KR20230054297A

KR20230054297A - 산자나무 열매 추출물 또는 분획물을 포함하는 항바이러스용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20230054297A
Application number: KR1020220132488A
Authority: KR
Inventors: 김정기; 김춘식; 김혜문; 박대환
Original assignee: 주식회사 보손바이오사이언스
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2022-10-14
Publication date: 2023-04-24

Abstract

본 발명은 산자나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는, 코로나바이러스 감염의 예방, 경감 또는 치료용 약학적 조성물 및 코로나바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 산자나무 열매 추출물이 포유동물에서 호흡기 질환, 소화기 질환, 간질환, 뇌질환 등을 일으키는 바이러스인 코로나바이러스, 특히 코로나-19 바이러스에 대한 우수한 항바이러스 활성을 나타내므로, 코로나바이러스의 감염에 의한 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 및 식품 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

산자나무 열매 추출물 또는 분획물을 포함하는 항바이러스용 약학적 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR SUPPRESSING INFECTION OF VIRUS COMPRISING Sea Buckthron EXTRACT or FRACTION}

본 발명은 산자나무 추출물을 포함하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물에 대한 것이다.

코로나바이러스(Coronavirus)는 외피가 있는 단일가닥의 양성 RNA 바이러스로 게놈 크기는 25-32kb, 27 개의 단백질을 코딩하는 14 개의 ORF(Open Reading Frame) 구조로 비교적 큰 RNA 바이러스에 속한다. 외피에는 곤봉모양의 돌기인 스파이크(spike) 단백질이 박혀 있어 화염 모양의 특이적 구조를 가지고 있다. 코로나 바이러스는 최근 발생한 SARS CoV 2 외 6 종으로 HCoV 229 E, NL 63 , OC 43 , HKU 1 등은 감기 유사질병을 유발하고, 나머지 2 종은 중증급성호흡기증후군과 중동호흡기증후군을 유발한다.

1937년 닭에서 처음으로 발견된 후 박쥐, 새, 고양이, 개, 소, 돼지, 쥐 등 다양한 조류와 동물에서 발견된 코로나바이러스는 4개의 그룹(Alpha-, Beta-,Gamma-, Deltacoronavirus)으로 나누어진다. 알파와 베타코로나바이러스 그룹은 포유류에 주로 감염되고 감마와 델타코로나바이러스 그룹은 조류에서 찾을 수 있다. 코로나바이러스는 동물들에서 위장병 및 호흡기질환과 같은 다양한 질환을 일으킬 수 있다고 알려져 있다.사람에 감염되는 코로나바이러스 현재까지 SARS-CoV[중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS, 사스)을 일으키는 코로나바이러스], MERS-CoV[중동호흡기증후군(Middle East Respiratory Syndrome, MERS, 메르스)을 일으키는 코로나바이러스] HCoV-229E, HCoV-OC43, SARS-CoV-2[코로나바이러스감염증-19(COVID-19)을 일으키는 바이러스] 등을 포함하여 7종이 보고되어 있다.

중증급성호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)을 일으키는 사스 코로나 바이러스 (SARS-CoV)는 2003년 처음 발견되었다. 사스(SARS)와 관련하여, 세계보건기구(WHO)보고에 따르면 2002년에서 2003년 동안 전 세계적으로 8,273명의 환자와 775명의 사망자(치사율 약 10%)가 발생하였고, 2004년까지 추가적인 환자 발생과 사망자가 보고되었다. 또한, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 감염은 2012년 9월 사우디아라비아에서 첫 감염사례가 확인된 후 2014년 6월까지 WHO에 공식적으로 보고된 환자는 전 세계적으로 808명이며, 313명이 사망하였다.

최근에는 중국 우한에서 처음 발생한 뒤 확산되고 있는 호흡기 감염질환인 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)에 의해 전 세계가 위협받고 있다. COVID-19의 병원체는 새로운 유형의 코로나바이러스인 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)로, 감염자의 비말(침방울)이 호흡기나 눈·코·입의 점막으로 침투될 때 전염된다.

이와 같이 코로나바이러스는 전 세계적으로 문제가 되고 있으나 효과적인 치료제 및 예방 백신이 개발되어 있지 않은 실정이다. 따라서, 코로나바이러스의 감염을 효과적으로 억제하는 조성물의 개발이 매우 시급하다.

산자나무(Seabuckthorn, Hippophae rhamnoides L.)는 일반적으로 보리수과(Elaeagnaceae)에 속하는 낙엽성 관목으로 갈매보리수나무, 비타민나무로도 알려져 있으며, 러시아, 중국, 일본에서 각각 시베리아 파인애플, 사극(莎棘), 싸지(sajee) 등의 여러 이름으로 불려지고 있다. 산자나무는 극한의 기후와 척박한 토양에서도 잘자라며, 열매, 잎 및 종자 모두가 식용이 가능하고, 화장품의 원료로도 사용되고 있어, 러시아, 유럽, 캐나다, 중국, 몽골, 히말라야 산맥 주변 국가 등지에서 폭 넓게 재배되고 있다.

특히, 산자나무 열매는, 열매의 숙성도, 크기, 품종, 생산지, 기후 및 추출방법 등에 영향을 받아 열매에 포함된 생리활성 물질이 다른 것으로 알려져 있으며, 노란색, 주황색 및 붉은색 열매에는 크립토크산틴(cryptoxanthin), 라이코펜(ycopene), γ-카로틴(γ-carotene), β-카로틴(β-carotene), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeaxanthin)과 같은 카로티노이드(carotenoid)에 기인하며, 카로티노이드는 친유성 색소로 식물 막에 존재하며, 광합성과 광보호 기능을 가지고, 항산화, 항돌연변이 및 항암 활성과 같은 다양한 활성을 나타낸다고 보고되고 있다.

본 발명자들은 산자나무 추출물을 이용한 항바이러스 활성을 연구하는 과정에서, 본 발명의 산자나무 열매 추출물이 다른 부위의 추출물과 다르게, 코로나 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 산자나무 열매에 포함되어 있는 바이러스 억제용 유효성분의 함량을 극대화시킬 수 있는 추출공정으로, 산자나무 열매 추출물을 제조하고, 바이러스 감염예방 및 억제용 조성물에 대한 것이다.

본 발명은 산자나무(Seabuckthorn, Hippophae rhamnoides L.) 추출물을 포함하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 추출은 산자나무 열매 분말을 실온에서 탈지후 건조하여 건조된 시료를 얻는 단계;상기 건조된 시료를 교반추출, 여과 및 농축하여 동결건조된 추출물을 얻는 단계;상기 동결건조된 추출물에서 고분자 다당류를 제거하기 위해, 원심분리하여 농축된 상등액을 얻는 단계;상기 농축액을 용해 및 교반추출하여 최종 추출물을 얻는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 추출물을 산자나무 열매의 에탄올 추출물일 수 있다.

본 발명은 산자나무(Seabuckthorn, Hippophae rhamnoides L.) 열매 에탄올 추출물의 분획물을 포함하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면에서, 산자나무 열매 에탄올 추출물의 분획물은 산자나무 열매 에탄올 추출물의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올분획물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 분획물일 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 바이러스는 코로나 바이러스일 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 코로나 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-OC43, SARS-CoV-2일 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 추출물을 산자나무 열매 추출물인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물일 수 있다.

상기 코로나바이러스는 돼지 전염성 위장염 바이러스(TGEV, transmissble gastroenteritis virus), 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 개 코로나바이러스(canine coronavirus), 소 코로나바이러스(bovine Coronavirus), 사스 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되어 경구로 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 산자나무 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는, 코로나바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 산자나무 열매 추출물은 포유동물에서 호흡기 질환, 소화기 질환, 간질환, 뇌질환 등을 일으키는 바이러스인 코로나바이러스, 특히 코로나-19 바이러스에 대한 우수한 항바이러스 활성을 나타내므로, 코로나바이러스의 감염에 의한 질환의 감염예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 및 식품 등에 유용하게 이용될 수 있다

도면1 및 2는 산자나무 열매 추출물의 돼지유행병 설사병 바이러스(PEDV,Porcine Epidemic Diarrhea Virus)에 대한 억제효능에 대한 실험결과이다.
도면3 및 4는 산자나무 열매 추출물의 인간코로사바이러스(HCoV-OC43)에 대한 억제효능에 대한 실험결과이다.
도면 5은 분획공정을 통해 제조된 산자나무 열매 추출/분획물을 얻는 공정에 대한 것이다.
도면 6은 분획공정을 통해 얻어진 분획 결과물에 대한 것이다.
도면 7은 분획물의 세포독성 실험결과이다.
도면 8는 분획물의 항바이러스효과에 대한 실험결과이다.

추출물은 당 업계에 공지된 추출 및 분리 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 정의된 ‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 산자나무로부터 추출한 것이다. ‘추출물’에는 조 추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성 용매 가용 추출물 등이 모두 포함될 수 있다. 산자나무로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로서 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용할 수 있다. 용매로서 정제수, 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소 수 1 내지 4의 알코올 및 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethylacetate), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 추출방법으로는 가열추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 선택하여 사용할 수 있다. 또한 목적에 따라 추출물은 추가적으로 통상의 분획 공정을 수행할 수 있으며, 통상의 정제 방법에 따라 정제될 수 있다.

보다 자세하게는 본 발명의 추출물을 얻는 공정은 산자나무 열매 분말을 실온에서 탈지후 건조하여 건조된 시료를 얻는 단계;상기 건조된 시료를 교반추출, 여과 및 농축하여 동결건조된 추출물을 얻는 단계;상기 동결건조된 추출물에서 고분자 다당류를 제거하기 위해, 원심분리하여 농축된 상등액을 얻는 단계;상기 농축액을 용해 및 교반추출하여 최종 추출물을 얻는 단계;를 포함할 수 있다.

보다 자세하게는 산자나무 열매 에탄올 추출물의 분획물은 산자나무 열매 에탄올 추출물의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올분획물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 분획물일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 ‘예방’이라 함은, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 코로나 바이러스 감염의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 뜻한다.

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액 및 분무제를 포함하는 것으로, 이들 제형 중 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있고 멸균 주사 제형이 더욱 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 ‘치료학적으로 유효한 양’이라 함은, 코로나 바이러스 감염에 의한 질환을 예방 또는 치료하는 데 유효한 조성물의 양으로서 약학적으로 허용하는 염의 양을 의미한다. 본 발명에서 제공하는 조성물의 치료학적으로 유효한 양은, 투여 방법, 목적 부위, 환자의 상태 등을 포함하는 여러 요소에 따라 달라질 수 있다. 따라서 인체에 본 조성물을 적용할 때에는 안전성 및 효율성을 고려하여 적정량으로 투여해야 하며, 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 ‘약학적으로 유효한 양’이라 함은, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 환자의 건강 상태, 질환의 종류 및 중증도, 약물 활성, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 방법·시간·경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소와 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정된다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 또한 다른 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여할 수 있으며 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기의 요소를 모두 고려하여 부작용 없는 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 투여량의 결정은 당업자에 의해 수행된다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 미결정 셀룰로오스, 분말 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 전분, 젤라틴화 전분, 전호화 전분, 옥수수 전분, 백당,락토스, 덱스트로스, 소르비톨, 만니톨, 엿, 유당, 콜로이달실리콘디옥사이드, 포비돈, 오파드라이, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 알루미늄, 스테아린산 칼슘, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 대한 약제학적으로 허용 가능한 첨가제의 양은 상기 조성물에 대하여 0.1 중량부 내지 90 중량부가 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제를 포함할 수 있으며, 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물의 생체 내 전달에 적합한 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 그 예로는 Merck Index, 13rd ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 식염수, 멸균수, 완충 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에틴올, 화합물 등이 있다. 또한 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 정균제, 완충제 등 다른 통상의 첨가제를 적용할 수 있다. 또한 희석제, 계면활성제, 분산제, 결합제, 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로서 제제화할 수 있다. 해당 분양의 적정한 방법으로 Remington’s Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 제시되어 있는 방법을 이용하여 성분 및 환자의 질환·중증도에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 바이러스는 코로나 바이러스일 수 있다.

코로나바이러스는 돼지 전염성 위장염 바이러스(TGEV, transmissble gastroenteritis virus), 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 개 코로나바이러스(canine coronavirus), 소 코로나바이러스(bovine Coronavirus), 사스 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.

상기 코로나 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-OC43, SARS-CoV-2일 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 코로나 바이러스는 베타 코로나 바이러스인, 코로나바이러스 감염의 예방, 경감 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것인, 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되어 경구로 투여하는 것인, 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 산자나무 추출물을 유효성분으로 포함하며, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분은 0.1 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 용어 "개체"란 는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 성인의 경우, 본 발명의 조성물은 1회 투여량으로 0.0001 내지 1000 ㎎/㎏, 바람직하게는 10 내지 300 ㎎/㎏(체중) 포함할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은 산자나무 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.

본 발명의 용어 "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.

본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 담팔수 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물 및 이의 분획물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 추출물은 산자나무 뿌리, 줄기, 잎, 열매의 추출물일 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 추출물은 산자나무 열매 에탄올 추출물일 수 있다.

실시예1-1 (추출물의 제조)

산자나무 열매 분말 50g에 hexane 1000ml를 넣고 1시간 동안 실온에서 3회 교반 추출하여 지방성분을 제거한 다음 건조하였다. 건조된 시료 20g에 50% 에탄올(주정) 120mL 첨가하여 5시간 동안 60℃에서 교반추출한 후 5㎛ 필터로 여과하고 회전농축기로 농축하고 동결건조한 추출물을 획득하였다. 고분자 다당류를 제거하기 위하여 증류수 100ml에 위 추출물 3g을 녹인 후 에탄올 300ml을 첨가하여 다당류를 침전시킨 다음 원심분리하는 과정을 2회 반복한 후 상등액을 농축하였다. 다당류가 제거된 위 농축액 2ml를 증류수에 용해한 후 hexane 40ml를 넣고 1시간 동안 실온에서 2회 교반 추출하여 플라보노이드 및 페놀산 등의 폴리페놀 화합물이 제거된 단당류의 추출물을 확보하였다.

실시예1-2 (분획물의 제조)

본 실험에서 이동상으로 사용한 methanol과 water는 Fisher (Hampton, NH, USA)사의 HPLC grade를 사용하였으며, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사 formic acid를 사용하였다. 또한 시료 추출을 위해 대정화금 (Siheung, Korea)사의 ethanol을 사용하였다. 정량, 정성 분석을 위해 Shimadzu (Kyoto, Japan)사의 HPLC-DAD system을 사용하였으며, 분석 컬럼은 Shiseido (Tokyo, Japan)사의 Capcell Pak C18 (4.6mm x 250mm)을 사용하였다.

추출에 사용된 시료는 2022년 5월 27일 보손바이오로부터 인수하였으며, 충남대학교 약학대학 천연물학연구실에 기탁되어있다 (Voucher code: 2020-CPNPE-36). 시료의 추출은 산자나무 열매 파우더 1 kg을 50% 에탄올 1L에 80℃의 온도로 2시간 2회 환류 추출하였으며, 회전감압농축기를 이용하여 농축시켰다. 그 후 추출물을 100℃의 물로 용해하고 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 순서로 순차적으로 분획하였다. 추출 및 분획의 순서는 아래의 그림 6과 같다.

실시예2 (산자나무 추출물의 항바이러스 효과)

세포 및 바이러스

아프리카 녹색 원숭이 세포 (Vero cell; ATCC® CCL-81TM) 와 밍크 폐 세포 (Mink Lung cell, Mv1Lu cell) 를 10% 소태아 혈청, 항진균성 항생제 (Gibco) 및 L-글루타민 (Gibco), 0.3% 중탄산나트륨 (Gibco)이 보충된 Minimal Eagle’s Medium (MEM, Gibco)로 구성된 성장 배지에서 성장시켰다. PEDV 감염 배지는 0.4% 소혈청 알부민, 0.3% 중탄산나트륨, 0.1% 항진균성 항생제, L-글루타민, 그리고 비타민 (Gibco)이 보충된 MEM으로 구성하였다. HCoV-OC43 감염 배지는 1% 소태아 혈청, 0.3% 중탄산나트륨, 0.1% 항진균성 항생제, L-글루타민, 그리고 비타민 (Gibco)이 보충된 MEM으로 구성하였다.

시약

산자나무는 산자나무 열매에서 실시예1-1에 따라 추출되었고, 인산완충식염수 (Phosphate-buffered saline solution, PBS) 로 재구성되었다. 산자나무는 -4 °C에 저장하였고, 사용 당일 감염 배지에서 작업 농도로 희석하였다.

PEDV에 감염된 세포의 생존율 검사

산자나무 열매 추출물의 처리에 따른 항바이러스 효과 분석을 실시하였다. 먼저, 96-well plate에 Vero 세포 (1.3×104 cell/well)를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하여 준비하였다. 산자나무를 처리하기 전에 96-well plate의 Vero 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세포에 정해진 농도만큼 산자나무를 처리하고, 동시에 100μL/well 의 부피까지 감염 배지에서 0.01의 감염 다중도 (multiplicity of infection, MOI)에서 PEDV로 감염시켰다. 37℃, 5% CO2에서 66시간까지 배양한 후, EZ-CYTOX (DogenBio, Co., Ltd, South Korea)를 배양액에 10μL/well을 첨가하였다. 3-4시간 후, 450nm에서 흡광도를 확인하였다. 본 실험은 triplicate로 진행하였다.

OC43에 감염된 세포의 생존율 검사

다음으로 OC43에서 산자나무의 효과 분석을 실시하였다. 먼저, 24-well plate에 Mv1Lu 세포 (1.25×?105 cell/well)를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하여 준비하였다. 산자나무를 처리하기 전에 24-well plate의 Mv1Lu 세포를 PBS로 2회 세척하였다. Mv1Lu 세포에 MOI 0.01의 OC43 (500μL/well) 를 감염시키고, 동시에 125mg/ml 농도의 (50μL/well) 산자나무 열매 추출물를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 배양한 후, 결과를 관찰하였다. 본 실험은 duplicate로 진행하였다.

PEDV 감염을 억제하는 산자나무 추출물의 효과

베로 세포에서, 감염이후부터 추출물의 농도가 높아질수록 세포 생존율이 높아짐을 확인하였다.

그 결과 PEDV에 감염된 vero 세포에 대한 추출물의 항바이러스 효과로 인해,베로 세포는 150mg/ml, 125mg/ml에서 91~93% 세포 생존효과를 보였다.

OC43 감염을 억제하는 산자나무 추출물의 효과

실시예1-1로 제조된 산자나무 추출물로 인간코로나 바이러스(HCov-Oc43)에 대한 바이러스 억제효과를 실험하였다.

그 결과 HCov-Oc43에 감염된 Mv1Lu 세포에 대한 추출물의 항바이러스 효과는 추출물의 농도의존적으로 바이러스를 억제하는 것으로 나타났고, 베로 세포는 150mg/ml, 125mg/ml에서 91~95% 세포 생존효과를 보였다.

실시예3( 산자나무 분획물의 항바이러스 효과)

세포독성 실험

실시예 1-2로 제조된 산자나무 분획물을 이용하여 세포독성을 실험하였다.

에탄올추출물(시료1, CNU1), 물분획물(시료2,CNU2), n-헥산 분획물(시료3,CNU3), 클로로포름 분획물(시료4,CNU4), 에틸아세테이트 분획물(시료5,CNU5), 부탄올 분획물(시료6,CNU6)에 대해 각각 세포독성 실험을 실시하였으며, 그 결과 상기 시료에서 모두 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

원스텝 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)

실시예 1-2로 제조된 산자나무 에탄올 추출물의 분획물을 이용하여 바이러스 억제실험을 실시하였다.

원스텝 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 확인하기 위해, 각각의 분획물처리 36시간 후 SARS-CoV-2 오미크론 spike 슈도바이러스 감염 A549 세포에서 Qiagen RNeasy 키트 또는 QIAamp 바이러스 RNA 키트(제조업체의 프로토콜에 따름)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. RNA 농도는 NanoDrop 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량하였다. 그 후, 프라이머 (Spike (F: TCTGCTTTACTAATGTCTATGC, R: GCTATAACGCAGCCTGTAAA, P: TCAGACAAATCGCTCCCAGGGCA)), 프로브 및 원스텝 RT-qPCR 마스터 믹스(SFCprobes, 청주, 한국)를 혼합하여 RT-qPCR을 수행하였다. StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 반응을 증폭하였음(제조업체의 지침에 따름).

그 결과, 클로로포름 분획물(시료4,CNU4), 부탄올 분획물(시료6,CNU6)에서 바이억스 억제효과(바이러스 발현 억제효과)가 우수한 것으로 나타났다.

Claims

산자나무(Seabuckthorn, Hippophae rhamnoides L.) 열매 추출물을 포함하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출은 산자나무 열매 분말을 실온에서 탈지후 건조하여 건조된 시료를 얻는 단계;
상기 건조된 시료를 교반추출, 여과 및 농축하여 동결건조된 추출물을 얻는 단계;
상기 동결건조된 추출물에서 고분자 다당류를 제거하기 위해, 원심분리하여 농축된 상등액을 얻는 단계;
상기 농축액을 용해 및 교반추출하여 최종 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이러스는 코로나 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 코로나 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-OC43, SARS-CoV-2인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이러스는 PEDV인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
산자나무(Seabuckthorn, Hippophae rhamnoides L.) 열매 에탄올 추출물의 분획물을 포함하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 분획물이 산자나무 열매 에탄올 추출물의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올분획물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 분획물인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 및 억제용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 분획물이 산자나무 열매 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물, 부탄올분획물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 분획물인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 및 억제용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 바이러스는 코로나 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 코로나 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-OC43, SARS-CoV-2인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염예방 또는 억제용 약학적 조성물.