KR20230058307A

KR20230058307A - 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 포함하는 분산제 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20230058307A
Application number: KR1020220137413A
Authority: KR
Inventors: 유상호; 박상동; 윤혜지
Original assignee: 세종대학교산학협력단
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-05-03

Abstract

본 발명에서는 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 포함하는 새로운 분산제 및 이의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서는 자당을 기질로 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소를 반응시켜 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 얻는 단계를 포함하는 분산제 제조 방법 및 이로부터 제조된 분산제를 제공한다.

Description

알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 포함하는 분산제 및 이의 제조방법 {DISPERSING AGENT CONTAINING ALPHA-1,4-1,6-GLUCAN POLYMER AND METHOD FOR PREPARING THEREOF}

본 발명은 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 포함하는 분산제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

다당류는 살아있는 시스템에서 가장 풍부하게 존재하는 거대 분자 중 하나이며, 세포벽의 구성 요소이자, 수송, 접착, 면역 반응 및 에너지 저장과 같은 다양한 기능을 갖고 있다. 글리코겐은 박테리아, 균류, 동물 및 식물에 있는 포도당 저장소의 과분지형 호모다당류이다. 천연 자원에서 분리된 글리코겐은 약 10⁷-10⁹g /mol의 분자량을 가지며, 알파-1,4-1,6-글리코시드 결합으로 연결된 D-포도당 잔기의 사슬 골격으로 구성된다.

글리코겐의 구성은 다른 하이드로콜로이드에 비해 생체 적합성, 생분해성 및 수용성이 매우 높은 장점이 있으나, 일반적으로 동물 조직의 글리코겐 함량이 매우 낮으며, 동물 조직에서 글리코겐을 추출하는 것이 비경제적이다. 따라서 동물 유래 글리코겐을 생산하는 데는 한계가 있으므로 다양한 합성 방법이 연구되어 왔으며, 아밀로수크라아제와 글리코겐분지효소를 이용하여 전술한 알파-1,4-1,6-글리코시드 결합을 갖는 글리코겐과 유사한 입자를 제조할 수 있다.

한편, 현재 난용성 물질을 가용화하는 방법으로는 유화제 또는 계면활성제를 사용하는 방법, 환상형 글루칸 구조체, 예를 들면 싸이클로덱스트린 등을 사용하여 포접하는 방법, 하이드로트로프를 사용하여 용해도를 증진시키는 방법, 리포좀 등의 지질 나노입자를 제조하는 방법 등이 사용되고 있다.

그러나, 유화제나 계면활성제는 인체에 유해하거나 환경오염을 유발할 가능성이 크고, 싸이클로덱스트린이나 지질 나노입자는 결합체의 크기가 커서 피부 통과 등에 불리하며 결합체에서 용출되지 않으면 물질의 기능 발휘가 어려운 단점이 있고, 하이드로트로프를 사용하여 용해도를 증진시키는 방법은 물질 자체의 기능을 발휘할 수 있으나 용해하고자 하는 물질에 따라 용해 효율성이 그리 높지 않을 수 있다는 단점이 있다. 또한, 수용액 상에서 분말이 분산되어 형성된 입자 상태에는 상기 방법들을 선택적으로 적용하더라도 효과적으로 용해하기 어렵다.

따라서, 새롭고 효과적인 분산제의 발명이 절실하며, 이에 본 발명에서는 상기 효소 반응을 이용하여 난용성 물질을 분산시킬 수 있는 글리코겐유사입자를 생성하고, 이를 사용하는 분산제 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.

한국등록특허 제0956430호

본 발명은 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 포함하는, 친환경적이고 우수한 분산제 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 기질인 자당을 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소와 반응시켜 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 얻는 단계를 포함하는 분산제의 제조 방법.

2. 위 1에 있어서, 상기 아밀로수크라아제는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인 분산제의 제조 방법.

3. 위 1에 있어서, 상기 글리코겐분지효소는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인 분산제의 제조 방법.

4. 위 1에 있어서, 상기 아밀로수크라아제와 글리코겐분지효소의 활성 비율은 1: 5 내지 10인, 분산제 제조방법.

5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 분산제.

본 발명의 분산제 제조 방법을 통해 동물 유래 글리코겐과 비교하여 생산이 용이한 분산제를 제조할 수 있다.

본 발명의 분산제 제조 방법을 통해 제조된 분산제는 분산능이 뛰어나고 친환경적인 원료로 이루어져 식품 산업 등에 활용될 수 있다.

도 1은 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머의 알파-1,4 및 알파-1,6 글리코사이드 결합을 나타낸다.
도 2는 아밀로수크라아제와 글리코겐분지효소를 동시에 적용하여 GLPs를 제조하는 방법을 도식화한 것이다.
도 3a 및 3b는 Np/VvGLP의 가지 사슬 길이의 분포를 나타낸 것이다. 도 3a의 (A)는 r1; (B)는 r2; (C)는 r3; (D)는 r4; (E)는 r5; (F)는 r6인 경우의 가지 사슬 길이의 분포이며, 도 3b의 (G)는 r7; (H)는 r8; (I)는 r9; (J)는 r10; (K)는 oyster glycogen을 사용한 경우의 가지 사슬 길이의 분포이다.
도 4는 동적 점도와 Np/VvGLP 용액의 농도 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Np/VvGLP 용액(1%, w/v)의 외관 및 탁도를 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는 Np/VvGLP 용액의 농도와 점도 사이의 관계를 나타낸 것이다. 도 6a의 (A)는 r1; (B)는 r2; (C)은 r3; (D)는 r4; (E)는 r5; (F)는 r6 가 사용된 그래프이며, 도 6b의 (G)는 r7; (H)는 r8; (I)은 r9; (J)는 r10 가 사용된 그래프이다.
도 7은 커큐민과 Np/VvGLP 혼합물의 시간(h) 경과에 따른 외관을 나타낸 것이다.
도 8은 혼합 용액에서 본 발명의 GLPs(NpAS/VvGBE)의 커큐민 보유 능력을 나타낸 그래프이다.
도 9는 혼합 용액에서 본 발명의 GLPs(NpAS/VvGBE)의 쌀 전분 보유 능력을 나타낸 그래프이다.
도 10은 혼합 용액에서 본 발명의 GLPs(BtAS/BtGBE)의 쌀 전분 보유 능력을 나타낸 그래프이다.
도 11은 혼합 용액에서 본 발명의 GLPs(BtAS/RoGBE)의 쌀 전분 보유 능력을 나타낸 그래프이다.
도 12는 혼합 용액에서 본 발명의 GLPs(NsAs/RoGBE)의 쌀 전분 보유 능력을 나타낸 그래프이다.
도 13은 혼합 용액에서 본 발명의 GLPs(NsAS/BtGBE)의 쌀 전분 보유 능력을 나타낸 그래프이다.
도 8 내지 13에서 ■은 GLP r5 50%; △은 GLP r5 30%; ▼은 GLP r5 10%; ○은 GLP r5 1%; ●은 증류수 조건을 의미한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기질인 자당을 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소와 반응시켜 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 얻는 단계를 포함하는 분산제 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머는 포도당 단위체들의 알파-1,4 및 알파-1,6 글리코사이드 결합으로 이루어진 폴리머로, 자당에 아밀로수크라아제와 글리코겐분지효소를 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 알파-1,4 글리코사이드 결합은 선형 글루칸 폴리머가 형성되도록 하고, 알파-1,6 글리코사이드 결합은 선형 글루칸의 내부 포도당 단위체와 다른 선형 글루칸의 포도당 단위체와의 결합으로, 선형 글루칸에 분지가 형성되도록 한다.

또한, 선형 글루칸에 형성된 분지에 또 다른 선형 글루칸이 결합할 수 있으며, 이에 따라 다수의 곁가지를 가진 알파-1,4-1,6 글루칸 폴리머가 형성될 수 있다. 도 1에서 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머의 알파-1,4 및 알파-1,6 글리코사이드 결합을 도식화하였으며, 도 2에서 알파-1,4-1,6 글루칸 폴리머의 형성 과정을 개략도로 나타내었다.

상기 글루칸은 디 글루코스(D-glucose)로 된 다당류의 총칭이며, 전분, 글리코겐, 셀롤로스, 덱스트란, 리그닌 등을 포함한다. 즉, 본 발명의 글루칸 폴리머는 글루칸이 중합되어 연결되어 있는 고분자를 의미한다.

상기 분산제는, 분말가루 등을 액체 속에 분산·현탁시켜 사용할 때, 적절한 적심성을 갖게 하고 입자를 고르게 분산시키며 또한 시험체가 부식이 되지 않도록 하기 위하여 수성 현탁액에 넣는 첨가제를 의미한다.

구체적으로, 본 발명의 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머는, 구조상 많은 수의 히드록실 그룹을 가지므로 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머 자체의 용해도가 높지만, 옥시-탄소 고리 구조는 소수성이며, 따라서 이러한 고분자 구조에서 분자의 상당 부분이 글루칸 나선 구조의 내부 공간과 같은 소수성 환경을 제공한다. 또한, 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머의 분지된 구조가 덴드리머형 폴리머와 같은 내부 빈 공간이 가져 기능성 물질을 포획하는 캐리어 역할을 할 수 있다.

즉, 상기 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머는 용액 내 폴리머의 네트워킹 매트릭스 구조를 형성하고, 난용성 물질을 상기 매트릭스 구조의 내부 및 사이에 가둘 수 있다.

상기 난용성 물질의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 본 발명의 분산제는 환경친화적인 원료로 만들어지므로 의약품, 화장품, 식품 첨가물 등에 사용될 수 있다. 상기 난용성은 수난용성일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "GLP"는 글리코겐유사입자(Glycogen-like particles)의 약어로, 즉 전술한 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 의미한다.

상기 아밀로수크라아제는 자당을 기질로 하여 자당을 포도당과 과당으로 가수분해한 다음, 다른 알파 1,4 결합을 가지고 있는 수용체 물질에 포도당을 전이시켜주는 효소로써 불용성 또는 수용성 다당체를 생산하며, 본 명세서에서 용어 "AS"는 달리 나타내지 않는 한 아밀로수크라아제를 뜻한다.

상기 아밀로수크라아제는 예를 들어 Neisseria polysaccharea(Np), Bifidobacterium thermophilum(Bt) 또는 Neisseria subflava(Ns)에서 유래한 것일 수 있다.

구체적으로 상기 아밀로수크라아제는 서열번호 1(Np), 서열번호 2(Bt), 서열번호 3(Ns) 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 글리코겐분지효소는 알파 1,4 결합을 가지는 직쇄형의 글루칸을 가수분해하여 수용체 물질에 알파 1,6 결합으로 전이시켜주는 효소이고, 본 명세서에서 용어 "GBE"는 달리 나타내지 않는 한 글리코겐분지효소를 뜻한다.

분지 효소에는 전분 분지 효소(SBE) 및 글리코겐 분지 효소(GBE)가 있으며, 두 효소 모두 알파-1,4-글루칸 결합을 절단하여 알파-1,6-글루칸 결합을 형성하나, GBE의 생성물은 SBE를 사용한 생성물에 비해 짧은 사슬이 많고 촘촘한 가지를 만드는 경향이 있으며, 본 발명에서는 GBE를 사용한다.

상기 글리코겐분지효소는 예를 들면 Rhodothermus obamensis(Ro), Deinococcus geothermalis(Dg), Bifidobacterium thermophilum(Bt), Synechocytis 또는 Vibrio vulnificus(Vv)에서 유래한 것일 수 있다.

구체적으로 상기 글리코겐분지효소는 서열번호 4(Vv), 서열번호 5(Ro), 서열번호 6(Bt) 중 어느 한 항의 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 기질인 자당과 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소를 반응시키는 시간, 온도 및 pH 조건 등은 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

상기 반응 온도는 25 내지 50℃, 30 내지 50℃, 40 내지 55℃ 또는 30 내지 45℃일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 기질인 자당과 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소의 반응 시간은 10시간, 20시간, 30시간, 40시간 이상, 50시간 이하, 60시간 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제조된 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머는 평균 분자량이 1 x 10⁵내지 1 x 10⁷ g/mol, 1 x 10⁵내지 1 x 10⁶ g/mol 또는 1 x 10⁵내지 5 x 10⁵ g/mol 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소는 기질인 자당에 동시 처리되어 단일공정으로(one-pot synthesis) 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 제조하는 것일 수 있다.

상기 반응에서 아밀로수크라아제와 글리코겐 분지효소의 효소 활성 비율을 조절함으로써, 제조되는 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머의 구조를 조절할 수 있다. 예를 들면, 아밀로수크라아제에 대하여 글리코겐분지효소의 활성 비율을 증가시킴으로써 입자 크기가 더 작고, 분자량이 더 높고, 입자의 밀도가 더 높고, 짧은 길이의 분지의 비율이 증가한 알파-1,4-1,6-글루칸을 제조할 수 있다. 상기 짧은 길이의 분지는 분지의 중합도(Degree of polymerization, DP)가 5이하인 것일 수 있다.

예를 들면 아밀로수크라아제와 글리코겐분지효소의 활성 비율은 1: 1 내지 10일 수 있고, 구체적으로 1: 5 내지 10일 수 있다.

상기 효소 활성 단위는 1U(μmol/min)로 정의할 수 있고, 이는 분석 방법의 특정 조건에서 분당 기질 1마이크로몰의 전환을 촉매하는 효소의 양을 의미한다.

효소활성의 측정은 본 발명이 속한 당업자에게 알려진 방법을 특별한 제한 없이 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 효소활성단위 1U는 분당 1unit의 흡광도(Dabs) 변화를 유발하는 효소의 양으로 측정될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "rX (X는 임의의 숫자)"는 아밀로수크라아제와 글리코겐분지효소의 효소 활성 비율이 1: X인 것을 의미한다.

상기 효소 반응 단계 후 제조된 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 분산제에 관한 것이다.

상기 분산제 및 제조방법에 대한 구체적인 설명은 전술한 바와 같으므로 중복을 피하기 위해 생략한다.

상기 분산제는 바람직하게는 난용성 물질의 혼합용매에 50 중량% 이상의 농도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실험방법

1. 재료

자당, 감자 아밀로스 및 굴 글리코겐은 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 밀랍 옥수수 전분은 대상(서울, 한국)에서 제공받았다. Pullulan 표준 P-20은 Showa Denko KK(Tokyo, Japan)에서 입수했다. 다른 사용된 모든 화학 시약은 분석 또는 분자 생물학적 등급이다.

2. 효소의 발현 및 정제

Neisseria polysaccharea(NpAS, ATCC 43768), Bifidobacterium thermophilum(BtAS, ATCC 25525), Neisseria subflava(NsAS, ATCC 49275) 유래 아밀로수크라아제 유전자와 Rhodothermus obamensis(RoGBE), Bifidobacterium thermophilum(BtGBE, JCM 1207), Vibrio vulnificus (VvGBE, MO6-24/O) 유래 GBE 유전자를 이전 연구에서 보고된 방법에 따라 클로닝하여 발현시켰다(Wang, R., Bae, J.-S., Kim, J.-H., Kim, B.-S., Yoon, S.-H., Park, C.-S., & Yoo, S.-H. (2012). Development of an efficient bioprocess for turanose production by sucrose isomerisation reaction of amylosucrase. Food Chemistry, 132(2), 773-779., van der Vlist, J., Palomo Reixach, M., van der Maarel, M., Dijkhuizen, L., Schouten, A. J., & Loos, K. (2008). Synthesis of branched polyglucans by the tandem action of potato phosphorylase and Deinococcus geothermalis glycogen branching enzyme. Macromolecular rapid communications, 29(15), 1293-1297., Jo, H.-J., Park, S., Jeong, H.-G., Kim, J.-W., & Park, J.-T. (2015). Vibrio vulnificus glycogen branching enzyme preferentially transfers very short chains: N1 domain determines the chain length transferred. FEBS letters, 589(10), 1089-1094., Lee, B.-H., Yoo, Y.-H., Ryu, J.-H., Kim, T.-J., & Yoo, S.-H. (2008). Heterologous expression and characterization of glycogen branching enzyme from Synechocystis sp. PCC6803. Journal of microbiology and biotechnology, 18(8), 1386-1392.). 즉, 재조합 AS 및 GBE 플라스미드를 클로닝 및 발현을 위해 E. coli BL21(DE3) 숙주 세포로 형질전환시켰다.

Rhodothermus obamensis에서 분리한 GBE는 Novozymes(Bagsvaerd, Denmark)에서 상용 제품(Branchzyme®)을 사용했다.

상기 AS 및 GBE 유전자를 보유하는 E. coli BL21 세포를 50 μg·mL-1의 암피실린이 보충된 LB 배지에서 37℃에서 성장시켰다. 세포 배양의 600 nm에서 Abs가 0.6-0.8에 도달하면 0.2 M IPTG를 첨가하고 18℃에서 18시간 더 배양하여 효소 단백질의 발현을 유도했다.

E. coli BL21 세포는 항생제(50 μg/mL ampicillin 또는 50 μg/mL kanamycin)가 첨가된 LB broth에서 30℃에서 성장하였고, 동일한 IPTG 유도에 의해 단백질이 발현되었다. 원심분리(4℃에서 10분 동안 5,000 × g)로 수확한 세포 펠릿을 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)에 재현탁하고 얼음 배쓰 위에서 소니케이터(VibraTM Cell VC 750 disruptor, Sonics Materials, Inc, Newtown, CT)를 사용하여 파쇄했다. 파괴된 세포를 원심분리하고(4°C에서 20분 동안 10,000 x g) 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과했다. 세포에서 추출한 효소는 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 컬럼 크로마토그래피(Qiagen, Hilden, Germany)를 적용하여 정제하였다.

Amicon ultra-15 원심분리 필터(MWCO=30kDa; Merck Millipore, Carrigtwohill, Ireland)와 원심분리기를 이용하여 정제된 효소 용액을 원심분리(25℃ 에서 20분 동안 5,000rpm)하여 농축했다.

3. 효소활성 검사

NpAS의 Amylosucrase(ASase) 활성은 sucrose 기질에 대한 반응 중 환원당의 생성량을 측정하여 판단하였다. 효소 반응은 35℃에서 0.1M 자당과 0.1%(w/v) 찰옥수수 전분이 포함된 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)에서 10분 동안 수행한 다음 500μL DNS 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 끓는 물에서 5분 동안 가열하여 반응 혼합물을 착색시켰다. 색상 안정화를 위해 혼합물을 얼음 위에서 냉각시켰다. 575 nm에서의 흡광도 변화(Dabs)는 분광광도계(Beckman DU 730; CA)를 사용하여 측정하였다. GBE의 효소 활성을 측정하기 위해 30°C의 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)에서 0.05%(w/v)의 감자 아밀로스 유형 3(Sigma-Aldrich chemical Co., St. Louis, MO)을 사용하여 20분 동안 효소 반응을 수행하였다. 그 후, 반응한 혼합물을 0.02% Lugol 용액과 혼합하고 용액의 Dabs를 620 nm에서 측정하였다. 효소활성단위 1unit은 NpAS 및 VvGBE 효소 모두에 대해 분당 1unit Dabs를 유발하는 효소의 양을 의미한다.

4. NpAS 및 GBE를 이용한 GLP의 제조

글리코겐 유사 입자(GLPs)를 생산하기 위해 NpAS와 VvGBE의 원 포트 효소 반응을 50mM HCl-Tris 완충액(pH7.0)에서 30 ℃에서 48시간 동안 0.7M 자당을 기질로 사용하여 수행했다. NpAS 활성 수준은 6U/mL로 고정시키고, 0.001U에서 0.01U까지 0.001U씩 증가시키며 10가지 다른 활성 수준의 VvGBE를 적용하여 GBE/ASase 활성비율 변화에 따른 효과를 평가했다. 효소 반응 후, 샘플 혼합물을 10분 동안 끓여 효소를 불활성화시켰다. 과당, 단당, 이당 및 올리고당과 같은 부산물을 제거하기 위해 반응 혼합물을 Amicon μLtra-15 원심분리 필터 튜브(100 kDa MWCO, Merck Millipore Ltd, Burlington, MA). 잔류물을 일반 원심 튜브로 옮기고 원심 분리(25 ℃에서 10분 동안 10,000 xg) 전에 75%(v/v) 에탄올과 혼합하여 잔류 부산물에서 GLP를 완전히 회수하고 분리했다. 동결건조 후 GLP의 수율은 기질로 사용된 초기 자당 중량에 대한 생성물 중량의 비율을 기준으로 계산하였다.

5. GLP의 화학적 구조 분석

1) HPAEC 및 HPSEC 분석을 위한 GLP 용액 준비

GLP 분산액의 제조는 약간의 변형을 가한 전분 제조 방법에 따라 수행하였다. 50 mg의 분말 GLP를 1%(w/v) 농도의 90% DMSO에 용해시켰다. 용해된 샘플을 1시간 동안 끓이고 밤새 교반하였다. 2mL의 분취량을 6배 부피의 무수 에탄올(12mL)과 혼합하였다. 침전된 GLP 샘플을 원심분리하고(5,000g, 25 ℃, 20분), 상층액을 제거했다. 샘플 페이스트를 동량의 에탄올로 재현탁하고, 에탄올 침전 단계를 2회 반복하였다.

2) HPAEC-PAD에 의한 GLP 분지 패턴 결정

에탄올 침전 단계에 의해 제조된 GLP 펠렛을 0.5%(w/v) 농도로 예열된 40mM의 아세트산나트륨 완충액(pH 3.5)을 첨가하여 재현탁시키고 1시간 동안 교반하면서 끓였다. 분지형 α-글루칸을 형성할 때 분지 반응 패턴을 확인하기 위해 분지형 α-글루칸 제품에 아이소아밀라제(EC 3.2.1.68; 500 unit/240 mg; Megazyme International Ireland Ltd, Wicklow, Ireland)를 첨가했다. 탈분지 반응은 40mM 아세트산나트륨 완충액(pH 3.5)에서 40℃에서 24시간 동안 수행하였다. 효소 반응 후, 효소의 불활성화를 위해 샘플 혼합물을 10분 동안 끓였다. 그 후 시료의 염분을 제거하기 위해 활성수지 IRA-200C와 IRA-67을 1:1 비율로 혼합하였다. 물을 제거한 후 시료 1ml당 0.2g을 넣고 2분간 부드럽게 흔든다. 샘플 용액을 0.45 um 주사기 필터(Whatman, Maidstone, UK)를 통해 여과하고 25 μL의 샘플을 펄스 전류 측정 검출과 결합된 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD, Dionex Dx-300, Sunnyvale, CA)에 주입했다. 사용된 컬럼은 30 ℃에서 유지되는 CarboPac PA200 분석 컬럼(3 x 250mm, Dionex, Sunnyvale, CA)이었다. 용리액 A는 150mM의 수산화나트륨이었으며, 용리액 B는 아세트산나트륨 500mM 아세트산나트륨을 포함하는 150mM 수산화나트륨이고, 아세트산나트륨의 변화(135분 동안 0에서 500mM)에 따른 유속은 0.5mL·min-1이었다.

3) HPSEC-RI-MALS에 의한 분자량 및 크기 분포 측정

에탄올 침전 단계에 의해 제조된 GLP 펠릿을 0.5%(w/v) 농도로 예열된 물에 재현탁하고 교반하면서 1시간 동안 끓였다. 재현탁된 GLP 용액을 5μm 주사기 필터(Whatman, Maidstone, UK)를 통해 여과하여 다중 레이저 광산란 시스템(HPSEC-RI-MALS)이 장착된 고성능 크기 배제 크로마토그래피에 주입했다. Shodex OH pak SB-806 HQ 및 SB-804 HQ 컬럼(8.0 mm ID x 300 mm, Showa, Denko, Japan)은 50℃로 설정된 오븐에서 분석 컬럼으로 사용되었다. K5 flow cell과 Wyatt Technology Corporation(Santa Barbara, CA)의 GaAs 레이저(λ = 658 nm)가 장착된 Dawn Heleos MALLS 시스템과 Shimadzu(Kyoto, Japan)의 RID-10A 굴절계가 탐지에 사용되었다. 분자량 및 크기의 분포는 Astra 소프트웨어(Windows용 버전 5.3.4.20, Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA)에 의해 계산되었다. 굴절률 증분(dn/dc) 값은 0.145 mL·g-1이었고, 저분자량의 풀루란을 표준으로 하였다(P20은 포토다이오드의 정규화를 위해 사용되었다).

6. GLP의 물리적 특성

1) 외관 및 탁도 측정

외관 관찰 및 탁도 측정을 위해 분말 GLP와 굴에서 추출한 천연 글리코겐을 증류수(1%, w/v)에 용해했다. 탁도는 Abs₆₄₀에서 blank로 증류수를 사용하여 분광광도계(Beckman DU 730; CA, U.S.A.)로 측정하였다.

2) 동적 점도 측정

GLP의 동적 점도는 m-VROC(Rheosense, Inc.)를 사용하여 25 ℃에서 측정되었다. 각 GLP 용액의 dynamic viscosity는 최대 농도 30%(w/v)로 측정되었다.

7. GLP의 분산제로서의 식품 성분에의 활용 실험

효소활성 비율 r5에서 생성된 Np/VvGLP를 10, 100, 300 및 500 mg/mL로 사용하여 난용성 물질인 커큐민에 대한 GLP의 분산능을 확인하였다. GLP 용액을 투명한 형태로 제조하고 여기에 커큐민 1%(10mg/ml)를 혼합한 후, 시간에 따른 용액 외관을 사진으로 촬영하였다(도 7).

또한, 다양한 아밀로수크라아제/글리코겐분지효소 조합으로 제조된 GLP에 대하여 분산 실험을 수행하였다(도 8 내지 13). GBE/ASase r5인 분말 GLP를 다양한 농도(10, 100, 300, 500 mg/mL)로 증류수에 용해시켰다. 커큐민 1%(10mg/ml)을 GLP 용액과 혼합하였다. 시간에 따른 용액의 탁도를 Abs425에서 증류수를 블랭크(blank)로 사용하여 분광광도계(Beckman DU 730; CA, U.S.A.)로 측정하였다. 측정된 흡광도를 통해 흡광도가 높을수록 탁도가 높으며 그만큼 난용성 물질의 분산이 균일하게 되었음을 파악할 수 있다. 파악된 탁도를 기준으로 하여 혼합 용액의 분산 정도를 비교할 수 있다.

8. 통계적 분석

모든 통계 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 평균은 분산 분석을 사용하여 평가되었다. 평균은 유의 수준의 5%에서 Tukey's honestly significant difference procedure에 따라 비교되었다.

실험결과

1. VvGBE와 NpAS의 반응에 의해 생성된 GLP의 생산 수율 및 화학 구조

본 발명에서 생합성 글리코겐 유사 입자(GLP)는 이 두 효소의 최적 반응 조건이 NpAS의 경우 pH 7.0, 35 ℃, VvGBE의 경우 pH 7.0-8.0 및 30 ℃로 약간 다르기 때문에, 이를 고려하여 pH 7.0과 30 ℃에서 합성했다. VvGBE/NpAS(ref)의 비율을 조절함으로써 GLP의 다른 화학 구조가 예상되었고, VvGBE/NpAS의 활성 비율은 1(r1)에서 10(r10)으로 조정하였다. 이러한 반응 매개변수를 고려하여 동시 모드에서 NpAS와 VvGBE의 공동 반응에 의해 GLP를 합성했다. 그 결과, GLP 수율은 VvGBE/NpAS 비율에 따라 r1(27.54%)에서 r10(38.40%)의 범위에 있었다.

GBE 활성 수준의 증가는 동일한 반응 시간 내에 비환원 말단을 갖는 더 많은 수의 분지쇄를 생성하여 NpAS에 대해 더 많은 반응 부위를 제공하였다. 이는 차례로 GBE와 다시 반응할 만큼 충분히 긴 선형 글루칸의 성장 속도를 가속화하여 GLP 질량을 더 크게 증가시켰다.

기존에 두 가지 다른 활성 수준의 VvGBE로 생성된 Np/VvGLP는 다른 박테리아 GBE 공급원으로 합성된 GLP와 비교할 때 상대적으로 짧은 사슬 길이 분포 패턴을 보였다. 이 결과는 중합도(Degree of polymerization, DP) 3-5의 매우 짧은 사슬을 더 많이 전달한 VvGBE의 고유한 특성으로 설명될 수 있다. VvGBE/NpAS의 활성 비율이 r1에서 r10으로 증가함에 따라 최대 피크의 DP가 8에서 6으로 감소하고 상대적 비율이 증가했다. 또한 VvGBE 활성과 함께 최대 검출 가능한 DP가 각각 60에서 26으로, 13.37에서 8.01로, 9.17에서 7.01로 점차 감소했다(표 1).

[표 1]

VvGBE/NpAS 효소활성 비율에 따른 Np/VvGLPs의 분지 길이 분포

구체적으로, VvGBE/NpAS의 비율이 r5에 도달했을 때, 개별 사슬의 길이, 평균 DP 및 검출 가능한 DP의 비율이 평준화되는 것으로 나타났다. GBE 비율을 더 높이면 더 이상 질량 축적이 관찰되지 않고 GLP의 크기가 더 이상 증가하지 않았다. 실제로 r5까지 실험된 활성비 내에서 질량 축적이 증가함에 따라 GLP 크기가 작아져 GLP 구조의 겉보기 밀도가 그에 따라 증가함을 보였다. 이러한 VvGBE/NpAS 활성의 비율 지점을 통과한 후, 매우 밀도가 높은 GLP 구조 때문에 유의한 질량 증가가 관찰되지 않았고, 이로 인해 효소는 물리적으로 환원하지 않는 말단의 반응 부위에 접근할 수 없었다. 전반적으로 GBE 활성이 증가함에 따라 사슬 길이 DP≥13의 양은 줄어들고 사슬 길이 DP≤12의 상대적인 양은 증가하는 경향을 보였다. 활발하게 성장하는 GLP에서 자유롭게 접근할 수 있는 DP≥13 사슬은 효과적으로 글루코실화되는 것으로 간주되어 DP≤12의 상대적 양이 증가했다(도 3). 이러한 결과는 VvGBE/NpAS 비율을 제어하여 Np/VvGLP의 분지 패턴을 정확하게 관리할 수 있음을 나타낸다.

합성된 모든 Np/VvGLP의 분자량은 굴에서 얻은 천연 글리코겐의 분자량보다 낮았다. Np/VvGLP 제품의 HPSEC-RI 피크 폭은 GBE/ASase의 비율이 증가함에 따라 좁아졌으며(도 4), 이는 GLP의 다분산성(polydispersity)이 감소했고 분자 구조와 크기가 더 균질해질 수 있음을 나타낸다. 이러한 생합성 조건에서 GLP의 분자량은 토종 동물 유래 글리코겐에 도달하지 못했으며, 이들 중 Rz's는 지속적으로 더 커서 겉보기 밀도(αapp)가 유의미하게 낮아졌다. 이러한 GLP의 구조적 매개변수는 이러한 시험관내 효소 합성이 토종 글리코겐과는 상당히 다른 분지 구조를 생성한다는 것을 시사했다. VvGBE의 활성도가 높아짐에 따라, 더 작은 공간에 잘 맞는 짧은 체인 길이 전달로 인해 동일한 부피의 공간에서의 패킹 질량(packing mass)으로 인해 GLP의 분자량이 증가하는 것으로 보였고, 따라서 밀도가 증가하여 더욱 조밀한 구조가 되었다(표 2). 그러나 분자량이 일정 수준 이상으로 크게 증가하지는 않아 효소가 self-enzymatically 형성된 고분자 입자를 기질로 더 이상 활용할 수 없음을 알 수 있다.

[표 2]

Np/VvGLP의 평균 분자량, 회전반경 및 겉보기 밀도

3. GLP의 물리적 특성

1) GLP의 외관 및 탁도

도 5에 GBE/ASase 비율에 따른 Np/VvGLP 용액의 물리적 외관을 나타냈다. GBE/ASase의 활성 비율이 5 이상으로 증가하면 탁도에 해당하는 Np/VvGLP 용액 흡광도가 거의 변하지 않고 완전히 투명해졌다. 대조적으로, r1 및 r2에서 Np/VvGLP의 용액은 서로 덩어리지기 쉬운 더 긴 선형 사슬 부분의 양이 상대적으로 더 많았기 때문에 각각 유백색을 띠었으며, 탁했다. 따라서 GLP의 분자량은 GBE 활성 수준에 따라 증가하는 경향이 있지만 GLP 구조에서 짧은 사슬의 비율 증가와 분자 크기의 감소는 GLP 용액의 외관 및 탁도에 상당한 영향을 미쳤다.

2) GLP의 동적 점도

GLP 시료는 완전히 녹을 수 있을 정도로 녹이고 최대 GLP 농도는 30%(w/v)로 설정하였다. 이전 연구에서 효소적으로 합성된 글리코겐은 최대 20%까지 매우 낮은 점도를 보였고 그 이후에는 용액 점도가 급격히 증가하는 것으로 보고되었다. 또한, 효소적으로 합성된 글리코겐의 점도는 분자량과 어떠한 상관관계도 보이지 않았다. 본 발명에서 일반적으로 Np/VvGLP 용액의 농도 증가는 매우 낮은 점도를 유지하면서 동적 점도를 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나 Np/VvGLP 용액의 동적 점도는 분자량에 비례하지 않기 때문에 동일한 농도에서 동적 점도에는 큰 차이가 없었다. 따라서 VvGBE 활성의 증가에 기인한 특성의 차이가 이전에 보고된 바와 같이 동적 점도에 영향을 미치지 않음을 암시했다. 본 연구에서 실험한 GLP 용액의 농도 범위 내에서, 모든 GLP 용액은 효소 활성 비율 변화로 인한 구조적 차이에 관계없이 거의 동일한 점도 값을 제공했다(도 6a 및 6b). 검출 가능한 점도 값이 다른 하이드로콜로이드에 비해 훨씬 적기 때문에 GLP 사이에 점도의 눈에 띄는 차이가 없을 수 있다.

특히 VvGBE/NpAS 비율이 5 이상인 Np/VvGLP의 매우 낮은 점도와 함께 매우 높은 용해도는 식품 가공 및 기타 광범위한 산업 분야에서 강력한 분산 능력과 제한된 점도 개발이 필요한 잠재적으로 가치 있는 재료로 적용될 수 있다.

4. 분산제로서의 생합성 GLP

도 7에서는 Np/VvGLP와 커큐민 혼합물의 사진을 방치 시간에 따라 촬영하여 나타내었다. 커큐민은 식품 산업에서 향신료 사용되는 대표적인 난용성 물질로, 노란색을 띄어 분산 정도를 육안으로도 용이하게 확인 가능하다.

대조군인 증류수와 r5의 Np/VvGLP 농도 1% 용액에서 커큐민은 2시간 후에 급속하게 거의 완전히 침전되었다. r5의 Np/VvGLP 농도 10% 및 30% 용액에서, 각각 12시간 및 48시간 후에 침전된 난용성 커큐민 샘플과 맑은 상청액이 얻어졌다. 한편, Np/VvGLP 농도 50% 용액에서의 커큐민은 96시간 후에도 큰 침전 없이 완전히 균질한 주황색-황색 분산액을 유지했다.

커큐민 혼합물에서 Np/VvGLP r5 농도가 10% 이상으로 증가하면 침전 속도가 지연되는 경향이 분명히 드러났다. 즉, Np/VvGLP r5의 농도가 증가할수록 용액 내 GLP 분자의 네트워킹 매트릭스 구조가 강해지며, 이는 난용성 물질이 상기 매트릭스 구조의 내부 및 사이에 효과적으로 갇힘을 의미한다.

또한, 다양한 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소 조합으로 제조된 GLP의 분산능을 확인하였다(도 8 내지 13). 모든 농도 중에서 가장 높은 분산능을 보이는 r5 50% 농도의 흡광도를 기준으로 하여 난용성 물질의 분산능을 비교하였다. 시간이 지남에 따라 침전되는 농도별 샘플의 흡광도를 측정 후, 가장 높은 농도인 r5 50%의 농도를 기준으로 난용성 물질의 보유능을 계산하였다.

사용된 GLP 모두 대조군인 증류수와 비교하여 농도가 높을수록 난용성 물질인 커큐민 또는 쌀 전분에 대한 높은 분산능을 보임을 확인할 수 있으며 시간이 지남에 따라 농도가 낮을수록 확연히 난용성 물질과 GLP가 분리되어 분산능이 떨어짐을 확인하였다.

Claims

기질인 자당을 아밀로수크라아제 및 글리코겐분지효소와 반응시켜 알파-1,4-1,6-글루칸 폴리머를 얻는 단계를 포함하는 분산제의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 아밀로수크라아제는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나인 분산제의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 글리코겐분지효소는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나인 분산제의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 아밀로수크라아제와 글리코겐분지효소의 활성 비율은 1: 5 내지 10인, 분산제 제조방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 분산제.