및 구리 이온을 통한)가 동시에 진행되어 수지-상아질 경계면의 내구성이 확보됨을 확인하였다(도 4C 참조). 본 발명은 이에 기초한 것이다.

본 발명에서 사용하는 용어 '생체활성 유리나노입자'란, 생체 조직 내에서 특정 생물학적 작용을 유도할 수 있는 유리나노입자를 의미하는 것으로, 일반적으로 무기물로 구성되는 유리나노입자를 의미한다. 바람직하게는, 상기 생체활성 유리나노입자는, 표면을 아민기로 개질한 표면 아민화된 생체활성 유리나노입자일 수 있다. 표면 아민화된 생체활성 유리나노입자는 아민기를 통하여 접착 수지 내 메타아크릴레이트와 화학적 공유 결합을 할 수 있으며, 이에 따라 접착제 수지 내로 나노생체활성 유리 나노입자가 혼입될 수 있다.

상기 생체활성 유리나노입자는 메조다공성인 것이 바람직하다. 다공성으로 인하여 치수 재생에 도움이 되는 이온의 담지 공간을 추가로 제공할 수 있을 뿐만 아니라 다공성이 아닌 것에 비하여 기계적 강도를 보다 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 ‘구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자’는 생체활성 유리나노입자의 표면 및 기공에 구리 이온이 담지된 생체활성 유리나노입자를 의미한다.

구리 도핑된 표면 아민화 메조다공성 생체활성 유리나노입자(CuBGn)(Si:Cu:Ca=85:10:5, 단위: wt%)를 문헌 [Bari et al., 2017; Lee et al., 2017a; Lee et al., 2017b; Saravanan and Selvamurugan, 2016]에 기재된 대로 졸-겔 합성법에 의해 제조하였다.

일례로, 상기 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 하기의 방법으로 제조될 수 있다:

1) 알칼리 알콜성분에 전구체와 (Ca(NO₃)₂·4H₂O (nBG 용) 또는 Cu(NO₃)₂.3H₂O(Cu-nBG 용)) 헥사데세틸트리메틸 암모늄 브로마이드가 포함된 용액과 테트라에틸 오쏘실리케이트(tetraethyl orthosilicate; TEOS)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;

2) 상기 혼합물을 교반하고 초음파 처리하여 침전물을 제조하는 단계;

3) 상기 침전물을 건조하여 생체활성 유리나노입자를 얻는 단계;

4) 상기 (구리도핑된) 생체활성 유리나노입자를 열처리하여 미반응 화합물을 제거하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 구리 도핑된 생체활성 유리나노입자는 85SiO₂-(15-x)CaO-xCuO(X>0)의 조성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, Si:Cu:Ca=85:10:5의 중량비를 갖는 것일 수 있다.

바람직하게는, 구리 도핑된 생체활성 유리나노입자는 평균 50 nm 내지 85 nm의 작은 입자 크기, 평균 7 nm 내지 9 nm의 균일한 기공 크기와 34 내지 40 m²/g의 높은 비표면적을 가짐으로써, 높은 생체분자 로딩 및 방출 효율을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 표면적이 34.1 m²/g인 아민화 메조포러스 CuBGn(직경: 약 51 nm)을 졸-겔 방법을 사용하여 제조하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 생체활성유리나노입자에 구리이온을 도핑함으로써, 상아질의 MMP의 활성을 현저히 억제하면서 동시에 상아질의 재광화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 상아질 접착제와 함께 사용할 시 상아질과 상아질 접착제의 계면의 강도를 증가시켜 주고, 상아질 접착제의 접착력을 유지시켜 줄 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 구리가 도핑된 생체활성 유리 나노입자 및 광중합성 상아질 접착제를 포함하는 상아질 접착제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상대적으로 큰 표면적을 갖는 메조다공성 생체활성 유리나노입자는 APTES를 사용하여 성공적으로 실란화되어(+20-24 mV) 광중합성 접착제 수지 매트릭스 내로 혼입되었다. 실란처리로 생긴 메조다공성 생체활성 유리나노입자의 아민기 (-NH₃)와 접착제 수지내의 메타크릴레이트와 공유결합을 형성하여 나노입자가 혼입되게 된다.

상기 광중합성 상아질 접착제는 메틸메타크릴레이트(MMP)계 단량체, 접착 단량체 및 광개시 시스템을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

메틸메타크릴레이트(MMP)계 단량체는 메틸메타크릴레이트(methyl methacrylate), 에틸메타크릴레이트(ethyl methacrylate), 이소프로필메타크릴레이드(isopropyl methacrylate), 글리세롤디메타크릴레이트(glycerol dimethacrylate), 글리세롤트리메타크릴레이트(glycerol trimethacrylate), 에틸렌글리세롤디메타크릴레이트(ethyleneglycerol dimethacrylate), 1,3-프로판디올디메타크릴레이드(1,3-propandiol dimethacrylate), 비스페놀 A 디글리시딜 에테르 디메타크릴레이트(Bis-GMA), 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트 (EGDMA), 트리에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(TEGDMA), 에톡실레이트 비스페놀 에이 디메타크릴레이트(Bis-EMA)류 및 우레탄디메타크릴레이트 (UDMA) 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 단량체일 수 있다.

바람직하게는, 비스페놀 A 디글리시딜 에테르 디메타크릴레이트(Bis-GMA)을 사용할 수 있다. Bis-GMA는 경화 후의 높은 강도 등 우수한 물리적 특성 때문에 종래에 치과 접착제용 프리폴리머로 가장 많이 사용되고 있다. Bis-GMA 분자는 두 개의 히드록시기를 갖고 있고, 또한 광중합을 할 수 있는 2개의 메타크릴레이트를 갖는다.

상기 광중합성 상아질 접착제는 치과 수복용 재료 뿐 아니라 치아와의 접착 강도를 동시에 향상시키기 위해서 접착 단량체를 포함할 수 있다.

접착 단량체는 주로 카르복실산과 그 유도체, 인산기, 술폰산기 등의 기능성기를 함유하며, 바람직하게는, 분자 내에 적어도 2개의 카르복실기를 가지는 다관능성 친수성 단량체를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 히드록시에틸 메타크릴레이트, 히드록시프로필 메타크릴레이트 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 친수성 단량체를 사용할 수 있다.

광개시 시스템은 광개시제와 환원제로 이루어져 있다. 광개시제로서는 벤질, 푸릴, 3,3,6,6-테트라메틸시클로헥산디온, 페난트라퀴논, 캄포르퀴논(CQ), 1-페닐-1,2-프로판디온 및 기타 1-아릴-2-알킬-1,2-에탄디온 및 시클릭 알파 디케톤 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 α-디케톤계의 지방족 및 방향족 카르보닐 화합물 광개시제인 캄포르퀴논(camphorquinone, CQ)을 사용할 수 있다.

환원제는 광여기된 CQ에 의해 수소를 빼앗기면 실제로 라디칼 중합을 개시하는 역할을 하며, N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(N,N-dimethylaminoethyl methacrylate, DMAEMA) 또는 에틸 ρ-디메틸 아미노벤조에이트(ethyl ρ-dimethyl aminobenzoate, EDMAB) 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다. 환원제의 함량은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.05 내지 5 중량%가 바람직하다.

광개시제와 환원제의 함량이 너무 적으면 중합속도가 너무 느려 치과 치료에 있어 불편을 야기시킬 수 있고, 함량이 너무 크면 중합속도는 빠르나 거대 분자를 이루기 어려워 물성 저하를 일으키므로 적절한 양을 사용하는 것이 요구된다.

광중합성 상아질 접착제는 혼합물의 점도를 감소시키면서 휘발성이 강하여 치아의 수분 제거에 용이한 희석용매를 추가로 포함할 수 있다. 희석용매로 에틸알콜, 아세톤, 물 등이 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 70 wt%의 비스페놀 A 디글리시딜 에테르 디메타크릴레이트(Bis-GMA), 28.75 wt%의 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 1 wt%의 에틸 N,N-디메틸-4-아미노벤조에이트(EDMAB) 및 0.25 wt% 캄포퀴논(CQ)을 포함하는 광중합성 상아질 접착제 조성물을 사용하였다.

본 발명에서, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 상아질 접착제 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 나노입자의 사용량이 0.1 중량% 미만인 경우 나노입자의 사용 효과가 미약하고, 2 중량%를 초과하면 나노입자의 큰 체적/중량비로 인해 상아질 접착제의 점도가 너무 높은 문제점이 발생할 수 있다.

본 발명의 상아질 접착제 조성물은 α-디케톤계의 지방족 및 방향족 카르보닐 화합물 광개시제와 3급 아민계 환원제를 사용하는 경우 파장 400-500 nm 영역의 인체에 무해한 가시광선을 이용하여 중합 및 경화될 수 있다.

도 6은 실험적 상아질 접착제 중의 나노 첨가제에 의존하는 광경화 후의 FTIR 결과로서, FTIR 결과로부터 나노첨가제 혼입에 상관없이 전환율에는 변화가 없음을 확인하였다.

본 발명의 제3 양태는, 헥사데세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(hexadecetyltrimethyl ammonium bromide; CTAB) 용액에 산화칼슘 전구체, 구리 이온 전구체 및 테트라에틸 오쏘실리케이드(tetraethyl orthosilicate; TEOS)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 상기 혼합물을 교반하고 초음파 처리하여 침전물을 제조하는 단계, 상기 침전물을 건조하여 구리 이온이 생체활성 유리나노입자의 표면 및 기공에 담지된, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 얻는 단계, 및 상기 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 광중합성 접착제 조성물에 혼입하는 단계를 포함하는, 상아질 접착제 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 혼입단계는 상대적으로 큰 표면적을 갖는 메조다공성 생체활성 유리나노입자는 APTES를 사용하여 성공적으로 실란화되어(+20-24 mV) 광중합성 접착제 수지 매트릭스 내로 혼입되는 단계를 포함할 수 있다. 실란처리로 생긴 메조다공성 생체활성 유리나노입자의 아민기 (-NH₃)와 접착제 수지내의 메타크릴레이트와 공유결합을 형성하여 나노입자가 혼입되게 된다.

상기 산화칼슘 전구체는 Ca(NO₃)₂·4H₂O일 수 있으며, 구리 이온 전구체는 Cu(NO₃)₂.3H₂O 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에서, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 광중합성 접착제 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%로 혼입되는 것이 바람직하다

본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제2양태에 따른 조성물을 상아질에 적용하여 칼슘 이온, 규산염 이온 및 구리 이온을 전달함으로써 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 비활성화 및 상아질의 재광화를 유도하는 것을 특징으로 하는 상아질 접착 방법을 제공한다.

본 발명의 상아질 접착제 조성물은 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자에 포함된 Ca, Si 및 Cu 이온을 방출함으로써 내인성 MMP 활성화를 방지하고, 시험관외에서 (생)무기화를 자극하는데 효과적이다.

본 발명의 상아질 접착제 조성물은 구리 도핑된 생체활성 유리나노입자를 포함함으로써, Ca, Si 및 Cu 이온을 상아질-접착제 계면에 전달하여 상아질-접착제 계면에서 MMP 비활성화 및 재광화 효과를 동시에 나타낼 수 있다.

도 1은 NP의 특성화 결과이다: (A) CuBGn의 TEM 이미지 및 EDS 결과 및 (B) BGn의 TEM 이미지 및 EDS 결과는 NP의 조성을 확증한다. (C) 입자 크기, 표면적, 평균 기공 크기, 기공 부피 및 제타 포텐셜 면에서 CuBGn 및 BGn의 특성화.
도 2는 이온 방출, 비세포 생활성 및 수분 재흡수도 및 용해도에 관한 것이다: (A) DW(3 cm²/mL)에서 120 rpm으로 교반하면서 37℃에서 배양하는 동안 ICP-AES로 분석한 CuBGn@DA 또는 BGn@DA 세트 검체로부터 이온 방출 결과(방출량은 [ppm] 및 [μM]로 표시; BGn과 Cu-BGn 간에 유의차가 표시됨(*p<0.05,n=3)). (B-D) SEM, FTIR 및 XRD을 사용하여 시각화 또는 결정된 28일 동안 37℃ SBF에 침지시킨 후의 비세포 생활성: (B) SBF에 침지시킨 CuBGn1%@DA 및 CuBGn2%@DA는 SEM 상으로 표면상에 하이드록시아파타이트(HA) 유사 침전을 나타냈다. 불량하게 결정화된 HA는 (C) FTIR 및 (D) XRD에 의해 확인되었다. (E) 수분 재흡수도 및 용해도는 ISO4049에 따라 측정하였다.
도 3은 hDPSC 분화에서 세포적합성 및 세포 생체 활성에 관한 것이다: hDPSC에 대한 세포적합성에 관한 (A) 미토콘드리아 효소 활성 시험(WST) 결과; 및 (B) 라이브-데드 어세이 결과; hDPSC 분화에서의 세포 생체 활성에 관한 (C) qPCR 및 (D) 알리자린 레드 염색 분석 결과. 다른 문자는 0.05 수준에서 그룹 간의 유의한 차이를 나타낸다. DM: 분화 배지. GM: 성장 배지.
도 4는 상아질에 구리 도핑된 생체활성유리 상아질 접착제 적용 후의 내인성 MMP 비활성화 및 미세인장 강도에 관한 것이다: (A) 상아질(광화된 매트릭스, 적색) 상에 CuBGn(청색) 혼입된 상아질 접착제(녹색)의 성공적인 적용을 나타내는 형광 이미지로서, 복합 수지의 자기형광도는 청색으로 나타났다. (B) 내인성 MMP 활성화도는 37% 인산으로 에칭된 상아질에 상아질 접착제를 적용한 후에 대조군(BGn@DA, DA 및 아세톤(상아질 접착제의 용매))과 비교하여 CuBGn@DA에서 현저하게 감소하였다. (C) NP의 혼입 후에 화학 노화(1 시간 동안 10% NaOCl) 후 미세인장 강도는 유의하게 손상되지 않았다. 다른 문자는 0.05 수준에서 그룹 간의 유의차를 나타낸다.
도 5는 SBF 침지 후 NP@DA 적용 상아질에서의 비세포 생체활성에 관한 SEM (A-F) 및 EDS(G-I) 결과이다. NP@DA를 상아질에 적용하고, 벌크 충전 레진(bulk-fill resin)은 복합 레진-DA-상아질 구조 복합체를 만들기 위해 쌓아올렸다. 상아질-복합 레진 스틱(1 x 1 x 8 mm)을 만들고 SBF (3 cm²/mL)에 14일간 담그기 전에 화학적 에이징을 위해 10% NaOCl을 1시간 처리하였다. 스팟 주변을 포함하는 접착 계면은 SEM을 이용하여 표시하였고(A-F),14일간 SBF에 담그기 전 후의 EDS로 표시(G-I)하였다. C와 F에서 흰색 상자(Dot white box)는 EDS 분석을 위한 지점을 나타낸다. HA 유사침전은 14일간 SBF 인큐베이션 후에 CuBGn2%@DA가 삽입된 혼성층(hybrid layer)에서 EDS에 의해 관찰되었으나, DA가 삽입된 혼성층에서는 관찰되지 않았다.
도 6은 실험적 상아질 접착제 중의 나노 첨가제에 의존하는 광경화 후의 FTIR 결과로서, FTIR 결과로부터 나노첨가제 혼입에 상관없이 전환율에는 변화가 없었다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

모든 화학 물질은 다른 기재가 없는 한 Sigma Aldrich Chemical Co.에서 구입하여 수령한 그대로 사용했다.

구리 도핑된 메조다공성 생체활성 유리나노입자의 제조

구리 도핑된 표면 아민화 메조다공성 생체활성 유리나노입자(CuBGn)(Si:Cu:Ca=85:10:5, 단위: wt%)를 문헌 [Bari et al., 2017; Lee et al., 2017a; Lee et al., 2017b; Saravanan and Selvamurugan, 2016]에 기재된 대로 졸-겔 합성법에 의해 제조하였다.

구체적으로, 33.3 mg/ml 의 구조 유도물질(structure directing agent) 및 nBG용 전구체로서 1.26 mg/ml 의 Ca(NO₃)₂·4H₂O를 포함하거나, 또는 3.3 mg/ml의 구조유도물질, Cu-nBG 용 전구체로서 0.42 mg/ml의 Ca(NO₃)₂·4H₂O 및 0.61 mg/ml of Cu(NO₃)₂.3H₂O를 포함하는 알칼리 알코올 용액을 준비하였다. 계면 활성제로서 헥사데세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB), 촉매로서 암모니아수 및 전구체로서 질산칼슘 4수화물을 사용하였다. 상기 혼합물을 격렬히 교반한 후(30 분), 상기 알칼리 알코올 용액에 29.5 mg/ml 의 테트라에틸 오쏘실리케이트(TEOS)의 알코올 용액을 첨가하고, 결렬히 교반한 후, 초음파 처리하였다. 산화 칼슘(CaO) 대 이산화규소(SiO₂)의 몰비는 15:85로 설정되었다. 겔 상태의 백색 침전물을 얻고, 여과하고, 순수로 세척하고, 60 ℃에서 24 시간 동안 공기 중에서 건조시켰다. 침전물을 1℃?/분의 속도로 600℃까지 가열하여 남아있는 CTAB를 제거하고, 샘플을 공기 중 600℃?에서 5 시간 동안 최종 소성시켰다. 에탄올 및 탈이온수(DW)로 세척한 후, 70°C에서 밤새 건조시켜 메조다공성 생체활성 유리나노입자(MBN) 및 구리이온이 도핑된 메조다공성 생체활성 유리나노입자를 수득하였다. 이후 합성 후 절차를 통해 -NH₂ 기로 표면 기능화하였다. 간단히 말하면, 0.2 % w/v의 MBN을 무수 톨루엔에 분산시키고, 3 % APTES와 함께 교반하면서 24 시간 동안 환류시켰다(N₂). 이어서, NH₂-작용화된 나노 입자를 원심 분리에 의해 수집하고, 톨루엔으로 세척하고, 마지막으로 80 ℃에서 진공하에 24 시간 동안 건조시켜 표면아민화된 생체활성 유리나노입자를 수득하였다.

실시예 1: 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 혼입한 상아질 접착제(CuBGn@DA) 조성물의 제조

70 wt%의 비스페놀 A 디글리시딜 에테르 디메타크릴레이트(Bis-GMA), 28.75 wt%의 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 1 wt%의 에틸 N,N-디메틸-4-아미노벤조에이트(EDMAB) 및 0.25 wt% 캄포르퀴논(CQ)을 포함하는 광중합성 접착제(Kim et al., Biomaterials 31:6618-6627)에, 제조한 나노입자(CuBGn)를 2 wt%까지 혼입시켜 구리 도핑된 생체활성 유리나노입자를 혼입한 상아질 접착제(CuBGn@DA) 조성물를 제조하였다.

실험예 1: 나노입자의 특성화

투과 전자 현미경(TEM, 7100, JEOL, USA)과 에너지 분산 X-선 분광기(EDS, Inca 300, Oxford, Abingdon, UK)를 사용하여 나노입자의 형태와 요소를 분석하였다. 나노입자의 표면적, 기공 크기 및 기공 부피는 전술한 바와 같이 계산하였다(Lee 등, 2017b)

졸-겔 경로를 통해 합성된 표면 아민화 CuBGn은 TEM 이미지(도 1A)에서 볼 수 있는 바와 같이, BGn에 필적하는 연충형(worm-like) 메조다공성 구조를 갖는 약 60 nm 크기의 나노구 형태였다. 삽도로 보여진 EDS 결과 CuBGn(Si:Cu:Ca=85.8±0.8:9.6±0.8:4.6±1.1, 단위: wt%)의 중량비는 10 wt% CuBGn의 경우 초기에 설계된 입자(Si:Cu:Ca=85:10:5, 단위: wt%)와 잘 일치되었다. 반면, BGn의 Si:Ca 중량비는 85.5±1.3:14.5±1.3이었다.

도 1C는 사이즈 및 메조기공 특성을 요약한 것으로, 표면 아민화 CuBGn의 입자 크기는 50.6 ± 4.9 nm이고, 표면적이 34.1 m²/g이고, 기공부피가 0.060 ± 0.003 cm³/g이고, 및 평균기공크기가 약 7.0 nm이었다. 반면, 표면 아민화 BGn는 상대적으로 높은 입자 크기(85.4±7.2), 표면적(39.7 m²/g) 및 기공부피(0.084 ± 0.004 cm³/g), 및 평균 기공 크기(약 8.8 nm)를 나타냈다.

제타 포텐셜로 측정된 나노입자 표면 전하는 표면 아민화로 인해 값이 양이다(CuBGn: 24.2 ± 0.94 mV, BGn: 20.2 ± 0.71 mV).

실험예 2: 이온 방출, 비세포 생체활성 , 및 수분 재흡수도 및 용해도

수지 매트릭스, 나노입자(0, 0.5, 1 또는 2 wt%) 및 캄포르퀴논(0.25 wt%)로 구성된 디스크형 상아질 접착제 시편을 제조하고, 37 ℃에서 28 일 동안 탈이온수(DW) 또는 SBF 용액에 침지시키고 DA에 NP를 혼입시켜 시편을 제조한 후에 이온 방출 거동 및 생체 활성을 평가하였다.

먼저, LED 경화 건(Litex 695, Dentamerica Industry, 40 초)을 사용하여 접착 디스크 시편(φ = 10 mm 및 h = 2 mm)을 준비하고 최대 800 grit SiC paper로 연마했다. 시험편을 탈이온수(DW, 3 cm²/mL)에 담갔다.

상층액을 모으고 DW를 신선한 DW로 연속적으로 교체한 후 유도 결합 플라스마 원자 방출 분광기(Optima 4300 DV, PerkinElmer, n = 3)를 사용하여 방출된 이온(Ca, Si, Cu)을 미리 결정된 시간에 분석하였다.

SBF를 신선한 SBF로 연속적으로 교체하며 디스크 시편을 28 일 동안 pH 7.4, 37℃?에서 의사체액(SBF, 3 cm²/mL)에서 배양하고, 표면을 주사 전자 현미경(SEM, 시그마 500, ZEISS), X-선 회절기(XRD, Danvers, MA, USA, 2

= 5-70°, 2° min^-1) 및 감쇠전반사 푸리에 변환 적외선(FT-IR, Perkin-Elmer)으로 조사하여 비세포 생체활성을 측정하였다((Lee et al., 2017a; Lee et al., 2017b).

CuBGn과 BGn은 각각 BGn@DA와 CuBGn@DA라는 실험용 DA에 통합되었으며, 세트 BGn@DA와 CuBGn@DA 디스크는 NP의 느린 분해로 인해 28 일에 걸쳐 Ca와 Si 이온의 지속적인 방출을 일으켰다. 방출된 이온의 총량은 NP 혼입량(최대 2%)에 달려있다. CuBGn@DA는 28 일 동안 0.5 ppm의 Cu 이온을 방출하였으며, 이는 MMP 비활성화의 유효 범위에 있었다.

CuBGn2%@DA 및 BGn2%@DA는 SBF 용액 침지하에 생체 활성을 나타냈다. 불량하게 결정화된 HA가 표면에 침전된 것을, FTIR 및 XRD를 사용하여 확인하였다(도 2B-D). FTIR(도 6)에 의해 밝혀진 바와 같이 상아질 접착제에 나노입자를 혼입하여도 광경화(40초)로부터의 변환 정도에 악영향을 미치지 않았다.

세트 시편으로부터 방출된 이온(규산염: 'Si', 칼슘: 'Ca' 및 구리: ‘Cu’)을 ICP-AES(도 2A)를 사용하여 분석하였다. CuBGn2%@DA 및 BGn2%@DA의 규산염 이온 방출은 시험 기간 동안 비슷한 수준으로 진행되었으며 비슷한 총 방출량(약 1.7ppm)을 나타냈다. 칼슘 이온은 BGn2%@DA보다 CuBGn2%@DA에서 더 천천히 방출되었으며, CuBGn으로부터 방출된 전체 칼슘 이온량은 BGn2%@DA(약 0.8ppm 대 1.7ppm)에서 방출된 양의 거의 절반이었다. 전체 구리 이온 방출량은 CuBGn@DA만으로 약 0.5 ppm이었고 시험 기간 동안 완만한 방출 패턴을 보였다.

시편을 SBF에서 28 일 배양한 후 SEM을 사용하여 표면 형태를 시각화했다. 대조군(DA)에 비해 CuBGn1%@DA 및 CuBGn2%@DA의 표면 상에 HA 형 결정 형태가 관찰되었고, CuBGn2%@DA가 CuBGn1%@DA보다 우수하였다. CuBGn(Si-O-Si)와 상아질 접착제(DA)를 나타내는 FT-IR 피크는 CuBGn0.5%@DA, CuBGn1%@DA 1 및 CuBGn2%@DA에서도 관찰되었고, 혼입량에 따라 CuBGn 관련 피크의 강도가 더 향상되었다(도 2C).

CuBGn2%@DA을 28-일 SBF 침지 후에 HA로 구성되는 탄산염 및 인산염 피크가 새로 검출되었다(도 2C). XRD 분석 결과 XRD 피크(별표)의 라이브러리에서 HA 피크로부터 추론되는, 28-일 SBF-배양 CuBGn2%@DA 상에 불량하게 결정화된 아파타이트의 형성을 확인했다(도 2D). SBF 침지 이전의 CuBGn2%@DA의 XRD 패턴은 2

=10-40°에서 넓은 비정질 피크를 나타냈다.

상아질 접착제(DA)에 나노입자 혼입시, 분해성 나노입자의 비정상적인 용해 및 그에 따른 수분 재흡수가 발생했는지를 결정하기 위해, 수분 재흡수도 및 용해도를 평가하였다. 수분 재흡수도 및 용해도는 디스크 시편(φ=15 mm, h=1.0 mm)을 사용하여 ISO 4049:2009에 따라 측정하였다. 그 결과, 나노입자 혼입 상아질 접착제는 대조군(DA)(재흡수도(60 μg/mm²) 및 용해도(-6.8μg/mm²))과 유사한 수분 재흡수도(65-70 μg/mm²) 및 용해도(-(8-13) μg/mm²)를 나타냈다(도 2E).

실험예 3: 세포적합성 시험 및 시험관외 치조생성 분석

인간 치수 줄기 세포(hDPSC)에 대한 세포 독성 시험을 ISO 표준(ISO-10993-5: 2009)에 따라 수행하였다. ISO 표준(ISO 10993-12 : 2012)에 따라 DW에서 24 시간 동안 추출물(3 cm²/mL)을 얻었다. 추출물 또는 DW에서 연속 희석된 추출물을 2x 배양 배지를 이용하여 24 시간 동안 부착 세포에 첨가하였다. WST 분석과 라이브/데드 분석을 수행하였다. 세포 배양, WST 분석, 라이브/데드 분석법은 공지된 문헌에 기재된 대로 수행하였다(Jun et al., 2017b). qPCR 및 알리자린 레드 염색 분석을 공지된 문헌에 기재된 대로 수행하였다(Castillo Diaz et al., 2016; Lee et al., 2017a; LoGuidice et al., 2016).

미토콘드리아 효소 활성 시험(WST 시험) 및 라이브/데드 염색법을 이용하여 hDPSC에 대한 세포적합성을 측정한 결과 대조군(DA)에 비해 NPs@DA에서 현저하게 감소한 것으로 나타났다.

상아질 접착제의 추출물과 접촉하는, 치수(pulp)의 주요 세포 유형인 hDPSC와의 세포 적합성을 치수 조직에 대한 초기 생체 적합성 시험으로 평가하였다.

hDPSC를 NP@DA로 처리했을 때 50% 상아질 접착제 추출물의 세포 생존율은 다음 순서:CuBGn2%=1%=0.5%>BGn2%>CuBGn0%@DA 로 현저하게 향상되었다. 이를 라이브/데드 이미지로 시각화하였다(도 3A 및 3B, p<0.05).

25% 상아질 접착제 추출물 처리는 대조군(DA)과 비교하여 세포 생존력에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.

hDPSC를 치성 분화 배지에서 세포 독성이 없는 25% 상아질 접착제 추출물로 배양하고, Col1a, DMP-1, DSPP 및 OCN과 같은 치성 유전자 마커를 평가하였다. 일반적으로, 유전자 발현의 순서는 BGn2%@DA, CuBGn2%@DA, DA, 분화 배지 및 성장 배지의 내림차순으로 관찰되었다(도 3C). DA와 비교하여 CuBGn2%@DA 및 BGn2%@DA에서 모든 유형의 유전자 발현이 유의하게 증가했다(p<0.05). ARS 염색 결과 대조군(DA)에 비해 CuBGn2%@DA 및 BGn2%@DA에서 적색 염색이 현저히 높았으며, 이로부터 대조군(DA)보다 CuBGn2%@DA 및 BGn2%@DA의 광화도(degree of mineralization)가 높음을 확인하였다(도 3D).

통계적 분석

데이터는 적어도 세번의 독립 실험의 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 통계적 유의성은 SPSS(버전 21.0; SPSS, Chicago, IL)에서 Tukey의 post hoc test로 편도 분석을 사용하여 0.05 수준에서 평가되었다. Fisher's exact test를 사용하여 실험 그룹과 실패 모드 사이의 관계를 평가하였다.

실험예 4: 혼성층에 NP 혼입, MMP 비활성화, 미세인장 및 재광화 테스트

12시간 동안 염색액(10 mg/mL) 중 7-아미노-4-메틸-3-쿠마리닐아세트산을 적재한 CuBGn을 플루오레신 이소티오시아네이트 이성질체(1 mg/mL) 혼입 상아질 접착제(DA)-아세톤 혼합물(1:1 부피%)과 혼합하고, 상아질(5 x 5 x 2 mm)에 적용하고, 37% 인산 겔(3M Scotchbond, 15 초)로 처리하고, DW(20 초)로 헹구고, 에어 건(20 초)으로 건조시켰다(Hass et al., 2016; Klinger-Strobel et al., 2016).

상아질 접착제(CuBGn@DA)를 광경화(20 초, Litex 695)시켜 중합한 후, 무기화된 매트릭스를 크실레놀 오렌지(0.5 중량% 크실레놀 오렌지 용액, 24 시간)로 염색하고 (Profeta et al., 2013), 형광 이미지를 공촛점 현미경으로 수득하였다(LSM 700, 칼 자이스 혈구).

매트릭스 결합된 MMP로부터 총 MMP 활성(MMP-1, 2, 3, 7, 8, 9, 12, 13, 및 14 등의 MMP family)을 결정하기 위해, 인간 상아질 빔(beam)(2 x 1 x 6)을 상기와 동일한 방식으로 에칭으로부터 광경화까지 처리하였다. 에칭된 빔을 96-웰 플레이트에서 교반(1 분) 후 5 분 동안 100μL의 아세톤(50%) 또는 실험용 접착제-아세톤 혼합물(1:1 부피%)로 처리하였다.

상아질 빔을 200μL의 일반 MMP 매트릭스(AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA)에 1 시간 동안 25℃에서 노출시킨 후 빔(n = 10)의 총 MMP 활성을 이전에 발표된 방법(Sabatini et al., 2014)에 따라 측정하였다. 실험용 접착제(20μL)를 에칭된(10μL, 20 초) 상아질에 도포하고 광경화(20 초)시키고 수지를 결합시켰다.

구리 도핑된 생체활성 유리나노입자 혼입 상아질 접착제(CuBGn@DA)로부터 방출된 Cu 이온의 유리한 효과를 조사하기 위해 MMP 활성을 측정하였다. 그 결과, 상아질 구조물에 상아질 접착제(CuBGn2%@DA) 침투가 확인되었다(도 4A). 상아질 접착제는 에칭 후 상아질에 적용되었고 청색 염료가 혼입된 CuBGn은 상아질과 상아질 세관을 나타내는 광화된 매트릭스(mineralized matrix) (적색)에 침투한 상아질 접착제(녹색)에서 균일하게 관찰되었다.

CuBGn@DA로부터의 일반적인 MMP 비활성화도 평가되었다. CuBGn2%@DA는 대조군(DA) 및 BGn2%@DA와 비교하여 총 MMP 비활성화를 유의하게 증가시켰다(도 4B, p<0.05). MMP 비활성화는 상아질 접착제에 CuBGn을 혼입함에 따라 증가하였고, 2% 이상의 혼입은 MMP 억제를 추가로 증가시킬 것으로 예상되었다. 그러나, 실험용 상아질 접착제 조성물 하에서는 나노입자의 큰 체적/중량비로 인해 상아질 접착제의 점도가 증가하기 때문에 최대 배합량으로 2%를 선택하였다.

라텍스 몰드(6 x 6 x 4 mm)와 광경화(20 s)를 사용하여 벌크 충전된 수지(Venus, Heraeus Kulzer, Germany)를 접착제 처리된 상아질에 적용했다. 상아질 스틱(1 x 1 x 8 mm, n = 16)을 만들고, 미세인장 테스트를 미세인장 시험기(Bisco, USA)을 사용하여 전술한 대로(Park et al., 2010) 1 mm/min의 속도로 수행했다.

화학적으로 에이징된(NaOCl, 10%, 1 시간) NP@DA-상아질 복합체에서 미세인장의 유의미한 감소는 관찰되지 않았다(도 4C, p>0.05). 실패 모드는 혼합 또는 접착 불량으로만 관찰되었으며, 그룹간에 실패에는 유의미한 차이가 없었다(p>0.05).

상아질 스틱을 화학적 에이징 조건(NaOCl 10 %, 1 시간)에서 배양하고(Garbui et al., 2012), 접착제 처리된 상아질의 재광화를 조사하기 위해 SBF 용액으로 14 일간 재배양하였다. SEM을 이용하여 상아질의 재광화를 관찰하였다. 모든 충치가 없는 인간의 치아는 기관 검토위원회(IRB 번호 H-1407/009/004)의 승인을 받아 제3대구치에서 수집하였다(Jun et al., 2017a).

실험예 5: 상아질-접착제 계면의 재광화

NP@DA-상아질 복합체를 화학적 에이징시키고 SBF에 침지시킨 후 생체 활성을 측정하였다.

구체적으로, NP@DA을 상아질에 적용하였고, 벌크 충진 수지를 쌓아 올려 복합 수지-상아질 접착제-상아질 구조의 복합체를 만들었다. 상아질 복합체 수지 스틱(1 x 1 x 8 mm)을 제조하고 1 시간 동안 10% NaOCl로 처리한 후 14 일 까지 SBF 침지시켰다(3 cm²/mL). 스폿 주변을 포함한 접착제 계면을 SBF 침지 전후에 (A-F) SEM 및 (G-I) EDS를 사용하여 14 일 동안 특성화하였다. CuBGn2%@DA-상아질 복합체는 14 일간의 배양 후에 BGn2%@DA-상아질과 유사한(그러나 더 적은) HA 형 결정 형태를 혼성층에 나타냈다(도 5).

도 5는 SBF 침지 후 NP@DA 적용 상아질에서의 비세포 생체활성을 나타낸다. C와 F의 점 흰색 상자(Dot white box)는 EDS 분석을 위한 지점을 나타낸다. SBF 배양 14 일 후에 CuBGn2%@DA 혼입 혼성층에서 HA 유사 침전이 관찰되었고 EDS 분석에 의해 결정되었으나 상아질 접착제 혼입 혼성층에서는 관찰되지 않았다.

EDS 분석 결과 CuBGn2%@DA-혼성층 내 HA 형 결정 조성의 Ca:P 비(%)는 SBF 배양 이전 1.28±0.21(도 5G)에서 SBF 배양 이후 상아질 접착제-혼성층이 없는 HA(약 1.67)와 유사하게 1.63±0.12(도 5I)로 변경되었다.

SBF 침지 전 CuBGn2%@DA-혼성층(5.54±0.90) 및 SBF 침지 후 상아질 접착제-혼성층(4.41±0.67) 모두에서 C:Ca 비(%)는 유사하게 검출된 반면, SBF 침지후 CuBGn2%@DA-혼성층은 현저히 낮은 값 0.22±0.05을 나타냈다.

따라서, 상아질-접착제 계면에서 재광화가 진행되었음을 알 수 있기에, 상아질-접착제 계면에 미세누출이 생길 경우 이를 재광화로 막아주게 될 수 있다. 이러한 성질은, 상아질-접착제 계면 실패를 막아, 접착제의 임상적 성공률을 높여줄 수 있다.

Claims (12)

1. 산성환경에서 구리 이온을 방출할 수 있도록 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 포함하는, 상아질 및 상아질 접착제 계면의 강도 증진 및 접착력 유지용 조성물.
   
2. 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자 및 광중합성 상아질 접착제를 포함하는, 상아질 접착제 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 85SiO₂-(15-x)CaO-xCuO(X>0)의 조성을 갖는 것인, 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 표면 아민화된 것인, 조성물.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 50 nm 내지 85 nm의 평균 입자 크기, 7nm 내지 9 nm의 평균 기공 크기, 및 34 내지 40 m²/g의 비표면적을 갖는 것인, 조성물.
   
6. 제2항에 있어서, 상기 광중합성 상아질 접착제는 메틸메타크릴레이트(MMP)계 단량체, 접착 단량체 및 광개시 시스템을 포함하는 것인, 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 메틸메타크릴레이트계 단량체는 비스페놀 A 디글리시딜 에테르 디메타크릴레이트(Bis-GMA)인 것인, 조성물.
   
8. 제6항에 있어서, 접착 단량체는 히드록시에틸 메타크릴레이트, 히드록시프로필 메타크릴레이트 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 조성물.
   
9. 제2항에 있어서, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 상아질 접착제 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%로 포함되는 것인, 조성물.
   
10. 헥사데세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(hexadecetyltrimethyl ammonium bromide; CTAB) 용액에 산화칼슘 전구체, 구리 이온 전구체 및 테트라에틸 오쏘실리케이트(tetraethyl orthosilicate; TEOS)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 혼합물을 교반하고 초음파 처리하여 침전물을 제조하는 단계;
    상기 침전물을 건조하여 구리 이온이 생체활성 유리나노입자의 표면 및 기공에 담지된, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 얻는 단계; 및
    상기 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자를 광중합성 접착제 조성물에 혼입하는 단계를 포함하는, 상아질 접착제 조성물의 제조방법.
    
11. 제10항에 있어서, 구리가 도핑된 생체활성 유리나노입자는 광중합성 접착제 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%로 혼입되는 것인, 제조방법.
    
12. 제2항에 따른 조성물을 상아질에 적용하여 칼슘 이온, 규산염 이온 및 구리 이온을 전달함으로써 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 비활성화 및 상아질의 재광화를 유도하는, 상아질 접착 방법.
    
    

Images