KR20230050487A - 다기능 나노섬유 복합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생활성 유리 나노입자(BGn, bioactive glass nanoparticle)가 함유된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤(PCL, poly(ε-caprolactone)) 및 젤라틴(Gel) 용액에 생활성 유리 나노입자를 혼합하여 전기방사하여 제조된 생분해성 다기능 나노섬유 복합체 및 생체 모방 광물화에 의해 생활성 유리 나노입자가 하이드록시아파타이트로 변경된 PCL/GEL-HA 나노섬유 복합체에 관한 것으로, 이의 우수한 인장 기계적 특성, 높은 비표면적, 다공성, 친수성 및 생분해성, 생활성 이온의 분비 및 단백질 흡착/분비 능력은 우수한 골 재생 유도 기능을 갖는 나노섬유 복합체를 제공한다.
Description
본 발명은 다기능 나노섬유 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
전기방사 나노섬유는 재생 의학 분야에서 상처 치유를 위한 상처 드레싱, 말초 신경 복구를 위한 가이드 매트릭스, 치료용 약물 전달 시스템, 골격근 엔지니어링을 위한 스캐폴드, 식도 조직 엔지니어링을 위한 매트릭스 플랫폼 및 조직 유도/뼈 재생용 차단막으로 광범위한 연구가 이뤄지고 있다.
특히, 골 유도 재생술식(GBR, Guided Bone Regeneration)에서 차단막으로 전기방사 나노섬유를 사용하는 데 관심이 높다. GBR은 연조직이 결손 부위로 침입하는 것을 방지하고 손상된 치주 조직의 재생을 유도하기 위한 공간을 유지하기 위해 막을 장벽으로 사용하는 절차이다.
치주 질환은 일반적으로 세균 감염 및 만성 염증과 관련되어 치아에서 치주 인대가 분리된다. 결과적으로 이는 치은, 치조골, 치주인대 조직을 포함한 치주조직을 악화시켜 궁극적으로 골소실을 초래한다. 다양한 차단막으로 확장된 폴리테트라플루오로에틸렌, ePTFE(비흡수성 유형) 및 콜라겐(흡수성 유형) 등이 골 유도 재생을 위해 적용되어 왔다.
그러나 비흡수성 멤브레인은 2차 수술로 제거해야 하므로 2차 절차에 의해 높은 위험성을 가질 수 있다. 반면 흡수성 멤브레인은 2차 세균 감염의 위험이 없이 단일의 수술 과정이 진행되므로, 흡수성 멤브레인의 임상적 사용에 대한 관심이 높아지고 있다.
한편, 흡수성 콜라겐 막은 통제되지 않는 빠른 생분해, 부적절한 기계적 강성 및 상피 내성장 및 손상된 뼈 형성과 관련이 있는 것으로 밝혀져 있다. 실제, 현재 이용 가능한 치주 멤브레인은 생활성의 부족 및 제한된 치료효과와 같은 단점을 갖는다.
폴리락트산(PLA) 및 폴리락트산/폴리글리콜산 공중합체(PLGA)와 같은 합성 고분자는 콜라겐보다 우수한 인장 기계적 특성과 조절된 생분해를 나타내는 반면, 낮은 강성, 소수성 특성 및 제한된 생활성을 갖는다.
본 발명자들은 바람직한 물리 화학적 및 생물학적 특성을 갖는 멤브레인을 개발하기 위해 노력한 결과, 전기방사 기술을 사용하여 생활성 유리 나노입자가 함유된 폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone), PCL)/젤라틴(GEL) 나노섬유 복합체를 개발하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생활성 유리 나노입자(BGn, bioactive glass nanoparticle)가 함유된 나노섬유 복합체를 제공하는 것이다. 생활성 유리 나노입자가 함유된 나노섬유 복합체는 폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone), PCL) 및 젤라틴을 포함하는 용액에 생활성 유리 나노입자를 혼합하여 전기방사하여 제조된 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노섬유 복합체를 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 용액에 침지시켜 형성된 하이드록시아파타이트를 함유하는 폴리카프로락톤 및 젤라틴 나노섬유 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 생활성 유리 나노입자를 폴리카프로락톤 및 젤라틴 용액과 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 (a)의 결과물을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계를 포함하는 상기 나노섬유 복합체 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 생활성 유리 나노입자를 폴리카프로락톤 및 젤라틴 용액과 혼합하는 단계; (b) 상기 (a)의 혼합 용액을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 결과물을 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 용액에 침지시켜 형성된 나노섬유 복합체를 수집하는 단계를 포함하는 상기 나노섬유 복합체 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노섬유 복합체를 함유하는 골재생 유도 멤브레인용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노섬유 복합체를 손상 골 조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 생활성 유리 나노입자(BGn, bioactive glass nanoparticle)가 함유된 나노섬유 복합체로서, 폴리카프로락톤(PCL, poly(ε-caprolactone)) 및 젤라틴 용액에 생활성 유리 나노입자를 혼합하여 전기방사하여 제조된 것인 생분해성 나노섬유 복합체에 관한 것이다.
본 발명자들은 생분해성이면서도 우수한 기계적 특성을 가져 골 재생 유도 등 조직 재생에 효과적인 다기능 나노섬유 복합체를 개발하고자 노력하였다.
PCL은 FDA(Food and Drug Administration)에서 여러 의료 기기에 사용하기 위한 생체 적합성 및 생분해성 합성 고분자로 승인되었다. 그러나, PCL은 소수성 특성, 불량한 세포 접착 및 상대적으로 느린 생분해성을 갖는다. 반면, GEL은 콜라겐에서 산(GEL Type A) 또는 염기(GEL Type B) 가수분해에 의해 파생된 천연 단백질이다. GEL은 우수한 생체적합성, 생분해성, 낮은 항원성 및 세포 부착 및 증식을 위한 많은 인테그린 결합 부위를 가지고 있으며 경제적이다. PCL 및 GEL 용액에 생활성 유리 나노입자를 혼합하여 전기방사하여 제조된 나노섬유 복합체는 생체 내에서 생분해성이면서도 우수한 기계적 특성, 높은 비표면적, 친수성 및 단백질 흡착 능력을 나타내 다기능 나노섬유 복합체로서의 가능성을 실험을 통해 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 생활성 유리는 유리-세라믹 생체재료를 의미하는 것으로 생활성 유리는 생체적합성에 의해 조직재생을 위한 임플란트, 지지체로 널리 이용된다. 생활성 유리는 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 합성할 수 있으며 이는 업계에서 잘 알려져 있다. 졸-겔법의 화학적인 과정은 실리콘이나 금속 알콕사이드 단위 전구체(monomer precursor)로부터 다양한 종류의 무기질 망상 조직(network)을 만드는 것이다. 이 과정을 이용하면 고온에서 용융과정을 거쳐 무기질 유리를 만드는 전통적인 방법과는 달리 상온에서 경도와 투명도, 화학적 안정도, 조절된 기공, 열전도도 등 좋은 성질의 균질한 무기질 산화물질을 만들 수 있는 장점이 있다. 생활성 유리 용액은 액상의 생활성 유리와 촉매, 용매 등을 포함하며, 생활성 유리 용액은 칼슘, 인 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 칼슘 성분과 인 성분을 포함함으로써 인체 골조직과 지지체간에 화학적 유사성을 갖도록 할 수 있다. 생활성 유리 용액은 생체 활성유리, 촉매, 용매, 칼슘 또는 인을 혼합하여 전자교반하여 제조할 수 있다.
상기 생활성 유리 나노입자는 생활성 유리를 나노수준의 입자로 만든 것으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, a) 폴리에틸렌 글리콜(poly(ethylene glycol), PEG) 및 질산칼슘 4 수화물(Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3)2·4H2O)을 혼합하여 복합 용액을 제조하는 단계; b) 상기 a)의 결과물에 테트라에틸 오소실리케이트(Tetraethyl orthosilicate, TEOS) 용액을 첨가하고 교반하고 초음파 처리하여 반응 생성물을 제조하는 단계; c) 상기 반응 생성물을 원심분리하여 분리한 백색 콜로이드를 세척하는 단계; 및 d) 상기 세척한 반응 생성물을 건조하고, 하소하는 단계를 포함하여 제조되었다. 생활성 유리 나노입자는 더 넓은 표면적과 더 많은 기공을 가져 생분해성 및 단백질 흡착능이 향상되게 된다. 일반적으로 생활성 유리 나노입자는 SiO2 및 CaO를 주성분으로 한다.
상기 전기방사는 많은 조직의 세포외 기질에 매우 가까운 구조를 가진 부직 나노섬유 막(non-woven nanofibrous membranes)을 제조하는 기술이다. 따라서 세포 부착, 세포 내 성장, 세포 증식 및 분화를 촉진한다. 전기방사에 의해 제조된 섬유 막은 높은 다공성, 높은 기공 상호 연결성 및 높은 표면적 대 부피 비율을 갖는다. 또한 조성을 변경하고 전기방사 공정 매개변수를 제어함으로써 물리화학적, 기계적 및 생물학적 특성을 조정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 생활성 유리 나노입자가 함유된 나노섬유 복합체는 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF, simulated body fluid) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것이다. 따라서, 상기 나노섬유 복합체는 인간의 생체 내에서 하이드록시아파타이트를 형성할 수 있음을 확인하였다. 하이드록시아파타이트는 우수한 생체적합성, 생분해성, 생활성 및 골전도성을 갖는 무기 생체 재료로 뼈와 같은 조성을 갖는다. 특히, 생체모방 광물화에 의해 성장된 HA는 조절된 결정 크기/형태, 계층적 나노/마이크로 구조, 높은 비표면적, 생체 모방 구성 및 우수한 세포 접착력과 같은 장점을 갖는다. 또한, HA는 연조직의 정압(static pressure)에 저항할 수 있는 막을 만들 수 있는 충분한 기계적 강도를 가져 치주골 재생을 위한 적절한 공간을 제공한다. 또한, HA는 칼슘(Ca2+)과 포스페이트 이온(PO4 3-)을 포함한 용해성 생활성 이온의 방출과 더불어 세포 부착, 증식을 개선하고 단백질 및 성장 인자의 흡착을 효과적으로 촉진한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유 복합체는 골재생 유도 기능을 갖는 것이다. 본 발명 나노섬유 복합체는 높은 비표면적, 높은 친수성을 가져 세포 부착에 용이하고, 높은 생분해성을 나타내며, 생체 내에서 골 형성 분화 및 혈관 신생에 효과적인 칼슘(Ca2+), 실리케이트(SiO4 4-), 포스페이트(PO4 3-) 이온을 방출하여 골 재생 유도에 효과적이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생활성 유리 나노입자의 CaO 및 SiO2의 몰%는 1 : 2 ~ 6인 것으로, 상기의 비율 범위에서 가장 안정한 3차원의 나노기공구조가 형성되며, CaO 및 SiO2 의 상기 비율이 1: 6 초과인 경우, Si이 많아 생활성이 저해될 수 있다. CaO 및 SiO2의 상기 비율이 1: 2 미만인 경우 다량의 Ca으로 인해 나노입자의 형상이나 크기를 균일하게 만드는데 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, PCL, 젤라틴 및 생활성 유리 나노입자의 중량비는 1 : 1 : 2 ~ 5 이다. 상기 중량비 보다 생활성 유리 나노입자의 비율이 낮은 경우 나노섬유에 생활성 유리 나노입자의 응집체가 형성되지 않아 하이드록시아파타이트의 침착이 어려우며, 상기 중량비 보다 생활성 나노입자의 비율이 높은 경우 섬유형태를 붕괴시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유의 평균 직경은 0.5 ~ 1μm이며, 생활성 유리 나노입자 응집체의 직경은 1.5 ~ 2.25μm이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 2 ~ 8 nm의 기공크기를 가지는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 비표면적이 0,5 ~ 1.5 m2/g이다. 본원에서 사용되는 용어 비표면적은 분체, 입자체의 단위 중량 또는 단위 부피당 겉넓이를 의미한다. 비표면적은 분체의 입도를 나타내는 특성값으로서 이용된다. 1g의 분체가 갖는 표면적 Sw(cm2/g)로 나타내는 것이 가장 많지만, 단위 부피에 대한 표면적 Sv(cm2/cm3)로 나타내는 것도 있다. 입자가 작아지는데 따라 이 값은 커지며 계면 현상에 있어 중요한 값이 된다. 비표면적이 넓을수록 실제 나노입자의 표면적이 증가된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 물 접촉각이 15 ~ 30°이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 인장강도가 0.1 ~ 0.2 MPA이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 상기 나노섬유 복합체를 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 용액에 침지시켜 형성된 생활성 유리 나노입자가 하이드록시아파타이트로 변경된 나노섬유 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 탄성계수가 7 ~ 13 MPA인 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 4 ~ 21 nm의 기공크기를 가지는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 비표면적이 20 ~ 40 m2/g인 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 물접촉각이 5 ~ 15°인 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 인장강도가 0,2 ~ 0.3 MPA인 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 탄성계수가 13 ~ 19 MPA인 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노섬유는 기공에 단백질을 적재한 것이다.
상기 성장인자는 골형성 단백질, 성장 인자 또는 이의 조합인 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 생활성 유리 나노입자를 폴리카프로락톤 및 젤라틴 용액과 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 (a)의 결과물을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계를 포함하는 나노섬유 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 용액은 용매가 디클로로메탄, 트리플루오로에탄올, 클로로포름, 사염화탄소, 벤젠, 톨루엔, 시클로헥사논, 2-니트로프로판 또는 이들로부터 선택되는 2종 이상의 혼합용매이다. 본 발명의 실시예에서 용매로 트리플루오로에탄올(TFE)을 사용하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 전기방사의 조건은 0.5 ~ 1.5 ml/h의 주입속도, 10 ~ 11 Kv의 전압, 주사기 바늘과 수집기간 거리는 12 ~ 16 cm, 회전 드럼의 속도는 200 ~ 240 rpm 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 (a) 생활성 유리 나노입자를 폴리카프로락톤 및 젤라틴 용액과 혼합하는 단계; (b) 상기 (a)의 혼합 용액을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 결과물을 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 용액에 침지시켜 형성된 나노섬유 복합체를 수집하는 단계를 포함하는 상기 나노섬유 복합체 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노섬유 복합체를 함유하는 골재생 유도 멤브레인용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노섬유 복합체를 손상 골 조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공한다.
본 발명은 전기방사 기술을 사용하여 제조된 PCL/GEL-NBG 나노섬유 복합체가 체내에서 생체 모방 광물화에 의해 PCL/GEL-HA 복합 멤브레인을 생성함을 확인하고, PCL/GEL-HA 복합 멤브레인의 우수한 인장 기계적 특성, 높은 비표면적, 다공성, 친수성 및 생분해성, 생활성 이온의 분비 및 단백질 흡착/분비 능력을 확인한 것으로, 우수한 골 재생 유도 기능을 갖는 나노섬유 복합체를 제공한다.
도 1 (a)는 NBG의 나노구체를 나타내는 TEM 이미지를 나타내며, (b)는 NBG를 SBF에 침지 7 일 후 바늘 모양의 HA 나노결정이 구 방향으로 점진적 성장하는 것을 나타내는 TEM 이미지이며, (c)는 NBG를 SBF에 침지 14 일 후 NBG에서 HA 구로의 완전한 변형을 나타내는 TEM 이미지이며, (d)는 NBG를 SBF에 침지 14 일 후 NGB 응집체에서 성장한 단일 HA 구의 FIB로부터 얻은 단면 FE-SEM 이미지이다.
도 2 (a), (b)는 PCL/GEL(투명 노란색) 및 PCL/GEL-NBG(불투명 흰색) 복합 고분자 용액의 광학 사진이며, (c)는 섬유질 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 전기방사 제조 공정을 나타내며, (d), (e)는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 PCL/GEL-HA로의 생체모방 광물화를 나타낸다.
도 3 (a), (b)는 PCL/GEL 나노섬유를 따라 NBG 응집체가 존재함을 보여주는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 저배율 및 고배율 SEM 이미지를 나타내며, (c), (d)는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 단일 나노섬유의 내부 구조에 NBG 덩어리의 존재를 보여주는 HR-TEM 이미지를 나타내며(c 삽입 도의 HR-TEM-EDX 분석은 NBG의 구성에 속하는 Si 및 Ca 원소의 신호를 나타냄) (e)는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 섬유 크기 분포를 나타내며, (f)는 NBG 응집체의 크기 분포를 나타낸다.
도 4는 나노/마이크로 구조의 PCL-GEL-HA 멤브레인의 SEM 이미지를 나타낸다. (a) ~ (c)는 저배율 SEM 이미지를 나타내며, (d), (e)는 고배율 SEM 이미지를 나타내며, (f)는 HA 구의 크기 분포를 나타낸다.
도 5 (a), (b)는 PCL/GEL 나노섬유 주변에서 생체 공학적으로 성장한 단일 HA 구의 SEM 이미지의 측면도, 전면도를 나타내며, (c)는 HR-TEM 이미지를 나타내며, (d)는 TEM-SAED 분석을 나타내며, (e)는 Ca/P 원자비가 1.60인 Ca 및 P 원소의 존재를 나타내는 SEM-EDX 조성 분석을 나타낸다.
도 6 (a), (b)는 PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 TF-XRD, ATR-FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7 (a)는 PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 N2 흡착-탈착 등온선을 나타내며, (b), (c)는 NLDFT 기공 크기 분포를 나타내며, (d)는 BET-플롯을 나타낸다. PCL/GEL-HAs 멤브레인은 PCL/GEL-NBG와 비교하여 훨씬 더 높은 N2 흡착과 더 큰 비표면적을 나타냈다. PCL/GEL-NBG의 경우 기공 크기 분포는 3.5 - 6 nm 범위이고, PCL/GEL-HA의 경우 5 - 20 nm 범위였다.
도 8 (a) ~ (d)는 각각 PCL, PCL/GEL, PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인 표면의 물방울 사진이며, (e)는 물 접촉각의 대응 측정값을 그래프로 나타낸 것이며, (f)는 생리학적 유사 조건에서 질량 손실 측정으로 평가된 PCL/GEL-HAs 막의 가수분해를 나타내며((f)의 삽입도는 분해 데이터의 선형 피팅(R2 = 0.963)을 나타냄), (g)는 TGA에 의해 조사된 PCL/GEL 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 열적 거동을 나타낸다.
도 9는 PCL/GEL, PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 인장 기계적 특성을 나타낸다. (a)는 대표적인 응력-변형률 곡선을 나타내며, (b)는 인장 강도를 나타내며, (c)는 탄성 계수를 나타내며, (d)는 연신율 %를 나타낸다. PCL/GEL-HA는 PCL/GEL 및 PCL/GEL-NBG 멤브레인에 비해 강화된 강성을 나타낸다.
도 10 (a)는 생리학적 유사 조건에서 Tris 완충액 내 PCL/GEL-HA 멤브레인의 칼슘(Ca2+), 포스페이트(PO4 3-) 및 실리케이트 이온(SiO4 4-)의 방출 프로필을 나타내며, (b), (c)는 각각 첫번째 단계, 두번째 단계에서 방출 이온의 방출 데이터의 선형 피팅을 나타내며, (d)는 칼슘(Ca2+), 포스페이트(PO4 3-) 이온의 방출이 시간의 제곱근에 의존적임을 나타내며 이는 확산에 의해 조절되는 용해를 나타낸다.
도 11 (a)는 PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인에서 Cyt c 흡착 플롯을 나타내며, (b)는 Cyt c의 방출 프로파일을 나타내며, PCL/GEL-HAs 멤브레인은 PCL/GEL-NBG에 비해 훨씬 높은 Cyt c 흡착을 나타낸다. Cyt c 방출은 초기의 빠른 단계와 뒤의 제어 방출을 갖는 2단계 방출 프로파일을 나타낸다. (c)는 Cyt 방출의 첫 번째 단계를 나타내며, (d)는 Cyt 방출의 두 번째 단계를 나타낸다.
도 2 (a), (b)는 PCL/GEL(투명 노란색) 및 PCL/GEL-NBG(불투명 흰색) 복합 고분자 용액의 광학 사진이며, (c)는 섬유질 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 전기방사 제조 공정을 나타내며, (d), (e)는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 PCL/GEL-HA로의 생체모방 광물화를 나타낸다.
도 3 (a), (b)는 PCL/GEL 나노섬유를 따라 NBG 응집체가 존재함을 보여주는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 저배율 및 고배율 SEM 이미지를 나타내며, (c), (d)는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 단일 나노섬유의 내부 구조에 NBG 덩어리의 존재를 보여주는 HR-TEM 이미지를 나타내며(c 삽입 도의 HR-TEM-EDX 분석은 NBG의 구성에 속하는 Si 및 Ca 원소의 신호를 나타냄) (e)는 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 섬유 크기 분포를 나타내며, (f)는 NBG 응집체의 크기 분포를 나타낸다.
도 4는 나노/마이크로 구조의 PCL-GEL-HA 멤브레인의 SEM 이미지를 나타낸다. (a) ~ (c)는 저배율 SEM 이미지를 나타내며, (d), (e)는 고배율 SEM 이미지를 나타내며, (f)는 HA 구의 크기 분포를 나타낸다.
도 5 (a), (b)는 PCL/GEL 나노섬유 주변에서 생체 공학적으로 성장한 단일 HA 구의 SEM 이미지의 측면도, 전면도를 나타내며, (c)는 HR-TEM 이미지를 나타내며, (d)는 TEM-SAED 분석을 나타내며, (e)는 Ca/P 원자비가 1.60인 Ca 및 P 원소의 존재를 나타내는 SEM-EDX 조성 분석을 나타낸다.
도 6 (a), (b)는 PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 TF-XRD, ATR-FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7 (a)는 PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 N2 흡착-탈착 등온선을 나타내며, (b), (c)는 NLDFT 기공 크기 분포를 나타내며, (d)는 BET-플롯을 나타낸다. PCL/GEL-HAs 멤브레인은 PCL/GEL-NBG와 비교하여 훨씬 더 높은 N2 흡착과 더 큰 비표면적을 나타냈다. PCL/GEL-NBG의 경우 기공 크기 분포는 3.5 - 6 nm 범위이고, PCL/GEL-HA의 경우 5 - 20 nm 범위였다.
도 8 (a) ~ (d)는 각각 PCL, PCL/GEL, PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인 표면의 물방울 사진이며, (e)는 물 접촉각의 대응 측정값을 그래프로 나타낸 것이며, (f)는 생리학적 유사 조건에서 질량 손실 측정으로 평가된 PCL/GEL-HAs 막의 가수분해를 나타내며((f)의 삽입도는 분해 데이터의 선형 피팅(R2 = 0.963)을 나타냄), (g)는 TGA에 의해 조사된 PCL/GEL 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 열적 거동을 나타낸다.
도 9는 PCL/GEL, PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 인장 기계적 특성을 나타낸다. (a)는 대표적인 응력-변형률 곡선을 나타내며, (b)는 인장 강도를 나타내며, (c)는 탄성 계수를 나타내며, (d)는 연신율 %를 나타낸다. PCL/GEL-HA는 PCL/GEL 및 PCL/GEL-NBG 멤브레인에 비해 강화된 강성을 나타낸다.
도 10 (a)는 생리학적 유사 조건에서 Tris 완충액 내 PCL/GEL-HA 멤브레인의 칼슘(Ca2+), 포스페이트(PO4 3-) 및 실리케이트 이온(SiO4 4-)의 방출 프로필을 나타내며, (b), (c)는 각각 첫번째 단계, 두번째 단계에서 방출 이온의 방출 데이터의 선형 피팅을 나타내며, (d)는 칼슘(Ca2+), 포스페이트(PO4 3-) 이온의 방출이 시간의 제곱근에 의존적임을 나타내며 이는 확산에 의해 조절되는 용해를 나타낸다.
도 11 (a)는 PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인에서 Cyt c 흡착 플롯을 나타내며, (b)는 Cyt c의 방출 프로파일을 나타내며, PCL/GEL-HAs 멤브레인은 PCL/GEL-NBG에 비해 훨씬 높은 Cyt c 흡착을 나타낸다. Cyt c 방출은 초기의 빠른 단계와 뒤의 제어 방출을 갖는 2단계 방출 프로파일을 나타낸다. (c)는 Cyt 방출의 첫 번째 단계를 나타내며, (d)는 Cyt 방출의 두 번째 단계를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다,
실시예 1. 실험재료의 준비
테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS, 98%), 질산칼슘 4수화물(CaNT, 99%), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Mn = 10,000), 수산화암모늄(28.0% NH3·H2O, ≥ 99.99%), 무수 메탄올(99.8) %), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL, Mn = 70,000 - 90,000), 젤라틴(소 심장에서 추출한 GEL 타입 B), 2,2,2-trifluroethanol (TFE, ≥ 99%), 시토크롬 c(Cyto c), Kokubo의 모의 체액(simulated body fluid, SBF), 트리스-하이드록시메틸 아미노메탄(Tris-buffer), 1N 염산(HCl) 및 인산완충식염수(PBS) 타블렛은 모두 Sigma-Aldrich에서 구입했다. 초순수 탈이온수(18.2MΩ cm, Millipore Direct-Q system)는 필요한 경우 실험에 사용했다.
실시예 2. 전기방사에 의한 PCL/GEL-NBG 나노섬유 및 PCL/GEL-HAs의 제조
2-1. 초음파-보조 졸 겔 공정에 의한 NBG 합성
NBG(15 % CaO - 85 % SiO2 mole %)는 원-포트 초음파 보조 졸-겔 합성(one-pot ultrasound-assisted sol-gel synthesis)에 의해 준비하였다. PEG(5 g) 및 CaNT(0.179 g)를 150 ml의 알칼리성 메탄올 용액에 용해시켰다. 다음으로, 격렬한 교반 및 초음파 조사(10s on/10s off) 하에 TEOS/메탄올(0.895 g/30 ml) 용액을 20 분 동안 적가하였다.
백색 콜로이드 입자는 24 시간 동안 격렬한 교반 후 원심분리에 의해 분리하였다. 분리된 백색 콜로이드를 탈이온수/에탄올 용액으로 3회 세척한 후 70 ℃에서 밤새 건조하여 백색 건조 분말을 얻었다. 마지막으로 건조 분말을 600 ℃로 5 시간 동안 공기 흐름(air follow) 하에서 열처리하였다. 열처리된 NBG 분말은 추가 사용을 위해 진공에 보관하였다. HA로의 NBG 광물화는 Kokubo의 SBF에서 수행되었다.
2-2. 전기방사에 의한 PCL/GEL-NBG 나노섬유의 제조
NBG 응집체를 포함하는 PCL/GEL 나노섬유 막(PCL/GEL-NBG)을 전기방사 기술에 의해 제조하였다.
10 wt% PCL - 10 wt% GEL 및 25 wt% NBG의 복합 고분자 용액을 TFE에서 준비했다(TFE는 PCL과 GEL을 모두 용해시키는 용매로 사용됨). 복합 고분자 용액을 전기방사기(NanoNC, 한국)를 사용하여 나노섬유 멤브레인으로 전기방사하였다. 1ml/h의 주입 속도, 10.5kV의 인가 전압 및 14.5cm의 주사기 바늘과 수집기 간 거리는 전기방사 과정에서 설정되었다. 나노섬유 멤브레인은 220 rpm의 회전 드럼에 부착된 Al 호일 시트에 수집되었다. 멤브레인은 후드 챔버 내부에 밤새 보관하여 잔류 용매를 완전히 증발시켰다.
2-3. 생체 모방 광물화에 의한 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 제조
PCL/GEL-NBG에서 PCL/GEL-HA로의 변환은 생체 모방 광물화 과정을 통해 이루어졌다. Kokubo의 SBF에 담궈지는 동안 NBG 응집체는 HA로 변환된다. 멤브레인 샘플(5 cm × 5 cm)에 2 일마다 SBF를 정기적으로 갈아주면서 14 일 동안 50 ml의 SBF에 담궜다. 마지막으로 SBF 용액에서 멤브레인을 제거하고 탈이온수, 70 % 에탄올 용액으로 헹군 다음 후드 내부, 실온에서 완전히 건조시켰다.
실시예 3. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 특성 분석
3-1. 위상 및 형태 분석
합성된 NBG 및 SBF가 침지된 NBG의 위상과 나노 형태는 각각 X선 회절(XRD)과 투과전자현미경(TEM, JEOL)으로 조사하였다. 또한, 14 일 후 NBG 응집체로부터 생체모방적으로 성장된 단일 구형 HA를 집속 이온 빔(FIB)에 의해 절단했다. 그런 다음, 내부 표면 구조는 전계 방출 주사 전자 현미경(FESEM, LYRA3 GMH, Tescan, Czech Republic)을 사용하여 이미지화하였다. 단면의 원소 분석은 FIB-FESEM에 결합된 에너지 분산 X선 분석기(EDS, Bruker, Quantax 기기)에 의해 수행하였다. SEM 및 SEM-EDS 분석을 통해 관찰된 멤브레인의 표면 형태와 원소 조성을 조사하였다. 단일 섬유의 내부 구조와 원소 조성도 TEM으로 이미지화하고 각각 TEM/EDS로 분석하였다. 또한, TEM-SAED(TEM-selected area electron diffraction)을 사용하여 HAs의 전자 회절 패턴을 식별하였다. PCL/GEL 섬유, NBG 응집체 및 HA 구의 크기 분포는 Digimizer 이미지 분석 소프트웨어(MedCalc software bv, Belgium)를 사용하여 여러 SEM 및 TEM 이미지로부터 직경을 측정하여 얻었다.
3-2. 화학 구조 측정
PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 복합 멤브레인의 비정질/결정상을 박막 X선 회절(TF-XRD)로 조사하였다. TF-XRD는 CuKα 방사선, λ = 1.5418 Å 및 0.02°의 스텝 사이즈를 사용하여 Rigaku-Ultima IV에서 수행하였다. 반면, 특징적 구조 그룹은 ATR-FTIR(attenuated total reflectance infra-red spectroscopy)을 사용하여 식별하였다. ATR-FTIR 스펙트럼은 다이아몬드 크리스탈 액세서리 유닛(GladiATR, PIKE TECH., USA)이 장착된 Varian 640-IR에서 수집하였다.
3-3. 비표면적 및 다공성 측정
CL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 N2 흡착-탈착 등온선은 N2-흡착 분석기(Quantachrome, USA)를 사용하여 얻었다. 멤브레인 샘플은 분석 전에 실온에서 12시간 동안 탈기되었다. 비표면적은 BET(Brunauer-Emmett-Teller) 식으로 계산하였다. 기공 크기 분포는 NLDFT(Non-Local Density Functional Theory)를 기반으로 분석하였다. 다공성(δ)은 멤브레인의 겉보기 밀도(Mρa) 및 벌크 밀도(Mρb)로부터 계산되었다. ρa 및 δ는 다음 방정식을 사용하여 구했다.
[식 1]
Mρa(g cm3) = Mm/Mt × Ma 및 δ(%) = (1-ρa/ρb) × 100
Mm = 질량(g), Mt = 두께(cm), Ma = 멤브레인 면적(cm2).
멤브레인(5 cm × 5 cm)의 두께는 버니어 캘리퍼스로 측정했다. 멤브레인 구성 요소의 부피 밀도(ρb)는 다음과 같다. NBG의 부피 밀도는 무게와 겉보기 부피로부터 평가하였다:
멤브레인의 부피 밀도는 다음 식에서 계산할 수 있다.
[식 2]
Mρb = x ρb(PCL/GEL) + x ρb(NBG) 또는 Mρb = x ρb(PCL/GEL) + x ρb(HA) (X는 멤브레인에서 각 구성요소의 질량 분율임)
ImageJ 소프트웨어를 사용하여 나노섬유 사이의 기공 너비를 측정했다.
3-4. 접촉각 및 가수/열 분해 측정
멤브레인의 표면 친수성은 벤치탑 접촉각 장치(Phoenix, PHX300)를 사용한 물 접촉각 측정(sessile drop method)에 의해 측정하였다. 펀처를 사용하여 직경 1.2 cm의 원형 멤브레인 시편을 준비하였다. 마이크로주사기에서 한 방울의 탈이온수(~5 μL)를 샘플 표면으로 전달하였다. 물방울 사진은 15 초 이내에 촬영하였으며 표면 접촉각은 Image 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 접촉각은 3가지 다른 측정방법으로 얻어 평균 ± 표준 편차를 측정하였다. PCL/GEL-HAs 복합 멤브레인의 시험관 내 생분해를 생리학적 조건에서 조사했다. 잘 건조된 멤브레인 샘플을 PBS(pH = 7.4) 10 ml에 담그고 37 ℃에서 최대 4 주 동안 인큐베이션했다. PBS 용액을 3 일마다 갈아주었다. 멤브레인 샘플을 미리 결정된 각 시점에 취하고 탈이온수/70 % 에탄올로 잘 헹군 후 건조시켰다.
분해 %는 멤브레인을 PBS에 담그기 전과 후의 질량 측정으로 결정하였다. 분해 %는 3회 실험으로 평가되었으며 평균 ± 표준 편차를 측정하였다. 또한, PCL/GEL-HA 복합 멤브레인에서 무기 성분인 HA의 백분율과 열 거동은 열 중량 분석(TGA)에 의해 결정되었다. TGA는 40 ml/min의 유속의 질소 퍼지에서 10 ℃/min의 가열 속도에서 수행하였다.
3-5. 멤브레인의 인장 기계적 특성 측정
멤브레인의 인장 기계적 특성은 Instron bench-top universal testing machine으로 측정하였다. 60 × 10 × 0.5 mm의 멤브레인 시편(n = 6)은 250 N 로드 셀과 0.5 mm/s의 크로스 헤드 속도를 사용하여 테스트하였다. 탄성계수, 인장강도, 파단신율(%)은 응력 변형률 곡선(stress-strain curves)을 분석하여 결정하였다. 기계적 매개변수는 6 가지 다른 측정으로 결정하였고 평균 ± 표준 편차를 확인하였다.
3-6. 이온 방출 측정
PCL/GEL-HAs 멤브레인으로부터 칼슘(Ca2+), 포스페이트(PO4 3-), 규산염(SiO4 4-) 생활성 이온의 시험관 내 방출은 ICP OES(inductively-coupled plasma optical emission spectrometry)에 의해 측정하였다. 200 mg의 멤브레인을 10 ml의 Tris-buffer(pH 7.4)에 담그고 120 rpm으로 37 ℃에서 진탕 배양하였다. 방출 매질은 미리 결정된 각 시점에서 완전히 회수하였고 새로운 Tris-buffer로 교체하였다. 수집된 방출 매질은 70 % 질산으로 처리한 다음 ICP-OES로 분석했다. 방출된 이온의 양은 3가지 다른 측정을 통해 수집되었으며 평균 ± 표준 편차를 확인하였다.
3-7. 단백질 흡착 및 방출 측정
Cyto c(cytochrome c)를 모델 단백질로 사용하는 단백질 흡착 테스트는 UV-Vis 스펙트럼 분석과 결합된 멤브레인 침지/고갈 방법으로 수행하였다. 10 mg 멤브레인 샘플(n = 3)을 접어 0.5 - 5 mg/ml 범위의 농도의 Cyto c 용액에 2 시간 동안 담가두었다. UV-Vis 분광계와 Cyto c의 표준 곡선(λ max = 409 nm, A = 0.0071C - 0.007, R2 = 0.9998)을 사용하여 Cyto c 용액 농도의 고갈로부터 멤브레인에 흡착된 Cyto c 양을 측정했다. 그 후, Cyto c의 방출은 2 mg/ml Cyto c 용액에 로딩된 10 mg 멤브레인으로부터 측정하였다. 멤브레인 샘플(n = 3)을 37 ℃에서 PBS 1 ml에 담그고 미리 결정된 각 시점에서 전체 방출 배지를 회수하고 1 ml의 새로운 PBS로 교체했다. 방출 매체에서 Cyto c의 농도는 UV-Vis 흡수 분광법에 의해 결정되었다. 흡착/방출된 Cyto c의 양은 3가지 다른 분석을 통해 수집되었으며 평균 ± 표준 편차를 확인하였다.
실험예 1. NBG의 특성
NBG의 위상은 XRD 분석에 의해 확인하였다. XRD는 날카로운 회절 피크가 없고 약 2θ= 23°를 중심으로 넓은 피크를 나타낸다. 이 넓은 피크는 무정형 할로(halo)로 알려져 있으며 이는 무정형 유리의 특징이다. SBF에 담근 후 14 일의 NBG에 대한 XRD 분석은 HA 결정상에 해당되는 강한 XRD 피크의 변화를 나타냈다.
NBG의 형태학적 특징과 광물화 가능성은 도 1에 나타냈다. 합성된 NBG의 나노형태는 TEM 이미징에 의해 시각화되었다(도 1a). TEM 이미지는 약 85 ± 15 nm 직경의 나노 구체를 나타낸다. 잘 발달된 구 형태의 나노입자 생산에 초음파 보조 졸-겔 합성이 효과적임을 확인할 수 있다.
NBG에서 HA로의 생체모방 광물화는 SBF에 담근 후 7 일 및 14 일 후에 확인하였다. SBF 침지된 NBG의 TEM 이미지는 HA 결정이 구형 방향으로 크게 성장하는 HA 구 형성 경향을 나타냈다(도 1b ~ c). SBF 침지 7 일 후 NBG의 TEM 이미지는 바늘형 HA 나노결정의 모든 방향에서 HA 구 형성을 향한 경향성을 나타냈다(도 1b). 또한, SBF 침지 14 일 후 NBG의 TEM 이미지는 NBG 응집체가 판 모양의 HA 나노결정과 함께 HA 구형으로 완전히 변형되었음을 나타냈다(도 1c). 14 일 후 성장된 단일 HA 구를 FIB에 의해 단면화하고, 얻은 HA 반구의 내부 표면 형태를 FE-SEM으로 시각화하여 나타냈다(도 1d).
또한, HA 반구 중앙의 조성은 FE-SEM-EDS로 분석하였다. EDS 분석(도 S2 a의 빨간색 원 점)은 NBG 응집체의 잔류물에 기인한 ~1 ~ 1.5 %의 Si 원소를 감지함과 동시에 원자 비율이 Ca/P = 1.55인 Ca 및 P 원소의 존재를 감지하였다.
그 후, 섬유질 PCL-GEL-NBG 멤브레인의 전기방사 제조 및 PCL-GEL-HA로의 생체모방 광물화를 포함하도록 2단계 공정이 설계되었다. 전기방사에 사용되는 PCL/GEL(투명한 노란색) 및 PCL/GEL-NBG(불투명한 흰색) 복합 고분자 용액의 광학 사진은 도 2(a-b)에 나타냈다. 제조된 PCL/GEL-NBG 복합 고분자 용액은 나노섬유로 전기방사되어(도 2c) 제작된 PCL/GEL-NBG 멤브레인은 생체 모방적으로 PCL/GEL-HA로 광물화된다(도 2d, e).
실험예 2. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인의 구성 및 표면 형태
전기방사된 PCL/GEL-NBG 복합 멤브레인의 표면 형태는 저배율 및 고배율에서 시각화하였다. SEM 이미지는 나노섬유 축을 따라 NBG 응집체를 함유하는 나노섬유를 나타냈다. PCL/GEL-NBG 나노섬유의 내부 구조는 TEM 영상으로 검사하였다. 내부 구조에서 단일 섬유의 TEM 이미지는 구형 생활성 유리 나노 입자 응집체의 존재를 나타낸다(도 3c, d). NBG 응집체(비드)의 형성은 고분자 매트릭스의 친수성과 함께 NBG의 양과 특성에 따라 달라진다. 예를 들어, NBG(75 % SiO2 - 25 % CaO 및 62.7 ± 12.3 nm의 입자 크기)를 PCL/GEL에 30 wt%로 추가해도 NBG 비드 형성이 발생하지 않는다. 그러나, PCL-GEL 조성물에 NBG를 40 wt% 첨가하면 NBG 비드가 형성되었다. 또한 NBG(85 % SiO2 - 15 % CaO 및 85 ± 15 nm의 입자 크기)를 PCL/GEL에 20 wt%로 첨가해도 NBG 비드가 형성되지 않았다. 그러나, NBG 25 wt%가 PCL-GEL 조성물에 첨가되었을 때 NBG 비드가 형성되었다(도 3a, b). TEM-EDS 분석(도 3c의 삽입도)은 NBG의 구성 요소, 즉 SiO2 및 CaO에 속하는 Si 및 Ca 원소의 존재를 감지했다. 나노섬유의 크기 분포(도 3e)는 대부분의 섬유가 0.5 ~ 1μm 범위의 직경을 가짐을 나타냈다. 반면, NBG 응집체의 크기 분포는 대부분의 NBG 응집체가 1.5 ~ 2.25 μm 범위 내의 직경을 가지고 있음을 나타냈다(도 3f).
다음으로, PCL/GEL-NBG 멤브레인의 생체모방 광물화에 의해 PCL/GEL-HA를 제조하였다. PCL/GEL-HAs 멤브레인의 표면 형태는 저배율 및 고배율에서 SEM으로 검사하였다(도 4a ~ e). SEM 이미지는 생체모방 광물화 동안 NBG 응집체로부터 성장한 HA 구의 형성을 나타낸다. HA의 성장은 새로운 나노/마이크로 구조의 섬유 멤브레인을 생성했다(도 4a ~ e). HA 구의 크기 분포는 HA 구가 1.5 ~ 6.5 μm 범위 직경을 가지며, 약 4 μm의 평균 직경을 가짐을 나타낸다.
도 5a-b는 SEM 이미징으로 촬영한 단일 HA 구의 측면 및 정면도를 나타낸다. 도 5c는 나노섬유 축을 중심으로 성장한 단일 HA 구의 TEM 이미지를 나타낸다. 또한, 도 5d에 나타낸 TEM-SAED는 HA 결정에 해당되는 002, 211 및 222 plane에 표시된 전자 회절 고리를 나타낸다. 도 5(e)에 표시된 HA 구의 SEM-EDS 미세분석은 HA의 이론적 화학양론적 비율 1.67에 매우 근접한 Ca(61.57)/P(38.43)의 원자 비율 1.60의 Ca 및 P 원자 신호를 감지하였다.
실험예 2. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인의 화학 구조적 특성
PCL/GEL-NBG 멤브레인의 XRD는 반결정질 PCL의 특징적인 XRD 피크(110 및 200 plane으로 표시됨)를 나타낸 반면(도 6a), GEL과 NBG는 XRD 피크를 나타내지 않아 비정질 특성을 나타낸다. 실제, NBG는 비정질 구조를 가지고 있으며 2θ = 23° 부근에서 넓은 비정질 할로를 나타낸다. 또한 비정질 GEL은 GEL 거대분자의 코일 형태와 관련하여 2θ = 20° 부근에서 넓은 할로를 보인다. 그러나 PCL/GEL-NBG 멤브레인의 XRD에서는 NBG와 GEL의 비정질 할로는 PCL 피크가 20°~25°의 2θ 범위에 존재하기 때문에 관찰할 수 없었다. 한편, PCL/GEL-HAs 멤브레인의 XRD는 HA 결정상에 기인하는 002, 211, 202, 130, 222, 213 및 004 plane에 표시된 강한 XRD 피크의 변화를 나타냈다. PCL 피크는 여전히 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 XRD에 나타나며 이는 PCL이 반결정 구조를 유지하고 있음을 나타냈다.
PCL, GEL, NBG 및 HA의 특징적인 구조 그룹은 ATR-FTIR 분석에 의해 확인되었다(도 6). PCL, GEL, 실리케이트, 포스페이트 및 카보네이트의 FT-IR 밴드는 도 6b의 스펙트럼에 해당된다. PCL의 특징적인 밴드는 1166 cm-1에서 C-O-C 대칭 스트레칭 1727 cm-1에서 C=O 스트레칭, 2949 cm-1에서 -CH2 비대칭 스트레칭 및 2868 cm-1에서 CH2 대칭 스트레칭에 해당된다. GEL의 특정적인 밴드는 아미드 A에 대한 3289 cm-1에서 N-H 스트레칭, 아미드 B에 대한 3065 cm-1에서 C-H 스트레칭, 아미드 I에 대한 1645 cm-1에서 C=O 스트레칭, 아미드 II에 대한 1542 cm-1에서 N-H deformation 및 아미드 III에 대한 1241 cm-1에서 N-H deformation을 포함하여 관찰되었다. PCL/GEL-NBG 멤브레인 스펙트럼에서 NBG의 실리케이트 그룹에 속하는 452 및 1043 cm-1에서 Si-O-Si 결합의 특징적인 신축 진동 밴드(stretching vibrational bands)가 관찰되었다. 반면, PCL/GEL-HAs 멤브레인의 스펙트럼은 560 cm-1, 597 cm-1에서 P-O 결합의 굽힘 밴드(bending band)와 1012 cm-1에서 P-O 결합의 강한 신축 밴드를 나타내며 이는 모두 하이드록시아파타이트의 포스페이트 그룹에 해당된다. 또한, 873 cm-1, 1415 cm-1 및 1458 cm-1에서 명확하게 감지할 수 있는 밴드는 카보네이트 그룹으로 간주된다. 이는 형성된 하이드록시아파타이트가 천연 뼈에서 발견되는 아파타이트를 모방하는 카보네이트 조성을 가지고 있음을 나타낸다.
실험예 3. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인의 다공성 및 비표면적
PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 N2 흡착-탈착 등온선 및 BET 플롯은 각각 도 7a 및 b에 나타냈다. N2 흡착 등온선은 메조 다공성 물질이 나타내는 등온선에 속한다. 흡착 등온선의 IUPAC 분류에 따르면, H4 히스테리시스 루프가 있는 유형 IV 등온선은 PCL/GEL-HA 멤브레인에서 메조 기공의 존재를 나타낸다. 0.1 < P/Po < 0.9 영역에서 N2 흡착의 지속적인 증가는 PCL/GEL-HA 멤브레인에 많은 수의 메조 기공이 존재함을 시사한다. 또한 고압에서 등온선이 포화되는 경향이 있는데, 이는 멤브레인이 메조 다공성 범위(2 - 50nm)에서 발생하는 모세관 응축과 관련됨을 나타낸다. 이 메조 다공성은 주로 PCL/GEL-HAs 나노섬유 매트릭스 또는 PCL/GEL-NBG 멤브레인의 NBG에서 HA의 존재 때문에 발생한다. PCL/GEL-NBG 멤브레인의 NLDFT 기공 크기 분포는 평균 기공 크기는 약 4.25 nm인 3.55, 3.95, 4.57, 5.51 및 6 nm에서 메조 기공의 존재를 나타냈고 및 총 기공 부피는 0.016 cc/g이었다(도 7b). 반면, PCL/GEL-HAs 멤브레인은 평균 11.39 nm 기공 크기를 갖는, 5.25(main pore size), 6.82, 8.12, 9.37, 13.54, 16.66, 19.94 nm 기공 크기에서 메조 기공의 존재를 나타내며 0.085cc/g의 전체 기공 부피를 갖는다(도 7c). 도 7d에 표시된 BET 플롯에서 얻은 비표면적(표 1)에서, 흥미롭게도 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 비표면적 31.5 m2/g은 PCL/GEL-NBG 멤브레인의 비표면적 0.98 m2/g에 비해 훨씬 더 높았다. 비표면적의 상당한 차이는 PCL/GEL 나노섬유 매트릭스에 생체모방적으로 성장한 HA 구의 존재에 기인한 것일 수 있다. 실제로, NBG는 약 54 m2/g의 비표면적을 갖는 반면, HA(SBF에 14 일 동안 담근 NBG) 약 63.7 m2/g의 비표면적을 갖는다.
PCL/GEL-NBG와 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 나노섬유 사이의 다공성(나노섬유 내, 사이의 공간에서 유래)와 기공 크기는 표 1에 나타냈다. PCL/GEL-NBG 멤브레인의 다공성은 97 %인 반면, PCL/GEL-HAs 멤브레인은 약 96 %의 다공성을 갖는다. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인의 다공성은 매우 유사하며, 이는 PCL/GEL-NBG의 생체모방 광물화와 HA의 성장이 PCL/GEL-HAs 막의 다공성에 큰 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 그러나 PCL/GEL-NBG 멤브레인의 평균 약 3.41 μm의 기공 크기를 나타내는 기공 크기 측정으로부터 밝혀진 바와 같이 기공 크기는 상대적으로 영향을 받았다. 반면, PCL/GEL-HAs 멤브레인은 평균 기공 크기는 약 2.75 μm이다(표 1). 이러한 기공 크기 감소는 고배율에서 볼 수 있는 PCL/GEL 나노섬유 매트릭스에서 HA 구의 성장에 기인한 것일 수 있다. SEM 이미지는 도 4e에 나타냈다.
멤브레인 | SSA(m2/g) | 다공성(%) | 평균 기공 크기(μm) | 접촉각(degree) | 단백질 흡착(μg/mg) |
PCL/GEL-NBG | 0.98 | 97.34 | 3.41 ±1.57 | 22.10±1.70 | 13.60±3.90 |
PCL/GEL-HAs | 31.50 | 96.49 | 2.75±1.83 | 10.75±3.0 | 157.40±7.30 |
실험예 4. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인의 표면 친수성 및 가수/열 분해
표면 친수성은 생분해성과 빠른 세포 부착에 중요한 매개변수이다. 멤브레인의 표면에 접촉하는 물방울의 사진과 해당 물 접촉각은 도 8a ~ e에 나타냈다. PCL/GEL-HAs 멤브레인은 PCL, PCL/GEL 및 PCL/GEL-NBG 멤브레인에 비해 더 나은 표면 습윤도를 나타냈으며, 이는 도 8a ~ e에 그래프로 표시된 물 접촉각과 함께 물방울의 퍼짐으로부터 확인할 수 있다. PCL/GEL-HAs 멤브레인의 물 접촉각은 약 10.75°± 3°인 반면, PCL, PCL/GEL 및 PCL/GEL-NBG 멤브레인의 접촉각은 약 91.3° ± 4.2°, 26.4° ± 1.1° 및 22.1° ± 1.7°이었다. 이 높은 정도의 친수성은 도 8e에 삽입된 SEM 이미지에서 볼 수 있는 PCL/GEL-HA 멤브레인의 표면 지형 및 미세 구조에 기인할 수 있다.
비분해성 멤브레인은 이를 제거하기 위해 2차 수술이 필요하기 때문에 생분해성 치주막은 임상 사용에 매력적이다. 따라서 치주막의 생분해성은 중요한 특성이다. PCL/GEL-HAs 멤브레인의 시험관 내 생분해성은 질량 손실 측정을 통해 측정되었다(도 8f). PCL/GEL-HAs 멤브레인은 4 주 동안 37 %의 총 질량 손실을 나타냈다. 첫 주에 약 16 %가 감소한 다음 3 주 동안 약 21 %가 감소하였다. 손실은 첫 주 이후 시간이 지남에 따라 거의 선형적으로 증가했다. 도 8f의 삽입도는 하루에 약 1.27 ± 0.14 %의 감소율을 나타낸다.
PCL-GEL 및 PCL/GEL-HA의 열분해 거동은 TGA 분석에 의해 조사되었다(도 8g). 25 ~ 120 ℃ 범위에서 발생한 점진적 질량 손실은 물 분자의 증발에 기인한 것이다. 이 범위에서 질량 손실은 PCL/GEL-HA의 경우 약 4.5 %이고 PCL/GEL의 경우 약 7.5 %이다. 250 ℃ ~ 400 ℃ 범위에서 관찰된 빠른 질량 손실은 600 ℃ 미만에서 완전히 분해되어 0 % 질량 잔류물을 남기는 PCL/GEL의 열분해와 관련이 있지만, PCL/GEL-HAs 멤브레인은 500 ℃ 이상에서 600 ℃ 사이에서 질량 잔류물로 약 28.3 %에서 질량 손실이 더 이상 나타나지 않았다. 이 잔류 질량은 PCL/GEL-HA 복합 멤브레인에서 HA의 비율에 대응된다.
실험예 5. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인의 인장 기계적 특성
멤브레인의 인장 기계적 특성은 도 9a ~ d에 그래프로 표시하였으며, 표 2에 요약하였다. 막의 응력-변형률 곡선(도 9a)은 변형률 < 0.025(도 9a의 삽입) 내에서 탄성 영역을 나타내고 멤브레인의 기계적 파손에 도달할 때까지 소성 변형 안정기(plastic deformation plateau)를 나타낸다. 인장 강도(도 9b), 탄성 계수(도 9c) 및 연신율(도 9d)은 응력-변형률 곡선에서 결정되었다. 인장강도는 PCL/GEL(0.44 MPa) > PCL/GEL-HAs(0.24 MPa) > PCL/GEL-NBG(0.17 MPa) 순이었다. 또한, PCL/GEL-HAs 멤브레인은 탄성 계수 16.86 MPa로 PCL-GEL의 탄성계수 1.67 MPa 및 PCL/GEL-NBG의 탄성계수 10.73 MPa에 비해 더 높았다. PCL/GEL-HAs 멤브레인의 기계적 강성의 이러한 향상은 섬유질 매트릭스에 HA 구의 존재에 기인한다. 그러나 PCL/GEL-HA의 연신율(~15.3 %)은 PCL/GEL((~76.1 %) 및 PCL/GEL-NBG(~22.2 %)에 비해 더 낮았다(표 2).
멤브레인 | 인장강도(MPa) | 탄성 계수(MPa) | 연신율(%) |
PCL/GEL | 0.44 ±0036 | 1.67 ± 0.36 | 76.1 ± 9.0 |
PCL/GEL-NBG | 0.17 ± 0.032 | 10.73 ± 1.1 | 22.5 ± 2.5 |
PCL/GEL-Has | 0.24 ± 0.012 | 16.86 ± 1.7 | 15.3 ± 1.5 |
실험예 5. PCL/GEL-HA 멤브레인의 생활성 이온 분비
세포는 세포외 이온 농도를 감지할 수 있으므로 생활성 이온은 조직 재생 동안 주요 치료 및 세포 자극 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 칼슘 이온은 칼슘 감지 수용체(CaSR)의 조절을 통해 골유도 촉진제 역할을 하며, 뼈 미세 환경에서 조골 기능을 조절하는 데 핵심적인 역할을 한다. 포스페이트(PO4 3-) 이온은 뼈 조직 형성과 성장에 큰 영향을 미친다. 실제로 포스페이트 이온은 IGF-1 및 ERK1/2 경로를 통한 조골세포 계열과 함께 조골세포의 분화 및 성장을 조절하고 BMP의 발현을 증가시킨다. 또한 용해성 실리케이트 이온(SiO4 4-)은 조골세포 유사 세포에서 I형 콜라겐의 발현과 골형성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 또한 용해성 실리케이트 이온은 골수 기질 세포의 분화와 증식을 향상시키고 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 실리케이트 이온은 혈관 내피 성장인자와 같은 혈관신생 성장인자의 분비를 자극하는 것 및 HIF-1α와 같은 저산소증 관련 인자의 활성을 조절하여 혈관신생을 유도할 수 있다. 따라서 실리케이트 이온은 골형성과 혈관신생도 자극할 수 있다.
본 발명에서 Tris-buffer에 담그는 동안 PCL/GEL-HAs 멤브레인에서 Ca2+, PO4 3-, SiO4 4-를 포함한 용해성 생활성 이온의 방출 및 농도를 확인하였다(도 10 및 표 4). Ca2+, PO4 3-, SiO4 4- 이온의 방출은 첫 주(첫 번째 단계)에 빠른 초기 방출을 나타내는 유사한 방출 프로파일을 보였다. 그 후 Ca2+, PO4 3-, SiO4 4- 이온은 3 주에 걸쳐 점진적이고 지속적인 방출을 보였다(두 번째 단계). Ca2+, PO4 3-, SiO4 4- 이온의 2단계 방출 프로파일이 선형성에 잘 맞는 것으로 밝혀졌다(도 10b, c). 첫 번째 단계에서 SiO4 4- , Ca2+ 및 PO4 3- 이온의 방출 속도(R1)는 각각 약 6.32 ± 1.27 ppm/day(R2 = 0.930), 3.12 ± 0.66 ppm/day(R2 = 0.920) 및 0.311 ± 1.61 ppm (R2 = 0.931)이었다. 반면 두 번째 단계에서 SiO4 4-, Ca2+ 및 PO4 3- 이온의 방출 속도(R2)는 각각 약 0.6 ± 0.13 ppm/day(R2 = 0.959), 0.58 ± 0.07 ppm/day(R2 = 0.990) 및 0.53 ± 0.09 ppm/day (R2 = 0.968) 이었다(표 4).
방출 속도 | Ca2+(ppm/day) | PO4 3-(ppm/day) | SiO4 4- (ppm/day) | Cyt c(μg/hour) |
R1 | 3.12 ± 0.66 | 1.61 ± 0.31 | 6.32 ± 1.27 | 20.58 ±1.94 |
R2 | 0.58 ± 0.07 | 0.53 ± 0.09 | 0.6 ± 0.13 | 1.69 ± 0.14 |
4 주 동안 PCL/GEL-HAs 멤브레인은 상당한 양의 Ca2+ (~ 37.9 ± 1.66 ppm), PO4 3- (~ 24.7 ± 1.9 ppm) 및 SiO4 4- (~ 61.9 ± 2.34 ppm)를 방출하였다. 흥미롭게도, Ca2+ 및 PO4 3- 이온은 방출을 시간의 제곱근(SQRT)(Ca2+: R2 = 0.985 및 PO4 3- : R2 = 0.997)에 대해 플롯할 때 거의 선형 방출 패턴을 보인 반면, SiO4 4- 이온 방출은 도 10d에 표시된 바와 같이 선형성(R2 = 0.934)에서 어느 정도 벗어나 있었다. 이는 Ca2+ 와 PO4 3- 이온의 방출이 큰 제곱근 시간 의존성을 나타내 이는 확산 제어된 방출 메커니즘을 나타낸다. 그러나, SiO4 4- 이온의 방출은 어느 정도 제곱근 시간 의존성을 보여주었고(R2 = 0.934), 이는 확산 제어된 방출 메커니즘(diffusion controlled release mechanism )의 존재를 나타낼 수 있다. 결정계수 R2는 실험 데이터에 대한 적합도를 나타낸다.
실험예 5. PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HA 멤브레인의 단백질 흡착/방출 능력
세포가 부착되기 전에 체액으로부터의 단백질이 이식된 생체 재료의 표면에 흡착된다. 이러한 단백질 흡착은 세포 거동과 조직-임플란트 경계면의 특성을 결정한다. 또한, 치료 단백질(ex. 골 형태 형성 단백질, BMP) 및 성장 인자(ex. 기본 섬유아세포 성장 인자, bFGF)의 흡착 및 전달 능력은 골 재생을 가속화하기 위한 중요한 필요 사항이다. 본 발명에서 단백질 흡착능 및 단백질 전달능을 입증하기 위해 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)로 알려진 섬유아세포 성장인자 2(FGF-2)와 분자량 및 등전점이 유사한 단백질인 시토크롬 c(Cyto c)를 모델 단백질로 사용하였다. Cyto c는 ~12 kDa의 분자량과 ~2.6 nm × 3.2 nm × 3.3 nm(~3.1 nm 직경)의 분자 크기를 갖는 작은 구형 단백질이다. 모델 단백질로 Cyto c를 선택하는 것은 넓은 pH 범위(pH 3 ~ pH 12)에서 매우 안정적인 구조를 가져 합리적이다.
PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인에 대한 Cyto c 세포 흡착은 도 11(a)에 나타냈다. Cyto c 흡착은 < 2 mg/ml 농도 범위에서 Cyto c 농도가 증가함에 따라 거의 선형으로 증가했다. 반면, 2 mg/ml를 초과하는 경우, 흡착은 조금씩 증가하였다. 참고로, PCL/GEL-NBG 멤브레인의 Cyto c 흡착(13.60 ± 3.90 μg/mg)에 비해 PCL/GEL-HAs 멤브레인은 훨씬 더 많은 양의 Cyto c을 흡착(157.40 ± 7.30 μg/mg)했다. 이러한 높은 단백질 흡착 친화력은 표 1에 나열된 PCL/GEL-NBG의 비표면적(0.98 m2/g)에 비해 HA의 존재에 기인하는 PCL/GEL-HA 멤브레인의 더 높은 비표면적(31.50 m2/g)에 기인할 수 있다. 또한, Cyto c는 등전점이 pI > 9(pI = 10.2)인 염기성 단백질이며 이는 Cyto c가 중성 pH에서 양전하를 띤다는 것을 의미한다. 반면에 HA(HA는 a-plane(Ca-rich)과 c-plane(P-rich)의 두 가지 결정면을 가짐)의 c-crystal plane 표면에 존재하는 PO4 3- 및 OH 그룹은 Cyto c의 아미노 그룹(각 Cyto c 분자에는 30 개의 하전 가능한 아미노산 잔기가 있음)과 HA 결정의 음으로 하전된 부위 사이의 정전기적 상호작용을 통한 단백질 흡착을 용이하게 한다. c-plane은 리소자임 및 시토크롬 c 와 같은 염기성 단백질을 흡착하는 경향이 있는 것으로 알려져 있다.
PCL/GEL-NBG 및 PCL/GEL-HAs 멤브레인에서 Cyto c의 방출은 도 11(b)에 표시하였다. Cyto c의 매우 빠른 방출은 PCL/GEL-NBG 멤브레인에서 관찰되었으며 단 24 시간 이내에 97 %가 방출되었다. 이 큰 파열 방출은 Cyto c의 매우 약한 흡착과 관련된다. 반면, 동일한 기간 내에 PCL/GEL-HAs 멤브레인에 대해 50 %의 Cyto c 방출이 관찰된 것은 Cyto c의 보다 안정적인 흡착을 나타낸다. 따라서 PCL/GEL-Has 멤브레인은 14 일 동안 Cyto c의 방출을 유지했으며, 방출 테스트 종료 시 93 %가 방출되었다. PCL/GEL-HAs 멤브레인에서 Cyto c의 방출은 도 11(b)와 같이 초기 폭발 방출로 이루어지는 2 단계 방출 프로필을 나타낸다. 이 2단계 방출 동역학은 성장 인자 방출에 일반적이다. 첫 번째 단계는 도 11(c)와 같이 비교적 빠른 선형 방출 속도, R1 = 20.58 ± 1.94 μg/h(R2 = 0.983)가 얻어지는 0차 방출로 설명할 수 있다. 이 빠른 방출 단계는 아마도 약하게 결합된 Cyto c 분자의 빠른 확산과 관련이 있을 것이다. 두 번째 단계에서 Cyto c 방출은 느리고 14 일 동안 높게 지속되는 선형 방출을 나타냈다. 흥미롭게도, 이러한 방출은 도 11(c)에 표시된 것처럼 방출 속도 R2 = 1.69 ± 0.14μg/h(R2 = 0.973)를 갖는 0차 방출 동역학에 잘 맞는 것일 수 있다. 이러한 0차 방출 동역학은 불용성 매트릭스로부터의 방출을 설명한다. 실제로, 예를 들어 0차 방출 동역학(즉, 방출 속도는 방출 기간 동안 일정함)을 갖는 성장 인자. 단백질 및 약물과 같은 치료제의 전달은 선호된다. 실제로, 일정한 용량으로 지속 가능한 방식으로 전달되는 치료제는 최고의 치료 효능을 제공할 수 있다.
Claims (21)
- 생활성 유리 나노입자(BGn, bioactive glass nanoparticle)가 함유된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤(PCL, poly(ε-caprolactone)) 및 젤라틴 용액에 생활성 유리 나노입자를 혼합하여 전기방사하여 제조된 것인 생분해성 다기능 나노섬유 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF, simulated body fluid) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것인 나노섬유 복합체,
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 골 재생 유도 기능을 갖는 것인 나노섬유 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리카프로락톤, 젤라틴 및 생활성 유리 나노입자의 중량비는 1 : 1 : 2 ~ 5 인 것인 나노섬유 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체의 평균 직경은 0.5 ~ 1μm 인 것인 나노섬유 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 2 ~ 8 nm의 크기의 기공을 가지는 것인 나노섬유 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 비표면적이 0,5 ~ 1.5 m2/g인 것인 나노섬유 복합체.
- 제1항의 나노섬유 복합체를 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 용액에 침지시켜 형성된 하이드록시아파타이트를 함유하는 폴리카프로락톤 및 젤라틴 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 탄성계수가 7 ~ 13 MPA인 것인 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 4 ~ 21 nm의 크기의 기공을 가지는 것인 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 비표면적이 20 ~ 40 m2/g인 것인 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 물접촉각이 5 ~ 15°인 것인 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체에 형성된 하이드록시아파타이트 구의 직경이 1 ~ 7 μm인 것인 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 탄성계수가 13 ~ 19 MPA인 것인 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 나노섬유 복합체는 기공에 단백질을 적재한 것인 나노섬유 복합체.
- 제8항에 있어서, 상기 단백질은 골형성 단백질, 성장인자 또는 이의 조합인 것인 나노섬유 복합체.
- 다음의 단계를 포함하는 제1항의 나노섬유 제조 방법:
(a) 생활성 유리 나노입자를 폴리카프로락톤 및 젤라틴 용액과 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 (a)의 결과물을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계. - 제17항에 있어서, 상기 (a) 단계의 용액은 용매가 디클로로메탄, 트리플루오로에탄올, 클로로포름, 사염화탄소, 벤젠, 톨루엔, 시클로헥사논, 2-니트로프로판 또는 이들로부터 선택되는 2종 이상의 혼합용매인 것인 나노셤유 제조 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 전기방사는 0.5 ~ 1.5 ml/h의 주입속도, 주사기 바늘과 수집기간 거리 12 ~ 16 cm, 회전 드럼의 200 ~ 240 rpm 속도 또는 이들의 조합인 조건에서 수행된 것인 나노섬유 제조 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 제8항의 나노섬유 복합체 제조 방법:
(a) 생활성 유리 나노입자를 폴리카프로락톤 및 젤라틴 용액과 혼합하는 단계;
(b) 상기 (a)의 혼합 용액을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계; 및
(c) 상기 (b)의 섬유를 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 용액에 침지시켜 형성된 나노섬유를 수집하는 단계. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 나노섬유 복합체를 함유하는 골재생 유도 멤브레인용 조성물.
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KR1020210132156A KR20230050487A (ko) | 2021-10-06 | 2021-10-06 | 다기능 나노섬유 복합체 및 이의 제조 방법 |
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KR100762928B1 (ko) | 2004-10-29 | 2007-10-04 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 견 피브로인 나노섬유로 이루어진 부직포 형태의 골조직유도 재생용 차폐막 및 그 제조방법 |
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2021
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