KR20230052019A - 효소화학적 해중합 공정에서의 Bs2Est의 신규 용도 및 이를 이용한 폐플라스틱 분해 방법 - Google Patents
효소화학적 해중합 공정에서의 Bs2Est의 신규 용도 및 이를 이용한 폐플라스틱 분해 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Bs2Est 효소를 포함하는 PET 분해용 조성물 및 이를 이용한 폐플라스틱 분해 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 Bs2Est 효소를 포함하는 PET 분해용 조성물 및 이를 이용한 폐플라스틱 분해 방법에 관한 것이다.
매년 전세계적으로 360 톤이 넘는 플라스틱이 생산되고 있으나, 재활용 비율은 생산된 플라스틱의 9% 미만에 불과하다. 이는 재활용되는 플라스틱의 경제적 가치가 낮기 때문이다. 이에 따라, 대부분의 폐플라스틱은 주로 매립지나 해양에서 처리하거나 소각하는 방식으로 처리되고 있다. 지구상에 축적된 엄청난 양의 플라스틱은 환경 속에서 거의 분해되지 않기 때문에 생태계의 파괴를 심화시키는 문제점이 있다.
이를 해결하기 위하여, 최근 생분해성 플라스틱이 활발하게 개발되고 있다. 그러나 이들의 생산량은 분해되지 않는 플라스틱에 비해 매우 낮아 생분해성 플라스틱이 환경에 미치는 영향은 여전히 미미한 수준이다. 이러한 측면에서, 보다 지속 가능한 사회를 만들기 위하여 플라스틱 업사이클링에 대하여 많은 이들이 상당한 관심을 가지고 있다.
그 중에서, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(Poly(ethylene terephthalate, PET)는 테레프탈산(terephthalic acid, TPA)과 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol, EG)로 합성된 고분자로, 섬유 및 포장재료의 일반적인 열가소성 수지로 알려져 있으며 총 플라스틱 생산량의 5%를 구성한다. 폴리에틸렌(PE)과 폴리프로필렌(PP) 등 탄화수소 플라스틱과 달리, PET의 에스테르 결합은 상대적으로 가수분해를 통해 분해되기 쉽다. 특히, PET 가수분해물인 TPA와 EG는 고부가가치 화학물질로 전환될 수 있어, PET는 업사이클링을 할 수 있는 장점이 충분하다 할 수 있다.
최근, 대사공학적 미생물을 이용하여 PET 가수분해물에서 TPA를 카테콜(catechol), 갈산(gallic acid, GA), 바닐산(vanillic acid, VA), 뮤콘산(muconic acid, MA) 또는 2피론-4,6-디스카복실산(2-pyrone-4,6-discarboxylic acid, PDC) 등의 부가가치 화학물질로 전환하기 위한 PET 업사이클링에 대해 연구되고 있다.
그러나 업사이클링 화학물질의 생산원가가 신규로 생산된 동일 물질보다 훨씬 높기 때문에, 산업 적용에 있어서 PET 업사이클링 개발 공정은 아직 경제적으로 실현 가능하지 않다는 문제점이 있다. 실제로, PET 업사이클링 화학물질의 높은 생산원가는 1) PET의 분해(해중합), 2) TPA의 고부가화(valorization) 및 3) 업사이클링 생성물의 정제와 같은, 에너지 및 시간이 많이 소모되는 공정과 관련이 있다.
특히, PET 업사이클링의 경제적 타당성은 PET 분해 공정의 효율성에 따라 좌우되는데, 지금까지 보고된 다양한 열화학 및 생물학적 분해 방법은 각각의 단점이 있다.
구체적으로, 열화학적 방법은 고온 (~450°C)과 고압 (~15MPA)의 상태에서, PET는 쉽게 EG, TPA, BHET(bis-(2-hydroxyethyl) terephthalate)), MHET((mono-(2-hydroxyethyl) terephthalic acid)) 및 PET 올리고머로 해중합(분해, depolymerization)된다. 그러나 이러한 과정들은 종종 탄화(carbonization)나, 부산물의 형성을 유발하는 고리 열림과 같은 과잉분해(over-decomposition)와 같은 통제할 수 없는 반응을 초래한다는 문제점이 존재한다.
반면, 효소와 미생물을 이용하는 생물학적 방법은 온화한 조건, 예를 들어 저온 저압 조건에서 PET를 해중합할 뿐만 아니라, 해중합된 단량체로부터 부가가치가 높은 화학물질을 생산한다. 그러나, PETase와 MHETase의 조합에 의한 PET 효소의 가수분해는 열화학적 방법보다 기질 투입량이 적고 느리게 PET를 분해하는 문제점이 있다.
한편, PET 업사이클링 공정의 또 다른 중요한 단계는 반응 결과물 내 고부가 생성물의 정제다. TPA의 생물학적 고부가화 단계에서 대상 화학 물질뿐만 아니라 부산물 및 대사물도 반응액 내 불순물로 생성되므로, 불순물 및 물의 제거와 같은 대상 화학 물질의 정제과정이 비용에 가장 결정적인 변수 중 하나이다.
불순물 제거는 멤브레인 여과, 결정화, 추출, 또는 증류 등의 정제 기술을 조합해 수행할 수 있다. 또한, 목적하는 화학물질은 일반적으로 낮은 농도로 생산되어, 운송 및 건조 공정에 있어 효율을 떨어뜨린다. 특히, 동결건조 및 분무건조 같은 비용이 많이 들고 느린 건조방법이 사용 가능하지만 이러한 공정은 대상 화학물질을 손상시킬 수도 있다.
따라서, 여전히 PET 업사이클링을 보다 효율적으로 할 수 있는 새로운 방법의 제시가 필요한 상황이다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은, PET에서 TPA를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 구축하기 위해 예의 노력한 결과, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래한 효소 Bs2Est를 규명하고, 상기 Bs2Est가 PET를 효과적으로 분해하고 특히 단일공정으로 PET 분해 생성물을 효소가수분해를 통해 TPA로 전환시키고 PET 올리고머까지 분해하는 잔류 활성을 가짐을 확인하여 별도의 불순물 정제 없이도, 상기 효소를 폐 PET에서 TPA로의 생산에 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 Bs2Est 효소를 포함하는 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 Bs2Est 효소를 PET에 처리하는 단계를 포함하는, PET 분해방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 PET 분해용 촉매 및 Bs2Est 효소를 PET에 처리하는 단계를 포함하는, 효소화학적 해중합공정을 이용한 PET의 단일공정 업사이클링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Bs2Est 효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터의 일부가 도입되고 상기 단백질의 활성을 나타내는 형질전환세포; 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PET 분해 생성물의 TPA로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 Bs2Est 효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터의 일부가 도입되고 상기 단백질의 활성을 나타내는 형질전환세포; 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 이용하여, PET 분해 생성물의 TPA로의 전환방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 PET에 촉매를 처리하여 PET 분해 생성물을 제조하는 제1단계; 및 상기 PET 분해 생성물에 Bs2Est 효소를 처리하는 제2단계;를 포함하는, 효소화학적 해중합 공정을 이용한 PET에서 TPA로의 단일공정 생산방법(One-pot synthesis)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 완충 시스템(buffer system)으로 인산나트륨 버퍼를 선택하는 단계; BHET의 농도를 1 내지 50mM로 조절하는 단계; 및 pH를 6 내지 8의 범위로 적정화하는 단계;를 포함하는, 전환활성을 가지는 Bs2Est 효소를 이용한 단일공정 효소 반응 시스템의 최적화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 PET에 촉매를 처리하여 PET 분해 생성물을 제조하는 단계; 및 상기 PET 분해 생성물에 Bs2Est 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 효소화학적 해중합 공정을 이용한 PET의 단일공정 업사이클링 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제1양태는 Bs2Est 효소를 포함하는 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 제2양태는 Bs2Est 효소를 PET에 처리하는 단계를 포함하는 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 분해방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 발명에서, 용어 "효소화학적 해중합공정"은 한가지 방법이 아닌 효소적 방법과 화학적 방법을 단일공정으로 하여 분해를 하는 공정을 말한다.
본 발명에서는 PET에 촉매를 처리하여 생성된 PET 분해 생성물에 효소 Bs2Est를 처리함으로써, 효소화학적 해중합 공정을 이용하여 단일공정으로 PET를 분해할 수 있는 것을 최초로 규명한 것에 특징이 있다.
본 발명에서 용어, "Bs2Est 효소"는 가수분해 활성을 가지는 단백질로, 에스터라제(esterase)에 속한다. 상기 에스터라제는 가수분해효소 중 에스터 결합을 가수분해하는 효소로 에스터라아제, 에스테라아제 또는 에스터가수분해효소라고도 하며, 가수분해에 의해 산(무기산도 포함)과 알코올류 또는 페놀류(─OH 화합물) 및 싸이올류(Thiol, -SH) 등의 산물을 생성하는 효소를 말한다. 상기 에스터라제는 작용하는 효소의 기질에 따라 여러 가지로 나뉘는데, 예를 들어 카복시산에스터가수분해효소, 싸이오 에스터가수분해효소(아세틸 Co A 가수분해효소), 인산모노에스터가수분해효소(포스파타아제), 인산다이에스터가수분해효소(포스포디에스테라아제), 또는 황산에스터가수분해효소 등으로 나눌 수 있으나, 좁은 뜻의 에스터라제는 카복실산과 알코올 또는 페놀의 에스터를 가수분해하는 효소를 말한다.
본 발명에서 규명된 Bs2Est 효소는 바실러스 서브틸리스 유래의 분해 활성을 지닌 효소로서, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의될 수 있으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 2의 염기서열로 코딩되는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 바실러스 서브틸리스 유래의 가수분해 효소를 'Bs2Est'로 명명하였다.
이와 같은 본 발명의 Bs2Est 효소는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 BHET와 같은 PET 분해 생성물을 가수분해 활성을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함하며, 또한 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 Bs2Est 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기 "유사성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 Bs2Est 효소는 분해 활성을 지니므로, 이를 PET에 적용하여 TPA와 같은 고부가가치 생성물을 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, PET는 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(Poly(ethylene terephthalate)로서, 테레프탈산(terephthalic acid, TPA)과 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol, EG)로 합성된 고분자를 말한다. PET는 섬유 및 포장재료의 일반적인 열가소성 수지로 알려져 있으며 총 플라스틱 생산량의 5%를 구성한다. PET의 에스테르 결합은 상대적으로 가수분해를 통해 분해되기 쉬워 TPA와 EG와 같은 고부가가치 화학물질로 전환시키는데 유용하다. 상기 PET는 폐 PET(waste PET)일 수 있으며, 폐 PET의 전체 또는 그의 일부 또는 조각(piece)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
폐 PET에서 유래된 PET의 전체 또는 이의 일부라 할지라도, PET로서의 특성을 포함하고 있다면, 고부가가치 물질의 생산을 위해 본 발명의 효소 또는 방법을 제한 없이 적용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 폐플라스틱 커피컵에서 유래된 PET의 일부에 본 발명의 효소와 방법을 적용하기 위하여, 상기 PET의 일부의 성분을 분석해본 결과, 본 발명에서 활용하고자 하는 PET 조각과 시약 등급의 PET가 성분이 동일하고 다른 불순물이 존재하지 않는 것으로 확인하였다(도 1).
이를 통해, 폐플라스틱 PET에서 유래된 것이라면 시약 등급의 PET와는 크게 성분상 차이가 없을 것임을 예측할 수 있는 바, 시약 등급의 수준이 아닌 폐플라스틱 PET 유래라 할지라도 본 발명의 효소와 방법을 적용할 수 있음을 알 수 있다.
상기 조성물은 PET 분해용 촉매를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "PET 분해용 촉매"는 PET 분해 과정에서 소모되거나 변하지 않으면서 반응 속도를 빠르게 만드는 물질을 의미하는 것으로서, 구체적으로 PET를 분해하는 촉매일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 촉매는 아세트산아연 또는 탄산칼륨(K2CO3)일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 탄산칼륨일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
상기 촉매 탄산칼륨은 함량에서 특별히 제한된 것은 아니나, 0.01 내지 1g, 구체적으로는 0.05 내지 0.4g으로 포함할 수 있다.
상기 촉매를 이용하여 PET, 구체적으로는 폐 PET로부터 PET 분해 생성물을 생성하는 것은 특별히 제한되지는 않으나, 반응시간 0.5 내지 6시간, 구체적으로는 1 내지 5시간에서 수행되는 것일 수 있으며, 온도는 150 내지 240℃, 구체적으로는 180 내지 210 ℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Bs2Est는 PET 분해용 촉매와 함께 효소화학적 해중합공정으로 PET를 분해하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 Bs2Est가 PET 분해용 촉매와 함께 효소화학적 해중합공정으로 PET를 테레프탈산(TPA)로 전환하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "PET 분해 생성물"은 폐플라스틱, 구체적으로는 PET를 촉매를 이용하여 분해한 것을 의미하는 것으로서, 에틸렌 글리콜을 이용하여 PET을 분해하여 생성된 물질을 말한다. 상기 PET 분해 생성물은 글리콜 추가 분해산물(glycolyzed product) 또는 글리콜산염 분해물과 혼용되어 사용될 수 있고, 구체적으로는 BHET가 포함될 수 있다.
상기 용어, "BHET"는 PET의 중간 산물로서 bis-(2-hydroxyethyl) terephthalate를 말한다. 구체적으로, 본 발명에서는 BHET를 g-BHET로 사용하기도 하는데, 상기 g-BHET는 폐 PET에서 분해에 의해서 얻어진 BHET를 말한다.
상기 효소 Bs2Est는 분해를 통하여 PET 분해 생성물인 BHET를 TPA와 EG로 빠르게 분해하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 효소 Bs2Est는 분해를 통하여 상기 PET 분해 생성물인 BHET를 특별한 정제 공정 없이, 또한 MHET 형성 없이도, 단일공정(one-stop)으로 TPA와 EG로 빠르게 가수분해하는 것일 수 있다.
상기 용어, "MHET(mono-(2-hydroxyethyl) terephthalic acid)"는 MW 210 g/mol인 물질로서, 에스테르 결합에 의해 서로 연결된 하나의 EG와 하나의 TPA로 구성된 유기 분자를 말한다. 상기 MHET는 가수분해 또는 효소에 의한 가수분해에 의하여 BHET의 부분 가수분해로 형성될 수 있다. 가수분해 동안, EG에 존재하는 소량의 물이나 공기 중의 수증기가 BHET를 가수 분해하여 MHET를 방출할 수 있다.
본 발명에서 용어, TPA(terephthalic acid, 테레프탈산, MW: 166 g/mol)는 Benzene-1,4-dicarboxylic acid라고도 불리며, 이는 효소화학적 해중합 과정의 최종 목표이다. TPA는 고부가화 생합성 경로를 도입한 미생물에 의해 카테콜의 기질로 사용되기도 한다.
상기 용어 "EG"는 에틸렌 글리콜로 가장 간단한 2가 알코올 중 하나이며, 모노에틸렌글리콜 또는 에테인-1,2-다이올이라고도 한다. 화학식은 HO(CH2)2OH이고, 분자량은 62.07, 녹는점은 －12.6℃, 끓는점은 197.7℃, 비중은 1.1131이다. EG는 끈적끈적하고 단맛이 있는 무색 액체로 습기를 잘 흡수하고, 물·에탄올·아세트산 등과 임의의 비율로 섞인다. 테트론의 합성원료로서 최대의 용도를 가지는 것 외에, 알키드 수지의 제조원료나 내한성 냉각액, 그 외에도 의약품, 화장품 등으로도 널리 사용된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 신규 효소 Bs2Est를 이용하여 BHET, MHET 및 EG를 모두 포함한 PET 분해 생성물에서 10시간 이내에 잔류 BHET 없이 TPA를 효율적으로 생성함을 확인하였다.
특히, BHET를 정제하지 않았을 때에도, 즉 BHET의 정제 공정 없이도, MHET의 방출 없이 단일공정으로 BHET를 TPA와 EG로 효과적으로 가수분해함을 확인하였다(도 11 내지 12).
또한, 상기 Bs2Est 효소 단백질은 PET 올리고머에 대한 잔류 분해 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "PET 올리고머(oligomer)"는 불완전한 분해(glycolysis: 글리콜 기반 PET 분해)에 의해 형성되는 것으로서, PET 올리고머는 주로 다이머 또는 트리머를 포함하고, 테트라머는 적은 비율로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서는 상기 신규 효소 Bs2Est가 PET 올리고머를 가수분해하는 잔류활성을 가짐을 새롭게 규명하였다.
본 발명에서, 용어 "다이머(dimer)"는 EG-(TPA-EG)2를 의미하는 것으로서, MW는 446 g/mol이고, 본 발명에서는 2개의 TPA가 3개의 EG에 대한 에스테르 결합에 의해 연결되는 물질, 즉 EG-TPA-EG-TPA-EG를 다이머로 정의한다. 이는 PET의 에스테르 결합이 EG의 추가에 의해 분해되기 때문이다. 다이머는 낮은 온도에서 PET의 불완전한 분해에 의해 또는 짧은 반응 시간으로 인해 형성된 가수분해 과정에서 발생하는 불용성 물질이다.
TPA-EG-TPA(-EG)는 다이머(EG-TPA-EG-TPA-EG)에 대한 에스터라제의 외부가수분해(exo-cleavage) 활성에 의한 잠재적 가수분해 생성물이다. PET 분해 생성물의 분해 동안 이러한 화합물이 형성된다는 것은 본 발명의 효소가 외부가수분해 활성에 의해 PET 올리고머를 가수분해한다는 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "트리머(trimer)"는 EG-(TPA-EG)3을 의미하는 것으로서, MW는 639 g/mol이고, 테트라머는 EG-(TPA-EG)4로서, MW가 831 g/mol이다. 트리머와 테트라머는 다이머와 마찬가지로 가수분해 후 PET의 불완전한 분해에 의해 형성된 PET 올리고머이다.
상기 조성물은 다이머를 Bs2Est의 내부가수분해(Endo-cleavage) 활성에 의해 먼저 BHET와 MHET로 가수분해하고, 이후 상기 BHET가 MHET로 가수분해된 후 MHET가 TPA와 EG로 가수분해되는 것이 특징일 수 있다.
본 발명에서, 용어 내부가수분해(Endo-cleavage)는 내부결합을 끊는 것을 의미하는 것으로서, 예컨대, 1-1-1-1-1의 결합이 있을 시 이를 1-1 + 1-1-1로 1-1-1-1-1의 중간결합을 끊는 것을 의미한다. 또한, 외부가수분해(Exo-cleavage)는 내부가수분해와 달리, 바깥부터 결합을 하나씩 잘라 나가는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 효소 Bs2Est로 PET 올리고머(다이머 기준으로 계산된 4.4 mM)와 반응했을 때, 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, BHET를 축적하지 않고 TPA를 생성하는 것을 확인할 수 있었으며 이는 Bs2Est의 PET 올리고머를 향한 내부가수분해(endo-cleavage) 활성을 나타내는 것을 시사한다 (도 13).
또한, 적은 양의 Bs2Est 효소를 추가하였음에도 불구하고, 외부가수분해 작용에 의해, 분해 생성물로 TPA-EG-TPA 또는 EG-TPA-EG-TPA는 생성되지 않은 채, 오직 다이머만 사라진 것을 확인함으로써, 본 발명의 효소 Bs2Est는 다이머에 있는 MHET와 BHET 모이어티 사이의 에스테르 결합을 분해하여 MHET와 BHET를 방출하고, 이때 형성된 BHET는 BHET 쪽으로 높은 촉매적인 효능을 가지는 Bs2Est에 의해 MHET와 EG로 빠르게 가수분해 됨을 확인하였다(도 14).
상기 Bs2Est 효소는 EG, TPA 디소듐염에 의해 활성이 억제되지 않는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "TPA 디소듐염(TPA disodium salt)"은 TPA의 염의 형태 중 하나로서 일반적으로 조직 배양 매체와 생물학적 완충제에 많이 사용되는 금속 치환제이다.
또한, 상기 Bs2Est 효소는 기질, 구체적으로는 BHET의 농도가 0.1 내지 50mM, 구체적으로는 1 내지 30mM, 보다 구체적으로는 2 내지 24mM, 보다 더 구체적으로는 4 내지 16 mM일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
또한, 상기 Bs2Est 효소는 pH 6 내지 8, 구체적으로는 pH 7 내지 8에서 분해 활성이 우수한 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 효소 Bs2Est의 생화학적 특성을 확인하기 위하여, Bs2Est에 미치는 효과를 EG나 TPA 디소듐염에 의한 효과, 버퍼 시스템에 의한 효과, 기질 농도에 의한 효과, pH에 의한 효과로 나누어 확인해 보았다.
그 결과, 다양한 농도인 EG 또는 TPA 디소듐염을 첨가하여도 이의 농도에 관계없이 효소 활성도가 감소되지 않았고(도 15 및 도 16), BHET, MHET 또는 TPA가 고농도 상태일 때 Bs2Est는 기질이나 생성물 저해에 의해 억제되며(도 17), Tris-HCl 버퍼 및 인산나트륨 버퍼 시스템에서 모두 TPA 용해도가 증가하여 적절한 완충 시스템 임을 확인하였고, 그 중에서도 인산나트륨 버퍼 시스템이 Tris-HCl 버퍼 보다 TPA의 용해도가 더 높아, 이로 인해 BHET가 고농도 반응이 더 좋음을 확인하였다(도 18). 또한, 기질 농도에서는 기질 BHET가 4 내지 16 mM일 때에는 TPA 전환율이 98.1 내지 99.9% 정도로 매우 우수하였고(도 19), 비록 BHET가 24mM 이상일 때는 TPA 전환율이 낮았으나, 이런 경우라 할지라도 pH를 7 내지 8, 구체적으로는 7.5로 유지 시에는 BHET 24mM을 기질로 사용하더라도 하는 효소반응 효율이 개선되고, 인산나트륨버퍼 농도 증가도 TPA의 용해도를 높여 BHET의 고농도 전환이 가능해는 것을 확인할 수 있었다(도 20 내지 도 21).
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는 PET 분해용 촉매 및 Bs2Est 효소를 PET에 처리하는 단계를 포함하는, 효소화학적 해중합공정을 이용한 PET의 단일공정 업사이클링 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "Bs2Est 효소", "PET" 및 "효소화학적 해중합공정"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서, 용어 "업사이클링(upcycling)"은 재활용품에 디자인 또는 활용도를 더해 그 가치를 높인 제품으로 재탄생시키는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명에서는 신규 효소 Bs2Est를 이용하여 효소화학적 해중합 공정으로 폐PET를 고부가가치 물질인 TPA로 높은 효율로 가수분해 함으로써, 폐PET를 업사이클링할 수 있는 시스템을 구축하였다.
본 발명의 또 다른 양태는 Bs2Est 효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터의 일부가 도입되고 상기 단백질의 활성을 나타내는 형질전환세포; 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PET 분해 생성물의 TPA로의 전환용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "Bs2Est 효소 단백질", "PET 분해 생성물" 및 "TPA"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명은 TPA를 제조함에 있어, 상기 Bs2Est 효소, 또는 상기 Bs2Est 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터의 일부를 포함하고, 상기 효소 활성을 나타내는 형질전환세포, 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 이용할 수 있다.
상기 Bs2Est 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구체적으로는 서열번호 2로 기재한 뉴클레오티드 서열로 정의되는 단백질일 수 있으며, 서열번호 2로 기재한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 유사성을 나타내는 뉴클레오티드 서열로서 실질적으로 Bs2Est 효소 단백질의 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다. 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 목적하는 단백질들을 수득할 수 있게 된다.
본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 고초균(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 아그로박테리움 매개 형질전환에 사용할 수 있는 Ti-플라스미드를 포함할 수 있다.
아울러 본 발명의 벡터로서, 핵산 발현 활성화 단백질(예를 들어, B42같은)이 연결된 융합 플라스미드(fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 융합 플라스미드에는 GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등을 태그(tag)로 포함할 수 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다.
형질전환으로 본 발명의 Bs2Est 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터의 일부를 숙주 세포 내에 도입할 수 있는데, 여기서 상기 발현 벡터의 일부란, 숙주 세포 내에 상기 Bs2Est 효소 단백질의 활성을 부여할 수 있도록 Bs2Est 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 발현 벡터의 부분을 의미한다. 예컨대, 아그로박테리아 매개 형질전환법에서 숙주 세포 내로 전달되는 Ti 플라스미드의 T-DNA를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 활용법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 Bs2Est 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 숙주는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 고초균(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 동물세포, 식물세포 및 곤충 세포가 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 CL41(DE3), BL21 또는 HB101이, 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 또는 LKS87이 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 벡터의 일부가 도입된 형질전환세포를 포함할 수 있는 생물체의 종류에는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 그 예로 담배, 애기장대, 감자, 인삼, 참깨, 유자, 데이지 등이 있다.
본 발명의 프로모터는, 본 발명의 핵산을 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터, CaMV35S, MAS 또는 히스톤 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.
상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 Bs2Est 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 BHET의 가수분해 활성을 지니며, 구체적으로는 분해된 생성물인 BHET에서 TPA를 생성하는 과정에서의 가수분해 활성을 가지나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 용어, "형질전환세포의 배양물"은 상기 형질전환세포를 공지된 미생물 배양방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미한다. 상기 배양물은 형질전환세포를 포함하는 형태 및 상기 형질전환세포를 포함하는 배양액에서 원심분리 등으로 형질전환세포를 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.
상기 배양물은 본 발명의 Bs2Est 효소 단백질을 포함하므로, PET 분해 생성물을 TPA로 전환할 수 있는 활성을 지니며, 그 예로 BHET를 TPA 및 EG로 전환시킬 수 있다.
이와 같이 본 발명의 Bs2Est 효소, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터의 일부가 도입되고, 상기 단백질의 활성을 나타내는 형질전환세포, 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 이용하여 BHET를 TPA로 전환시킬 수 있어, 이를 PET에서 고부가가치 소재의 원료물질인 TPA를 생성하는데 있어 상기 방법이 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 Bs2Est 효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터의 일부가 도입되고 상기 단백질의 활성을 나타내는 형질전환세포; 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 이용하여, PET 분해 생성물의 TPA로의 전환방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "Bs2Est 효소", "폴리뉴클레오티드", "이를 포함하는 벡터", "벡터의 일부", "형질전환세포", "상기 형질전환세포가 포함된 생물체", "형질전환세포의 배양물", "PET 분해 생성물", 및 "TPA"에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 PET에 촉매를 처리하여 PET 분해 생성물을 제조하는 제1단계; 및 상기 PET 분해 생성물에 Bs2Est 효소를 처리하는 제2단계;를 포함하는, 효소화학적 해중합 공정을 이용한 PET에서 TPA로의 단일공정 생산방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "Bs2Est 효소", "효소화학적 해중합 공정", "PET" 및 "TPA"는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 완충 시스템으로 인산나트륨 버퍼를 선택 후, pH를 6 내지 8의 범위로 적정화하는 단계; 및 BHET의 농도를 1 내지 30mM로 조절하는 단계;를 포함하는, 분해 활성을 가지는 Bs2Est 효소를 이용한 단일공정 효소 반응 시스템의 최적화 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "인산나트륨 버퍼", "pH", "BHET", "Bs2Est", "원-포트"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 효소 반응 시스템의 최적화 방법은 완충 시스템, pH의 범위 조절, 기질인 BHET의 농도 조절을 함으로써 본 발명의 신규 효소 Bs2Est가 최적의 활성을 가질 수 있는 조건을 확립하는 것을 말한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 신규 효소 Bs2Est의 생화학적 특성을 확인하기 위하여, Bs2Est에 미치는 효과를 EG나 TPA 디소듐염에 의한 효과, 버퍼 시스템에 의한 효과, 기질 농도에 의한 효과, pH에 의한 효과로 나누어 확인해 보았다.
그 결과, 다양한 농도인 EG 또는 TPA 디소듐염을 첨가하여도 이의 농도에 관계없이 효소 활성도가 감소되지 않았고(도 15 및 도 16), BHET, MHET 또는 TPA가 고농도 상태일 때 Bs2Est는 기질이나 생성물 저해에 의해 억제되며(도 17), Tris-HCl 버퍼 및 인산나트륨 버퍼 시스템에서 모두 TPA 용해도가 증가하여 적절한 완충 시스템 임을 확인하였고, 그 중에서도 인산나트륨 버퍼 시스템이 Tris-HCl 버퍼 보다 TPA의 용해도가 더 높아, 이로 인해 BHET가 고농도 반응이 더 좋음을 확인하였다(도 18). 또한, 기질 농도에서는 기질 BHET가 4 내지 16 mM일 때에는 TPA 전환율이 98.1 내지 99.9% 정도로 매우 우수하였고(도 19), 비록 BHET가 24mM 이상일 때는 TPA 전환율이 낮았으나, 이런 경우라 할지라도 pH를 7 내지 8, 구체적으로는 7.5로 유지 시에는 BHET 24mM을 기질로 사용하더라도 하는 효소반응 효율이 개선되고, 인산나트륨버퍼 농도 증가도 TPA의 용해도를 높여 BHET의 고농도 전환이 가능해는 것을 확인할 수 있었다(도 20 및 도 21).
또 다른 양태로서, 본 발명은 PET에 촉매를 처리하여 PET 분해 생성물물을 제조하는 단계; 및 상기 PET 분해 생성물에 Bs2Est 효소를 처리하는 단계;를 포함하는, 효소-화학적 해중합을 이용한 PET의 단일공정 업사이클링 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "PET", "촉매", "분해된 생성물", "Bs2Est", "효소-화학적 해중합", "단일공정" 및 "업사이클링"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 Bs2Est 효소를 포함하는 PET 분해용 조성물을 이용하면 폐 PET를 효과적으로 분해할 수 있다.
도 1은 Sigma-Aldrich 제품과 폐 PET의 NMR 및 FT-IR 분석을 통하여 둘의 화학적 성질이 동일함을 나타낸 도이다.
도 2는 PET의 생물화학적 PET 분해의 전체적인 개략도를 나타낸다.
도 3은 촉매 K2CO3와 EG를 이용하여 PET를 분해하였을 때의 전환효율을 나타낸 도이다.
도 4는 촉매 K2CO3를 이용한 PET 분해 결과에서 g-BHET가 생성되는 것을 확인한 도이다.
도 5는 정제된 BHET 생성물의 FT-IR 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 정제된 BHET 생성물의 1H 및 13C 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 확인한 도이다.
도 7은 4개의 에스터라제의 BHET-가수분해 활성을 확인하기 위한 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 경로 1에서 수득한 순수 BHET를 Bs2Est 효소로 가수분해한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 경로 1에서 순수 BHET에 대한 TPA로의 가수분해 수율을 나타내는 도면으로, 구체적으로 (a) 시그마 시약 BEHT 가수분해 활성 및 (b) PET waste 유래 BHET 가수분해 활성을 나타낸 도이다.
도 10은 경로 1에서 생성된 TPA의 순도를 1H 및 13C NMR 분석에서 확인한 도이다.
도 11은 경로 2에서의 TPA 수율을 나타내는 도이다.
도 12는 경로 3에서의 TPA 수율을 나타내는 도이다.
도 13은 Bs2Est의 PET 올리고머 분해 활성을 나타내는 도이다.
도 14는 (a)와 (c)는 Bs2Est 효소 농도에 따른 PET 올리고머 분해활성을 나타낸 도이고, (b)와 (d)는 상기 각각의 MS 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 EG의 저해효과를 나타낸 도이다.
도 16은 TPA 이소듐염의 효과를 나타낸 도이다.
도 17은 Bs2Est에 미치는 버퍼 시스템의 효과를 나타내는 도이다.
도 18은 TPA로의 전환율 감소를 설명하기 위해, 서로 다른 버퍼 시스템의 TPA 용해도 변화를 확인한 도이다.
도 19는 기질 농도에 따른 Bs2Est의 BHT 가수분해 활성을 나타내는 도이다.
도 20은 초기 pH가 Bs2Est에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 구체적으로, 효소 반응은 3 시간 동안 2U / mL의 Bs2Est를 사용하여 2mM의 MHET에서 수행되었고, 반응 혼합물을 1000rpm 및 30℃에서 교반하였다.
도 21은 Bs2Est에 미치는 버퍼시스템의 영향을 확인한 결과로, (a) 50mM, (b) 100mM, 및 (c) 200mM의 인산나트륨버퍼에서 pH 7.5 하에 2U / mL의 Bs2Est를 사용하여 24mM BHET의 효소 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 PET의 생물화학적 PET 분해의 전체적인 개략도를 나타낸다.
도 3은 촉매 K2CO3와 EG를 이용하여 PET를 분해하였을 때의 전환효율을 나타낸 도이다.
도 4는 촉매 K2CO3를 이용한 PET 분해 결과에서 g-BHET가 생성되는 것을 확인한 도이다.
도 5는 정제된 BHET 생성물의 FT-IR 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 정제된 BHET 생성물의 1H 및 13C 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 확인한 도이다.
도 7은 4개의 에스터라제의 BHET-가수분해 활성을 확인하기 위한 HPLC 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 경로 1에서 수득한 순수 BHET를 Bs2Est 효소로 가수분해한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 경로 1에서 순수 BHET에 대한 TPA로의 가수분해 수율을 나타내는 도면으로, 구체적으로 (a) 시그마 시약 BEHT 가수분해 활성 및 (b) PET waste 유래 BHET 가수분해 활성을 나타낸 도이다.
도 10은 경로 1에서 생성된 TPA의 순도를 1H 및 13C NMR 분석에서 확인한 도이다.
도 11은 경로 2에서의 TPA 수율을 나타내는 도이다.
도 12는 경로 3에서의 TPA 수율을 나타내는 도이다.
도 13은 Bs2Est의 PET 올리고머 분해 활성을 나타내는 도이다.
도 14는 (a)와 (c)는 Bs2Est 효소 농도에 따른 PET 올리고머 분해활성을 나타낸 도이고, (b)와 (d)는 상기 각각의 MS 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 EG의 저해효과를 나타낸 도이다.
도 16은 TPA 이소듐염의 효과를 나타낸 도이다.
도 17은 Bs2Est에 미치는 버퍼 시스템의 효과를 나타내는 도이다.
도 18은 TPA로의 전환율 감소를 설명하기 위해, 서로 다른 버퍼 시스템의 TPA 용해도 변화를 확인한 도이다.
도 19는 기질 농도에 따른 Bs2Est의 BHT 가수분해 활성을 나타내는 도이다.
도 20은 초기 pH가 Bs2Est에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 구체적으로, 효소 반응은 3 시간 동안 2U / mL의 Bs2Est를 사용하여 2mM의 MHET에서 수행되었고, 반응 혼합물을 1000rpm 및 30℃에서 교반하였다.
도 21은 Bs2Est에 미치는 버퍼시스템의 영향을 확인한 결과로, (a) 50mM, (b) 100mM, 및 (c) 200mM의 인산나트륨버퍼에서 pH 7.5 하에 2U / mL의 Bs2Est를 사용하여 24mM BHET의 효소 반응 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
재료
K2CO3(99.5%), 염산(35~37%), 및 글리세롤(99%)은 SAMCHUN 社 (한국)에서 구매하였고, 에틸렌 글리콜 (≥ 99%), 비스(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트 (bis(2-hydroxyethyl) terephthalate, BHET, 98%), 테레프탈산 (TPA), 제2인산칼륨 (potassium phosphate dibasic, ≥ 98%), 카테콜 (≥ 98%)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구매하였다. Tris-HCl 버퍼(1M, pH 8.5)와 인산이수소칼륨 (potassium dihydrogen phosphate, >98%)은 iNtRON 바이오테크놀로지(한국 성남)와 듀크파 생화학(네덜란드 할렘)에서 각각 구매하였다. mono-(2-hydroxythyl) Mono-(2-hydroxyethyl) terephthalic acid (MHET, 97%)는 어드밴스트 켐블록스 주식회사(Burlingame, 미국)에서 획득하였다. 메탄올(HPLC급)은 덕산주식회사(한국 안산시)에서 공급받았다. 물(≥ 99.9%, 미국 델라웨어 카운티 J.T 베이커), 아세토나이트릴(≥ 99.9%, J.T 베이커), 클로로포름(≥ 99.9%, J.T 베이커), formic acid (85%, SKC, 성남, 한국) 등을 이동상(mobile phases)으로 사용하였다. 두께 50μm의 PET 필름은 SKC(서울, 한국)에서 제공받았다.
분석
기질(substrate) 및 PET 분해 생성물의 NMR 분석을 위해, 상기 chemical을 이의 특성에 따라 d6-DMSO, D2O 또는 d-트리플루오로아세트산(d-trifluoroacetic acid)에 용해하였다. 실험은 모두 Bruker AVANCE 1H-NMR 500 MHz 및 13C-NMR 125 MHz 모델에 수행 및 기록하였다.
FT-IR 분광 분석은 DTGS 검출기가 장착된 Bruker AVANCE 1H-P&ALPA-T 분광기를 사용하여 PET의 화학 구조 특성을 분석하였다.
샘플 측정은 모두 4000-400 cm-1의 주파수 범위에서, 256 스캔, attenuated total reflectance(ATR) 모드로 수행하였다. PET 올리고머의 중량 분포를 분석하기 위해, Pelgel Mixed-C와 Pelgel Mixed-D(Agilent, USA)가 장착된 GPC(Gel Permeration Chromatography, GPC)를 사용하였다.
BHET, MHET 및 TPA는 ZORBAX Eclipse Plus C18(5μm, 애질런트)과 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 컬럼의 온도는 35 °C, 유량은 0.8 mL/min이었다. 상기 이동상(mobile phase)은 formic acid 0.1%(v/v) 함유된 95 % 탈이온수에서 20분 만에 30% 아세토니트릴로 단계적으로 변화되었다.
UV 검출기는 260 nm에서 작동하였다. PET 올리고머의 질량은 Bruker Autoflex Speed TOF/TOF Matrix Assisted Laser Desorption lionization Time of Flight-Mass Spectrometer (MALDI-TOF-MS)를 통해 분석하였다. 용매 DMSO에 샘플을 용해하고, 매트릭스로서 2,5-dihydroxy benzoic acid (DHB)를 용해하였다. 유량 1 mL/min의 용출액으로 클로로포름을 사용하였으며, 컬럼의 온도는 40 °C 였다. 샘플을 Refractive Index (RI) detector (Viscotek VE 3580)로 모니터링하였다.
분광도계(UV-1700, 시마즈)를 이용해 대장균(Escherichia coli) 세포의 OD600 값을 측정하였다. Optimapak C18 column(RSTech, 한국 대전)이 장착된 HPLC로 TPA와 카테콜의 농도를 확인하였다. 컬럼 온도는 30°C로 유지하였고, 이동상으로는 1.0 mL/min 유량에서 탈이온수 내 트리플루오로아세트산 0.1 % (v/v)에서 10% (v/v)의 아세토나이트릴로 사용하였다.
주입량은 5μL, UV 검출은 254nm와 270nm로 확인하였다. 접촉 각도는 SEO 300A(Surface and Electro-Optics Co., 한국)를 사용하여 측정했다. 측정에 사용되는 drop 용량은 5μL로, 카메라로 droplet의 거시적 영상을 촬영했다. 그람 음성(E. coly-bauer) 박테리아에 대해서는 Kirby-Bauer 방법으로 항균 활성을 평가하였다. 여기에서는 청정 필름을 음성 대조군으로 사용하였다.
한편, PET 전환율과 BHET 수율을 하기 식 1과 식 2로 각각 계산하였다. 여기에서, BHET의 이론상 중량은 PET 샘플의 초기 중량을 반복 단위(TPA-EG, 192.2 g/mol)의 분자 중량으로 나누고, BHET의 분자 중량(254 g/mol)을 곱하여 계산한다. BHET의 실제 중량은 반응 혼합물의 재분석을 통해 실제로 수득한 BHET이다.
[식 1]
[식 2]
이론상 최대 가수분해 수율 계산
이론상 최대 가수분해 수율은 하기의 식3을 이용하여 PET의 효소화학적 해중합 반응에 의해 형성된 실제 molar 농도의 TPA를, PET 조각에서 생성된 TPA의 이론상 최대 농도로 나누어 계산한다. 이론상 최대의 TPA 농도는 PET 샘플의 초기 중량을 반복 단위(TPA-EG)의 분자 중량으로 나눈 값이다.
[식 3]
실시예 1: 폐플라스틱 커피컵 유래 PET 조각의 성분 분석
폐플라스틱 커피잔을 3x3mm2로 절단하여 PET 조각(piece)을 획득하고, 검증 후 시약 등급의 PET와 기능 및 순도를 비교해 가수분해용으로 사용하였다.
구체적으로, 가수분해를 수행하기 전에 폐플라스틱 커피컵의 PET 조각이 시약 등급의 PET와 동일한 성분인지 확인하기 위하여, 폐플라스틱 커피컵 유래 PET 조각의 성분을 NMR 및 FT-IR 분석으로 확인하였다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이, PET의 NMR에 존재하는 특징적인 피크인 Ha와 Hb는 시약 등급의 PET에서도 확인되어, PET 조각과 시약 등급의 PET는 성분이 동일하고 다른 불순물이 존재하지 않는 것으로 확인할 수 있었다.
또한, IR 스펙트럼에서 하이드록실 그룹에 의해 나타나는 3400 cm-1 주변 피크가 존재하지 않는 것으로 확인되어, 이로부터 분자 중량이 높은 PET라는 것을 간접적으로 알 수 있었다.
이를 종합하면, Sigma Aldrich 유래 시약 등급의 PET와 폐 PET의 진동 피크가 동일하여 두 소재가 비슷한 것으로 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 토대로 폐 PET 조각으로 하기와 같이 효소-화학적 해중합 과정을 수행하였다.
실시예 2: 화학적 분해 반응에 의한, PET 조각으로부터의 BHET 제조
2-1: PET의 BHET로의 분해반응 최적 조건 확인
BHET를 생성하기 위하여 PET의 화학적 분해 반응을 수행하였다. 이의 전체적인 개략도는 도 2와 같다.
PET의 분해반응 촉매로는, 종래 PET 가수분해로 잘 알려진 Zn보다 환경 친화적인 탄산칼륨을 사용하여 PET 분해반응을 하였다. 이는, 아세트산아연은 독성이 있고 생물 분해 능력이 없으며 비용 면에서 효율적이지 않다는 문제점이 존재하여 새로운 촉매의 발굴이 필요한 상황이었다.
구체적으로, PET 분해반응을 역류 콘덴서와 자기 교반기가 장착된 250 mL 원형 플라스크에서 수행하였다. 먼저, PET 5g, 에틸렌 글리콜 20g 및 0.05 내지 0.4g의 탄산칼륨을 반응 플라스크에 첨가하였다. 이후, 상기 반응 혼합물을 180 내지 210 ℃의 다양한 온도에서 1 내지 5시간으로 가열하였다. 분해반응 반응이 완료된 후, 상기 혼합물에 400 mL의 온수를 첨가하고, 여과를 통해 PET 올리고머를 제거하였다. 상기 여과액은 60 ℃에서 회전 증발로 30 내지 40 mL로 농축하였다. 이후 상기 농축된 혼합물을 4 ℃의 냉장고에서 18시간 동안 재결정화로 여과하였다. 여과 후 수득한 BHET를 PET 유래 g-BHET라 칭하고 이를 90 ℃에서 12시간 동안 건조하였다.
그 결과, 도 3 내지 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 촉매 탄산칼륨을 이용하여 분해반응을 하였을 때도, 종래 촉매로 공지된 아세트산아연 가수분해 효율인 50 내지 66%과 유사한 정도까지 PET 분해가 되는 것을 확인할 수 있었으며, 분해반응 결과로 흰색 결정의 g-BHET(glycolyzed-BHET)가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
특히, PET 분해반응은 반응시간이 1 내지 5 h, 온도가 180 내지 210°C, 촉매 함량이 탄산칼륨 0.05 내지 0.4g일 때 PET가 효과적으로 BHET로 전환되는 것을 알 수 있었으며, 그 중에서도, 온도, 반응시간 및 촉매 함량이 각각 200℃, 3h 및 0.1g일 때 BHET, MHET 및 PET 올리고머가 84.83%, 7.65% 및 8.67%로 확인되어, 상기 조건이 PET에서 BHET로 전환되는 최적의 조건 임을 확인할 수 있었다.
2-2: 상기 최적 조건 하에서 PET 분해 생성물의 분리정제
상기 실시예 2-1에서 확인한 최적 조건 하에서, 순수한 BHET를 수득하기 위해, PET 분해 생성물의 분리정제를 추가로 수행하였다.
구체적으로, 폐 PET의 PET 분해 생성물을 여과 및 재결정화(recrystallization)로 정제하여, 각각 PET 올리고머와 EG/MHET를 제거하였다. 이 후, 정제된 BHET 생성물로 FT-IR 및 1H 및 13C 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 확인한 결과, 도 5 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, BHET 표준 화학물질의 스펙트럼과 동일한 것으로 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 BHET 생성물이 높은 순도를 가지는 것을 나타낸다.
실시예 3: PET 분해 생성물의 Bs2Est에 의한 TPA로의 효소적 가수분해
3-1: PET 분해 생성물에서 BHET에 대한 3개의 경로 설계
다음과 같이 PET 분해 생성물에서 BHET의 제조를 위한 세 가지 경로를 설계하였다.
구체적으로, 정제 후 순수 BHET에 대한 경로 1, 여과 후 BHET/MHET/EG 혼합물에 대한 경로 2, 및 정제되지 않은 BHET/MHET/EG/올리고머 모두 포함된 경로 3이다(도 2 참조).
보다 구체적인 경로 1 내지 3에 대한 설계는 다음과 같다.
경로 1: 정제 후 순수 BHET의 효소적 가수분해
경로 2: 여과 후 BHET/MHET/EG 혼합물에 대한 가수분해
경로 3: 정제되지 않은 BHET/MHET/EG/올리고머에 대한 가수분해
여기에서, 만약 상기 경로 3의 TPA 수율이 경로 1의 수율(즉, 순수 BHET)과 동일하다면, PET 분해 생성물을 정제하지 않고도 하나의 단계(one-step)로 가수분해하는 것이 정제 비용을 절감하고 기질 활용의 극대화 측면에서 매우 효율적일 것임을 알 수 있을 것이라 예상하였다.
3-2: BHET 가수분해용 효소 선별
현재 공지된 PETase와 MHETase를 사용하는 이중 효소 시스템은 높은 비용을 요구하기 때문에, 단일 효소 가수분해 시스템의 구축이 중요하다. 따라서 본 발명에서는 BHET 가수분해가 가능한 단일 효소 시스템을 이용하여 TPA와 EG를 생산하였다.
먼저, 효소-화학적 해중합 공정에 적합한 효소를 찾기 위해, 시중에서 구할 수 있는 4개의 에스터라제, 즉 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, cat. #96667), 파니바실러스 바시노넨시스(Paenibacillus barcinonensis, cat. #04492), 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae, cat. #79208) 및 메틸로박테리움 포풀리(Methylobacterium populi,, cat. #80127) 유래 에스터라제를 테스트하였다. 참고로, 상기 에스터라제는 모두 Sigma Aldrich 社로부터 구입하였다.
이후, 상기 실시예 3-1의 3개 경로의 PET 분해 생성물에 대한 BHET-가수분해 활성을 조사하기 위해, 상기 4개의 상용 에스터라제를 이용하여 가수분해 활성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 4개의 에스터라제의 BHET-가수분해 활성을 확인하기 위해, 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)에서 BHET 4 mM을 포함하는 반응 혼합물에 1 U/mL의 에스터라제를 첨가한 후, 30 ℃, 1000 rpm 에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 그 결과물을 HPLC 시스템을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 유래 에스터라제 Bs2Est 만이 MHET의 형성 없이, 단일공정으로 BHET를 TPA와 EG로 완전히 가수분해할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이와 달리, 파니바실러스 바시노넨시스, 리조푸스 오리재 및 메틸로박테리움 포풀리 유래 에스터라제는 24시간 동안 부분적으로만 가수분해하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 파니바실러스 바시노넨시스 유래 에스터라제는 BHET를 가수분해하여 12시간 이내에 MHET를 방출하는 동안 MHET 가수 분해 활동이 관찰되지 않음을 확인하였다.
이로써, 바실러스 서브틸리스 유래 에스터라제 Bs2Est를 단일공정으로 BHET를 가수분해할 수 있는 효소로 발굴하였다.
3-3: 경로 1 내지 3에 따른 효소 반응 결과 확인
구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 설계한 경로 1 내지 3에서 하기와 같이 효소 반응을 수행하였다.
[경로 1]
경로 1에서 효소 반응은 Bs2Est 2 U/mL가 존재하는 상태에서, 30 °C에서 50 mM의 Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)로 수행하였다. 1:19 (v/v)의 비율로 메탄올을 첨가하여 효소 가수분해를 중지하고, 반응 혼합물을 0.22 μm 나일론 막(Choice filter, Thermo Scientific)으로 여과 후, HPLC 시스템을 이용하여 기질과 생성물을 분석하였다. 정제된 TPA는 이전 연구에 따른 후속 산화와 여과로 간단히 수득하였다. 정제된 TPA를 1H 및 13C NMR로 분석하였다.
[경로 2 및 경로 3]
경로 2 및 3에서는, 효소 반응을 위해 50 mM Tris-HCl 버퍼 또는 초기 기질 투입을 위한 50, 100, 200 mM sodium phosphate (pH 7.5)와 같은 적절한 완충 시스템에서 PET 분해 생성물을 BHET 4 내지 24 mM으로 희석하였다. 상기 효소 반응은 30°C와 1000 rpm에서 Bs2Est 2 U/mL를 첨가하여 수행하였다.
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, Bs2Est-촉매 반응을 순차적으로 최적화한 후, 경로 1에서 수득한 순수 BHET(20mM)는 Bs2Est 2 U/mL로 30°C에서 수율 99%(M/M) 이상으로 10시간 이내에 가수 분해함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 경로 1에서 순수 BHET에 대한 TPA로의 가수분해 수율은 97.7%(M/M)로, 상용 시약 등급 BHET의 수율인 96.2%(M/M)와 유사한 것을 알 수 있었으며, 상기 결과는 도 10의 1H 및 13C NMR 분석에서도 확인된 각각에서 생성된 TPA의 순도를 확인한 결과에서도 확인할 수 있었다(도 10).
한편, 경로 2와 경로 3은 경로 1에 비하여, BHET 이외의 PET 분해 생성물이 더 많이 포함되어 있음을 확인하였다. 따라서 Bs2Est의 가수분해 활성을 경로 2와 경로 3의 PET 분해 생성물을 대상으로도 확인해 보았다.
우선, 경로 1에서 개발된 효소 가수분해 프로세스를 EG, BHET 및 MHET를 포함하는 경로 2의 PET 분해 생성물에 먼저 적용하여 확인해 보았다. 그 결과, 도 11에서 확인할 수 있듯이, 100 mM 인산나트륨 버퍼에서 Bs2Est 2 U/mL과 BHET 19.69 mM 및 MHET 0.47 mM의 PET 가수분해 혼합물을 반응시켰을 때, 10시간 이내에 잔류 BHET 없이, TPA 20.17 mM이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
특히, 경로 2의 혼합물에서 MHET의 추가적인 가수분해로 인해, 경로 2의 초기 BHET 투입량(100%)에 기초한 TPA 수율은 순수 BHET를 포함하는 경로 1보다도 높았다. 이러한 결과는 Bs2Est의 가수분해 활성이 EG를 포함한 경로 2 혼합물의 불순물 또는 PET에서 파생된 알려지지 않은 생성물에 의해 억제되지 않았음을 시사하는 것이다.
마지막으로, EG, BHET(18.82mM), MHET(1.37mM), 및 PET 올리고머 등으로 구성된 정제되지 않은 경로 3에서는, PET 분해 생성물을 Bs2EST 2 U/mL를 사용하여 가수분해한 결과, 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다른 PET-TPA 가수 분해 경로 중 여과 및 재결정 없이도, Bs2Est가 잔류 MHET와 BHET 없이, 23.49mM의 높은 전환농도를 가져 TPA(116.3% M/M)를 성공적으로 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
특히, 경로 3의 혼합물에서의 TPA의 생산 수율은 BHET와 MEHT에서 계산한 이론상 최대 가수분해 수율보다도, 약 5mM 가까이 높은 것을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 발굴한 Bs2Est가 PET 올리고머를 단일반응으로 가수 분해하여 TPA를 효과적으로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
이를 종합하면, 본 발명에서 신규로 발굴한 Bs2Est 효소를 사용하면 PET에서 가수분해된 BHET에 대하여 정제나 여과를 거치지 않더라도, 잔류 MHET와 BHET 없이, TPA를 현저히 높은 수율로 생산하는 것을 알 수 있다.
실시예 4: Bs2Est의 잔류 활성 측정 - PET 올리고머 가수분해 활성 측정
화학적 또는 생물학적 전환 과정에서 불완전하게 전환된 생성물(예: PET PET 분해 생성물 내 불용성 프랙션(fraction)의 활용은 기질 이용과 생산 수율을 극대화하고, 정제의 부담을 줄이는 중요한 사안이다.
경로 3의 Bs2Est에 의한 분해된 혼합물의 원 포트 가수분해 반응에서, 기질 BHET와 MHET의 몰량보다 TPA의 몰량이 과다하게 생성되는 것을 실시예 3에서 확인하였다. 이러한 결과는 경로 3에서 TPA 수율 향상에 기여하는 TPA를 방출하기 위해, 가수분해 혼합물의 PET 올리고머 들이 가수분해되었음을 시사하는 것이다.
이에, PET 올리고머에 대한 Bs2Est의 생물학적 특성을 확인하기 위해, 1H-NMR, GPC 및 FT-IR로 PET 올리고머 구성의 변화를 분석하였다. 참고로, 효소 가수분해 시 PET 올리고머 구성의 변화는 HPLC와 MALDI-TOF로 확인하였다.
그 결과, Bs2Est 2 U/mL로 1 g/L PET 올리고머(다이머 기준으로 계산된 4.4 mM)와 반응했을 때, 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, BHET를 축적하지 않고 TPA 3.46 mM을 생성하는 것을 확인하였으며, 이는 반응 중간체가 생성되는 것을 시사한다.
이러한 효소 가수분해 동안 TPA-EG-TPA 또는 EG-TPA-EG-TPA와 같은 형성은 Bs2EST의 PET 올리고머를 향한 exo-cleavage 활성을 나타내는 것을 시사한다.
이에, Bs2Est의 exo-cleavage 활성을 검증하기 위해, 효소(0.5 및 1U/mL)가 적게 존재하는 상태에서 효소 반응을 수행하고, MALDI-TOF를 사용하여 반응 혼합물의 프로파일링을 분석하였다.
그 결과, 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 적은 양의 효소를 추가하였음에도 불구하고, exo-cleavage 작용에 의해, 가수분해 생성물로 TPA-EG-TPA 또는 EG-TPA-EG-TPA는 생성되지 않은 채 오직 다이머만 사라진 것을 알 수 있었고, HPLC 분석에서는 MHET, TPA 및 EG 만이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 하기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, Bs2Est의 BHET에 대한 높은 가수분해 활성으로 인해 반응 혼합물에서 BHET가 검출되지 않음을 알 수 있었다(표 1).
| Substrate | K M (mm) | V max (u/mg) | k cat (1/s) | k cat/K M (1/mM·Es) |
| BHET | 8.84 | 5.99×104 | 2.10×105 | 2.37×104 |
| MHET | 5.10 | 2.33 | 6.46 | 1.27 |
즉, Bs2Est 효소는 다이머에 있는 MHET와 BHET 모이어티 사이의 에스테르 결합을 분해하여 MHET와 BHET를 방출하는 것으로 보이며, 이때 형성된 BHET는 BHET 쪽으로 높은 촉매적인 효능을 가지는 Bs2Est에 의해 MHET와 EG로 빠르게 가수분해될 수 있음을 알 수 있다(kcat/KM: 2.37 × 104 [1/mm·s]).
결국, 이러한 결과는 PET 올리고머에서의 다이머는 Bs2EST의 내부가수분해(Endo-cleavage) 활성에 의해 먼저 BHET와 MHET로 가수 분해되고, 이후 BHET는 빠르게 MHET로 가수 분해된 다음, MHET는 서서히 TPA와 EG로 가수분해되는 것을 시사하는 것이다.
실시예 5: Bs2Est의 생화학적 특성 확인 및 반응 시스템 구축
5-1: Bs2Est에 미치는 EG, TPA 디소듐 염의 억제 효과
EG, TPA 디소듐 염이 Bs2Est의 가수분해 활성에 미치는 효과를 확인하기 위하여, EG 0 내지 40 mM 또는 TPA 디소듐 염 0 내지 16 mm 농도 범위에서 효소 반응을 수행하였다. EG 또는 TPA가 존재 시에는, 30 °C, 50 mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.5)에서 2 U/mL Bs2Est로 2 mM BHET를 가수분해하였다. pH 적정화(titration)를 위해, Metrohm 906 Titrando(Herisau, Switzerland)를 사용하여 1 n NaOH의 적정량을 추가하여 pH를 7.5로 조정하였다.
Bs2Est의 가수분해 활성에 대한 EG 또는 TPA 디소듐 염의 추가로 인한 잠재적 유해성을 확인한 결과, 도 15 및 도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다양한 농도인 EG 0 내지 40 mM 또는 TPA 0 내지 16 mM 디소듐 염을 첨가하여 확인했을 때, EG 또는 TPA 농도에 관계없이 효소 활성도가 감소되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
이를 토대로, 보다 효율적인 해중합 공정을 확립하기 위하여 BHET 농도는 증가시켰다.
4-2: Bs2Est에 미치는 버퍼 시스템의 효과
효소 가수분해 공정에서 기질 농도는 공정의 효율성을 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나이다. 따라서 Bs2Est가 효소 선별에 사용된 조건(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 30°C)에서 고농도 BHET를 TPA 및 EG로 완전히 가수 분해할 수 있는지 확인하였다.
그 결과, 도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, 50 mM Tris-HCl 에서는 TPA 변환이 BHET 또는 MHET 농도가 증가함에 따라 눈에 띄게 감소하는 것을 알 수 있었다.
이를 통해 Bs2Est는 BHET, MHET 또는 TPA가 고농도 상태일 때는 기질이나 생성물 저해에 의해 억제됨을 예상할 수 있었다.
상기와 같은 전환율의 감소를 설명하기 위해, 서로 다른 버퍼 시스템의 TPA 용해도 변화를 먼저 확인해 보았다.
그 결과, 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, Tris-HCl 버퍼 시스템에서는 TPA의 용해도가 6.6 mM로(도 18의 a), Tris-HCl 기반 효소 가수분해 반응에서의 최대 TPA 생산량에 해당하는 것을 알 수 있었다. 또한, 인산나트륨 버퍼 시스템에서도 TPA 용해도는 21 mM로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 18의 b).
4-3: Bs2Est에 미치는 기질 농도의 효과
이후, 상기의 결과를 반영하여 효소 가수분해 과정에 인산나트륨 버퍼 시스템을 적용하여 기질 투입량이 개선된 효소 가수분해 시스템을 구축하였다(50 mM sodium phosphate buffer).
한편, 인산나트륨 버퍼 시스템을 적용하여 기질 로딩이 개선된 효소 가수분해 시스템을 구축 후 BHET 농도에 따른 TPA 생산량을 확인해 보았다. 그 결과, 도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, BHET 4, 8, 12, 16 mM에서는 TPA 전환율이 98.1 내지 99.9%였으나, BHET 24 mM 이상을 이용하는 효소 반응에서는 TPA 17.7 mM이 생성되고 MHET 7.5 mM은 비전환(unconverted) 상태를 유지하는 것을 확인할 수 있었다
이로써, 기질 BHET를 증가시켜도 TPA 전환율을 높은 상태로 유지할 수 있는 새로운 조건이 필요함을 알 수 있었다.
4-4: Bs2Est에 미치는 pH의 영향
기질 BHET를 증가시켜도 TPA로의 전환율이 높은 상태를 유지할 수 있는 시스템의 구축을 위하여, pH의 조건을 변화시켜 보았다. 구체적으로는, NaOH를 이용하여 pH를 6 내지 8의 범위로 조절한 후, TPA의 농도를 확인하였다.
구체적으로, 효소 반응은 3 시간 동안 2U / mL의 Bs2Est를 사용하여 2mM의 MHET에서 수행되었고, 반응 혼합물을 1000rpm 및 30℃에서 교반하였다.
그 결과, 도 20에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상대적으로 pH 7.5에서 TPA의 상대적인 전환율이 100%에 근접하여 pH 7.5에서 본 발명의 신규 효소의 활성이 가장 우수한 것을 알 수 있었으며, 특히, 도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이, BHET 24mM을 기질로 사용하는 효소반응의 비율이 pH가 7.5로 유지되면 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 인산나트륨 버퍼의 농도가 50mM에서 200mM으로 높아질 때에도 pH가 7.5로 적정화가 이뤄지면 효소 반응이 개선됨을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이, (a) 50mM, (b) 100mM, 및 (c) 200mM의 인산나트륨 버퍼에서 효소반응은 완충농도가 50mM에서 200mM로 증가함으로써 개선되는 것을 알 수 있었으며, 특히 인산나트륨 버퍼가 50mM일 때도 NaOH로 pH를 7.5를 유지하면 반응성이 50mM 초기 pH 7.5일 때보다 반응성이 좋은 것을 확인할 수 있었다.
종합하면, 본 발명은 화학적으로 전처리된 제품을 정제 없이 단일공정의 과정으로 효소 화학적으로 해중합 할 수 있는 신규 효소 Bs2Est를 새롭게 규명하였고, 특히, 상기 신규 효소 Bs2Est는 잔류 활성으로 PET 올리고머까지 분해함으로써, 이론상 TPA 최대 수율보다도 더 높은 수치로 TPA를 생산할 수 있음을 규명한 것이다.
나아가, 이를 이용하여 최적으로 TPA를 생성할 수 있도록 Bs2Est의 활성화를 높일 수 있는 최적의 조건을 규명함으로써, 반응 시스템의 최적화를 확립하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Novel use of Bs2Est in chemo enzymatic depolymerization process
and Method for decomposing waste plastics using the same
<130> KPA201292-KR
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 489
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly Thr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Gly Val His Lys Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro
20 25 30
Pro Val Gly Gln Trp Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu Val Trp
35 40 45
Glu Asp Val Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gly Ser Ile Cys Pro Gln Pro
50 55 60
Ser Asp Leu Leu Ser Leu Ser Tyr Thr Glu Leu Pro Arg Gln Ser Glu
65 70 75 80
Asp Cys Leu Tyr Val Asn Val Phe Ala Pro Asp Thr Pro Ser Lys Asn
85 90 95
Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Tyr Leu Gly Ala
100 105 110
Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Ala Ala Gln Gly Glu
115 120 125
Val Ile Val Val Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Pro Phe Gly Phe Leu
130 135 140
His Leu Ser Ser Phe Asn Glu Ala Tyr Ser Asp Asn Leu Gly Leu Leu
145 150 155 160
Asp Gln Ala Ala Ala Leu Lys Trp Val Arg Glu Asn Ile Ser Ala Phe
165 170 175
Gly Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly
180 185 190
Met Ser Ile Ala Ala Leu Leu Ala Met Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe
195 200 205
Gln Lys Ala Ile Met Glu Ser Gly Ala Ser Arg Thr Met Thr Lys Glu
210 215 220
Gln Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Phe Leu Gln Val Leu Gly Ile Asn
225 230 235 240
Glu Gly Gln Leu Asp Lys Leu His Thr Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu
245 250 255
Lys Ala Ala Asp Gln Leu Arg Ile Ala Glu Lys Glu Asn Ile Phe Gln
260 265 270
Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp Pro Lys Thr Leu Pro Glu Glu Pro
275 280 285
Glu Lys Ala Ile Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly Ile Pro Leu Leu Ile
290 295 300
Gly Thr Thr Arg Asp Glu Gly Tyr Leu Phe Phe Thr Pro Asp Ser Asp
305 310 315 320
Val His Ser Gln Glu Thr Leu Asp Ala Ala Leu Glu Tyr Leu Leu Gly
325 330 335
Lys Pro Leu Ala Glu Lys Val Ala Asp Leu Tyr Pro Arg Ser Leu Glu
340 345 350
Ser Gln Ile His Met Met Thr Asp Leu Leu Phe Trp Arg Pro Ala Val
355 360 365
Ala Tyr Ala Ser Ala Gln Ser His Tyr Ala Pro Val Trp Met Tyr Arg
370 375 380
Phe Asp Trp His Pro Lys Lys Pro Pro Tyr Asn Lys Ala Phe His Ala
385 390 395 400
Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Arg Met
405 410 415
Ala Lys Ala Glu Ile Thr Asp Glu Val Lys Gln Leu Ser His Thr Ile
420 425 430
Gln Ser Ala Trp Ile Thr Phe Ala Lys Thr Gly Asn Pro Ser Thr Glu
435 440 445
Ala Val Asn Trp Pro Ala Tyr His Glu Glu Thr Arg Glu Thr Leu Ile
450 455 460
Leu Asp Ser Glu Ile Thr Ile Glu Asn Asp Pro Glu Ser Glu Lys Arg
465 470 475 480
Gln Lys Leu Phe Pro Ser Lys Gly Glu
485
<210> 2
<211> 1470
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
atgactcatc aaatagtaac gactcaatac ggcaaagtaa aaggcacaac ggaaaacggc 60
gtacataagt ggaaaggcat cccctatgcc aagccgcctg tcggacaatg gcgttttaaa 120
gcacctgagc cgcctgaagt gtgggaagat gtgcttgatg ccacagcgta cggctctatt 180
tgcccgcagc cgtctgattt gctgtcactt tcgtatactg agctgccccg ccagtccgag 240
gattgcttgt atgtcaatgt atttgcgcct gacaccccaa gtaaaaatct tcctgtcatg 300
gtgtggattc acggaggcgc tttttatcta ggagcgggca gtgagccatt gtatgacgga 360
tcaaaacttg cggcacaggg agaagtcatt gtcgttacat tgaactatcg gctggggccg 420
tttggctttt tgcacttgtc ttcatttaat gaggcgtatt ctgataacct tgggctttta 480
gaccaagccg ccgcgctgaa atgggtgcga gagaatattt cagcgtttgg cggtgatccc 540
gataacgtaa cagtatttgg agaatccgcc ggcgggatga gcattgccgc gctgcttgct 600
atgcctgcgg caaaaggcct gttccagaaa gcaatcatgg aaagcggcgc ttctcgaacg 660
atgacgaaag aacaagcggc gagcacctcg gcagcctttt tacaggtcct tgggattaac 720
gagggccaac tggataaatt gcatacggtt tctgcggaag atttgctaaa agcggctgat 780
cagcttcgga ttgcagaaaa agaaaatatc tttcagctgt tcttccagcc cgcccttgat 840
ccgaaaacgc tgcctgaaga accagaaaaa gcgatcgcag aaggggctgc ttccggtatt 900
ccgctattaa ttggaacaac ccgtgatgaa ggatatttat ttttcacccc ggattcagac 960
gttcattctc aggaaacgct tgatgcagcg ctggagtatt tactagggaa gccgctggca 1020
gagaaagttg ccgatttgta tccgcgttct ctggaaagcc aaattcacat gatgactgat 1080
ttattatttt ggcgccctgc cgtcgcctat gcatccgcac agtctcatta cgcccctgtc 1140
tggatgtaca ggttcgattg gcacccgaag aagccgccgt acaataaagc gtttcacgca 1200
ttagagcttc cttttgtctt tggaaatctg gacggattgg aacgaatggc aaaagcggag 1260
attacggatg aggtgaaaca gctttctcac acgatacaat cagcgtggat cacgttcgcc 1320
aaaacaggaa acccaagcac cgaagctgtg aattggcctg cgtatcatga agaaacgaga 1380
gagacgctga ttttagactc agagattacg atcgaaaacg atcccgaatc tgaaaaaagg 1440
cagaagctat tcccttcaaa aggagaataa 1470
Claims (28)
- Bs2Est 효소를 포함하는 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 분해용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 PET 분해용 촉매를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 분해는 효소화학적 해중합공정에 의한 분해인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 PET는 폐 PET(waste-PET) 전체 또는 이의 일부인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 촉매는 아세트산아연 촉매 또는 탄산칼륨인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Bs2Est 효소는 고초균(Bacillus subtilis)에서 유래된 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Bs2Est 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 2의 염기서열로 코딩되는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Bs2Est 효소는 MHET 형성 없이, 단일공정으로 BHET를 TPA 및 EG로 완전히 가수분해하는 것이 특징인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Bs2Est 효소는 EG 또는 TPA 디소듐염에 의해 전환 활성이 억제되지 않는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Bs2Est 효소는 pH 6 내지 8에서 전환활성이 우수한 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Bs2Est 효소는 PET 올리고머에 대한 잔류 분해 활성을 가지는 것인, 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 PET 올리고머는 다이머, 트리머 또는 테트라머를 포함하는 것인, 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 다이머는 Bs2EST의 내부가수분해(Endo-cleavage) 활성에 의해 먼저 BHET와 MHET로 가수분해되고, 이후 상기 BHET가 MHET로 가수분해된 후 MHET가 TPA와 EG로 가수분해되는 것이 특징인, 조성물.
- Bs2Est 효소를 PET에 처리하는 단계를 포함하는, PET 분해방법.
- 제15항에 있어서, PET 분해용 촉매를 더 처리하는 것인, 분해방법.
- 제16항에 있어서, 상기 촉매는 아세트산아연 촉매 또는 탄산칼륨인 것인, 분해방법.
- 제16항에 있어서, 상기 촉매는 1 내지 5시간동안 반응을 수행하는 것인, 분해방법.
- 제16항에 있어서, 상기 촉매는 180 내지 210 °C의 온도에서 반응하는 것인, 분해방법.
- 제16항에 있어서, 상기 촉매 탄산칼륨 함량은 0.05 내지 0.4g인 것인, 분해방법.
- 제15항에 있어서, 인산나트륨 버퍼로 pH 6 내지 8의 범위에서 수행되는 것인, 분해방법.
- PET 분해용 촉매 및 Bs2Est 효소를 PET에 처리하는 단계를 포함하는, 효소화학적 해중합공정을 이용한 PET의 단일공정 업사이클링 방법.
- Bs2Est 효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터의 일부가 도입되고 상기 단백질의 활성을 나타내는 형질전환세포; 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PET 분해 생성물의 TPA로의 전환용 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 PET 분해 생성물은 PET로부터 유래된 것인, 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 PET 분해 생성물은 BHET를 포함하는 것인, 조성물.
- Bs2Est 효소 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터의 일부가 도입되고 상기 단백질의 활성을 나타내는 형질전환세포; 상기 형질전환세포가 포함된 생물체 또는 상기 형질전환세포의 배양물을 이용하여, PET 분해 생성물의 TPA로의 전환방법.
- PET에 Bs2Est 효소를 처리하여 PET 분해 생성물을 제조하는 제1단계; 및
상기 PET 분해 생성물에 Bs2Est 효소를 처리하는 제2단계;를 포함하는, 효소화학적 해중합공정을 이용한 PET에서 TPA의 생산방법. - 완충 시스템으로 인산나트륨 버퍼를 선택하는 단계;
BHET의 농도를 1 내지 50mM로 조절하는 단계; 및
pH를 6 내지 8의 범위로 적정화하는 단계;를 포함하는, Bs2Est 효소를 이용한 단일공정 효소 반응 시스템의 최적화 방법.
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