KR20230042353A - 부분 수확을 이용한 바실루스의 산업적 발효 공정 - Google Patents

부분 수확을 이용한 바실루스의 산업적 발효 공정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산업적 발효 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 위한 발현 구축물을 포함하는 바실루스 숙주 세포를 발효 배지에 접종하는 단계, 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 탄소 공급원을 제공하는 단계, 및 배양 단계 동안 상이한 시점에서 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 일부분을 분리하고, 상기 일부분으로부터 대상 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 바실루스 숙주 세포로부터 대상 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

부분 수확을 이용한 바실루스의 산업적 발효 공정
본 발명은 산업적 발효 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 위한 발현 구축물을 포함하는 바실루스 숙주 세포를 발효 배지에 접종하는 단계, 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 탄소 공급원을 제공하는 단계, 및 배양 단계 동안 상이한 시점에서 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 일부분을 분리하고, 상기 일부분으로부터 대상 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 바실루스 숙주 세포로부터 대상 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
미생물은 대상 생성물, 특히 단백질, 및 특히 효소의 생산을 위한 산업적 주요 성분으로서 널리 사용된다. 대상 생성물의 생명공학적 생산은 생성물의 발효 및 후속 정제를 통해 수행된다. 바실루스 종과 같은 미생물은 상당한 양의 생성물을 발효 브로스에 분비할 수 있다. 이것은 세포내 생산에 비해서 간단한 생성물 정제 공정을 허용하며, 산업적 적용에서 바실루스의 성공을 설명한다.
미생물을 이용한 산업적 생물공정은 전형적으로 50 ㎥ 초과의 크기를 갖는 대규모 생산 생물반응기에서 수행된다. 상기 대규모 생물반응기에서의 발효 공정을 위해, 전형적으로 생물반응기에서 발효 브로스의 접종은 바실루스 세포의 사전 배양물로 수행된다. 사전 배양물은 바실루스 세포를 보다 작은 시드 발효기에서 배양함으로써 수득될 수 있다.
대규모 발효 공정은 통상적으로 생성될 대상 단백질의 성장 및 발현을 허용하는 조건 하에서 접종된 바실루스 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 전형적으로, 바실루스 세포는 복잡한 또는 정의된 발효 배지에서 성장하며, 탄소 공급원은 배양 동안에 일정한 또는 다양한 양으로 공급될 것이다.
대규모 생물반응기에서 상기 배양 동안에 바실루스 세포에 의해 생성되는 대상 단백질의 수율을 증가시키는 것을 목표로 하는 상이한 접근법이 보고되었다. 이들 접근법은, 예를 들어 배지의 조성의 변화와 관련이 있다. 탄소 제한 유가 발효에서, 탄소 공급원 첨가 속도 (탄소 공급 속도라고도 함) 는 생물량의 질량 당 특정한 기질 흡수 속도 및 생물량의 특정한 성장 속도를 결정한다. 그러므로, 다른 접근법은 특정한 기질 흡수 및 성장 속도의 증가와 관련이 있다.
그러나, 대규모 산업적 발효 공정에서 수율을 추가로 증가시키기 위한 수단이 매우 요구된다.
본 발명의 근본적인 기술적 과제는 상기에서 언급한 필요성을 충족시키기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다. 이것은 하기의 청구범위 및 본원에서 특징지어지는 구현예에 의해 해결될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 바실루스 숙주 세포로부터 대상 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다:
(a) 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 위한 발현 구축물을 포함하는 바실루스 숙주 세포를 발효 배지에 접종하는 단계;
(b) 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 탄소 공급원을 제공하는 단계; 및
(c) 배양 단계 동안 상이한 시점에서 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 일부분을 분리하고, 상기 일부분으로부터 대상 단백질을 수득하는 단계.
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 "부정관사" 또는 "정관사" 는 사용되는 문맥에 따라 하나 이상을 의미할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어 "세포" 에 대한 언급은 하나 이상의 세포가 이용될 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "하나 이상" 은 상기 용어 다음에 언급된 하나 이상의 항목이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 상기 용어가 하나 이상의 공급 용액이 사용되어야 한다는 것을 나타내는 경우, 이것은 하나의 공급 용액 또는 하나 초과의 공급 용액, 즉, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 임의의 다른 개수의 공급 용액으로서 이해될 수 있다. 항목에 따라, 용어는 해당 용어가 참조할 수 있는 상한 (있는 경우) 에 대해 당업자가 이해하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약" 은 상기 용어 뒤에 인용된 임의의 수에 대해, 기술적 효과가 달성될 수 있는 간격 정확도가 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 언급된 바와 같은 약은 바람직하게는 ± 20 %, 바람직하게는 ± 15 %, 보다 바람직하게는 ± 10 %, 또는 더욱 바람직하게는 ± 5 % 의 정확한 수치 또는 상기 정확한 수치 부근의 범위를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포함하는" 은 제한적인 의미로 이해되지 않아야 한다. 상기 용어는 오히려 언급된 실제 항목보다 많은 항목이 존재할 수 있다는 것을 나타내며, 예를 들어 이것이 특정한 단계를 포함하는 방법을 지칭하는 경우, 추가 단계의 존재가 배제되지 않아야 한다. 그러나, 상기 용어는 또한 언급된 항목 만이 존재하는 구현예를 포함하며, 즉, 이것은 "로 이루어지는" 의 의미에서 제한적인 의미를 가진다.
따라서, 본 발명은 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 대상 단백질을 생산하는데 적용될 수 있는 방법을 제공한다. 상기 방법은 특히 바실루스 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이것은 실험실 및 산업적 규모의 발효 공정 모두에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따라서 언급되는 바와 같은 "산업적 발효" 는 초기 발효 배지 1 리터 당 200 g 이상의 탄소 공급원이 첨가되는 배양 방법을 의미한다.
본 발명에 따른 방법은 또한 추가의 단계를 포함할 수 있다. 이러한 추가의 단계는 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 수득된 대상 단백질을 처리하는 추가의 단계 또는 배양과 관련된 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "생산하는" 은 발현 구축물로부터 바실루스 숙주 세포 배양물에서 대상 단백질을 발현하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 상기 대상 단백질을 수득하는 것을 또한 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 대상 단백질을 제조하는데 적용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "배양하는" 또는 "배양" 은 배양물에 포함된 바실루스 세포를 적어도 소정의 시간 동안 생존 및/또는 증식시키는 것을 의미한다. 상기 용어는 접종 후의 성장 개시 시에 기하급수적인 세포 성장 단계 뿐만 아니라, 정지 성장 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 제 1 단계로서, 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 위한 발현 구축물을 포함하는 바실루스 숙주 세포를 발효 배지에 접종한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "접종하는" 은 배양에 사용된 발효 배지에 바실루스 숙주 세포를 도입하는 것을 의미한다. 발효 배지에 대한 바실루스 숙주 세포의 접종은 사전 배양물 (종균 배양물) 의 바실루스 숙주 세포를 도입함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 발효는 당업자에게 공지된 조건 하에서 성장된 사전 배양물로 접종된다. 사전 배양물은 화학적으로 정의된 사전 배양물 배지 또는 복합 사전 배양물 배지일 수 있는 사전 배양물 배지에서 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 사전 배양물 배지는 본 발명의 방법에서 배양에 사용된 발효 배지와 동일하거나 상이할 수 있다. 복합 사전 배양물 배지는 복합 질소 및/또는 복합 탄소 공급원을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 접종에 사용된 사전 배양물은 복합 배양물 배지를 사용함으로써 수득된다. 사전 배양물은 주요 발효 배지에 전부 또는 부분적으로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 사전 배양물에서의 바실루스 숙주 세포는 활발하게 성장하는 세포이며, 즉, 이들은 세포의 수가 증가하는 단계에 있다. 전형적으로, 사전 배양물에서의 세포는 유도기에서 사전 배양물의 접종을 받으며, 시간이 경과함에 따라 기하급수적인 성장기로 전환된다. 바람직하게는, 기하급수적인 성장기에서의 세포는 발효 배지의 접종을 위한 사전 배양물로부터 사용된다. 접종에 사용되는 사전 배양물과 주요 발효 배지 사이의 부피비는 바람직하게는 0.1 내지 30 % (v/v) 이다.
용어 "바실루스 숙주 세포" 는 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 위한 발현 구축물에 대해 숙주로서 기능하는 바실루스 세포를 의미한다. 상기 발현 구축물은 자연적으로 발생하는 발현 구축물, 재조합적으로 도입된 발현 구축물, 또는 바실루스 세포에서 유전적으로 변형된 자연적으로 발생하는 발현 구축물일 수 있다. 바실루스 숙주 세포는 박테리아 속 바실루스의 임의의 구성원으로부터의 숙주 세포, 바람직하게는 바실루스 리체니포르미스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리케파시엔스, 바실루스 브레비스, 바실루스 서큘란스, 바실루스 클라우시이, 바실루스 코아굴란스, 바실루스 피르무스, 바실루스 자우투스, 바실루스 렌투스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 스테아로서모필루스, 바실루스 투린기엔시스 또는 바실루스 벨레젠시스의 숙주 세포일 수 있다. 보다 바람직하게는, 바실루스 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스, 바실루스 푸밀루스 또는 바실루스 서브틸리스 숙주 세포, 더욱 바람직하게는 바실루스 리체니포르미스 또는 바실루스 서브틸리스 숙주 세포, 가장 바람직하게는 바실루스 리체니포르미스 숙주 세포이다. 특히 바람직하게는, 바실루스 리체니포르미스는 ATCC (American Type Culture Collection) 번호 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53926, ATCC 53757, ATCC 55768, 및 DSMZ 번호 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259 및 DSM 26543 으로 기탁된 바와 같은 바실루스 리체니포르미스로 이루어진 군에서 선택된다.
전형적으로, 숙주 세포는 ATCC (American Type Culture Collection) 번호 14580 으로 기탁된 바와 같은 바실루스 리체니포르미스 균주의 숙주 세포와 같은 종 바실루스 리체니포르미스에 속한다 (DSM 13 과 동일, 문헌 [Veith et al. "The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM 13, an organism with great industrial potential." J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2004) 7:204-211] 참조). 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 31972 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53757 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 55768 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 394 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 641 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 1913 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 11259 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 26543 의 숙주 세포일 수 있다.
바람직하게는, 바실루스 리체니포르미스 균주는 바실루스 리체니포르미스 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53757, ATCC 53926, ATCC 55768, DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259 및 DSM 26543 으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 방법에서 적용되는 바실루스 숙주 세포는 상기 숙주 세포에 의해 발현될 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 위한 발현 구축물을 포함해야 한다. 본원에서 언급된 바와 같은 용어 "발현 구축물" 은 발현 제어 서열, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 대상 단백질을 코팅하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 본원에서 언급된 바와 같은 프로모터는 상기 유전자의 전사를 가능하게 하는 유전자와 동일한 스트랜드 상의 유전자의 업스트림에 위치한 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터 다음에는 유전자의 전사 개시 부위가 이어진다. 프로모터는 전형적으로 전사를 개시하는 필요한 전사 인자와 함께 RNA 폴리머라아제에 의해 인식된다. 프로모터의 기능적 단편 또는 기능적 변이체는, RNA 폴리머라아제에 의해 인식 가능하며 전사를 개시할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터의 기능적 단편 또는 기능적 변이체는 또한 본 발명의 의미에서 프로모터로서 포함된다. 프로모터는 이의 활성이 활성화 신호 분자, 즉, 유도물질 분자의 존재에 의존하는 유도물질 의존성 프로모터일 수 있거나, 또는 유도물질-독립성 프로모터, 즉, 발효 배지에 첨가된 유도물질 분자의 존재에 의존하지 않으며, 구성적으로 활성이거나, 또는 발효 배지에 첨가된 유도물질 분자의 존재와 관계없이 활성이 증가될 수 있는 프로모터일 수 있다.
바람직하게는, 프로모터는 aprE 프로모터 (바실루스 서브틸리신 Carlsberg 프로테아제를 코팅하는 유전자로부터의 네이티브 프로모터), 바실루스 아밀로리케파시엔스로부터의 amyQ 프로모터, 바실루스 리체니포르미스로부터의 amyL 프로모터 및 이의 변이체 (바람직하게는 US 5698415 에 기재된 바와 같음), 박테리오파지 SPO1 프로모터, 바람직하게는 프로모터 P4, P5 또는 P15 (바람직하게는 WO 2015118126 또는 문헌 [Stewart, C. R., Gaslightwala, I., Hinata, K., Krolikowski, K. A., Needleman, D. S., Peng, A. S., Peterman, M. A., Tobias, A., and Wei, P. 1998, Genes and regulatory sites of the "host-takeover module" in the terminal redundancy of Bacillus subtilis bacteriophage SPO1. Virology 246(2), 329-340] 에 기재된 바와 같음), 바실루스 투린기엔시스로부터의 cryIIIA 프로모터 (바람직하게는 WO 9425612 또는 문헌 [Agaisse, H. and Lereclus, D. 1994. Structural and functional analysis of the promoter region involved in full expression of the cryIIIA toxin gene of Bacillus thuringiensis. Mol.Microbiol. 13(1). 97-107] 에 기재된 바와 같음), 및 이들의 조합, 및 이들의 활성 단편 또는 변이체의 프로모터 서열로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 프로모터 서열은 본원에서 기재된 바와 같이, 숙주 세포에 고유한 또는 이종인 5'-UTR 서열과 조합될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 veg 프로모터, lepA 프로모터, serA 프로모터, ymdA 프로모터, fba 프로모터, aprE 프로모터, amyQ 프로모터, amyL 프로모터, 박테리오파지 SPO1 프로모터, cryIIIA 프로모터, 이들의 조합, 및 이들의 활성 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 프로모터 서열은 aprE 프로모터, amyL 프로모터, veg 프로모터, 박테리오파지 SPO1 프로모터 및 cryIIIA 프로모터, 및 이들의 조합, 또는 이들의 활성 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 프로모터는 aprE 프로모터, SPO1 프로모터, 바람직하게는 P4, P5 또는 P15 (바람직하게는 WO 15118126 에 기재된 바와 같음), 프로모터 서열 amyl 및 amyQ 를 포함하는 탄뎀 프로모터 (바람직하게는 WO 9943835 에 기재된 바와 같음), 및 프로모터 서열 amyL, amyQ 및 cryIIIa 를 포함하는 삼중 프로모터 (바람직하게는 WO 2005098016 에 기재된 바와 같음) 로 이루어진 군에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 프로모터는 aprE 프로모터, 바람직하게는 바실루스 아밀로리케파시엔스, 바실루스 클라우시이, 바실루스 할로두안스, 바실루스 렌투스, 바실루스 리체니포르미스, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 벨레젠시스로부터의, 보다 바람직하게는 바실루스 리체니포르미스, 바실루스 푸밀루스 또는 바실루스 서브틸리스로부터의, 가장 바람직하게는 바실루스 리체니포르미스로부터의 aprE 프로모터이다.
본 발명의 방법에 따라서 사용되는 프로모터의 활성은 바람직하게는 열 유도성 요소에 의존하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에 따라서 발현 제어 서열로서 사용될 프로모터는 바람직하게는 온도에 민감하지 않은 프로모터이며 및/또는 열 유도성 요소가 결여되어 있다.
또한, 상기 발현 구축물은 번역의 적절한 종결에 필요한 추가의 요소, 또는 상기 발현 구축물의 삽입, 안정화, 숙주 세포에의 도입 또는 복제에 필요한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 특히 5'-UTR (리더 서열이라고도 함), 리보솜 결합 부위 (RBS, Shine-Dalgarno 서열), 3'-UTR, 전사 개시 및 정지 부위 및, 발현 구축물의 성질에 따라, 복제의 기원, 통합 부위 등을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 구축물 및/또는 발현 벡터는 5'-UTR 및 RBS 를 포함한다. 바람직하게는, 5'-UTR 은 aprE, grpE, ctoG, SP82, gsiB, cryIIa 및 ribG 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 제어 서열에서 선택된다.
그러나, 발현 구축물은 또한 대상 단백질을 코팅하는 핵산 서열을 포함해야 한다. 본원에서 언급된 바와 같은 "대상 단백질" 은 바실루스 숙주 세포에서 생산되도록 의도되는 임의의 단백질, 펩티드 또는 이들의 단편을 의미한다. 따라서, 단백질은 폴리펩티드, 펩티드, 이들의 단편, 뿐만 아니라, 융합 단백질 등을 포함한다.
바람직하게는, 대상 단백질은 효소이다. 특정한 구현예에 있어서, 효소는 옥시도리덕타아제 (EC 1), 트랜스퍼라아제 (EC 2), 하이드롤라아제 (EC 3), 리아제 (EC 4), 이소머라아제 (EC 5) 또는 리가아제 (EC 6) (문헌 [Enzyme Nomenclature, Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology including its supplements published 1993-1999] 에 따른 EC 번호 지정) 로서 분류된다. 바람직한 구현예에 있어서, 대상 단백질은 세제에서 사용하기에 적합한 효소이다.
가장 바람직하게는, 효소는 하이드롤라아제 (EC 3), 바람직하게는 글리코시다아제 (EC 3.2) 또는 펩티다아제 (EC 3.4) 이다. 특히 바람직한 효소는 아밀라아제 (특히 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1)), 셀룰라아제 (EC 3.2.1.4), 락타아제 (EC 3.2.1.108), 만나나아제 (EC 3.2.1.25), 리파아제 (EC 3.1.1.3), 피타아제 (EC 3.1.3.8), 뉴클레아제 (EC 3.1.11 내지 EC 3.1.31) 및 프로테아제 (EC 3.4) 로 이루어진 군에서 선택되는 효소; 특히 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 만나나아제, 피타아제, 자일라나아제, 포스파타아제, 글루코아밀라아제, 뉴클레아제 및 셀룰라아제, 바람직하게는 아밀라아제 또는 프로테아제, 바람직하게는 프로테아제로 이루어진 군에서 선택되는 효소이다. 세린 프로테아제 (EC 3.4.21), 바람직하게는 서브틸리신 프로테아제가 가장 바람직하다.
각각의 발현 제어 서열, 대상 단백질을 코팅하는 핵산 서열 및/또는 상기에서 언급한 추가의 요소는 바실루스 숙주 세포로부터 유래할 수 있거나, 또는 또다른 종, 즉, 상기 바실루스 숙주 세포에 대해서 이종성인 종으로부터 유래할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
또한, 발현 구축물은 바실루스 숙주 세포의 게놈에 고유한, 즉, 내생적으로 존재하는 대상 유전자 및 발현 제어 서열 및/또는 상기에서 명시한 추가의 요소의 배열일 수 있다. 또한, 상기 용어는, 예를 들어 게놈 편집 및/또는 돌연변이유발 기술에 의해 유전자 조작된 이러한 네이티브 발현 구축물을 또한 포함한다.
발현 구축물은 또한 외생적으로 도입된 발현 구축물일 수 있다. 외생적으로 도입된 발현 구축물에 있어서, 발현 제어 서열, 대상 단백질을 코딩하는 유전자 및/또는 추가의 요소는 숙주 세포에 대해서 천연일 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 유래할 수 있으며, 즉, 바실루스 숙주 세포에 대해서 이종성일 수 있다. 바실루스 숙주 세포에의 발현 구축물의 도입은 특히 충분히 공지된 형질전환, 형질감염, 형질도입 및 접합 기술 등을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 본 발명에 따라서 달성될 수 있다. 바람직하게는, 외생적으로 도입된 발현 구축물은 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 포함된다. 발현 벡터는 바람직하게는 바실루스 숙주 세포의 염색체 DNA 의 외부에 위치할 수 있으며, 즉, 하나 이상의 카피로 에피솜에 존재할 수 있다. 그러나, 발현 벡터는 또한 바람직하게는 하나 이상의 카피로 바실루스 세포의 염색체 DNA 에 통합될 수 있다. 발현 벡터는 선형 또는 원형일 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다.
자율 복제를 위해, 발현 벡터는 벡터가 해당 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있게 하는 복제의 기원을 추가로 포함할 수 있다. 복제의 박테리아 기원은 바실루스에서 복제를 허용하는 플라스미드 pUB110, pC194, pTB19, pAMß1 및 pTA1060 (문헌 [Janniere, L., Bruand, C., and Ehrlich, S.D. (1990). Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors. Gene 87, 53-6; Ehrlich, S.D., Bruand, C., Sozhamannan, S., Dabert, P., Gros, M.F., Janniere, L., and Gruss, A. (1991). Plasmid replication and structural stability in Bacillus subtilis. Res. Microbiol. 142, 869-873]), 및 pE194 (문헌 [Dempsey, L.A. and Dubnau, D.A. (1989). Localization of the replication origin of plasmid pE194. J. Bacteriol. 171, 2866-2869]) 의 복제의 기원을 비제한적으로 포함한다. 복제의 기원은 숙주 세포에서 이의 기능을 온도에 민감하게 만드는 돌연변이를 갖는 것일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433-1436] 참조). 그러나, 발현 벡터는 바람직하게는 형질전환된 바실루스 숙주 세포의 용이한 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함한다. 선택 가능한 마커는 살생물제 내성, 중금속에 대한 내성, 영양 요구체에 대한 원영양성 등을 제공하는 생성물을 코딩하는 유전자이다. 박테리아 선택 가능한 마커는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리체니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 에리스로마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커를 비제한적으로 포함한다. 또한, 선택은, 예를 들어 WO 9109129 에 기재된 바와 같이, 선택 가능한 마커가 별도의 벡터 상에 있는 동시 형질전환에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "배양 단계" 는 하나 이상의 공급 용액의 첨가하에서 배양이 수행되는 기간을 의미한다. 상기 하나 이상의 공급 용액은 탄소 공급원을 제공한다. 탄소 공급원은 배양 단계 동안 바람직하게는 일정한 또는 다양한 속도로, 전형적으로 증가하는 속도로 제공될 수 있다. 본 발명에 따라서 예상되는 탄소 공급원을 제공하기 위한 특히 바람직한 프로파일은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 또한, 배양 단계 동안, 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건이 배양물에 적용된다. 바람직한 조건은 본원의 다른 곳에 상세히 기재되어 있다.
바람직하게는 발효 배지의 접종 후 및 제 1 배양 단계 전에 바실루스 숙주 세포 배양물에서 하나 이상의 탄소 공급원이 고갈된다. 이것은 당업자에게 충분히 공지된 배양 기술에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 고갈은 센서에 의해 제공되는 용존 산소 값의 급격한 상승 또는 pH 의 상승을 관찰함으로써 검출될 수 있다. 보다 바람직하게는, 고갈은 10 % 이상의 용존 산소 (DO) 의 상승 및/또는 0.1 단위 이상의 pH 의 상승을 특징으로 한다. 또한, 바람직하게는 고갈은 탄소 공급원의 대부분이 상기 사전 배양물 부피보다 적어도 3.33 배 더 높은 부피로 배양함으로써 소비된 사전 배양물로의 접종에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발효 배지" 는 세포의 성장을 지원할 수 있는 하나 이상의 화학적 화합물을 함유하는 수성 용액을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발효 배지는 복합 발효 배지 또는 화학적으로 정의된 발효 배지이다.
본원에서 사용된 바와 같은 복합 발효 배지는 복합 영양소 공급원을 발효 배지의 0.5 내지 30 % (w/v) 의 양으로 포함하는 발효 배지를 의미한다. 복합 영양소 공급원은 화학적으로 정의되지 않은 화합물, 즉, 이들의 화학식에 의해 알려지지 않은, 바람직하게는 정의되지 않은 유기 질소- 및/또는 탄소-함유 화합물을 포함하는 화합물로 구성된 영양소 공급원이다. 이와 대조적으로, "화학적으로 정의된 영양소 공급원" (예를 들어, "화학적으로 정의된 탄소 공급원" 또는 "화학적으로 정의된 질소 공급원") 은 화학적으로 정의된 화합물로 구성된 영양소 공급원에 사용되는 것으로 이해된다. 화학적으로 정의된 성분은 이의 화학식에 의해 알려진 성분이다. 복합 질소 공급원은 하나 이상의 화학적으로 정의되지 않은 질소 함유 화합물, 즉, 이들의 화학식에 의해 알려지지 않은, 바람직하게는 유기 질소 함유 화합물을 포함하는 질소 함유 화합물로 구성된 영양소 공급원, 예를 들어 조성이 알려지지 않은 단백질 및/또는 아미노산이다. 복합 탄소 공급원은 하나 이상의 화학적으로 정의되지 않은 탄소 함유 화합물, 즉, 이들의 화학식에 의해 알려지지 않은, 바람직하게는 유기 탄소 함유 화합물을 포함하는 탄소 함유 화합물로 구성된 탄소 공급원, 예를 들어 조성이 알려지지 않은 탄수화물이다. 복합 영양소 공급원이 상이한 복합 영양소 공급원의 혼합물일 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 따라서, 복합 질소 공급원은 복합 탄소 공급원을 포함할 수 있고, 그 반대도 가능하며, 복합 질소 공급원은 이것이 탄소 공급원으로서 기능하는 방식으로 세포에 의해 대사될 수 있고, 그 반대도 가능하다.
바람직하게는, 복합 영양소 공급원은 복합 질소 공급원이다. 복합 질소 공급원은 비제한적으로 단백질 함유 물질, 예컨대 미생물, 동물 또는 식물 세포로부터의 추출물, 예를 들어 식물성 단백질 제제, 대두 밀, 옥수수 밀, 완두콩 밀, 옥수수 글루텐, 목화 밀, 땅콩 밀, 감자 밀, 육류, 카세인, 젤라틴, 유장, 어류 밀, 효모 단백질, 효모 추출물, 트립톤, 펩톤, 박토-트립톤, 박토-펩톤, 미생물 세포, 식물, 육류 또는 동물체의 가공시의 폐기물, 및 이들의 조합을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 복합 질소 공급원은 식물성 단백질, 바람직하게는 감자 단백질, 대두 단백질, 옥수수 단백질, 땅콩, 목화 단백질 및/또는 완두콩 단백질, 카세인, 트립톤, 펩톤 및 효모 추출물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는, 발효 배지는 또한 정의된 배지 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발효 배지는 또한 정의된 질소 공급원을 포함한다. 무기 질소 공급원의 예는 암모늄, 니트레이트 및 니트라이트, 및 이들의 조합이다. 바람직한 구현예에 있어서, 발효 배지는 질소 공급원을 포함하며, 여기에서 질소 공급원은 복잡한 또는 정의된 질소 공급원 또는 이의 조합이다. 하나의 구현예에 있어서, 정의된 질소 공급원은 암모니아, 암모늄, 암모늄 염 (예를 들어, 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 술페이트, 암모늄 아세테이트), 우레아, 니트레이트, 니트레이트 염, 니트라이트 및 아미노산, 바람직하게는 글루타메이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는, 복합 영양소 공급원은 발효 배지의 2 내지 15 % (v/w) 의 양이다. 또다른 구현예에 있어서, 복합 영양소 공급원은 발효 배지의 3 내지 10 % (v/w) 의 양이다.
또한, 바람직하게는 복합 발효 배지는 추가로 탄소 공급원을 포함할 수 있다. 탄소 공급원은 바람직하게는 복잡한 또는 정의된 탄소 공급원 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 복합 영양소 공급원은 탄수화물 공급원을 포함한다. 다양한 당 및 당-함유 물질이 탄소의 적합한 공급원이며, 당은 중합의 여러 단계에서 존재할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 복합 탄소 공급원은 당밀, 옥수수 침지액, 감자당, 덱스트린, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로오스 가수분해물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 정의된 탄소 공급원은 탄수화물, 유기 산 및 알코올, 바람직하게는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 자일로오스, 아라비노오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 글리세롤, 이노시톨, 만니톨 및 소르비톨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 정의된 탄소 공급원은 시럽의 형태로 제공되며, 이는 최대 20 %, 바람직하게는 최대 10 %, 보다 바람직하게는 최대 5 % 의 불순물을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 탄소 공급원은 사탕무 시럽, 사탕수수 시럽, 옥수수 시럽, 바람직하게는 고급 프룩토오스 옥수수 시럽이다. 또다른 구현예에 있어서, 복합 탄소 공급원은 당밀, 옥수수 침지액, 덱스트린 및 전분, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되며, 정의된 탄소 공급원은 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 자일로오스, 아라비노오스, 수크로오스, 말토오스, 덱스트린, 락토오스, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는, 발효 배지는 복합 질소 및 복합 탄소 공급원을 포함하는 복합 배지이다. 보다 바람직하게는, 발효 배지는 복합 질소 및 탄소 공급원을 포함하는 복합 배지이며, 여기에서 복합 질소 공급원은 WO 2004/003216 에 기재된 바와 같이 부분적으로 가수분해될 수 있다.
그러나, 발효 배지는 전형적으로 수소 공급원, 산소 공급원, 황 공급원, 인 공급원, 마그네슘 공급원, 나트륨 공급원, 칼륨 공급원, 미량 원소 공급원, 및 본원의 다른 곳에 추가로 기재된 바와 같은 비타민 공급원을 또한 포함할 수 있다.
또다른 구현예에 있어서, 발효 배지는 화학적으로 정의된 발효 배지일 수 있다. 화학적으로 정의된 발효 배지는 알려진 농도의 화학적으로 정의된 성분으로 본질적으로 구성된 발효 배지이다. 화학적으로 정의된 성분은 이의 화학식에 의해 알려진 성분이다. 화학적으로 정의된 성분으로 본질적으로 구성된 발효 배지는 복합 영양소 공급원을 함유하지 않는, 특히 복합 탄소 및/또는 복합 질소 공급원을 함유하지 않는, 즉, 화학적으로 정의되지 않은 조성을 갖는 복합 원료를 함유하지 않는 배지를 포함한다. 화학적으로 정의된 성분으로 본질적으로 구성된 발효 배지는 본질적으로 소량의 복합 영양소 공급원, 예를 들어 복합 질소 및/또는 탄소 공급원을 하기에 정의된 바와 같은 양으로 포함하는 배지를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 전형적으로 바실루스 숙주 세포의 성장을 유지하는데 충분하지 않으며 및/또는 충분한 양의 생물량의 형성을 보장하는데 충분하지 않은 양이다.
이와 관련하여, 복합 원료는, 예를 들어 이들 원료가 복합 헤테로중합체성 화합물을 포함하는 많은 상이한 화합물을 함유하며, 계절적 변화 및 지리적 기원의 차이로 인해 다양한 조성을 갖는다는 사실 때문에, 화학적으로 정의되지 않은 조성을 가진다. 발효에서 복합 탄소 및/또는 질소 공급원으로서 기능하는 복합 원료의 전형적인 예는 대두 밀, 목화씨 밀, 옥수수 침지액, 효모 추출물, 카세인 가수분해물, 당밀 등이다. 본질적으로 소량의 복합 탄소 및/또는 질소 공급원은, 예를 들어 주요 발효를 위한 접종물로부터의 잔재로서 본 발명에 따른 화학적으로 정의된 발효 배지에 존재할 수 있다. 주요 발효를 위한 접종물은 화학적으로 정의된 배지 상에서 발효에 의해 반드시 수득되는 것은 아니다. 대부분의 경우, 접종물로부터의 잔재는 주요 발효의 화학적으로 정의된 발효 배지에서의 소량의 복합 질소 공급원의 존재를 통해 감지할 수 있을 것이다. 복합 탄소 및/또는 질소 공급원과 같은 소량의 복합 배지 성분은 또한 소량의 이들 복합 성분을 발효 배지에 첨가함으로써 발효 배지에 도입될 수 있다. 예를 들어 생물량의 형성을 가속화하기 위해서, 즉, 미생물의 성장 속도를 증가시키고 및/또는 내부 pH 조절을 용이하게 하기 위해서, 주요 발효를 위한 접종물의 발효 공정에서 복합 탄소 및/또는 질소 공급원을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 동일한 이유로, 특히 발효 공정의 초기 단계에서 생물량 형성을 가속화하기 위해서, 본질적으로 소량의 복합 탄소 및/또는 질소 공급원, 예를 들어 효모 추출물을 주요 발효의 초기 단계에 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명에 따른 발효 공정에서 화학적으로 정의된 발효 배지에 첨가될 수 있는 복합 영양소 공급원의 본질적으로 소량은 발효 공정에서 첨가되는 각각의 영양소의 총량의 최대 10 % 의 양으로 정의된다. 특히, 화학적으로 정의된 발효 배지에 첨가될 수 있는 복합 탄소 및/또는 질소 공급원의 본질적으로 소량은 발효 공정에서 첨가되는 탄소의 총량의 최대 10 % 를 생성하는 복합 탄소 공급원의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 10 % 를 생성하는 복합 질소 공급원의 양, 바람직하게는 발효 공정에서 첨가되는 탄소의 총량의 최대 5 % 를 생성하는 복합 탄소 공급원의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 5 % 를 생성하는 복합 질소 공급원의 양, 보다 바람직하게는 탄소의 총량의 최대 1 % 를 생성하는 복합 탄소 공급원의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 1 % 를 생성하는 복합 질소 공급원의 양으로 정의된다. 바람직하게는, 발효 공정에서 첨가되는 탄소의 총량의 최대 10 % 및/또는 질소의 총량의 최대 10 %, 바람직하게는 탄소의 총량의 최대 5 % 의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 5 % 의 양, 보다 바람직하게는 탄소의 총량의 최대 1 % 의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 1 % 의 양이 접종물로부터의 잔재를 통해 첨가된다. 가장 바람직하게는, 복합 탄소 및/또는 복합 질소 공급원은 발효 공정에서 발효 배지에 첨가되지 않는다.
본원에서 언급된 바와 같은 화학적으로 정의된 영양소 공급원, 예를 들어 화학적으로 정의된 탄소 공급원 또는 화학적으로 정의된 질소 공급원은 화학적으로 정의된 화합물로 구성된 영양소 공급원에 사용되는 것으로 이해된다.
화학적으로 정의된 발효 배지에서 미생물의 배양은 화학적으로 정의된 수소 공급원, 화학적으로 정의된 산소 공급원, 화학적으로 정의된 탄소 공급원, 화학적으로 정의된 질소 공급원, 화학적으로 정의된 황 공급원, 화학적으로 정의된 인 공급원, 화학적으로 정의된 마그네슘 공급원, 화학적으로 정의된 나트륨 공급원, 화학적으로 정의된 칼륨 공급원, 화학적으로 정의된 미량 원소 공급원, 및 화학적으로 정의된 비타민 공급원으로 이루어진 군에서 선택되는 다양한 화학적으로 정의된 영양소 공급원을 함유하는 배지에서 세포를 배양하는 것을 필요로 한다. 바람직하게는, 화학적으로 정의된 탄소 공급원은 탄수화물, 유기 산, 탄화수소, 알코올, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 탄수화물은 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 자일로오스, 아라비노오스, 수크로오스, 말토오스, 말토트리오스, 락토오스, 덱스트린, 말토덱스트린, 전분 및 이눌린, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 알코올은 글리세롤, 메탄올 및 에탄올, 이노시톨, 만니톨 및 소르비톨, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 유기 산은 아세트산, 프로피온산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산, 푸마르산 및 고급 알칸산, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 화학적으로 정의된 탄소 공급원은 글루코오스 또는 수크로오스를 포함한다. 보다 바람직하게는, 화학적으로 정의된 탄소 공급원은 글루코오스를 포함하며, 더욱 바람직하게는 우세한 양의 화학적으로 정의된 탄소 공급원이 글루코오스로서 제공된다.
가장 바람직하게는, 화학적으로 정의된 탄소 공급원은 글루코오스이다. 화학적으로 정의된 탄소 공급원은 시럽의 형태로, 바람직하게는 글루코오스 시럽으로서 제공될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 이해되는 바와 같이, 본원에서 언급된 바와 같은 글루코오스는 글루코오스 시럽을 포함할 것이다. 글루코오스 시럽은 높은 당 농도를 갖는 점성 당 용액이다. 글루코오스 시럽에서의 당은 주로 글루코오스이며, 시럽의 품질 등급에 따라 다양한 농도의 말토오스 및 말토트리오스도 소량 함유되어 있다. 바람직하게는, 글루코오스, 말토오스 및 말토트리오스 이외에, 시럽은 최대 10 %, 바람직하게는 최대 5 %, 보다 바람직하게는 최대 3 % 의 불순물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 글루코오스 시럽은 옥수수로부터 유래한다.
화학적으로 정의된 질소 공급원은 바람직하게는 우레아, 암모니아, 니트레이트, 니트레이트 염, 니트라이트, 암모늄 염, 예컨대 암모늄 클로라이드, 암모늄 술페이트, 암모늄 아세테이트, 암모늄 포스페이트 및 암모늄 니트레이트, 및 아미노산, 예컨대 글루타메이트 또는 리신 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 화학적으로 정의된 질소 공급원은 암모니아, 암모늄 술페이트 및 암모늄 포스페이트로 이루어진 군에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 화학적으로 정의된 질소 공급원은 암모니아이다. 화학적으로 정의된 질소 공급원으로서 암모니아의 사용은 암모니아가 pH 조절제로서 추가로 기능할 수 있다는 이점을 가진다.
추가의 화합물이 이하에서 기술하는 바와 같이, 복잡한 및 화학적으로 정의된 발효 배지에 첨가될 수 있다.
산소는 통상적으로 교반 및/또는 기체 공급에 의한 발효 배지의 통기에 의해 세포의 배양 동안에 제공된다. 수소는 통상적으로 수성 발효 배지에서 물의 존재로 인해 제공된다. 그러나, 수소 및 산소는 또한 탄소 및/또는 질소 공급원에 함유되며, 이러한 방식으로 제공될 수 있다.
마그네슘은 바람직하게는 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 술페이트, 마그네슘 니트레이트, 마그네슘 포스페이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마그네슘 염에 의해, 또는 마그네슘 히드록사이드에 의해, 또는 하나 이상의 마그네슘 염과 마그네슘 히드록사이드의 조합에 의해 발효 배지에 제공될 수 있다.
나트륨은 바람직하게는 나트륨 클로라이드, 나트륨 니트레이트, 나트륨 술페이트, 나트륨 포스페이트, 나트륨 히드록사이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 나트륨 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다.
칼슘은 바람직하게는 칼슘 술페이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 니트레이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 히드록사이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 칼슘 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다.
칼륨은 바람직하게는 칼륨 클로라이드, 칼륨 니트레이트, 칼륨 술페이트, 칼륨 포스페이트, 칼륨 히드록사이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 칼륨 염에 의해 화학적으로 정의된 형태로 발효 배지에 첨가될 수 있다.
인은 바람직하게는 칼륨 포스페이트, 나트륨 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 인산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 인을 포함하는 하나 이상의 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 초기 발효 배지 1 리터 당 1 g 이상의 인이 첨가된다.
황은 바람직하게는 칼륨 술페이트, 나트륨 술페이트, 마그네슘 술페이트, 황산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 황을 포함하는 하나 이상의 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 발효 배지 및/또는 초기 발효 배지는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함한다:
발효 배지 1 리터 당 0.1 내지 50 g 의 질소;
발효 배지 1 리터 당 1 내지 6 g 의 인;
발효 배지 1 리터 당 0.15 내지 2 g 의 황;
발효 배지 1 리터 당 0.4 내지 8 g 의 칼륨;
발효 배지 1 리터 당 0.01 내지 2 g 의 나트륨;
발효 배지 1 리터 당 0.01 내지 3 g 의 칼슘; 및
발효 배지 1 리터 당 0.1 내지 10 g 의 마그네슘.
전형적으로, 공급 용액은 상기에서 나열한 상기 그룹의 화합물 중 하나 이상에서 발효 배지 및/또는 초기 발효 배지와 상이하다. 더욱 전형적으로, 공급 용액은 상기에서 나열한 상기 그룹의 화합물 중 하나 이상에서 발효 배지 및/또는 초기 발효 배지와 상이하다.
하나 이상의 미량 원소 이온은 각각 바람직하게는 초기 발효 배지 1 리터 당 10 mmol 미만의 양으로 발효 배지에 첨가될 수 있다. 이들 미량 원소 이온은 철, 구리, 망간, 아연, 코발트, 니켈, 몰리브덴, 셀레늄 및 붕소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 미량 원소 이온인 철, 구리, 망간, 아연, 코발트, 니켈 및 몰리브덴이 발효 배지에 첨가된다. 바람직하게는, 하나 이상의 미량 원소 이온은 초기 배지 1 리터 당 50 μmol 내지 5 mmol 의 철, 초기 배지 1 리터 당 40 μmol 내지 4 mmol 의 구리, 초기 배지 1 리터 당 30 μmol 내지 3 mmol 의 망간, 초기 배지 1 리터 당 20 μmol 내지 2 mmol 의 아연, 초기 배지 1 리터 당 1 μmol 내지 100 μmol 의 코발트, 초기 배지 1 리터 당 2 μmol 내지 200 μmol 의 니켈 및 초기 배지 1 리터 당 0.3 μmol 내지 30 μmol 의 몰리브덴, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 양으로 발효 배지에 첨가된다. 각각의 미량 원소를 첨가하기 위해, 바람직하게는 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 니트레이트, 시트레이트 및 아세테이트 염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이 사용될 수 있다.
발효 배지에 임의로 포함될 수 있는 화합물은 시트르산, MGDA, NTA 또는 GLDA 와 같은 킬레이트제, 및 모노- 및 디칼륨 포스페이트, 칼슘 카보네이트와 같은 완충제 등이다. 완충제는 바람직하게는 외부 pH 조절없이 공정을 처리할 때 첨가된다. 또한, 소포제가 발효 공정 전에 및/또는 동안에 투입될 수 있다.
비타민은 세포의 정상적인 대사에 필요한 구조적으로 관련이 없는 유기 화합물의 그룹을 의미한다. 세포는 필요한 비타민을 합성하는 능력이 매우 다양한 것으로 알려져 있다. 비타민은 바실루스 세포의 발효 배지에 첨가되어야 한다. 비타민은 티아민, 리보플라빈, 피리독살, 니코틴산 또는 니코틴아미드, 판토텐산, 시아노코발라민, 폴산, 비오틴, 리포산, 퓨린, 피리미딘, 이노시톨, 콜린 및 헤민의 군에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 발효 배지는 또한 세포의 선별 마커가 내성을 제공하는 선별제, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 클로로암페니콜, 스트렙토마이신 또는 플레오마이신과 같은 항생제를 포함한다.
배지에 첨가되는 필요한 화합물의 양은 주로 발효 공정에서 형성되는 생물량의 양에 따라 달라질 것이다. 형성되는 생물량의 양은 광범위하게 변할 수 있으며, 전형적으로 생물량의 양은 발효 브로스 1 리터 당 약 10 내지 약 150 그램의 건조 세포 질량이다. 통상적으로, 단백질 생산을 위해, 발효 브로스 1 리터 당 약 10 g 미만의 건조 세포 질량인 생물량의 양을 생산하는 발효는 산업적으로 관련이 없는 것으로 간주된다.
정의된 배지의 각 성분의 최적의 양, 뿐만 아니라, 어느 화합물이 필수이고 어느 것이 필수가 아닌지는 배지에서 발효에 적용되는 바실루스 세포의 유형, 생물량의 양 및 형성되는 생성물에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 형성되는 생물량의 양은 사용되는 탄소 공급원의 양에 의해 주로 결정될 것이기 때문에, 미생물 세포의 성장에 필요한 배지 성분의 양은 발효에 사용되는 탄소 공급원의 양과 관련하여 결정될 수 있다.
특히 바람직한 발효 배지는 또한 하기의 실시예에 기재되어 있다.
바람직하게는, 발효 배지는 접종된 미생물 세포와 상이한, 발효 공정 동안에 미생물의 성장을 방지 또는 감소시키기 위해서 사용 전에 멸균된다. 멸균은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 비제한적으로, 오토클레이빙 또는 멸균 여과로 수행될 수 있다. 일부 또는 모든 배지 성분은 멸균 처리 동안에 배지 성분의 상호 작용을 피하거나 또는 멸균 조건 하에서 배지 성분의 분해를 피하기 위해서, 다른 배지 성분과 별도로 멸균될 수 있다.
문구 "바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건" 은 배양에 사용되는 온도 또는 발효 배지 이외의 조건을 의미한다. 이러한 조건은 배양 동안의 pH, 진탕 또는 교반에 의한 배양물의 물리적 이동 및/또는 배양물에 적용되는 대기 조건을 포함한다.
배양 동안에 발효 배지의 pH 는 조절되거나 유지될 수 있다. 바람직하게는, 배지의 pH 는 접종 전에 조절된다. 발효 배지에 대해 예상되는 바람직한 pH 값은 약 pH 6.6 내지 약 pH 9 의 범위 내, 바람직하게는 약 pH 6.6 내지 약 pH 8.5 의 범위 내, 보다 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 8.5 의 범위 내, 가장 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 8.0 의 범위 내이다. 예로서, 바실루스 세포 숙주 세포 배양물의 경우, pH 는 바람직하게는 약 pH 6.8, 약 pH 7.0, 약 pH 7.2, 약 pH 7.4 또는 약 pH 7.6 이상으로 조절된다. 바람직하게는, 바실루스 숙주 세포 배양물의 배양 동안에 발효 배지의 pH 는 약 pH 6.8 내지 약 pH 9, 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 8.5, 보다 바람직하게는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.5, 가장 바람직하게는 약 pH 7.2 내지 약 pH 8.0 의 범위 내의 pH 로 조절된다.
물리적 이동은 발효 배지의 교반 및/또는 진탕에 의해 적용될 수 있다. 바람직하게는, 발효 배지의 상기 교반은 약 50 내지 약 2000 rpm, 바람직하게는 약 50 내지 약 1600 rpm, 더욱 바람직하게는 약 800 내지 약 1400 rpm, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 200 rpm 으로 수행된다.
교반 외에도, 적합한 대기 조건을 조정함으로써 산소 및/또는 다른 기체가 배양물에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 산소는 0 내지 3 bar 의 공기 또는 산소로 공급된다.
또한, 바실루스 숙주 세포의 배양을 위한 적합한 생물반응기 또는 용기의 선택을 포함하는 추가의 조건은 당업계에 충분히 공지되어 있으며, 더이상 고민없이 당업자에 의해 설정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "공급 용액" 은 초기 발효 배지에 바실루스 숙주 세포를 접종한 후에 발효 배지에 첨가되는 용액을 의미한다. 초기 발효 배지는 전형적으로 바실루스 숙주 세포를 접종할 때 발효기에 존재하는 발효 배지를 의미한다. 공급 용액은 상기 세포의 성장을 지지하는 화합물을 포함한다. 발효 배지와 비교하여, 공급 용액은 하나 이상의 화합물이 풍부할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따르면, 공급 용액은 하나 이상의 화합물에서 발효 배지와 상이하다. 보다 전형적으로, 공급 용액은 주요 탄소 공급원 이외의 하나 이상의 화합물에서 발효 배지와 상이하다. 더욱 전형적으로, 공급 용액은 질소 공급원, 마그네슘 염, 나트륨 염, 칼슘 염, 칼륨 염, 인을 포함하는 염, 황을 포함하는 염으로 이루어진 군에서 선택되는 하기 화합물 중 하나 이상에서 발효 배지와 상이하다.
"탄소의 주요 공급원" 또는 "주요 탄소 공급원" 은 전형적으로 배양 동안에 존재하는, 전형적으로 공급 용액 및/또는 초기 발효 배지에 존재하는 탄소 공급원의 질량 비율에 기초한 탄소의 주요 공급원을 나타내는 탄소 공급원을 의미한다. 용어 "탄소 공급원" 은 전형적으로 이의 생물량 구축 및/또는 이의 성장 및/또는 생성물 형성을 위한 탄소의 공급원으로서 유기체에 의해 대사되는 화합물로 이해된다. 적합한 탄소 공급원은, 예를 들어 탄수화물과 같은 유기 화합물을 포함한다.
사용되는 공급 배지 또는 공급 용액은 전형적으로 상기에서 언급한 임의의 배지 성분 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 공급 용액으로서 제공되는 화합물의 적어도 일부는 상기 화합물의 공급 전에 이미 발효 배지에 어느 정도 존재할 수 있는 것으로 본원에서 이해된다. 바람직하게는, 공급 용액은 화학적으로 정의된 탄소 공급원을 포함하며, 보다 바람직하게는 공급 용액은 화학적으로 정의된 탄소 공급원을 주요 탄소 공급원으로서 포함한다. 더욱 바람직하게는, 공급 용액은 글루코오스를 포함한다. 보다 바람직하게는, 공급 용액은 40 % 내지 60 % 의 글루코오스, 바람직하게는 42 % 내지 58 % 의 글루코오스, 보다 바람직하게는 45 % 내지 55 % 의 글루코오스, 더욱 바람직하게는 47 % 내지 52 % 의 글루코오스, 및 가장 바람직하게는 50 % 의 글루코오스를 포함한다.
공급 용액은 발효 공정 동안에 연속적으로 또는 불연속적으로 첨가될 수 있다. 공급 용액의 불연속적인 첨가는 발효 공정 동안에 단일 덩어리로서 한번, 또는 상이한 또는 동일한 부피로 여러번 발생할 수 있다. 공급 용액의 연속적인 첨가는 발효 공정 동안에 동일한 또는 다양한 속도 (즉, 부피/시간) 로 발생할 수 있다. 또한, 연속 및 불연속 공급 프로파일의 조합이 발효 공정 동안에 적용될 수 있다. 공급 용액으로서 제공되는 발효 배지의 성분은 하나의 공급 용액에 첨가될 수 있거나, 또는 상이한 공급 용액으로서 첨가될 수 있다. 2 개 이상의 공급 용액이 적용되는 경우, 공급 용액은 상기에서 기술한 바와 같이 동일한 또는 상이한 공급 프로파일을 가질 수 있다. 특히 바람직한 공급 용액은 또한 하기의 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 방법은 더욱 바람직하게는 제 1 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기에서 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "제 1 배양 단계" 는 하나 이상의 공급 용액의 첨가하에서 배양이 수행되는 제 1 기간을 의미한다. 상기 하나 이상의 공급 용액은 증가하는 속도, 바람직하게는 기하급수적으로 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공할 것이다. 상기 기간은 배양물의 매개변수, 예를 들어 박테리아 성장 속도, 탄소 공급원 소모 속도, 발효 배지에 제공된 탄소 공급원의 양 등에 따라 미리 결정되거나 가변적일 수 있다. 바람직하게는, 상기 제 1 배양 단계는 적어도 약 3 h 내지 약 48 h, 바람직하게는 약 12 h 내지 약 24 h, 바람직하게는 약 22 h 의 시간 동안 수행된다. 대안적으로, 이것은 하나 이상의 공급 용액에 의해 탄소 공급원의 소정의 총량이 제공될 때까지 수행될 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 공급 용액은 약 0.13 h-1 이상의 지수 인자로 기하급수적으로 증가하는 속도 및 리터 및 시간 당 약 1 g 이상의 하나 이상의 탄소 공급원의 시작 양으로 탄소 공급원을 제공한다. 더욱 바람직하게는, 단계 b) 에서 초기에 존재하는 바실루스 숙주 세포 배양물 1 kg 당 적어도 약 50 g 이상의 총량의 상기 하나 이상의 탄소 공급원이 제 1 배양 단계 동안 첨가된다. 더욱 상세한 내용은 하기의 첨부된 실시예에서 확인할 수 있다. 당업자는 제 1 배양 단계의 기간을 결정하는 방법을 충분히 알고 있다. 바실루스 숙주 세포는 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 제 1 배양 단계에서 배양된다.
본 발명의 방법은 또한 바람직하게는 제 2 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 이전 단계에서 수득된 바실루스 숙주 세포 배양물을 배양하는 단계로서, 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로, 감소하는 속도로, 또는 제 1 배양 단계 동안 적용되는 속도보다 적게 증가하는 속도로, 보다 바람직하게는 일정한 속도로 탄소 공급원을 제공하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "제 2 배양 단계" 는 하나 이상의 공급 용액의 첨가하에서 배양이 수행되는 제 2 기간을 의미한다. 상기 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로, 감소하는 속도로, 또는 제 1 배양 단계 동안 적용되는 속도보다 적게 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공할 것이다. 바람직하게는, 상기 일정한 속도, 또는 상기 감소하는 속도의 시작 속도, 또는 상기 제 1 배양 단계에서의 속도보다 적게 증가하는 속도의 시작 속도는 제 1 배양 단계의 최대 속도 미만이다. 바람직하게는, 본원에서 언급된 바와 같은 공급 용액에 의해 제공되는 탄소 공급원의 속도의 증가 정도는 개별적인 또는 지속적으로 적용되는 공급 용액 양을 비교하고, 예를 들어 상기 증가에 대한 인자를 결정함으로써 결정될 수 있다. 공급 용액에 의해 제공되는 탄소 공급원에 대한 제 1 및 제 2 배양 단계에서의 증가 인자를 비교함으로써, 상기 탄소 공급원이 제 1 배양 단계에서보다 적게 증가하는 속도로 제 2 배양 단계에서 제공되는지의 여부를 결정할 수 있다. 상기 제 2 기간은 배양물의 매개변수, 예를 들어 박테리아 성장 속도, 탄소 공급원 소모 속도, 발효 배지에 제공된 탄소 공급원의 양 등에 따라 미리 결정되거나 가변적일 수 있다. 제 2 배양 단계에서, 하나 이상의 공급 용액이 일정한 속도로 탄소 공급원을 제공할 때, 바실루스 숙주 세포 배양물의 지속적인 성장이 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 제 2 배양 단계는 적어도 약 40 h 내지 약 120 h, 바람직하게는 적어도 약 40 h 내지 약 96 h, 바람직하게는 약 68 h 의 시간 동안 수행된다. 바람직하게는, 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로 탄소 공급원을 제공한다. 상기 일정한 속도는 바람직하게는 제 1 배양 단계 동안 하나 이상의 공급 용액에 의해 제공되는 탄소 공급원의 최대 공급 속도이다. 바람직하게는, 이것은 제 1 배양 단계에서 적용되는 하나 이상의 탄소 공급원에 대한 최대 공급 속도의 약 70 % 내지 약 20 % 의 범위 내, 바람직하게는 약 50 % 내지 약 30 % 의 범위 내, 또는 보다 바람직하게는 약 35 % 이다. 당업자는 제 2 배양 단계의 기간을 결정하는 방법을 충분히 알고 있다. 바실루스 숙주 세포는 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 제 2 배양 단계에서 배양된다.
따라서, 본 발명의 방법의 보다 바람직한 구현예에 있어서, 상기 배양 단계는 하기의 단계를 포함한다:
(b1) 제 1 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하는 단계; 및
(b2) 제 2 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 단계 (b1) 에서 수득된 바실루스 숙주 세포 배양물을 배양하는 단계로서, 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로, 감소하는 속도로, 또는 단계 (b1) 에서의 속도보다 적게 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하며, 상기 일정한 속도, 또는 상기 감소하는 속도의 시작 속도, 또는 상기 단계 (b1) 에서의 속도보다 적게 증가하는 속도의 시작 속도는 제 1 배양 단계의 최대 속도 미만인 단계.
보다 바람직하게는, 단계 (b1) 에서의 상기 증가하는 속도는 기하급수적으로 증가하는 속도이다. 또한, 보다 바람직하게는 단계 (b2) 에서의 상기 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로 상기 탄소 공급원을 제공한다.
바람직하게는, 상이한 시점에서 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 일부분의 상기 분리가 수행되는 단계 (c) 에서의 상기 배양 단계는 단지 제 2 배양 단계이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터의 분리되는 일부분은 바람직하게는 제 2 배양 단계 동안 상이한 시점에서 상기 배양물로부터 분리된다. 이러한 전략은 또한 본원에서 "부분적인 수확" 또는 "부분적인 수확 전략" 이라고도 한다. 이어서, 대상 단백질은 상기 분리된 일부분으로부터 수득된다.
상기 일부분의 분리는 바람직하게는 사전 정의된 부피를 갖는 배양물의 샘플을 채취함으로써 수행된다. 바람직하게는, 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 분리될 부피는 바실루스 숙주 세포 배양물의 초기 부피의 약 40 %, 약 30 %, 약 20 %, 약 15 %, 약 10 %, 약 5 %, 또는 보다 바람직하게는 약 10 % 이다. 특히 바람직하게는, 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 분리될 부피는 바실루스 숙주 세포 배양물의 초기 부피의 약 40 % 내지 약 1 % 의 범위 내, 더욱 바람직하게는 바실루스 숙주 세포 배양물의 초기 부피의 30 % 내지 5 % 의 범위 내, 더욱 바람직하게는 20 % 내지 10 % 의 범위 내이다. 보다 바람직하게는, 초기 바실루스 숙주 세포 배양물 1 L 당 100 mL 의 바실루스 숙주 세포 배양물이 채취된다.
특히, 본 발명의 부분적인 수확 전략은 반복된 유가 배양과 상이하며, 여기에서 전형적으로 숙주 세포 배양물의 초기 부피와 반응기에 첨가된 모든 공급물의 부피의 합계의 50 % 이상은 공정 동안에 한번 또는 반복된 방식으로 제거된다.
상기 일부분은 상이한 시점에서 분리되어야 한다. 바람직하게는, 일부분은 제 2 배양 단계 동안 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상 또는 5 개 이상의 상이한 시점에서 분리된다. 바람직하게는, 상기 상이한 시점은 시간적으로 약 8 h 떨어져 있다. 바람직하게는, 바실루스 숙주 세포 배양물의 분리는 제 2 배양 단계의 개시 후 약 30 h, 약 34 h, 약 36 h, 또는 바람직하게는 약 32 h 후에 시작된다.
배양 단계의 완료 후, 남아있는 바실루스 숙주 세포 배양물은 또한 바람직하게는 대상 단백질이 수득되는 일부분으로서 사용된다.
상기 방법에 의해 수득되는 대상 단백질은 바람직하게는 모든 일부분으로부터 수득되는 조합된 총 대상 단백질이다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 각각의 일부분에서 수득되는 대상 단백질을 하나의 제제로 조합하는 것을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
바람직하게는, 대상 단백질은 분리된 바실루스 숙주 세포 배양물 일부분으로부터 정제에 의해 수득된다. 대상 단백질의 성질에 따라, 적합한 기술이 선택될 수 있다. 예를 들어, 대상 단백질이 발효 브로스에 분비되는 경우, 바실루스 세포는 배양물 일부분으로부터 분리될 수 있으며, 대상 단백질은 발효 브로스의 액체 부분으로부터 정제될 수 있다. 대상 단백질이 세포질 단백질인 경우, 즉, 바실루스 숙주 세포 내에 존재하는 경우, 이것은 바실루스 숙주 세포를 발효 브로스로부터 분리하고, 이어서 상기 숙주 세포를 용해시키고, 배양물의 용해된 바실루스 숙주 세포로부터 대상 단백질을 정제함으로써 정제될 수 있다. 대안적으로, 단계 c) 후에 배양물에 존재하는 바실루스 숙주 세포는 용해될 수 있으며, 대상 단백질은 발효 브로스에서 용해된 바실루스 숙주 세포로부터 정제될 수 있다.
대상 단백질의 정제는 물리적 분리, 예컨대 원심분리, 증발, 동결 건조, 여과 (특히, 한외여과), 전기영동 (분취용 SDS PAGE 또는 등전점 전기영동), 초음파 및/또는 압력, 또는 화학적 처리, 예컨대 화학적 침전, 결정화, 추출 및/또는 효소 처리 단계를 포함하는 선택된 기술에 따라 달라질 수 있다. 또한, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제 크로마토그래피) 가 적용될 수 있다. 또한, 항체 기반 친화성 크로마토그래피 또는 정제 태그를 사용하는 기술을 포함하는 친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 적합한 기술은 당업계에 충분히 공지되어 있으며, 대상 단백질에 따라 당업자에 의해 더이상 고민없이 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기에서 기술한 바와 같이 정제된 대상 단백질의 처리를 포함하는 추가의 처리를 또한 포함할 수 있다. 이러한 처리는 대상 단백질에 대한 소포제 또는 안정화제의 첨가와 같은 정제를 개선하는 화학적 및/또는 물리적 처리를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 대상 단백질, 특히 캡슐, 과립, 분말, 액체 등을 포함하는 상업적 제품 또는 물품을 수득하기 위한 제조 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 대상 단백질을 포함하는 정제된 또는 부분적으로 정제된 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 방법은 정제된 또는 부분적으로 정제된 형태의 대상 단백질을 제공한다.
바람직하게는, 글루코오스 소모 속도에 대한 단백질의 수율은 대조군에 비해 유의하게 증가한다. 바람직하게는, 상기 수율은 대상 단백질의 생산 속도 및 글루코오스 소모 속도의 비율이다. 이 경우의 대조군으로서, 부분적인 수확없이 본 발명의 방법을 수행할 때 수득되는 대상 단백질의 수율을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 수율은 적어도 또는 최대 10 %, 20 %, 30 %, 40 % 또는 50 % 까지 증가한다.
수율의 증가는 대상 단백질의 특정한 정량화를 가능하게 하는 임의의 기술에 의해 대상 단백질에 따라 결정될 수 있다. 일부 기술은 본원의 다른 곳에서 언급된다. 본원에서 언급된 바와 같이, 상기 증가는 대조군과 비교한 증가이다. 따라서, 수율의 증가를 결정하기 위해, 본 발명의 방법에 따라서 배양된 바실루스 숙주 세포 배양물 및 대조군 바실루스 숙주 세포 배양물에서 관심 생산 속도를 결정한다. 두 배양물에 대한 글루코오스 소모 속도를 결정하고, 각각의 배양물에서의 대상 단백질의 생산 속도와 각각의 글루코오스 소모 속도의 비율을 계산한다. 본원에서 언급된 바와 같은 수율의 증가를 결정하기 위해서, 두 결정된 비율을 서로 비교한다. 이러한 수율의 증가가 통계적으로 유의한 것인지의 여부는 당업자에게 충분히 공지된 다양한 통계적 시험에 의해 결정될 수 있다. 전형적인 시험은 스튜던츠 t-테스트 (Student´s t-test) 또는 만-휘트니 U 테스트 (Mann-Whitney U test) 이다.
전형적으로, 배양 동안의 온도는 바람직하게는 약 28 ℃, 약 32 ℃ 에서, 또는 보다 바람직하게는 약 30 ℃ 에서 일정하게 유지될 수 있다.
배양이 본원에서 명시된 바와 같은 제 1 및 제 2 배양 단계를 포함하는 본 발명의 방법의 구현예에 있어서, 배양 동안의 온도는 또한 전형적으로 바람직하게는 약 28 ℃, 약 32 ℃ 에서, 또는 보다 바람직하게는 약 30 ℃ 에서 일정하게 유지된다.
그러나, 본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 제 1 배양 단계 동안의 상기 배양은 제 1 온도에서 수행되고, 제 2 배양 단계 동안의 배양은 제 2 온도에서 수행되며, 상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높다.
본원에서 언급된 바와 같은 용어 "제 1 온도" 는 제 1 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포 배양물을 배양하는데 사용되는 온도를 의미한다. 제 1 배양 단계 동안 제 1 온도가 일정하게 적용된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 제 1 온도는 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현을 허용하는 온도일 것이다. 바람직하게는, 상기 제 1 온도는 약 28 ℃ 내지 약 32 ℃, 약 29 ℃ 내지 약 31 ℃ 의 범위 내이거나, 또는 바람직하게는 약 30 ℃ 이다.
본원에서 언급된 바와 같은 용어 "제 2 온도" 는 제 2 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포 배양물을 배양하는데 사용되는 온도를 의미한다. 제 2 배양 단계 동안 제 2 온도가 일정하게 적용된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 제 2 온도는 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현을 허용하는 온도일 것이다. 바람직하게는, 상기 제 2 온도는 약 33 ℃ 내지 약 37 ℃, 약 34 ℃ 내지 약 36 ℃ 의 범위 내이거나, 또는 바람직하게는 약 35 ℃ 이다.
상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높아야 한다. 바람직하게는, 상기 제 1 및 상기 제 2 온도는 약 3 ℃ 내지 약 7 ℃, 약 4 ℃ 내지 약 6 ℃, 또는 바람직하게는 약 5 ℃ 만큼 상이하다.
바람직하게는, 제 2 배양 단계, 즉, 제 1 배양 단계에서 온도의 증가는 대상 단백질의 수율의 증가를 초래한다.
유리하게는, 대상 단백질의 제조를 위해 바실루스 숙주 세포를 배양할 때, 배양 단계 동안 부분적인 수확 전략은 대조군 배양물에 비해, 바실루스 숙주 세포 배양물에 의해 생산된 대상 단백질의 수율을 상당히 증가시킬 수 있었으며 및/또는 안정화시킬 수 있었다는 것이, 본 발명의 기초가 되는 실험에서 발견되었다. 수율에 대한 유익한 효과는, 배양 단계가 2 단계 배양이었고, 부분적인 수확 전략이 배양 단계 동안 수행되었을 때 훨씬 더 증가하였으며, 여기에서 공급 용액은 탄소 공급원, 바람직하게는 글루코오스를 일정한 속도로, 감소하는 속도로, 또는 제 1 배양 단계에서의 속도보다 적게 증가하는 속도로 제공하였고, 적용되는 경우, 강력하게 증가하는 속도, 바람직하게는 기하급수적으로 증가하는 속도로 제공하였다. 특히, 부분적인 수확이 없는 발효는 발효 개시 후 약 45 h 에 글루코오스에 대한 정규화된 최대 생성물 수율 1.00 에 도달하였다. 그 후, 수율은 85 h 의 공정 시간 후에 글루코오스에 대한 정규화된 생성물 수율이 0.30 으로 꾸준히 감소하여, 40 h 에 수율이 70 % 감소하였다. 그러나, 부분적인 수확에 의한 발효는 약 47 h 에 글루코오스에 대한 정규화된 생성물 수율 0.60 에 도달하였으며, 발효 개시 후 55 h 에 최대 수율 0.62 에 도달하였다. 87 h 의 발효 후, 글루코오스에 대한 정규화된 수율은 여전히 0.41 이었으며, 따라서 40 h 에 수율이 34 % 감소하였다. 따라서, 부분적인 수확 전략에 대해, 수율에 대한 안정화 효과가 입증되었다. 따라서, 본 발명에 의해, 대상 단백질의 미생물 생산을 목표로 하는 발효 공정에서의 수율은 일반적으로 적용 가능한 배양 방법에 의해 증가될 수 있다. 상기 방법은 기존의 생산 계획에 용이하게 포함될 수 있으며, 단지 수확 전략의 변형을 필요로 한다; 특히 청구된 방법은 노동 및 비용 집약적일 수 있는 연속 생산 시스템으로 변경할 필요없이 수율을 최적화하고 증가시킬 수 있다.
상기에서 이루어진 용어에 대한 설명 및 해석은 하기의 본원에서 설명되는 구현예에 준용된다.
하기의 구현예는 본 발명의 방법의 바람직한 구현예이다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 배양 단계는 하기의 단계를 포함한다:
(b1) 제 1 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하는 단계; 및
(b2) 제 2 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 단계 (b1) 에서 수득된 바실루스 숙주 세포 배양물을 배양하는 단계로서, 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로, 감소하는 속도로, 또는 단계 (b1) 에서의 속도보다 적게 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하며, 상기 일정한 속도, 또는 상기 감소하는 속도의 시작 속도, 또는 상기 단계 (b1) 에서의 속도보다 적게 증가하는 속도의 시작 속도는 제 1 배양 단계의 최대 속도 미만인 단계.
본 발명의 방법의 보다 바람직한 구현예에 있어서, 단계 (b1) 에서의 상기 증가하는 속도는 기하급수적으로 증가하는 속도이다. 보다 바람직하게는, 제 1 배양 단계 동안, 하나 이상의 공급 용액은 약 0.13 h-1 이상의 지수 인자로 기하급수적으로 증가하는 속도 및 리터 및 시간 당 약 1 g 이상의 하나 이상의 탄소 공급원의 시작 양으로 탄소 공급원을 제공한다. 보다 바람직하게는, 상기 제 1 배양 단계 동안, 단계 b) 에서 초기에 존재하는 바실루스 숙주 세포 배양물 1 kg 당 약 50 g 이상의 총량의 상기 하나 이상의 탄소 공급원이 첨가된다. 바람직하게는, 상기 제 1 배양 단계는 적어도 약 3 h 내지 약 48 h 의 시간 동안 수행된다.
본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에 있어서, 단계 (b2) 에서의 상기 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로 상기 탄소 공급원을 제공한다. 바람직하게는, 상기 일정한 속도는 제 1 배양 단계에서 제공되는 최대 공급 속도이거나, 또는 제 1 배양 단계에서 적용되는 하나 이상의 탄소 공급원에 대한 최대 공급 속도의 약 70 % 내지 약 20 % 의 범위 내, 바람직하게는 약 50 % 내지 약 30 % 의 범위 내이거나, 또는 보다 바람직하게는 약 35 % 이다. 바람직하게는, 상기 제 2 배양 단계는 적어도 약 40 h 내지 약 120 h, 바람직하게는 적어도 약 40 h 내지 약 96 h 의 시간 동안 수행된다.
본 발명의 방법의 보다 바람직한 구현예에 있어서, 상이한 시점에서 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 일부분의 상기 분리가 수행되는 단계 (c) 에서의 상기 배양 단계는 제 2 배양 단계이다.
본 발명의 방법의 보다 바람직한 구현예에 있어서, 제 1 배양 단계 동안의 배양은 제 1 온도에서 수행되고, 제 2 배양 단계 동안의 배양은 제 2 온도에서 수행되며, 상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높다. 보다 바람직하게는, 상기 제 1 및 상기 제 2 온도는 약 3 ℃ 내지 약 7 ℃, 약 4 ℃ 내지 약 6 ℃, 또는 바람직하게는 약 5 ℃ 만큼 상이하다. 보다 바람직하게는, 상기 제 1 온도는 약 28 ℃ 내지 약 32 ℃ 의 범위 내, 약 29 ℃ 내지 약 31 ℃ 의 범위 내이거나, 또는 바람직하게는 약 30 ℃ 이다. 보다 바람직하게는, 상기 제 2 온도는 약 33 ℃ 내지 약 37 ℃, 약 34 ℃ 내지 약 36 ℃ 의 범위 내이거나, 또는 바람직하게는 약 35 ℃ 이다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 발효 배지의 접종 후 및 배양 단계 전에 상기 바실루스 숙주 세포 배양물에서 하나 이상의 탄소 공급원이 고갈된다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 단계 c) 에서의 상기 상이한 시점의 제 1 시점은 배양 단계의 개시 후 약 32 h 이다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 상이한 시점 사이의 시간 차이는 6 h 내지 10 h, 바람직하게는 7 h 내지 9 h, 또는 보다 바람직하게는 약 8 h 이다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 단계 c) 후에 수득되는 대상 단백질의 수율은, 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포 배양물의 일부분을 분리하지 않고 배양 단계의 완료 후에 대상 단백질을 수득하여 본 발명의 방법을 수행함으로써 수득된 대조군에 비해서 상당히 증가한다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 바실루스는 바실루스 리체니포르미스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리케파시엔스, 바실루스 브레비스, 바실루스 서큘란스, 바실루스 클라우시이, 바실루스 코아굴란스, 바실루스 피르무스, 바실루스 자우투스, 바실루스 렌투스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 스테아로서모필루스, 바실루스 투린기엔시스 및 바실루스 벨레젠시스로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는 상기 바실루스는 바실루스 리체니포르미스, 바실루스 푸밀루스 또는 바실루스 서브틸리스이고, 더욱 바람직하게는 바실루스는 바실루스 리체니포르미스 또는 바실루스 서브틸리스이며, 더욱 바람직하게는 바실루스 리체니포르미스이다.
더욱 바람직한 구현예에 있어서, 숙주 세포는 종 바실루스 리체니포르미스, 예컨대 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 14580 의 숙주 세포에 속한다 (DSM 13 과 동일함, 문헌 [Veith et al. "The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM 13, an organism with great industrial potential." J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2004) 7:204-211] 참조). 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 31972 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53757 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 55768 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 394 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 641 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 1913 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 11259 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 26543 의 숙주 세포일 수 있다.
더욱 바람직한 구현예에 있어서, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53757, ATCC 53926, ATCC 55768, DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259 및 DSM 26543 으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 대상 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 상기 발현 구축물은 유전자 변형에 의해 바실루스 숙주 세포에 도입되었다. 바람직하게는, 상기 발현 구축물은 하나 이상의 이종 핵산을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 발현 구축물은 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 포함된다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 발현 구축물은 상기 바실루스 숙주 세포에 내생적으로 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 구축물은 바실루스 숙주 세포의 게놈에 포함된다. 보다 바람직하게는, 게놈에 존재하는 상기 발현 구축물은 유전자 변형되었다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 발현 구축물은 상기 바실루스 숙주 세포에서 대상 단백질을 코팅하는 유전자의 발현을 지배하는 발현 제어 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 구조적으로 활성인 프로모터이다. 또한, 바람직하게는, 상기 프로모터는 열에 민감하지 않은 프로모터이다. 보다 바람직하게는, 상기 프로모터는 veg 프로모터, lepA 프로모터, serA 프로모터, ymdA 프로모터, fba 프로모터, aprE 프로모터, amyQ 프로모터, amyL 프로모터, 박테리오파지 SPO1 프로모터 및 cryIIIA 프로모터 또는 이러한 프로모터의 조합 및/또는 이들의 활성 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 발효 배지는 화학적으로 정의된 발효 배지이다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 발효 배지는 다량 원소 및 미량 원소를 사전에 정의된 양으로 포함한다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 공급 용액은 하나 이상의 탄소 공급원, 바람직하게는 글루코오스를 포함한다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 공급 용액은 본원의 다른 곳에서 더욱 상세히 명시된 하나 이상의 화합물에서 발효 배지와 상이하다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 대상 단백질은 효소이다. 바람직하게는, 상기 효소는 하이드롤라아제 (EC 3), 바람직하게는 글리코시다아제 (EC 3.2) 또는 펩티다아제 (EC 3.4) 이다. 보다 바람직하게는, 효소는 아밀라아제, 특히 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1), 셀룰라아제 (EC 3.2.1.4), 락타아제 (EC 3.2.1.108), 만나나아제 (EC 3.2.1.25), 리파아제 (EC 3.1.1.3), 피타아제 (EC 3.1.3.8), 뉴클레아제 (EC 3.1.11 내지 EC 3.1.31) 및 프로테아제 (EC 3.4) 로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기에서 언급한 방법에 따라서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 바실루스 숙주 세포로부터 대상 단백질을 수득하는 추가의 단계를 포함하는, 대상 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 어느 하나의 방법에 의해 수득 가능한 바실루스 숙주 세포 배양물에 관한 것이다. 바람직하게는, 일부의 바실루스 숙주 세포 배양물은 배양 동안에 분리하였으며, 또는 남아있는 박테리아 숙주 세포 배양물은 분리 후에 수득하였다. 바실루스 숙주 세포 배양물은 본 발명의 방법에 의해 생산된 대상 단백질을 바람직하게는 증가된 양으로 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 대상 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌은 구체적으로 언급된 개시내용과 관련하여 참조로 그 전체가 본원에 포함된다.
도면
도 1: 초기 반응기 부피에 대한 글루코오스 공급 속도로서, 선형 공급 단계에서 부분적인 수확을 수행하지 않은 발효는 초기 부피 1 L 당 5.6 g 의 글루코오스를 공급했으며 (회색 점선) 또는 부분적인 수확을 수행한 발효는 초기 부피 1 L 당 8.8 g 의 글루코오스를 공급했다 (흑색 실선). 화살표는 공정 시작 후 10 시간에서 공급의 시작을 나타낸다.
도 2: 부분적인 수확을 수행하지 않은 발효 (회색 점선) 및 부분적인 수확을 수행한 발효 (흑색 실선) 에 대한 최대 점유 반응기 부피 (RV) 당 수확 질량의 시간 경과.
도 3: 부분적인 수확을 수행하지 않은 발효 (정사각형) 및 부분적인 수확을 수행한 발효 (다이아몬드) 에 대한 글루코오스에 대한 정규화된 수율의 시간 경과.
실시예
다음에, 본 발명을 실시예에 의해 예시한다. 이들 실시예는 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예: 부분적인 수확 전략에 의한 글루코오스에 대한 알칼리성 프로테아제 1 의 수율 안정화
알칼리성 프로테아제 1 을 발현하는 바실루스 리체니포르미스 균주를 표 1 에 나열한 성분을 제공하는 화학적으로 정의된 발효 배지를 사용하여 발효 공정에서 배양하였다.
표 1: 발효 공정에서 제공되는 다량 원소
Figure pct00001
표 2: 발효 공정에서 제공되는 미량 원소
Figure pct00002
8 g/l 의 글루코오스를 함유하는 배지로 발효를 시작하였다. 50 % 글루코오스를 함유하는 용액을 공급 용액으로서 사용하였다. 암모니아를 사용하여 발효 동안에 pH 를 조정하였다.
0.2 pH 단위 만큼 배양물 pH 의 증가로 표시되는 8 g/l 글루코오스의 초기 양이 고갈되면, 공정 시작 후 10 시간에 공급을 시작하였다. 글루코오스 공급 전략은 0.13 h-1 의 지수 인자 및 22 h 동안 초기 부피 L 및 시간 당 글루코오스 1 g 의 시작 값을 갖는 기하급수적 공급 단계로 이루어졌다. 이어서, 68 h 동안 초기 부피 L 및 시간 당 글루코오스 5.6 g 또는 8.8 g 의 공급 속도의 일정한 글루코오스 공급 단계가 이어졌다 (도 1). 후자의 경우, 초기 부피 L 당 100 mL 의 부피를 32 h 의 발효 시간부터 8 h 마다 부분적인 수확으로서 취한 반면, 전자의 경우, 분석을 위한 소량의 샘플링 부피 만을 취하였다 (도 2). 두 발효 모두에서, pH 는 NH4OH 의 첨가에 의해 7.0 이상으로 유지하였다. 배양 온도는 30 ℃ 에서 일정하게 유지하였다.
부분적인 수확을 수행하지 않은 발효는 발효 개시 후 약 45 h 에 글루코오스에 대한 정규화된 최대 생성물 수율 1.00 에 도달한다 (도 3). 그 후, 수율은 꾸준히 감소해서 85 h 의 공정 시간 후에 글루코오스에 대한 정규화된 생성물 수율은 0.30 이며, 따라서 40 h 내에 수율이 70 % 감소한다.
부분적인 수확을 수행한 발효는 발효 개시 후 약 47 h 에 글루코오스에 대한 정규화된 생성물 수율 0.60 에 도달하며, 발효 개시 후 55 h 에 0.62 의 최대 수율에 도달한다 (도 3). 발효 87 h 후, 글루코오스에 대한 정규화된 수율은 여전히 0.41 이며, 따라서 40 h 내에 수율이 34 % 감소한다. 이것은 글루코오스의 생성물 수율에 대한 부분적인 수확 전략의 안정화 효과를 명확하게 나타낸다.

Claims (15)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 바실루스 숙주 세포로부터 대상 단백질을 생산하는 방법:
    (a) 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 위한 발현 구축물을 포함하는 바실루스 숙주 세포를 발효 배지에 접종하는 단계;
    (b) 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 탄소 공급원을 제공하는 단계; 및
    (c) 배양 단계 동안 상이한 시점에서 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 일부분을 분리하고, 상기 일부분으로부터 대상 단백질을 수득하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 배양 단계가 하기의 단계를 포함하는 방법:
    (b1) 제 1 배양 단계 동안 상기 발효 배지에서 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 바실루스 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 바실루스 숙주 세포의 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하는 단계; 및
    (b2) 제 2 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포의 성장 및 대상 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 단계 (b1) 에서 수득된 바실루스 숙주 세포 배양물을 배양하는 단계로서, 배양은 하나 이상의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 하나 이상의 공급 용액은 일정한 속도로, 감소하는 속도로, 또는 단계 (b1) 에서의 속도보다 적게 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하며, 상기 일정한 속도, 또는 상기 감소하는 속도의 시작 속도, 또는 상기 단계 (b1) 에서의 속도보다 적게 증가하는 속도의 시작 속도는 제 1 배양 단계의 최대 속도 미만인 단계.
  3. 제 2 항에 있어서, 단계 (b1) 에서의 상기 증가하는 속도가 기하급수적으로 증가하는 속도인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 제 1 배양 단계 동안, 하나 이상의 공급 용액이 약 0.13 h-1 이상의 지수 인자로 기하급수적으로 증가하는 속도 및 리터 및 시간 당 약 1 g 이상의 하나 이상의 탄소 공급원의 시작 양으로 탄소 공급원을 제공하는 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 배양 단계 동안, 단계 b) 에서 초기에 존재하는 바실루스 숙주 세포 배양물 1 kg 당 약 50 g 이상의 총량의 상기 하나 이상의 탄소 공급원이 첨가되는 방법.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 배양 단계가 적어도 약 3 h 내지 약 48 h 의 시간 동안 수행되는 방법.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b2) 에서의 상기 하나 이상의 공급 용액이 일정한 속도로 상기 탄소 공급원을 제공하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 일정한 속도가 제 1 배양 단계에서 제공되는 최대 공급 속도이거나, 또는 제 1 배양 단계에서 적용되는 하나 이상의 탄소 공급원에 대한 최대 공급 속도의 약 70 % 내지 약 20 % 의 범위 내, 바람직하게는 약 50 % 내지 약 30 % 의 범위 내, 또는 보다 바람직하게는 약 35 % 인 방법.
  9. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 배양 단계가 적어도 약 40 h 내지 약 120 h, 바람직하게는 적어도 약 40 h 내지 약 96 h 의 시간 동안 수행되는 방법.
  10. 제 2 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 시점에서 상기 바실루스 숙주 세포 배양물로부터 일부분의 상기 분리가 수행되는 단계 (c) 에서의 상기 배양 단계가 제 2 배양 단계인 방법.
  11. 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 배양 단계 동안 배양이 제 1 온도에서 수행되고, 제 2 배양 단계 동안 배양이 제 2 온도에서 수행되며, 상기 제 2 온도가 제 1 온도보다 높은 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지의 접종 후 및 배양 단계 전에 상기 바실루스 숙주 세포 배양물에서 하나 이상의 탄소 공급원이 고갈되는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 시점의 제 1 시점이 배양 단계의 개시 후 약 32 h 인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 시점 사이의 시간 차이가 6 h 내지 10 h, 바람직하게는 7 h 내지 9 h, 또는 보다 바람직하게는 약 8 h 인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 후에 수득되는 대상 단백질의 수율이, 배양 단계 동안 바실루스 숙주 세포 배양물의 일부분을 분리하지 않고 배양 단계의 완료 후에 대상 단백질을 수득하여 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행함으로써 수득된 대조군에 비해서 상당히 증가되는 방법.
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