KR20230050062A - Method of manufacturing sample for electron microscopy to observe myelination structure according to cell culture - Google Patents
Method of manufacturing sample for electron microscopy to observe myelination structure according to cell culture Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230050062A KR20230050062A KR1020210133312A KR20210133312A KR20230050062A KR 20230050062 A KR20230050062 A KR 20230050062A KR 1020210133312 A KR1020210133312 A KR 1020210133312A KR 20210133312 A KR20210133312 A KR 20210133312A KR 20230050062 A KR20230050062 A KR 20230050062A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sample
- mold
- myelination
- cover
- myelin
- Prior art date
Links
- 230000023105 myelination Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 title description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 48
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 12
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 claims description 41
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 claims description 41
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 claims description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 8
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 12
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229920004439 Aclar® Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 239000005023 polychlorotrifluoroethylene (PCTFE) polymer Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게 설명하면 생체외 세포배양에 따른 수초의 단면 구조를 전자현미경으로 보다 용이하게 관찰할 수 있도록 하는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a sample for an electron microscope for observing myelin structure according to cell culture, and more specifically, a cell that allows a cross-sectional structure of myelin according to in vitro cell culture to be more easily observed with an electron microscope. It relates to a method for preparing a sample for an electron microscope for observing myelination structure according to culture.
포매(embedding)는 생체조직 또는 세포를 얇게 자를 수 있도록 하기 위해 특수한 매질을 침투시켜 단단하게 굳히는 과정 전반을 의미하는 것으로, 생체조직 또는 세포를 전자현미경으로 관찰하기 위한 샘플을 제조하기 위해 널리 사용된다.Embedding refers to the entire process of infiltrating and solidifying a special medium in order to cut biological tissues or cells into thin slices, and is widely used to prepare samples for observing biological tissues or cells with an electron microscope. .
생체 조직을 포매하여 전자현미경으로 관찰하는 과정은 단순하나, 세포를 배양한 것을 포매하여 전자현미경으로 관찰하는 과정은 비교적 번거로운 측면이 있다.The process of embedding biological tissue and observing it under an electron microscope is simple, but the process of embedding cultured cells and observing it under an electron microscope is relatively cumbersome.
세포를 포매하는 방법은 두 가지가 있다.There are two methods for embedding cells.
첫 번째는 세포를 배양한 그릇에서 세포를 모두 떼어내 모아와서 원심분리를 통해 하나의 덩어리(pellet)로 만들어 포매하는 방법이고, 두 번째는 세포를 배양한 형태 그대로 포매하는 방법이다. 두 번째 방법은 한 층으로 얇게 자랐던 세포를 포매한다고 하여 흔히 단층 포매(monolayer embedding), 평면 포매(flat embedding) 등으로도 불린다. The first method is to remove all the cells from the bowl in which the cells were cultured, collect them, and form a pellet through centrifugation to embed them. The second method is to embed the cells as they are in the form of culture. The second method is commonly referred to as monolayer embedding or flat embedding because it embeds cells that have grown thinly in one layer.
예를 들어, 배근 신경절(dorsal root ganglion; DRG)을 배양하여 수초를 관찰하고자 할 때 해당 미세구조를 그대로 유지해야 하므로 두 번째 방법을 채택하여야 한다. For example, when culturing dorsal root ganglion (DRG) and observing myelin sheath, the second method should be adopted because the microstructure must be maintained as it is.
이처럼 형태를 그대로 유지할 필요가 있는 실험도 많이 있으며, 이를 위해 위해 단층 포매 방법을 제안하는 문헌들이 공개된 바 있다.There are many experiments that need to keep the shape as it is, and for this purpose, literatures suggesting a monolayer embedding method have been published.
그러나 선행문헌들은 대부분 세포를 배양한 그릇을 바닥에 두고 위에서 내려다 보는 방향을 관찰하는데 특화되어 있으며, 그릇을 옆에서 바라보는 방향, 즉 단면(cross section)을 관찰하기 위해서는 이미 포매가 완료된 블록을 절단하고 방향을 다시 맞춰 주어야 하거나, 별도의 장비가 필요하다는 한계가 있다.However, most of the preceding literatures are specialized in observing the direction of looking down from the top with the bowl in which the cells were cultured on the floor, and in order to observe the direction of looking at the bowl from the side, that is, cross section (cross section), the block that has already been embedded is cut There is a limitation that the direction must be re-aligned or separate equipment is required.
또한, 선행문헌들은 대부분 하나의 세포 또는 이에 준하는 특정한 좁은 영역을 추적하는 방법을 제시하므로, 세포배양에 따른 수초화 구조 등과 같이 보다 넓은 영역을 추적하여 관찰하고자 하는 경우에는 적용하기 어렵다는 한계가 있다.In addition, since most of the prior literature suggests a method for tracking a single cell or a specific narrow area corresponding thereto, it is difficult to apply when tracking and observing a wider area, such as a myelination structure according to cell culture.
이와 같이 본 발명에 따르면, 생체외 세포배양에 따른 수초의 단면 구조를 전자현미경으로 보다 용이하게 관찰할 수 있도록 하는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.Thus, according to the present invention, it is to provide a sample preparation method for an electron microscope for observing myelin structure according to cell culture, which allows the cross-sectional structure of myelin according to cell culture in vitro to be more easily observed with an electron microscope.
이러한 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 실시예에 따르면 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법에 있어서, 커버 상에 세포를 배양하여 수초화를 유도하는 단계; 수초화가 유도된 샘플에서 수초를 염색하고 포매를 수행하는 단계; 염색에 의해 확인된 수초 위치를 상기 커버 상에 마킹하는 단계; 제1 몰드를 사용하여 상기 샘플을 제1 경화시켜 레진 블록을 형성하는 단계; 상기 레진 블록으로부터 상기 커버를 제거하는 단계; 및 제 2 몰드를 사용하여 커버가 제거된 레진 블록을 제2 경화시켜 최종 샘플을 제조하는 단계를 포함한다.According to an embodiment of the present invention to achieve this technical problem, in the method for preparing a sample for an electron microscope for observing myelination structure according to cell culture, inducing myelination by culturing cells on a cover; staining myelin in the sample in which myelination is induced and performing embedding; marking the location of the myelin sheath identified by staining on the cover; forming a resin block by first curing the sample using a first mold; removing the cover from the resin block; and second curing the resin block from which the cover is removed using a second mold to prepare a final sample.
상기 포매를 수행하는 단계는, 상기 샘플을 안정화시키는 고정 단계; 안정화된 샘플에 대해 전자현미경 관찰을 위해 전자 밀도를 높여주는 후고정 단계; 후고정된 샘플을 증류수로 세척하는 세척 단계; 세척 후 수분을 제거하는 탈수 단계; 유도된 수초를 지질 염료를 이용하여 염색하는 염색 단계; 염색 완료된 샘플에 함유된 수분을 제거하는 탈수 단계; 및 수분이 제거된 샘플 내에 포매 매질이 침투하여 샘플을 경화시키는 침투 단계를 포함할 수 있다.The embedding may include a fixation step of stabilizing the sample; A post-fixation step of increasing the electron density of the stabilized sample for electron microscope observation; A washing step of washing the post-fixed sample with distilled water; A dehydration step of removing moisture after washing; A staining step of staining the induced myelin sheath using a lipid dye; A dehydration step of removing moisture contained in the dyed sample; and an infiltration step of hardening the sample by infiltrating the embedding medium into the sample from which moisture has been removed.
상기 커버 상에 마킹하는 단계는, 상기 세포를 기준점으로 삼고 염색된 수초가 다른 영역에 비해 상대적으로 많이 관찰되는 수초 영역을 선정한 후, 상기 수초 영역에서 추가로 연장된 영역의 커버 상에 적어도 하나의 마킹을 남길 수 있다.In the step of marking on the cover, after selecting a myelin area in which a relatively large amount of stained myelin is observed compared to other areas using the cell as a reference point, at least one layer is applied on the cover of an area additionally extended from the myelin area. You can leave a mark.
상기 샘플을 제1 경화시켜 레진 블록을 형성하는 단계는, 상기 제1 몰드 내부에 액체 상태의 레진을 채우고 상기 제1 몰드 상에 상기 샘플의 세포층이 상기 제1 몰드 내부를 향하도록 얹어준 후 열을 가하여 상기 레진 블록을 형성할 수 있다. 이 경우, 상기 세포가 상기 제1 몰드의 길이 방향의 일 단 측에 위치하고, 상기 세포와 상기 적어도 하나의 마킹 사이를 연결하는 가상의 선이 상기 제1 몰드의 길이 방향의 양 측면 사이에서 상기 양 측면과 평행을 이루도록 상기 몰드 상에 위치시킬 수 있다.In the step of first curing the sample to form a resin block, the liquid state resin is filled in the first mold, and the cell layer of the sample is placed on the first mold so that the cell layer faces the inside of the first mold, and then heat The resin block may be formed by adding. In this case, the cells are located on one end side of the first mold in the longitudinal direction, and a virtual line connecting the cells and the at least one marking is between both sides of the first mold in the longitudinal direction. It can be placed on the mold so as to be parallel to the side.
상기 제1 몰드 및 제2 몰드의 형상은 동일하고, 상기 제1 몰드의 깊이는 상기 제2 몰드의 깊이에 비해 얕을 수 있다.The first mold and the second mold may have the same shape, and a depth of the first mold may be shallower than a depth of the second mold.
상기 제2 경화시켜 최종 샘플을 제조하는 단계는, 상기 커버가 제거된 레진 블록의 샘플 면이 상부에 오도록 한 상태로 상기 제 2 몰드 내에 삽입하고, 상기 제2 몰드 내에서 상기 레진 블록 위의 남은 공간에 액체 상태의 레진을 채우고 열을 가하여 상기 샘플 면이 레진에 의해 덮인 최종 샘플을 제조할 수 있다.In the step of preparing a final sample by performing the second curing, the resin block from which the cover is removed is inserted into the second mold with the sample surface facing up, and the resin block remaining on the resin block is inserted into the second mold. A liquid resin is filled in the space and heat is applied to prepare a final sample in which the surface of the sample is covered by the resin.
이와 같이 본 발명에 따르면, 별도의 장비나 시약 등을 사용하지 않고도 간단한 지질 염색을 통해 관찰 대상이 되는 수초의 위치를 표지할 수 있다. 또한, 2 단계의 레진 경화를 통해 세포배양에 따른 수초화 구조를 레진 블록 내부에 완전히 포함되도록 하여 단면 절단이 보다 용이해지고, 샘플 면을 보호할 수 있다.As described above, according to the present invention, the position of the myelin to be observed can be marked through simple lipid staining without using separate equipment or reagents. In addition, through the two-step resin curing, the myelination structure according to cell culture is completely included in the resin block, so that cross-section cutting is easier and the sample surface can be protected.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2 내지 도 8은 도 1에 도시된 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법의 각 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 샘플을 절단하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 종래 기술과 본 발명에 따라 제조된 샘플을 전자현미경으로 관찰한 결과를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 샘플을 전자현미경으로 관찰한 결과를 보다 구체적으로 나타낸 도면이다.1 is a flowchart illustrating a method for preparing a sample for electron microscopy for observing myelination structure according to cell culture according to an embodiment of the present invention.
2 to 8 are diagrams for explaining each step of the sample preparation method for an electron microscope for observing myelination structure according to cell culture shown in FIG. 1 .
9 is a view for explaining a method of cutting a sample manufactured according to an embodiment of the present invention.
10 is a view showing a comparison of the results of observing samples prepared according to the prior art and the present invention with an electron microscope.
11 is a view showing the results obtained by observing samples prepared according to the present invention with an electron microscope in more detail.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이 과정에서 도면에 도시된 선들의 두께나 구성요소의 크기 등은 설명의 명료성과 편의상 과장되게 도시되어 있을 수 있다. Hereinafter, preferred embodiments according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In this process, the thickness of lines or the size of components shown in the drawings may be exaggerated for clarity and convenience of explanation.
또한 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.In addition, terms to be described later are terms defined in consideration of functions in the present invention, which may vary according to the intention or custom of a user or operator. Therefore, definitions of these terms will have to be made based on the content throughout this specification.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법을 나타내는 흐름도이고, 도 2 내지 도 8은 도 1에 도시된 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법의 각 단계를 설명하기 위한 도면이다.1 is a flow chart showing a sample preparation method for an electron microscope for observing myelination structure according to cell culture according to an embodiment of the present invention, and FIGS. 2 to 8 show the observation of myelination structure according to cell culture shown in FIG. It is a drawing for explaining each step of the sample preparation method for an electron microscope.
도 1 내지 도 8을 참조하면, 우선 커버 상에 세포를 배양하여 수초화를 유도한다(S10). 본 발명의 실시예에서는 DRG를 배양하여 수초화를 유도하는 경우를 예로 들어 설명한다. 배양 후에 바닥면을 그대로 분리할 필요가 있으므로, 일반적으로 세포를 배양하는 그릇 상에 바로 키우는 것이 아니라, 도 2의 (a)에 도시된 바와 같이 포매에 사용 가능한 커버(예를 들어, TMX 커버슬립 또는 Aclar 필름 등) 상에 DRG를 배양할 수 있다. 도 2의 (b)는 DRG 배양에 따라 수초화가 일어난 부분을 현미경으로 관찰한 사진으로, 수초화가 일어난 부분(빨간색 화살표로 표시)은 다른 곳에 비해 어둡게 보여서 검은 선과 같이 나타나게 된다.1 to 8, first, cells are cultured on the cover to induce myelination (S10). In an embodiment of the present invention, a case in which myelination is induced by culturing DRG will be described as an example. Since it is necessary to separate the bottom surface as it is after culture, generally, instead of directly growing cells on a dish, as shown in (a) of FIG. 2, a cover usable for embedding (eg, TMX coverslip) Alternatively, DRG can be cultured on Aclar film, etc.). Figure 2 (b) is a photograph of the part where myelination occurred according to the DRG culture observed under a microscope.
이후, 수초화가 유도된 샘플에서 수초를 염색하고 포매를 수행한다(S20). 세포배양에 따라 유도된 수초는 포매 전에는 일반적인 도립현미경으로 관찰이 가능하나, 포매가 완료되면 도립현미경을 통해 수초의 위치를 확인하기 어렵게 된다. 따라서, 본 발명의 실시예에서는 수초를 염색할 수 있는 지질 염료(예를 들어, 수단 블랙 등)를 이용하여 수초를 염색하고 포매를 수행하게 된다. Thereafter, myelin is stained and embedded in the sample in which myelination is induced (S20). The myelin induced by cell culture can be observed with a general inverted microscope before embedding, but it becomes difficult to confirm the location of the myelin through an inverted microscope after embedding is completed. Therefore, in the embodiment of the present invention, the myelin is dyed using a lipid dye capable of dyeing the myelin (eg, Sudan Black, etc.) and embedding is performed.
본 발명의 실시예에 따르면, 다음과 같은 과정에 따라 수초를 염색하고 포매를 수행한다.According to an embodiment of the present invention, the myelin is dyed and embedding is performed according to the following process.
1) 고정: 샘플을 안정화시키는 단계로, 일종의 방부 처리에 해당함1) Fixation: This is a step of stabilizing the sample, which corresponds to a kind of preservative treatment.
2) 후고정: 전자현미경 관찰을 위한 처리 단계로, 전자 밀도를 높여줌2) Post-fixation: As a processing step for electron microscope observation, it increases the electron density
3) 세척: 증류수를 이용하여 복수회(예를 들어, 3회) 세척함3) Washing: Washing multiple times (eg, 3 times) using distilled water
4) 탈수: 세척 후 수분을 제거하는 단계로, 휘발성 용매(예를 들어, 70% 에탄올)를 이용하여 기 설정 시간(예를 들어, 30분) 동안 탈수4) Dehydration: In the step of removing moisture after washing, dehydration for a predetermined time (eg, 30 minutes) using a volatile solvent (eg, 70% ethanol)
5) 염색: 수단 블랙을 이용하여 수초 염색5) Dyeing: Myelin dyeing using Sudan Black
6) 탈수: 염색 완료된 샘플에 함유된 수분을 제거하는 단계로, 휘발성 용매를 이용하여 기 설정 시간 동안 탈수6) Dehydration: This step removes the moisture contained in the dyed sample, and dehydration is performed for a predetermined time using a volatile solvent.
7) 침투: 샘플 내에 포매 매질이 침투하는 단계로, 샘플을 경화시킴7) Infiltration: A step in which the embedding medium penetrates into the sample, and the sample is cured
도 3의 (a)는 지질 염료에 의해 수초가 염색된 모습을 현미경으로 관찰한 사진으로 수초가 염색된 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 3의 (b)는 포매 과정의 마지막 단계의 샘플 모습을 현미경으로 관찰한 사진으로 지질 염료에 의한 수초 염색이 남아 있어서 포매가 완료된 후에도 수초의 위치를 확인 가능함을 알 수 있다.Figure 3 (a) is a photograph of the myelin stained by the lipid dye under a microscope, and it can be seen that the myelin is stained. In addition, (b) of FIG. 3 is a photograph of the sample at the final stage of the embedding process under a microscope, and it can be seen that the myelin staining by the lipid dye remains, so that the position of the myelin can be confirmed even after the embedding is completed.
이후, 포매가 완료된 샘플에서 염색에 의해 확인된 수초 위치를 서버 상에 마킹한다(S30). 도 3의 (a)는 포매가 완료된 샘플을 현미경으로 관찰한 사진으로, DRG를 배양하여 수초화를 유도하는 경우 DRG를 중심으로 수초가 사방으로 뻗어나가는 형상을 관찰할 수 있다. 따라서, 검은 색으로 나타난 DRG를 기준점으로 삼고 검은색으로 염색되어 뻗어 나가는 수초가 다른 영역에 비해 상대적으로 많이 관찰되는 수초 영역을 선정한 후, 해당 수초 영역에서 추가로 연장된 영역(즉, 수초 영역을 기준으로 한 경우 DRG의 반대측)의 커버 상에 예를 들어 나이프 등을 이용하여 적어도 하나의 마킹(파란색 점으로 표시)을 남길 수 있다. 도 3의 (b)는 커버 상에 수초 위치를 마킹(knife mark)한 일 실시예를 보여주는 사진으로, 이와 같이 DRG를 중심으로 수초가 연장되는 방향으로 2 이상의 마킹을 남길 수 있다. 마킹의 깊이 및 크기는 육안으로 관찰 가능한 정도로만 형성되면 된다. Thereafter, the position of the myelin sheath identified by staining in the embedding-completed sample is marked on the server (S30). (a) of FIG. 3 is a photograph of a sample after embedding was observed under a microscope. When myelination is induced by culturing DRG, it can be observed that myelin extends in all directions around the DRG. Therefore, taking the DRG shown in black as a reference point, selecting a myelin area in which relatively more myelin is observed compared to other areas stained black, and then the area additionally extended from the corresponding myelin area (ie, the myelin area In the case of reference, at least one marking (indicated by a blue dot) may be left on the cover on the opposite side of the DRG using, for example, a knife. 3(b) is a photograph showing an embodiment in which the myelin position is marked on the cover (knife mark), and thus, two or more markings may be left in the direction in which the myelin extends around the DRG. The depth and size of the marking need only be formed to the extent that it can be observed with the naked eye.
이후, 제1 몰드를 사용하여 샘플을 제1 경화시켜 레진 블록을 형성한다(S40). 제1 경화에서는 도 5의 (a)에 도시된 바와 같이 일반적으로 사용되는 몰드(Full-deep)에 비해 깊이가 얕은 몰드(Half-deep)를 사용할 수 있다. 이 경우, 도 5의 (b)에 도시된 바와 같이 제1 몰드 내부에 액체 상태의 레진(노란색)을 가득 채우고 그 위에 샘플을 뒤집어서(즉, 샘플의 세포층이 제1 몰드 내부를 향하도록) 얹어준다. 이 경우, S30 단계에서 남겨둔 마킹을 따라서 샘플을 제1 몰드 상에 위치시킬 수 있다. 구체적으로, 도 6에 도시된 바와 같이, DRG(검은색 점)와 적어도 하나의 마킹(빨간색 점) 사이를 연결하는 가상의 선(초록색 선)을 그리는 경우, DRG가 제1 몰드의 길이 방향의 일 단 측에 위치하고 가상의 선이 제1 몰드의 길이 방향의 양 측면(검은색 선)의 사이에서 양 측면과 평행을 이루도록 샘플을 제1 몰드 상에 위치시킬 수 있다. 이와 같이 샘플을 제1 몰드 상에 위치시킨 후 열을 가해서 굳히면 레진 블록이 형성된다.Thereafter, the sample is first cured using a first mold to form a resin block (S40). In the first curing, as shown in (a) of FIG. 5 , a mold (half-deep) shallower than a generally used mold (full-deep) may be used. In this case, as shown in (b) of FIG. 5, the inside of the first mold is filled with liquid resin (yellow), and the sample is turned upside down (ie, the cell layer of the sample faces the inside of the first mold) and placed on top of the liquid resin (yellow). give. In this case, the sample may be placed on the first mold along the markings left in step S30. Specifically, as shown in FIG. 6, when drawing a virtual line (green line) connecting the DRG (black dot) and at least one marking (red dot), the DRG is the length direction of the first mold. The sample may be placed on one side of the first mold so that an imaginary line is parallel to both sides (black lines) of the first mold in the longitudinal direction. In this way, when the sample is placed on the first mold and hardened by applying heat, a resin block is formed.
이후, 형성된 레진 블록으로부터 커버를 제거한다(S50). 본 발명의 실시예에 따라 커버로 TMX 커버슬립을 사용한 경우 이를 액체 질소(LN2)에 침지시켜 커버를 제거할 수 있고, 커버로 Aclar 필름을 사용한 경우 추가적인 처리 없이 손쉽게 제거 가능하다. 도 7의 (a)는 액체 상태인 레진에 열을 가해서 굳힌 레진 블록을 보여주는 사진으로 레진 블록에 커버가 붙어 있는 상태임을 확인할 수 있다. 이와 같은 상태의 레진 블록으로부터 커버를 제거하면 도 7의 (b)에 도시된 바와 같이 커버 상에서 배양된 세포와 배양에 의해 유도된 수초화 구조가 레진 블록으로 전사된 것을 확인할 수 있다. 이 경우, 커버 상에서 몰드 내의 레진과 접촉하지 않는 나머지 부분은 버려지게 된다. 본 발명의 실시예에 따르면, 수초 염색(S20)과 수초 위치 마킹(S30)을 통해서 수초가 비교적 많이 관찰되는 수초 영역을 미리 표시해 둠으로써 관찰 대상이 되는 수초 영역을 특정하여 레진 블록으로 만들 수 있게 된다. Thereafter, the cover is removed from the formed resin block (S50). According to an embodiment of the present invention, when a TMX coverslip is used as a cover, the cover can be removed by immersing it in liquid nitrogen (LN2), and when an Aclar film is used as a cover, it can be easily removed without additional treatment. 7(a) is a photograph showing a resin block hardened by applying heat to a resin in a liquid state, and it can be confirmed that the cover is attached to the resin block. When the cover is removed from the resin block in this state, it can be confirmed that the cells cultured on the cover and the myelination structure induced by the culture are transferred to the resin block, as shown in (b) of FIG. 7 . In this case, the remaining portion on the cover not in contact with the resin in the mold is discarded. According to the embodiment of the present invention, the myelin area where relatively many myelin are observed is marked in advance through myelin dyeing (S20) and myelin location marking (S30), so that the myelin area to be observed can be specified and made into a resin block do.
이후, 제2 몰드를 사용하여 커버가 제거된 레진 블록을 제2 경화시켜 최종 샘플을 제조한다(S60). 제2 경화에서는 도 8의 (a)에 도시된 바와 같이 일반적으로 사용되는 몰드(Full-deep)를 사용할 수 있다. 즉, 제1 몰드 및 제2 몰드는 형상은 동일하고 깊이만 서로 다른 몰드이다(제1 몰드가 제2 몰드에 비해 깊이가 얕음). 이 경우, 커버가 제거된 레진 블록의 샘플 면이 상부에 오도록 한 상태로 제2 몰드 내부에 딱 맞도록 삽입하면 제2 몰드 내에 레진 블록 위로 공간이 남게 된다. 이에 따라, 제2 몰드 내의 남는 공간에 액체 상태의 레진을 채우고 열을 가하면, 도 8의 (c)에 도시된 바와 같이 외부로 드러나 있던 샘플 면이 레진에 의해 덮이게 되어 세포면이 레진 블록 내부에 완전히 포함된 형태의 최종 샘플을 제조할 수 있다.Thereafter, a final sample is prepared by second curing the resin block from which the cover is removed using a second mold (S60). In the second curing, as shown in (a) of FIG. 8, a generally used mold (full-deep) may be used. That is, the first mold and the second mold are molds having the same shape but different depths (the first mold has a shallower depth than the second mold). In this case, if the sample side of the resin block from which the cover has been removed is placed on top, the resin block is inserted into the second mold so as to fit snugly, leaving a space above the resin block in the second mold. Accordingly, when liquid resin is filled in the remaining space in the second mold and heat is applied, the surface of the sample exposed to the outside is covered with the resin, as shown in FIG. It is possible to prepare a final sample in the form of being completely included in the
도 1 내지 도 8을 참조하여 상술한 바에 따라 제조된 샘플은 관찰 대상이 되는 수초 영역을 정확하게 특정하여 포함할 수 있으며, 세포배양에 따른 수초화 구조가 레진 블록 내부에 완전히 포함되도록 하여 단면 절단이 보다 용이해지고, 샘플 면을 보호할 수 있다.The sample prepared as described above with reference to FIGS. 1 to 8 can accurately specify and include the myelin region to be observed, and the myelin structure according to cell culture is completely included inside the resin block, so that cross-section cutting is more efficient. It is easy, and the sample surface can be protected.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 샘플을 절단하는 방법을 설명하기 위한 도면으로, 상술한 방법에 따라 제조된 레진 블록(1)은 도 9에 도시된 바와 같이 측면으로 눕혀서 홀더에 고정한 후 절단할 수 있으며, 이에 따라 블록의 단면을 전자현미경으로 관찰하여 세포배양에 따른 수초화 구조를 관찰할 수 있다.9 is a view for explaining a method of cutting a sample manufactured according to an embodiment of the present invention. The
도 10은 종래 기술과 본 발명에 따라 제조된 샘플을 전자현미경으로 관찰한 결과를 비교하여 나타낸 도면으로, (a)는 종래 기술에 따라 세포를 하나의 덩어리로 만들어 포매한 경우의 블록의 형태 및 전자현미경 사진을 나타내고, (b)는 종래의 단층 포매 방법에 따라 포매한 경우의 블록의 형태 및 전자현미경 사진을 나타내며, (c)는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 블록의 형태 및 전자현미경 사진을 나타낸다. Figure 10 is a view showing the comparison of the results of observing the sample prepared according to the prior art and the present invention with an electron microscope, (a) is the shape of a block when cells are made into a lump and embedded according to the prior art Shows an electron microscope picture, (b) shows the shape and electron microscope picture of the block when embedded according to the conventional monolayer embedding method, (c) shows the shape and electron microscope picture of the block manufactured according to the embodiment of the present invention show a picture
도 10을 참조하면, 종래 기술에 따라 제조된 블록을 관찰한 경우와는 달리, 본 발명에 따르면 세포배양에 따른 수초화 구조를 관찰할 수 있음을 알 수 있다.Referring to FIG. 10, it can be seen that, unlike the case of observing blocks manufactured according to the prior art, according to the present invention, the myelination structure according to cell culture can be observed.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 샘플을 전자현미경으로 관찰한 결과를 보다 구체적으로 나타낸 도면이다.11 is a view showing the results obtained by observing samples prepared according to the present invention with an electron microscope in more detail.
도 11의 (a)에 도시된 바와 같이, 세포층 바닥이었던 부분, 즉 커버와 닿아 있던 부분은 배양액과 접하는 세포층 위쪽이었던 부분에 비해 일직선으로 나타나므로 상부 및 하부를 쉽게 구별할 수 있으며, 얇은 세포층이 샘플을 따라 길게 이어져 있으며 이를 따라가면 세포층 위쪽에서 수초화가 일어난 축삭을 관찰할 수 있다. 여기서, 수초는 미세구조가 여러 겹으로 겹쳐 있는 구조이므로 저배율에서는 눈에 띄게 검은 색으로 보인다.As shown in (a) of FIG. 11, the part that was the bottom of the cell layer, that is, the part that was in contact with the cover, appeared in a straight line compared to the part that was the upper part of the cell layer in contact with the culture medium, so it was easy to distinguish the upper and lower parts, and the thin cell layer It runs along the sample, and if you follow it, you can observe myelinated axons at the top of the cell layer. Here, since the myelin has a multi-layered microstructure, it looks conspicuously black at low magnification.
도 11의 (b)에 도시된 바와 같이, 이를 확대해서 살펴보면, 내부의 축삭과 이를 둘러싼 수초 구조를 자세히 관찰할 수 있다. 즉, 수초는 여러 겹의 얇은 층상 구조로 나타나며, 각각의 층을 뚜렷하게 구분하여 관찰할 수 있다.As shown in (b) of FIG. 11, when looking at it enlarged, it is possible to observe the axon inside and the myelin structure surrounding it in detail. That is, myelin appears as a thin layered structure of several layers, and each layer can be clearly distinguished and observed.
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 하여 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 아래의 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.Although the present invention has been described with reference to the embodiments shown in the drawings, this is only exemplary, and those skilled in the art will understand that various modifications and equivalent other embodiments are possible therefrom. will be. Therefore, the true technical protection scope of the present invention should be determined by the technical spirit of the claims below.
Claims (7)
수초화가 유도된 샘플에서 수초를 염색하고 포매를 수행하는 단계;
염색에 의해 확인된 수초 위치를 상기 커버 상에 마킹하는 단계;
제1 몰드를 사용하여 상기 샘플을 제1 경화시켜 레진 블록을 형성하는 단계;
상기 레진 블록으로부터 상기 커버를 제거하는 단계; 및
제 2 몰드를 사용하여 커버가 제거된 레진 블록을 제2 경화시켜 최종 샘플을 제조하는 단계를 포함하는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법.Inducing myelination by culturing cells on the cover;
staining myelin in the sample in which myelination is induced and performing embedding;
marking the location of the myelin sheath identified by staining on the cover;
forming a resin block by first curing the sample using a first mold;
removing the cover from the resin block; and
A method for preparing a sample for an electron microscope for observing a myelination structure according to cell culture, comprising preparing a final sample by second curing the resin block from which the cover is removed using a second mold.
상기 포매를 수행하는 단계는,
상기 샘플을 안정화시키는 고정 단계;
안정화된 샘플에 대해 전자현미경 관찰을 위해 전자 밀도를 높여주는 후고정 단계;
후고정된 샘플을 증류수로 세척하는 세척 단계;
세척 후 수분을 제거하는 탈수 단계;
유도된 수초를 지질 염료를 이용하여 염색하는 염색 단계;
염색 완료된 샘플에 함유된 수분을 제거하는 탈수 단계; 및
수분이 제거된 샘플 내에 포매 매질이 침투하여 샘플을 경화시키는 침투 단계를 포함하는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법.According to claim 1,
The step of performing the embedding,
a fixation step to stabilize the sample;
A post-fixation step of increasing the electron density of the stabilized sample for electron microscope observation;
A washing step of washing the post-fixed sample with distilled water;
A dehydration step of removing moisture after washing;
A staining step of staining the induced myelin sheath using a lipid dye;
A dehydration step of removing moisture contained in the dyed sample; and
A sample preparation method for an electron microscope for observing a myelination structure according to cell culture, comprising an infiltration step of infiltrating a moisture-removed sample with an embedding medium to harden the sample.
상기 커버 상에 마킹하는 단계는,
상기 세포를 기준점으로 삼고 염색된 수초가 다른 영역에 비해 상대적으로 많이 관찰되는 수초 영역을 선정한 후, 상기 수초 영역에서 추가로 연장된 영역의 커버 상에 적어도 하나의 마킹을 남기는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법.According to claim 1,
The step of marking on the cover is,
After selecting the myelin area in which a relatively large number of stained myelin is observed compared to other areas using the cell as a reference point, the myelination structure according to cell culture leaving at least one marking on the cover of the area additionally extended from the myelin area. A method for preparing a sample for an electron microscope for observation.
상기 샘플을 제1 경화시켜 레진 블록을 형성하는 단계는,
상기 제1 몰드 내부에 액체 상태의 레진을 채우고 상기 제1 몰드 상에 상기 샘플의 세포층이 상기 제1 몰드 내부를 향하도록 얹어준 후 열을 가하여 상기 레진 블록을 형성하는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법.According to claim 3,
Forming a resin block by first curing the sample,
After filling the inside of the first mold with a liquid resin, placing the cell layer of the sample on the first mold so that the cell layer faces the inside of the first mold, and then applying heat to form the resin block Observation of myelination structure according to cell culture A method for preparing a sample for an electron microscope for
상기 세포가 상기 제1 몰드의 길이 방향의 일 단 측에 위치하고, 상기 세포와 상기 적어도 하나의 마킹 사이를 연결하는 가상의 선이 상기 제1 몰드의 길이 방향의 양 측면 사이에서 상기 양 측면과 평행을 이루도록 상기 몰드 상에 위치시키는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법.According to claim 4,
The cells are located at one end side of the first mold in the longitudinal direction, and an imaginary line connecting between the cells and the at least one marking is parallel to both sides between both sides of the first mold in the longitudinal direction. A sample preparation method for an electron microscope for observing a myelination structure according to cell culture placed on the mold to form a.
상기 제1 몰드 및 제2 몰드의 형상은 동일하고, 상기 제1 몰드의 깊이는 상기 제2 몰드의 깊이에 비해 얕은 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법.According to claim 1,
The first mold and the second mold have the same shape, and the depth of the first mold is shallower than the depth of the second mold.
상기 제2 경화시켜 최종 샘플을 제조하는 단계는,
상기 커버가 제거된 레진 블록의 샘플 면이 상부에 오도록 한 상태로 상기 제 2 몰드 내에 삽입하고, 상기 제2 몰드 내에서 상기 레진 블록 위의 남은 공간에 액체 상태의 레진을 채우고 열을 가하여 상기 샘플 면이 레진에 의해 덮인 최종 샘플을 제조하는 세포배양에 따른 수초화 구조 관찰을 위한 전자현미경용 샘플 제조 방법.According to claim 6,
The step of preparing the final sample by curing the second,
The sample surface of the resin block from which the cover was removed is inserted into the second mold with the sample face on top, and liquid resin is filled in the remaining space on the resin block in the second mold and heat is applied to obtain the sample A sample preparation method for an electron microscope for observing a myelination structure according to cell culture to prepare a final sample whose surface is covered with resin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210133312A KR20230050062A (en) | 2021-10-07 | 2021-10-07 | Method of manufacturing sample for electron microscopy to observe myelination structure according to cell culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210133312A KR20230050062A (en) | 2021-10-07 | 2021-10-07 | Method of manufacturing sample for electron microscopy to observe myelination structure according to cell culture |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230050062A true KR20230050062A (en) | 2023-04-14 |
Family
ID=85946527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210133312A KR20230050062A (en) | 2021-10-07 | 2021-10-07 | Method of manufacturing sample for electron microscopy to observe myelination structure according to cell culture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230050062A (en) |
-
2021
- 2021-10-07 KR KR1020210133312A patent/KR20230050062A/en unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Jimenez N, Van Donselaar EG, De Winter DA, Vocking K, Verkleij AJ, Post JA. Gridded Aclar: preparation methods and use for correlative light and electron microscopy of cell monolayers, by TEM and FIB-SEM. J Microsc. 2010 Feb;237(2):208-20. doi: 10.1111/j.1365-2818.2009.03329.x. PMID: 20096051. |
| Steiner M, Schofer C, Mosgoeller W. In situ flat embedding of monolayers and cell relocation in the acrylic resin LR white for comparative light and electron microscopy studies. Histochem J. 1994 Dec;26(12):934-8. PMID: 7896569. |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schenk et al. | From the sap's perspective: The nature of vessel surfaces in angiosperm xylem | |
| CN107576558B (en) | Embedding-free tissue pathology specimen dewatering wax box and use method thereof | |
| JP2018526632A5 (en) | ||
| Heinsen | Serial thick, frozen, gallocyanin stained sections of human centrl nervous system | |
| KR20230050062A (en) | Method of manufacturing sample for electron microscopy to observe myelination structure according to cell culture | |
| CN106482997B (en) | It is a kind of suitable for amphibious, reptiles species bone slice preparation methods | |
| JP2007528484A (en) | Recipient block and manufacturing method thereof | |
| Bjarkam et al. | New strategies for embedding, orientation and sectioning of small brain specimens enable direct correlation to MR-images, brain atlases, or use of unbiased stereology | |
| ATE317973T1 (en) | METHOD FOR PRODUCING BLOCKS OF MATERIAL WITH A VARIETY OF SAMPLES TO BE EXAMINED | |
| CN109312300B (en) | Spherical tissue microarray and preparation method thereof | |
| CN105699145A (en) | Method for preparing transmission electron microscope sample by embedding drosophila melanogaster in agar | |
| CN110108537A (en) | A kind of embedding medium and embedding method for biological tissue embedding | |
| CN114577608A (en) | Test device and method for researching mechanical properties of root-unsaturated soil interface | |
| Egeberg | Sandwich embedding of monolayers of cells in epoxy resin for ultrathin sectioning | |
| US11946840B2 (en) | Assembly for use with biological sample material | |
| Wang et al. | A simple and economical method for the manual construction of well-aligned tissue arrays | |
| DE102013003522A1 (en) | Container for receiving tissue material sample of biopsy of e.g. human body for subsequent pathological examination of sample, has compartments with walls, filing substances, identification carriers and material samples cuttable as unit | |
| CN107271248B (en) | A kind of multiple groups sample tissue is total to embedding method | |
| Wheeler et al. | Treatment of the Abydos reliefs: consolidation and cleaning | |
| CN103698190A (en) | Dip dyeing method for preparation of concrete microanalysis sample under normal temperature and pressure | |
| JP7468242B2 (en) | Method for impregnating a sample with resin, method for preparing a sample, and method for analyzing a sample | |
| Chevalier et al. | Plastic embedding of Arabidopsis stem sections | |
| US20220387996A1 (en) | New multi-functional fluidic device for clamping biopsies | |
| Lonsdale et al. | Microwave Polymerization in Thin Layers of London Resin White Allows Selection of Specimens for Immunogold Labeling | |
| CN111238897B (en) | Method and agent for treating biological specimen |