KR20230048435A - 리보톡신 또는 RNAse를 포함하는 재조합 면역독소 - Google Patents

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KR20230048435A
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세바스티앙 메르크스
맥스 아우리
버트런드 매기
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에이티비 테라퓨틱스
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Abstract

본 발명은 결합제-독소 융합 단백질에 관한 것으로,
·항체
·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
·항체 모방체,
로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 결합제,
리보톡신 또는 -프로톡신, 및 선택적으로, a) 및 b), 및/또는 프로톡신에 포함된 절단가능한 도메인을 연결하는 펩타이드 링커(도 1)를 포함한다.

Description

리보톡신 또는 RNAse를 포함하는 재조합 면역독소
본원은 바인더 독소 융합 단백질의 분야에 관한 것이다.
표적 결합제와 독소를 결합한 접합체는 40년 전에 개발되었으며 현재 암과 싸울 수 있는 주요 희망이다. 이들 접합체는 주로 링커를 통해 화학적 세포독성제에 화학적으로 접합된 단클론 항체로 구성된 항체-약물-접합체(ADC) 부류로 대표된다. 이 약물은 암세포를 표적으로 삼는 단일 클론 항체의 특이성과 페이로드의 높은 독성 효능을 결합하여 건강한 조직을 보존하면서 표적 세포를 죽인다.
다양한 종양 유형에 대해 더 나은 치료 옵션을 제공하기 위해 새로운 그러한 엔티티(entity)가 여전히 필요하다.
따라서 본 발명의 하나의 목적은 이러한 새로운 엔티티를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 환자를 위한 대안적 또는 심지어 더 나은 치료 옵션을 제공하는 것이다.
이들 및 추가의 목적들은 본 발명의 독립적인 청구범위에 따른 방법 및 수단에 부합한다. 종속 청구항은 특정 실시예와 관련된다.
본 발명의 개념 및 축소 실시에 사용된 방법론은 PCT 출원 PCT/EP2020/054263에 개시되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 거기에 개시된 정의들 및 실시예들은 본 개시내용의 일부를 형성한다. 명확성을 위해, PCT 출원 PCT/EP2020/054263의 텍스트가 본 출원에 첨부되고 본 출원의 일부를 구성한다.
본 발명에 따르면 리보톡신 또는 RNAse를 포함하는 재조합 면역독소가 제공된다.
본 발명이 상세히 설명되기 전에, 본 발명은 이러한 장치 및 방법으로서 설명된 방법의 설명 또는 공정 단계들의 특정 구성 부분에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및/또는 복수 지시 대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다. 또한, 숫자 값으로 구분되는 파라미터 범위가 주어지는 경우, 범위는 이러한 제한 값을 포함하는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본 명세서에 개시된 실시예들은 서로 관련되지 않는 개별 실시예로서 이해되는 것을 의미하지 않는다. 일 실시예와 논의된 특징들은 여기에 도시된 다른 실시예와 관련해서도 개시되는 것을 의미한다. 만약, 하나의 경우에, 특정 특징이 하나의 실시예와 함께 개시되지 않고, 다른 실시예와 함께 개시되는 경우, 통상의 기술자는 상기 특징이 상기 다른 실시예와 함께 개시되는 것을 의미하지 않는다는 것을 반드시 의미하지는 않는다는 것을 이해할 것이다. 통상의 기술자는 다른 실시예에 대해서도 상기 특징을 개시하는 것이 본 출원의 요지이지만, 단지 명확성을 목적으로 하고 사양을 관리 가능한 볼륨으로 유지하기 위해 이것이 수행되지 않았다는 것을 이해할 것이다.
또한, 본 명세서에 언급된 종래 기술 문헌의 내용은 참조로 포함된다. 이는 특히 표준 또는 일상적인 방법을 개시하는 선행 기술 문서를 지칭한다. 이 경우, 참조에 의한 통합은 주로 충분한 개시를 가능하게 하고, 긴 반복을 피하기 위한 목적을 갖는다.
본 발명의 실시예는 특허청구범위에 나타내었다.
일 구현예에 따르면, 아니소플린 또는 이의 활성 단편을 포함하는 결합제-독소 융합 단백질이 제공된다. 바람직하게는, 결합제-독소 융합 단백질은 서열번호 48 또는 49에 따른 독소 서열, 또는 서열번호 48 또는 49와 66% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 동족체를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 아니소플린 동족체 또는 이의 활성 단편을 포함하는 결합제-독소 융합 단백질이 제공된다. 바람직하게는, 결합제-독소 융합 단백질은 서열번호 51, 52 또는 53에 따른 독소 서열, 또는 서열번호 51, 52 또는 53과 적어도 66% 서열 동일성을 갖는 이의 동족체를 포함한다.
아니소플린은 곤충병원성 곰팡이 Metarhizium anisopliae에 의해 자연적으로 생성되는 곰팡이 리보톡신이다. M. anisopliae는 1800 년대 후반에 밀 곡물 딱정벌레의 생물학적 방제를 위해 처음 사용되었다. 그 이후로 이 곰팡이를 기반으로 한 생물 농약이 크게 진화했다. 최근에, M. anisopliae는 또한 살충제에 대한 내성의 출현이 질병을 통제하려는 노력을 방해함에 따라 Anopheles gambiae 모기와 같은 성인 말라리아 매개체의 방제를 위한 상호 추정 및 유망한 대안이 되었다.
아니소플린은 지금까지 항 종양 치료의 맥락에서 설명되지 않았으며 결합제 독소 융합 단백질의 독소 성분으로도 설명되지 않았다. 본 발명자들은 먼저 이러한 맥락에서 아니소플린의 잠재력을 탐구하였고, 놀랍게도 독소가 이들 용도에 적합하도록 만드는 우수한 특성을 갖는다는 것을 발견하였다.
몇몇 구체예에서, 독소 서열은 ≥ 67%; ≥ 68 %; ≥ 69 %; ≥ 70 %; ≥ 71 %; ≥ 72 %; ≥ 73 %; ≥ 74 %; ≥ 75 %; ≥ 76 %; ≥ 77 %; ≥ 78 %; ≥ 79 %; ≥ 80 %; ≥ 81 %; ≥ 82 %; ≥ 83 %; ≥ 84 %; ≥ 85 %; ≥ 86 %; ≥ 87 %; ≥ 88 %; ≥ 89 %; ≥ 90 %; ≥ 91 %; ≥ 92 %; ≥ 93 %; ≥ 94 %; ≥ 95 %; ≥ 96 %; ≥ 97 %; ≥ 98 %; ≥ 99% 의 서열 동일성을 갖고, 가장 바람직하게는 서열번호 48 또는 49를 갖는 100%이다.
일 구현예에 따르면, 상기 단백질 결합제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
·항체
·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
·항체 모방체.
일 구현예에 따르면, 결합제-독소 융합 단백질은 독소에 포함된 결합제, 또는 그의 도메인을 독소와, 또는 절단가능한 도메인과 연결하는 펩타이드 링커를 포함한다.
상기 바인더 독소 융합 단백질의 여러 구체예에 따르면
·펩타이드 링커 또는 절단가능한 도메인은 포유동물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 포유동물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 특이적(specifically) 또는 비특이적으로 절단가능하다. 및/또는
·펩타이드 링커 또는 절단가능한 도메인은 식물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 식물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 절단가능하지 않다, 및/또는
·결합제-독소 융합 단백질은 형질감염된 식물 세포 또는 형질감염된 전체 식물에서 발현된다.
숙련된 사람은 프로톡신의 펩타이드 링커 또는 절단 가능한 도메인이 식물 세포에 의해 발현되는 효소에 의해 절단되지 않는 조건, 또는 식물 숙주에 의해 생성되는 효소가 충족되는지 여부를 확인하기 위해 많은 일상적인 방법을 가지고 있다. 예를 들어, Wilbers et al (2016) 참조한다. 또한, 통상의 기술자는 펩타이드 링커 또는 절단가능한 도메인이 포유동물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 포유동물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 특이적으로 또는 비특이적으로 절단가능한지 여부를 통상적인 방법으로 확인할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단백질 결합제는 인간 CD20 또는 인간 CD79B에 결합한다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 결합제-독소 융합 단백질은 적어도 다음을 포함한다:
a) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 단백질 결합제
·항체
·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
·항체 모방체,
b) RNAse, 리보톡신 또는 각각의 프로톡신, 및
c) 임의로, 펩타이드 링커는 결합제, 또는 이의 도메인을, 독소와, 또는 프로톡신에 포함된 절단가능한 도메인과 결합한다.
일 양태에 따르면, 이러한 결합제-독소 융합 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 포맷을 포함한다.
·(scFv-FC)-(링커)-독소 (이량체)
·2 개의 HC와 2 개의 LC- (링커) - 독소의 사량체
·2 개의 LC 및 2 개의 HC- (링커) - 독소의 사량체, 또는
·2 개의 LC- (링커) - 독소 및 2 개의 HC- (링커) - 독소의 사량체
상기 링커는 선택적이다.
도 1은 선택가능한 결합제-독소 융합 단백질 포맷을 나타낸다.
CH3 = 중쇄 불변 도메인 3
CH2 = 중쇄 불변 도메인 2
VL = 경쇄 가변 도메인
VH = 중쇄 가변 도메인
FC = 항체 FC 도메인
LC = 경쇄
HC = 중쇄
추가 측면에 따르면,
·펩타이드 링커 또는 프로톡신 내의 절단가능한 도메인은 포유동물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 포유동물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 특이적 또는 비특이적으로 절단가능하다. 및/또는
·프로톡신 내의 펩타이드 링커 또는 절단가능한 도메인은 식물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 식물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 절단가능하지 않다.
한 측면에 따르면, 이러한 결합제-독소 융합 단백질은 형질감염된 식물 세포 또는 형질감염된 전체 식물에서 발현된다.
일 양태에 따르면, 이러한 결합제에서 단백질 결합제-독소 융합 단백질은 인간 CD20 또는 인간 CD79B에 결합한다.
CD79b (B 세포 항원 수용체 복합체 관련 단백질 β쇄)는 체액성 면역 반응에 관여하는 표면 단백질이다. CD79b는 B 세포에 의해 생성된다. 그것은 CD79a에 결합하고 이황화 다리에 의해 연결된다. 이 이종 이량체 중 두 개는 mIgM 또는 mIgD 아형의 막 결합 항체에 결합하여 항원이 결합하는 B 세포 수용체 (BCR)를 형성한다. CD79b는 CD79a의 인산화를 향상시킨다. 항원 결합 후, 항원-항체 BCR은 엔도사이토화된다. CD79b는 글리코실화된다. 그것은 BCR의 활성화 후 단백질 키나제 Syk 또는 Lyn에 의해 결합하고 인산화되는 세포 내 ITAM 모티프를 가지고 있다.
CD79bhas의 전체 서열은 Hashimoto et al. Immunogenetics에 의해 처음으로 공개되었다. 1994;40(2):145-149. CD79B에 대한 단백질 결합제는 당업계에 기재되어 있다. CD79b에 대한 최초의 항체(마우스)는 SN8이라고 불리며, 문헌 Okazaki et al., Blood, 81:84-94(1993)에 의해 공개되었다. 폴슨 외, 블러드. 2007;110(2):616-623은 CD79b에 대한 항체 약물 접합체(ADC) 또는 재조합 면역독소를 만들 가능성에 대해 논의했다. 최초의 인간화 항 CD79b 항체 (폴라투주맙)는 US8545850에 개시되어 있다. 이 특허에서는 폴라투주맙에 연결된 MMAE로 구성된 ADC도 개시되어 있다.
B-림프구 항원 CD20 또는 pro-B 단계에서 시작하는 모든 B 세포의 표면 상에서 발현된다. 인간에서 CD20은 MS4A1 유전자에 의해 암호화된다. 단백질에는 알려진 천연 리간드가 없으며 그 기능은 특히 T 비의존성 항원에 대한 최적의 B 세포 면역 반응을 가능하게 하는 것이다. 세포막에서 칼슘 채널 역할을 하는 것으로 의심된다. CD20은 CXCR4/SDF1(CXCL12) 케모카인 신호전달에 의한 미환경적 상호작용의 맥락에서 유도되며, CD20의 분자 기능은 이러한 맥락에서 B 세포 수용체(BCR)의 신호전달 성향과 관련이 있다.
CD20은 모든 B 세포 림프종, 백혈병 및 B 세포 매개 자가면역 질환의 치료에 모두 활성제인 단클론 항체 리툭시맙, 오렐리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙 및 우블리툭시맙의 표적이다. 이들 항체는 그의 서열을 포함하여 선행 문헌에 잘 기재되어 있으며, 본 발명의 명세서에 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "리보톡신"은 진균에 의해 분비되는 세포외 리보뉴클레아제 (RNases)의 그룹에 관한 것이다. 그들의 가장 주목할만한 특징은 그들의 특별한 특이성이다. 그들은 보편적으로 보존된 서열에서 발견되는 rRNA의 단일 포스 포디 에스테르 결합을 절단하여 리보솜을 비활성화한다. 이 절단은 세포 사멸에 의한 세포 사멸로 이어진다. 그러나 세포 외 단백질이기 때문에 먼저 세포 독성 작용을 발휘하기 위해 표적을 구성하는 세포에 들어가야한다. 이 항목은 해당 작업의 속도 결정 단계를 구성한다.
알려진 모든 리보톡신은 130-150 개의 아미노산으로 구성된 단백질로, 정렬된 2 차 구조의 적어도 두 가지 다른 요소, 즉 활성 중심이 있는 β 시트와 짧은 α 나선을 공유한다. 구조적 배열은 독성이 없는 다른 세포외 진균 RNase의 배열과 매우 유사하며 가장 잘 알려진 대표자가 Aspergillus oryzae의 RNase T1인 패밀리를 구성한다. 이것은 리보 톡신이 그룹의 독성 대표자로 간주되는 이유를 설명한다. 그들의 3 차원 구조의 관찰은 리보 톡신이 무독성 "친척"에서 훨씬 더 짧고 음전하를 띤 정렬되지 않은 양전하를 띤 긴 루프를 존재하기 때문에 독성 측면에서 기능적 차이를 보여준다. 이러한 리보 톡신 결합은 세포로의 진입을 촉진하는 음전하를 띤 산성 인지질과 불 활성화를 유발할 수있는 리보솜 특이적 특징을 모두 인식하는 역할을 한다.
리보톡신은 독성에 관계없이 지금까지 특성화된 모든 세포 외 진균 RNase가 공유하는 일반적인 산-염기 메커니즘에 따라 RNA를 절단한다. GpA와 같은 디 뉴 클레오 사이드를 사용하여 기질의 포스 포디 에스테르 결합 3'-5'의 파손은 반응의 최종 생성물인 상응하는 유도체 3'- 모노 포스페이트가되는 고리형 중간체의 형성을 통해 발생한다는 것이 입증되었다. 그것은 트랜스 인산화 반응이며, 이 순환 중간체의 가수 분해가 뒤따른다. 이러한 이유로 이러한 단백질은 고리형 RNase로 알려져 있다.
다른 구현예들에 따르면, 리보톡신은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 독소, 또는 그의 활성 단편이다.
·사르신
·레스트릭톡신
·아니소플린
·히르수텔린
·클라빈,
·미토길린,
·아게리틴, 및
·기간틴.
리보톡신은 곤충 병원성 및 식용 종을 포함한 다양한 균류에서 검출되었지만 3 차원 구조는 α- 사르신, 레테토신 및 히르수텔린 A (HtA)의 세 가지에서만 해결되었다. Aspergillus giganteus와 Aspergillus restrictus에 의해 각각 생산된 처음 두 개는 거의 동일하다.
한 실시양태에서, 리보톡신은 α- 사르신, 또는 그의 활성 단편이다.
α- 사르신의 상이한 변이체가 존재하며, 그 예는 Uni Prot 식별자 P00655, Q7LVR0, O14446, O13323, O13324, O13322, O13325, A0A0G2DUB2 하에 공개된다. 본 출원의 일부 예가 P00655를 사용하는 반면, 다른 사르신 변이체도 마찬가지로 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 각각의 데이터베이스에서 일상적인 노력으로 이러한 변종을 찾을 수 있다. 사르신의 하나의 예시적인 서열은 서열번호 56에 제시되며, 이는 이의 탈면역화된 변이체를 나타낸다. 서열번호 55는 와일드타입을 나타낸다.
일 구현예에서, 리보톡신은 히르수텔린 A (HtA), 또는 그의 활성 단편이다. 곤충 병원성 곰팡이 Hirsutella thompsonii에 의해 생성된 HtA는 훨씬 작으며 다른 큰 리보 톡신과 25 %의 서열 동일성만 보인다. 그럼에도 불구하고 가족의 모든 기능적 특성을 유지한다. 히르수텔린 A의 상이한 변이체가 존재하며, 그 예는 UniProt 식별자 N4VY63, P78696, A0A0B4HUA1, A0A0B4FSP6, T5AB58, A0A0B4EQU3, E9FCV0, A0A014PJJ6, A0A0B4GG41, L2G0X6, A0A063C0Y4, A0A179FJ94, A0A166WTA3, A1CDH8, I8AC84, A0A364MLV5, A0A4Q7JNA6, Q8NJP2, Q8NJP0, Q8NJP3, Q8NJP1, Q8NJN9, Q8NIC7, E9E2C8 하에 공개된다. 본 출원의 일부 예가 N4VY63을 사용하는 반면, 다른 히르수텔린 A 변이체도 마찬가지로 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 각각의 데이터베이스에서 일상적인 노력으로 이러한 변종을 찾을 수 있다. 히르수텔린 A의 하나의 예시적인 서열은 서열번호 47에 제시되어 있다.
일 구현예에서, 리보톡신은 레스트릭토신(때때로 미토겔린으로도 지칭됨) 또는 이의 활성 단편(UniProt 식별자: P67876)이다. 레스트릭토신의 하나의 예시적인 서열은 서열번호 27에 제시되어 있다.
그 변이체도 마찬가지로 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 각각의 데이터베이스에서 일상적인 노력으로 이러한 변종을 찾을 수 있다.
한 실시양태에서, 리보톡신은 클라빈, 또는 그의 활성 단편이다. 상이한 변이체 클라빈이 존재하며, 그 예는 유니프로트 식별자 P0CL70, P0CL71, E0YUC8, A0A4R8PRX1, A0A4R8T0U3, U4KU86, A0A4R8R208, U4KUQ3 하에 공개된다. 그 변이체도 마찬가지로 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 각각의 데이터베이스에서 일상적인 노력으로 이러한 변종을 찾을 수 있다.
일 구현예에서, 리보톡신은 기간틴, 또는 이의 활성 단편이다 (UniProt 식별자: P87063). 그 변이체도 마찬가지로 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 각각의 데이터베이스에서 일상적인 노력으로 이러한 변종을 찾을 수 있다.
한 실시양태에서, 리보톡신은 아니소플린, 또는 그의 활성 단편 (예를 들어 서열번호 48, 및 서열번호 49의 변형된 변이체 참조)이다. 그것은 곰팡이 Metarhizium anisopliae, 또 다른 곤충 병원체에 의해 생성된다.
본원에 사용된 용어 "RNase"는 RNA의 분해를 더 작은 성분으로 촉매하는 뉴클레아제 그룹 ("리보뉴클레아제")에 관한 것이다. 리보뉴클레아제는 엔도리보뉴클레아제와 엑소리보뉴클레아제로 나눌 수 있으며 EC 2.7(인분해효소용) 및 3.1(가수분해 효소용) 부류 내에서 여러 하위 부류로 구성된다.
본원에 개시된 엔도리보뉴클레아제의 주요 유형은 다음과 같다:
EC 3.1.27.5: RNase A는 연구에서 일반적으로 사용되는 RNase이다. RNase A (예 : 소 췌장 리보뉴클레아제 A : PDB : 2AAS)는 일반적인 실험실 사용에서 가장 단단한 효소 중 하나이다. 이를 분리하는 한 가지 방법은 RNase A 이외의 모든 효소가 변성될 때까지 조세포 추출물을 끓이는 것이다. 단일 가닥 RNA에 특이적이다. 짝을 이루지 않은 C 및 U 잔기의 3'-말단을 절단하여 궁극적으로 2',3'-사이클릭 모노포스페이트 중간체를 통해 3'-인산화된 생성물을 형성한다. 활동에 보조 인자가 필요하지 않다.
EC 3.1.26.4: RNase H는 ssDNA를 생성하기 위해 DNA/RNA 듀플렉스에서 RNA를 절단하는 리보뉴클레아제이다. RNase H는 비특이적 엔도뉴클레아제이며 효소 결합 2가 금속 이온의 도움을 받는 가수분해 메커니즘을 통해 RNA의 절단을 촉매한다. RNase H는 5'-인산화된 생성물을 남긴다.
EC 3.1.26.3: RNase III는 원핵생물의 전사된 폴리시스트로닉 RNA 오페론으로부터 rRNA(16s rRNA 및 23s rRNA)를 절단하는 리보뉴클레아제의 일종이다. 또한 RNase의 이중 가닥 RNA (dsRNA)-Dicer 패밀리를 소화하여 특정 부위에서 pre-miRNA (60-70bp 길이)를 절단하고 전사 및 mRNA 수명 조절에 적극적으로 관여하는 miRNA (22-30bp)로 변형시킨다.
EC 번호 3.1.26: RNase L은 활성화시 세포 내의 모든 RNA를 파괴하는 인터페론 유도 뉴클레아제이다.
EC 3.1.26.5: RNase P는 효소와 같은 방식으로 촉매 역할을 하는 리보 핵산인 리보자임이라는 점에서 독특한 리보뉴클레아제의 일종이다. 그 기능 중 하나는 하나의 가닥 pre-tRNA의 5' 말단에서 리더 서열을 절단하는 것이다. RNase P는 자연에서 알려진 두 가지 다중 턴오버 리보자임 중 하나이다(다른 하나는 리보솜). 박테리아에서 RNase P는 또한 코엔자임과 결합하여 활성 효소 시스템을 형성하고 기질에 대한이 시스템의 특이성을 결정하는 아포엔자임으로 구성된 홀로엔자임의 촉매 활성을 담당한다. 단백질이고 RNA를 포함하지 않는 RNase P의 형태가 최근에 발견되었다.
EC 번호 3.1.: RNase PhyM은 단일 가닥 RNA에 특이적인 서열이다. 짝을 이루지 않은 A 및 U 잔기의 3'-말단을 절단한다.
EC 3.1.27.3: RNase T1은 단일 가닥 RNA에 특이적인 서열이다. 짝을 이루지 않은 G 잔기의 3'-말단을 절단한다.
EC 3.1.27.1: RNase T2는 단일 가닥 RNA에 특이적인 서열이다. 그것은 모든 4 잔기의 3'- 말단을 절단하지만, 우선적으로 As의 3'- 말단을 절단한다.
EC 3.1.27.4: RNase U2는 단일 가닥 RNA에 특이적인 서열이다. 짝을 이루지 않은 A 잔기의 3'-말단을 절단한다.
EC 3.1.27.8: RNase V는 폴리아데닌 및 폴리우리딘 RNA에 특이적이다.
EC 3.1.26.12: RNase E는 박테리아에서 SOS 반응을 조절하는 식물 기원의 리보 뉴 클레아 제로, RecA / LexA 의존성 신호 전달 경로에 의한 SOS 메커니즘의 활성화에 의한 DNA 손상의 스트레스에 대한 반응으로, 세포 분열의 통과 정지 및 DNA 복구의 개시로 이어지는 유전자의 다양성을 전사적으로 억제한다.
EC 3.1.26.-: RNase G 5s rRNA의 16'-말단을 처리하는데 관여한다. 염색체 분리 및 세포 분열과 관련이 있다. 그것은 세포질 축 필라멘트 번들의 구성 요소 중 하나로 간주된다. 또한 이 구조의 형성을 조절할 수 있다고 생각된다.
엑소리보뉴클레아제의 주요 유형
EC 번호 EC 2.7.7.8: 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제(PNPase)는 엑소뉴클레아제 및 뉴클레오티딜트랜스퍼라제로서 기능한다.
EC 번호 EC 2.7.7.56: RNase PH는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제뿐만 아니라 엑소뉴클레아제로서 기능한다.
EC 번호 3.1.??: RNase R은 RNase II의 가까운 상동체이지만, RNase II와 달리 보조 인자의 도움 없이 2차 구조로 RNA를 분해할 수 있다.
EC 번호 EC 3.1.13.5: RNase D는 프리(pre)-tRNA의 3'-to-5' 처리에 관여한다.
EC 번호 3.1.??: RNase T는 많은 안정한 RNA의 3'-to-5' 성숙에 대한 주요 기여자이다.
EC 3.1.13.3: 올리고리보뉴클레아제는 짧은 올리고뉴클레오티드를 모노뉴클레오티드로 분해한다.
EC 3.1. 11.1: 엑소리보뉴클레아제 I은 단일 가닥 RNA를 5'-3'에서 3'으로 분해하며 진핵생물에만 존재한다.
EC 3.1.13.1: 엑소리보뉴클레아제 II는 엑소리보뉴클레아제 I의 밀접한 동족체이다.
일부 구현예에서, RNase는 하기 군으로부터 선택되는 하나이다:
·Onconase: (람피리나제, frog rnase): Onconase의 다른 변종: 존재하며, 그 예는 Uni Prot 식별자 Q8UVX5, Q9I8V8, Q6EUW9, Q6EUW8, Q6EUW7 또는 P22069로 공개된다.
·RNase 1: 췌장 리보뉴클레아제 (예를 들어 RNAse1, 예를 들어 유니프로트 식별자 P07998; 예를 들어 서열번호 57 참조)
·RNase 2: 비분비성 리보뉴클레아제(예: RNAse2, 예: 유니프로트 식별자 P10153)
·RNase 3 : 호산구 양이온성 단백질 (예 : RNAse3 / 드로 샤, 예 : 유니 프로트 식별자 Q9NRR4 또는 P12724)
·RNase 4: 리보뉴클레아제 4 (예: RNAse4, 예: 유니프로트 식별자 P34096)
·RNase 5: 안지오제닌 (예를 들어, RNAse 5, 예를 들어 유니프로트 식별자 P03950), 예를 들어 서열번호 50 참조)
·RNase 6: 리보뉴클레아제 K6/리보뉴클레아제 T2/리보뉴클레아제 K3 (예: RNAse6, 예: 유니프로트 식별자 Q93091)
·RNase 7: 리보뉴클레아제 7/리보뉴클레아제 A E1 (예: RNAse7, 예: 유니프로트 식별자 Q9H1E1)
·RNase 8: 리보뉴클레아제 8 (예: RNAse8, 예: 유니프로트 식별자 Q8TDE3)
위의 Uniprot 식별자는 예시적인 목적으로만 사용된다. 그 변이체도 마찬가지로 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 각각의 데이터베이스에서 일상적인 노력으로 이러한 변종을 찾을 수 있다.
여러 실시양태에서, 펩타이드 링커 또는 프로톡신 내의 절단가능한 도메인은 포유동물 세포에 의해 발현되는 효소에 의해 특이적으로 또는 비특이적으로 절단가능하거나, 포유동물 숙주에 의해 생산되는 효소에 의해 절단가능하거나, 식물 세포에 의해 발현되는 효소에 의해 절단가능하거나, 또는 식물 숙주에 의해 생산되는 효소에 의해 절단가능하다.
한 구체예에서, 결합제-독소 융합 단백질은 식물 숙주 또는 식물 세포에서 생산된다. 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 이것은 식물 숙주에 존재하지 않는 포유동물 효소에 의해 절단가능한 링커를 갖는 작제물을 생성하는 옵션을 제공한다. 이와 같이, 생산 시스템의 자가 중독은 회피되는 반면, 절단가능한 링커는 생체 내에서 독소의 빠른 방출을 허용한다.
한 구체예에서, 결합제-독소 융합 단백질은 포유동물 세포, 예컨대 CHO에서 생산된다.
한 구체예에서, 식물 숙주 또는 식물 세포는 벡터를 코딩하는 벡터에 의해 일시적으로 변형되고, 그 중에서도 특히, 결합제-독소 융합 단백질이다.
한 실시양태에서, 식물 숙주 또는 식물 세포는 벡터를 코딩하는 벡터에 의해 영구적으로 변형되고, 그 중에서도 특히, 결합제-독소 융합 단백질이다.
식물 숙주 또는 플랫 세포에서 결합제-독소 융합 단백질을 일시적 또는 영구적으로 발현하기 위한 방법에 대한 배경 이 WO2020169620에 제공되어 있으며, 그 내용은 활성화 목적을 위해 본원에 포함된다.
한 구체예에서, 식물 숙주 또는 식물 세포는 니코티아나 속으로부터 유래한다. 이러한 맥락에서, 한 실시양태에서, 펩타이드 링커 또는 프로톡신의 절단가능한 도메인은 식물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 식물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 절단가능하지 않다는 것이 다시 언급된다. 이러한 방식으로, 생산된 식물 세포 또는 식물 숙주는 결합제-독소 융합 단백질의 원치 않는 절단으로 인한 자가 중독으로부터 보호된다.
한 실시양태에서, 핵산 작제물이 접촉되는 식물 또는 식물 세포는 엽록체가 아니거나, 또는 조류의 엽록체가 아니며, 특히 클라미도모나스 라인하르드티의 엽록체가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 작제물이 접촉되는 식물 또는 식물 세포 내의 구조는 엽록체가 아니거나, 또는 조류의 엽록체가 아니며, 특히 클라미도모나스 라인하르드티의 엽록체가 아니다.
단백질 결합제가 2개 이상의 쇄를 포함하는 또 다른 구체예에서 2개의 핵산 작제물이 제공될 수 있으며, 제1 단백질 결합제의 제1 쇄, 링커 및 독소를 암호화하는 3개의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 단백질 결합제의 제2 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일시적 및 안정한 발현 모두는 "유도성 촉진제"에 의해 유도될 수 있었다. 이들 프로모터는 내인성 또는 외인성 자극의 존재에 따라 또는 화학적, 환경적, 호르몬 및/또는 발달 신호에 반응하여 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 선택적으로 발현한다. 이들 조절 요소들은 Abdel-Ghany et al(2015)에 의해 검토되고 US 10344290 B2에서 논의된 바와 같이, 제한 없이, 에탄올, 열, 빛, 스트레스, 재스몬, 살리실산, 식물호르몬, 염, 홍수 또는 가뭄에 민감하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 유도성 프로모터는 Ali et al(2019)에서 논의된 합성 성분을 포함하되 이에 국한되지 않으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
니코티아나 속은 담배 식물을 포함한다. 담배 식물 또는 식물 세포는 안정한 링커를 갖는 단백질 독소에 연결된 작은 sFv 단편으로 구성된 재조합 면역요법 결합제-독소 융합 단백질을 생산하기 위해 이미 시험되었다(Francisco et al. (1997), 및 US6140075A.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 상기 식물세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
·니코티아나 타바쿰 cv. BY2,
·니코티아나 타바쿰 NT-1,
·아라비돕시스 탈리아나,
·다우커스 카로타 및/또는
·오리자 사티바.
니코티아나 타바쿰 cv. BY2 일명 담배 BY-2 세포 및 cv. 니코티아나 타바쿰 1 (NT-1, BY-2의 형제)은 적절한 배양 배지와 좋은 배양 조건에서 1 주일 이내에 최대 100 배까지 증식 할 수있는 비녹색의 빠르게 성장하는 식물 세포이다. 이 담배 품종은 세포 배양, 특히 세포 현탁 배양 (액체 배지에서 자라는 세포의 특수 개체군으로 식물 세포의 특정 생물학적 특성을 연구하기 위해 과학자들에 의해 양육됨)으로 유지된다. 세포 현탁 배양에서, 각각의 세포는 독립적으로 또는 기껏해야 배양 배지에서 짧은 사슬로만 부유한다. 각 셀은 다른 셀과 유사한 특성을 가지고 있다.
모델 식물 시스템은 인간 연구를 위한 HeLa 세포와 유사하다. 유기체는 비교적 간단하고 예측 가능하기 때문에 생물학적 과정에 대한 연구가 더 쉬워지고 더 복잡한 유기체를 이해하기 위한 중간 단계가 될 수 있다. 그들은 식물 생리 학자와 분자 생물 학자에 의해 모델 유기체로 사용되며, 상대적으로 높은 균질성과 높은 성장률로 인해 고등 식물의 모델 시스템으로도 사용되며 식물 세포의 일반적인 행동을 특징으로 한다. 자연적으로 자란 식물(생체 내)의 모든 부분 내에서 세포 유형의 다양성은 살아있는 식물 세포의 일반적인 생화학적 현상을 조사하고 이해하는 것을 매우 어렵게 만든다. 예를 들어, 세포 안팎으로 용질을 운반하는 것은 다세포 유기체의 특수 세포가 다르게 행동하기 때문에 연구하기가 어렵다. 담배 BY-2와 같은 세포 현탁 배양은 담배 BY-2 세포가 서로 매우 유사하게 행동하기 때문에 단일 세포 및 그 구획 수준에서 이러한 연구를 위한 우수한 모델 시스템을 제공한다. 현탁액에서 이웃 세포 행동의 영향은 손상되지 않은 식물에서와 같이 중요하지 않다. 결과적으로 자극이 적용된 후 관찰된 모든 변화는 통계적으로 상관될 수 있으며 이러한 변화가 자극에 대한 반응인지 아니면 단순히 우연의 일치인지를 결정할 수 있다. BY-2 및 NT-1 세포는 비교적 잘 이해되고 이종 단백질, 특히 항체의 발현을 포함하여 연구에 자주 사용된다 (Hellwig et al. (2004)). 이러한 방법은 Hkkinen et al. (2018)에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
Torres (1989)는 당근 세포 현탁액 배양 (Daucus carota)을 확립하는 방법에 대해 논의한다. Shaaltiel 등(2007)은 당근 세포 기반 발현 시스템을 이용한 효소 생산에 대해 논의한다. 이들 기사의 내용은 본원에 참조로 포함된다. Daucus carota 및 Oryza sativa는 또한 Santos et al(2016)에서 적합한 식물-세포 기반 발현 시스템으로서 논의되며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다. 니코티아나 타바쿰, 아라비돕시스 탈리아나, 오리자 사티바에서의 재조합 단백질의 생산은 Plasson et al(2009)에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일반적으로, 본 발명은 식물의 세포가 외래 폴리펩티드의 발현에 적합한 DNA 작제물로 형질전환되고 표준 식물 세포 배양 조건 하에서 배양될 수 있는 임의의 식물 품종으로 실시될 수 있다. 식물 세포 현탁액 또는 식물 조직 배양이 바람직하지만, 캘러스 배양 또는 다른 통상적인 식물 세포 배양 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 식물은 니코티아나 벤타미아나이다. 니코티아나 식물에서 항체의 생산은 예를 들어 Daniell et al. (2001)에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 명세서에서 사용될 수 있는 다른 식물 또는 식물 세포는, 상추(Lactuca spp.), 시금치(Spinacia oleracea) 및 아라비돕시스(Arabidopsis spp)이에 제한되는 것은 아니다.
여러 실시양태에서, 절단 부위는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
a) 엔도솜 및/또는 리소좀 프로테아제 절단 부위
b) 세포질 프로테아제 절단 부위, 및/또는
c) 세포 표면 프로테아제 절단 부위.
이러한 효소 및 그의 절단 부위의 예는 하기 표에 나타내었다 (또한 Choi et al. (2012) 참조), 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 이 표에서는 각 효소에 관한 더 많은 정보를 얻기 위해 "Merops" 데이터베이스를 참조한다. https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml.
클래스 효소 클래스 예시 분열 시퀀스(한 글자 코드) 참조
일반 모티프(예시 만)
X는 임의의 천연 단백질생성 아미노산일 수 있음
"링커 클래스 1" 엔도솜 및/또는 리소좀 절단 부위 프로프로테인 전환효소 서브틸리신/케신 계열 후린 RXR/KR↓S/A/G/Nxxx 메롭스 S08.071
카텝신
　
　		 카텝신 B xxF/xV/R/G/L/S/A↓ A/F/LXXX 메롭스 C01.060
카텝신 E xxxL/F↓Vxxx 메롭스 A01.010
카텝신 D xxxL/F↓xxxx 메롭스 A01.009
카텝신 L xxL/V/F/IR/K↓S/A/Gxxx 메롭스 C01.032
카텝신 K xK/R/GF/L/I/V/Px↓xxxx 메롭스 C01.036
카텝신 C xSxE/S↓xxxG/R 메롭스 C01.070
"링커 클래스 2"
세포질 절단 부위		 카스파세 카스파세 3
 DxxD↓A/G/S/Txxx 또는 xxxx↓GGFV 메롭스 C14.003
카스파세 8 D/LxxD↓G/S/Axxx 메롭스 C14.009
칼리케라인 (hK) hk 1 xxF / IR / Y↓R / SxGx 메롭스 S01.160
hK 2 G/K/AxxR↓xxxG/S/T 메롭스 S01.161
hK3 S/IS/QxY/Q/R↓SSxx
hK10 결정되지 않음
"링커 클래스 3"
세포 표면 절단 부위		 매트릭스 메탈로 프로테아제
 MMP2 xP/Axx↓L/Ixxx 메롭스 M10.003
MMP1 xP/Axx↓L/Ixx 메롭스 M10.001
MMP3 xxxR/N/G↓L/Kxx 메롭스 S01.072
MMP7 xPA/G/Lx↓Lxxx 메롭스 M10.005
MMP8 GP/A/Sxx↓Lxxx 메롭스 M10.002
MMP9 GP/Axx↓Lxxx
P2는 바람직하게는 L
P1은 바람직하게는 G		 메롭스 M10.004
MMP12 GP/A/GL/A/Gx↓Lxxx 메롭스 M10.009
MMP14 xPxx↓Lxxx
 메롭스 M10.014
마트립타제 마트립타제 2 xxxR↓k/G/Rxxx 메롭스 S01.308
마트립타제 1 xxxR↓K/V/A/RVxx 메롭스 S01.302
조직형 플라스미노겐 활성제 우로키나아제 유형 플라스미노겐 활성화제 (uPA) xSG/SR/K↓xR/Vxx 메롭스 S01.231
절단 부위는 절단 부위 지점(↓로 표시)으로부터 기재된다. 문자 x는 모든 아미노산을 나타낸다. 몇 가지 우선 아미노산이 있기 전에 슬래시 (/)로 구분된다.
이러한 효소는 바람직하게는 프로테아제이다. 한 실시양태에서, 상기 펩타이드 링커는 식물 효소에 의해 절단가능하지 않다.
푸린은 서브틸리신 유사 프로단백질 전환효소 패밀리에 속하는 효소이며, 캐논 염기성 아미노산 서열 모티프 Arg-X-Arg/Lys-Arg(RX(R/K)R)의 단백질 C-말단을 절단하며, 여기서 X는 임의의 천연 단백질성 아미노산일 수 있다. 상기 모티프는 본원에서 후린 절단 부위라고 한다.
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바람직하게는, 이의 서열은 HRRRKRSLDTS (서열번호 46, 본원에서 Liop 또는 FCS I ("푸린 절단 부위 1")로도 지칭됨)이다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 추가의 절단가능한 링커는 TRHRQPRGWEQL (서열번호 44, 본 원에서 Fpe 또는 FCS II로도 지칭됨) 및 AGGNRVRRSVG (서열번호 45, 또한 본 원에서 Fdt 또는 FCS III로 지칭됨)이다.
카텝신은 다른 유기체뿐만 아니라 모든 동물에서 발견되는 프로테아제이다. 대부분의 구성원은 리소좀에서 발견되는 낮은 pH에서 활성화된다. 카텝신 B는 디펩티드 모티프 Val-Ala(VA)를 포함하는 펩티드 서열을 절단할 수 있다. 상기 모티프는 본원에서 카텝신 B 절단 부위라고 한다. 당업자는 Turk el al(2012)에서 카텝신 및 그의 절단 부위에 대한 충분한 가능하게 하는 정보를 발견하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
카스파아제(시스테인-아스파르트 산 프로테아제, 시스테인 아스파타제 또는 시스테인 의존성 아스 파르 테이트 지시 프로테아제)는 프로그램된 세포 사멸에 필수적인 역할을 하는 프로테아제 효소 계열이다. 1500개 이상의 카스파아제 기질이 인간 프로테옴에서 발견되었다. 일반적인 절단 모티프는 DXXD-A/G/S/T이고, 여기서 X는 임의의 천연 단백질성 아미노산일 수 있다. 당업자는 Kumar el al(2014)에서 카스파아제 및 이들의 절단 부위에 대한 충분한 가능하게 하는 정보를 발견하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
매트릭스 금속 단백 분해 효소(MMPs)는 매트릭스 의존성 아연 함유 엔도 펩티다아제이다. 다른 패밀리 구성원은 아다말리신, 세랄리신 및 아스타신이다. 총체적으로, 이들 효소는 모든 종류의 세포 외 기질 단백질을 분해할 수 있지만, 또한 다수의 생리 활성 분자를 처리할 수 있다. 당업자는 Eckard el al (2016)에서 매트릭스 메탈로 프로테아제 및 이들의 절단 부위에 대한 충분한 가능하게 하는 정보를 발견하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일반적으로, 당업자는 일상적인 고려 사항 및 문헌 의뢰에 의해, 각각의 포유동물 효소와 일치하는 특정 절단 부위를 선택하여, 단백질 독소 또는 프로톡신의 표적 특이적 방출을 조절할 수 있다. 이러한 분열 부위를 찾기 위한 일반적인 지침은 예를 들어 Rawlings (2016)에 공개되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단백질 독소 또는 프로톡신은 천연 단백질 독소의 탈면역화된 변이체이다. 서열 변형에 의해 단백질 독소를 탈면역화하는 재조합 방법이 예를 들어 문헌 Schmohl et al. (2015), 또는 Grinberg and Benhar (2017)에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, 상기 단백질 독소 또는 프로톡신은 식물 또는 식물 세포에 독성이 없다. 숙련된 사람은이 조건이 충족되는지 확인하기 위해 많은 일상적인 방법을 가지고 있다. 예를 들어, Klaine and Lewis (1995)의 개요를 참조하고, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질은 적어도 하나의 식물 특이적 N-글리칸을 포함한다. N-글리칸은 단백질의 아스파라긴 (Asn) 잔기의 아미드 그룹에 연결된 글리칸으로, 대부분 Asn-X-Thr 또는 Asn-X-Ser (NXT 또는 NXS) 모티프에 있으며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다. 전형적인 식물 특이적 N-글리칸은 문헌 Gomord et al. (2010))에 개시되어 있으며, 포유류의 N-글리칸 패턴과는 유의하게 상이하다.
이와 관련하여 식물에 의해 생성된 N- 글리칸은 예를 들어 포유류에서 생산된 것과 현저하게 다르다는 점을 강조하는 것이 중요하다. 특히, 담배 식물에서 생산되는 N-글리칸은
·α3 글리코 시드 링크를 통해 근위 N- 아세틸-글루코사민 잔기에 접합된 Fucose 잔기 (포유류에서와 같이 α6 대신)
·β2 글리코시드 링크를 통해 근위 만노스 잔기에 접합된 자일로스 잔기
·두 개의 원위 N- 아세틸-글루코사민 잔기, 각각은 α3 글리코 시드 링크를 통해 Fucose 잔기를 운반하고 β3 글리코 시드 링크를 통해 갈락토스 잔기를 운반한다(포유류의 뉴라민산 대신).
반면에, 예를 들어 조류에서 재조합적으로 발현되는 단백질은 종종 어떤 종류의 글리코실화도 부족하다. 그러나 조류는 하나 이상의 디술피드 다리를 갖는 IgG 형상 항체, 또는 항체 단편을 발현할 수 있다.
확인된 주요 식물 기반 글리코폼은 복합형 글리칸(GnGn/GnGnXF)이다. 다른 글리코폼(Man5-Man9, GnGnF, GnGnX, MMXF, Man5Gn 및 GnM(X)(F))도 검출할 수 있다.
이 명명법에 따르면 MGnX는 예를 들어
Figure pct00001
펩티드 글리코폼을 분석하기 위한 방법에 대한 배경은 WO2020169620에 제공되어 있으며, 그 내용은 활성화 목적을 위해 본원에 포함된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 설명에 따른 적어도 결합제-독소 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 이는 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 (i) 상기 설명에 따른 결합제-독소 융합 단백질 또는 약학 조성물, 및 (ii) 하나 이상의 추가의 치료학적 활성 화합물을 포함하는 조합물이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 설명에 따른 결합제-독소 융합 단백질, 조성물 또는 조합물은 다음의 인간 또는 동물 대상체의 치료(약제의 제조용)에 사용하기 위해 제공된다.
신생물성 질환으로
·고통받는,
·발병 위험 및/또는
·진단 중,
또는 그러한 상태를 예방한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음 인간 또는 동물 대상체를 치료하는 방법은
신생물성 질환으로
·고통받는,
·발병 위험 및/또는
·진단 중
또는 이러한 병태의 예방을 위한, 상기 설명에 따른 결합제 독소 융합 단백질, 조성물 또는 조합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 상기 방법이 제공된다.
예시
본 발명은 도면 및 전술한 설명에서 상세히 예시되고 설명되었지만, 이러한 예시 및 설명은 예시적이거나 예시적인 것으로 간주되어야 하며 제한적이지 않고; 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않는다. 개시된 실시양태에 대한 다른 변형들은 청구된 발명을 실시하는데 있어서 당업자에 의해, 도면, 개시물 및 첨부된 청구항의 연구로부터 이해되고 영향을 미칠 수 있다. 청구항들에서, 단어 "포함하는"은 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않으며, 부정관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 특정 조치가 상호 다른 종속 청구에서 인용된다는 단순한 사실이 이러한 조치의 조합을 유리하게 사용할 수 없음을 의미하지는 않는다. 청구항의 모든 참조 기호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지 나타내고; 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'->3'으로 표시된다.
이 예는 HPRNAse와 Anisoplin 및 일부 다른 독소에 대한 실험을 기반으로 한다. 그러나 실험 프로토콜은 해당 가족에 속하거나 가까운 다른 독소에도 적용된다.
상기 실시예들은 양(both) 푸린 절단가능한 링커를 사용한 실험에 기초하지만, 실험 프로토콜은 포유동물 효소에 민감한 다른 서열에 적용된다.
재료 및 방법
유전자 구성 바인더-독소 융합
전장 리툭시맙 HC 및 LC 서열은 mAb 기반 결합제-독소 융합 단백질을 개발하는데 사용되었다. 리툭시맙 서열의 중쇄 및 경쇄의 가변 부분 서열은 단일 쇄 scFv에서 조립되고 인간 IgG1 Fc 부분 서열에 융합되었다. 그런 다음 인간 푸린 절단 서열을 사용하여 LC의 C- 말단 부분 또는 전장 리툭시 맙의 HC 또는 scFv-Fc의 C- 말단 부분에서 알파 사르신 서열을 융합하여 HC + LC-FCS- 알파 사르신, HC-FCS- 알파 사르신 + LC 및 scFv-c-FCS- 알파 사르신 융합 단백질 서열을 수득했다. 또 다른 결합제-독소 융합 단백질은 scFv-Fc-알파 사르신을 얻기 위해 절단 부위 없이 알파 사르신에 연결된 scFv-Fc 부분으로 실현되었다. 이들 서열은 XbaI 및 IsceI와 함께 측면에 있는 유전자 합성에 의해 생성되었다.
항체를 포함하는 유전자 작제물
전장 HC 및 LC 항체 서열은 항체 기반 결합제-독소 융합 단백질을 개발하는 데 사용되었다. 개시되지 않은 서열의 중쇄 및 경쇄의 가변 부분 서열은 단일 쇄 scFv로 조립되고 인간 IgG1 Fc 부분 서열에 융합되었다. 이어서, 인간 푸린 절단 서열을 각각 사용하여 전장 미개시 항체의 LC 또는 HC 또는 둘 다의 C-말단 부분에서 인간 아니소플린 서열을 융합시키거나 scFv-Fc의 C-말단 부분에 융합시켜 HC+ LC-FCS-아니소플린, HC-FCS-아니소플린+ LC, 및 scFv-Fc-FCS-아니소플린 또는 scFv-Fc-아니소플린 융합 단백질 서열을 수득하였다. 또 다른 결합제-독소 융합 단백질은 scFv-Fc-아니소플린, HC-아니소플린을 수득하기 위해 절단 부위 없이 아니소플린에 연결된 scFv-Fc, HC 및 LC 부분으로 실현되었으며, scFv-Fc-아니소플린, HC+LC-아니소플린, HC-아니소플린을 얻었다. 이들 서열은 XbaI 및 IsceI와 함께 측면에 있는 유전자 합성에 의해 생성되었다.
니코티아나 벤타미아나 식물 잎 의 일시적인 발현
니코티아나 벤타미아나 ( Nicotiana benthaminana)는 16 시간 빛 / 8 시간 암광 주기, 22 +/- 3°C에서 성장했다. 7-8 주 된 식물 잎은 주사기 침투에 의해 일시적으로 변형되었다. 약 0.8-1.0의 600-1.0nm 광학 밀도(OD600)에 도달하는 유전자 작제물을 함유하는 미개시 플라스미드를 보유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (pMP90RK)을 3500g에서 10분 동안 원심분리하여 수집하였다. 결국, 박테리아를 침윤 완충액 (10 mM MgCl2, 10 mM MES, 100 μM 아세토시린곤, pH 5,6) 중 0.5의 OD600으로 조정되었고, 혼합물은 바늘 없는 주사기를 사용하여 침윤시켰다. 침윤 지역은 농작물 여과 후 4 일 및 6 일에 수확되었다. 농약 여과 4일 후에 수확한 전체 잎을 단백질 A 정제에 사용하였다.
N. 타바쿰 세포 에서의 발현
니코티아나 타바쿰 식물 현탁액 세포를 Nagata 등(1992)에 의해 기술된 바와 같이 식물 배양 배지에서 130 rpm, 25°C에서 5일간 성장시켰으며, 그 함량은 본원에 포함된다. pPZP-ATB 이원 플라스미드가 0.8-1.0 부근에서 600nm 광학 밀도(OD600)에 도달하는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(pBBR1MCS-5.virGN54D)를 2000g에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 이어서, 식물 세포와 박테리아 세포를 2000g 5분 원심분리 전에 30분 동안 공배양 배지에서 공동 배양하였다. 상청액 제거 후, 세포를 2일 동안 고체 공배양 배지에 도말하였다. 일시적 형질전환의 경우, 세포를 수집하고, 3회 세척하고, 추가 분석을 위해 수확하기 전에 세포탁심 및 카르베니클린을 함유하는 식물 배양 배지에서 배양하였다. 안정한 형질전환의 경우, 2일간의 고체 공배양 후, 세포를 세척하고, 선택적 카나마이신 및 세포탁심 및 카르베니클린 항생제를 함유하는 식물 배지에 도말하였다. 캘러스를 4주 후에 선별하고 후속 분석을 위해 고체 배지 또는 액체 현탁액 배양에서 계대 배양했다.
단백질 분석: ELISA, SDS-PAGE 및 웨스턴블롯
수집된 잎 조직(120 mg)을 400 μL 추출 완충액(250 mM 소르비톨, 60 mM 트리스, Na2EDTA, 0.6% 폴리클라 AT, pH8.0)에서 분쇄하였다. 균질화된 조직을 18200g에서 40분 동안 4°C에서 원심분리하였다. 그런 다음 상청액을 회수하고 액체 질소에서 동결시키고 -20°C에서 저장했다.
추출된 조직은 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 단백질을 환원 또는 비환원 SDS 로딩 완충액(80mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루)에서 5분 동안 끓여서 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 SDS-PAGE(4-20% 폴리아크릴아미드)로 분리하였다. 웨스턴 블로팅을 위해, 단백질을 반건식 전기영동 장치(Biorad Trans-Blot Turbo)를 사용하여 PVDF 멤브레인(Biorad) 상에 전기전사하였다; 이어서, 막을 TBST 완충액 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.5 % 트윈 20, pH 7.5) 중 3 % (w / v) 무 지방 분유로 실온에서 1 시간 동안 차단한 다음, 항 인간 IgG Fc 특이적 영역 (A0170; Sigma-Aldrich), 1 : 10.000의 희석 또는 알파 사르신 1 차 항체 (하우스 시약, 항 사르신 토끼 혈청, 산타 크루즈 CAS 86243-64-3의 알파 사르신으로 면역화된 토끼)에 대해 1 : 10.000로 희석하였다. 항-알파 사르신/HPRnase 항체에 이어 HRP-접합된 항-토끼 항체(0545; Sigma)를 1: 10000의 희석률로 처리했다. 단백질은 향상된 화학발광에 의해 검출되었다(Amersham Imager 600/GE; GE 헬스케어).
항 CD79b 엘리사
CD79b에 특이적인 접합체의 특이성 분석을 위해, CD79b에 대한 결합제를 포함하는 정제된 결합제 독소 융합 단백질을 96 웰 마이크로플레이트(Greiner)로 분석하였다. 웰을 50μl의 항원 CD79b(2,5μg/mL)로 37°C에서 1시간 동안 코팅한 다음 250μL 세척 완충액(PBS 트윈 0,1%)으로 5회 세척했다. 블로킹은 이어서, PBST 중 150μL 하이드로카제인(3.6%)을 RT에서 30분 동안 수행한 다음, 5회 세척하였다. 50 μL 항 항원 대조 항체를 로딩하여 5와 0 μg/mL 사이의 검량선을 실현하고, 50 μL 샘플을 RT에서 1시간 동안 비교하기 위해 동일한 96웰 플레이트에 로딩한 다음 5회 세척하였다. 50 μL의 1/200.000 희석된 검출 항체 (염소 항-인간 HRPO, Bethyl)를 로딩하고 RT에서 1h 인큐베이션하였다. 이어서, 리벨레이션(revelation)을 50 μL TMB 반응 완충액 (젠텍)으로 15분 동안 수행하고, 최종적으로 H3PO4 1M으로 정지시켰다. 이어서, 효소 활성을 450 nm에서 분광분석법에 의해 분석하였다. 그 결과를 도 4B에 나타내었다.
단백질 A 정제
아그로침투 4 일 후, 잎을 수집하고, 무게를 측정하고, 신선한 농상 침윤 잎 그램 당 2mL의 추출 완충액 (250mM 소르비톨, 60mM 트리스, Na2EDTA, 0.6 % Polyclar AT, pH8.0)을 사용하여 블렌더에서 분쇄하였다. 이어서, 혼합물을 이중 미라클로스(Millipore) 층을 통해 여과하였다. 이어서, 여과액을 4°C에서 20.000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 추출 완충액으로 예비평형화된 단백질 A 수지 상에 로딩하였다. 이어서, 수지를 60 mM 트리스 pH8.0의 10 컬럼 부피로 세척하고, 용출은 10% 트리스 pH8.0으로 직접 완충된 100 mM 글리신 pH3.0을 사용하여 수행하였다. 이어서, 농축된 단백질 분획을 수집하고, 액체 질소에서 동결시켰다.
시험관 내 세포 독성 분석
CD20 또는 CD79b를 발현하는 세포주의 생존력에 대한 결합제-독소 융합 단백질의 효과를 세포 역가 Glo 검정 (Promega, G9241)을 사용하여 평가하였다. 이 분석에서 루시페린의 단일 산소화는 Mg 2+ 및 ATP의 존재 하에 루시페라아제에 의해 촉매된다. 이 반응은 생존 가능한 세포의 수에 비례하는 발광 신호를 생성한다.
테스트된 세포주에 따라 세포를 96웰 플레이트의 공동에 2000 또는 5.000 cells/웰의 밀도로 50μl의 성장 배지(RPMI1640)에 시딩했다. 결합제-독소 융합체의 연속 희석액은 40 μl의 성장 배지에 10 μl의 결합제-독소 융합체 또는 완충액(PBS, Tween 0.02%)을 첨가함으로써 제조하였다. 혼합물을 세포에 첨가하고, 5% CO2로 37°C에서 72시간 동안 배양하였다. 결합제-독소 융합을 이중으로 시험하였다. 완충액은 음성 대조군으로 작용하였고, 배지 및 세포는 각각 블랭크와 미처리 대조군으로서 작용하였다.
72시간 후, 플레이트를 실온에서 30분 동안 평형화시키고 100μl의 CellTiter Glo 시약을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 후속적으로 진탕 플랫폼 상에 2분 동안 놓은 다음, 신호를 어둠 속에서 실온에서 10분 동안 안정화시켰다. 그런 다음 발광이 기록되었다.
생존율의 백분율을 결정하기 위해, 블랭크(성장 배지만)의 평균 발광 신호를 각 웰에서 빼고, 처리되지 않은 세포의 평균 발광 신호를 100% 생존율로 설정하였다. 이어서, 처리된 세포의 평균 신호를 정규화하고 ATB 농도의 함수로서 플롯화하였다.
CD20 기반 항-결합제-독소 융합 단백질을 표적 세포 WSU-NHL (CD20+) 및 비표적 세포 K562 (CD20-)로 평가하였다.
항-CD79b 기반 결합제-독소 융합 단백질을 표적 세포 JEKO, OCY-LY3, BJAB 및 WSU-DLCL2 (CD79 +) 및 비표적 세포 K-562 (CD79-)에서 평가하였다.
생체 내 분석: 급성 독성
동물에서 결합제-독소 융합의 안전성을 입증하기 위해, 20 g 암컷 NOG 마우스 (Taconic)에 대한 급성 독성 연구가 수행되었다. 미공개 항체 sc-Fv-Fc-알파 사르신 (125), 알파 사르신 단독 및 sc-Fv-Fc (대조군으로서 86)를 각각 20 mg / kg, 4.9 mg / kg 및 15 mg / kg으로 정맥 내 주사했다. 체중의 측정은 주사 후 연속 8 일 동안 매일 수행되었다. 이 연구는 EPO Experimentelle Pharmakologie & Onkologie Berlin-Buch GmbH에서 ATB 테라퓨틱스(Therapeutics)에서 제공한 자료로 수행되었다.
펩타이드 당형 분석
펩티드 글리코폼을 분석하기 위한 방법에 대한 배경은 WO2020169620에 제공되어 있으며, 그 내용은 활성화 목적을 위해 본원에 포함된다.
절단 분석
독소의 방출을 허용하는 절단성은 정제된 scFv-Fc-FCS-알파 사르신, scFv-Fc-알파 사르신 또는 HPRNAse (결합제-독소 융합 단백질) 상에 재조합 푸린을 첨가한 후 시험관내에서 입증되었다. 반응은 1μl의 절단 완충액 (아세트산 나트륨 1M pH 5,5 + 10mM CaCl2)에 바인더-독소 융합 단백질 마이크로 그램에 25 units / ml furin (NEB P8077S) 1μl 를 첨가한 후 37 ℃에서 4 시간 동안 수행되었다. 절단은 SDS 페이지 쿠마시 블루 겔 (4-20% 폴리아크릴아미드)에 의해 가시화되었다.
CHO 과도 발현
제어 목적을 위해, 일부 작제물 414, 301, 452, 221 및 125 도 CHO 세포에서 발현되었다. 이는 에비트리아가 기존의 (비 PCR 기반) 클로닝 기술을 사용하여 개발한 벡터 시스템에서 수행되었다. 에비트리아 벡터 플라스미드를 유전자 합성하였다. 플라스미드 DNA는 음이온 교환 크로마토그래피에 기초하여 저-내독소 조건 하에서 제조되었다. DNA 농도는 파장 260 nm에서의 흡수를 측정하여 결정하였다. 서열의 정확성은 Sanger 시퀀싱(cDNA의 크기에 따라 플라스미드당 최대 2개의 시퀀싱 반응 포함)으로 검증되었다.
Suspension-적응된 CHO K1 세포를 생산을 위해 사용하였다 (원래 ATCC로부터 받았고, Evitria에서 현탁액에서 무혈청 성장에 적응시켰다). 종자는 화학적으로 정의된 동물 성분이 없고 혈청이 없는 배지인 eviGrow 배지에서 재배되었다. 세포를 Evitria의 맞춤형 독점적(proprietary) 형질주입 시약인 eviFect로 형질감염시키고, 동물 성분이 없고 혈청이 없는 배지인 eviMake2에서 형질주입 후 세포를 성장시켰다.
상청액은 원심분리 및 후속 여과(0.2 pm 필터)에 의해 수확하였다.
항체를 MabSelect SuRe (Cytivia)를 사용하여 정제하였다.
결과
scFv-Fc-Fc 포맷에 기초한 몇몇 재조합 결합제-독소 융합 단백질이 구성되었다: scFv-Fc-FCS-아니소플린, scFv-Fc-아니소핀, scFv-Fc-FCS-HPRNAse, scFv-Fc-HPRNAse, scFv-Fc-FCS-알파 사르신, scFv-Fc-알파 사르신, scFv-Fc-FCS-알파 사르신 동족체, scFv-Fc-알파 사르신 동족체, scFv-Fc-FCS-HPRNAse 동족체, 및 scFv-Fc-HPRNAse 동족체이다. 전장 mAb를 기반으로 하는 결합제-독소 융합 단백질은 아니소플린, HPRNAse 및 알파 사르신으로 구성되었다: HC+LC--아니소플린, HC-아니소플린 또는 LC, HC-아니소플린 + LC 아니소플린, LC+ HC-FCS-아니소플린 또는 HPRNAse 또는 알파 사르신. 비접합 mAb도 대조군으로 구축하였다.
세포 생존율 분석
정제된 결합제-독소 융합체는 이들의 세포독성에 대해 암 세포주에서 평가되었다. 모든 결합제-독소 융합은 양성 세포주 생존력을 손상시키는 것으로 나타났다. 더욱이, 우리는 동일한 항원을 표적으로 하는 시판된 ADC (Polivy® US8545850에 개시된 바와 같이 MMAE에 꼬인 최초의 인간화 항 CD79b 항체 (폴라투주맙)를 포함함) 보다 우월성을 입증하였다(425 및 507 참조). 또한, 상술한 결합제-독소 융합 단백질은 음성 세포주에 대해 매우 낮은 효과를 나타내었다(425 및 125 참조).
결합제-독소 융합 단백질은 표적 음성 일차 세포 HUVEC 및 HEP2에 무해하며 암세포에 대한 높은 효능을 나타낸다.
급성 독성
리보톡신 알파 사르신은 고용량 (4.91 mg / kg)으로 주사했을 때 마우스에서 내약성이 우수했다. 리보톡신 기반의 바인더 독소 융합은 리보톡신 단독에 비해 암세포에 매우 활성이 높으며 바인더 알파 사르신 융합 Ⅳ 의 20mg / kg의 주사에서 급성 독성의 징후를 유발하지 않기 때문에 동물 모델에 잘 견딘다.
CHO 과도 발현
작제물 414, 301, 452, 221 및 125는 상당히 낮은 수율에도 불구하고 실제로 CHO 세포에서도 생산될 수 있음이 밝혀졌다.
예를 들어, 작제물 452의 수율은 니코티니아 실험에 비해 CHO 실험에서 인자 14 내지 15 더 낮았다. 작제물 452는 항체와 독소 사이에 G4S 링커를 갖는데, 이는 포유동물 프로테아제에 의해 절단가능하지 않다. 그러나 이론에 얽매이지 않고 CHO의 낮은 수확량에 대한 한 가지 이유는 CHO에서 발생하지만 니코티아나와 같은 식물에서는 발생하지 않는 자발적인 분열 및 부분적 인자가 중독일 수 있다.
작제물 22는 푸린 절단가능한 링커(Fpe)를 가지며, 마찬가지로 Nicinia 에 비해 CHO에서 감소된 발현을 경험한다.
작제물 포유류 세포에 의해 절단 가능한 링커? CHO 대 니코티니아의 수율의 상대적 감소
221 (Fpe-SA) 예(Fpe) 요인 7 - 8
301 (G4S-ANI) 아니요 요인 8.5 - 9.5
452 (전체 G4S-ANI) 아니요 요인 14 - 15
여전히, CHO(푸린 절단가능한 링커, Fpe를 가짐)에서 생산된 작제물 221은 0,2595 nM의 IC50을 갖는 양성 세포주 상에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다는 것을 보여줄 수 있었다. 비절단성 G4S 링커를 갖는 작제물 125는 0,7792 nM의 IC50을 갖는 양성 세포주 상에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
실험 결과 요약
실험 결과는 다음 표에 요약되어 있다.

도면 		실험 유형 항체 표적 항체 형식 링커 독소 생산 시스템 셀 구성 번호 발견
2 생존력 분석 CD20 sc-Fv-Fc G4S 사르신 니코티아나 WSU-NHL 206 ATB 206은 0,03669 nM의 IC50으로 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
3 CD79b sc-Fv-Fc G4S 사르신 니코티아나 CD79b + (JEKO) 및 - (K-562) 86 및 125 ATB 125는 IC50이 0,3669 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시키는 반면, 아파 사르신 단독은IC50이 565 nM 인 hig h er 용량에서만 활성화된다. 음성 세포주에서 ATB 125는 활성화되지 않은 반면 양성 세포주에 대해 더 높은 용량에서 알파 사르신 단독의 효과를 관찰한다.
4 CD79b sc-Fv-Fc 리오프 사르신 니코티아나 CD79b + (BJAB) 및 - (K-562) 222 ATB 222는 IC50이 0,000058 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시키는 반면, 아파 사르신 단독은IC50이 1,143 nM 인 hig h er 용량에서만 활성화된다. 음성 세포주에서 ATB 222는 활성화되지 않은 반면 50 nM의 IC205,3로 더 높은 용량에서 알파 사르신 단독의 효과를 관찰한다.
5 CD79b sc-Fv-Fc Fpe 사르신 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 221 ATB 221은 0,1405 nM의 IC50을 갖는 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
6 CD79b sc-Fv-Fc Fdt 사르신 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 229 ATB 229는 IC50이 0,06368 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
7 CD79b 전체 IgG G4S 2x RRKR 사르신 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 323 ATB 323은 IC50이 0,1601nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
8 CD79b sc-Fv-Fc G4S 아제리틴 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 304 ATB 304는 IC50이 0,2807 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
9 CD79b sc-Fv-Fc G4S 히르수텔린 A 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 302 ATB 304는 IC50이 1,107nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
10 CD79b sc-Fv-Fc G4S 아니소플린 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 301 ATB 301은 IC50이 0,1032nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
11 CD79b sc-Fv-Fc 리오프 아니소플린 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 466 ATB 466은 IC50이 0,0005326 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
12 CD79b sc-Fv-Fc Fpe 아니소플린 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 467 ATB 467은 IC50이 0,08602 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
13 CD20 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 WSU-NHL 676 ATB 676은 IC50이 0,03760 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
14 CD20 전체 IgG 리오프 아니소플린 니코티아나 WSU-NHL 680 ATB 680은 IC50이 0,01906 nM 인 양성 세포주 WSU-NHL에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
15 CD79b 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 CD79b + (BJAB) 및 - (K-562) 452 ATB 452는 IC50이 0,00003325 nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시키며, 이는 동일한 항원을 인식하는 시판되는 항체 접합 약물(Polatuzumab)에 비해 3000배 더 나은 효능이다. ATB 452 및 벤치마크 항체 약물 접합체는 음성 세포주에서 생존력을 감소시키지 않는다.
16 CD79b 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 CD79b + (JEKO) 및 - (K-562) 452 ATB 452는 IC50이 0,01507nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시키며, 이는 동일한 항원을 인식하는 접합된 시판되는 항체 약물에 비해 4,5배 더 나은 효능이다. 아니소플린 단독은 양성 세포주에서 생존력 감소를 유발하지 않는다. ATB 452, 아니소플린 단독 및 벤치마크 항체 약물 접합체는 음성 세포주에서 생존력을 감소시키지 않는다.
17 CD79b 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 CD79b + (BJAB) 및 - (K-562) 452 ATB 452는 IC50이 0,00003325 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시키는 반면 음성 세포주에서는 세포 독성을 유발하지 않는다.
18 CD79b 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 CD79b + (OCY-LY3) 및 - (K-562) 452 ATB 452는 IC50이 0,05866nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시키는 반면 음성 세포주에서는 세포독성을 유발하지 않는다.
19 CD79b 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 Huvec/HepG2 452 ATB 452, 리보톡신에 대한 비절단 링커와의 완전 mab 융합은 인간 내피 세포(HUVEC) 및 인간 간 세포(HEP-G2)에 의해 잘 견딘다.
20 CD79b 전체 IgG 리오프 아니소플린 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 507 ATB 507은 IC50이 0,02582 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
21 CD79b 전체 IgG 리오프 아니소플린 니코티아나 Huvec/HepG2 507 ATB 507, 리보톡신에 대한 절단 가능한 링커와의 완전 mab 융합은 인간 내피 세포 (HUVEC) 및 인간 간 세포 (HEP-G2)에 의해 잘 견딘다.
22 CD79b 전체 IgG Fpe 아니소플린 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 508 ATB 508은 IC50이 0,1573 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
23 CD79b 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 509 ATB 509는 IC50이 0,02870 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
24 CD79b 전체 IgG G4S 아니소플린 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 536 ATB 536은 IC50이 0,03743 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
25 겔 CD79b sc-Fv-Fc G4S 아니소플린 동족체 ONC2 니코티아나 해당 없음 　 　
26 생존력 분석 CD79b sc-Fv-Fc G4S 아니소플린 상동 1 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 495 ATB 495는 IC50이 0,3263nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
27 CD79b sc-Fv-Fc G4S 아니소플린 상동 2 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 496 ATB 496은 IC50이 0,5317 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
28 CD79b sc-Fv-Fc G4S 아니소플린 상동 3 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 497 ATB 497은 IC50이 0,1377 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
29 분열 분석 CD79b (사르신) 해당 없음
(hPRNase)		 sc-Fv-Fc G4S (선택적으로 RRKRAS) 사르신 또는 hpRNase1 니코티아나 해당 없음 125, 222 및 48 푸린 절단 분석은 링커가 절단 가능할 때 푸린 (+)을 첨가한 후 페이로드 인 알파 사르신 또는 HPRNAse가 항체로부터 방출되는 반면, 비 절단 링커 (125)는 푸린에 노출된 경우에도 페이로드 방출을 방지한다는 것을 보여준다.
30 독소 연구 CD79b sc-Fv-Fc G4S 사르신 니코티아나 해당 없음 125 (독소가없는 86) 알파 사르신 단독 (녹색), 미공개 sc-Fv-Fc (파란색), 미공개 sc-Fv-Fc-알파 사르신 (빨간색)의 정맥 주사 후 최대 8 일까지 평균 체중 변화의 백분율. 평균 체중 변화는 6%를 초과하지 않으며, 이는 리보톡신을 기반으로 한 결합제-독소 융합의 우수한 내약성을 보여준다.
31 엘리사 CD79b sc-Fv-Fc G4S 사르신 니코티아나 해당 없음 125 (독소가없는 86) 페이로드의 존재는 동일한 코팅된 항원을 향한 항체의 결합을 변형시키지 않는다.
32 생존력 분석 CD79b sc-Fv-Fc G4S hpRNase1 니코티아나 CD79b + (WSU-DLCL2) 96 ATB 96은 IC50이 9,044nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다.
33 겔 CD79b sc-Fv-Fc G4S hpRNase1 니코티아나 　 92 및 63 　
34 생존력 분석 CD79b sc-Fv-Fc G4S 안지오제닌 니코티아나 CD79b+ (JEKO) 228 ATB 228은 IC50이 ,160nM인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.
35 겔 CD79b sc-fv-FC 또는 전체 IgG G4S 사르신 또는 아니소플린 CHO 해당 없음 414, 301, 452 　
36 생존력 분석 CD79b sc-Fv-Fc Fpe 사르신 CHO CD79b+ (JEKO) 221 및 125 ATB 221은 0,2595 nM의 IC50을 갖는 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다. ATB 125는 IC50이 0,7792 nM 인 양성 세포주에서 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시킨다.

CHO의 Produc tion 수율은 숙주 효소에 의한 Fpe 링커의 부분적 절단 과 그로 인한 자가 중독으로 인해 매우 적다.
37 겔 n/d IgG hpRNase1 니코티아나 해당 없음
정의
본원에 사용된 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 바이오서열(아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열)을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우 내의 상응하는 서열의 부분은 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있고, 두 시퀀스의 최적 정렬을 위해. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교 윈도우의 총 위치 수로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 서열인 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 두 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖는 경우(즉, 특정 영역에 걸쳐, 또는 지정되지 않은 경우 참조 서열의 전체 서열에 걸쳐 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성), 비교 창 또는 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 지정된 영역에 대해 최대 대응을 위해 비교 및 정렬될 때, 두 서열은 "실질적으로 동일"하다. 본 개시내용은 본원에 예시된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 제공한다. 아미노산 서열과 관련하여, 동일성 또는 실질적인 동일성은 길이가 적어도 5, 10, 15 또는 20개 아미노산 길이, 임의로 적어도 약 25, 30, 35, 40, 50, 75 또는 100개 아미노산 길이, 임의로 약 150, 200 또는 250개 아미노산 길이인 영역에 걸쳐 존재할 수 있고, 또는 참조 시퀀스의 전체 길이에 걸쳐 더 짧은 아미노산 서열, 예를 들어, 20개 이하의 아미노산의 아미노산 서열과 관련하여, 본원에 정의된 보존적 치환에 따라, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환될 때 실질적인 동일성이 존재한다.
용어 "단백질 독소" 또는 "단백질 프로톡신"은, 그의 화학적 성질에 의해, 단백질 (즉, 길이가 50개 이상의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 펩티드) 또는 폴리펩티드 (즉, 길이가 10개 이상이면서 50개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 펩티드)인 독소를 제한 없이 지칭한다. 본 발명의 의미에서 프로톡신은 잠복 독소라고도 하는 독소의 전구체이며, 이는 예를 들어 억제 아미노산 서열을 절단하거나 구조적 변화를 겪음으로써 활성화될 필요가 있다. 용어 "프로톡신" 및 "단백질 프로톡신"은 여기에서 상호교환적으로 사용되며 동일한 주제를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 적어도 하나의 추가 성분에 작동가능하게 연결된 펩티드 성분을 갖고 그의 도메인의 조성 및/또는 조직에서 천연 단백질과 상이한 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은, 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 언급할 때, 서로 다른 폴리뉴클레오티드가 서로 기능적 관계에 놓여 있는 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 마찬가지로, 신호 펩티드의 코딩 서열은 신호 펩티드가 그 폴리펩티드의 세포외 분비에 영향을 미치는 경우 폴리펩티드의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 각각의 폴리뉴클레오티드가 상이한 펩티드를 인코딩할 때, "작동가능하게 연결된"은 각각의 폴리뉴클레오티드가 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 접합하는데 필요한 경우, 개방 판독 프레임이 정렬됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "절단가능한 펩타이드 링커"는 결합제 모이어티와 독소 단백질을 연결하는 잔기를 함유하는 융합 단백질 내의 내부 아미노산 서열을 의미하여, 독소 단백질이 표적 세포 외부에서 그의 독성 효과를 발휘할 수 없게 하거나, 세포 성장을 억제(cytostasis) 또는 세포 사멸(cytotoxic)을 유발하는 독소 단백질의 그 능력을 제한한다. 이러한 방식으로 단백질 독소는 혈장에 있는 한 세포 독성 페이로드가 선택적으로 방출 및/또는 활성화될 표적 세포에 도달할 때까지 비활성 상태로 유지된다(Grawunder & Stein, 2017). 표적 세포 내부에서, 절단 가능한 링커 서열이 절단되고 독소 단백질이 활성 또는 독성이 된다. 본 발명의 융합 단백질은 특정 프로테아제, 특히 암 특이적 프로테아제에 대한 절단 인식 부위를 갖는 특정 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열에 의해 연결된 세포 특이적 바인더 모이어티 및 단백질 독소 모이어티로 구성되며, 및/또는 다음과 같은 특이적 조건 하에서 절단가능하고, 이에 제한되지 않으며, 산성 및/또는 환원 조건과 같은 특정 조건 하에서 절단 가능하다. 특이적 프로테아제에 대한 절단 인식 부위를 코딩하는 서열은 공지된 유비쿼터스 인간 프로테아제 사이에서 및/또는 암 관련 프로테아제의 발현을 시험함으로써 확인될 수 있다. 또한 링커 서열은 리소좀으로의 세포 결합 및 내재화에서 결합제 모이어티의 역할을 방해하지 않아야 한다.
프로톡신의 용어 "절단가능한 도메인"은 일단 가수분해 또는 효소적 절단에 의해 절단되면, 프로톡신의 독소 부분을 활성화시키는 서열에 관한 것이다. 많은 전구독소는 효소 또는 pH 의존적 가수분해(예: 엔도좀의 엔도사이토시스 후)에 의해 특이적으로 절단되어 활성 독소 부분을 세포질로 방출하는 아미노산 도메인을 가지고 있다. 이러한 절단가능한 도메인은 독소가 활성화를 위한 절단가능한 도메인을 포함하지 않는 경우에 사용되어야 하는 절단가능한 펩타이드 링커와는 반대로, 예를 들어 프로톡신으로서 오지 않기 때문에 "자연 발생" 절단 가능한 펩타이드 링커 (또는 "내인성 절단 부위")로서 이중 작용한다.
따라서, 절단가능한 링커가 활성 프로파일과 관련하여 안정한 링커에 비해 명확한 이점을 제공하는 반면, 링커의 절단이 생산 시스템의 자가 중독을 유발하기 때문에 이의 사용은 포유동물, 곤충 및 효모 세포에서 각각의 결합 단백질-독소 접합체의 생산을 복잡하게 한다. 그러나 이것은 식물 기반 생산 시스템에는 적용되지 않는다.
(i) 링커를 절단하지 않는다(각각의 프로테아제 부족 또는 환원/가수분해 조건으로 인해) 및/또는
(ii) 포유동물 또는 포유동물 세포에 독성인 각각의 단백질 독소는 식물 또는 식물 세포에 독성이 없다.
본원에 사용된 용어 항체는 균질한 항체 집단, 즉 전체 면역글로불린으로 이루어진 균질한 집단, 또는 그의 단편 또는 유도체가 표적 결합 능력을 보유하는 항체 조성물을 지칭한다.
특히 바람직하게는, 이러한 항체는 표적 결합 능력을 유지하는 IgG 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체이다. 면역 글로불린 G (IgG)는 항체의 일종이다. 인간 혈청 항체의 약 75 %를 차지하는 IgG는 혈액 순환에서 발견되는 가장 일반적인 유형의 항체이다. IgG 분자는 혈장 B 세포에 의해 생성 및 방출된다. 각 IgG에는 두 개의 항원 결합 부위가 있다.
IgG 항체는 4 개의 펩타이드 사슬로 구성된 분자량이 약 150kDa 인 큰 분자이다. 그것은 약 50 kDa의 2개의 동일한 부류 γ 중쇄 및 약 25 kDa의 2개의 동일한 경쇄를 함유하고, 따라서 사량체 4차 구조를 포함한다. 2개의 중쇄는 서로 연결되고 각각 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된다. 생성된 사량 체는 두 개의 동일한 반쪽을 가지며, 함께 Y와 같은 모양을 형성한다. 포크의 각 끝은 동일한 항원 결합 부위를 포함한다. IgG의 Fc 영역은 고도로 보존된 N-글리코 실화 부위를 가지고 있다. 이 부위에 부착된 N- 글리 칸은 주로 복잡한 유형의 코어-푸코 실화된 이안테나 구조이다. 또한, 소량의 이러한 N-글리칸은 GlcNAc 및 α-2,6-링크 시알 산 잔기를 이등분한다.
인간에는 4 개의 IgG 하위 클래스 (IgG1, 2, 3 및 4)가 있으며, 혈청에 풍부하게 (IgG1이 가장 풍부함) 순으로 명명되었다.
본원에 사용된 용어 "항체 단편"은 표적 결합 능력을 유지하는 이러한 항체의 단편, 예를 들어
·CDR(상보성 결정 영역),
·초가변 영역,
·가변 도메인(Fv),
·IgG 중쇄 (VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 구성됨),
·IgG 경쇄(VL 및 CL 영역으로 구성됨) 및/또는
·팹 및/또는 F(ab)2.
본원에 사용된 용어 "유도체"는 일반적인 항체 개념과 구조적으로 상이하지만 여전히 일부 구조적 관계를 갖는 단백질 작제물, 예를 들어 scFv, scFv-FC, Fab 및/또는 F(ab)2, 뿐만 아니라 이중, 삼중- 또는 그 이상의 특이적 항체 작제물 또는 1가 항체, 및 표적 결합 능력을 추가로 보유하는 것을 의미한다. 이 모든 항목은 아래에 설명되어 있다.
당업자에게 공지된 다른 항체 유도체는 디아바디, 카멜리드(camelid) 항체, 나노바디, 도메인 항체, scFvs로 구성된 2개의 쇄를 갖는 2가 동종이량체, IgAs (J 쇄 및 분비 성분에 의해 접합된 2개의 IgG 구조), 상어 항체, 신세계 영장류 프레임워크 및 비-신세계 영장류 CDR로 구성된 항체, CH3+VL+VH를 포함하는 이량체화된 작제물, 및 항체 접합체(예를 들어 항체 또는 독소, 사이토카인, 방사성 동위원소 또는 표지에 연결된 단편 또는 유도체)가 있다. 이들 유형은 문헌에 잘 기재되어 있고, 본 개시내용에 기초하여, 추가의 본 발명 활성과 함께 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.
하이브리도마 세포의 생산을 위한 방법은 이전에 기재되어 있다 (본원에 참고로 포함된 Kohler and Milstein 1975 참조). 본질적으로, 예를 들어, 마우스를 인간 가용성 구아닐릴 사이클라제(sGC) 단백질로 면역화시키고, 이어서 상기 마우스로부터 B-세포를 단리하고, 단리된 B-세포와 골수종 세포를 융합시킨다.
키메라 또는 인간화 mAb의 제조 및/또는 선택을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본질적으로, 예를 들어, 표적 결합에 관여하지 않는 뮤린 항 sGC 항체로부터의 단백질 서열은 상응하는 인간 서열로 대체된다. 예를 들어, Genentech의 US6331415는 키메라 항체의 생산을 기술하고, 의학 연구 위원회의 US6548640은 CDR 이식 기술을 기술하고, Celltech의 US5859205는 인간화 항체의 생산을 설명한다. 이들 개시 내용은 모두 본원에 참조로 포함된다.
완전한 인간 mAb의 제조 및/또는 선택을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 여기에는 인간 sGC로 면역화된 형질전환 동물의 사용 또는 효모 디스플레이, 파지 디스플레이, B 세포 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이와 같은 적절한 디스플레이 기술의 사용이 포함될 수 있으며, 여기서 라이브러리의 항체는 고정상에서 인간 sGC에 대해 스크리닝된다.
시험관내 항체 라이브러리는 무엇보다도 MorphoSys에 의해 US6300064 및 MRC/Scripps/Stratagene에 의해 US6248516에 개시되어 있다. 파지 디스플레이 기술은 예를 들어 Dyax에 의해 US5223409에 개시되어 있다. 트랜스제닉 포유동물 플랫폼은 예를 들어 TaconicArtemis에 의해 EP1480515A2에 기재되어 있다. 이들 개시 내용은 모두 본원에 참조로 포함된다.
IgG, scFv, scFv-FC, Fab 및/또는 F(ab)2는 통상의 기술자에게 잘 알려진 항체 포맷이다. 관련 활성화 기술은 각 교과서에서 구할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fab"는 항원 결합 영역을 포함하는 IgG 단편에 관한 것이며, 상기 단편은 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄로부터 하나의 불변 및 1개의 가변 도메인으로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "F(ab)2"는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 Fab 단편으로 구성된 IgG 단편에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "scFv"는 짧은 링커, 보통 세린 (S) 또는 글리신 (G)과 함께 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합된 단일쇄 가변 단편에 관한 것이다. 이 키메라 분자는 불변 영역의 제거와 링커 펩티드의 도입에도 불구하고 원래의 면역 글로불린의 특이성을 유지한다.
본원에 사용된 용어 "scFv-FC"는 특이적 항체 포맷에 관한 것이다. 이 포맷은 특히 안정적이며 식물 세포 및 식물에서 높은 수율로 표현될 수 있다. scFv-FC 작제물은 예를 들어 Bujak et al(2014)에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다. scFv-Fc 작제물은 예를 들어 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 회합된 2개의 사슬을 포함하는 이량체 작제물이며, 여기서 각각은 하기와 같은 구조로 구성된다(N->C 방향으로):
VL-링커-VH-링커-FC, 또는
VH- 링커 -VL- 링커 -FC
VL은 항체의 경쇄의 가변 도메인이고, VH는 항체의 중쇄의 가변 도메인이고, FC는 항체의 불변 도메인이다.
전장 IgG-형상 항체 또는 scFv-Fc 결합 도메인의 사용은 접합체에 더 긴 반감기를 부여한다. 또한 항체의 Fc 부분은 CDC(보체 의존성 세포독성) 또는 ADCC(항체 의존성 세포 독성) 활성화가 필요할 때 가장 중요할 수 있다.
변형된 항체 포맷은 예를 들어 이중- 또는 삼중특이적 항체 작제물, 항체-기반 융합 단백질, 면역접합체 등이다. 이들 유형은 문헌에 잘 기재되어 있고, 본 개시내용에 기초하여, 추가의 본 발명 활성과 함께 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다. 또한, 1가 항체는 이전에 US 2004/0033561 A1 (본원에서 모노바디로 지칭됨) 또는 WO2007048037; 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
항체 모조물은 유기 화합물(대부분의 경우 재조합 단백질 또는 펩티드)으로, 항체와 마찬가지로 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만 구조적으로 항체와 관련이 없다. 항체에 비해 공통된 장점은 더 나은 용해도, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성, 비교적 낮은 생산 비용이다. 항체 모방체는 치료제 및 진단제로서 개발되고 있으며, 특히 아피바디 분자, 아필린, 유비퀴틴, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPins, 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드, 모노바디 및 나노클램프를 포함한다. 항체 모방체는 매우 상세히 논의되며, 특히 본원에 참조로 포함된 Gebauer and Skerra (2009)에 기재되어 있다.
일반적으로, 단백질 결합제는 단일 사슬로 구성될 수 있다. 이는 예를 들어 단백질 결합제가 scFv 항체, 또는 scFv-FC인 경우이다. 이 경우, 전체 단백질 결합제는 단일 폴리뉴클레오티드 상에 코딩될 수 있다.
다른 실시양태에서, 단백질 결합제는 예를 들어 전체 크기의 IgG 또는 F(ab)2 단편과 같이 2개 이상의 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 경우에 핵산 작제물은 단백질 결합제에 대해 상이한 쇄 또는 도메인을 암호화하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있음이 제공될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "식물" (그로부터 유래된 세포 포함)은 조류(클로로피타 및 차로피타/스트렙토피타, 뿐만 아니라 메소스티그마토피세아, 클로로키보피세아과 및 스피로테니아 포함), 및 또한 모노- 및 쌍떡잎식물을 포함하는 짐노스퍼TMS 및 속씨식물을 포함하는 육상 식물(배아식물)에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "일시적인 발현"은 핵산, 가장 빈번하게 발현 카세트를 코딩하는 플라스미드 DNA가 숙주 세포 또는 식물에 도입된 후 짧은 시간 동안 발현되는 유전자의 일시적인 발현에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "안정한 발현"은 핵산, 가장 빈번하게는 발현 카세트를 코딩하는 플라스미드 DNA가 숙주 세포의 게놈 내로 도입된 후 시간에 따라 연속적으로 발현되는 유전자의 발현에 관한 것이다(핵 또는 색소체 통합). 안정적으로 형질감염된 세포에서 외래 유전자는 게놈의 일부가 되어 복제된다.
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시퀀스
하기 서열은 본원의 개시내용의 일부를 형성한다. WIPO ST 25 호환 전자 서열 목록도 이 애플리케이션과 함께 제공된다. 의심의 여지를 없애기 위해, 다음 표의 서열과 전자 서열 목록 사이에 불일치가 존재하는 경우, 이 표의 서열은 올바른 것으로 간주된다.
또한 일부 구체예에서, 각각의 아미노산 서열은 신호 펩티드/리드(lead) 펩티드를 갖거나 갖지 않는다는 것을 주목한다. 모든 실시양태는 신호 펩티드/리드 펩티드와 함께 개시되고 신호 펩티드/리드 펩티드가 없는 것으로 간주되어야 한다.
또한 일부 구체예에서, 독소의 각각의 아미노산 서열은 이의 탈면역화된 버전을 나타낸다는 것을 주목한다. 모든 실시양태는 야생형 독소 서열 또는 탈면역화된 변이체 중 어느 하나로 개시된 것으로 간주되어야 한다.
<표 4>
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
음영 = 독소
EVQL... = VH 도메인, 밑줄 = HCDR 1 - 3
DIQL...= VL 도메인, 밑줄 = LCDR 1 - 3
QIVL...= VL 도메인, 밑줄 = LCDR 1 - 3
APELL... = CH2 도메인
GQPRE... = CH3 도메인
RTVAAP... = CL1 도메인
기울임꼴 = 링커 또는 절단 부위
SEQUENCE LISTING <110> ATB Therapeutics <120> Recombinant immunotoxin comprising a ribotoxin or hRNASe <130> AD42605 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 624 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 1 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln 145 150 155 160 Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn 165 170 175 Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 180 185 190 Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr 195 200 205 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly 210 215 220 Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ala Ala Ser Thr Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 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Thr Phe Pro Asp 565 570 575 Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys Pro Lys Glu Asn Pro Gly 580 585 590 Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly Ile 595 600 605 Ile Ala His Thr Lys Glu Asn Gln Gly Glu Leu Lys Leu Cys Ser His 610 615 620 <210> 2 <211> 625 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Trp Thr 465 470 475 480 Cys Leu Asn Asp Gln Lys Asn Pro Lys Thr Asn Lys Tyr Glu Thr Lys 485 490 495 Arg Leu Leu Tyr Asn Gln Asn Lys Ala Glu Ser Asn Ser His His Ala 500 505 510 Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr Pro His Trp Phe Thr 515 520 525 Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Gly Lys Leu Pro Lys Gly Arg Thr Pro Ile 530 535 540 Lys Phe Gly Lys Ser Asp Cys Asp Arg Pro Pro Lys His Ser Lys Asp 545 550 555 560 Gly Asn Gly Lys Thr Asp His Tyr Leu Leu Glu Phe Pro Thr Phe Pro 565 570 575 Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys Pro Lys Glu Asn Pro 580 585 590 Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly 595 600 605 Ile Ile Ala His Thr Lys Glu Asn Gln Gly Glu Leu Lys Leu Cys Ser 610 615 620 His 625 <210> 3 <211> 632 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 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515 520 525 Ser Tyr Pro His Trp Phe Thr Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Gly Lys Leu 530 535 540 Pro Lys Gly Arg Thr Pro Ile Lys Phe Gly Lys Ser Asp Cys Asp Arg 545 550 555 560 Pro Pro Lys His Ser Lys Asp Gly Asn Gly Lys Thr Asp His Tyr Leu 565 570 575 Leu Glu Phe Pro Thr Phe Pro Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser 580 585 590 Lys Lys Pro Lys Glu Asn Pro Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr 595 600 605 Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly Ile Ile Ala His Thr Lys Glu Asn Gln 610 615 620 Gly Glu Leu Lys Leu Cys Ser His 625 630 <210> 4 <211> 633 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 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285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp 465 470 475 480 Glu Gln Leu Ala Val Thr Trp Thr Cys Leu Asn Asp Gln Lys Asn Pro 485 490 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Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Ala Asp Thr Val Ile Cys Glu Pro His Gln Asp Thr Glu Thr 450 455 460 Gly Lys Ile Lys Lys Phe Lys Val Asp Val Gly Val Ala Glu Asp Gln 465 470 475 480 Ala Lys Lys Ala Gly Leu Thr Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Arg 485 490 495 Tyr Met Asn Gly Asp Lys Ile Asn Phe Gly Ile His Asn Cys Asp Lys 500 505 510 Glu Gly Ala Ile Leu Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Lys 515 520 525 Ala Glu Trp Met Lys Asp Glu Lys Thr Asp Arg Gln Pro Gly Gly Pro 530 535 540 Thr Pro Ile Arg Val Val Tyr Ala Asn Asn Asn Gly Asn Ile Val Tyr 545 550 555 560 Cys Gly Val Met Thr His Ala Val Val Lys Ser Asn Asn Gln Gly Glu 565 570 575 Lys Phe Phe Leu Lys Cys Thr 580 <210> 43 <211> 218 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 43 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu 20 25 30 Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 44 Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 45 Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 46 His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Leu Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 130 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 47 Ala Pro Ile Val Thr Cys Arg Pro Lys Leu Asp Gly Arg Glu Lys Pro 1 5 10 15 Phe Lys Val Asp Val Ala Thr Ala Gln Ala Gln Ala Arg Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Arg Tyr Phe Ala Gly Asp 35 40 45 His Ile Arg Trp Gly Val Asn Asn Cys Asp Lys Ala Asp Ala Ile Leu 50 55 60 Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Asn Ala Glu Trp Ala Lys 65 70 75 80 Asp Val Lys Thr Ser Gln Gln Lys Gly Gly Pro Thr Pro Ile Arg Val 85 90 95 Val Tyr Ala Asn Ser Arg Gly Ala Val Gln Tyr Cys Gly Val Met Thr 100 105 110 His Ser Lys Val Asp Lys Asn Asn Gln Gly Lys Glu Phe Phe Glu Lys 115 120 125 Cys Asp 130 <210> 48 <211> 133 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 48 Ala Asp Thr Val Ile Cys Glu Pro His Gln Asp Thr Glu Thr Gly Lys 1 5 10 15 Ile Lys Lys Phe Lys Val Asp Val Gly Val Ala Glu Asp Gln Ala Lys 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Thr Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Arg Tyr Met 35 40 45 Asn Gly Asp Lys Ile Asn Phe Gly Ile His Asn Cys Asp Lys Glu Gly 50 55 60 Ala Ile Leu Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Lys Ala Glu 65 70 75 80 Trp Met Lys Asp Glu Lys Thr Asp Arg Gln Pro Gly Gly Pro Thr Pro 85 90 95 Ile Arg Val Val Tyr Ala Asn Asn Asn Gly Asn Ile Val Tyr Cys Gly 100 105 110 Val Met Thr His Ala Val Val Lys Ser Asn Asn Gln Gly Glu Lys Phe 115 120 125 Phe Leu Lys Cys Thr 130 <210> 49 <211> 133 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 49 Ala Asp Thr Val Ile Cys Glu Pro His Gln Asp Thr Glu Thr Gly Lys 1 5 10 15 Ile Lys Lys Phe Lys Val Asp Val Gly Val Ala Glu Asp Gln Ala Lys 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Thr Thr Gly Lys Ser Gly Tyr Pro His Arg Tyr Met 35 40 45 Asn Gly Asp Lys Ile Asn Phe Gly Ile His Asn Cys Asp Lys Glu Gly 50 55 60 Ala Ile Leu Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Lys Ala Glu 65 70 75 80 Trp Met Lys Asp Glu Lys Thr Asp Arg Gln Pro Gly Gly Pro Thr Pro 85 90 95 Ile Arg Val Val Tyr Ala Asn Asn Asn Gly Asn Ile Val Tyr Cys Gly 100 105 110 Val Met Thr His Ala Val Val Lys Ser Asn Asn Gln Gly Glu Lys Phe 115 120 125 Phe Leu Lys Cys Thr 130 <210> 50 <211> 123 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 50 Gln Asp Asn Ser Arg Tyr Thr His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Lys Pro Gln Gly Arg Asp Asp Arg Tyr Cys Glu Ser Ile Met Arg Arg 20 25 30 Arg Gly Leu Thr Ser Pro Cys Lys Asp Ile Asn Thr Phe Ile His Gly 35 40 45 Asn Lys Arg Ser Ile Lys Ala Ile Cys Glu Asn Lys Asn Gly Asn Pro 50 55 60 His Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ser Lys Ser Ser Phe Gln Val Thr Thr 65 70 75 80 Cys Lys Leu His Arg Arg Ser Pro Trp Pro Pro Cys Gln Tyr Arg Ala 85 90 95 Thr Ala Gly Phe Arg Asn Val Val Val Ala Cys Glu Asn Gly Leu Pro 100 105 110 Val His Leu Asp Gln Ser Ile Phe Arg Arg Pro 115 120 <210> 51 <211> 133 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 51 Ala Asp Thr Val Ile Cys Glu Pro His Gln Asp Thr Glu Thr Gly Lys 1 5 10 15 Ile Lys Lys Phe Lys Val Asp Val Gly Val Ala Glu Asp Gln Ala Lys 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Ile Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Arg Tyr Met 35 40 45 Asn Gly Asp Lys Ile Asn Phe Gly Ile His Asn Cys Asp Lys Glu Gly 50 55 60 Ala Ile Leu Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Lys Ala Glu 65 70 75 80 Trp Met Lys Asp Glu Lys Thr Asp Arg Gln Pro Gly Gly Pro Thr Pro 85 90 95 Ile Arg Val Val Tyr Ala Asn Asn Asn Gly Asn Ile Val Tyr Cys Gly 100 105 110 Val Met Thr His Ala Val Val Lys Ser Asn Asn Gln Gly Glu Lys Phe 115 120 125 Phe Leu Lys Cys Thr 130 <210> 52 <211> 133 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 52 Ala Asp Thr Val Ile Cys Glu Pro Arg Gln Asp Thr Glu Thr Gly Lys 1 5 10 15 Ile Lys Lys Phe Lys Val Asp Val Gly Val Ala Glu Asp Gln Ala Lys 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Ile Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Arg Tyr Met 35 40 45 Asn Gly Asp Lys Ile Asn Phe Gly Ile His Asn Cys Asp Lys Glu Gly 50 55 60 Ala Ile Leu Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Lys Ala Glu 65 70 75 80 Trp Met Lys Asp Glu Lys Thr Asp Arg Gln Pro Gly Gly Pro Thr Pro 85 90 95 Ile Arg Val Val Tyr Ala Asn Asn Asn Gly Asn Ile Val Tyr Cys Gly 100 105 110 Val Met Thr His Ala Val Val Lys Ser Asn Asn Gln Gly Glu Lys Phe 115 120 125 Phe Leu Lys Cys Thr 130 <210> 53 <211> 133 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 53 Ala Asp Thr Val Ile Cys Glu Pro His Gln Asp Thr Glu Thr Gly Lys 1 5 10 15 Ile Lys Lys Phe Thr Val Asp Val Gly Val Ala Glu Asp Gln Ala Lys 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Thr Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Arg Tyr Met 35 40 45 Asn Gly Asp Asn Ile Asn Phe Gly Ile His Asn Cys Asp Lys Glu Gly 50 55 60 Ala Ile Leu Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Lys Ala Glu 65 70 75 80 Trp Lys Lys Asp Glu Lys Thr Asp Arg Gln Pro Gly Gly Pro Thr Pro 85 90 95 Leu Arg Val Val Tyr Ala Asn Asn Asn Gly Asn Ile Val Tyr Cys Gly 100 105 110 Val Met Thr His Ala Val Val Lys Ser Asn Asn Gln Gly Glu Lys Phe 115 120 125 Phe Leu Lys Cys Thr 130 <210> 54 <211> 135 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 54 Ala Glu Thr Val Gln Tyr Tyr Asn Ser Tyr Ser Asp Ala Ser Ile Ala 1 5 10 15 Ser Cys Ala Phe Val Asp Ser Gly Lys Asp Lys Ile Asp Lys Thr Lys 20 25 30 Leu Val Thr Tyr Thr Ser Arg Leu Ala Ala Ser Pro Ala Tyr Gln Lys 35 40 45 Val Val Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ile Val Pro Tyr 50 55 60 Val Arg Leu Asp Met Asp Asn Thr Gly Lys Gly Ile His Phe Asn Ala 65 70 75 80 Thr Lys Leu Ser Asp Ser Ser Ala Lys Leu Ala Ala Val Leu Lys Thr 85 90 95 Thr Val Ser Met Thr Glu Ala Gln Arg Thr Gln Leu Tyr Met Glu Tyr 100 105 110 Ile Lys Gly Ile Glu Asn Arg Ser Ala Gln Phe Ile Trp Asp Trp Trp 115 120 125 Arg Thr Gly Lys Ala Pro Ala 130 135 <210> 55 <211> 150 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 55 Ala Val Thr Trp Thr Cys Leu Asn Asp Gln Lys Asn Pro Lys Thr Asn 1 5 10 15 Lys Tyr Glu Thr Lys Arg Leu Leu Tyr Asn Gln Asn Lys Ala Glu Ser 20 25 30 Asn Ser His His Ala Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr 35 40 45 Pro His Trp Phe Thr Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Gly Lys Leu Pro Lys 50 55 60 Gly Arg Thr Pro Ile Lys Phe Gly Lys Ser Asp Cys Asp Arg Pro Pro 65 70 75 80 Lys His Ser Lys Asp Gly Asn Gly Lys Thr Asp His Tyr Leu Leu Glu 85 90 95 Phe Pro Thr Phe Pro Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys 100 105 110 Pro Lys Glu Asn Pro Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn 115 120 125 Lys Val Phe Cys Gly Ile Ile Ala His Thr Lys Glu Asn Gln Gly Glu 130 135 140 Leu Lys Leu Cys Ser His 145 150 <210> 56 <211> 150 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 56 Ala Val Thr Trp Thr Cys Leu Asn Thr Gln Lys Asn Pro Lys Thr Asn 1 5 10 15 Lys Tyr Glu Thr Lys Arg Leu Leu Tyr Asn Gln Asn Lys Ala Glu Ser 20 25 30 Asn Ser His His Ala Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr 35 40 45 Pro His Trp Phe Thr Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Gly Lys Leu Pro Lys 50 55 60 Gly Arg Thr Pro Ile Lys Phe Gly Lys Ser Asp Cys Asp Arg Pro Pro 65 70 75 80 Lys His Ser Lys Asp Gly Asn Gly Lys Thr Asp His Tyr Leu Leu Glu 85 90 95 Phe Pro Thr Phe Pro Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys 100 105 110 Pro Lys Glu Asn Pro Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn 115 120 125 Lys Val Phe Cys Gly Ile Ile Ala His Thr Lys Glu Asn Thr Gly Glu 130 135 140 Leu Lys Leu Cys Ser His 145 150 <210> 57 <211> 128 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 57 Lys Glu Ser Arg Ala Lys Lys Phe Gln Arg Gln His Met Asp Ser Asp 1 5 10 15 Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Cys Asn Gln Met Met Arg Arg 20 25 30 Arg Asn Met Thr Gln Gly Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val His 35 40 45 Glu Pro Leu Val Asp Val Gln Asn Val Cys Phe Gln Glu Lys Val Thr 50 55 60 Cys Lys Asn Gly Gln Gly Asn Cys Tyr Lys Ser Asn Ser Ser Met His 65 70 75 80 Ile Thr Asp Cys Arg Leu Thr Asn Gly Ser Arg Tyr Pro Asn Cys Ala 85 90 95 Tyr Arg Thr Ser Pro Lys Glu Arg His Ile Ile Val Ala Cys Glu Gly 100 105 110 Ser Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val Glu Asp Ser Thr 115 120 125 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 58 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 59 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe 1 5 10 15 Lys Gly <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 60 Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 61 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn 1 5 10 15 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 62 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 63 Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 64 Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 65 Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 66 Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 67 Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 68 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Recombinant immunotoxin, antibody CDR, linker or toxin <400> 69 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro 1 5

Claims (19)

  1. 아니소플린, 또는 이의 활성 단편, 바람직하게는 서열번호 48 또는 49에 따른 서열을 포함하는, 또는 그와 66% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 동족체를 포함하는 결합제-독소 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 결합제는,
    ·항체
    ·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
    ·항체 모방체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합제-독소 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 결합제, 또는 이의 도메인을 상기 독소와, 또는 상기 독소에 포함된 절단 가능한 도메인과 연결하는 펩타이드 링커를 포함하는 결합제-독소 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서
    ·상기 펩타이드 링커 또는 상기 절단가능한 도메인은 포유동물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 포유동물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 특이적 또는 비특이적으로 절단가능하고, 및/또는
    ·상기 펩타이드 링커 또는 상기 절단가능한 도메인은 식물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 식물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 절단가능하지 않고, 및/또는
    ·상기 결합제-독소 융합 단백질은 형질감염된 식물 세포 또는 형질감염된 전체 식물에서 발현되는,
    결합제-독소 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 결합제가 인간 CD20 또는 인간 CD79B에 결합하는 독소 결합제 융합 단백질.
  6. 결합제-독소 융합 단백질에 있어서, 상기 결합제-독소 융합 단백질은 적어도:
    a)
    ·항체
    ·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
    ·항체 모방체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 단백질 결합제,
    b)RNAse, 리보톡신 또는 각각의 프로톡신, 및
    c)선택적으로, 바인더 또는 이의 도메인을 독소와, 또는 상기 프로톡신 내에 포함되어 있는 절단가능한 도메인과 연결하는 펩타이드 링커
    를 포함하고,
    여기서, 상기 결합제-독소 융합단백질은,
    ·(scFv-FC)-(링커)-독소 (이량체)
    ·2 개의 HC와 2 개의 LC- (링커) - 독소의 사량체
    ·2 개의 LC 및 2 개의 HC- (링커) - 독소의 사량체, 또는
    ·2 개의 LC- (링커) - 독소 및 2 개의 HC- (링커) - 독소의 사량체,
    여기서, 상기 링커는 선택적이고,
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 포맷 중 하나인, 독소 결합제 융합 단백질.
  7. 결합제-독소 융합 단백질에 있어서,
    a)
    ·항체
    ·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
    ·항체 모방체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 단백질 결합제
    b)RNAse, 리보톡신 또는 각각의 프로톡신, 및
    c) 선택적으로, 바인더 또는 이의 도메인을 독소와, 또는 상기 프로톡신 내에 포함되어 있는 절단가능한 도메인과 연결하는 펩타이드 링커
    를 포함하고,
    ·상기 프로톡신 내의 상기 펩타이드 링커 또는 상기 절단가능한 도메인은 포유동물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 포유동물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 특이적으로 또는 비특이적으로 절단가능함, 및/또는
    ·상기 프로톡신 내의 상기 펩타이드 링커 또는 상기 절단가능한 도메인은 식물 세포에 의해 발현되는 효소, 또는 식물 숙주에 의해 생성되는 효소에 의해 절단가능하지 않음 중 적어도 하나인 결합제-독소 융합 단백질.
  8. 결합제-독소 융합 단백질에 있어서, 상기 결합제-독소 융합 단백질은 적어도:
    a)
    ·항체
    ·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
    ·항체 모방체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 단백질 결합제,
    b)RNAse, 리보톡신 또는 각각의 프로톡신, 및
    c)선택적으로, 결합제, 또는 이의 도메인을 독소와, 또는 상기 프로톡신에 포함된 절단가능한 도메인과 연결하는 펩타이드 링커
    를 포함하고,
    상기 결합제-독소 융합 단백질은 형질감염된 식물 세포 또는 형질감염된 식물 전체에서 발현되는 결합제-독소 융합 단백질.
  9. 결합제-독소 융합 단백질에 있어서, 상기 결합제-독소 융합 단백질은 적어도:
    a)
    ·항체
    ·표적 결합능을 유지하는 항체 단편 또는 유도체, 또는
    ·항체 모방체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 단백질 결합제,
    b)RNAse, 리보톡신 또는 각각의 프로톡신, 및
    c)선택적으로, 상기 결합제, 또는 이의 도메인을 독소와, 또는 상기 프로톡신에 포함된 절단가능한 도메인과 연결하는 펩타이드 링커
    를 포함하고,
    여기서, 상기 단백질 결합제는 인간 CD20 또는 인간 CD79b에 결합하는 결합제-독소 융합 단백질
  10. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리보톡신은:
    ·사르신
    ·레스트릭토신
    ·아니소플린
    ·히르수텔린
    ·클라빈,
    ·미토길린,
    ·아게리틴, 및
    ·기간틴
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 독소, 또는 그의 활성 단편인 것인 결합제-독소 융합 단백질.
  11. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNase는 독소, 또는 이들의 활성 단편으로,
    ·온코나제: 람피리나제, 프로그 르나아제(rnase)
    ·RNase 1: 췌장 리보뉴클레아제 (서열번호 57)
    ·RNase 2: 비분비성 리보뉴클레아제
    ·RNase 3: 호산구 양이온성 단백질
    ·RNase 4: 리보뉴클레아제 4
    ·RNase 5 : 안지오제닌 (서열번호 50)
    ·RNase 6: 리보뉴클레아제 K6/리보뉴클레아제 T2/리보뉴클레아제 K3
    ·RNase 7: 리보뉴클레아제 7/리보뉴클레아제 A E1, 및
    ·RNase 8 : 리보뉴클레아제 8
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합제-독소 융합 단백질.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제-독소 융합 단백질은 식물 숙주 또는 식물 세포에서 생성되는 결합제-독소 융합 단백질.
  13. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 숙주 또는 식물 세포가 니코티아나 속으로부터 유래하는 것인 결합제-독소 융합 단백질.
  14. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 프로톡신 내에 상기 절단가능한 링커 또는 상기 절단가능한 도메인은,
    a)엔도솜 및/또는 리소좀 프로테아제 절단 부위
    b)세포질 프로테아제 절단 부위, 및/또는
    c)세포 표면 프로테아제 절단 부위
    로부터 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 절단 부위를 포함하는 결합제-독소 융합 단백질.
  15. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 식물 특이적 N-글리칸을 포함하는 결합제-독소 융합 단백질.
  16. 전술한 청구항 중 어느 하나에 따른 결합제-독소 융합 단백질, 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. (i) 제1항 내지 제15항의 상기 결합제-독소 융합 단백질 또는 제16항의 상기 약제학적 조성물, 및 (ii) 하나 이상의 추가의 치료적 활성 화합물을 포함하는 조합.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 상기 결합제-독소 융합 단백질, 또는 제16항의 상기 조성물, 또는 제17항의 상기 조합은,
    신생물성 질환에
    ·고통받는,
    ·발병 위험, 및/또는,
    ·진단 중이거나
    또는 그러한 상태를 상기 예방하기 위한 것으로,
    인간 또는 동물 대상체의 상기 치료(의약품의 제조)에 사용하기 위한, 결합제-독소 융합 단백질.
  19. 인간 또는 동물 피험자를 치료하는 방법에 있어서,
    신생물성 질환에
    ·고통받는,
    ·발병 위험, 및/또는,
    ·진단 중인,
    또는 그러한 상태를 예방하기 위한 것으로, 상기 방법은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 결합제-독소 융합 단백질, 제16항의 상기 조성물, 또는 제17항의 상기 조합의 치료적 유효량의 투여를 포함하는, 인간 또는 동물 대상체를 치료하는 방법.
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