KR20230056824A - Pak4 저해제 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20230056824A
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pyrrolo
pyrimidina
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박병현
배은주
김남두
손정범
이윤호
강세인
정소현
최환근
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전북대학교산학협력단
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Abstract

본 개시내용은 신규의 PAK4 억제제 및 그의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직의 손상 과정에서 PAK4의 역할을 새롭게 밝히고, 이를 바탕으로 PAK4 저해제의 새로운 의약적 용도를 제공한다.

Description

PAK4 저해제 및 그의 용도{PAK4 inhibitors and use thereof}
본 개시내용은 PAK4 저해제 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다.
PAK4 (p21 activated kinase 4)는 serine/threonine 인산화 효소로서 Rho GTPase의 하위 단백질이다. 지금까지 보고된 PAK4의 주요 기능은 세포골격의 리모델링을 통한 세포의 증식, 침윤, 이동, 비부착 증식(anchorage independent growth) 등으로써 광범위한 세포 기능에 관여하는 것으로 알려졌다. PAK4의 발현 및 활성의 조절에 문제가 생기면 다양한 병적 상태가 초래된다.
PAK4는 상피간엽의 이행, 침윤 및 전이를 촉진함으로써 암의 진행에 중심적인 역할을 하며, 전립선암, 유방암, 폐암, 뇌암, 위암, 난소암, 담낭암 등 다양한 종류의 암 조직에서 발현이 증가된다(Won 등, Experimental & Molecular Medicine (2019) 51:11). 따라서 PAK4는 다양한 암의 치료 타겟으로 여겨지고, PAK4 저해제들이 항암제로서 개발되고 있다. 동물실험에서 항암효과를 갖는 것으로 가장 먼저 보고된 PAK4 저해제는 화이자에서 개발한 PF-3758309 (IC50 = 1.3 nM)로서, PAK1에 대한 선택성이 없어서 임상시험이 조기 종료되는 등 아직까지 개발에 성공한 약물은 없다. 따라서 신규의 PAK4 선택적 저해제의 개발이 필요하다.
또한, PAK4는 Cdc42, CREB 등 많은 효과인자(effector)와 작용하는 것으로 알려져 있다. PAK4는 각질형성세포 성장인자(keratinocyte growth factor) 수용체와 직접 결합하여 산화스트레스로부터 폐상피세포를 보호하는 것으로 보고되었으며(Lu Y 등, J Biol Chem (2003) 278: 10374), 한국공개특허공보 제2016-0112181호에서는 PAK4가 α-MSH 및 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성 과정에서 촉진자로서 역할을 수행한다는 것을 기초로 PAK4 활성 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료를 위한 약학 조성물을 제공하였다. 추가의 효과인자 및 작용기전의 발견은 PAK4의 새로운 의약용도의 도출이 가능하다. 따라서, PAK4의 효과인자 및 작용기전의 규명을 위한 노력이 더욱 필요하다.
본 개시내용에서 해결하고자 하는 하나의 기술적 과제는 신규한 PAK4의 저해제를 제공하고, 그의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시내용에서 해결하고자 하는 다른 하나의 기술적 과제는 PAK4의 신규한 효과인자 및 작용 기전을 밝히고, 그에 기반한 새로운 치료제로서의 용도를 제공하는 것이다.
그러나 본 개시내용이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
피롤로피리미딘 유도체 화합물
상기 과제를 해결하기 위해, 본 개시내용은 일 측면에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, X는 -C1할로알킬이고,
Y는 아릴 또는 5-6원 헤테로아릴이고 {여기서, 상기 아릴 또는 5-6원 헤테로아릴의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6아미노알킬, -C1- 6하이드록시알킬, -C1-6할로알킬, -C1- 6알킬-O-C1- 6알킬, -CN, -NR1R2, -OR3, -할로, -사이클로알킬, -C(=O)-사이클로알킬, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음 [이때, -사이클로알킬, -C(=O)-사이클로알킬, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6아미노알킬, -C1-6하이드록시알킬, -사이클로알킬, 또는 -헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음]}
L1은 -C(=O)-NR4-, -C(=O)-O-, -NR5-C(=O)-, 또는 -C(=O)-(헤테로사이클로알킬)-이고 {여기서, -C(=O)-(헤테로사이클로알킬)-의 헤테로사이클로알킬 고리는 N을 하나 이상 함유하고 N은 -C(=O)-에 연결된 것임}
L2는 -NH- 또는 -O-이고,
n은 O, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고 {여기서, n이 0인 경우 L1 및 L2는 직접 연결됨},
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), 또는 -C1-6알킬-O-C1-6알킬이고,
R3는 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), -C1- 6알킬-O-C1- 6알킬, 또는 -C1-6알킬-헤테로사이클로알킬이고,
R4 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 -C1-6알킬이다.
본 개시내용의 구체 예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 아래 범위일 수 있다.
X는 -CF3이고,
Y는 페닐 또는 5-6원 헤테로아릴이고 {여기서, 상기 페닐 또는 5-6원 헤테로아릴의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-O-C1- 6알킬, -NR1R2, -OR3, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음 [이때, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬 또는 -헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음]},
L1은 -C(=O)-NR4-, -C(=O)-O-, -NR5-C(=O)-,
Figure pat00002
,
Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
, 또는
Figure pat00006
이고;
L2는 -NH- 또는 -O-이고,
n은 O, 1, 2, 3, 또는 4 이고 {여기서, n이 0인 경우 L1 및 L2는 직접 연결됨};
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), 또는 -C1-6알킬-O-C1-6알킬이고,
R3는 -H, -C1-6알킬, 또는 -C1-6알킬-헤테로사이클로알킬이고,
R4 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 -C1-6알킬이다.
본 개시내용에 있어서, "알킬"은, 다른 기재가 없는 한, 직쇄 또는 분지쇄의 비고리형, 고리형 또는 이들이 결합된 포화 탄화수소를 의미할 수 있다. 예를 들어, "C1- 6알킬"은 탄소 원자를 1 내지 6 개 포함하는 알킬을 의미할 수 있다. 비고리형 알킬은, 일 예로서, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, 아이소프로필, 2급(sec)-부틸, 아이소부틸, 또는 3급(tert)-부틸 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 고리형 알킬은 본 명세서에서 "사이클로알킬"과 교환적으로 사용될 수 있으며, 일 예로서, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 또는 사이클로옥틸 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용에 있어서, "알콕시"는 알킬 에터기로 -(O-알킬)을 의미할 수 있고, 여기서, 알킬은 상기에서 정의된 바와 같다. 예를 들어, "C1-6의 알콕시"는 C1-6의 알킬을 함유하는 알콕시, 즉, -(O-C1- 6알킬)을 의미할 수 있으며, 일 예로서, 알콕시는 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy), n-프로폭시(n-propoxy), 아이소프로폭시(isopropoxy), n-부톡시(n-butoxy), 아이소부톡시(isobutoxy), sec-부톡시(sec-butoxy), 또는 tert-부톡시(tert-butoxy) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시내용에 있어서, "할로"는 F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다.
본 개시내용에 있어서, "할로알킬"은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 할로로 치환된 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬(탄화수소)을 의미할 수 있다. 상기 할로알킬의 예로는 하나 이상의 할로겐, 예를 들어 F, Cl, Br, 또는 I로 독립적으로 치환된 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 아이소부틸 또는 n-부틸을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시내용에 있어서, "하이드록시알킬"은 하이드록시(OH)로 치환된 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬(탄화수소)을 의미할 수 있다.
본 개시내용에 있어서, "아미노알킬"은 아미노(NR'R")로 치환된 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬(탄화수소)을 의미할 수 있다. 여기서, R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 선택된 R' 및 R"은 각각 독립적으로 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 개시내용에 있어서, "시아노알킬"은 시아노(CN)로 치환된 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬(탄화수소)을 의미할 수 있다.
본 개시내용에 있어서, "헤테로사이클로알킬"은 고리 내에 N, O, P, P(=O), 및 S로부터 선택된 1 이상을 함유하는 고리를 의미할 수 있고, 포화 또는 부분적으로 불포화될 수 있다. 여기서, 불포화된 경우, 헤테로사이클로알켄으로 지칭될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 헤테로사이클로알킬은 단일 고리이거나, 스파이로(spiro) 고리, 다리(bridged) 고리 또는 융합(fused) 고리와 같은 다중 고리일 수 있다. 또한, "3 내지 12 원자의 헤테로사이클로알킬"은 고리를 형성하는 원자를 3 내지 12 개 포함하는 헤테로사이클로알킬을 의미할 수 있으며, 일 예로서, 헤테로사이클로알킬은 피롤리딘, 피페리딘, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 부티로락탐, 발레로락탐, 이미다졸리딘온, 하이단토인, 다이옥솔란, 프탈이미드, 피페리딘, 피리미딘-2,4(1H,3H)-다이온, 1,4-다이옥산, 모르폴린, 싸이오모르폴린, 싸이오모르폴린-S-옥사이드, 싸이오모르폴린-S,S-옥사이드, 피페라진, 피란, 피리돈, 3-피롤린, 싸이오피란, 피론, 테트라하이드로퓨란, 테트라하이드로싸이오펜, 퀴누클리딘, 트로판, 2-아자스파이로[3.3]헵탄, (1R,5S)-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄, (1s,4s)-2-아자바이사이클로[2.2.2]옥탄, 또는 (1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.2]옥탄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시내용에 있어서, "아렌"은 방향족 탄화수소 고리를 의미할 수 있다. 아렌은 단환식 아렌 또는 다환식 아렌일 수 있다. 아렌의 고리 형성 탄소수는 5 이상 30 이하, 5 이상 20 이하, 또는 5 이상 15 이하일 수 있다. 아렌의 예로는 벤젠, 나프탈렌, 플루오렌, 안트라센, 페난트렌, 바이벤젠, 터벤젠, 쿼터벤젠, 퀸크벤젠, 섹시벤젠, 트라이페닐렌, 피렌, 벤조 플루오란텐, 크리센 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 상기 "아렌"에서 수소 원자 하나를 제거한 잔기를 "아릴"로 지칭한다.
본 개시내용에 있어서, "헤테로아렌"은 이종 원소로 O, N, P, Si, 및 S 중 1 개 이상을 포함하는 고리일 수 있다. 헤테로아렌의 고리 형성 탄소수는 2 이상 30 이하 또는 2 이상 20 이하일 수 있다. 헤테로 아렌은 단환식 헤테로 아렌 또는 다환식 헤테로 아렌일 수 있다. 다환식 헤테로아렌은 예를 들어, 2 환 또는 3 환 구조를 갖는 것일 수 있다. 헤테로아렌의 예로는 싸이오펜, 퓨린, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 싸이아졸, 옥사졸, 아이소싸이아졸, 옥사다이아졸, 트라이아졸, 피리딘, 비피리딜, 트라이아진, 아크리딜, 피리다진, 피라진, 퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 페녹사진, 프탈라진, 피리미딘, 피리도 피리미딘, 피리도 피라진, 피라지노 피라진, 아이소퀴놀린, 인돌, 카바졸, 이미다조피리다진, 이미다조피리딘, 이미다조피리미딘, 피라졸로피리미딘, 이미다조피라진 또는 피라졸로피리딘, N-아릴카바졸, N-헤테로아릴카바졸, N-알킬카바졸, 벤조옥사졸, 벤조이미다졸, 벤조싸이아졸, 벤조카바졸, 벤조싸이오펜, 다이벤조싸이오펜, 싸이에노싸이오펜, 벤조퓨란, 페난트롤린, 아이소옥사졸, 옥사다이아졸, 싸이아다이아졸, 벤조싸이아졸, 테트라졸, 페노싸이아진, 다이벤조실롤 및 다이벤조퓨란 등이 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 본 개시내용의 일 실시 태양에서 헤테로아렌은 또한 헤테로사이클로알킬 고리에 융합된 아렌 고리 또는 사이클로알킬 고리에 융합된 헤테로아렌을 포함하는 바이사이클릭 헤테로사이클로-아렌을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 상기 "헤테로아렌"에서 수소 원자 하나를 제거한 잔기를 "헤테로아릴"로 지칭한다.
본 개시내용의 일 구현 예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 하기의 ‘발명을 실시하기 위한 구체적인 내용’에 기재된 표 1에 나열된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 개시내용에 있어서, 용어 "광학 이성질체(enantiomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 입체적으로 다른 본 개시내용의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 각각의 광학 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 개시내용의 범위에 포함된다. 다른 설명이 없는 한, 비대칭 탄소 원자와 연결되는 실선 결합 (-)은 입체 중심의 절대적 배열을 나타내는 쐐기형 실선 결합
Figure pat00007
또는 쐐기형 점선 결합
Figure pat00008
을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 화학식 1의 화합물은 "약학적으로 허용 가능한 염"의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 본 개시내용의 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기산 또는 무기산 부가염을 의미한다.
산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토나이트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 또는 질산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메테인설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 또는 아이오딘화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있다. 다만, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 개시내용의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메테인설포네이트(메실레이트), 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 개시 내용에 따른 화학식 1의 화합물은 하기 <실험예 1>에서 확인된 바와 같이 PAK4의 효소활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한 본 개시 내용에 따른 화합물은 하기 <실시예 37>에서 확인된 바와 같이, 허혈-재관류 손상 모델 마우스에서 비히클 대조군과 비교하여 간세포 괴사, 세포자멸사, 산화적 스트레스 및 사이토카인 방출의 뚜렷한 억제 효과를 나타났으며 간 손상의 치료효과를 가진다.
피롤로피리미딘 유도체 화합물의 용도
본 개시내용은 일 측면에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
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상기 화학식 1 화합물의 X, Y, L1 및 L2는 상기 ‘피롤로피리미딘 유도체 화합물’항목에서 기재된 바와 같다.
본 개시 내용의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 PAK4의 효소 활성에 대하여 억제 활성을 나타낸다. 따라서, 본 개시 내용은 PAK4의 과다 발현 또는 과다 활성으로 인한 질병을 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
본 개시 내용은 일 측면에서, 본 개시 내용에서 제공하는 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환, 허혈-재관류로 인한 질환, 저산소-재산소화로 인한 질환, 멜라닌 색소 과다 침착 질환, 근육 재생(Mao Y 등, J Cachexia Sarcopenia Muscle (2021), in press), 파킨슨병(Won SY 등, Sci Transl Med (2016) 8: 367), 근위축성 측생경화증 (Cong C 등, Cell Prolif (2021) 54: e13003)와 같은 신경계 질환, 고혈압 (Wu Z 등, Pulm Circ (2020) 10: 2015894020974919), 에이즈 (Vargas B 등, Antimicrob Agents Chemother (2019) 63: e01744), 다낭성신종 (Hwang VJ 등, Kidney Int (2017) 92: 922-933), 골다공증 (Choi SW 등, J Bone Miner Res (2015) 30: 1494-1507)으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 약학적 조성물에 포함되는 화학식 1의 화합물은 PAK4의 저해, Nrf2의 인산화 억제, 및 Nrf2 단백질의 안정성 및 전사활성 증가로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 염증성 질환은 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 자가면역성 질환 및 만성 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화 관련 질환은, 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화로 인한 간 손상, 뇌 손상, 폐 손상, 신장 손상, 심근 손상, 골격근 손상으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 일광 흑색증, 피부미백을 포함한 멜라닌 색소 과다 침착 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
허혈-재관류에 의한 조직 손상의 예방 및 치료를 위한 조성물
허혈-재관류에 의한 간 손상은 간이식, 간절제술, 외상과 같은 외과적 상황과 저혈량쇼크(hypovolemic shock), 과다출혈 후 수혈과 같은 내과적 상황에서 발생한다. 병태생리적 관점에서 허혈-재관류 간 손상은 초기 허혈 단계와 후기 재관류 손상 단계로 이루어진다. 허혈 단계에서 활성산소(ROS)가, 재관류 단계에서는 Kupffer 세포나 외부로부터 침윤한 염증세포(예, 대식세포, 호중구세포)가 주요 간 손상 인자이다. 따라서 활성산소 생성과 염증반응 억제는 허혈-재관류에 의한 간 손상을 억제하는 핵심 기전이다.
활성산소에 의한 손상을 억제하기 위해 간세포는 방어기제를 활성화시킨다. 대표적인 예가 Nrf2이다. 보통의 경우 Nrf2는 Keap1이라는 단백질과 결합하여 세포질 내에 존재한다. 활성산소가 발생하면 Nrf2는 Keap1으로부터 떨어져서 핵으로 이동하고, antioxidant response element (ARE)에 결합하여 다양한 항산화 효소의 발현을 촉진한다. 세포 내 다양한 인산화 효소는 인산화를 통해 Nrf2 단백질의 안정성 및 전사활성을 조절한다.
본 개시 내용자들은 허혈-재관류에 의한 간 손상 과정에서 PAK4 발현이 증가함을 밝히고, PAK4가 허혈-재관류에 의한 간 손상에 핵심 기전이라는 가설을 세웠다. 그리고 이를 증명하기 위해 본 개시 내용자들은 간세포 특이적 PAK4 결손 (knockout, KO) 마우스를 제작하였고, PAK4 선택적 저해제를 합성하여 실험을 진행하였다. 그리하여 본 개시 내용자들은 허혈-재관류에 의해 간세포에서 PAK4 발현이 증가하여 Nrf2의 T369에 인산화를 유도하고, 인산화된 Nrf2는 핵에서 세포질로 이송되어 유비퀴틴화와 프로테아좀을 통해 단백질 분해가 일어나고, 핵내 Nrf2의 감소에 의해 Nrf2에 의해 조절되는 항산화 효소 발현이 감소됨을 확인하였다. 또한 본 개시 내용자들은 허혈-재관류에 의한 간 손상을 억제하기 위한 제제를 연구한 결과 PAK4 저해제의 간 손상 억제하는 효과를 확인하여 본 개시내용을 완성하였다.
따라서, 본 개시 내용은 일 측면에서, PAK4의 활성 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직 또는 세포의 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 PAK4에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모사체, 항체, 앱타머, 또는 단백질 인산화 효소 A (protein kinase A) 억제제로부터 선택될 수 있다.
PAK4 단백질에 특이적으로 결합하여 이 단백질의 활성을 억제할 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. PAK4 단백질에 대한 항체는 당 업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511- 519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 PAK4 단백질에 대한 항체는 상업적으로 시판되는 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 PAK4 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하여 PAK4 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 본 발명에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당 업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391410(1997)).
본 개시 내용에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 억제할 수 있는 화합물은 PAK4 활성 특이적 억제제가 바람직하다. 예를 들어, 본 개시 내용에서 제공된 화학식 1의 화합물이 사용될 수 있으며, 공지된 PAK4 활성 억제 화합물인 PF-3758309 [(S)-N-(2-(디메틸아미노)-1-페닐에 틸)-6,6-디메틸-3-((2-메틸티에노[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-4,6-디하이드로피롤로[3,4-c]피라졸-5(1H)-카 르복사마이드)], 또는 LCH-7749944 [N2-(3-메톡시페닐)-N4-((테트라히드로푸란-2-일)메틸) 퀴나졸린-2,4-디아민](Cancer Lett. 2012 Apr 1;317(1);24-32)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시 내용에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드 모방체(Peptide mimetics)는 PAK4 단백질의 특정 도메인에 결합하여 이 단백질의 활성을 억제한다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합 (Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체 (cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활 성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩타이드 모방체는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
본 개시 내용에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.
본 개시 내용에서 PKA 단백질 활성 억제제는 바람직하게는 단백질 인산화 효소 A(protein kinase A) 억제제이고, 보다 바람직하게는 H89 화합물 N-[2-[[3-(4-브로모페닐)-2-프로페닐]아미노]에틸]-5-이소퀴놀린술폰아미드를 포 함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 H89 화합물은 PKA의 촉매 도메인의 ATP 결합부위에 경쟁적으로 결합하여 PKA의 활성을 억제한다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 PAK4의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 또는 라이보자임일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 PAK4 mRNA에 상보적이고 PAK4 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서 열을 의미하고, PAK4 mRNA의 번역, 세포질내로의 이동(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체 적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다. 상기 안티센스 뉴클레 오타이드는 이의 활성을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 안티센스 핵산의 골격은 포스포로 티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클 릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아 미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 개시 내용의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 다양한 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 제조 방법은 본 개시 내용의 기술 분야에서 공지되어 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 본 개시 내용에서 이용 될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 디자인은 당 업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다 (Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999).
본 개시 내용에서 PAK4 발현 억제제는 PAK4 유전자의 염기서열에 상보적인 서열을 포함하는 shRNA 또는 siRNA 일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)”는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵(silence)시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세 포로 전달되어 유전자 침묵이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA 로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 Ⅲ에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다.
본 명세서에서 용어 “siRNA(small interference RNA)”는 RNA 방해 (RNA interference) 또는 유전자 침묵 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹-다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에 서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005). [0029] 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 상보적은 100% 상보적인 경우 뿐만 아니라 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 완전 상보적(completely complementary)으로 특별하게 기재된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 보다 더 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. 상기 siRNA는 PAK4 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성될 수 있다. siRNA 말단 구조는 PAK4 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점 착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3’말단 돌출 구조와 5’말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 개시 내용의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5- 15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프(stem-and-loop) 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 동물 실험에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활 성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 개시 내용의 PAK4 유전자에 특이적으로 결합하는 RNAi(RNA interference) 분자는 유전자 캐리어에 삽입될 수 있다. 상기 유전자 캐리어는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543- 551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066- [0036] 1073(1989)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV)(LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest, 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al. Gene Therapy, 2:29-37(1995)), 레트로바이러스(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11): R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉 스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 또는 니오좀일 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 약학 조성물은 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화의 전에, 동시에 혹은 후에 투여될 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 약학 조성물은 세포질 내에서 Nrf2의 유비퀴틴화 과정과 프로테아좀을 통한 Nrf2의 단백분해를 억제할 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 약학 조성물은 조직의 염증세포 침윤을 억제하거나, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 CCL-2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인의 생성을 억제할 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 약학 조성물은 NF-κB 전사활성을 억제할 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 약학 조성물은 조직 또는 세포의 활성산소 발생을 억제하거나 혈중 활성산소 마커를 줄일 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 약학 조성물은 세포의 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포괴사(necrosis)을 억제할 수 있다.
본 개시 내용의 일 측면에서, 상기 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화 관련 질환은, 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화로 인한 간 손상, 뇌 손상, 폐 손상, 신장 손상, 심근 손상, 골격근 손상으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 개시내용의 상기 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1 종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 개시내용의 약학적 조성물은, 임상 투여 시에 이용될 수 있으며, 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있도록 제조될 수 있다.
또한 본 개시내용의 일 구체 예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료학적으로 유효한 양을, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, PAK4 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 대상(subject)은 인간을 포함하는 포유류일 수 있다.
본 개시내용에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 PAK4 관련 질환의 치료 또는 예방에 유효한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 양을 나타낸다. 구체적으로, "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 시판되는 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 개시내용의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있다. 본 개시 내용의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어 1일 당 0.0001-100mg/kg(체중)일 수 있다.
또한 본 개시내용의 일 구체 예에 따르면, 본 개시내용은 PAK4 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제(medicament)의 제조에 사용하기 위한, 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도(use)를 제공한다. 약제의 제조를 위한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 허용되는 보조제, 희석제, 담체 등을 혼합할 수 있으며, 기타 활성제제와 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.
본 개시내용에서 “약학적 조성물”은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 일반적으로 국소 투여 방식이 추천된다. 또한 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중, 투여경로 등의 조건에 따라 달라 질 수 있으며, 일일 1회부터 수회까지 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 개시내용에서 비히클(vehicle)은 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
본 개시내용에서 “희석제(diluent)”란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 완충에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 완충액은 포스페이트 버퍼 식염수(PBS)이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 완충액은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 완충용 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자 체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형 제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.
또한, PAK4 저해제 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히 드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정 제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단 순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용 제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주 입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 개시내용의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 개시내용의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 일 측면에서, 허혈-재관류에 의한 간 손상 모델 동물 또는 저산소-재산소화에 의해 손상된 간세포에 후보 물질 혹은 아데노바이러스를 통한 후보 유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직 또는 세포의 손상을 억제하는 약제의 선별(screening) 방법을 제공한다.
본 개시내용의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 개시 내용에 따른 화학식 1의 화합물은 PAK4의 효소활성을 억제하므로, PAK4의 과다 활성으로 인한 질병의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.
또한, 본 개시 내용에서는 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직 또는 세포의 손상에서 PAK4의 역할 및 기전을 새롭게 규명하였다. 따라서 PAK4 저해제를 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직 또는 세포의 손상의 예방 또는 치료에 사용할 수 있게 되었다.
도 1은 마우스에서 허혈-재관류(ischemia-reperfusion, I/R)에 의한 간손상 모델(A)과 일차배양간세포(primary hepatocyte)에 저산소-재산소화(hypoxia-reoxygenation, H/R)에 의한 간세포 손상 모델(B)의 제조 및 이를 사용한 실험프로토콜을 보여주는 개략도이다. A. 마우스에 1시간 동안 부분 허혈을 적용하고 이어서 재관류시켰다. 아데노바이러스 PAK4의 과발현을 위해서는, 허혈 손상을 시키기 전 2일 전에 쥐에게 Ad-LacZ, Ad-PAK4, 또는 Ad-PAK4S474A를 정맥주사하였다. B. 일차배양간세포를 무산소 배양통에서 1시간 동안 배양하고, 그 후 12시간 동안 산소를 공급하였다. 아데노바이러스를 사용한 PSK4 과발현을 위해서는 저산소 손상의 12시간 전에 일차배양 간세포를 쥐에게 Ad-LacZ, Ad-PAK4, 또는 Ad-PAK4S474A로 감염시켰다.
도 2a 및 도 2b는 마우스에 허혈-재관류 후, 간 조직 내 PAK4 단백질의 발현 (A) 및 mRNA의 발현 (B)을, 허혈-재관류 후 6시간 혹은 24시간 후에 PAK4 단백질에 대한 면역조직화학염색(C)과 면역형광염색(D) 결과를 나타낸다. E와 F는 저산소-재산소화에 의한 일차배양간세포 손상 모델에서 PAK4 단백질의 발현 (E) 및 mRNA의 발현(F)을 보여준다. **는 시간 0에 대하여 p<0.01 임을 나타낸다. HNF4: hepatocyte nuclear factor 4
도 3a 및 도 3b는 간세포특이적 PAK4 KO 마우스에 허혈-재관류에 의한 간손상을 유발할 때 각종 지표에 대한 영향을 나타낸다. A: 야생형 마우스 및 PAK4 KO 마우스의 간에서의 PAK4 수준, B 및 C: 간 절단부위의 현미경 사진 및 괴사 면적. D: 간세포 손상 표지 단백질인 AST와 AKT의 혈중 수치, E: 간 조직의 CD68+ (대식세포 macrophages), F4/80+ (대식세포), Ly6G+ (호중구 neutrophils) 및 TUNEL+ (세포자멸사) 세포에 대한 면역형광 염색 결과 사진 및 이를 정량화한 그래프, F 및 G: 혈중 및 간 조직 내의 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인/케모카인의 단백질 및 mRNA 수준. **, 샴에 대하여 p<0.01, ##, 야생형에 대하여 p<0.01.
도 4a 및 4b는 아데노바이러스를 이용해서 PAK를 과발현시킨 마우스에 허혈-재관류에 의한 간손상을 유발할 때 각종 지표에 대한 영향을 나타낸다. A: PAK4 아데노바이러스(Ad-PAK4) 및 인산화기능을 제거한 PAK4 변이 아데노바이러스(Ad-PAK4S474A)를 마우스에 주사했을 때 간조직 내에 PAK4의 발현,
B 및 C: 간 절단부위의 현미경 사진 및 괴사 면적. D: 간세포 손상 표지 단백질인 AST와 AKT의 혈중 수치, E: 간 조직의 CD68+ (대식세포 macrophages), F4/80+ (대식세포), Ly6G+ (호중구 neutrophils) 및 TUNEL+ (세포자멸사) 세포에 대한 면역형광 염색 결과 사진 및 이를 정량화한 그래프, F 및 G: 혈중 및 간 조직 내의 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인/케모카인의 단백질 및 mRNA 수준. **, 샴에 대하여 p<0.01, ##, Ad-LacZ에 대하여 p<0.01, $, Ad-PAK4에 대하여 p<0.05, $$, Ad-PAK4에 대하여 p<0.01.
도 5a 및 5b는 PAK4 KO 마우스에 허혈-재관류에 의한 간손상을 유발할 때 각종 지표에 대한 영향을 나타낸다. A; 간조직의 RNA sequencing 분석 결과, B: Gene set enrichment analysis (GSEA) 결과, C: GeneMANIA 분석 결과, D: 4-HNE 염색 결과, E: 혈중 GSH 및 MDA 수준. F 및 G: PAK4 과발현시 허열-재관류 후 간 조직에서의 4-HNE 염색결과 및 혈중 GSH 및 MDA 수준.
도 6a, 6b 및 6c는 Nrf2의 안정성 및 전사활성 조절에 대한 PAK4의 영향을 보여주는 실험 결과들을 나타낸다. A HEK293T 세포에 Nrf2 및 PAK4를 과발현시킨 후의 ARE-luciferase assay 결과, B 허혈-재관류로 손상된 간 조직의 총 단백질 추출물(total), 세포질 추출물(CE) 및 핵추출물(NE)의 Nrf2 및 카겟 유전자의 수준, C 저산소-재산소화 공격 후 일차배양 간세포의 Nrf2의 면역염색 결과, D 야생형 및 PAK4 KO 마우스로부터 분리한 일차배양 간세포 및 PAK4를 과발현하는 일차배양 간세포를 저산소호-재산소화(12시간)를 실시한 후, 전세포용해물(Total), 핵추출물(NE) 및 세포질 추출물(CE)의 Nrf2 단백질을 웨스턴블롯으로 분석한 결과, E PAK4 과발현 간세포에서 Nrf2 및 PAK4의 세포 이하 단위에서의 국재화, F 사이클로헥사미드로 처리한 후(CHX, 20㎍/㎖, n=5), 일차배양 간세포에서 Nrf2의 상대적인 단백질 수준, G MG132 (2 μM) 존재하에 HEK293T 세포에서 Nrf2의 유비퀴틴화 및 프로테아좀을 통한 분해, H Keap 1 및 Nrf2 조절을 위한 신호조절 분자의 단백질 수준을 웨스턴블롯으로 분석.
도 7a 및 도 7b는 PAK4가 Nrf2를 직접 인산화 시킴을 관찰한 결과이다. A HEK293 T 세포에서의 공면역침전, B PAK4의 존재 또는 부존재 하에, 전장(full-length) 재조합 Nrf2 단백질을 [γ-32P] ATP와 인큐베이션 한 후의 방사능사진 및 쿠마시브릴리언트 블루 염색 결과, C PAK4에 의한 Nrf2 인산화에 대한 합성 올리고펩티드의 영향. 각각의 10 ㎍의 올리고펩티드의 존재 또는 부존재하에 실시한 시험관내 카나아제 분석, D HEK293T 세포에서의 ARE 루시퍼라제 활성, E D HEK293T 세포에서의 공면역침전, F 저산소-재산소화에 의한 손상된 간세포에서 Nrf2의 세포 이하 국재화, G Nrf2의 유비퀴틴화(도 6c의 G와 유사하게 실험함), H 전염증성 사이토카인의 단백질 및 mRNA 수준, I Nrf2 타겟 유전자 및 세포자멸사 관련 경로. **, mock에 대하여 p < 0.01; ##, Nrf2-WT 만에 대하여 p < 0.01; $$, Nrf2-WT+PAK4에 대하여 p < 0.01.
도 8a 및 8b는 야생형 및 PAK4 KO 마우스에 Ad-shLacZ 또는 Ad-shNrf2를 정맥주사하고 간 허혈-재관류 손상을 시켰을 때 지표들을 나타낸다(A, C~H). 또는 스크램블드 siRNA(siCtrl) 또는 Nrf2dp 대한 siRNA (siNrf2)로 감염된 야생형 및 PAK4 KO 마우스로부터 분리된 일차배양 간세포에서 저산소-재산소화 손상을 시켰을 때의 지표를 나타낸다(B, I, J) A 간 조직에서 Nrf2의 단백질 수준, B Nrf2의 단백질 수준, C 혈청 AST 및 ALT 수준, D 간 조직의 간세포 괴사, 세포자멸사 및 지질과산화, E 및 F 간 조직에서 세포자멸사 관련 단백질 및 산화적 스트레스 마커, G 및 H 혈액 및 간에서의 전염증성 사이토카인의 수준, I 일차배양 간세포에서의 세포자멸사 관련 단백질 및 산화적 스트레스 마커, J 일차배양 간세포에서 전염증성 사이토카인의 수준. **, WT-Ad-shLacZ에 대하여 p < 0.01; ##, KO-Ad-shLacZ에 대하여 p < 0.01.
도 9a 및 9b는 본 개시내용을 통하여 제공된 신규의 PAK4 억제제인 ND201651의 허혈-재관류에 의해 손상된 간에 대한 영향을 평가한 실험 결과를 보여준다. A ND201651의 화학적 구조, B ND20165을 C57B/6 마우스에 처리하고 진행한 실험 프로토콜, C 허혈-재관류에 의해 손상된 간 조직에서의 간 괴사, 세포자멸사 및 산화적 스트레스, D 혈청 중의 AST 및 ALT의 수준, E 간에서의 MDA, GSH의 수준, F 혈청 중의 사이토카인 수준, G 간에서 사이토카인의 mRNA 발현, H 핵내 및 세포질에서 Nrf2의 수준 및 간에서의 NrF2의 타겟 단백질.
도 10은 허혈-재관류에 의한 손상에 대한 PAK4 및 PAK4 저해제의 작용 기전을 개략적으로 도시한 것이다.
이하, 본 개시내용을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 본 개시내용은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 개시내용을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 개시내용의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시내용의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
I. 피롤로피리미딘 유도체 화합물
<분석 및 정제 조건>
본 개시내용의 실시예에서 합성된 화합물은 하기의 HPLC 조건에 의해 정제하거나 또는 구조 분석을 실시하였다.
1. HPLC 조건
분석용 HPLC 조건 (ACQUITY UPLC H-Class Core System)
Waters사 제조 UPLC system(ACQUITY UPLC PDA Detector)에 Waters사 제조 mass QDA Detector가 장착된 장비를 사용하였다. 사용 컬럼은 Waters사의 ACQUITY UPLC®BEH C18(1.7 ㎛, 2.1 X 50 mm)였으며, 컬럼 온도는 30 ℃에서 진행하였다.
이동상 A는 0.1% 개미산이 포함된 물, 이동상 B는 0.1%의 개미산이 포함된 아세토나이트릴을 사용하였다.
Gradient condition(10-100% B로 3분, 이동속도 = 0.6 ml/min)
정제용 Prep-LCMS (Preparative-Liquid chromatography mass spectrometry)
Waters사 제조 Autopurification HPLC system(2767 sample manger, 2545 binary gradient module, 2998 Photodiode Array Detector)에 Waters사 제조 mass QDA Detector가 장착된 장비를 사용하였다. 사용 컬럼은 Waters사의 SunFire®Prep C18 OBDTM (5 ㎛, 19 X 50 mm)였으며 컬럼 온도는 실온에서 진행하였다.
이동상 A는 0.035% 트라이플루오로아세트산이 포함된 물, 이동상 B는 0.035%의 트라이플루오로아세트산이 포함된 메탄올을 사용하였다.
Gradient condition(15-100% B로 10분, 이동속도 = 25 ml/min)
정제용 Prep-150 LC System (Preparative-Liquid chromatography UV spectrometry)
Waters사 제조 Prep 150 LC system (2545 Quaternary gradient module, 2998 Photodiode Array Detector, Fraction collector III) 장비를 사용하였다. 사용 컬럼은 Waters사의 XTERRA®Prep RP18 OBDTM(10 ㎛, 30 X 300 mm)였으며 컬럼 온도는 실온에서 진행하였다.
이동상 A는 0.035% 트라이플루오로아세트산이 포함된 물, 이동상 B는 0.035%의 트라이플루오로아세트산이 포함된 메탄올을 사용하였다.
Gradient condition(3-100% B로 120분, 이동속도 = 40 ml/min)
정제용 Preparative HPLC System (Preparative-Liquid chromatography UV spectrometry)
Teledyne사 제조 ACCQPrep HP150 장비를 사용하였다. 사용 컬럼은 Waters사의 XTERRA®Prep RP18 OBDTM(10 ㎛, 30 X 300 mm)였으며 컬럼 온도는 실온에서 진행하였다.
이동상 A는 0.035% 트라이플루오로아세트산이 포함된 물, 이동상 B는 0.035%의 트라이플루오로아세트산이 포함된 메탄올을 사용하였다.
Gradient condition(10-100% B로 120분, 이동속도 = 42 ml/min)
2. NMR 해석
NMR 분석은 Bruker사 제조 AVANCE III 400 또는 AVANCE III 400 HD를 사용해서 수행하였고, 데이터는 ppm(parts per milion(δ))으로 나타내었다.
사용된 시판 시약은 추가 정제 없이 사용하였다. 본 개시내용에서 실온 또는 상온이란 5 ℃ 내지 40 ℃, 일 예로서, 10 ℃ 내지 30 ℃, 다른 예로서 20 ℃ 내지 27 ℃ 정도의 온도를 말하는 것으로, 상기 범위 내로 엄밀하게 한정되는 것은 아니다. 감압 하 농축 또는 용매 증류 제거는 회전식 증발기(rotary evaporator)를 사용하였다.
<제조예 1> 에틸 4-아미노-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실레이트의 제조
Figure pat00010
단계 1: 에틸 1,3-다이메틸-4-나이트로-1H-피라졸-5-카복실레이트의 제조
0 ℃에서 질산(60%, 4 mL, 3.34 eq)과 황산(13 mL, 14.14 eq)을 혼합하였다.
상온이 될 때까지 혼합물을 교반한 후, 에틸 1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실레이트(2.9 g, 1 eq)를 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온에서 6 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며 목적 화합물이 검출되었다. 반응 혼합물을 얼음물에 부어 침전된 고체를 여과하고 건조하여 목적 화합물 (2g, 54% 수율)를 수득하였다.
MS m/z: 214.1[M+1].
단계 2: 에틸 4-아미노-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실레이트의 제조
상기 단계 1에서 얻어진 에틸 1,3-다이메틸-4-나이트로-1H-피라졸-5-카복실레이트(2 g, 1 eq)를 에탄올(50 mL)에 녹인 후, 팔라듐/탄소(Pd/C; 10%, 0.2 g, 0.02 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 가스 하에서 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며 목적 화합물이 검출되었다. 반응 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여액을 감압 하에 증발 건조시켜 목적 화합물 (1.7 g, 100% 수율)를 수득하였다.
MS m/z: 184.2[M+1].
< 실시예 1> 3 1 ,3 3 - 다이메틸 -1 5 -( 트라이플루오로메틸 )- 1 7 H,3 1 H -2,5,9- 트라이아자 -1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온의 제조
Figure pat00011
단계 1: tert - 뷰틸 (3-((2- 클로로 -5-( 트라이플루오로메틸 )-7-((2-( 트라이메틸실릴 )에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노)프로필)카바메이트의 제조
출발 물질인 2,4-다이클로로-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(1.2 g, 1 eq)을 아세토나이트릴(ACN; 10 mL)에 녹인 후, 트라이에틸아민(TEA; 0.65 mL, 1.5 eq)을 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물에 tert-뷰틸 (3-아미노프로필)카바메이트(0.541 g, 1 eq)를 첨가하고 상온에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며 목적 화합물이 검출되었다. 에틸아세테이트(EA; 200mL)와 물(100mL)을 이용해 유기층을 추출하고 포화 소금물(100ml * 2)로 유기층을 여러번 씻어 주었다. 그 후, 유기층을 황산 마그네슘으로 건조한 후 감압 농축하였다. 농축한 화합물을 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물(1.6g, 98% 수율)을 수득하였다.
MS m/z: 524.3 [M+1].
단계 2: 에틸 4-((4-((3-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)프로필)아미노)-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노)-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실레이트의 제조
상기 단계 1에서 얻어진 tert-뷰틸 (3-((2-클로로-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노)프로필)카바메이트(0.542 g, 1 eq)를 sec-뷰탄올(8 mL)에 녹인 후, <제조예 1>에서 얻어진 에틸 4-아미노-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실레이트(0.227 g, 1.2 eq)와 탄산칼륨(0.715 g, 5 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 탈기한 후, 5분 간 60 ℃에서 반응하였다. 트리스(다이벤질아이덴아세톤)다이팔라듐(0)(0.095 g, 0.1 eq)과 다이사이클로헥실(2',4',6'-트라이아이소프로필-[1,1'-바이페닐]-2-yl)포스페인(Xphos; 0.049 g, 0.1 eq)을 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 질소 대기 하에 100 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며 목적 화합물이 검출되었다. 반응 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여액을 감압 하에 증발 건조시키고, 크로마토그래피로 정제하여(30-40% 에틸아세테이트 in 헥세인) 목적 화합물 (367 mg, 68%)를 수득하였다.
MS m/z: 671.4[M+1].
단계 3: 4-((4-((3-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)프로필)아미노)-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노)-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실산의 제조
상기 단계 2에서 얻어진 에틸 4-((4-((3-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)프로필)아미노)-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노)-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실레이트(367 mg, 1 eq)를 메탄올(8 mL)에 녹인 후, 수산화나트륨(6M; 1.824 mL, 20 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며 목적 화합물이 검출되었다. 에틸아세테이트(EA; 200mL), 물(100mL), 그리고 염산(3N; 100mL)을 이용해 유기층을 추출하고 황산 마그네슘으로 건조한 후 감압 농축하여 목적 화합물 (150 mg, 42%)을 수득하였다.
MS m/z: 643.4[M+1].
단계 4: 4-((4-((3-아미노프로필)아미노)-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노)-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실산의 제조
상기 단계 3에서 얻어진 4-((4-((3-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)프로필)아미노)-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노)-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실산(150 mg, 1 eq)을 메탄올(5 mL)에 녹인 후 염산/다이옥산(4N, 0.46 mL, 8 eq)을 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며, 반응 혼합물을 감압 농축하여 목적 화합물 (76 mg, 60%)을 수득하였다.
MS m/z: 543.3[M+1].
단계 5: 3 1 ,3 3 - 다이메틸 -1 5 -( 트라이플루오로메틸 )-1 7 -((2-( 트라이메틸실릴 ) 에톡시 )메틸)-1 7 H ,3 1 H -2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3- d ]피리미디나- 3(4,5)- 피라졸라사이클로노나판 -4-온의 제조
상기 단계 4에서 얻어진 4-((4-((3-아미노프로필)아미노)-5-(트라이플루오로메틸)-7-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노)-1,3-다이메틸-1H-피라졸-5-카복실산(76 mg, 1 eq)을 N,N-다이메틸포름아마이드(10 mL)와 테트라하이드로퓨란(10 mL)에 녹인 후, 다이아이소프로필에틸아민(0.249 mL, 10 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분간 교반한 후, 1-[비스(다이메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트라이아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU; 75 mg, 1.4 eq)를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며 목적 화합물이 검출되었다. 에틸아세테이트(EA; 200mL)와 물(100mL)을 이용해 유기층을 추출하고 포화 염화나트륨(100ml * 2)으로 유기층을 씻어 주었다. 그 후, 유기층을 황산 마그네슘으로 건조한 후 감압 농축하였다. 농축한 화합물을 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물 (50 mg, 68%)을 수득 하였다.
MS m/z: 525.3[M+1].
단계 6: 3 1 ,3 3 - 다이메틸 -1 5 -( 트라이플루오로메틸 )- 1 7 H ,3 1 H -2,5,9- 트라이아자 -1(2,4)-피롤로[2,3- d ]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온의 제조
상기 단계 5에서 얻어진 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17-((2-(트라이메틸실릴)에톡시)메틸)-17 H,31 H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온(50 mg, 1 eq)을 다이클로로메테인(2 mL)에 녹인 후, 트라이플루오로아세트산(1 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 출발 물질이 모두 사라졌으며 반응 혼합물을 감압 농축하였다. 농축된 화합물을 1,4-다이옥산(2 mL)에 녹인 후, 수산화암모늄(2 mL)을 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS 분석 결과, 목적 화합물이 검출되었고 반응 혼합물을 감압 농축하였다. 농축된 화합물을 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물(18 mg, 48%)을 수득하였다.
MS m/z: 395.3[M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ= 11.99 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.24 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.52 (s, 1H), 3.10 (s, 1H), 2.85 (s, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.80 (d, J = 19.7 Hz, 2H)
<실시예 2 내지 30>
상기 실시예 1과 유사한 방법으로 실시예 2 내지 30 화합물을 제조하였다.
각 실시예 화합물의 화합물명, 화학구조식, NMR 및 LCMS 분석 결과를 하기 [표 1]에 정리하여 나타내었다.
실시예
화합물		 구조 화합물명 1H NMR; MS[M+H]+
1
Figure pat00012
 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=11.99 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.24 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.52 (s, 1H), 3.10 (s, 1H), 2.85 (s, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.80 (d, J = 19.7 Hz, 2H); 395.3[M+H]+
2
Figure pat00013
 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로데카판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12.23 (d, J = 20.5 Hz, 1H), 9.82 (s, 1H), 8.60 (d, J = 38.9 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 2.10 (d, J = 0.9 Hz, 3H), 1.70 (d, J = 7.9 Hz, 4H), 1.41 (d, J = 6.8 Hz, 4H); 409.2[M+H]+
3
Figure pat00014
 31-(2-메톡시에틸)-33-메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ= 11.90 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 4.25 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.06 (s, 1H), 3.59 (d, J = 12.4 Hz, 3H), 3.45 (s, 1H), 3.06 (s, 1H), 2.83 (s, 1H), 2.10 (s, 3H), 1.80 (s, 1H), 1.68 (d, J = 6.7 Hz, 1H); 439.2[M+H]+
4
Figure pat00015
 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-5-옥사-2,9-다이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ= 11.87 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 4.54 (t, J = 10.8 Hz, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.77 (d, J = 1.5 Hz, 3H), 3.07 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.09 (d, J = 1.5 Hz, 3H), 1.85 (s, 2H); 396.2 [M+H]+
5
Figure pat00016
 33-메틸-31-(1-메틸피페리딘-4-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 11.88 (s, 1H), 9.47 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.25 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 5.90 (s, 1H), 4.45 (td, J = 11.5, 10.3, 4.9 Hz, 2H), 4.03 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 3.66 - 3.34 (m, 4H), 3.18 (s, 2H), 2.88 - 2.81 (m, 1H), 2.79 (d, J = 4.3 Hz, 3H), 2.16 (s, 2H), 1.97 (d, J = 11.8 Hz, 2H), 1.82 (t, J = 19.1 Hz, 2H); 478.3 [M+H]+
6
Figure pat00017
 33-메틸-31-(모르폴린-4-카보닐)-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=11.74 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.03 - 7.82 (m, 1H), 7.48 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 5.73 (s, 1H), 3.69 (t, J = 4.6 Hz, 8H), 3.08 (s, 2H), 2.85 - 2.65 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 1.76 (s, 2H); 494.3 [M+H]+
7
Figure pat00018
 31-메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,4)-피라졸라사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=11.80 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 8.95 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.65 - 7.57 (m, 1H), 7.52 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.61 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 3.70 (d, J = 2.3 Hz, 3H), 2.98 (s, 2H), 2.89 (s, 1H), 2.71 (s, 1H), 1.76 (s, 2H); 381.2 [M+H]+
8
Figure pat00019
 34-((2-(다이메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온 477.3 [M+H]+
9
Figure pat00020
 35-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=11.88 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 9.06 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.64 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.71 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.24 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 3.75 (d, J = 9.8 Hz, 8H), 3.18 (q, J = 11.3, 8.8 Hz, 2H), 3.09 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 1.94 (d, J = 22.6 Hz, 2H); 462.2 [M+H]+
10
Figure pat00021
 34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=12.01 - 11.81 (m, 1H), 9.10 (s, 1H), 7.83 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 7.15 - 7.09 (m, 1H), 7.04 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 6.31 (s, 1H), 3.67 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 3.08 (s, 2H), 3.01 (s, 4H), 2.96 - 2.80 (m, 2H), 1.98 - 1.82 (m, 2H); 462.0 [M+H]+
11
Figure pat00022
 36-메톡시-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=12.38 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.45 (d, J = 24.1 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.63 - 7.56 (m, 1H), 6.71 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.75 - 3.67 (m, 4H), 3.40 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 4.5 Hz, 3H), 2.86 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 2.24 - 2.16 (m, 2H), 1.68 (s, 2H), 1.60 - 1.50 (m, 2H); 506.3 [M+H]+
12
Figure pat00023
 34-((2-메톡시에틸)아미노)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=12.27 (s, 1H), 9.51 (s, 1H), 7.99 - 7.82 (m, 2H), 7.56 (s, 2H), 7.06 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.71 (s, 1H), 3.53 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.29 - 3.24 (m, 3H), 3.21 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 3.11 (q, J = 7.9 Hz, 2H), 2.85 (s, 2H), 2.04 - 1.92 (m, 2H); 450.3 [M+H]+
13
Figure pat00024
 36-메톡시-34-(4-모르폴리노피페리딘-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온 589.4 [M+H]+
14
Figure pat00025
 15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-4-온 391.3 [M+H]+
15
Figure pat00026
 36,5-다이메틸-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.66 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.43 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.06 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.62 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 3.17 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.15 - 3.04 (m, 4H), 2.98 - 2.87 (m, 5H), 2.77 (dq, J = 9.6, 4.6 Hz, 2H), 2.25 (s, 3H), 1.81 - 1.72 (m, 1H); 490.3 [M+H]+
16
Figure pat00027
 36,4-다이메틸-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.67 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.45 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 5.84 - 5.77 (m, 1H), 4.15 - 4.05 (m, 2H), 3.88 - 3.77 (m, 1H), 3.67 (ddt, J = 14.0, 10.8, 5.5 Hz, 4H), 3.09 (s, 3H), 2.99 - 2.91 (m, 2H), 2.88 - 2.82 (m, 1H), 2.79 - 2.73 (m, 2H), 2.26 (s, 3H), 1.98 - 1.88 (m, 1H), 1.87 - 1.80 (m, 1H), 1.47 - 1.41 (m, 1H), 1.35 - 1.29 (m, 1H); 504.4 [M+H]+
17
Figure pat00028
 36-메틸-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ= 12.48 (s, 1H), 9.44 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.28 - 6.22 (m, 1H), 3.61 (d, J = 6.2 Hz, 5H), 3.34 (t, J = 6.3 Hz, 3H), 2.96 (s, 2H), 2.20 (s, 3H), 1.90 - 1.77 (m, 3H); 476.3 [M+H]+
18
Figure pat00029
 36-메톡시-34-(4-(옥세탄-3-일)피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=12.19 (s, 1H), 8.78 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.71 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 7.63 - 7.48 (m, 1H), 6.69 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 6.43 (s, 1H), 4.83 - 4.72 (m, 4H), 3.89 (s, 3H), 3.43 - 3.34 (m, 4H), 3.14 (s, 4H), 3.09 (s, 2H), 2.25 (dd, J = 10.4, 5.1 Hz, 3H), 1.68 (s, 2H), 1.55 (s, 2H); 561.4 [M+H]+
19
Figure pat00030
 (33S)-56-(4-메틸피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.95 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.20 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.20 (s, 1H), 4.60 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.39 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.76 (s, 1H), 3.24 - 3.12 (m, 2H), 2.73 - 2.62 (m, 3H), 2.58 (dd, J = 21.6, 9.5 Hz, 1H), 2.36 (s, 4H), 2.18 (s, 3H), 1.96 (s, 1H), 1.85 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 1.71 (t, J = 13.0 Hz, 1H); 501.3 [M+H]+
20
Figure pat00031
 (33R)-56-(4-메틸피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.98 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.20 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 3.8, 1.7 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.81 - 3.70 (m, 2H), 3.23 - 3.18 (m, 2H), 2.71 - 2.61 (m, 3H), 2.61 - 2.53 (m, 1H), 2.36 (s, 4H), 2.18 (s, 3H), 2.01 - 1.94 (m, 1H), 1.87 - 1.79 (m, 2H), 1.76 - 1.62 (m, 1H); 501.3 [M+H]+
21
Figure pat00032
 (33S)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.92 (br s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.24 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 3.78 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.62 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 3.26 - 3.19 (m, 2H), 2.73 - 2.62 (m, 3H), 2.58 (dd, J = 12.4, 10.0 Hz, 1H), 2.00 - 1.92 (m, 1H), 1.87 - 1.80 (m, 2H), 1.78 - 1.63 (m, 1H); 488.3 [M+H]+
22
Figure pat00033
 (33R)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.92 (br s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.24 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 3.78 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.62 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 3.22 (dt, J = 11.5, 4.6 Hz, 2H), 2.66 (dt, J = 11.8, 4.8 Hz, 3H), 2.58 (dd, J = 12.4, 10.0 Hz, 1H), 2.00 - 1.92 (m, 1H), 1.87 - 1.80 (m, 2H), 1.78 - 1.63 (m, 1H); 488.3 [M+H]+
23
Figure pat00034
 (33S)-54-메틸-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.92 (br s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 5.11 (d, 1H), 4.59 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.36 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 3.73 - 3.66 (m, 1H), 3.62 (ddd, J = 5.5, 3.6, 1.5 Hz, 4H), 3.25 (dt, J = 11.9, 4.6 Hz, 2H), 2.70 - 2.60 (m, 3H), 2.55 (dd, J = 12.4, 10.1 Hz, 1H), 2.28 (s, 3H), 1.99 - 1.90 (m, 1H), 1.88 - 1.78 (m, 2H), 1.74 - 1.62 (m, 1H); 502.3 [M+H]+
24
Figure pat00035
 (33S)-54-메톡시-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.86 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.60 - 7.57 (m, 1H), 7.48 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.25 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 4.36 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.09 - 3.96 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.82 - 3.72 (m, 2H), 3.68 - 3.60 (m, 5H), 3.38 - 3.31 (m, 3H), 2.74 - 2.67 (m, 2H), 2.66 - 2.54 (m, 2H); 518.3 [M+H]+
25
Figure pat00036
 (33S)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-아제파나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.99 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.11 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.57 - 7.54 (m, 1H), 7.08 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.85 - 4.81 (m, 1H), 4.22 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 3.95 - 3.88 (m, 1H), 3.82 - 3.75 (m, 1H), 3.61 (t, J = 4.7 Hz, 5H), 3.07 - 2.97 (m, 4H), 2.69 - 2.63 (m, 2H), 1.99 - 1.91 (m, 3H), 1.80 - 1.72 (m, 2H); 502.3 [M+H]+
26
Figure pat00037
 (33R)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-아제파나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.99 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.11 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.57 - 7.55 (m, 1H), 7.08 (dd, J = 8.5, 2.5 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.86 - 4.81 (m, 1H), 4.22 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 3.95 - 3.88 (m, 1H), 3.82 - 3.76 (m, 1H), 3.61 (t, J = 4.7 Hz, 5H), 3.09 - 2.97 (m, 4H), 2.69 - 2.62 (m, 2H), 1.99 - 1.92 (m, 3H), 1.80 - 1.72 (m, 2H); 502.3 [M+H]+
27
Figure pat00038
 (33S)-55-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.02 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.59 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.86 - 6.79 (m, 1H), 6.61 - 6.54 (m, 1H), 5.26 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.83 - 4.72 (m, 1H), 4.53 - 4.42 (m, 1H), 3.88 - 3.79 (m, 1H), 3.73 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 3.10 - 3.00 (m, 4H), 2.72 - 2.63 (m, 1H), 2.57 - 2.51 (m, 1H), 2.07 - 1.98 (m, 1H), 1.92 - 1.83 (m, 2H), 1.78 - 1.64 (m, 1H); 488.3 [M+H]+
28
Figure pat00039
 (33S)-56-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.97 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.25 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.59 - 7.54 (m, 1H), 7.10 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.22 - 5.18 (m, 1H), 4.56 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 4.44 - 4.38 (m, 1H), 4.07 (dt, J = 9.7, 6.0 Hz, 2H), 3.97 (dt, J = 10.0, 6.1 Hz, 2H), 3.81 - 3.72 (m, 4H), 2.73 - 2.67 (m, 2H), 2.65 - 2.53 (m, 2H), 2.50 - 2.43 (m, 4H), 2.01 - 1.95 (m, 1H), 1.88 - 1.80 (m, 2H); 516.3 [M+H]+
29
Figure pat00040
 (33R)-54-메틸-56-(4-메틸피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.97 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.56 (q, J = 1.7 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 5.12 - 5.08 (m, 1H), 4.63 - 4.55 (m, 2H), 4.34 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 3.72 - 3.63 (m, 2H), 3.27 - 3.19 (m, 2H), 2.71 - 2.62 (m, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.37 - 2.34 (m, 3H), 2.26 (s, 3H), 1.98 - 1.90 (m, 1H), 1.78 - 1.59 (m, 2H); 515.2 [M+H]+
30
Figure pat00041
 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-9-옥사-2,5-다이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 11.84 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.35 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.54 (dt, J = 3.1, 1.7 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.57 (s, 4H), 2.13 (s, 3H), 1.99 - 1.85 (m, 2H); 396.2 [M+H]+
< 실험예 1> PAK4 효소 억제활성 평가
본 개시내용에 따른 화합물의 PAK4 키나아제 대한 활성 억제를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
실시예 화합물을 정제된 human PAK4 (full-length, SignalChem) 효소와 CDC42 효소를 함께 반응하여 하기와 같은 방법으로 효소 저해능을 평가하였다. 반응 버퍼는 40 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA, 50 μM DTT 조성으로 사용하였으며, 모든 시험물의 반응은 반응 버퍼상에서 이루어졌다. 화합물은 10 mM DMSO stock을 계열 희석법으로 12 단계로 희석하였으며, 최종 화합물의 농도 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, 0.001, 0.0003, 0.0001, 0 μM에서 효소활성을 측정하였다.
시험 시 human PAK4(0.8 ng)/human CDC42(1.6 ng) 혼합 효소와 정제된 ATP(5 μM), 효소 기질(0.2 μg)과 25 ℃에서 1 시간 반응시킨 후, 효소 활성은 in vitro ADP-GloTM kinase assay(Promega)을 이용하여 확인하였다. 2:2:1 비율로 효소활성 반응액과 ADP-Glo 반응 용액, 효소능 검출 용액을 반응시켜서 효소의 활성 저해도를 Luminescence로 측정하였다. 화합물을 처리하지 않은 용매 대조군 효소활성의 발광도를 기준으로 각 화합물들의 처리 농도에 따른 효소활성 저해 정도를 산출하였으며, 이때 효소활성 저해를 50% 억제하는 각 화합물의 농도를 IC50(nM) 값으로 결정하였고, GraphPad Prism 8.3.0(GraphPad software Inc., San Diego))을 이용하여 구하였다. 그 결과를 아래 [표 2]에 나타냈다.
실시예
화합물		 PAK4
효소 활성		 실시예
화합물		 PAK4
효소 활성		 실시예
화합물		 PAK4
효소 활성
19 A 21 A 28 A
20 B 27 A
A: IC50 < 100 nM; B: 100 nM ≤ IC50 < 1,000 nM; C: 1,000 nM ≤ IC50;
II. 허혈-재관류/저산소-재산소화에 의한 조직 손상에 미치는 PAK4의 영향
본 개시내용은 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직 손상에서 PAK4의 역할 및 작용기전을 밝히고, 이를 바탕으로 PAK4 저해제의 새로운 용도를 제공한다.
허혈-재관류에 의한 간손상은 간이식, 간절제술, 외상, 저혈량쇼크(hypovolemic shock), 과다출혈 후 수혈과 같은 다양한 병적 상황에서 발생한다. 이 과정에서 간세포에서 PAK4의 발현이 증가하고, 핵내 Nrf2의 발현이 감소하여 항산화 능력이 감소한다. 따라서 PAK4 저해제를 처리하여 핵내 Nrf2 발현 및 전사활성 유지는 간과 체내 항산화 능력을 유지하고, 궁극적으로 허혈-재관류 손상으로부터 간을 보호하게 된다.
하기 실시예에서 사용된 실험 프로토콜은 다음과 같았다.
실험 동물
실험동물은 통제된 방벽 시설 (12시간 light/dark cycle, 23+1oC, 60-70% 습도)에서 표준식이와 물을 자유로이 섭취하도록 하였다. 모든 동물 실험은 미국 국립보건원(NIH Publication No. 85-23, 2011년 개정)이 발표한 실험동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었고, 전북대학교 실험동물윤리위원회의 승인을 받았다(승인번호: JBNU-2019-00122).
간세포-특이적 PAK4 넉아웃(KO) 마우스의 제작
Pak4 flox / flox 마우스(B6.129S2-Pak4 tm2 . 1Amin /J)와 Albumin- cre(B6.Cg-Speer6-ps1 Tg(Alb-cre)21Mgn /J) 마우스를 교배하여 간세포-특이적 Pak4 KO 마우스(Pak4 flox / flox ; Albumin-cre)를 제작하였다.
허혈-재관류(ischemia-reperfusion, I/R)에 의한 부분 간 손상 모델의 제작
C57BL/6 마우스에 케타민 (100mg/kg) 및 자일라진(10m/kg)을 복강내로 주입하여 마취시켰다. 중앙선 절개를 시행하고 문맥, 간동맥, 우측 가지(branch) 바로 위의 담관을 가로질러 비외상성 클립을 설치하여 좌측 측면(left lateral) 및 중앙 엽(median lobe)으로의 혈액의 흐름을 차단하였으며, 이는 간으로 가는 총 혈액 공급의 약 70%에 해당한다. 생리식염수에 적신 거즈로 간의 습기를 유지하였으며, 허혈기간 동안 따뜻한 담요로 체온을 37 ℃로 유지시켰다. 부분 간 허혈을 시킨 후 60분 후에, 클립을 제거하고 재관류를 시작하였다. 샴(sham) 마우스는 혈관 폐색없이 동일한 절차를 진행하였다.
원하는 시간 동안 재관류 후에, 마우스를 마취하에 방혈시켜 희생시키고, 혈청 시료를 모았다. 간의 좌측 측면 및 중앙 엽을 수득하여 추가의 분석을 진행할 때까지 -80 ℃에서 보관하였으며, 또는 즉시 10% 포르말린에 고정하였다.
일차배양 간세포(primary hepatocyte)의 분리
8~10주령의 한 배의 새끼의 마우스로부터 관류를 통하여 1차 간세포(primary hepatocyte)를 준비하였다. 하대 정맥에 삽관 후, 칼슘이 없는 HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)으로 0.35 ml/min의 유속으로 5분 동안, 이어서 5mM 염화칼슘과 함께 5 ㎍의 콜라게나제 IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함유하는 HEPES 완충액으로 5분동안 간을 관류시켰다. 간세포를 10% FBS, 10 units/ml 페니실린, 10 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 42% 퍼콜과 혼합된 10 nM 덱사메타손으로 보충된 DMEM/F12에 재현탁하고 1300 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포를 6-웰 배양접시에 1x106 cells/well로 플레이팅하였다.
저산소-재산소화 (hypoxia-reoxygenation, H/R) 프로토콜
산소 흡수 팩(AnaeroGen, Oxoid)을 가지는 무산소 배양통(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England)에서 일차배양 간세포를 37 ℃에서 배양하였다. 이 방법은 1% 미만의 배양통 내의 산소 수준을 달성하였다. 다양한 기간 동안의 저산소 상태 후에, 챔버를 열고 저산소 배지를 산소를 함유하는 배지로 교체하여 세포의 재산소화를 개시하였다.
세포 배양 및 일시적 감염
인간 배아 신장 세포주 HEK239T는 ATCC (manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. Nrf2 리포터 유전자 분석을 위해서, 루시퍼라제 발현을 구동하는 항산화 반응요소(ARE, antioxidant responsive element)와 함께 프로모터를 함유하는 플라스미드 1 ㎍을 사용하였다. HEK293T 세포를 리포펙타민 3000 (Invitroge, Carlsbad, CA, USA)과 함께 0.1~1 ㎍의 NrF2, PAK4, PAK4S474A로 감염시켜 외부 단백질을 발현시켰다. 루시퍼라제 활성은 Lumat LB 9570 (Berthold, Bad Wildbad, Germany)로 Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega, Madson, WI, USA)를 사용하여 측정하였다.
화학적 분석
알라닌 아미노 전이효소 (ALT), 아스파르산 아미노 전이효소 (AST) (아산 약품, 서울, 한국) 및 간에서 글루타치온의 수준(GSH, Arbor Assays, AnnArbor, Michiganm, USA) 및 말론다이알데하이드 (MDA, ab118970, Abcam, Cambridge, UK)는 상업적인 키트를 사용하여 분석하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α 및 CCL-2의 혈중 수준은 모두 Invitrogen 으로부터 구입한 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
비실질세포(nonparenchymal cell)의 유세포분석(flow cytometry analysis)
간의 비실질세포는 콜라게나제 IV 효소 분해로 분리하였다. Fcγ 수용체에 대한 비특이적 결합을 차단하기 위하여 세포를 항-CD16/CD32 항체 (1:100, #14-0161-86)로 30분간 인큐베이션하였다. FITC-컨쥬게이티드 항-F4/80 항체 (1:200, #123108), PE-컨쥬게이티드 항-Ly6G 항체 (1:200, #108408) 및 APC-컨쥬게이티드 항-CD11b 항체 (1:200, #101212)로 4℃, 30분간 염색하였다. 모든 항체는 인비트로젠으로부터 구입하였다. FACS 완충액 (인산완충액 중 3% FBS)으로 세번 세척한 후, 세포를 AccurTM flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.
RNA 분리 및 qPCR
TRIzol 시약(인비트로젠)을 사용하여 냉동된 간 조직 또는 일차배양 간세포로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA를 70% 에탄올을 사용하여 건조시킨 이소프로판올로 침전시키고, 디에틸피로카르보네이트-처리된 증류수에 용해시켰다. First-strand cDNA 합성 키트 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)에서 제공하는 랜덤 헥사머 프라이머를 사용하여 fist-strand cDNA를 생성시켰다. 특정 프라이머는 PrimerBank (https ://pga. mgh .harvard. edu / primerbank)를 사용하여 디자인하였다. 아래표는 qPCR에 사용된 프라이머의 서열을 보여준다.
Figure pat00042
qPCR 반응을 10 ng 역전사된 총 RNA, 200 nM 전방향 및 역방향 프라미어 및 PCR master mixture를 포함하는 최종 부피 10 ㎕로, ABI PrismTM 7900 sequence Detection System (applied Biosystems)를 사용하여 384-웰 플레이트에서 수행하였다.
세포이하 분획(subcellular fractionation), 웨스턴블롯, 공-면역침전(Co-IP)
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 핵 및 세포질 분획을 제조하였다. 조직 균질액 또는 세포 용해액 (15 ㎍)을 6~14% SDS-PAGE 로 분리하고, PVDF 막으로 이전시켰다. 5% skim milk로 차단한 후, 블롯을 PAK4, p-PAK4 (S474A), p-IKKα/β, p-IKBα, p-p65, 절단된 caspase-3, Bax (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), GAPDH, lamin B1, Bcl2, NQO1 (Bioworld Technology, St Louis Park, MN, USA), p65, IKBα, Ub (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), Nrf2 (Proteintech, Rosemont, IL, USA), HO-1 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, USA), p-Thr, 및 p-Ser (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 대한 일차항체로 입증하였다.
공-면역침전을 위해서는 600 ㎍의 단백질을 항-Nrf2 항체(Proteintech, Sankt Leon-Rot, Germany)와 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음, protein G 아가로스와 4 ℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 블롯을 PAK4, Nrf2, p-Ser, 또는 p-Thr에 대한 항체로 입증하였다.
조직학(histology)
광학현미경 관찰을 위하여 간 조직의 파라핀 섹션 (5 ㎛)를 헤마토실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. TUNEL 염색은 상업적 키트 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 실시하였다. 괴사면적 및 아폽토틱 세포의 퍼센트를 결정하기 위하여 한 슬라이드 당 5~6개의 랜덤 섹션을 조사하였다.
괴사 면적을 측정하기 위하여, 섹션을 Axiovert 40 CFL 현미경 (CARl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하고, iSolution DT 36 소프트웨어 (Carl Zeiss)를 사용하여 측정하였다. DAKO Envision 시스템 (DAKO, Carpinteria, CA, USA)을 사용하여 면역조직학적 염색을 실시하였다. 파라핀을 제거하고 수화시킨 후, 조직 섹션에 0.01 M 시트르산 나트륨 완충액에서 전자파 항원-회수 절차를 실시하였다. 면역형광염색을 위하여 파라핀을 제거하고 섹션을 PAK4에 대한 항체 (ab173315, Abcam), hepatocyte nuclear factor 4α에 대한 항체 (HNF4α, ab41898), F4/80에 대한 항체 (ab6640), Ly6G에 대한 항체 (ab25377), 650 CD68에 대한 항체 (ab125212), 4-hydroxynonenal에 대한 항체 (HNE, ab46545) (모두 Abcam 제품)로 면역염색하였다. 인산완충용액으로 세척 후, 이차 항체(Alexa Fluor 488-접합 염소 항-마우스 IgG1 및 Alexa fluor 594-접합 염소 항-토기 IgM, Thermo Fisher Scientific)를 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 섹션을 DAPI로 대조염색제로 착색하였다.
RNA 염기서열 (RNA-seq) 분석
간 허혈-재관류 (즉, 1시간 부분 허혈 후 6시간 재관류)를 받은 한 배 새끼 및 간세포 특이적 PAK4 KO 마우스의 간 조직으로부터의 RNA를 사용하였다. 총 RNA 농도를 Quant-IT RiboGreen (Invitrogen, #R11490)으로 계산하였다. 총 RNA의 무결성을 평가하기 위하여 시료를 TapeStation RNA screentape (Agilent, #5067-5576) 상에서 실행하였다. 7.0 보다 큰 RIN을 가지는 고품질의 RNA 제조물만이 RNA 라이브러리 구축을 위하여 사용되었다. 라이브러리는 일루미나의 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina Inc, San Diego, CA, USA, #20020599)로, 각 시료당 0.5 ㎍의 총 RNA로 각각 독립적으로 제조되었다. 작업흐름의 첫번째 단계는 총 RNA로부터 rRNA를 제거하는 것을 포함하였다. 이 단계 후에, 남은 mRNA를 상승된 온도 하에 이가 양이온을 사용하여 작은 조각으로 절단하였다. 절단된 RNA 절편은 SuperScript II reverse transcriptase (Invtrogen, #18064014) 및 random primer를 사용하여 제1 가닥 cDNA로 복제하였다. 다음, DNA Polymerase I, RNase H 및 dUTP를 사용한 제2 가닥 cDNA 합성을 실시하였다. 다음, 이들 cDNA 절편들에 하나의 ‘’염기를 부가하는 단부 수선 과정 및 다음, 어탭터를 결찰하였다. 다음, 최종 cDNA 라이브러리를 만들기 위하여 생산물을 정제하고 PCR을 실시하여 풍부하게 만들었다. qPCR 정량 프로토콜 가이드(KAPA BIOSYSTEMS, #KK4854)에 따라 Illumina Sequencing platforms을 위한 KAPA 라이브러리 정량 키트를 사용하여 라이브러리를 정량하고, TapeStation D1000 ScreenTape (agilent Technologies, #5067-5582)를 사용하여 검사하였다. 다음, 인덱스딘 라이브러리를 Illumina NovaSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)에 제출하였으며, Macrogen Inc.에 의하여 paired-end (2 x 100 bp) 시퀀싱을 실시하였다.
유전자의 상대 빈도(relative abundances)를 StringTie를 사용하는 Read Count로 측정하였다. 차등발현된 유전자 (DEGs, differentially expressed genes)를 찾아내기 위하여 시료 내의 각 유전자에 대한 추정 빈도를 사용하여 통계 분석을 실시하였다. 시료 내의 zeroed Read Count 값보다 1 이상 큰 유전자는 제외시켰다. Log2-변환을 위하여 필터링된 유전자의 각 Read Count 값에 1을 더하였다. 필터링된 데이터를 log2 변환을 시키고 TMM normalization을 하였다. edgeR 및 배수 변화(fold change)와 함께 exactTest를 사용하여 차등 발현 데이터의 통계적 의미를 결정하였다. Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 보정하여 false discovery rate (FDR)을 조절하였다. DEG 세트에 대하여, complete linkage 및 유사도 척도로써 Euclidean distance를 사용하여 hierarchical clustering 분석을 실시하였다. gProfiler (https :// biit .cs.ut. ee / gprofiler / gost) 및 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway (http://www.genome.jp/keff/pathway.html)를 기반으로 의미있는 유전자 리스트에 대한 gene-enrichment 및 functional annotation 분석 및 경로 분석을 실시하였다.
Gene set enrichment 분석 ( GSEA )
GSEA 4.1.0 소프트웨어를 사용하여 RNA-seq 데이터를 분석하였다. 분석을 위하여 Molecular Signatures Database (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb) v7.4의 hallmark gene set이 사용되었다. NES의 통계적 의미 평가를 위하여 FDR이 사용되었다. FDR<0.25인 유전자 세트는 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다. 유전자 상호작용 네트워크는 GeneMANIA (https://genemania.org/)에 의하여 평가되었으며, Cytoscape 3.8.2 소프트웨어 (http://www.cytoscape.org)를 사용하여 시각화하였다.
시험관 내 키나아제 분석
5 μCi의 [γ-32P]ATP 및 50 μM cold ATP를 함유하는 분석 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT 및 0.1 mM EDTA)에서 재조합 Nrf2 (0.6 ㎍, ab132356, Abcam)를 활성 PAK4 (0.2 ㎍, ab96405, Abcam)과 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 다음, 반응물을 SDS-PAGE하고 32P-표지된 단백질을 방사능사진촬영으로 검출하였다. 쿠마시블루 염색을 위하여 겔을 쿠마시 단백질 염색 완충액 (ab119211, Abcam)에서 1시간 염색하였다. 펩타이드 경쟁 분석을 위하여, Ser168, Thr211 또는 Thr369를 포함하는 각 영역에 해당하는 합성 15-residue 올리고펩타이드가 사용되었다.
Nrf2 돌연변이체의 돌연변이 생성
인간 Nrf2 플라스미드 벡터 (클론 ID, OHu26812)를 GenScript (Tokyo, Japan)로부터 공급받았다. Nrf2의 돌연변이체를 site-directed mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 의하여 생성하였다. 다음과 같이 Nrf2의 세린 또는 트레오닌 잔기를 알라닌으로의 점돌연변이를 도입하여 Nrf2-S168A, Nrf2-T211A 및 Nrf2-T360A 돌연변이체를 생성하였다: Nrf2-S168A (TCT→ GCT), Nrf2-T211A (ACC→ GCC) 및 Nrf2-T360A (ACA→ GCA).
통계처리
데이터는 평균±SD로 나타낸다. 통계적 비교를 위해서 Fixher’post hoc 일원분산분석을 사용하였다. 그룹들간의 차이의 유의성은 Student’unpaired t-test를 사용하여 결정하였다. 0.05 미만의 p 값일 때 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 31: 허혈- 재관류로 손상된 간 및 저산소- 재산소화한 일차배양 간세포에서의 PAK4의 발현
도 1의 프로토콜에 따라 1시간 동안 허혈 후 재관류시킨 야생형 마우스의 간(A) 및 1시간 동안 저산소 후 재산소화한 일차배양 간세포(B)에서 PAK4의 발현을 평가하였다.
정상 간(샴, 허혈시키기 이전)에서는 PAK4의 단백질 및 mRNA 수준이 모두 낮았으나, 허혈/재관류 후에 크게 증가하여 수술 후 24시간에 절정에 도달하였다 (도 2a의 A-C 및 도2b의 D). (A)는 허혈-재관류 후에 시간의 변화에 따른 PAK4 단백질의 발현 증가를, (B)는 PAK4 mRNA의 발현 증가를 보여주고 있다. (C, D)는 허혈-재관류 후 6시간 혹은 24시간 후에 PAK4 단백질 증가를 면역조직화학염색(C)과 면역형광염색(D)을 통해 관찰한 것이다.
또한, 일차배양 간세포에 저산소-재산소화 후에도 역시 PAK4의 단백질 및 mRNA 발현이 증가하였다(도 2b의 E, F).
간세포에서의 이러한 상향조절은 PAK4가 허혈/재관류로 인한 간 손상의 발병에 관련될 가능성을 시사한다.
실시예 32: 허혈-재관류에 의한 간 손상에 PAK4의 유전적 결손의 영향
PAK4 유전적 과발현 혹은 결손이 허혈-재관류에 의한 간 손상에 영향을 미치는지 확인하기 위해 간세포 특이적 PAK4 KO(녹아웃) 마우스를 사용하였다.
도 3a의 A는 야생형 마우스 및 PAK4 KO 마우스의 간에서의 PAK4 수준을 나타낸다. PAK4 KO 마우스에서 PAK가 결손되었음을 보여준다.
도 3a의 B 및 C는 각각 허혈-재관류 후 헤마톡실린-에오진 염색 및 괴사 면적을 분석한 것이다. 야생형(WT)과 KO 마우스에 허혈-재관류를 시행했을 경우, 야생형 마우스에 비해 KO 마우스에서 간 조직의 괴사가 유의하게 감소함을 보여준다. 이 결과는 간세포 손상 표지 단백질인 AST와 AKT의 혈중 수치 감소로 확인된다(도 3a의 D).
도 3b의 E는 간 조직의 CD68+ (대식세포 macrophages), F4/80+ (대식세포), Ly6G+ (호중구 neutrophils) 및 TUNEL+ (세포자멸사) 세포에 대한 면역형광 염색 결과 사진 및 이를 정량화한 그래프이다. 허혈-재관류 후에, 야생형 마우스에 비해 KO 마우스의 간 조직에서 염증세포인 대식세포와 호중구 세포의 침윤이 감소되어 있음을 보여준다.
도 3b의 F 및 G는 각각 혈중 및 간 조직 내의 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인/케모카인의 단백질 및 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다. 혈중과 간 조직 내에서 다양한 사이토카인 수치가 KO 마우스에서 감소되어 있음을 보여준다.
이와 같이, PAK4 KO 마우스의 경우 PAK4 저해제를 처리한 결과와 비슷하게 허혈-재관류에 의한 간 조직의 괴사(도 3a의 B, C), 간세포 손상(도 3a의 D), 염증세포 침윤(도 3b의 E), 세포자멸사(도 3b의 E), 사이토카인 발생(도 3b의 F 및 G)이 정상 대조군 마우스에 비해 현저히 감소하였다. 이는 간세포 특이적 PAK4 KO 마우스가 대조군(야생형, WI)에 비해 허혈-재관류에 의한 간 손상으로부터 보호된다는 것을 보여준다.
실시예 33: 허혈- 재관류에 의한 간 손상 및 염증에 대한 PAK4의 유전적 과발현의 영향
PAK4를 과발현하기 위해서는 C57BL/6 마우스에 1 x 109 pfu의 PAK4를 발현하는 아데노바이러스(Ad-PAK4), 인산화 효소 기능을 제거한 PAK4 변이 아데노바이러스(Ad-PAK4S474A), 대조군 바이러스(Ad-LacZ)를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 바이러스 주사 후 1 시간 동안의 허혈과 6시간 혹은 24시간 동안의 재관류를 실시하였다(도 1A).
도 4a 및 4b는 아데노바이러스를 이용해서 PAK를 과발현시켰을 때 허혈-재관류에 의한 간손상이 악화됨을 보여주고 있다.
도 4a의 A는 간 조직의 균질액의 PAK4 단백질을 검출한 결과이다. PAK4 아데노바이러스(Ad-PAK4)와 인산화 기능을 제거한 PAK4 변이 아데노바이러스(Ad-PAK4S474A)를 마우스에 주사했을 때 간 조직 내에서 PAK4의 발현이 증가함을 보여주고 있다.
도 4a의 B 및 C는 각각 간 절단면의 현미경 사진 및 괴사 면적을 정량화한 그래프이다. 이는 대조군 아데노바이러스(Ad-LacZ) 투여군에 비해 Ad-PAK4 투여군에서 괴사 및 간세포 손상이 증가함을 보여주고 있다. 하지만 Ad-PAK4S474A 투여군은 괴사 및 손상을 일으키지 않았다. 이 결과는 간세포 손상 표지 단백질인 AST와 ALT의 혈중 수치 감소로 확인된다(도 4a의 D).
도 4b의 E는 간 조직의 CD68+ (대식세포, macrophages), F4/80+ (대식세포), Ly6G+ (호중구, neutrophils) 및 TUNEL+ (세포자멸사) 세포에 대한 면역형광 염색 결과 사진 및 이를 정량화한 그래프이다. 허혈-재관류 후에, 대조군 또는 변이 아데노바이러스 투여군에 비해 Ad-PAK4 투여군에서 염증세포인 대식세포와 호중구 세포의 침윤이 증가되어 있음을 보여준다.
도 4b의 F 및 G는 각각 혈중 및 간 조직 내의 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인/케모카인의 단백질 및 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다. PAK4에 의해 간 조직과 혈중에서 사이토카인 발현이 증가함을 보여주고 있다.
이와 같이, PAK4를 과발현 했을 경우(Ad-PAK4 군), 허혈-재관류에 의한 간 조직의 괴사(도 4a의 B 및 C), 간세포 손상(도 4a의 D), 염증세포 침윤(도 4b의 E), 세포자멸사(도 4b의 E), 사이토카인 발생(도 4b의 F, G)이 대조군 바이러스(Ad-LacZ 군) 마우스에 비해 현저히 증가하였다. 하지만 PAK4의 인산화 기능을 제거한 PAK4 변이 아데노바이러스를 투여한 경우 (Ad-PAK4S474A 군) 간손상이 악화되지 않아 PAK4의 인산화 효소 기능이 간 손상에 핵심적인 요소임을 알 수 있었다.
실시예 34: PAK4에 의한 활성산소 발생 증가
PAK4의 유전적 결손 혹은 효소활성 억제의 허혈-재관류에 의한 간 손상 억제 기전을 찾기 위해 야생형과 PAK4 KO 마우스에 허혈-재관류 손상을 가한 후 간 조직에서 RNA 서열 분석을 실시하였다.
야생형 및 PAK4 KO 마우스(도 5a 및 도 5b의 A~E) 또는 PAK4 과발현 C57BKL/6 마우스 (도 5b의 F, G)에 간 허혈-재관류 손상을 주었다.
도 5a의 A는 야생형 및 PAK4 KO 마우스에 허혈-재관류 손상을 가한 후에 간 조직의 RNA 서열분석을 시행한 결과이다. 간에서 차등적으로 발현된 유전자들에 대한 KEGG 경로 및 유전자 온톨로지 분석 (gene ontology biological process)을 실시하였다. PAK4 KO 마우스에서 기존에 알려진 세포골격, 증식, 성장에 관련된 유전자 뿐만 아니라 염증 혹은 스트레스에 관련된 유전자 발현이 감소되었다. Gene set enrichment analysis (GSEA)으로 KO 마우스에서 활성산소 발생이 감소하였음을 확인하였다(도 5a의 B). GeneMANIA 분석을 실시한 결과, Nrf2는 상기 B에서 확인된 ROS 경로의 활성산소 발생과 관련된 유전자 군과 관련성이 있었다(도 5a의 C).
이러한 유전자 변화의 결과로 허혈-재관류 후에 간 조직과 혈액에서 PAK4 발현과 활성산소 발생과 양의 상관관계가 있음을 보여준다. 다음, 이들 마우스의 간에서 산화적 스트레스 마커들, 즉 지질 과산화 마커인 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) 및 말론알데하이드(MDA), 그리고 GSH 수준을 평가하였다.
이들 산화적 스트레스 마커들은 PAK4의 발현과 상관 관계가 있었다. PAK4 KO 마우스의 PAK4 결손 간 조직에서 허혈-재관류 후에 활성산소 발생을 표지하는 4-HNE-양성 간세포의 숫자가 야생형에 비하여 의미 있게 감소하였고(도 5a의 D), 반대로 아데노바이러스에 의해 PAK4를 과발현 시킬 경우 간의 허혈-재관류 후 4-HNE 양성 간세포의 숫자가 증가하였다. 하지만 PAK4S474A의 경우는 그렇지 않았다(도 5a의 F). 이러한 조직학적 결과는 간에서의 MDA 및 GSH의 수준에 의하여 뒷받침되는데, PAK4의 결손으로 GSH의 수준이 증가하고, MDA의 수준이 감소하였으며(도 5a의 E), 반면에 PAK4의 과발현으로 혈중 GSH가 감소하고 혈중 MDA가 증가하였다(도 5a의 G).
실시예 35: PAK4에 의한 Nrf2의 안정성 및 전사활성 조절
상기 실시예 34의 Genemania 분석을 통하여 PAK4 KO 마우스에서 활성산소 발생에 Nrf2가 밀접하게 관련되어 있음을 확인하고(도 5a의 C), Nrf2가 PAK4의 잠재적인 하위표적일 것으로 예상하였다. 따라서 PAK4가 Nrf2를 직접 인산화시켜 Nrf2의 항산화 효소 발현을 조절하는지 조사하였다.
HEK293T 세포에 Nrf2 및 PAK4를 과발현시킨 후, ARE-luciferase assay를 실시하였으며, 결과는 PAK4가 Nrf2의 전사활성을 의미 있게 억제함을 나타냈다. 그러나 PAK4S474A는 그렇지 않았다(도 6a의 A).
위의 실험결과와 일치하게, PAK4가 과발현 후 허혈-재관류를 실시한 경우 야생형 마우스에 비하여 총 Nrf2 및 핵 Nrf2의 수준이 감소한 반면, PAK4가 결손된 KO 마우스에서는 허혈-재관류 후에 핵내 Nrf2의 양이 야생형 마우스에 비하여 증가하였다(도 6a의 B). 핵내 Nrf2 양이 Nrf2에 의해 조절되는 항산화 효소(예를들어, NQO1, HO-1 등) 발현에 필수적임을 감안하면 마우스 간 조직에서도 PAK4에 의해 Nrf2의 전사활성이 억제됨을 확인할 수 있었다.
이러한 효과는 일차배양 간세포의 저산소-재산소화 손상 실험에서도 확인되었다. 저산소-재산소화에 의해 PAK4는 핵내 Nrf2를 세포질로 이동시켰다(도 6b의 C, D, E).
Nrf2 활성은 주로 핵 축적 및 단백질 안정성에 의하여 결정된다. CHX 추적 실험 결과에 따르면, PAK4의 제거는 Nrf2의 단백질 안정성을 증가시켰다(도 6c의 F). 이와 일관되게, PAK4 과발현은 MG132의 존재 하에 Nrf2의 유비퀴틴화를 눈에 띄게 증가시켰다(도 6c의 G). PAK4 결손에 의하여 Keap1 발현이 증가하여, Nrf2의 Keap 1 의존적 조절의 가능성이 배제되었다(도 6c의 H).
상기와 같은 결과들은 PAK4에 의해 활성산소 발생은 Nrf2 단백질의 전사활성과 단백질 안정성(protein stability) 조절을 통해 일어남을 보여준다.
실시예 36: PAK4에 의한 Nrf2의 T369 인산화
PAK4에 의한 Nrf2 단백질 안전성 및 전사활성 조절 기전을 밝히기 위해, Nrf2의 인산화를 측정하였는데, 이는 Nrf2의 세포 내 분포 및 단백질 안정성의 변화를 결정하는 중요 요소이기 때문이다.
HEK293T 세포에 PAK4를 과발현 시킨 후에 공면역침전(Co-IP)과 in vitro kinase assay를 통해, PAK4와 Nrf2 사이의 물리적인 상호작용 및 PAK4가 Nrf2를 직접적으로 인산화시킴을 밝혔다(도 7a의 A, B). 그러나, PKC 또는 GSK-3β에 의하여 매개되는 Nrf2의 Ser40의 인산화는 PAK4 KO 마우스의 간에서 변하지 않았다 (도 6c의 H 참조).
PAK4에 의하여 인산화되는 Nrf2의 특정 부위를 확인하기 위하여 PhosphoNET을 사용하는 생물정보학적 접근법을 사용하여 잠재적인 인산화 사이트를 예측하였다. 인간 Nrf2 단백질에서 3개의 잔기 (즉, S168, T211 및 T369)가 확인되었다.
펩티드 경쟁 시험관 내 키나아제 분석(peptide competition in vitro kinase assay)를 통해 Nrf2 단백질의 세 군데 인산화 후보 중에 T369 영역을 포함하는 펩티드가 PAK4에 의한 Nrf2 인산화를 효율적으로 저해하였으며, S168 또는 T211을 포함하는 펩티드는 약간 저해하였다(도 7a의 C). 이는 PAK4의 존재 하에, 3개의 부위 모두 Nrf2의 인산화에 기여함을 시사한다.
이를 더 확인하기 위하여, 세린 또는 트레오닌을 알라닌으로 치환한 인산화-불활성화 돌연변이체를 제작하여 Co-IP 및 웨스턴블롯 분석을 실시하였다. Nrf2의 T369부위를 알라닌으로 치환한 T369A mutant의 경우 PAK4에 의한 Nrf2 인산화를 효과적으로 억제하였다 (도 7a의 D). ARE 리포터 분석 역시 Nrf2T369A 돌연변이체 만이 PAK4에 의한 Nrf2의 전사활성 억제를 눈에 띄게 차단하여(도 7a의 E), PAK4에 의한 Nrf2의 T369 인산화가 Nrf2의 전사활성을 감소시키는데 핵심적인 과정임을 나타내준다.
나아가, PAK4가 유도하는 Nrf2의 핵 수출(nuclear export) 및 유비퀴틴화는 Nrf2T369A 돌연변이체에서는 관찰되지 않았다(도 7b의 F, G). Nrf2T369A 돌연변이체는 PAK4에 의한 Nrf2의 전사활성 억제를 회피하고(도 7b의 E), 핵내 Nrf2 발현을 높이고(도 7b의 F), 프로테아좀을 통한 Nrf2 단백질 분해를 억제하고(도 7b의 G), 사이토카인 생성을 억제하고(도 7b의 H), 세포자멸사를 억제하고, 항산화 효소 발현을 높였다(도 7b의 I).
상기 실험 결과들로부터, PAK4는 T369에서 Nrf2를 인산화하고, Nrf2를 불안정하게 하여 간 허혈-재관류 동안 간세포에서의 산화적 스트레스를 조절한다는 것을 알 수 있다.
실시예 37: 간 허혈- 재관류에 대한 PAK4 결핍의 보호효과에 대한 Nrf2 유전자 넉다운의 영향
Nrf2 억제와 PAK4-의존적 간 허혈-재관류 손상 사이의 직접적인 인과관계를 보이기 위하여, Nrf2 넉다운 실험을 실시하였다. 야생형 및 PAK4 KO 마우스에 Ad-shNrf2 또는 Ad-shLacZ를 주입(도 8a의 A)하고, 야생형 및 PAK4 KO 마우스로부터 분리한 일차배양 간세포에 Nrf2를 타겟팅하는 siRNA를 도입하여(도 8a의 B) Nrf2의 발현을 억제하였다. Nrf2의 넉다운은 허혈-재관류에 따른 간 손상을 증가시켰으며(혈청 AST 및 ALT 수준, 간 손상 및 세포자멸사, 산화적 스트레스 및 염증의 증가), PAK4 결핍에 의한 이들 마커들의 향상을 제거하였다(도 8a 및 도 8b의 E~H).
PAK4 효과와 관련한 Nrf2의 특이성 또한 일차배양 간세포에서 재현되었다. Nrf2-siRNA로 감염된 야생형 및 PAK4 KO 마우스 간세포사이에서 세포자멸사 마커 및 전염증성 사이토카인의 수준에서 차이가 없었다 (도 8b의 I, J).
실시예 38: PAK4 저해제의 간 손상에 대한 영향
본 개시내용에서 제공하는 경구투여가 가능한 신규 저분자 PAK4 저해제인 ND201651 (실시예 19의 화합물, (33S)-56-(4-메틸피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온)(도 9a의 A)이 허혈-재관류에 의한 간 손상에 영향을 평가하였다. ND201651 (50 mg/kg)을 도 9a의 B에서 보는 바와 같이 허혈-재관류 48시간, 12시간, 6시간 전에 경구투여를 통해 주입하였다. 재관류 후 6시간, 24시간 후에 혈청 및 간 조직을 수집하여 조직학적으로 분석하고, mRNA와 단백질 발현을 비교하였다.
ND201651은 강력한 ATP-경쟁적 PAK4 저해제이며, PAK1 대비 탁월한 PAK4 선택성을 가지는 것으로 판명되었다. PAK4 IC50는 4.22 nM, PAK1 IC50는 1200 nM이었다.
첫번째 ND201651 경구 투여 (50mg/kg, 연속 3일) 후 72 시간에 마우스 간은 허혈-재관류에 의한 간 손상이 거의 완전히 차단되었다. 이는 비히클 대조군과 비교하여 간세포 괴사, 세포자멸사, 산화적 스트레스 및 사이토카인 방출의 뚜렷한 억제로 나타났으며(도 9a의 D 및 도 9b의 E~G), 허혈-재관류 조건 하에서 Nrf2의 핵내 축적 및 타겟 유전자의 유도와 관련이 있다(도 9a의 C).
상기 결과들은 PAK4 KO 마우스에서의 결과와 일치한다(도 2a, 도 2b, 도 5a의 B).
이상으로 본 개시내용 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태 일뿐이며, 이에 의해 본 개시내용의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 개시내용의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 아래에 기재된 과제의 지원을 받아 출원을 진행하는 것이다.
Figure pat00043

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환, 허혈-재관류로 인한 질환, 저산소-재산소화로 인한 질환, 멜라닌 색소 과다 침착 질환, 근육 재생, 파킨슨병, 근위축성 측생경화증과 같은 신경계 질환, 고혈압, 에이즈, 다낭성신종, 골다공증으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 또는 치료용 약학적 조성물
    [화학식 1]
    Figure pat00044

    상기 화학식 1에서,
    X는 -C1할로알킬이고,
    Y는 아릴 또는 5-6원 헤테로아릴이고 {여기서, 상기 아릴 또는 5-6원 헤테로아릴의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6아미노알킬, -C1- 6하이드록시알킬, -C1- 6할로알킬, -C1-6알킬-O-C1-6알킬, -CN, -NR1R2, -OR3, -할로, -사이클로알킬, -C(=O)-사이클로알킬, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음 [이때, -사이클로알킬, -C(=O)-사이클로알킬, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6아미노알킬, -C1- 6하이드록시알킬, -사이클로알킬, 또는 -헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음]}
    L1은 -C(=O)-NR4-, -C(=O)-O-, -NR5-C(=O)-, 또는 -C(=O)-(헤테로사이클로알킬)-이고 {여기서, -C(=O)-(헤테로사이클로알킬)-의 헤테로사이클로알킬 고리는 N을 하나 이상 함유하고 N은 -C(=O)-에 연결된 것임}
    L2는 -NH- 또는 -O-이고,
    n은 O, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고 {여기서, n이 0인 경우 L1 및 L2는 직접 연결됨},
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), 또는 -C1-6알킬-O-C1-6알킬이고,
    R3는 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), -C1- 6알킬-O-C1- 6알킬, 또는 -C1- 6알킬-헤테로사이클로알킬이고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 -C1-6알킬이다.
  2. 제1항에 있어서,
    X는 -CF3이고,
    Y는 페닐 또는 5-6원 헤테로아릴이고 {여기서, 상기 페닐 또는 5-6원 헤테로아릴의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-O-C1- 6알킬, -NR1R2, -OR3, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음 [이때, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬 또는 -헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음]}
    L1은 -C(=O)-NR4-, -C(=O)-O-, -NR5-C(=O)-,
    Figure pat00045
    ,
    Figure pat00046
    ,
    Figure pat00047
    ,
    Figure pat00048
    , 또는
    Figure pat00049
    이고;
    L2는 -NH- 또는 -O-이고,
    n은 O, 1, 2, 3, 또는 4 이고 {여기서, n이 0인 경우 L1 및 L2는 직접 연결됨},
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), 또는 -C1-6알킬-O-C1-6알킬이고,
    R3는 -H, -C1-6알킬, 또는 -C1-6알킬-헤테로사이클로알킬이고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 -C1- 6알킬인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물
    (1) 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온
    (2) 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로데카판-4-온
    (3) 31-(2-메톡시에틸)-33-메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온
    (4) 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-5-옥사-2,9-다이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온
    (5) 33-메틸-31-(1-메틸피페리딘-4-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온
    (6) 33-메틸-31-(모르폴린-4-카보닐)-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온
    (7) 31-메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,4)-피라졸라사이클로노나판-4-온
    (8) 34-((2-(다이메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온
    (9) 35-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온
    (10) 34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온
    (11) 36-메톡시-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온
    (12) 34-((2-메톡시에틸)아미노)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온
    (13) 36-메톡시-34-(4-모르폴리노피페리딘-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온
    (14) 15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-4-온
    (15) 36,5-다이메틸-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온
    (16) 36,4-다이메틸-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온
    (17) 36-메틸-34-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,5,9-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로노나판-4-온
    (18) 36-메톡시-34-(4-(옥세탄-3-일)피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,4,10-트라이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(1,3)-벤젠사이클로데카판-5-온
    (19) (33S)-56-(4-메틸피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (20) (33R)-56-(4-메틸피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (21) (33S)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (22) (33R)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (23) (33S)-54-메틸-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (24) (33S)-54-메톡시-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (25) (33S)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-아제파나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (26) (33R)-56-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-아제파나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (27) (33S)-55-모르폴리노-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (28) (33S)-56-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온
    (29) (33R)-54-메틸-56-(4-메틸피페라진-1-일)-15-(트라이플루오로메틸)-17H-2,6-다이아자-1(4,2)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(3,1)-피페리디나-5(1,3)-벤젠사이클로헥사판-4-온; 및
    (30) 31,33-다이메틸-15-(트라이플루오로메틸)-17H,31H-9-옥사-2,5-다이아자-1(2,4)-피롤로[2,3-d]피리미디나-3(4,5)-피라졸라사이클로노나판-4-온.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 1의 화합물은 PAK4의 저해, Nrf2의 인산화 억제 및 Nrf2 단백질의 안정성 및 전사활성 증가로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 자가면역성 질환 및 만성 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화 관련 질환은, 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화로 인한 간 손상, 뇌 손상, 폐 손상, 신장 손상, 심근 손상, 골격근 손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 일광 흑색증, 피부미백을 포함한 멜라닌 색소 과다 침착 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 이의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 PAK4의 활성 또는 발현 억제제의 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직 또는 세포의 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00050

    상기 화학식 1에서,
    X는 -C1할로알킬이고,
    Y는 아릴 또는 5-6원 헤테로아릴이고 {여기서, 상기 아릴 또는 5-6원 헤테로아릴의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6아미노알킬, -C1- 6하이드록시알킬, -C1- 6할로알킬, -C1-6알킬-O-C1-6알킬, -CN, -NR1R2, -OR3, -할로, -사이클로알킬, -C(=O)-사이클로알킬, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음 [이때, -사이클로알킬, -C(=O)-사이클로알킬, -헤테로사이클로알킬, 또는 -C(=O)-헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1- 6알킬, -C1- 6아미노알킬, -C1- 6하이드록시알킬, -사이클로알킬, 또는 -헤테로사이클로알킬로 치환될 수 있음]}
    L1은 -C(=O)-NR4-, -C(=O)-O-, -NR5-C(=O)-, 또는 -C(=O)-(헤테로사이클로알킬)-이고 {여기서, -C(=O)-(헤테로사이클로알킬)-의 헤테로사이클로알킬 고리는 N을 하나 이상 함유하고 N은 -C(=O)-에 연결된 것임}
    L2는 -NH- 또는 -O-이고,
    n은 O, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고 {여기서, n이 0인 경우 L1 및 L2는 직접 연결됨},
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), 또는 -C1-6알킬-O-C1-6알킬이고, R3는 -H, -C1- 6알킬, -C1- 6알킬-N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬), -C1- 6알킬-O-C1-6알킬, 또는 -C1- 6알킬-헤테로사이클로알킬이고, R4 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 -C1-6알킬이다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 PAK4에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모사체, 앱타머, 항체, 또는 단백질 인산화 효소 A (protein kinase A) 억제제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  10. 제9항에 있어서, 상기 PAK4에 특이적으로 결합하는 화합물은 상기 청구항 제1항 내지 제3항에 기재된 화합물 중의 하나 이상인 것인 약학적 조성물
  11. 제8항에 있어서, 상기 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 PAK4의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 또는 라이보자임인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화의 전에, 동시에 혹은 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  13. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 세포질 내에서 Nrf2의 유비퀴틴화 과정과 프로테아좀을 통한 Nrf2의 단백분해를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  14. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조직의 염증세포 침윤을 억제하거나, 염증 관련 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 CCL-2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  15. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 NF-κB 전사활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  16. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조직 또는 세포의 염증 관련 활성산소 발생을 억제하거나 혈중 활성산소 마커를 줄이는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  17. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 세포의 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포괴사(necrosis)을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  18. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화 관련 질환은, 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화로 인한 간 손상, 뇌 손상, 폐 손상, 신장 손상, 심근 손상, 골격근 손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
  19. 허혈-재관류에 의한 간 손상 모델 동물 또는 저산소-재산소화에 의해 손상된 간세포에 후보 물질 혹은 아데노바이러스를 통한 후보 유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈-재관류 또는 저산소-재산소화에 의한 조직 또는 세포의 손상을 억제하는 약제의 선별(screening) 방법
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