KR20230041760A - 항-트랜스페린 수용체 (tfr) 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항-트랜스페린 수용체 (tfr) 항체 및 그의 용도 Download PDF

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로메쉬 알. 서브라마니안
모하메드 티. 콰타나니
티모시 위든
코디 에이. 데자르댕
브렌단 퀸
존 나짐
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다인 세라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용의 측면은 트랜스페린 수용체 (예를 들어, 트랜스페린 수용체 1)에 결합하는 항체 및 분자 페이로드에 공유 연결된 상기 항체를 포함하는 복합체에 관한 것이다. 항체를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

항-트랜스페린 수용체 (TFR) 항체 및 그의 용도
관련 출원
본 출원은 2021년 1월 30일에 출원된 "항-트랜스페린 수용체 (TFR) 항체 및 그의 용도"라는 발명의 명칭의 미국 가출원 일련 번호 63/143825, 2020년 8월 23일에 출원된 "항-트랜스페린 수용체 (TFR) 항체 및 그의 용도"라는 발명의 명칭의 미국 가출원 일련 번호 63/069071 및 2020년 7월 23일에 출원된 "항-트랜스페린 수용체 (TFR) 항체 및 그의 용도"라는 발명의 명칭의 미국 가출원 일련 번호 63/055721을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며; 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 신규 항-트랜스페린 수용체 (TfR) 항체 및 항체의 용도에 관한 것이다.
EFS-웹을 통한 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상기 ASCII 카피는 2021년 7월 8일에 생성되었고, 파일명이 D082470037WO00-SEQ-DWY이며, 크기가 120,479 바이트이다.
트랜스페린 수용체 (TfR)는 철 수송에 관여하는 이량체 막횡단 당단백질 수용체이다. 2종의 트랜스페린 수용체인 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 및 트랜스페린 수용체 2 (TfR2)가 인간에서 특징화되었다. TfR은 보다 높은 전이 잠재력을 갖는 암 세포에서 과다발현되는 것으로 밝혀졌다. TfR1은 혈액 뇌 장벽의 내피 세포 상에서 발현되어 대형 분자의 뇌 내로의 전달을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 트랜스페린 수용체에 결합하는 인간화 항체 (항-TfR 항체)의 개발에 기초한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 인간 또는 비-인간 영장류 (NHP) 트랜스페린 수용체 1 (TfR1)에 높은 특이성 및 친화도 (예를 들어, 서브나노몰 내지 나노몰 범위)로 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 TfR1을 발현하는 조직 및/또는 (예를 들어, 및) 세포를 표적화하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-TfR 항체는 세포 또는 조직에서의 TfR1의 검출에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-TfR 항체는 진단, 치료 또는 연구 용도에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 분자 페이로드를 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, TfR1을 발현하는 세포 또는 조직)에 전달하기 위해 사용된다.
따라서, 일부 측면에서, 분자 페이로드 (예를 들어, 진단제 또는 치료제)에 접합된 (예를 들어, 공유 접합된) 항-TfR 항체를 포함하는 복합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-TfR 항체는 질환 (예를 들어, 근육 질환 또는 신경계 질환)을 진단 및/또는 (예를 들어, 및) 치료하기 위해, 접합된 분자 페이로드를 TfR1을 발현하는 세포 또는 조직 (예를 들어, 근육 또는 뇌)에 전달하는 데 사용된다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항-TfR 항체가 다른 공지된 항-TfR 항체와 비교하여 분자 페이로드를 표적 세포 (예를 들어, 근육 세포) 내로 전달하는 데 우수한 활성을 갖는다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 인간 트랜스페린 수용체 (TfR)에 결합하는 항체에 관한 것이며, 여기서 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(ii) 서열식별번호: 69에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(iii) 서열식별번호: 71에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(iv) 서열식별번호: 72에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(v) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(vi) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(vii) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(viii) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(ix) 서열식별번호: 79에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
(x) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
일부 실시양태에서, 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ii) 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iii) 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(iv) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vi) 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(vii) 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(viii) 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(ix) 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(x) 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv 및 전장 IgG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편이다.
일부 실시양태에서, 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열식별번호: 101에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ii) 서열식별번호: 97에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iii) 서열식별번호: 98에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iv) 서열식별번호: 99에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(v) 서열식별번호: 100에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vi) 서열식별번호: 100에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vii) 서열식별번호: 101에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(viii) 서열식별번호: 102에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 93에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ix) 서열식별번호: 103에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(x) 서열식별번호: 102에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 실시양태에서, 항체는 하기를 포함한다:
(i) 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ii) 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iii) 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iv) 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(v) 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vi) 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vii) 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(viii) 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ix) 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(x) 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 실시양태에서, 트랜스페린 수용체에 대한 항체의 결합의 평형 해리 상수 (KD)는 10-11 M 내지 10-6 M의 범위이다. 일부 실시양태에서, 항체는 트랜스페린 수용체의 트랜스페린 결합 부위에 특이적으로 결합하지 않고/거나 항체는 트랜스페린 수용체에 대한 트랜스페린의 결합을 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 비-인간 영장류 및 설치류 트랜스페린 수용체 중 2종 이상의 세포외 에피토프와 교차-반응성이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 분자 페이로드에 공유 연결된 항체를 포함하는 복합체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 진단제 또는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 항체 및 분자 페이로드는 링커를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 발린-시트룰린 서열을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 개시된 항체 또는 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 세포를 본원에 개시된 복합체 또는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 분자 페이로드를 전달하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 근육 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체 내의 세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 복합체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 근육에 분자 페이로드를 전달하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내 투여이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 복합체 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 분자 페이로드는 치료제인, 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 질환은 근육 질환이고, 분자 페이로드는 근육 질환을 치료하기 위한 약물이다. 일부 실시양태에서, 근육 질환은 희귀 근육 질환 또는 근육 위축이다.
도 1a-1f는 ELISA에 의해 측정된, 인간 TfR1 (hTfR1) 또는 시노몰구스 원숭이 TfR1 (cTfR1)에 대한 인간화 항-TfR Fab의 결합을 보여준다. 도 1a는 hTfR1에 대한 인간화 3M12 변이체의 결합을 보여준다. 도 1b는 cTfR1에 대한 인간화 3M12 변이체의 결합을 보여준다. 도 1c는 hTfR1에 대한 인간화 3A4 변이체의 결합을 보여준다. 도 1d는 cTfR1에 대한 인간화 3A4 변이체의 결합을 보여준다. 도 1e는 hTfR1에 대한 인간화 5H12 변이체의 결합을 보여준다. 도 1f는 hTfR1에 대한 인간화 5H12 변이체의 결합을 보여준다.
도 2는 횡문근육종 (RD) 세포 내로의 항-TfR Fab 접합체의 정량화된 세포 흡수를 보여준다. 시험된 접합체 내의 분자 페이로드는 DMPK-표적화 올리고뉴클레오티드이고, 접합체의 흡수는 나타낸 항-TfR Fab에 의해 용이해졌다. 음성 대조군 Fab (항-마우스 TfR) 또는 양성 대조군 Fab (항-인간 TfR1)를 갖는 접합체가 또한 본 검정에 포함된다. 세포를 100 nM의 농도의 나타낸 접합체와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 흡수를 평균 사이퍼5e(Cypher5e) 형광에 의해 측정하였다.
도 3a-3f는 ELISA에 의해 측정된, 인간 TfR1 (hTfR1) 및 시노몰구스 원숭이 TfR1 (cTfR1)에 대한 올리고뉴클레오티드-접합된 또는 비접합된 인간화 항-TfR Fab의 결합을 보여준다. 도 3a는 hTfR1에 대한 인간화 3M12 변이체 단독 또는 DMPK 표적화 올리고와의 접합체의 결합을 보여준다. 도 3b는 cTfR1에 대한 인간화 3M12 변이체 단독 또는 DMPK 표적화 올리고와의 접합체의 결합을 보여준다. 도 3c는 hTfR1에 대한 인간화 3A4 변이체 단독 또는 DMPK 표적화 올리고와의 접합체의 결합을 보여준다. 도 3d는 cTfR1에 대한 인간화 3A4 변이체 단독 또는 DMPK 표적화 올리고와의 접합체의 결합을 보여준다. 도 3e는 hTfR1에 대한 인간화 5H12 변이체 단독 또는 DMPK 표적화 올리고와의 접합체의 결합을 보여준다. 도 3f는 cTfR1에 대한 인간화 5H12 변이체의 단독 또는 DMPK 표적화 올리고와의 접합체의 결합을 보여준다. 각각의 EC50 값이 또한 제시된다.
도 4는 DMPK-표적화 올리고뉴클레오티드 (ASO300)에 접합된 나타낸 인간화 항-TfR Fab 항체를 함유하는 다양한 농도의 접합체로 처리된 RD 세포에서의 DMPK 발현을 보여준다. 처리 지속기간은 3일이었다. 형질감염제를 사용하여 전달된 ASO300 ("형질감염(Trans)"으로 라벨링됨)을 대조군으로서 사용하였다.
도 5는 정맥내 투여 후 시간 경과에 따른 다양한 종에서의 항-TfR 항체와 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 연결하는 데 사용된 링커의 혈청 안정성을 보여준다.
도 6은 DMD 엑손-스킵핑 올리고뉴클레오티드에 접합된 지정된 항-TfR Fab (3M12 VH3/VK2, 3M12 VH4/VK3 및 3A4 VH3 N54S/VK4)를 함유하는 접합체가 DMD 환자 근관에서 네이키드 DMD 엑손 스킵핑 올리고와 비교하여 증진된 엑손 스킵핑을 유발하였다는 것을 예시하는 데이터를 보여준다.
도 7a-7e는 인간 TfR1을 발현하는 마우스 (hTfR1 녹-인 마우스)에서 DMPK mRNA 발현을 감소시키는 데 있어서 DMPK 표적화 올리고뉴클레오티드에 접합된 지정된 항-TfR Fab (대조군, 3M12 VH3/VK2, 3M12 VH4/VK3 및 3A4 VH3 N54S/VK4)를 함유하는 접합체의 생체내 활성을 보여준다. 도 7a는 실험 설계 (예를 들어, IV 투여량, 투여 빈도)를 보여준다. DMPK mRNA 수준을 마우스의 전경골근 (도 7b), 비복근 (도 7c), 심장 (도 7d) 및 횡격막 (도 7e)에서 제1 용량 14일 후에 측정하였다.
도 8은 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3의 230 pM 내지 500 nM의 Fab의 농도 범위에서의 재조합 인간 (원형), 시노몰구스 원숭이 (정사각형), 마우스 (상향 삼각형) 또는 래트 (하향 삼각형) TfR1 단백질에 대한 결합의 ELISA 측정치를 보여준다. 측정 결과는 항-TfR Fab가 인간 및 시노몰구스 원숭이 TfR1과 반응성임을 보여준다. 마우스 또는 래트 재조합 TfR1에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 데이터는 기준선에 대해 정규화된 상대 형광 단위로서 제시된다.
도 9는 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3의 230 pM 내지 500 nM의 Fab의 농도 범위에 걸친 재조합 인간 TfR1 또는 TfR2에 대한 친화도를 시험하는 ELISA의 결과를 보여준다. 데이터는 기준선에 대해 정규화된 상대 형광 단위로서 제시된다. 결과는 Fab가 재조합 인간 TfR2에 결합하지 않는다는 것을 입증한다.
도 10은 PBS에서 또는 래트, 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간 혈청에서 72시간 인큐베이션에 걸쳐 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3을 대조군 안티센스 올리고뉴클레오티드에 연결시키는 데 사용된 링커의 혈청 안정성을 보여준다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 인간 TfR에 대한 높은 결합 친화도 및 특이성을 나타낸 인간화 항-TfR 항체, 예를 들어 표 3에 열거된 항체의 개발에 기초한다. 연구, 진단/검출 및 치료 용도에서의 항-TfR 항체 및 그의 변이체의 용도가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 소분자)를 TfR을 발현하는 표적 세포 또는 조직에 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 전달될 분자 페이로드는 항-TfR 항체에 접합되고, TfR을 발현하는 표적 세포 또는 조직으로 수용체 내재화를 통해 전달된다. TfR을 발현하고 본원에 기재된 항-TfR 항체를 사용하여 표적화될 수 있는 예시적인 조직은 비제한적으로 뇌, 근육, 부신, 충수, 골수, 결장, 십이지장, 자궁내막, 식도, 지방, 담낭, 심장, 신장, 간, 폐, 림프절, 난소, 췌장, 태반, 전립선, 타액선, 피부, 소장, 비장, 위, 고환, 갑상선, 방광을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 접근법은 근육 세포에서 유익한 효과를 갖고, 어려운 것으로 입증된 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 전달에 유익한 효과를 갖는다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항-TfR 항체가 다른 공지된 항-TfR 항체와 비교하여 분자 페이로드를 표적 세포 (예를 들어, 근육 세포) 내로 전달하는 데 우수한 활성을 갖는다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 또한 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR1 항체 중 어느 하나를 포함하는 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복합체는, 예를 들어 희귀 근육 질환 또는 근육 위축 (예를 들어, 표 6에 열거된 바와 같음)을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 근육 세포에 표적 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 분자 페이로드를 전달하는 데 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 복합체는 신경계 질환 (예를 들어, 표 7에 열거된 바와 같음)을 치료하기 위해 뇌에 약물을 전달하는 데 특히 유용하다.
정의된 용어의 설명을 포함한 본 개시내용의 추가 측면이 하기에 제공된다.
I. 정의
투여: 본원에 사용된 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 생리학상 및/또는 (예를 들어, 및) 약리학상 유용한 (예를 들어, 대상체에서 상태를 치료하기 위한) 방식으로 대상체에게 복합체를 제공하는 것을 의미한다.
대략: 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 1개 이상의 관심 값에 적용되는 경우에 기재된 언급 값에 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않거나 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 기재된 언급 값의 어느 방향으로 (초과 또는 미만) 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
항체: 본원에 사용된 용어 "항체"는 적어도 1개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 또는 적어도 1개의 항원 결정기, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 파라토프를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 또는 scFv 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 낙타류 항체로부터 유래된 나노바디 또는 상어 항체로부터 유래된 나노바디이다. 일부 실시양태에서, 항체는 디아바디이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 배선 서열을 갖는 프레임워크를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 IgG, IgG1, IgG2, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM 및 IgE 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및/또는 (예를 들어, 및) 경쇄 (L) 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 불변 도메인, 예를 들어 Fc 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 지칭한다. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열 및 그의 기능적 변이는 공지되어 있다. 중쇄와 관련하여, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 알파 (α), 델타 (Δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 인간 알파 (α), 델타 (Δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 감마 1 CH1, CH2 및/또는 (예를 들어, 및) CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 아미노산 서열은 인간 감마 (γ) 중쇄 불변 영역, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적 예는 관련 기술분야에 기재되었으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,693,780 및 상기 문헌 [Kabat E A et al., (1991)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은 본원에 제공된 임의의 가변 쇄 불변 영역에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 변형되고, 예를 들어 글리코실화, 인산화, SUMO화 및/또는 (예를 들어, 및) 메틸화를 통해 변형된다. 일부 실시양태에서, 항체는 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자에 접합된 글리코실화 항체이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 N-글리코실화, O-글리코실화, C-글리코실화, GPI화 (GPI 앵커 부착) 및/또는 (예를 들어, 및) 포스포글리코실화를 통해 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드 또는 글리칸이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 분지형 올리고사카라이드 또는 분지형 글리칸이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 만노스 단위, 글루코스 단위, N-아세틸글루코사민 단위, N-아세틸갈락토사민 단위, 갈락토스 단위, 푸코스 단위 또는 인지질 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 링커 폴리펩티드 또는 이뮤노글로불린 불변 도메인에 연결된 본 개시내용의 1개 이상의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 구축물이다. 링커 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 1개 이상의 항원 결합 부분을 연결하는 데 사용된다. 링커 폴리펩티드의 예가 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 추가로, 항체는 항체 또는 항체 부분과 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오티닐화 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다.
CDR: 본원에 사용된 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 전형적인 항체 분자는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 이는 통상적으로 항원 결합에 수반된다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역" ("FR")으로 공지된 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, "상보성 결정 영역" ("CDR")으로도 공지된 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 프레임워크 영역 및 CDR의 정도는 관련 기술분야에 공지된 방법론을 사용하여, 예를 들어 카바트 정의, IMGT 정의, 코티아 정의, AbM 정의 및/또는 (예를 들어, 및) 접촉 정의에 의해 정확하게 확인될 수 있으며, 이들 모두는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® http://www.imgt.org, Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999); Ruiz, M. et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); Lefranc, M.-P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); Lefranc, M.-P., Nucleic Acids Res., 31:307-310 (2003); Lefranc, M.-P. et al., In Silico Biol., 5, 0006 (2004) [Epub], 5:45-60 (2005); Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 33:D593-597 (2005); Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 37:D1006-1012 (2009); Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 43:D413-422 (2015); Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; 및 Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)]을 참조한다. 또한 hgmp.mrc.ac.uk 및 bioinf.org.uk/abs를 참조한다. 본원에 사용된 CDR은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 동일한 CDR을 갖는 2종의 항체는 2종의 항체가 동일한 방법, 예를 들어 IMGT 정의에 의해 결정 시 그 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역에 3개의 CDR이 존재하며, 이는 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 본원에 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 군을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 카바트에 의해 기재된 시스템 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명백한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. CDR의 하위-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로 지정될 수 있으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지정한다. 이들 영역은 코티아 CDR로 지칭될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌 [Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) 및 MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))]에 기재되었다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 시스템 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있으나 그럼에도 불구하고 카바트 CDR과 중첩될 것이며, 다만 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용된 방법은 임의의 이들 시스템에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. CDR 정의 시스템의 예가 표 1에 제공된다.
표 1. CDR 정의
Figure pct00001
1 IMGT®, 국제 이뮤노제네틱스 정보 시스템(international ImMunoGeneTics information system)®, imgt.org, [Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999)]
2 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]
3 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))]
CDR-그라프트된 항체: 용어 "CDR-그라프트된 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하나, VH 및/또는 (예를 들어, 및) VL의 CDR 영역 중 1개 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체, 예컨대 뮤린 CDR 중 1개 이상 (예를 들어, CDR3)이 인간 CDR 서열로 대체된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.
키메라 항체: 용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 또 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예컨대 인간 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.
상보적: 본원에 사용된 용어 "상보적"은 2개의 뉴클레오티드 또는 2개 세트의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성 능력을 지칭한다. 특히, 상보적은 2개의 뉴클레오티드 또는 2개 세트의 뉴클레오티드 사이의 결합을 가져오는 수소 결합 쌍형성의 정도를 특징화하는 용어이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 한 위치에서의 염기가 표적 핵산 (예를 들어, mRNA)의 상응하는 위치에서의 염기와 수소 결합할 수 있으면, 염기들이 그 위치에서 서로에 대해 상보적인 것으로 간주된다. 염기 쌍형성은 정규 왓슨-크릭 염기 쌍형성 및 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성 (예를 들어, 워블 염기 쌍형성 및 후그스틴 염기 쌍형성) 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상보적 염기 쌍형성의 경우, 아데노신-유형 염기 (A)는 티미딘-유형 염기 (T) 또는 우라실-유형 염기 (U)에 대해 상보적이고, 시토신-유형 염기 (C)는 구아노신-유형 염기 (G)에 대해 상보적이고, 범용 염기, 예컨대 3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌은 임의의 A, C, U 또는 T에 혼성화할 수 있고 그에 대해 상보적인 것으로 간주된다. 이노신 (I)은 또한 관련 기술분야에서 범용 염기인 것으로 간주되어 왔고, 임의의 A, C, U 또는 T에 대해 상보적인 것으로 간주된다.
보존적 아미노산 치환: 본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대 전하 또는 크기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경시키는 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예컨대 이러한 방법을 편집해 놓은 참고문헌, 예를 들어 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 발견된다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군 내의 아미노산들 사이에 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
공유 연결된: 본원에 사용된 용어 "공유 연결된"은 2개 이상의 분자가 적어도 1개의 공유 결합을 통해 함께 연결된 특징을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2개의 분자는 분자들 사이의 링커로서의 역할을 하는 단일 결합, 예를 들어 디술피드 결합 또는 디술피드 가교에 의해 함께 공유 연결될 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 2개 이상의 분자는 다중 공유 결합을 통해 2개 이상의 분자를 함께 연결하는 링커로서의 역할을 하는 분자를 통해 함께 공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 링커는 비-절단가능한 링커일 수 있다.
교차-반응성: 본원에서 표적화제 (예를 들어, 항체)와 관련하여 사용된 용어 "교차-반응성"은 유사한 친화도 또는 결합력으로 유사한 유형 또는 부류의 1종 초과의 항원 (예를 들어, 다수의 상동체, 파라로그 또는 오르토로그의 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 작용제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유사한 유형 또는 부류의 인간 및 비-인간 영장류 항원 (예를 들어, 인간 트랜스페린 수용체 및 비-인간 영장류 트랜스페린 수용체)에 대해 교차-반응성인 항체는 유사한 친화도 또는 결합력으로 인간 항원 및 비-인간 영장류 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 유사한 유형 또는 부류의 인간 항원 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 항체는 유사한 유형 또는 부류의 설치류 항원 및 비-인간 영장류 항원에 대해 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 항체는 유사한 유형 또는 부류의 인간 항원, 비-인간 영장류 항원 및 설치류 항원에 대해 교차-반응성이다.
프레임워크: 본원에 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 지칭한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미는 상응하는 상이한 해석에 따른다. 6개의 CDR (경쇄의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 및 중쇄의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상에서 4개의 하위-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 분류하며, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에, CDR2는 FR2와 FR3 사이에, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정한 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 명시하지 않으면서, 다른 것으로 지칭되는 프레임워크 영역은, 단일의 자연 발생 이뮤노글로불린 쇄의 가변 영역 내의 조합 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 FR은 4개의 하위-영역 중 1개를 나타내고, FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위-영역 중 2개 이상을 나타낸다. 인간 중쇄 및 경쇄 수용자 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 관련 기술분야에 공지된 수용자 서열은 본원에 개시된 항체에 사용될 수 있다.
인간 항체: 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 인간 항체는, 예를 들어 CDR, 특히 CDR3 내에, 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프트된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
인간화 항체: 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 (예를 들어, 및) VL 서열의 적어도 한 부분이 보다 "인간-유사"하도록, 즉 인간 배선 가변 서열과 보다 유사하도록 변경된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 한 유형은 인간 CDR 서열이 비-인간 VH 및 VL 서열에 도입되어 상응하는 비인간 CDR 서열을 대체하는 CDR-그라프트된 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항-TfR 항체 및 항원 결합 부분이 제공된다. 이러한 항체는 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 뮤린 항-트랜스페린 수용체 모노클로날 항체를 수득하고, 이어서 시험관내 유전자 조작, 예컨대 PCT 공개 번호 WO 2005/123126 A2 (Kasaian et al.)에 개시된 것을 사용하여 인간화함으로써 생성될 수 있다.
단리된 항체: 본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다 (예를 들어, 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 트랜스페린 수용체 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 트랜스페린 수용체 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 트랜스페린 수용체 분자에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 (예를 들어, 및) 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
분자 페이로드: 본원에 사용된 용어 "분자 페이로드"는 생물학적 결과를 조정하는 기능을 하는 분자 또는 종을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 항-TfR 항체에 연결되거나 또는 달리 그와 회합된다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 소분자, 단백질, 펩티드, 핵산 또는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 DNA 서열의 전사를 조정하거나, 단백질의 발현을 조정하거나 또는 단백질의 활성을 조정하는 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 표적 유전자에 대한 상보성 영역을 갖는 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 최대 200개의 뉴클레오티드 길이의 올리고머 핵산 화합물을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 예는 RNAi 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA, shRNA), 마이크로RNA, 갭머, 믹스머, 포스포로디아미다이트 모르폴리노, 펩티드 핵산, 압타머, 가이드 핵산 (예를 들어, Cas9 가이드 RNA) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-O-메틸 당 변형, 퓨린 또는 피리미딘 변형)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 Rp 또는 Sp 입체화학적 입체형태일 수 있는 1개 이상의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다.
재조합 항체: 본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체 (본 개시내용에 보다 상세히 기재됨), 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 (예를 들어, 문헌 [Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370] 참조) 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용되고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그와 관련되지만 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다. 본 개시내용의 한 실시양태는 인간 트랜스페린 수용체에 결합할 수 있는 완전 인간 항체를 제공하며, 이는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예컨대, 비제한적으로 인간 Ig 파지 라이브러리, 예컨대 PCT 공개 번호 WO 2005/007699 A2 (Jermutus et al.)에 개시된 것을 사용하여 생성될 수 있다.
상보성 영역: 본원에 사용된 용어 "상보성 영역"은 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 동족 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열에 대해, 2개의 뉴클레오티드 서열이 생리학적 조건 하에 (예를 들어, 세포에서) 서로에 대해 어닐링될 수 있도록 하는 데 충분히 상보적인 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열에 대해 완전히 상보적이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열에 대해 부분적으로 상보적이다 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 상보성). 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열과 비교하여 1, 2, 3 또는 4개의 미스매치를 함유한다.
특이적으로 결합한다: 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 분자가 결합 검정 또는 다른 결합 상황에서 결합 파트너를 적절한 대조군과 구별하는 데 사용될 수 있게 하는 친화도 또는 결합력의 정도로 분자가 결합 파트너에 결합하는 능력을 지칭한다. 항체와 관련하여, 용어 "특이적으로 결합한다"는 적절한 참조 항원 또는 항원들과 비교하여, 항체가 특이적 항원을 다른 것과 구별하는 데, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 항원에 대한 결합을 통해 특정 세포, 예를 들어 근육 세포에 대한 우선적 표적화를 허용하는 정도로 사용될 수 있게 하는 친화도 또는 결합력의 정도로 항체가 특이적 항원에 결합하는 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체가 표적에의 결합에 대한 KD가 적어도 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만인 경우에 항체는 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합한다.
대상체: 본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류 또는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자, 예를 들어 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는, 예를 들어 DMPK 대립유전자 내 질환-연관-반복부 확장으로 인한 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 인간 환자이다.
트랜스페린 수용체: 본원에 사용된 용어 "트랜스페린 수용체" (TFRC, CD71, p90, TFR 또는 TFR1로도 공지됨)는 트랜스페린에 결합하여 세포내이입에 의한 철 흡수를 용이하게 하는 내재화 세포 표면 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 트랜스페린 수용체는 인간 (NCBI 진(Gene) ID 7037), 비-인간 영장류 (예를 들어, NCBI 진 ID 711568 또는 NCBI 진 ID 102136007) 또는 설치류 (예를 들어, NCBI 진 ID 22042) 기원의 것일 수 있다. 추가로, 수용체의 상이한 이소형을 코딩하는 다수의 인간 전사체 변이체 (예를 들어, 진뱅크(GenBank) RefSeq 수탁 번호: NP_001121620.1, NP_003225.2, NP_001300894.1 및 NP_001300895.1 하에 주석달린 바와 같음)가 특징화되었다.
NCBI 서열 NP_003225.2 (트랜스페린 수용체 단백질 1 이소형 1, 호모 사피엔스(homo sapiens))에 상응하는 인간 트랜스페린 수용체 아미노산 서열의 예는 하기와 같다:
Figure pct00002
NCBI 서열 NP_001244232.1 (트랜스페린 수용체 단백질 1, 마카카 물라타(Macaca mulatta))에 상응하는 비-인간 영장류 트랜스페린 수용체 아미노산 서열의 예는 하기와 같다:
Figure pct00003
NCBI 서열 XP_005545315.1 (트랜스페린 수용체 단백질 1, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에 상응하는 비-인간 영장류 트랜스페린 수용체 아미노산 서열의 예는 하기와 같다:
Figure pct00004
NCBI 서열 NP_001344227.1 (트랜스페린 수용체 단백질 1, 무스 무스쿨루스(mus musculus))에 상응하는 마우스 트랜스페린 수용체 아미노산 서열의 예는 하기와 같다:
Figure pct00005
2'-변형된 뉴클레오시드: 본원에 사용된 용어 "2'-변형된 뉴클레오시드" 및 "2'-변형된 리보뉴클레오시드"는 상호교환가능하게 사용되고, 2' 위치에서 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형된 뉴클레오시드는 당의 2' 및 4' 위치가 (예를 들어, 메틸렌, 에틸렌 또는 (S)-구속성 에틸 가교를 통해) 가교된 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 2'-변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 당 모이어티의 2' 위치가 치환된 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드이다. 2'-변형된 뉴클레오시드의 비제한적 예는 2'-데옥시, 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA), 잠금 핵산 (LNA, 메틸렌-가교 핵산), 에틸렌-가교 핵산 (ENA) 및 (S)-구속성 에틸-가교 핵산 (cEt)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 2'-변형된 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오티드이고, 2'-변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 비변형된 올리고뉴클레오티드에 비해 표적 서열에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 2'-변형된 뉴클레오시드의 구조의 예가 하기에 제공된다:
Figure pct00006
II. 항-TfR 항체
일부 실시양태에서, 트랜스페린 수용체에 결합하는 작용제, 예를 들어 항-TfR 항체는 근육 세포를 표적화할 수 있고/거나 (예를 들어, 있고) 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 작용제의 수송을 매개할 수 있다. 트랜스페린 수용체는 세포 막을 가로질러 트랜스페린을 수송하고 세포내 철 수준의 조절 및 항상성에 참여하는 내재화 세포 표면 수용체이다. 본 개시내용의 일부 측면은 트랜스페린 수용체에 결합할 수 있는 트랜스페린 수용체 결합 단백질을 제공한다. 트랜스페린 수용체에 결합하는, 예를 들어 특이적으로 결합하는 항체는 트랜스페린 수용체에 결합 시, 예를 들어 수용체-매개 세포내이입을 통해 세포 내로 내재화될 수 있다.
일부 측면에서, 트랜스페린 수용체에 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 인간화 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 트랜스페린 수용체의 임의의 세포외 에피토프 또는 항체에 노출되게 되는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 인간화 항-TfR 항체는 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트 등으로부터의 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 인간화 항-TfR 항체는 인간 트랜스페린 수용체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 105-108에 제공된 바와 같은 인간 또는 비-인간 영장류 트랜스페린 수용체의 아미노산 절편에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 트랜스페린 수용체의 정단 도메인에 존재하지 않는, 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 인간 트랜스페린 수용체의 아미노산 90-96에 상응하는 아미노산 절편에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 TfR1에 결합하지만 TfR2에는 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체 (예를 들어, 3M12 및 인간화 변이체)는 TfR1 내의 에피토프에 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 105의 아미노산 258-291 및/또는 아미노산 358-381 내의 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체 (예를 들어, 3M12 및 인간화 변이체)는 서열식별번호: 105의 아미노산 258-291 및 아미노산 358-381 내의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체 (예를 들어, 3M12 및 인간화 변이체)는 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 인간 TfR1의 잔기 K261, S273, Y282, T362, S368, S370 및 K371 중 1개 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체 (예를 들어, 3M12 및 인간화 변이체)는 서열식별번호: 105에 제시된 바와 같은 인간 TfR1의 잔기 K261, S273, Y282, T362, S368, S370 및 K371을 포함하는 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-TFR 항체는 TfR1 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류 TfR1)에 적어도 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 결합 친화도 (예를 들어, Kd에 의해 나타낸 바와 같음)로 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 나노몰 미만의 범위의 KD로 TfR1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 트랜스페린 수용체 1 (TfR1)에 선택적으로 결합하지만, 트랜스페린 수용체 2 (TfR2)에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 인간 TfR1 및 시노 TfR1에 결합하지만 (예를 들어, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 Kd로), 마우스 TfR1에는 결합하지 않는다. 항-TfR 항체의 친화도 및 결합 동역학은 바이오센서 기술 (예를 들어, 옥테트(OCTET) 또는 비아코어(BIACORE))을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나의 결합은 TfR1에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하지 않거나 또는 그를 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나의 결합은 TfR1에 대한 HFE-베타-2-마이크로글로불린 결합과 경쟁하지 않거나 또는 그를 억제하지 않는다.
본원에 기재된 항-TfR 항체는 인간화 항체이다. 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체가 유래된 마우스 모노클로날 항-TfR 항체의 CDR 및 가변 영역 아미노산 서열이 표 2에 제공된다.
표 2. 마우스 모노클로날 항-TfR 항체
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
* 돌연변이 위치는 돌연변이를 함유하는 각각의 VH 서열의 카바트 넘버링에 따른다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR 항체는 표 2에 제공된 항-TfR 항체 중 어느 하나의 인간화 변이체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR 항체는 표 2에 제공된 항-TfR 항체 중 어느 하나에서의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3과 동일한 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 인간화 중쇄 가변 영역 및/또는 (예를 들어, 및) 인간화 경쇄 가변 영역을 포함한다.
인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 실시양태에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않고 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않지만 항체 성능을 추가로 정밀화하고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화 항체는 원래 항체에 비해 변경된 1개 이상의 CDR (1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 가지며, 이는 또한 원래 항체로부터의 1개 이상의 CDR로부터 유래된 1개 이상의 CDR로 명명된다. 인간화 항체는 또한 친화도 성숙을 수반할 수 있다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Almagro et al., Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005); Padlan et al., Mol. Immunol. 28:489-498 (1991); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005); Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005); 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)]에 기재된 바와 같이 공지되어 있으며, 이들 모두의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, 예를 들어 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993); Almagro et al., Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997); 및 Rosok et al., J Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)]에 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 표 2에 열거된 VH 중 어느 하나와 비교하여 (예를 들어, VH 프레임워크 영역에) 1개 이상의 아미노산 변이를 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 표 2에 열거된 VL 중 어느 하나와 비교하여 (예를 들어, VL 프레임워크 영역에) 1개 이상의 아미노산 변이를 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 표 2에 열거된 임의의 항-TfR 항체의 VH (예를 들어, 서열식별번호: 17, 22, 26, 43, 61, 65 및 68 중 어느 하나)와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 표 2에 열거된 항-TfR 항체 중 어느 하나의 VL (예를 들어, 서열식별번호: 18, 44 및 62 중 어느 하나)과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 프레임워크 영역에서 표 2에 열거된 임의의 항-TfR 항체의 VH (예를 들어, 서열식별번호: 17, 22, 26, 43, 61, 65 및 68 중 어느 하나)에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 프레임워크 영역에서 표 2에 열거된 임의의 항-TfR 항체의 VL (예를 들어, 서열식별번호: 18, 44 및 62 중 어느 하나)에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 26에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 항-TfR 항체는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (IMGT 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 18에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 26에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (IMGT 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 18 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 26에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (카바트 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 18에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 26에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (카바트 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 18 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 26에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (코티아 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 18에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 26에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 항-TfR 항체는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (코티아 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 18 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (IMGT 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 44에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (IMGT 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 44에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (카바트 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 44에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (카바트 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 44에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (코티아 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 44에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (코티아 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 44에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 63 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 65 또는 서열식별번호: 68에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (IMGT 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 62에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 63 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 68에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (IMGT 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 62에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 64 또는 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 68에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (카바트 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 62에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 64 또는 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 68에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (카바트 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 62에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 58의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 68에 제시된 바와 같은 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (코티아 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하고, 서열식별번호: 62에 제시된 바와 같은 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 58의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 68에 제시된 바와 같은 VH에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1 (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 (코티아 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 프레임워크 영역에서 서열식별번호: 62에 제시된 바와 같은 VL에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일하다.
본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체의 아미노산 서열의 예가 표 3에 제공된다.
표 3. 인간화 항-TfR 항체의 가변 영역
Figure pct00010
Figure pct00011
* 돌연변이 위치는 돌연변이를 함유하는 각각의 VH 서열의 카바트 넘버링에 따른다.
** 카바트 넘버링 시스템에 따른 CDR은 볼드체이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 표 2에 제공된 항-TfR 항체 중 어느 하나의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 인간화 VH를 포함하고, 표 3에 제공된 각각의 인간화 VH와 비교하여 프레임워크 영역에 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)의 아미노산 변이를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 표 2에 제공된 항-TfR 항체 중 어느 하나의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 인간화 VL을 포함하고, 표 3에 제공된 각각의 인간화 VL과 비교하여 프레임워크 영역에 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)의 아미노산 변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 69에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 70에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 71에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 70에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 72에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 70에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 74에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 75에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 76에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 74에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 76에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 75에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 77에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 78에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 79에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 80에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 77에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 80에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 인간 항체로부터의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는 전장 IgG이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-TfR 항체의 중쇄는 중쇄 불변 영역 (CH) 또는 그의 부분 (예를 들어, CH1, CH2, CH3 또는 그의 조합)을 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 임의의 적합한 기원, 예를 들어 인간, 마우스, 래트 또는 토끼의 것일 수 있다. 하나의 구체적 예에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG (감마 중쇄), 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 것이다. 인간 IgG1 불변 영역의 예가 하기에 주어진다:
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 항-TfR 항체의 중쇄는 돌연변이 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1의 CH2 도메인에서 LALA 돌연변이 (하부 힌지 잔기 Leu234 Leu235를 Ala234 및 Ala235로 대체하도록 돌연변이된 mAb b12로부터 유래된 돌연변이체)의 도입은 Fcγ 수용체 결합을 감소시키는 것으로 공지되어 있다 (Bruhns, P., et al. (2009) 및 Xu, D. et al. (2000)). 돌연변이 인간 IgG1 불변 영역이 하기에 제공된다 (돌연변이는 볼드체 및 밑줄표시됨):
Figure pct00013
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 항-TfR 항체의 경쇄는 관련 기술분야에 공지된 임의의 경쇄 불변 영역 (CL)일 수 있는 CL을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, CL은 카파 경쇄이다. 다른 예에서, CL은 람다 경쇄이다. 일부 실시양태에서, CL은 카파 경쇄이며, 이의 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00014
다른 항체 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 IMGT 데이터베이스 (www.imgt.org) 또는 www.vbase2.org/vbstat.php.에 제공되어 있으며, 이들 둘 다는 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VH 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 81 또는 서열식별번호: 82에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VH 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 81 또는 서열식별번호: 82와 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VH 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 81에 제시된 바와 같은 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VH 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 82에 제시된 바와 같은 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VL 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 83에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VL 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 83과 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VL 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 83에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
기재된 항-TfR 항체의 IgG 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 예가 하기 표 4에 제공된다.
표 4. 인간화 항-TfR IgG의 예의 중쇄 및 경쇄 서열
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
* 돌연변이 위치는 돌연변이를 함유하는 각각의 VH 서열의 카바트 넘버링에 따른다.
** 카바트 넘버링 시스템에 따른 CDR은 볼드체이고; VH/VL 서열은 밑줄표시된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 84, 86, 87, 88, 91, 92 및 94 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄와 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 중쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 85, 89, 90, 93 및 95 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄와 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 84, 86, 87, 88, 91, 92 및 94 중 어느 하나에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 85, 89, 90, 93 및 95 중 어느 하나에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 서열식별번호: 84, 86, 87, 88, 91, 92 및 94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본원에 기재된 항-TfR 항체는 서열식별번호: 85, 89, 90, 93 및 95 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 84에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 86에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 87에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 89에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 91에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 89에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 91에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 93에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 94에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 95에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 95에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-TfR 항체는 무손상 항체 (전장 항체)의 Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편이다. 무손상 항체 (전장 항체)의 항원 결합 단편은 상용 방법을 통해 (예를 들어, 재조합적으로 또는 전장 IgG의 중쇄 불변 영역을 효소, 예컨대 파파인을 사용하여 소화시킴으로써) 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 생산될 수 있고, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR1 항체의 Fab 단편 내의 중쇄 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00018
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VH 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 96에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VH 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 96과 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VH 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 96에 제시된 바와 같은 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VL 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 83에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VL 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 83과 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 표 3에 열거된 바와 같은 VL 중 어느 하나 또는 그의 임의의 변이체 및 서열식별번호: 83에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
기재된 항-TfR 항체의 Fab 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 예가 하기 표 5에 제공된다.
표 5. 인간화 항-TfR Fab의 예의 중쇄 및 경쇄 서열
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
* 돌연변이 위치는 돌연변이를 함유하는 각각의 VH 서열의 카바트 넘버링에 따른다.
** 카바트 넘버링 시스템에 따른 CDR은 볼드체이고; VH/VL 서열은 밑줄표시된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 97-103 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄와 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 중쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 85, 89, 90, 93 및 95 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄와 비교하여 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 97-103 중 어느 하나에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 85, 89, 90, 93 및 95 중 어느 하나에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 서열식별번호: 97-103 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본원에 기재된 항-TfR 항체는 서열식별번호: 85, 89, 90, 93 및 95 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 97에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 98에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 99에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 85에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 100에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 89에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 100에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 101에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 89에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 101에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 90에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 102에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 93에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 103에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 95에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 102에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 서열식별번호: 95에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항-TfR 항체는 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 수용체 항체는 무손상 (즉, 전장) 항체, 그의 항원-결합 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 항체, 이중특이적 항체 또는 나노바디를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 항체 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 scFv-Fab (예를 들어, 불변 영역의 부분에 융합된 scFv)이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 수용체 항체는 N-말단 또는 C-말단에서 불변 영역 (예를 들어, 서열식별번호: 81 또는 서열식별번호: 82에 제시된 바와 같은 인간 IgG1 불변 영역 또는 그의 부분, 예컨대 Fc 부분)에 융합된 scFv이다.
일부 실시양태에서, 보존적 돌연변이는, 예를 들어 결정 구조에 기초하여 결정된 바와 같이, 잔기가 표적 항원 (예를 들어, 트랜스페린 수용체)과 상호작용하는 데 관여할 가능성이 없는 위치에서 항체 서열 (예를 들어, CDR 또는 프레임워크 서열) 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 치환)가 본원에 기재된 항-TfR 항체의 Fc 영역 내로 (예를 들어, CH2 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 (예를 들어, 및) CH3 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447) 및/또는 (예를 들어, 및) 힌지 영역에 (여기서 넘버링은 카바트 넘버링 시스템 (예를 들어, 카바트에서의 EU 인덱스)에 따름)) 도입되어 항체의 1종 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 (예를 들어, 및) 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시킨다.
일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 치환)가, 예를 들어 미국 특허 번호 5,677,425에 기재된 바와 같이 Fc 영역의 힌지 영역 (CH1 도메인) 내로 도입되어 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 개수가 변경 (예를 들어, 증가 또는 감소)된다. CH1 도메인의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 개수는 변경되어, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 변경 (예를 들어, 증가 또는 감소)시키거나 또는 링커 접합을 용이하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 치환)가 본원에 기재된 근육-표적화 항체의 Fc 영역 내로 (예를 들어, CH2 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 (예를 들어, 및) CH3 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447) 및/또는 (예를 들어, 및) 힌지 영역에 (여기서 넘버링은 카바트 넘버링 시스템 (예를 들어, 카바트에서의 EU 인덱스)에 따름)) 도입되어 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체 (예를 들어, 활성화된 Fc 수용체)에 대한 항체의 친화도를 증가 또는 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 항체의 친화도를 감소 또는 증가시키는 항체의 Fc 영역 내의 돌연변이 및 Fc 수용체 또는 그의 단편 내로 이러한 돌연변이를 도입하는 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. Fc 수용체에 대한 항체의 친화도를 변경시키도록 제조될 수 있는 항체의 Fc 수용체 내의 돌연변이의 예는, 예를 들어 문헌 [Smith P et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186], 미국 특허 번호 6,737,056 및 국제 공개 번호 WO 02/060919; WO 98/23289; 및 WO 97/34631에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 아미노산 돌연변이 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)가 IgG 불변 도메인 또는 그의 FcRn-결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편) 내로 도입되어 생체내 항체의 반감기를 변경 (예를 들어, 감소 또는 증가)시킨다. 생체내 항체의 반감기를 변경 (예를 들어, 감소 또는 증가)시킬 돌연변이의 예에 대해서는, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 02/060919; WO 98/23289; 및 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 5,869,046, 6,121,022, 6,277,375 및 6,165,745를 참조한다.
일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 아미노산 돌연변이 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)가 IgG 불변 도메인 또는 그의 FcRn-결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편) 내로 도입되어 생체내 항-항-TfR 항체의 반감기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 아미노산 돌연변이 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)가 IgG 불변 도메인 또는 그의 FcRn-결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편) 내로 도입되어 생체내 항체의 반감기를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 제2 불변 (CH2) 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 (예를 들어, 및) 제3 불변 (CH3) 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447)에 1개 이상의 아미노산 돌연변이 (예를 들어, 치환)를 가질 수 있으며, 여기서 넘버링은 카바트에서의 EU 인덱스에 따른다 (Kabat E A et al., (1991) 상기 문헌). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 IgG1의 불변 영역은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된, 위치 252에서의 메티오닌 (M)에서 티로신 (Y)으로의 치환, 위치 254에서의 세린 (S)에서 트레오닌 (T)으로의 치환, 및 위치 256에서의 트레오닌 (T)에서 글루탐산 (E)으로의 치환을 포함한다. 미국 특허 번호 7,658,921을 참조하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. "YTE 돌연변이체"로 지칭되는 이러한 유형의 돌연변이 IgG는 동일한 항체의 야생형 버전과 비교하여 4배 증가된 반감기를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Dall'Acqua W F et al., (2006) J Biol Chem 281: 23514-24] 참조). 일부 실시양태에서, 항체는 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된 위치 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 및 428-436에서의 아미노산 잔기의 1, 2, 3개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 아미노산 치환이 IgG 불변 도메인 Fc 영역 내로 도입되어 항-항-TfR 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킨다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세히 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해)는 순환 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양 국재화를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 불변 도메인을 결실시키거나 불활성화시켜 종양 국재화를 증가시키는 돌연변이의 기재에 대해서는 미국 특허 번호 5,585,097 및 8,591,886을 참조한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환이 본원에 기재된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 상의 잠재적 글리코실화 부위를 제거할 수 있으며, 이는 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shields R L et al., (2001) J Biol Chem 276: 6591-604] 참조).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체의 불변 영역 내의 1개 이상의 아미노산은 상이한 아미노산 잔기로 대체되어 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 (예를 들어, 및) 감소 또는 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 CH2 도메인의 N-말단 영역 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 국제 공개 번호 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 Fc 영역은 변형되어 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 (예를 들어, 증가시키고) Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시킨다. 이러한 접근법은 국제 공개 번호 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 경쇄 가변 도메인(들) 서열(들)은, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 CDR-그라프트된, 키메라, 인간화 또는 복합 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는데 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 제공된 임의의 항체로부터 유래된 임의의 변이체, CDR-그라프트된, 키메라, 인간화 또는 복합 항체는 본원에 기재된 조성물 및 방법에 유용할 수 있고, 이러한 변이체, CDR-그라프트된, 키메라, 인간화 또는 복합 항체는 그가 유래한 원래 항체에 비해 트랜스페린 수용체에 대한 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 초과의 결합을 갖도록, 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 능력을 유지할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 바람직한 특성을 항체에 부여하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 천연 IgG4 mAb에 의해 발생하는 것으로 공지된 Fab-아암 교환으로 인한 잠재적 합병증을 피하기 위해, 본원에 제공된 항체는 세린 228 (EU 넘버링; 카바트 넘버링의 잔기 241)이 프롤린으로 전환되어 IgG1-유사 힌지 서열을 생성하는 안정화 'Adair' 돌연변이를 포함할 수 있다 (Angal S., et al., "A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody," Mol Immunol 30, 105-108; 1993). 따라서, 임의의 항체는 안정화 'Adair' 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 변형되고, 예를 들어 글리코실화, 인산화, SUMO화 및/또는 (예를 들어, 및) 메틸화를 통해 변형된다. 일부 실시양태에서, 항체는 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자에 접합된 글리코실화 항체이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 N-글리코실화, O-글리코실화, C-글리코실화, GPI화 (GPI 앵커 부착) 및/또는 (예를 들어, 및) 포스포글리코실화를 통해 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드 또는 글리칸이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 분지형 올리고사카라이드 또는 분지형 글리칸이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 만노스 단위, 글루코스 단위, N-아세틸글루코사민 단위, N-아세틸갈락토사민 단위, 갈락토스 단위, 푸코스 단위 또는 인지질 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 1-10, 약 1-5, 약 5-10, 약 1-4, 약 1-3 또는 약 2개의 당 분자가 존재한다. 일부 실시양태에서, 글리코실화 항체는 완전히 또는 부분적으로 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 항체는 화학 반응 또는 효소적 수단에 의해 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 항체는 시험관내에서 또는 임의로 N- 또는 O-글리코실화 경로 내의 효소, 예를 들어 글리코실트랜스퍼라제가 결핍되어 있을 수 있는 세포 내부에서 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 항체는 2014년 5월 1일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO2014065661 (발명의 명칭: "Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof")에 기재된 바와 같이 당 또는 탄수화물 분자로 관능화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR1 항체 중 어느 하나는 중쇄 및/또는 (예를 들어, 및) 경쇄 서열에 신호 펩티드 (예를 들어, N-말단 신호 펩티드)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR1 항체는 본원에 기재된 VH 및 VL 서열 중 어느 하나, IgG 중쇄 및 경쇄 서열 중 어느 하나, 또는 Fab 중쇄 및 경쇄 서열 중 어느 하나를 포함하고, 신호 펩티드 (예를 들어, N-말단 신호 펩티드)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 MGWSCIILFLVATATGVHS (서열식별번호: 104)의 아미노산 서열을 포함한다.
III. 항-TfR 항체의 제조
본원에 기재된 바와 같이 TfR에 결합할 수 있는 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원 (예를 들어, TfR)에 특이적인 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 임의로 담체 단백질, 예컨대 KLH에 커플링된 전장 표적 항원 또는 그의 단편은 그 항원에 결합하는 항체를 생성하기 위해 숙주 동물을 면역화시키는 데 사용될 수 있다. 숙주 동물의 면역화 경로 및 스케줄은 일반적으로 본원에 추가로 기재된 바와 같은 항체 자극 및 생산을 위한 확립되고 통상적인 기술에 따른다. 마우스, 인간화 및 인간 항체의 생산을 위한 일반적 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다. 인간을 포함한 임의의 포유동물 대상체 또는 그로부터의 항체 생산 세포는 인간 하이브리도마 세포주를 포함한, 포유동물의 생산을 위한 기초로서의 역할을 하도록 조작될 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 것을 포함한 소정량의 면역원이 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 족저내로 및/또는 (예를 들어, 및) 피내로 접종된다.
원하는 경우에, 관심 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날) (예를 들어, 하이브리도마에 의해 생산됨)는 서열분석될 수 있고, 이어서 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 향후 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 또는 항체의 친화도 (친화도 성숙) 또는 다른 특징을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 인간에서의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우에 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 보다 유사하도록 조작될 수 있다. 표적 항원에 대한 보다 큰 친화도 및 보다 큰 효능을 얻기 위해 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항체에 대해 이루어질 수 있고, 표적 항원에 대한 그의 결합 특이성을 여전히 유지할 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다.
다른 실시양태에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용함으로써 수득될 수 있다. 보다 바람직한 (예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강건한 면역 반응을 생성하도록 설계된 트랜스제닉 동물이 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 암젠, 인크.(Amgen, Inc.) (캘리포니아주 프리몬트)로부터의 제노마우스R(XenomouseR)™ 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.) (뉴저지주 프린스턴)로부터의 HuMAb-마우스R™ 및 TC 마우스™ 또는 하버 안티바디즈 비브이(Harbour Antibodies BV) (네덜란드)로부터의 H2L2 마우스이다. 또 다른 대안에서, 항체는 파지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455]을 참조한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)을 사용하여, 비면역화 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생산할 수 있다.
무손상 항체 (전장 항체)의 항원-결합 단편은 상용 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있고, Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있다. 유전자 조작된 항체, 예컨대 인간화 항체, 키메라 항체, 단일-쇄 항체 및 이중특이적 항체는, 예를 들어 통상적인 재조합 기술을 통해 생산될 수 있다. 한 예에서, 표적 항원에 특이적인 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 1개 이상의 발현 벡터 내로 배치할 수 있고, 이어서 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 HEK293 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 얻는다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. 이어서 DNA를, 예를 들어 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하거나 (Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851) 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 공유 연결함으로써 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원의 결합 특이성을 갖는 유전자 조작된 항체, 예컨대 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조될 수 있다.
단일-쇄 항체는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 연결함으로써 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 가요성 링커가 2개의 가변 영역 사이에 혼입된다.
대안적으로, 단일 쇄 항체의 생산을 위해 기재된 기술 (미국 특허 번호 4,946,778 및 4,704,692)이 파지 또는 효모 scFv 라이브러리를 생산하도록 적합화될 수 있고, TfR에 특이적인 scFv 클론이 상용 절차에 따라 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 양성 클론은 높은 TfR 결합 친화도를 갖는 것을 확인하기 위한 추가의 스크리닝에 적용될 수 있다.
관련 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라 수득된 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 항원이 결합하는 에피토프를 확인하는 것 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]의 챕터 11에 기재된 바와 같은 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해석, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함한, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징화하는 관련 기술분야에 공지된 많은 방법이 존재한다. 한 예에서, 에피토프 맵핑은 단백질분해 및 질량 분광측정법과 커플링된 H/D-Ex (수소 중수소 교환)를 사용하여 달성될 수 있다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 스트레치에 함유된 것일 수 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 (1차 구조 선형 서열)에 함유될 필요는 없을 수 있는, 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 적어도 4-6개의 아미노산 길이)가 단리 또는 합성되고 (예를 들어, 재조합적으로), 항체와의 결합 검정에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하고 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크리닝으로 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 표적 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 무작위로 또는 특이적 유전자 구축에 의해 단편화되고, 항원의 발현된 단편과 시험될 항체와의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해 생산된 다음, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 이어서 방사성 표지된 항원 단편에 대한 항체의 결합이 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용함으로써 특정 에피토프가 또한 확인될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 규정된 라이브러리가 단순 결합 검정에서 시험 항체에의 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 수행되어 에피토프 결합에 요구되고/거나 (예를 들어, 요구되고) 충분하고/거나 (예를 들어, 충분하고) 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로, 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체를 사용하여 경쟁 검정을 수행함으로써 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
일부 예에서, 항-TfR 항체는 하기 예시된 바와 같은 재조합 기술에 의해 제조된다. 본원에 기재된 바와 같은 항-TfR 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 1개의 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있으며, 각각의 뉴클레오티드 서열은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 예에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드 서열은 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 중쇄 및 경쇄 둘 다가 동일한 프로모터로부터 발현되도록 단일 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 필요한 경우에, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)가 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 사이에 삽입될 수 있다.
일부 예에서, 항체의 2개의 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2개의 벡터 내로 클로닝되며, 이들은 동일하거나 상이한 세포 내로 도입될 수 있다. 2개의 쇄가 상이한 세포에서 발현되는 경우에, 이들 각각은 이를 발현하는 숙주 세포로부터 단리될 수 있고, 단리된 중쇄 및 경쇄는 항체의 형성을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 혼합 및 인큐베이션될 수 있다.
일반적으로, 항체의 하나 또는 모든 쇄를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 적합한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 적합한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 및 벡터는 적합한 조건 하에 제한 효소와 접촉되어, 서로 쌍형성할 수 있고 리가제로 함께 연결될 수 있는 상보적 말단을 각각의 분자 상에 생성할 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커가 유전자의 말단에 라이게이션될 수 있다. 이들 합성 링커는 벡터 내의 특정한 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 벡터/프로모터의 선택은 항체를 생산하는 데 사용하기 위한 숙주 세포의 유형에 좌우될 것이다.
시토메갈로바이러스 (CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스 LTR, 예컨대 라우스 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 이. 콜라이 lac UV 프로모터 및 단순 포진 tk 바이러스 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 프로모터가 본원에 기재된 항체의 발현에 사용될 수 있다.
조절성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 조절성 프로모터는 lac 오퍼레이터 보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하기 위한 전사 조정제로서 이. 콜라이로부터의 lac 리프레서를 사용하는 것 [Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)], 테트라시클린 리프레서 (tetR)를 사용하는 것 [Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-555115 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]을 포함한다. 다른 시스템은 아스트라디올, RU486, 디페놀 무리슬레론 또는 라파마이신을 사용하는 FK506 이량체, VP16 또는 p65를 포함한다. 유도성 시스템은 특히 인비트로젠(Invitrogen), 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)로부터 입수가능하다.
오페론에 리프레서를 포함하는 조절성 프로모터가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이. 콜라이로부터의 lac 리프레서는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하는 전사 조정제로서 기능할 수 있어 [M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; Gossen and Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551(1992)], 테트라시클린 리프레서 (tetR)를 전사 활성인자 (VP 16)와 조합하여 tetR-포유동물 세포 전사 활성인자 융합 단백질인 tTa (tetR-VP 16)를 생성하고, 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV) 프로모터로부터 유래된 tetO 보유 최소 프로모터와 조합하여 포유동물 세포에서 유전자 발현을 제어하는 tetR-tet 오퍼레이터 시스템을 생성한다. 한 실시양태에서, 테트라시클린 유도성 스위치가 사용된다. tetR-포유동물 세포 전사 인자 융합 유도체보다는 테트라시클린 리프레서 (tetR) 단독이, 테트라시클린 오퍼레이터가 CMVIE 프로모터의 TATA 요소에 대해 하류에 적절하게 위치하는 경우에 포유동물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 강력한 트랜스-조정제로서 기능할 수 있다 (Yao et al., Human Gene Therapy). 이러한 테트라시클린 유도성 스위치의 하나의 특정한 이점은, 그의 조절성 효과를 달성하기 위해, 일부 경우 세포에 대해 독성일 수 있는 테트라시클린 리프레서-포유동물 세포 전사활성인자 또는 리프레서 융합 단백질의 사용을 요구하지 않는다는 것이다 (Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)).
추가적으로, 벡터는, 예를 들어 하기 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있다: 선택 마커 유전자, 예컨대 포유동물 세포에서 안정한 또는 일시적인 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 극초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종결 및 RNA 프로세싱 신호; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제 기점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 다목적 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 트랜스진을 함유하는 벡터를 생산하기 위한 적합한 벡터 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 이용가능하다. 본원에 기재된 방법을 실시하는 데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
임의의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 1개 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 항체를 생산하는 데 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 항체 또는 그의 임의의 폴리펩티드 쇄의 발현에 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 이러한 항체 또는 그의 폴리펩티드 쇄는 통상적인 방법, 예를 들어 친화도 정제를 통해 배양 세포에 의해 (예를 들어, 세포 또는 배양 상청액으로부터) 회수될 수 있다. 필요한 경우에, 항체의 폴리펩티드 쇄는 항체의 생산을 가능하게 하는 적합한 기간 동안 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체를 제조하는 방법은 또한 본원에 기재된 바와 같은 항-TfR 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 수반한다. 재조합 발현 벡터는 통상적인 방법, 예를 들어 인산칼슘 매개 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 (예를 들어, dhfr- CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체 숙주 세포는 항체를 형성하는 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 선택 및 배양될 수 있으며, 이는 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우에, 숙주 세포로부터 회수된 2개의 쇄는 항체의 형성을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체를 발현시키는 데 사용된 숙주 세포는 CHO-S 세포 (예를 들어, 써모피셔(ThermoFisher) 카탈로그# R80007)이다.
한 예에서, 하나는 항-TfR 항체의 중쇄를 코딩하고 다른 것은 항-TfR 항체의 경쇄를 코딩하는 2개의 재조합 발현 벡터가 제공된다. 2개의 재조합 발현 벡터 둘 다는 통상적인 방법, 예를 들어 인산칼슘-매개 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 (예를 들어, dhfr- CHO 세포) 내로 도입될 수 있다.
대안적으로, 발현 벡터 각각이 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체는 항체의 폴리펩티드 쇄의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 선택 및 배양될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 동일한 숙주 세포 내로 도입되는 경우에, 그 내에서 생산된 항체는 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우에, 폴리펩티드 쇄는 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수된 다음, 항체의 형성을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 상이한 숙주 세포 내로 도입되는 경우에, 이들 각각은 상응하는 숙주 세포로부터 또는 상응하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 이어서 2개의 폴리펩티드 쇄는 항체의 형성에 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술이, 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 커플링된 매트릭스를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 현탁 배양, 임의로 CHO-K1 세포 (예를 들어, 유럽 동물 세포 배양 수집(European Collection of Animal Cell Culture)으로부터 유래된 CHO-K1 세포, 카탈로그 번호 85051005) 현탁 배양에서 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 1종 이상의 번역후 변형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 피로글루타메이트 형성 (피로-Glu)으로도 불리는 N-말단 고리화는 생산 동안 항체에서 N-말단 글루타메이트 (Glu) 및/또는 글루타민 (Gln) 잔기에서 발생할 수 있다. 따라서, N-말단 글루타메이트 또는 글루타민 잔기를 포함하는 서열을 갖는 것으로 명시된 항체는 번역후 변형으로부터 생성된 피로글루타메이트 형성을 겪은 항체를 포괄하는 것으로 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 피로글루타메이트 형성은 중쇄 서열에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 피로글루타메이트 형성은 경쇄 서열에서 발생한다.
IV. 복합체
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체는 분자 페이로드를 표적 세포 또는 표적 조직 (예를 들어, TfR을 발현하는 세포 또는 조직)에 전달하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 분자 페이로드에 대한 본원에 기재된 인간화 항-TfR 항체 (예를 들어, 표 4 및 표 5에 제공된 바와 같은 IgG 또는 Fab 형태의 인간화 3-A4, 3-M12 또는 5-H12) 중 어느 하나를 포함하는 복합체를 제공한다. 본원에 기재된 복합체는 다양한 용도, 예를 들어 진단 또는 치료 용도에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 복합체는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 적어도 1종의 유전자, 단백질 및/또는 (예를 들어, 및) 핵산의 활성 또는 기능을 조정하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 복합체에 존재하는 분자 페이로드는 유전자, 단백질 및/또는 (예를 들어, 및) 핵산의 조정을 담당한다. 분자 페이로드는 소분자, 단백질, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 또는 세포 내의 유전자, 단백질 및/또는 (예를 들어, 및) 핵산의 활성 또는 기능을 조정할 수 있는 임의의 분자 개체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 근육 세포에서 질환-연관 반복부를 표적화하는 올리고뉴클레오티드이다.
A. 분자 페이로드
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나에 연결될 수 있는, 예를 들어 생물학적 결과, 예를 들어 DNA 서열의 전사, 단백질의 발현 또는 단백질의 활성을 조정하기 위한 분자 페이로드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 분자 페이로드는, 예를 들어 연결된 항-TfR 항체에 의한 근육 세포로의 전달 후에 근육 세포 내의 핵산 또는 단백질에 대한 특이적 결합을 통해 근육 세포를 표적화할 수 있다. 다양한 유형의 분자 페이로드가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 분자 페이로드는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드), 펩티드 (예를 들어, 근육 세포에서 질환과 연관된 핵산 또는 단백질에 결합하는 펩티드), 단백질 (예를 들어, 근육 세포에서 질환과 연관된 핵산 또는 단백질에 결합하는 단백질), 또는 소분자 (예를 들어, 근육 세포에서 질환과 연관된 핵산 또는 단백질의 기능을 조정하는 소분자)를 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 표 6에 제공된 유전자에 대한 상보성 영역을 갖는 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
표 6. 근육 질환 및 상응하는 유전자의 목록.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
*인용된 참고문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 신경계 장애의 치료를 위한 작용제이다. 본원에 사용된 "신경계 장애"는 CNS에 영향을 미치고/거나 (예를 들어, 미치고) CNS에서 병인을 갖는 질환 또는 장애를 지칭한다. CNS 질환 또는 장애의 예는 신경병증, 아밀로이드증, 암, 안구 질환 또는 장애, 바이러스 또는 미생물 감염, 염증, 허혈, 신경변성 질환, 발작, 행동 장애 및 리소솜 축적 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 출원의 목적상, CNS는 혈액-망막 장벽에 의해 신체의 나머지로부터 정상적으로 격리되는 눈을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 신경계 장애의 구체적 예는 신경변성 질환 (예컨대, 비제한적으로, 루이 소체 질환, 회색질척수염후 증후군, 샤이-드래거 증후군, 올리브교뇌소뇌 위축, 파킨슨병, 다계통 위축, 선조체흑질 변성, 타우병증 (예컨대, 비제한적으로, 알츠하이머병 및 핵상 마비), 프리온 질환 (예컨대, 비제한적으로, 소 해면상 뇌병증, 스크래피, 크로이츠펠트-야콥 증후군, 쿠루병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커병, 만성 소모성 질환 및 치명적 가족성 불면증), 연수 마비, 운동 뉴런 질환 및 신경계 이종변성 장애 (예컨대, 비제한적으로, 카나반병, 헌팅톤병, 신경 세로이드-리포푸신증, 알렉산더병, 투렛 증후군, 멘케스 킨키 헤어 증후군, 코케인 증후군, 할러보르덴-스파츠 증후군, 라포라병, 레트 증후군, 간렌즈핵 변성, 레쉬-니한 증후군 및 운베리히트-룬트보르크 증후군), 치매 (예컨대, 비제한적으로, 픽병 및 척수소뇌성 운동실조), 암 (예를 들어, 신체 내 다른 곳의 암으로부터 생성된 뇌 전이를 포함한 CNS의 암)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나에 접합될 수 있는 신경계 장애 약물 및 이들이 치료할 수 있는 상응하는 상태의 비제한적 예가 표 7에 제공된다.
표 7. 신경계 장애 약물 및 치료되는 상태의 예
Figure pct00025
일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개)의 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)가 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나에 연결된다. 일부 실시양태에서, 항-TfR 항체에 부착된 모든 분자 페이로드는 동일하며, 예를 들어 동일한 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 항-TfR 항체에 부착된 모든 분자 페이로드는 상이하며, 예를 들어 분자 페이로드는 동일한 표적 유전자의 상이한 부분을 표적화할 수 있거나 또는 분자 페이로드는 적어도 2종의 상이한 표적 유전자를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 동일한 일부 분자 페이로드 및 상이한 일부 분자 페이로드에 부착될 수 있다.
본 개시내용은 또한 복합체의 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%)가 동일한 수의 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 것인 복수의 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
예시적인 분자 페이로드는 본원에 추가로 상세히 기재되어 있지만, 본원에 제공된 예시적인 분자 페이로드는 제한적인 것으로 의도되지 않는 것으로 인지될 것이다.
i. 올리고뉴클레오티드
임의의 적합한 올리고뉴클레오티드가 본원에 기재된 바와 같은 분자 페이로드로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 분해를 유발하도록 설계될 수 있다 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 분해를 유발하는 갭머, siRNA, 리보자임 또는 압타머일 수 있음). 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 번역을 차단하도록 설계될 수 있다 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 번역을 차단하는 믹스머, siRNA 또는 압타머일 수 있음). 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 분해를 유발하고 그의 번역을 차단하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 효소 (예를 들어, 유전자 편집 효소)의 활성을 지시하기 위한 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 다른 예가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나의 포맷의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 하나의 포맷에서 또 다른 포맷 (예를 들어, siRNA 올리고뉴클레오티드)으로 기능적 서열 (예를 들어, 안티센스 가닥 서열)을 혼입시킴으로써 다른 포맷에 적합하게 적합화될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표 6에 제공된 표적 유전자에 대한 상보성 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 분해를 위해 lncRNA 또는 mRNA를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 분해를 위해 미스매치 복구 경로에 수반되는 단백질, 예를 들어 MSH2, MutL알파, MutS베타, MutL알파를 코딩하는 핵산을 표적화할 수 있다. 미스매치 복구 경로에 수반되는 단백질을 코딩하는 mRNA가 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있는 이러한 단백질의 비제한적 예는 문헌 [Iyer, R.R. et al., "DNA triplet repeat expansion and mismatch repair" Annu Rev Biochem. 2015;84:199-226.; 및 Schmidt M.H. and Pearson C.E., "Disease-associated repeat instability and mismatch repair" DNA Repair (Amst). 2016 Feb;38:117-26]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 염 형태, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 마그네슘 염일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 5' 또는 3' 뉴클레오시드 (예를 들어, 말단 뉴클레오시드)는 임의로 스페이서를 통해 아민 기에 접합된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 지방족 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스포디에스테르 연결은 스페이서와 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 뉴클레오시드 사이에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 뉴클레오시드 (예를 들어, 말단 뉴클레오시드)는 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 헤테로지방족, 치환 또는 비치환된 카르보시클릴렌, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴렌, 치환 또는 비치환된 아릴렌, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌, -O-, -N(RA)-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)NRA-, -NRAC(=O)-, -NRAC(=O)RA-, -C(=O)RA-, -NRAC(=O)O-, -NRAC(=O)N(RA)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -OC(=O)N(RA)-, -S(O)2NRA-, -NRAS(O)2- 또는 그의 조합인 스페이서에 접합되고; 각각의 RA는 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 알킬이다. 특정 실시양태에서, 스페이서는 치환 또는 비치환된 알킬렌, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴렌, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌, -O-, -N(RA)- 또는 -C(=O)N(RA)2 또는 그의 조합이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 5' 또는 3' 뉴클레오시드는 화학식 -NH2-(CH2)n-의 화합물에 접합되며, 여기서 n은 1 내지 12의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다. 일부 실시양태에서, 포스포디에스테르 연결은 화학식 NH2-(CH2)n-의 화합물과 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 뉴클레오시드 사이에 존재한다. 일부 실시양태에서, 화학식 NH2-(CH2)6-의 화합물은 6-아미노-1-헥산올 (NH2-(CH2)6-OH)과 올리고뉴클레오티드의 5' 포스페이트 사이의 반응을 통해 올리고뉴클레오티드에 접합된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 아민 기를 통해 표적화제, 예를 들어 근육 표적화제, 예컨대 항-TfR 항체에 접합된다.
a. 올리고뉴클레오티드 크기/서열
올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 포맷에 따라 다양한 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 8 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 8 내지 40개의 뉴클레오티드 길이, 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 10 내지 15개의 뉴클레오티드 길이, 10 내지 20개의 뉴클레오티드 길이, 15 내지 25개의 뉴클레오티드 길이, 21 내지 23개의 뉴클레오티드 길이 등이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 목적을 위한 올리고뉴클레오티드의 상보적 핵산 서열은 표적 분자 (예를 들어, mRNA)에 대한 서열의 결합이 표적 (예를 들어, mRNA)의 정상 기능을 방해하여 활성의 손실 (예를 들어, 번역을 억제함) 또는 발현의 손실 (예를 들어, 표적 mRNA를 분해함)을 유발하는 경우에 표적 핵산에 특이적으로 혼성화가능하거나 특이적이고, 비-특이적 결합의 회피가 요망되는 조건 하에, 예를 들어 생체내 검정 또는 치유적 치료의 경우에는 생리학적 조건 하에, 및 시험관내 검정의 경우에는 검정이 적합한 엄격도 조건 하에 수행되는 조건 하에, 비-표적 서열에 대한 서열의 비-특이적 결합을 회피하는 데 충분한 정도의 상보성이 존재한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보적 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화가능하거나 특이적이 되기 위해 그의 표적의 서열에 대해 100% 상보적일 필요는 없다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 8 내지 15, 8 내지 30, 8 내지 40, 또는 10 내지 50, 또는 5 내지 50, 또는 5 내지 40개의 뉴클레오티드 길이의 범위인 표적 핵산에 대한 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 상보성 영역은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드와 상보적이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 연속 뉴클레오티드의 부분과 비교하여 1, 2 또는 3개의 염기 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 15개 염기에 걸쳐 3개 이하의 미스매치 또는 10개 염기에 걸쳐 2개 이하의 미스매치를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 표적 서열에 대해 (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%) 상보적이다. 일부 실시양태에서, 이러한 표적 서열은 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드에 대해 100% 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나 내의 티민 염기 (T) 중 어느 하나 이상은 임의로 우라실 염기 (U)일 수 있고/거나, U 중 어느 하나 이상은 임의로 T일 수 있다.
b. 올리고뉴클레오티드 변형:
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 변형될 수 있으며, 예를 들어 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 (예를 들어, 및) 그의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 특성 중 1종 이상을 나타낼 수 있다: 대안적 스플라이싱을 매개하지 않음; 면역 자극성이 아님; 뉴클레아제 저항성임; 비변형된 올리고뉴클레오티드와 비교하여 개선된 세포 흡수를 가짐; 세포 또는 포유동물에 대해 독성이 아님; 세포 내부에 개선된 엔도솜 출구를 가짐; TLR 자극을 최소화함; 또는 패턴 인식 수용체를 회피함. 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드의 임의의 변형된 화학 또는 포맷은 서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 상이한 유형의 변형이 동일한 올리고뉴클레오티드 내에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형이 혼입되는 올리고뉴클레오티드를 천연 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 올리고리보뉴클레오티드 분자보다 뉴클레아제 소화에 대해 더 저항성으로 만드는 이러한 특정 뉴클레오티드 변형이 사용될 수 있고; 이들 변형된 올리고뉴클레오티드는 비변형된 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 시간 동안 무손상으로 생존한다. 변형된 올리고뉴클레오티드의 구체적 예는 변형된 백본, 예를 들어 변형된 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 연결을 포함하는 것을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 변형, 예를 들어 뉴클레오티드 변형의 혼입에 의해 핵산분해적 분해에 대해 안정화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 2 내지 10, 2 내지 15, 2 내지 16, 2 내지 17, 2 내지 18, 2 내지 19, 2 내지 20, 2 내지 25, 2 내지 30, 2 내지 40, 2 내지 45개 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 50개 이하 또는 100개 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 2 내지 10, 2 내지 15, 2 내지 16, 2 내지 17, 2 내지 18, 2 내지 19, 2 내지 20, 2 내지 25, 2 내지 30개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 2 내지 7, 2 내지 8, 2 내지 9, 2 내지 10, 2 내지 11, 2 내지 12, 2 내지 13, 2 내지 14개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 8 내지 15개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 임의로, 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드가 변형된 것을 제외하고는 모든 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 변형은 본원에 추가로 기재된다.
c. 변형된 뉴클레오시드
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 당의 2' 위치에서 변형된 적어도 1개의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 2'-변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드는 2'-변형된 뉴클레오시드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 2'-데옥시, 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 리보스 고리가 고리 내의 2개의 원자를 연결하는, 예를 들어 메틸렌 (LNA) 가교, 에틸렌 (ENA) 가교 또는 (S)-구속성 에틸 (cEt) 가교를 통해 2'-O 원자를 4'-C 원자에 연결하는 가교 모이어티를 포함하는 1개 이상의 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드를 포함한다. LNA의 예는 2008년 4월 17일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO/2008/043753 (발명의 명칭: "RNA Antagonist Compounds For The Modulation Of PCSK9")에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. ENA의 예는 2005년 5월 12일에 공개된 국제 특허 공개 번호 WO 2005/042777 (발명의 명칭: "APP/ENA Antisense"); 문헌 [Morita et al., Nucleic Acid Res., Suppl 1:241-242, 2001; Surono et al., Hum. Gene Ther., 15:749-757, 2004; Koizumi, Curr. Opin. Mol. Ther., 8:144-149, 2006 및 Horie et al., Nucleic Acids Symp. Ser (Oxf), 49:171-172, 2005]에 제공되어 있으며; 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. cEt의 예는 미국 특허 7,101,993; 7,399,845 및 7,569,686에 제공되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 미국 특허 또는 특허 출원 공개 중 하나에 개시된 변형된 뉴클레오시드를 포함한다: 2008년 7월 15일에 허여된 미국 특허 7,399,845 (발명의 명칭: "6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs"); 2010년 6월 22일에 허여된 미국 특허 7,741,457 (발명의 명칭: "6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs"); 2011년 9월 20일에 허여된 미국 특허 8,022,193 (발명의 명칭: "6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs"); 2009년 8월 4일에 허여된 미국 특허 7,569,686 (발명의 명칭: "Compounds And Methods For Synthesis Of Bicyclic Nucleic Acid Analogs"); 2008년 2월 26일에 허여된 미국 특허 7,335,765 (발명의 명칭: "Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues"); 2008년 1월 1일에 허여된 미국 특허 7,314,923 (발명의 명칭: "Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues"); 2010년 10월 19일에 허여된 미국 특허 7,816,333 (발명의 명칭: "Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same") 및 미국 공개 번호 2011/0009471이며 2015년 2월 17일에 허여된 현재 미국 특허 8,957,201 (발명의 명칭: "Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same") (이들 각각의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오시드를 갖지 않는 올리고뉴클레오티드와 비교하여 1℃, 2℃, 3℃, 4℃ 또는 5℃ 범위의 올리고뉴클레오티드 Tm의 증가를 유발하는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드를 갖지 않는 올리고뉴클레오티드와 비교하여 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃ 또는 그 초과의 범위의 올리고뉴클레오티드 Tm의 총 증가를 유발하는 복수의 변형된 뉴클레오시드를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 상이한 종류의 뉴클레오시드의 혼합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드와 2'-플루오로 변형된 뉴클레오시드의 혼합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드와 2'-O-Me 변형된 뉴클레오시드의 혼합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오시드와 2'-O-Me 변형된 뉴클레오시드의 혼합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드와 2'-MOE, 2'-플루오로 또는 2'-O-Me 변형된 뉴클레오시드의 혼합을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE, 2'-플루오로 또는 2'-O-Me)와 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA, ENA, cEt)의 혼합을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 상이한 종류의 교대 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 교대 2'-데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드 및 2'-플루오로 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 교대 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드 및 2'-O-Me 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 교대 2'-플루오로 변형된 뉴클레오시드 및 2'-O-Me 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 교대 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 및 2'-MOE, 2'-플루오로 또는 2'-O-Me 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 교대 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE, 2'-플루오로 또는 2'-O-Me) 및 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA, ENA, cEt)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 5'-비닐포스포네이트 변형, 1개 이상의 무염기성 잔기 및/또는 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기를 포함한다.
d. 뉴클레오시드간 연결 / 백본
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 뉴클레오시드간 연결을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단에서 제1, 제2 및/또는 (예를 들어, 및) 제3 뉴클레오시드간 연결에 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
사용될 수 있는 인-함유 연결은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역극성을 갖는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050을 참조한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 헤테로원자 백본, 예컨대 메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본; 아미드 백본 (문헌 [De Mesmaeker et al. Ace. Chem. Res. 1995, 28:366-374] 참조); 모르폴리노 백본 (미국 특허 번호 5,034,506 (Summerton and Weller) 참조); 또는 펩티드 핵산 (PNA) 백본 (여기서 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 백본은 폴리아미드 백본으로 대체되고, 뉴클레오티드는 폴리아미드 백본의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합됨, 문헌 [Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497] 참조)을 가질 수 있다.
e. 입체특이적 올리고뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 인 원자는 키랄이고, 올리고뉴클레오티드의 특성은 키랄 인 원자의 배위에 기초하여 조정된다. 일부 실시양태에서, 적절한 방법을 사용하여 P-키랄 올리고뉴클레오티드 유사체를 입체제어된 방식으로 합성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Oka N, Wada T, Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms. Chem Soc Rev. 2011 Dec;40(12):5829-43.]에 기재된 바와 같음). 일부 실시양태에서, 실질적으로 모든 Sp 또는 실질적으로 모든 Rp 포스포로티오에이트 당간 연결에 의해 함께 연결된 뉴클레오시드 단위를 포함하는 포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 키랄 순수한 당간 연결을 갖는 이러한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 1996년 12월 12일에 허여된 미국 특허 5,587,261 (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 효소적 또는 화학적 합성에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 키랄 제어된 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 선택적 절단 패턴을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 키랄 제어된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 2017년 2월 2일에 공개된 미국 특허 출원 공개 20170037399 A1 (발명의 명칭: "CHIRAL DESIGN") (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 핵산의 상보적 서열 내에 단일 부위 절단을 제공한다.
f. 모르폴리노
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노-기재 화합물일 수 있다. 모르폴리노-기재 올리고머 화합물은 문헌 [Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510); Genesis, volume 30, issue 3, 2001; Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214; Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220; Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596]; 및 1991년 7월 23일에 허여된 미국 특허 번호 5,034,506에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 모르폴리노-기재 올리고머 화합물은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이다 (예를 들어, 문헌 [Iverson, Curr. Opin. Mol. Ther., 3:235-238, 2001; 및 Wang et al., J. Gene Med., 12:354-364, 2010]에 기재된 바와 같고, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
g. 펩티드 핵산 (PNA)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결 (백본) 둘 다는 신규 기로 대체된다. 일부 실시양태에서, 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 탁월한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 올리고뉴클레오티드 모방체인 하나의 이러한 올리고머 화합물은 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 아미드 함유 백본, 예를 들어 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵염기는 보유되고, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 보고하는 대표적인 공개는 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. PNA 화합물의 추가의 교시는 문헌 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 찾을 수 있다.
h. 갭머
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 식 5'-X-Y-Z-3'을 가지며, 여기서 X 및 Z는 갭 영역 Y 주위의 플랭킹 영역이다. 일부 실시양태에서, 식 5'-X-Y-Z-3'의 플랭킹 영역 X는 또한 X 영역, 플랭킹 서열 X, 5' 윙 영역 X 또는 5' 윙 절편으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 식 5'-X-Y-Z-3'의 플랭킹 영역 Z는 또한 Z 영역, 플랭킹 서열 Z, 3' 윙 영역 Z 또는 3' 윙 절편으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 식 5'-X-Y-Z-3'의 갭 영역 Y는 또한 Y 영역, Y 절편 또는 갭-절편 Y로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고, 5' 윙 영역 X나 3' 윙 영역 Z 모두는 임의의 2'-데옥시리보뉴클레오시드를 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서, Y 영역은 RNAse, 예컨대 RNAse H를 동원할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치, 예를 들어 6개 이상의 DNA 뉴클레오티드의 영역이다. 일부 실시양태에서, 갭머는 표적 핵산에 결합하고, 이 지점에 RNAse가 동원된 다음, 표적 핵산을 절단할 수 있다. 일부 실시양태에서, Y 영역은 고친화도 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 1 내지 6개의 고친화도의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 영역 X 및 Z가 5' 및 3' 둘 다에 플랭킹된다. 고친화도 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE, 2'O-Me, 2'-F) 또는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA, cEt, ENA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 서열 X 및 Z는 1-20개의 뉴클레오티드, 1-8개의 뉴클레오티드 또는 1-5개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 플랭킹 서열 X 및 Z는 유사한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭-절편 Y는 5-20개의 뉴클레오티드, 5-15개의 뉴클레오티드 또는 6-10개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일부 실시양태에서, 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역은 DNA 뉴클레오티드에 추가로 효율적인 RNase H 작용에 허용되는 것으로 공지된 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 C4'-치환된 뉴클레오티드, 비-시클릭 뉴클레오티드 및 아라비노-구성된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭 영역은 1개 이상의 비변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 또는 둘 다의 플랭킹 영역은 각각 독립적으로 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 사이에 1개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 또는 다른 연결)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 및 2개의 플랭킹 영역은 각각 독립적으로 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 사이에 변형된 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 또는 다른 연결)을 포함한다.
갭머는 적절한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 갭머의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허, 미국 특허 공개 및 PCT 공개는 미국 특허 번호 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 5,700,922; 5,898,031; 7,015,315; 7,101,993; 7,399,845; 7,432,250; 7,569,686; 7,683,036; 7,750,131; 8,580,756; 9,045,754; 9,428,534; 9,695,418; 10,017,764; 10,260,069; 9,428,534; 8,580,756; 미국 특허 공개 번호 US20050074801, US20090221685; US20090286969, US20100197762 및 US20110112170; PCT 공개 번호 WO2004069991; WO2005023825; WO2008049085 및 WO2009090182; 및 EP 특허 번호 EP2,149,605를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 갭머는 10-40개의 뉴클레오시드 길이이다. 예를 들어, 갭머는 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-40, 15-35, 15-30, 15-25, 15-20, 20-40, 20-35, 20-30, 20-25, 25-40, 25-35, 25-30, 30-40, 30-35 또는 35-40개의 뉴클레오시드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭머는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오시드 길이이다.
일부 실시양태에서, 갭머 내의 갭 영역 Y는 5-20개의 뉴클레오시드 길이이다. 예를 들어, 갭 영역 Y는 5-20, 5-15, 5-10, 10-20, 10-15 또는 15-20개의 뉴클레오시드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오시드 길이이다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y 내의 모든 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y 내의 뉴클레오시드 중 1개 이상은 변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 본원에 기재된 것)이다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y 내의 1개 이상의 시토신은 임의로 5-메틸-시토신이다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y 내의 각각의 시토신은 5-메틸-시토신이다.
일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 독립적으로 1-20개의 뉴클레오시드 길이이다. 예를 들어, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 독립적으로 1-20, 1-15, 1-10, 1-7, 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 2-7, 3-5, 3-7, 5-20, 5-15, 5-10, 10-20, 10-15 또는 15-20개의 뉴클레오시드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오시드 길이이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 동일한 길이이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 상이한 길이이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X)은 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)보다 더 길다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X)은 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)보다 더 짧다.
일부 실시양태에서, 갭머는 5-10-5, 4-12-4, 3-14-3, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 4-6-4, 3-6-3, 2-6-2, 4-7-4, 3-7-3, 2-7-2, 4-8-4, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 2-9-2, 1-9-1, 2-10-2, 1-10-1, 1-12-1, 1-16-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-14-3, 3-14-1, 2-14-2, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-3, 3-13-2, 1-12-5, 5-12-1, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 1-11-6, 6-11-1, 2-11-5, 5-11-2, 3-11-4, 4-11-3, 1-17-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-15-3, 3-15-1, 2-15-2, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-3, 3-14-2, 1-13-5, 5-13-1, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 1-12-6, 6-12-1, 2-12-5, 5-12-2, 3-12-4, 4-12-3, 1-11-7, 7-11-1, 2-11-6, 6-11-2, 3-11-5, 5-11-3, 4-11-4, 1-18-1, 1-17-2, 2-17-1, 1-16-3, 1-16-3, 2-16-2, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-3, 3-15-2, 1-14-5, 5-14-1, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 1-13-6, 6-13-1, 2-13-5, 5-13-2, 3-13-4, 4-13-3, 1-12-7, 7-12-1, 2-12-6, 6-12-2, 3-12-5, 5-12-3, 1-11-8, 8-11-1, 2-11-7, 7-11-2, 3-11-6, 6-11-3, 4-11-5, 5-11-4, 1-18-1, 1-17-2, 2-17-1, 1-16-3, 3-16-1, 2-16-2, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-3, 3-15-2, 1-14-5, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 1-13-6, 6-13-1, 2-13-5, 5-13-2, 3-13-4, 4-13-3, 1-12-7, 7-12-1, 2-12-6, 6-12-2, 3-12-5, 5-12-3, 1-11-8, 8-11-1, 2-11-7, 7-11-2, 3-11-6, 6-11-3, 4-11-5, 5-11-4, 1-19-1, 1-18-2, 2-18-1, 1-17-3, 3-17-1, 2-17-2, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-3, 3-16-2, 1-15-5, 2-15-4, 4-15-2, 3-15-3, 1-14-6, 6-14-1, 2-14-5, 5-14-2, 3-14-4, 4-14-3, 1-13-7, 7-13-1, 2-13-6, 6-13-2, 3-13-5, 5-13-3, 4-13-4, 1-12-8, 8-12-1, 2-12-7, 7-12-2, 3-12-6, 6-12-3, 4-12-5, 5-12-4, 2-11-8, 8-11-2, 3-11-7, 7-11-3, 4-11-6, 6-11-4, 5-11-5, 1-20-1, 1-19-2, 2-19-1, 1-18-3, 3-18-1, 2-18-2, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-3, 3-17-2, 1-16-5, 2-16-4, 4-16-2, 3-16-3, 1-15-6, 6-15-1, 2-15-5, 5-15-2, 3-15-4, 4-15-3, 1-14-7, 7-14-1, 2-14-6, 6-14-2, 3-14-5, 5-14-3, 4-14-4, 1-13-8, 8-13-1, 2-13-7, 7-13-2, 3-13-6, 6-13-3, 4-13-5, 5-13-4, 2-12-8, 8-12-2, 3-12-7, 7-12-3, 4-12-6, 6-12-4, 5-12-5, 3-11-8, 8-11-3, 4-11-7, 7-11-4, 5-11-6, 6-11-5, 1-21-1, 1-20-2, 2-20-1, 1-20-3, 3-19-1, 2-19-2, 1-18-4, 4-18-1, 2-18-3, 3-18-2, 1-17-5, 2-17-4, 4-17-2, 3-17-3, 1-16-6, 6-16-1, 2-16-5, 5-16-2, 3-16-4, 4-16-3, 1-15-7, 7-15-1, 2-15-6, 6-15-2, 3-15-5, 5-15-3, 4-15-4, 1-14-8, 8-14-1, 2-14-7, 7-14-2, 3-14-6, 6-14-3, 4-14-5, 5-14-4, 2-13-8, 8-13-2, 3-13-7, 7-13-3, 4-13-6, 6-13-4, 5-13-5, 1-12-10, 10-12-1, 2-12-9, 9-12-2, 3-12-8, 8-12-3, 4-12-7, 7-12-4, 5-12-6, 6-12-5, 4-11-8, 8-11-4, 5-11-7, 7-11-5, 6-11-6, 1-22-1, 1-21-2, 2-21-1, 1-21-3, 3-20-1, 2-20-2, 1-19-4, 4-19-1, 2-19-3, 3-19-2, 1-18-5, 2-18-4, 4-18-2, 3-18-3, 1-17-6, 6-17-1, 2-17-5, 5-17-2, 3-17-4, 4-17-3, 1-16-7, 7-16-1, 2-16-6, 6-16-2, 3-16-5, 5-16-3, 4-16-4, 1-15-8, 8-15-1, 2-15-7, 7-15-2, 3-15-6, 6-15-3, 4-15-5, 5-15-4, 2-14-8, 8-14-2, 3-14-7, 7-14-3, 4-14-6, 6-14-4, 5-14-5, 3-13-8, 8-13-3, 4-13-7, 7-13-4, 5-13-6, 6-13-5, 4-12-8, 8-12-4, 5-12-7, 7-12-5, 6-12-6, 5-11-8, 8-11-5, 6-11-7 또는 7-11-6의 5'-X-Y-Z-3'를 포함한다. 숫자는 5'-X-Y-Z-3' 갭머 내의 X, Y 및 Z 영역 내의 뉴클레오시드의 수를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 또는 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 1개 이상의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 고친화도 변형된 뉴클레오시드)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 고친화도 변형된 뉴클레오시드)는 2'-변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 2'-변형된 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 또는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 고친화도 변형된 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA, cEt 또는 ENA) 또는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA))이다.
일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 내의 1개 이상의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 내의 각각의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 1개 이상의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 각각의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 내의 1개 이상의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이고, 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 1개 이상의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 내의 각각의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이고, 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 각각의 뉴클레오시드는 고친화도 변형된 뉴클레오시드이다.
일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X)은 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)과 동일한 고친화도 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 1개 이상의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 1개 이상의 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 각각의 뉴클레오시드는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)이다.
일부 실시양태에서, 갭머는 5'-X-Y-Z-3' 구성을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 1-7개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 뉴클레오시드 길이이고, Y는 6-10개 (예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 X 및 Z 내의 각각의 뉴클레오시드는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)이고, Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머는 5'-X-Y-Z-3' 구성을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 1-7 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)개의 뉴클레오시드 길이이고, Y는 6-10 (예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10)개의 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 X 및 Z 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)이고, Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X)은 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)과 상이한 고친화도 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X)은 1개 이상의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)를 포함할 수 있고, 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 1개 이상의 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 1개 이상의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)를 포함할 수 있고, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X)은 1개 이상의 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 갭머는 5'-X-Y-Z-3' 구성을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 1-7 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)개의 뉴클레오시드 길이이고, Y는 6-10 (예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10)개의 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 X 내의 각각의 뉴클레오시드는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)이고, Z 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)이고, Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머는 5'-X-Y-Z-3' 구성을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 1-7 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)개의 뉴클레오시드 길이이고, Y는 6-10 (예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10)개의 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 X 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)이고, Z 내의 각각의 뉴클레오시드는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)이고, Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이다.
일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X)은 1개 이상의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me) 및 1개 이상의 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z)은 1개 이상의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me) 및 1개 이상의 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 둘 다는 1개 이상의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me) 및 1개 이상의 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 갭머는 5'-X-Y-Z-3' 구성을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 2-7개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 뉴클레오시드 길이이고, Y는 6-10개 (예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 X의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 (가장 5'의 위치는 위치 1임) 중 모두는 아니지만 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)이고, 여기서 X 및 Z 둘 다 내의 나머지 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)이고, 여기서 Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'데옥시리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머는 5'-X-Y-Z-3' 구성을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 2-7개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 뉴클레오시드 길이이고, Y는 6-10개 (예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 Z의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 (가장 5'의 위치는 위치 1임) 중 모두는 아니지만 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)이고, 여기서 X 및 Z 둘 다 내의 나머지 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)이고, 여기서 Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'데옥시리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 갭머는 5'-X-Y-Z-3' 구성을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 2-7개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 뉴클레오시드 길이이고, Y는 6-10개 (예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 X 내의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 중 모두는 아니지만 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 및 Z 내의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 중 모두는 아니지만 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) (예를 들어, 가장 5'의 위치는 위치 1임)는 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)이고, 여기서 X 및 Z 둘 다 내의 나머지 뉴클레오시드는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)이고, 여기서 Y 내의 각각의 뉴클레오시드는 2'데옥시리보뉴클레오시드이다.
갭머의 5'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 X) 및/또는 갭머의 3'윙 영역 (5'-X-Y-Z-3' 식에서 Z) 내의 비-비시클릭 2'-변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-MOE 또는 2'-O-Me)와 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)의 혼합을 갖는 갭머 구성의 비제한적 예는 하기를 포함한다: BBB-(D)n-BBBAA; KKK-(D)n-KKKAA; LLL-(D)n-LLLAA; BBB-(D)n-BBBEE; KKK-(D)n-KKKEE; LLL-(D)n-LLLEE; BBB-(D)n-BBBAA; KKK-(D)n-KKKAA; LLL-(D)n-LLLAA; BBB-(D)n-BBBEE; KKK-(D)n-KKKEE; LLL-(D)n-LLLEE; BBB-(D)n-BBBAAA; KKK-(D)n-KKKAAA; LLL-(D)n-LLLAAA; BBB-(D)n-BBBEEE; KKK-(D)n-KKKEEE; LLL-(D)n-LLLEEE; BBB-(D)n-BBBAAA; KKK-(D)n-KKKAAA; LLL-(D)n-LLLAAA; BBB-(D)n-BBBEEE; KKK-(D)n-KKKEEE; LLL-(D)n-LLLEEE; BABA-(D)n-ABAB; KAKA-(D)n-AKAK; LALA-(D)n-ALAL; BEBE-(D)n-EBEB; KEKE-(D)n-EKEK; LELE-(D)n-ELEL; BABA-(D)n-ABAB; KAKA-(D)n-AKAK; LALA-(D)n-ALAL; BEBE-(D)n-EBEB; KEKE-(D)n-EKEK; LELE-(D)n-ELEL; ABAB-(D)n-ABAB; AKAK-(D)n-AKAK; ALAL-(D)n-ALAL; EBEB-(D)n-EBEB; EKEK-(D)n-EKEK; ELEL-(D)n-ELEL; ABAB-(D)n-ABAB; AKAK-(D)n-AKAK; ALAL-(D)n-ALAL; EBEB-(D)n-EBEB; EKEK-(D)n-EKEK; ELEL-(D)n-ELEL; AABB-(D)n-BBAA; BBAA-(D)n-AABB; AAKK-(D)n-KKAA; AALL-(D)n-LLAA; EEBB-(D)n-BBEE; EEKK-(D)n-KKEE; EELL-(D)n-LLEE; AABB-(D)n-BBAA; AAKK-(D)n-KKAA; AALL-(D)n-LLAA; EEBB-(D)n-BBEE; EEKK-(D)n-KKEE; EELL-(D)n-LLEE; BBB-(D)n-BBA; KKK-(D)n-KKA; LLL-(D)n-LLA; BBB-(D)n-BBE; KKK-(D)n-KKE; LLL-(D)n-LLE; BBB-(D)n-BBA; KKK-(D)n-KKA; LLL-(D)n-LLA; BBB-(D)n-BBE; KKK-(D)n-KKE; LLL-(D)n-LLE; BBB-(D)n-BBA; KKK-(D)n-KKA; LLL-(D)n-LLA; BBB-(D)n-BBE; KKK-(D)n-KKE; LLL-(D)n-LLE; ABBB-(D)n-BBBA; AKKK-(D)n-KKKA; ALLL-(D)n-LLLA; EBBB-(D)n-BBBE; EKKK-(D)n-KKKE; ELLL-(D)n-LLLE; ABBB-(D)n-BBBA; AKKK-(D)n-KKKA; ALLL-(D)n-LLLA; EBBB-(D)n-BBBE; EKKK-(D)n-KKKE; ELLL-(D)n-LLLE; ABBB-(D)n-BBBAA; AKKK-(D)n-KKKAA; ALLL-(D)n-LLLAA; EBBB-(D)n-BBBEE; EKKK-(D)n-KKKEE; ELLL-(D)n-LLLEE; ABBB-(D)n-BBBAA; AKKK-(D)n-KKKAA; ALLL-(D)n-LLLAA; EBBB-(D)n-BBBEE; EKKK-(D)n-KKKEE; ELLL-(D)n-LLLEE; AABBB-(D)n-BBB; AAKKK-(D)n-KKK; AALLL-(D)n-LLL; EEBBB-(D)n-BBB; EEKKK-(D)n-KKK; EELLL-(D)n-LLL; AABBB-(D)n-BBB; AAKKK-(D)n-KKK; AALLL-(D)n-LLL; EEBBB-(D)n-BBB; EEKKK-(D)n-KKK; EELLL-(D)n-LLL; AABBB-(D)n-BBBA; AAKKK-(D)n-KKKA; AALLL-(D)n-LLLA; EEBBB-(D)n-BBBE; EEKKK-(D)n-KKKE; EELLL-(D)n-LLLE; AABBB-(D)n-BBBA; AAKKK-(D)n-KKKA; AALLL-(D)n-LLLA; EEBBB-(D)n-BBBE; EEKKK-(D)n-KKKE; EELLL-(D)n-LLLE; ABBAABB-(D)n-BB; AKKAAKK-(D)n-KK; ALLAALLL-(D)n-LL; EBBEEBB-(D)n-BB; EKKEEKK-(D)n-KK; ELLEELL-(D)n-LL; ABBAABB-(D)n-BB; AKKAAKK-(D)n-KK; ALLAALL-(D)n-LL; EBBEEBB-(D)n-BB; EKKEEKK-(D)n-KK; ELLEELL-(D)n-LL; ABBABB-(D)n-BBB; AKKAKK-(D)n-KKK; ALLALLL-(D)n-LLL; EBBEBB-(D)n-BBB; EKKEKK-(D)n-KKK; ELLELL-(D)n-LLL; ABBABB-(D)n-BBB; AKKAKK-(D)n-KKK; ALLALL-(D)n-LLL; EBBEBB-(D)n-BBB; EKKEKK-(D)n-KKK; ELLELL-(D)n-LLL; EEEK-(D)n-EEEEEEEE; EEK-(D)n-EEEEEEEEE; EK-(D)n-EEEEEEEEEE; EK-(D)n-EEEKK; K-(D)n-EEEKEKE; K-(D)n-EEEKEKEE; K-(D)n-EEKEK; EK-(D)n-EEEEKEKE; EK-(D)n-EEEKEK; EEK-(D)n-KEEKE; EK-(D)n-EEKEK; EK-(D)n-KEEK; EEK-(D)n-EEEKEK; EK-(D)n-KEEEKEE; EK-(D)n-EEKEKE; EK-(D)n-EEEKEKE; 및 EK-(D)n-EEEEKEK. "A" 뉴클레오시드는 2'-변형된 뉴클레오시드를 포함하고; "B"는 2'-4' 비시클릭 뉴클레오시드를 나타내고; "K"는 구속성 에틸 뉴클레오시드 (cEt)를 나타내고; "L"은 LNA 뉴클레오시드를 나타내고; "E"는 2'-MOE 변형된 리보뉴클레오시드를 나타내고; "D"는 2'-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고; "n"은 갭 절편 (5'-X-Y-Z-3' 구성에서 Y)의 길이를 나타내고, 1-20의 정수이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 갭머 중 어느 하나는 각각의 X, Y 및 Z 영역에 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트 연결)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 갭머 중 어느 하나 내의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 각각의 X, Y 및 Z 영역은 독립적으로 포스포로티오에이트 연결과 포스포디에스테르 연결의 혼합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 갭 영역 Y 내의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고, 5'윙 영역 X는 포스포로티오에이트 연결과 포스포디에스테르 연결의 혼합을 포함하고, 3'윙 영역 Z는 포스포로티오에이트 연결과 포스포디에스테르 연결의 혼합을 포함한다.
i. 믹스머
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 믹스머일 수 있거나 또는 믹스머 서열 패턴을 포함할 수 있다. 일반적으로, 믹스머는 자연 및 비-자연 발생 뉴클레오시드 둘 다를 포함하거나 또는 2종의 상이한 유형의 비-자연 발생 뉴클레오시드를 전형적으로 교대 패턴으로 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 믹스머는 일반적으로 비변형된 올리고뉴클레오티드보다 더 높은 결합 친화도를 갖고, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 데, 예를 들어 표적 분자 상의 결합 부위를 차단하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 믹스머는 RNase를 표적 분자로 동원하지 않고, 따라서 표적 분자의 절단을 촉진하지 않는다. RNase H를 동원할 수 없는 이러한 올리고뉴클레오티드는 기재되었으며, 예를 들어 WO2007/112754 또는 WO2007/112753을 참조한다.
일부 실시양태에서, 믹스머는 반복 패턴의 뉴클레오시드 유사체 및 자연 발생 뉴클레오시드, 또는 한 유형의 뉴클레오시드 유사체 및 제2 유형의 뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 그러나, 믹스머는 반복 패턴을 포함할 필요가 없고, 대신에 변형된 뉴클레오시드 및 자연 발생 뉴클레오시드의 임의의 배열 또는 한 유형의 변형된 뉴클레오시드 및 제2 유형의 변형된 뉴클레오시드의 임의의 배열을 포함할 수 있다. 반복 패턴은, 예를 들어 매 두 번째 또는 매 세 번째 뉴클레오시드가 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA이고, 나머지 뉴클레오시드는 자연 발생 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 또는 2' 치환된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 2' MOE 또는 2' 플루오로 유사체 또는 본원에 기재된 임의의 다른 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 단위의 반복 패턴은 고정된 위치, 예를 들어 5' 또는 3' 말단에서 변형된 뉴클레오시드와 조합될 수 있는 것으로 인식된다.
일부 실시양태에서, 믹스머는 5개 초과, 4개 초과, 3개 초과 또는 2개 초과의 연속 자연 발생 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 믹스머는 적어도 2개의 연속 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 2개의 연속 LNA로 이루어진 영역을 적어도 포함한다. 일부 실시양태에서, 믹스머는 적어도 3개의 연속 변형된 뉴클레오시드 단위, 예컨대 적어도 3개의 연속 LNA로 이루어진 영역을 적어도 포함한다.
일부 실시양태에서, 믹스머는 7개 초과, 6개 초과, 5개 초과, 4개 초과, 3개 초과 또는 2개 초과의 연속 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA의 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, LNA 단위는 다른 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 본원에 언급된 것으로 대체될 수 있다.
믹스머는 친화도 증진 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 비제한적 예에서 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-Me 뉴클레오시드의 혼합물을 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 믹스머는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5개 또는 그 초과의 뉴클레오시드 사이에 변형된 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 또는 다른 연결)을 포함한다.
믹스머는 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 믹스머의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허, 미국 특허 공개 및 PCT 공개는 미국 특허 공개 번호 US20060128646, US20090209748, US20090298916, US20110077288 및 US20120322851, 및 미국 특허 번호 7687617을 포함한다.
일부 실시양태에서, 믹스머는 1개 이상의 모르폴리노 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 믹스머는 1개 이상의 다른 뉴클레오시드 (예를 들어, DNA, RNA 뉴클레오시드) 또는 변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA, 2'-O-Me 뉴클레오시드)와 혼합된 (예를 들어, 교대 방식으로 혼합된) 모르폴리노 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 믹스머는, 예를 들어 문헌 [Touznik A., et al., LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts Scientific Reports, volume 7, Article number: 3672 (2017), Chen S. et al., Synthesis of a Morpholino Nucleic Acid (MNA)-Uridine Phosphoramidite, and Exon Skipping Using MNA/2'-O-Methyl Mixmer Antisense Oligonucleotide, Molecules 2016, 21, 1582] (이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 보고된 바와 같이, 스플라이스 교정 또는 엑손 스킵핑에 유용하다.
j. RNA 간섭 (RNAi)
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 짧은 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로도 공지된 소형 간섭 RNA (siRNA)의 형태일 수 있다. siRNA는 세포 내의 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 통한 분해를 위해 핵산 (예를 들어, mRNA)을 표적화하는, 전형적으로 약 20-25개의 염기 쌍 길이의 이중 가닥 RNA 분자의 부류이다. siRNA 분자의 특이성은 분자의 안티센스 가닥이 그의 표적 RNA에 결합하는 것에 의해 결정될 수 있다. 효과적인 siRNA 분자는 인터페론 반응을 통한 세포 내의 비-특이적 RNA 간섭 경로의 촉발을 방지하기 위해 일반적으로 30 내지 35개 미만의 염기 쌍 길이이며, 더 긴 siRNA도 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 8 내지 30개의 염기 쌍 길이, 10 내지 15개의 염기 쌍 길이, 10 내지 20개의 염기 쌍 길이, 15 내지 25개의 염기 쌍 길이, 19 내지 21개의 염기 쌍 길이, 21 내지 23개의 염기 쌍 길이이다.
적절한 표적 RNA 서열의 선택 후에, 표적 서열의 모두 또는 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 즉 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 분자가 적절한 방법을 사용하여 설계되고 제조될 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2004/016735; 및 미국 특허 공개 번호 2004/0077574 및 2008/0081791 참조). siRNA 분자는 이중 가닥 (즉, 혼성화하여 dsRNA를 형성하는 안티센스 가닥 및 상보적 센스 가닥을 포함하는 dsRNA 분자) 또는 단일 가닥 (즉, 안티센스 가닥만을 포함하는 ssRNA 분자)일 수 있다. siRNA 분자는 자기-상보적 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 듀플렉스, 비대칭 듀플렉스, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 2차 구조를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 8 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 8 내지 40개의 뉴클레오티드 길이, 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 10 내지 15개의 뉴클레오티드 길이, 10 내지 20개의 뉴클레오티드 길이, 15 내지 25개의 뉴클레오티드 길이, 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이, 21 내지 23개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 8 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 8 내지 40개의 뉴클레오티드 길이, 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 10 내지 15개의 뉴클레오티드 길이, 10 내지 20개의 뉴클레오티드 길이, 15 내지 25개의 뉴클레오티드 길이, 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이, 21 내지 23개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자는 표적 mRNA 내의 표적 영역에 대한 상보성 영역을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 mRNA 내의 표적 영역에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 표적 mRNA 내의 연속 뉴클레오티드의 영역이다. 일부 실시양태에서, 상보적 뉴클레오티드 서열은 표적 RNA 서열에 특이적으로 혼성화가능하거나 특이적이기 위해 그의 표적의 서열에 대해 100% 상보적일 필요는 없다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자는 표적 RNA 서열에 대한 상보성 영역을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고, 상보성 영역은 8 내지 15, 8 내지 30, 8 내지 40 또는 10 내지 50 또는 5 내지 50 또는 5 내지 40개 범위의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 RNA 서열의 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드와 상보적이다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 표적 RNA 서열의 연속 뉴클레오티드의 부분과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 염기 미스매치를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 15개의 염기에 걸쳐 3개 이하의 미스매치 또는 10개의 염기에 걸쳐 2개 이하의 미스매치를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자는 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드의 표적 RNA 서열에 대해 (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%) 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드의 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
이중 가닥 siRNA는 동일한 길이 또는 상이한 길이인 센스 및 안티센스 RNA 가닥을 포함할 수 있다. 이중 가닥 siRNA 분자는 또한 스템-루프 구조의 단일 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있으며, 여기서 siRNA 분자의 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역은 핵산 기반 또는 비-핵산-기반 링커(들)에 의해 연결될 뿐만 아니라 2개 이상의 루프 구조 및 자기-상보적 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 스템을 갖는 원형 단일 가닥 RNA로부터 조립될 수 있으며, 여기서 원형 RNA는 생체내 또는 시험관내에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 생성할 수 있다. 따라서, 소형 헤어핀 RNA (shRNA) 분자가 또한 본원에서 고려된다. 이들 분자는 전형적으로 스페이서 또는 루프 서열에 의해 분리되어 있는, 역 상보체 (센스) 서열에 추가로 특이적 안티센스 서열을 포함한다. 스페이서 또는 루프의 절단은 단일 가닥 RNA 분자 및 그의 역 상보체를 제공하여, 이들이 어닐링되어 dsRNA 분자를 형성할 수 있다 (임의로 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥의 3' 말단 및/또는 (예를 들어, 및) 5' 말단으로부터 1, 2, 3개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 부가 또는 제거를 유발할 수 있는 추가의 프로세싱 단계가 존재함). 스페이서는 안티센스 및 센스 서열이 스페이서의 절단 (및 임의로, 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥의 3' 말단 및/또는 (예를 들어, 및) 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 부가 또는 제거를 유발할 수 있는 후속 프로세싱 단계) 전에 어닐링되어 이중 가닥 구조 (또는 스템)를 형성하도록 허용하는 데 충분한 길이일 수 있다. 스페이서 서열은 이중 가닥 핵산으로 어닐링되는 경우 shRNA에 포함되는 2개의 상보적 뉴클레오티드 서열 영역 사이에 위치하는 비관련 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
siRNA 분자의 전체 길이는 설계되는 siRNA 분자의 유형에 따라 약 14 내지 약 100개의 뉴클레오티드로 달라질 수 있다. 일반적으로, 이들 뉴클레오티드 중 약 14 내지 약 50개는 RNA 표적 서열에 대해 상보적이며, 즉 siRNA 분자의 특이적 안티센스 서열을 구성한다. 예를 들어, siRNA가 이중- 또는 단일 가닥 siRNA인 경우에, 길이는 약 14 내지 약 50개의 뉴클레오티드로 달라질 수 있는 반면, siRNA가 shRNA 또는 원형 분자인 경우에, 길이는 약 40개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드로 달라질 수 있다.
siRNA 분자는 분자의 한쪽 말단에 3' 오버행을 포함할 수 있다. 다른쪽 말단은 평활 말단일 수 있거나 또는 또한 오버행 (5' 또는 3')을 가질 수 있다. siRNA 분자가 분자의 양쪽 말단에 오버행을 포함하는 경우에, 오버행의 길이는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 siRNA 분자는 분자의 양쪽 말단 상에 약 1 내지 약 3개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 센스 가닥 상에 약 1 내지 약 3개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 안티센스 가닥 상에 약 1 내지 약 3개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다 상에 약 1 내지 약 3개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)를 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티 (예를 들어, 2' 변형된 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 1개 이상의 2' 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-데옥시, 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O--N-메틸아세트아미도 (2'-O--NMA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-변형된 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 1개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노를 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 각각의 뉴클레오티드는 포스포로디아미데이트 모르폴리노이다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자는 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 적어도 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 siRNA 분자의 5' 또는 3' 말단에서의 제1, 제2 및/또는 (예를 들어, 및) 제3 뉴클레오시드간 연결에 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 인-함유 연결이다. 일부 실시양태에서, 사용될 수 있는 인-함유 연결은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역극성을 갖는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050을 참조한다.
본원에 기재된 siRNA 분자의 임의의 변형된 화학 또는 포맷은 서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 상이한 유형의 변형이 동일한 siRNA 분자 내에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티 (예를 들어, 2' 변형된 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 1개 이상의 2' 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-데옥시, 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O--N-메틸아세트아미도 (2'-O--NMA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-변형된 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 1개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 siRNA 분자의 5' 또는 3' 말단에서의 제1, 제2 및/또는 (예를 들어, 및) 제3 뉴클레오시드간 연결에 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 인-함유 연결이다. 일부 실시양태에서, 사용될 수 있는 인-함유 연결은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역극성을 갖는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050을 참조한다.
본원에 기재된 안티센스 가닥의 임의의 변형된 화학 또는 포맷은 서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 상이한 유형의 변형이 동일한 안티센스 가닥 내에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티 (예를 들어, 2' 변형된 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 1개 이상의 2' 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-데옥시, 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O--N-메틸아세트아미도 (2'-O--NMA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-변형된 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 1개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에서의 제1, 제2 및/또는 (예를 들어, 및) 제3 뉴클레오시드간 연결에 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 인-함유 연결이다. 일부 실시양태에서, 사용될 수 있는 인-함유 연결은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역극성을 갖는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050을 참조한다.
본원에 기재된 센스 가닥의 임의의 변형된 화학 또는 포맷은 서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 상이한 유형의 변형이 동일한 센스 가닥 내에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 또는 센스 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 로딩을 증진 또는 감소시키는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 RISC 로딩을 증진시키는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 RISC 로딩을 감소시키고 오프-타겟 효과를 감소시키는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 변형을 포함한다. 절단 부위에서의 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 기의 부가는 문헌 [Song et al., (2017) Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 변형된 가닥의 배향된 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 로딩을 용이하게 함으로써 siRNA의 특이성 및 침묵 활성 둘 다를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 문헌 [Wu et al., (2014) Nat Commun 5:3459] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 2'-OMe-포스포로디티오에이트 변형을 포함하며, 이는 RISC 로딩을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 문헌 [Kumar et al., (2019) Chem Commun (Camb) 55(35):5139-5142] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 5'-모르폴리노를 포함하며, 이는 센스 가닥의 RISC 로딩을 감소시키고, 안티센스 가닥 선택 및 RNAi 활성을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 문헌 [Elman et al., (2005) Nucleic Acids Res. 33(1): 439-447] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 합성 RNA-유사 고친화도 뉴클레오티드 유사체인 잠금 핵산 (LNA)으로 변형되며, 이는 센스 가닥의 RISC 로딩을 감소시키고, RISC 내로의 안티센스 가닥 혼입을 추가로 증진시킨다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 문헌 [Snead et al., (2013) Mol Ther Nucleic Acids 2(7):e103] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 5' 비잠금 핵산 (UNA) 변형을 포함하며, 이는 센스 가닥의 RISC 로딩을 감소시키고, 안티센스 가닥의 침묵 효력을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 문헌 [Zhang et al., (2012) Chembiochem 13(13):1940-1945] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 5-니트로인돌 변형을 포함하며, 이는 센스 가닥의 RNAi 효력을 감소시키고, 오프-타겟 효과를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 문헌 [Zheng et al., FASEB (2013) 27(10): 4017-4026] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 2'-O'메틸 (2'-O-Me) 변형을 포함하며, 이는 센스 가닥의 RISC 로딩 및 오프-타겟 효과를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 문헌 [Kole et al., (2012) Nature reviews. Drug Discovery 11(2):125-140] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 모르폴리노, 2'-MOE 또는 2'-O-Me 잔기로 완전히 치환되고, RISC에 의해 인식되지 않는다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 2'-MOE 변형을 포함하고, 센스 가닥은 2'-O-Me 변형을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Song et al., (2017) Mol Ther Nucleic Acids 9:242-250] 참조). 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10개)의 siRNA 분자가 근육-표적화제에 (예를 들어, 공유) 연결된다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 펩티드 (예를 들어, 항체), 지질 (예를 들어, 미세소포) 또는 당 모이어티 (예를 들어, 폴리사카라이드)를 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 항-트랜스페린 수용체 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 항-TfR 항체 중 어느 하나)이다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 siRNA 분자의 센스 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 siRNA 분자의 센스 가닥의 3' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 siRNA 분자의 센스 가닥에 내부적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화제는 siRNA 분자의 안티센스 가닥에 내부적으로 연결될 수 있다.
k. 마이크로RNA (miRNA)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA (miRNA)일 수 있다. 마이크로RNA ("miRNA"로 지칭됨)는 표적 RNA 전사체 상의 상보적 부위에 결합함으로써 유전자 발현을 제어하는 조절 분자의 부류에 속하는 소형 비-코딩 RNA이다. 전형적으로, miRNA는 대형 RNA 전구체 (pri-miRNA로 명명됨)로부터 생성되며, 이들은 핵에서 대략 70개의 뉴클레오티드의 pre-miRNA로 프로세싱되어 불완전한 스템-루프 구조로 폴딩된다. 이들 pre-miRNA는 전형적으로 세포질 내에서 RNase III 효소인 다이서에 의해 pre-miRNA 헤어핀의 한 측면으로부터 18-25개의 뉴클레오티드 길이의 성숙 miRNA가 절제되는 추가의 프로세싱 단계를 겪는다.
본원에 사용된 바와 같이, miRNA는 pri-miRNA, pre-miRNA, 성숙 miRNA 또는 성숙 miRNA의 생물학적 활성을 보유하는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, miRNA의 크기 범위는 21개의 뉴클레오티드 내지 170개의 뉴클레오티드일 수 있다. 한 실시양태에서, miRNA의 크기 범위는 70 내지 170개의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 21 내지 25개의 뉴클레오티드 길이의 성숙 miRNA가 사용될 수 있다.
l. 압타머
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 압타머의 형태일 수 있다. 일반적으로, 분자 페이로드와 관련하여, 압타머는 세포 내의 표적, 예컨대 소분자, 단백질, 핵산에 특이적으로 결합하는 임의의 핵산이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 DNA 압타머 또는 RNA 압타머이다. 일부 실시양태에서, 핵산 압타머는 단일 가닥 DNA 또는 RNA (ssDNA 또는 ssRNA)이다. 단일 가닥 핵산 압타머는 나선 및/또는 (예를 들어, 및) 루프 구조를 형성할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 핵산 압타머를 형성하는 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 탄화수소 링커 (예를 들어, 알킬렌) 또는 폴리에테르 링커 (예를 들어, PEG 링커)가 1개 이상의 뉴클레오티드 사이에 삽입된 자연 발생 뉴클레오티드, 탄화수소 또는 PEG 링커가 1개 이상의 뉴클레오티드 사이에 삽입된 변형된 뉴클레오티드, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 압타머 및 압타머의 제조 방법을 기재하는 예시적인 공개 및 특허는, 예를 들어 문헌 [Lorsch and Szostak, 1996; Jayasena, 1999]; 미국 특허 번호 5,270,163; 5,567,588; 5,650,275; 5,670,637; 5,683,867; 5,696,249; 5,789,157; 5,843,653; 5,864,026; 5,989,823; 6,569,630; 8,318,438 및 PCT 출원 WO 99/31275를 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
m. 리보자임
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 리보자임의 형태일 수 있다. 리보자임 (리보핵산 효소)은 단백질 효소의 작용과 유사한 특이적 생화학적 반응을 수행할 수 있는 분자, 전형적으로 RNA 분자이다. 리보자임은 이들이 혼성화된 RNA 분자 내의 특정 포스포디에스테르 연결에서 절단 능력을 포함한 촉매 활성을 갖는 분자, 예컨대 mRNA, RNA-함유 기질, lncRNA 및 리보자임 그 자체이다.
리보자임은 여러 물리적 구조 중 하나를 취할 수 있으며, 이 중 하나는 "해머헤드"로 불린다. 해머헤드 리보자임은 9개의 보존된 염기를 함유하는 촉매 코어, 이중 가닥 스템 및 루프 구조 (스템-루프 II), 및 촉매 코어의 표적 RNA 플랭킹 영역에 대해 상보적인 2개의 영역으로 구성된다. 플랭킹 영역은 리보자임이 이중 가닥 스템 I 및 III을 형성함으로써 특이적으로 표적 RNA에 결합할 수 있게 한다. 절단은 3',5'-포스페이트 디에스테르로부터 2',3'-시클릭 포스페이트 디에스테르로의 에스테르교환 반응에 의해 특이적 리보뉴클레오티드 삼중체 옆에 시스로 일어나거나 (즉, 해머헤드 모티프를 함유하는 동일한 RNA 분자의 절단) 또는 트랜스로 일어난다 (리보자임을 함유하는 것 이외의 RNA 기질의 절단). 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 촉매 활성은 리보자임의 촉매 영역에 고도로 보존된 특이적 서열의 존재를 요구하는 것으로 여겨진다.
리보자임 구조에서의 변형은 또한 분자의 다양한 비-코어 부분의 비-뉴클레오티드 분자로의 치환 또는 대체를 포함하였다. 예를 들어, 문헌 [Benseler et al. (J. Am. Chem. Soc. (1993) 115:8483-8484)]에는 스템 II의 염기 쌍 중 2개 및 루프 II의 뉴클레오티드 중 4개 모두가 헥사에틸렌 글리콜, 프로판디올, 비스(트리에틸렌 글리콜)포스페이트, 트리스(프로판디올)비스포스페이트 또는 비스(프로판디올)포스페이트 기반 비-뉴클레오시드 링커로 대체된 해머헤드-유사 분자가 개시되었다. 문헌 [Ma et al. (Biochem. (1993) 32:1751-1758; Nucleic Acids Res. (1993) 21:2585-2589)]에서는 TAR 리보자임 헤어핀의 6개의 뉴클레오티드 루프를 비-뉴클레오티드인 에틸렌 글리콜-관련 링커로 대체하였다. 문헌 [Thomson et al. (Nucleic Acids Res. (1993) 21:5600-5603)]에서는 루프 II를 13, 17 및 19개 원자 길이의 선형 비-뉴클레오티드 링커로 대체하였다.
리보자임 올리고뉴클레오티드는 널리 공지된 방법 (예를 들어, PCT 공개 WO9118624; WO9413688; WO9201806; 및 WO 92/07065; 및 미국 특허 5436143 및 5650502 참조)을 사용하여 제조될 수 있거나 또는 상업적 공급원 (예를 들어, 유에스 바이오케미칼스(US Biochemicals))으로부터 구입될 수 있고, 원하는 경우에, 세포에서 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 올리고뉴클레오티드의 저항성을 증가시키는 뉴클레오티드 유사체를 혼입시킬 수 있다. 리보자임은 임의의 공지된 방식으로, 예를 들어 상업적으로 입수가능한 합성기를 사용하여, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈, 인크.(Applied Biosystems, Inc.) 또는 밀리겐(Milligen)에 의해 생산된 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 리보자임은 또한 통상적인 수단에 의해 재조합 벡터에서 생산될 수 있다. 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (Current edition)]을 참조한다. 리보자임 RNA 서열은 통상적으로, 예를 들어 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7 또는 SP6을 사용하여 합성될 수 있다.
n. 가이드 핵산
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 가이드 핵산, 예를 들어 가이드 RNA (gRNA) 분자이다. 일반적으로, 가이드 RNA는 (1) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp), 예컨대 Cas9에 결합하는 스캐폴드 서열, 및 (2) gRNA가 결합하는 DNA 표적 서열 (예를 들어, 게놈 DNA 표적)을 정의하여 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질을 이러한 DNA 표적 서열에 근접하게 가져오는 뉴클레오티드 스페이서 부분으로 구성된 짧은 합성 RNA이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 핵산-프로그램가능한 단백질을 표적 DNA 서열 (예를 들어, 표적 게놈 DNA 서열)에 표적화하는 1개 이상의 RNA(들)와 복합체를 형성하는 (예를 들어, 그와 결합하거나 회합하는) 핵산-프로그램가능한 단백질이다. 일부 실시양태에서, 핵산-프로그램가능한 뉴클레아제는, RNA와의 복합체로 존재하는 경우에, 뉴클레아제:RNA 복합체로 지칭될 수 있다. 가이드 RNA는 2개 이상의 RNA의 복합체로서 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다.
단일 RNA 분자로서 존재하는 가이드 RNA (gRNA)는 단일-가이드 RNA (sgRNA)로 지칭될 수 있으며, gRNA는 또한 단일 분자로서 또는 2개 이상의 분자의 복합체로서 존재하는 가이드 RNA를 지칭하는 것으로 사용된다. 전형적으로, 단일 RNA 종으로서 존재하는 gRNA는 다음 2개의 도메인: (1) 표적 핵산에 대한 상동성을 공유하는 (즉, 표적에 대한 Cas9 복합체의 결합을 지시하는) 도메인; 및 (2) Cas9 단백질에 결합하는 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 도메인 (2)는 tracrRNA로 공지된 서열에 상응하며, 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 도메인 (2)는 문헌 [Jinek et al., Science 337:816-821 (2012)] (이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 제공된 바와 같은 tracrRNA와 동일하거나 상동이다.
일부 실시양태에서, gRNA는 도메인 (1) 및 (2) 중 2개 이상을 포함하며, 연장된 gRNA로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 연장된 gRNA는 본원에 기재된 바와 같이 2개 이상의 Cas9 단백질에 결합하고, 2개 이상의 별개의 영역에서 표적 핵산에 결합할 것이다. gRNA는 표적 부위에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 상기 표적 부위에 대한 뉴클레아제/RNA 복합체의 결합을 매개하여, 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA-프로그램가능한 뉴클레아제는 (CRISPR-연관 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9 (Csn1)이다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663 (2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607 (2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821 (2012)] 참조, 이들 문헌 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
o. 다량체
일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 링커에 의해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드의 다량체 (예를 들어, 콘카테머)를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 일부 실시양태에서, 복합체/접합체의 올리고뉴클레오티드 로딩은 표적화제 상의 이용가능한 연결 부위 (예를 들어, 항체 상의 이용가능한 티올 부위 또는 아민 부위)를 넘어 증가되거나 또는 달리 특정한 페이로드 로딩 함량을 달성하도록 조정될 수 있다. 다량체 내의 올리고뉴클레오티드는 동일하거나 상이할 수 있다 (예를 들어, 상이한 유전자 또는 동일한 유전자 상의 상이한 부위 또는 그의 생성물을 표적화함).
일부 실시양태에서, 다량체는 절단가능한 링커에 의해 함께 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 다량체는 비-절단가능한 링커에 의해 함께 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체는 함께 연결된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체는 함께 연결된 2 내지 5, 2 내지 10 또는 4 내지 20개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다량체는 말단-대-말단 (선형 배열로) 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체는 올리고뉴클레오티드 기반 링커 (예를 들어, 폴리-dT 링커, 무염기성 링커)를 통해 말단-대-말단 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체는 한 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 또 다른 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체는 한 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 또 다른 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체는 한 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 또 다른 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 연결된 것을 포함한다. 또한, 일부 실시양태에서, 다량체는 분지화 링커에 의해 함께 연결된 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 분지형 구조를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 복합체에 사용될 수 있는 다량체의 추가의 예는, 예를 들어 2015년 11월 5일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2015/0315588 A1 (발명의 명칭: Methods of delivering multiple targeting oligonucleotides to a cell using cleavable linkers); 2015년 9월 3일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2015/0247141 A1 (발명의 명칭: Multimeric Oligonucleotide Compounds); 2011년 6월 30일에 공개된 미국 특허 출원 번호 US 2011/0158937 A1 (발명의 명칭: Immunostimulatory Oligonucleotide Multimers); 및 1997년 12월 2일에 허여된 미국 특허 번호 5,693,773 (발명의 명칭: Triplex-Forming Antisense Oligonucleotides Having Abasic Linkers Targeting Nucleic Acids Comprising Mixed Sequences Of Purines And Pyrimidines)에 개시되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
o. 스플라이스 변경 올리고뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 모르폴리노를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 스플라이싱을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 엑손 스킵핑을 유도하고 유전자 내의 리딩 프레임을 복원함으로써 스플라이싱을 표적화한다. 비제한적 예로서, 올리고뉴클레오티드는 프레임시프트 돌연변이를 코딩하는 엑손 및/또는 (예를 들어, 및) 조기 정지 코돈을 코딩하는 엑손의 스킵핑을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 스플라이스 부위의 스플라이세오솜 인식을 차단함으로써 엑손 스킵핑을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑손 스킵핑은 참조 단백질 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 말단절단되었지만 기능적인 DMD 단백질)과 비교하여 말단절단되었지만 기능적인 단백질을 생성한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 특정한 엑손 (예를 들어, 하기 기재된 SMN2 유전자의 엑손 7)의 포함을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 스플라이스 부위 억제 서열을 표적화함으로써 엑손의 포함을 유도할 수 있다. RNA 스플라이싱은 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD) 및 척수성 근육 위축 (SMA)을 포함한 근육 질환에 연루되어 왔다.
디스트로핀 (DMD)을 코딩하는 유전자 내의 변경 (예를 들어, 결실, 점 돌연변이 및 중복)은 DMD를 유발한다. 이들 변경은 프레임시프트 돌연변이 및/또는 (예를 들어, 및) 넌센스 돌연변이를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 DMD 엑손 (예를 들어, 엑손 8, 엑손 43, 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 엑손 53 및/또는 (예를 들어, 및) 엑손 55)의 스킵핑을 촉진하고, 기능적 말단절단된 단백질을 생성한다. 예를 들어, 2013년 7월 16일에 공개된 미국 특허 번호 8,486,907 및 2014년 9월 18일에 공개된 미국 20140275212를 참조한다.
SMA에서, 기능 상실 SMN1이 존재한다. SMN2 유전자는 SMN1에 대한 파라로그이지만, SMN2 유전자의 대안적 스플라이싱은 우세하게 엑손 7의 스킵핑 및 SMN1 상실을 보상할 수 없는 말단절단된 SMN 단백질의 후속 생산을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 SMN2 엑손 7의 포함을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 SMN2 스플라이스 부위 억제 서열을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다 (예를 들어, 2010년 11월 23일에 공개된 미국 특허 번호 7,838,657 참조).
ii. 소분자:
임의의 적합한 소분자가 본원에 기재된 바와 같은 분자 페이로드로서 사용될 수 있다.
iii. 펩티드/단백질
임의의 적합한 펩티드 또는 단백질이 본원에 기재된 바와 같은 분자 페이로드로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 효소 (예를 들어, GAA 유전자에 의해 코딩되는 바와 같은, 예를 들어 산 알파-글루코시다제)이다. 이들 펩티드 또는 단백질은 여러 방법론, 예를 들어 파지 디스플레이된 펩티드 라이브러리, 1-비드 1-화합물 펩티드 라이브러리 또는 위치 스캐닝 합성 펩티드 조합 라이브러리를 사용하여 생산, 합성 및/또는 (예를 들어, 및) 유도체화될 수 있다. 예시적인 방법론은 관련 기술분야에서 특징화되었으며, 참조로 포함된다 (Gray, B.P. and Brown, K.C. "Combinatorial Peptide Libraries: Mining for Cell-Binding Peptides" Chem Rev. 2014, 114:2, 1020-1081.; Samoylova, T.I. and Smith, B.F. "Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening." Muscle Nerve, 1999, 22:4. 460-6.).
iv. 핵산 구축물
임의의 적합한 유전자 발현 구축물이 본원에 기재된 바와 같은 분자 페이로드로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 벡터 또는 cDNA 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 메신저 RNA (mRNA)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 mRNA는, 예를 들어 2014년 4월 24일에 허여된 미국 특허 8,710,200 (발명의 명칭: "Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression")에 기재된 바와 같은 변형된 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 5'-메틸 캡을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 임의로 160개 이하의 뉴클레오티드 길이의 폴리A 테일을 포함할 수 있다. 유전자 발현 구축물은 근육 질환에서 결핍된 단백질의 서열을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 근육 세포의 핵 내에서 발현, 예를 들어 과다발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 근육 질환에서 결핍된 유전자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 적어도 1개의 아연 핑거를 포함하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 표 6의 유전자에 결합하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 표 6의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 (예를 들어, 돌연변이 단백질)의 발현의 감소를 유도하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 구축물은 유전자 편집 효소를 코딩한다. 분자 페이로드로서 사용될 수 있는 핵산 구축물의 추가의 예는 2017년 9월 19일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO2017152149A1 (발명의 명칭: "CLOSED-ENDED LINEAR DUPLEX DNA FOR NON-VIRAL GENE TRANSFER"); 2014년 10월 7일에 허여된 미국 특허 8,853,377B2 (발명의 명칭: "MRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES"); 및 2014년 9월 2일에 허여된 미국 특허 US8822663B2 (ENGINEERED NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE THEREOF")에 제공되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
v. 검출가능한 표지 / 진단제
임의의 적합한 검출가능한 표지 또는 진단제가 본 개시내용의 분자 페이로드로서 사용될 수 있다. "진단제"는, 예를 들어 세포 또는 조직에서 또 다른 분자를 검출함으로써 진단 목적으로 사용되는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 진단제는 대상체에서 질환과 연관된 것으로 공지된 바이오마커 (예를 들어, 핵산 바이오마커, 단백질 바이오마커 또는 대사물 바이오마커)를 표적화하고 (예를 들어, 그에 결합하고), 검출가능한 신호를 생성하는 작용제이며, 이는 바이오마커의 존재/부재를 결정하여 질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 진단제는 비제한적으로 항체 또는 안티센스 핵산일 수 있다.
일부 실시양태에서, 진단제는 검출가능한 표지를 함유한다. 검출가능한 표지는 진단제가 결합하는 분자, 예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 개체의 검출을 가능하게 하는, 혼입된 적어도 1개의 요소, 동위원소 또는 구조적 또는 기능적 기를 갖는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 하기 5종의 부류 중 임의의 1종 (또는 그 초과)에 속한다: a) 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 67Ga, 76Br, 99mTc (Tc-99m), 111In, 123I, 125I, 131I, 153Gd, 169Yb 및 186Re를 포함하나 이에 제한되지는 않는 방사성 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동위원소 모이어티를 함유하는 작용제; b) 효소 (예를 들어, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제)에 결합될 수 있는 항체 또는 항원일 수 있는 면역 모이어티를 함유하는 작용제; c) 유색, 발광, 인광 또는 형광 모이어티 (예를 들어, 예컨대 형광 표지 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC))를 포함하는 작용제; d) 1종 이상의 광 친화도 모이어티를 갖는 작용제; 및 e) 1종 이상의 공지된 결합 파트너에 대한 리간드 (예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘, His-NiTNAFK506-FKBP)인 작용제. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 방사성 동위원소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 형광 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 염료, 예를 들어 형광 염료, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민, Cy3, Cy5, Cy5.5, 알렉사 647 및 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 비오틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 분자는 형광 폴리펩티드 (예를 들어, GFP 또는 그의 유도체, 예컨대 증강 GFP (EGFP)) 또는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이, 레닐라 또는 가우시아 루시페라제)이다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 적합한 기질 (예를 들어, 루시페린)과 반응하여 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 형광 단백질의 비제한적 예는 GFP 및 그의 유도체, 상이한 색상의 광을 방출하는 발색단을 포함하는 단백질, 예컨대 레드, 옐로우 및 시안 형광 단백질 등을 포함한다. 예시적인 형광 단백질은, 예를 들어 시리우스, 아주라이트, EBFP2, TagBFP, mTurquoise, ECFP, 세룰리안, TagCFP, mTFP1, mUkG1, mAG1, AcGFP1, TagGFP2, EGFP, mWasabi, EmGFP, TagYPF, EYFP, 토파즈, SYFP2, 비너스, 시트린, mKO, mKO2, mOrange, mOrange2, TagRFP, TagRFP-T, mStrawberry, mRuby, mCherry, mRaspberry, mKate2, mPlum, mNeptune, T-사파이어, mAmetrine, mKeima를 포함한다. 예를 들어, GFP 및 수많은 다른 형광 또는 발광 단백질의 논의에 대해, 문헌 [Chalfie, M. and Kain, SR (eds.) Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols (Methods of biochemical analysis, v. 47, Wiley-Interscience, and Hoboken, N.J., 2006] 및/또는 (예를 들어, 및) [Chudakov, DM, et al., Physiol Rev. 90(3):1103-63, 2010] (본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 암색 켄처, 예를 들어 형광단으로부터 여기 에너지를 흡수하고 열로서 에너지를 소멸시키는 물질을 포함한다.
B. 링커
본원에 기재된 복합체는 일반적으로 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나를 분자 페이로드에 연결하는 링커를 포함한다. 링커는 적어도 1개의 공유 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 항-TfR 항체를 분자 페이로드에 연결하는 단일 결합, 예를 들어 디술피드 결합 또는 디술피드 가교일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 링커는 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나를 다중 공유 결합을 통해 분자 페이로드에 연결시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 링커는 비-절단가능한 링커일 수 있다. 링커는 일반적으로 시험관내 및 생체내에서 안정하고, 특정 세포 환경에서 안정할 수 있다. 추가적으로, 일반적으로 링커는 항-TfR 항체 또는 분자 페이로드의 기능적 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 링커의 합성의 예 및 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Kline, T. et al. "Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates." Pharmaceutical Research, 2015, 32:11, 3480-3493.; Jain, N. et al. "Current ADC Linker Chemistry" Pharm Res. 2015, 32:11, 3526-3540.; McCombs, J.R. and Owen, S.C. "Antibody Drug Conjugates: Design and Selection of Linker, Payload and Conjugation Chemistry" AAPS J. 2015, 17:2, 339-351.] 참조).
링커에 대한 전구체는 전형적으로 항-TfR 항체 및 분자 페이로드 둘 다에 대한 부착을 가능하게 하는 2종의 상이한 반응성 종을 함유할 것이다. 일부 실시양태에서, 2종의 상이한 반응성 종은 친핵체 및/또는 (예를 들어, 및) 친전자체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 항-TfR 항체의 리신 잔기 또는 시스테인 잔기에 대한 접합을 통해 항-TfR 항체에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 말레이미드-함유 링커를 통해 항-TfR 항체의 시스테인 잔기에 연결되며, 여기서 임의로 말레이미드-함유 링커는 말레이미도카프로일 또는 말레이미도메틸 시클로헥산-1-카르복실레이트 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 3-아릴프로피오니트릴 관능기를 통해 항-TfR 항체 또는 티올 관능화 분자 페이로드의 시스테인 잔기에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 항-TfR 항체의 리신 잔기에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미드 결합, 카르바메이트 결합, 히드라지드, 트리아졸, 티오에테르 또는 디술피드 결합을 통해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결된다.
i. 절단가능한 링커
절단가능한 링커는 프로테아제-감수성 링커, pH-감수성 링커 또는 글루타티온-감수성 링커일 수 있다. 이들 링커는 일반적으로 세포내에서만 절단가능하고, 바람직하게는 세포외 환경, 예를 들어 근육 세포에 대한 세포외 환경에서 안정하다.
프로테아제-감수성 링커는 프로테아제 효소적 활성에 의해 절단가능하다. 이들 링커는 전형적으로 펩티드 서열을 포함하고, 2-10개의 아미노산, 약 2-5개의 아미노산, 약 5-10개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 또는 약 2개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 서열은 자연 발생 아미노산, 예를 들어 시스테인, 알라닌, 또는 비-자연 발생 또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 아미노산은 β-아미노산, 호모-아미노산, 프롤린 유도체, 3-치환된 알라닌 유도체, 선형 코어 아미노산, N-메틸 아미노산 및 관련 기술분야에 공지된 다른 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제-감수성 링커는 발린-시트룰린 또는 알라닌-시트룰린 디펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제-감수성 링커는 리소솜 프로테아제, 예를 들어 카텝신 B 및/또는 (예를 들어, 및) 엔도솜 프로테아제에 의해 절단될 수 있다.
pH-감수성 링커는 높은 또는 낮은 pH 환경에서 용이하게 분해되는 공유 연결이다. 일부 실시양태에서, pH-감수성 링커는 4 내지 6의 범위의 pH에서 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, pH-감수성 링커는 히드라존 또는 시클릭 아세탈을 포함한다. 일부 실시양태에서, pH-감수성 링커는 엔도솜 또는 리소솜 내에서 절단된다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 링커는 디술피드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-감수성 링커는 세포 내부의 글루타티온 종과의 디술피드 교환 반응에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 디술피드 모이어티는 적어도 1개의 아미노산, 예를 들어 시스테인 잔기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 Val-cit 링커이다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 6,214,345에 기재된 바와 같음). 일부 실시양태에서, 접합 전에, val-cit 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00026
일부 실시양태에서, 접합 후에, val-cit 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00027
일부 실시양태에서, Val-cit 링커는 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 접합을 위한 SPAAC)에 부착된다. 일부 실시양태에서, 클릭 화학 접합 전에, 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 접합을 위한 SPAAC)에 부착된 val-cit 링커는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00028
여기서 n은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, n은 3이다.
일부 실시양태에서, 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 접합을 위한 SPAAC)에 부착된 val-cit 링커는 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 (예를 들어, 상이한 화학적 모이어티를 통해) 접합된다. 일부 실시양태에서, 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 접합을 위한 SPAAC)에 부착되고 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 접합된 val-cit 링커는 하기 구조를 갖고 (클릭 화학 접합 전):
Figure pct00029
여기서 n은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, n은 3이다.
일부 실시양태에서, 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 대한 접합 후에, val-cit 링커는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00030
여기서 n은 0-10의 임의의 수이고, 여기서 m은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, n은 3이고, m은 4이다.
ii. 비-절단가능한 링커
일부 실시양태에서, 비-절단가능한 링커가 사용될 수 있다. 일반적으로, 비-절단가능한 링커는 세포 또는 생리학적 환경에서 용이하게 분해될 수 없다. 일부 실시양태에서, 비-절단가능한 링커는 임의로 치환된 알킬 기를 포함하며, 여기서 치환은 할로겐, 히드록실 기, 산소 종 및 다른 통상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알킬렌, 임의로 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 적어도 1개의 비-천연 아미노산을 포함하는 펩티드 서열, 말단절단된 글리칸, 효소적으로 분해될 수 없는 당 또는 당들, 아지드, 알킨-아지드, LPXT 서열을 포함하는 펩티드 서열, 티오에테르, 비오틴, 비페닐, 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 또는 등가 화합물, 산 에스테르, 산 아미드, 술파미드 및/또는 (예를 들어, 및) 알콕시-아민 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 소르타제-매개 라이게이션은 LPXT 서열을 포함하는 항-TfR 항체를 (G)n 서열을 포함하는 분자 페이로드에 공유 연결시키는 데 이용될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Proft T. Sortase-mediated protein ligation: an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilization. Biotechnol Lett. 2010, 32(1):1-10.] 참조).
일부 실시양태에서, 링커는 치환된 알킬렌, 임의로 치환된 알케닐렌, 임의로 치환된 알키닐렌, 임의로 치환된 시클로알킬렌, 임의로 치환된 시클로알케닐렌, 임의로 치환된 아릴렌, N, O 및 S로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자를 추가로 포함하는 임의로 치환된 헤테로아릴렌; N, O 및 S로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자를 추가로 포함하는 임의로 치환된 헤테로시클릴렌; 이미노, 임의로 치환된 질소 종, 임의로 치환된 산소 종 O, 임의로 치환된 황 종, 또는 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어 폴리에틸렌 옥시드 또는 폴리프로필렌 옥시드를 포함할 수 있다.
iii. 링커 접합
일부 실시양태에서, 링커는 포스페이트, 티오에테르, 에테르, 탄소-탄소, 카르바메이트 또는 아미드 결합을 통해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 기, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 백본의 말단 포스페이트를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 항-TfR 항체 상에 존재하는 리신 또는 시스테인 잔기를 통해 항-TfR 항체에 연결된다.
일부 실시양태에서, 링커는 아지드와 알킨 사이의 고리화첨가 반응으로 트리아졸을 형성하는 것에 의해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결되며, 여기서 아지드 및 알킨은 항-TfR 항체, 분자 페이로드 또는 링커 상에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 알킨은 시클릭 알킨, 예를 들어 시클로옥틴일 수 있다. 일부 실시양태에서, 알킨은 비시클로노닌 (비시클로[6.1.0]노닌 또는 BCN으로도 공지됨) 또는 치환된 비시클로노닌일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시클로옥탄은 2011년 11월 3일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO2011136645 (발명의 명칭: "Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions")에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 아지드는 아지드를 포함하는 당 또는 탄수화물 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아지드는 6-아지도-6-데옥시갈락토스 또는 6-아지도-N-아세틸갈락토사민일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아지드를 포함하는 당 또는 탄수화물 분자는 2016년 10월 27일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO2016170186 (발명의 명칭: "Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase")에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 아지드와 알킨 사이의 고리화첨가 반응으로 트리아졸을 형성하며, 여기서 아지드 및 알킨은 항-TfR 항체, 분자 페이로드 또는 링커 상에 위치할 수 있다는 것은 2014년 5월 1일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO2014065661 (발명의 명칭: "Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof"); 또는 2016년 10월 27일에 공개된 국제 특허 출원 공개 WO2016170186 (발명의 명칭: "Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase")에 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 링커는 스페이서, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 또는 아실/카르보모일 술파미드 스페이서, 예를 들어 히드라스페이스(HydraSpace)™ 스페이서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 문헌 [Verkade, J.M.M. et al., "A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufacturability, Stability, and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates", Antibodies, 2018, 7, 12]에 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 링커는 친디엔체와 디엔/헤테로-디엔 사이의 딜스-알더 반응에 의해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결되고, 여기서 친디엔체 및 디엔/헤테로-디엔은 항-TfR 항체, 분자 페이로드 또는 링커 상에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 다른 페리시클릭 반응, 예를 들어 엔 반응에 의해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미드, 티오아미드 또는 술폰아미드 결합 반응에 의해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 축합 반응에 의해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결되어 링커와 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드 사이에 존재하는 옥심, 히드라존 또는 세미카르바지드 기를 형성한다.
일부 실시양태에서, 링커는 친핵체, 예를 들어 아민 또는 히드록실 기와 친전자체, 예를 들어 카르복실산 또는 알데히드 사이의 공액 첨가 반응에 의해 항-TfR 항체 및/또는 (예를 들어, 및) 분자 페이로드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 친핵체는 링커 상에 존재할 수 있고, 친전자체는 링커와 항-TfR 항체 또는 분자 페이로드 사이의 반응 전 항-TfR 항체 또는 분자 페이로드 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친전자체는 링커 상에 존재할 수 있고, 친핵체는 링커와 항-TfR 항체 또는 분자 페이로드 사이의 반응 전 항-TfR 항체 또는 분자 페이로드 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친전자체는 아지드, 펜타플루오로페닐, 규소 중심, 카르보닐, 카르복실산, 무수물, 이소시아네이트, 티오이소시아네이트, 숙신이미딜 에스테르, 술포숙신이미딜 에스테르, 말레이미드, 알킬 할라이드, 알킬 슈도할라이드, 에폭시드, 에피술피드, 아지리딘, 아릴, 활성화된 인 중심 및/또는 (예를 들어, 및) 활성화된 황 중심일 수 있다. 일부 실시양태에서, 친핵체는 임의로 치환된 알켄, 임의로 치환된 알킨, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 히드록실 기, 아미노 기, 알킬아미노 기, 아닐리도 기 또는 티올 기일 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 접합을 위한 SPAAC)에 부착된 val-cit 링커는 하기 구조에 의해 항-TfR 항체에 접합되고:
Figure pct00031
여기서 m은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 접합을 위한 SPAAC)에 부착된 val-cit 링커는 하기 구조를 갖는 항-TfR 항체에 접합되고:
Figure pct00032
여기서 m은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 접합을 위한 SPAAC)에 부착되고 항-TfR 항체에 접합된 val-cit 링커는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00033
여기서 n은 0-10의 임의의 수이고, 여기서 m은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, n은 3이고/거나 (예를 들어, 이고) m은 4이다.
일부 실시양태에서, 항체와 분자 페이로드를 연결하는 val-cit 링커는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00034
여기서 n은 0-10의 임의의 수이고, 여기서 m은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, n은 3이고/거나 (예를 들어, 이고) m은 4이다. 일부 실시양태에서, n은 3이고/거나 (예를 들어, 이고) m은 4이다. 일부 실시양태에서, X는 항체의 NH (예를 들어, 리신의 아민 기로부터의 NH), S (예를 들어, 시스테인의 티올 기로부터의 S) 또는 O (예를 들어, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 히드록실 기로부터의 O)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00035
여기서 n은 0-10의 임의의 수이고, 여기서 m은 0-10의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, n은 3이고/거나 (예를 들어, 이고) m은 4이다.
구조식 (A), (B), (C) 및 (D)에서, L1은, 일부 실시양태에서, 치환 또는 비치환된 지방족, 치환 또는 비치환된 헤테로지방족, 치환 또는 비치환된 카르보시클릴렌, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴렌, 치환 또는 비치환된 아릴렌, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌, -O-, -N(RA)-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)NRA-, -NRAC(=O)-, -NRAC(=O)RA-, -C(=O)RA-, -NRAC(=O)O-, -NRAC(=O)N(RA)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -OC(=O)N(RA)-, -S(O)2NRA-, -NRAS(O)2- 또는 그의 조합인 스페이서이다. 일부 실시양태에서, L1은 하기이고:
Figure pct00036
여기서 피페라진 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 연결되고, 여기서 L2는
Figure pct00037
이다.
일부 실시양태에서, L1은 하기이고:
Figure pct00038
여기서 피페라진 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 연결된다.
일부 실시양태에서, L1은
Figure pct00039
이다.
일부 실시양태에서, L1은 올리고뉴클레오티드의 5' 포스페이트에 연결된다.
일부 실시양태에서, L1은 임의적이다 (예를 들어, 반드시 존재할 필요는 없음).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체 중 어느 하나는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00040
여기서 n은 0-15 (예를 들어, 3)이고, m은 0-15 (예를 들어, 4)이다.
C. 항체-분자 페이로드 복합체의 예
본원에 기재된 임의의 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 공유 연결된 본원에 기재된 어느 하나의 항-TfR 항체를 포함하는 복합체의 비제한적 예가 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-TfR 항체 (예를 들어, 표 2에 제공된 항-TfR 항체 중 어느 하나)는 링커를 통해 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 공유 연결된다. 본원에 기재된 임의의 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드가 올리고뉴클레오티드인 경우에, 링커는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단, 3' 말단 또는 내부에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 항-TfR 항체에 티올-반응성 연결을 통해 (예를 들어, 항-TfR 항체 내의 시스테인을 통해) 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커 (예를 들어, Val-cit 링커)는 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 항-TfR 항체)에 아민 기를 통해 (예를 들어, 항체 내의 리신을 통해) 연결된다.
Val-cit 링커를 통해 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체의 구조의 예가 하기에 제공된다:
Figure pct00041
여기서 링커는 항체에 티올-반응성 연결을 통해 (예를 들어, 항체 내의 시스테인을 통해) 연결된다.
Val-cit 링커를 통해 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체의 구조의 또 다른 예가 하기에 제공된다:
Figure pct00042
여기서 n은 0-10의 수이고, 여기서 m은 0-10의 수이고, 여기서 링커는 항체에 아민 기를 통해 (예를 들어, 리신 잔기 상에서) 연결되고/거나 (예를 들어, 연결되고), 여기서 링커는 올리고뉴클레오티드에 (예를 들어, 5' 말단, 3' 말단 또는 내부에) 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 항체에 리신을 통해 연결되고, 링커는 올리고뉴클레오티드에 5' 말단에서 연결되고, n은 3이고, m은 4이다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 링커는 5' 말단 또는 3' 말단에서 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 연결된다.
항체는 분자 페이로드에, 약물 대 항체 비 (DAR) (여기서 "약물"은 분자 페이로드임)로 지칭될 수 있는 특성인 상이한 화학량론으로 연결될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 일부 실시양태에서, 1개의 분자 페이로드가 항체에 연결된다 (DAR = 1). 일부 실시양태에서, 2개의 분자 페이로드가 항체에 연결된다 (DAR = 2). 일부 실시양태에서, 3개의 분자 페이로드가 항체에 연결된다 (DAR = 3). 일부 실시양태에서, 4개의 분자 페이로드가 항체에 연결된다 (DAR = 4). 일부 실시양태에서, 각각 상이한 DAR을 갖는 상이한 복합체의 혼합물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 혼합물 중 복합체의 평균 DAR은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5 또는 그 초과의 범위일 수 있다. DAR은 분자 페이로드를 항체 상의 상이한 부위에 접합시킴으로써 및/또는 (예를 들어, 및) 다량체를 항체 상의 1개 이상의 부위에 접합시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, DAR 2는 단일 분자 페이로드를 항체 상의 2개의 상이한 부위에 접합시킴으로써 또는 이량체 분자 페이로드를 항체의 단일 부위에 접합시킴으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 본원에 기재된 항-TfR 항체 (예를 들어, 표 2-5의 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 링커 (예를 들어, Val-cit 링커)를 통해 분자 페이로드에 공유 연결된 본원에 기재된 항-TfR 항체 (예를 들어, 표 2-5의 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 (예를 들어, Val-cit 링커)는 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 항-TfR 항체)에 티올-반응성 연결을 통해 (예를 들어, 항체 내의 시스테인을 통해) 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커 (예를 들어, Val-cit 링커)는 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 항-TfR 항체)에 아민 기를 통해 (예를 들어, 항체 내의 리신을 통해) 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체의 예 중 어느 하나에서, 분자 페이로드는 본원에 기재된 유전자 표적 서열 중 어느 하나에 대한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 상보성 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 표 2에 제시된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3과 동일한 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및 표 2에 제시된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3과 동일한 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 69, 서열식별번호: 71 또는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 77 또는 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 86 또는 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88 또는 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88 또는 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92 또는 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 97, 서열식별번호: 98 또는 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 100 또는 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 100 또는 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 102 또는 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00043
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00044
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00045
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00046
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00047
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00048
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00049
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00050
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00051
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하며, 여기서 항-TfR 항체는 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00052
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00053
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00054
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00055
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00056
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00057
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00058
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00059
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00060
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00061
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00062
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00063
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00064
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00065
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00066
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00067
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00068
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00069
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00070
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00071
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리신을 통해 공유 연결된 항-TfR Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR Fab는 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 복합체는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00072
여기서 n은 3이고, m은 4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체의 예 중 어느 하나에서, L1은 본원에 기재된 스페이서 중 어느 하나이다.
일부 실시양태에서, L1은 하기이고:
Figure pct00073
여기서 피페라진 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 연결되고, 여기서 L2는
Figure pct00074
이다.
일부 실시양태에서, L1은 하기이고:
Figure pct00075
,
여기서 피페라진 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 연결된다.
일부 실시양태에서, L1은
Figure pct00076
이다.
일부 실시양태에서, L1은 올리고뉴클레오티드의 5' 포스페이트에 연결된다.
일부 실시양태에서, L1은 임의적이다 (예를 들어, 반드시 존재할 필요는 없음).
IV. 제제
본원에 제공된 항-TfR 항체 또는 복합체는 임의의 적합한 방식으로 제제화될 수 있다. 일반적으로, 본원에 제공된 항체 또는 복합체는 제약 용도에 적합한 방식으로 제제화된다. 예를 들어, 항체 또는 복합체는 분해를 최소화하거나, 전달 및/또는 (예를 들어, 및) 흡수를 용이하게 하거나, 또는 제제 내의 복합체에 또 다른 유익한 특성을 제공하는 제제를 사용하여 대상체에게 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 복합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 대상체에게 투여되는 경우에 표적 세포의 바로 옆 환경으로 또는 전신으로, 충분한 양의 복합체가 표적 근육 세포에 진입하도록 적합하게 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 복합체는 완충제 용액, 예컨대 포스페이트-완충 염수 용액, 리포솜, 미셀 구조 및 캡시드 중에 제제화된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 제공된 복합체의 1종 이상의 성분 (예를 들어, 항-TfR 항체, 링커, 분자 페이로드 또는 이들 중 어느 하나의 전구체 분자)을 개별적으로 포함할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 복합체는 물 또는 수용액 (예를 들어, pH 조정이 동반된 물) 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 복합체는 염기성 완충 수용액 (예를 들어, PBS) 중에 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 조성물에 활성 성분의 개선된 안정성, 개선된 흡수, 개선된 용해도 및/또는 (예를 들어, 및) 치료 증진을 부여한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 완충제 (예를 들어, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 트리스 염기 또는 수산화나트륨) 또는 비히클 (예를 들어, 완충 용액, 페트롤라툼, 디메틸 술폭시드 또는 미네랄 오일)이다.
일부 실시양태에서, 복합체 또는 그의 성분 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 항체)은 그의 보관 수명을 연장시키기 위해 동결건조된 다음, 사용 (예를 들어, 대상체에 대한 투여) 전에 용액으로 만들어진다. 따라서, 본원에 기재된 복합체 또는 그의 성분을 포함하는 조성물 중 부형제는 동결건조보호제 (예를 들어, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐 피롤리돈) 또는 붕괴 온도 조절제 (예를 들어, 덱스트란, 피콜 또는 젤라틴)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하 투여를 포함한다. 전형적으로, 투여 경로는 정맥내 또는 피하이다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨을 포함한다. 멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 선택된 용매 중에 요구되는 양의 복합체를 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 0.1% 또는 그 초과의 복합체 또는 그의 성분을 함유할 수 있으며, 활성 성분(들)의 백분율은 총 조성물의 중량 또는 부피의 약 1% 내지 약 80% 또는 그 초과일 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 이러한 제약 제제를 제조하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
V. 사용 방법
본 개시내용의 일부 측면은 연구, 진단 방법, 검출 방법 및 치료 방법을 포함한, 본원에 기재된 항-TfR 항체, 항체 단편 또는 변이체, 그를 코딩하는 핵산 및 복합체의 다양한 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 분자 페이로드 (예를 들어, 진단제 또는 치료제)를 트랜스페린 수용체를 발현하는 표적 세포 또는 조직에 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 근육 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 근육이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 뇌이다. 분자 페이로드를 전달하기 위해, 항-TfR 항체는 분자 페이로드에 접합 (예를 들어, 공유 접합)되어 복합체를 형성할 수 있다.
a. 진단 및 검출 방법
또한, 진단 및/또는 (예를 들어, 및) 검출 방법에서의 상기 기재된 항체, 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 및 임의로 적합한 수단 중 어느 하나의 용도가 본원에 제공된다. 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어 이들이 액체 상에서 이용되거나 고체 상 담체에 결합될 수 있는 면역검정에서 사용하기에 적합하다. 항체 또는 항원-결합 단편을 이용할 수 있는 면역검정의 예는 직접 또는 간접 포맷의 경쟁적 및 비-경쟁적 면역검정이다. 이러한 면역검정의 예는 효소 연결 면역검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA), 샌드위치 (면역측정 검정), 유동 세포측정법, 웨스턴 블롯 검정, 면역침전 검정, 면역조직화학, 면역-현미경검사, 측방 유동 면역-크로마토그래피 검정 및 프로테오믹스 어레이이다. 항원 및 항체 또는 항원-결합 단편은 많은 상이한 고체 지지체 (예를 들어, 담체, 막, 칼럼, 프로테오믹스 어레이 등)에 결합될 수 있다. 널리 공지된 고체 지지체 물질의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 개질된 셀룰로스, 예컨대 니트로셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 지지체의 성질은 고정되거나 용액 중에 현탁될 수 있다 (예를 들어, 비드).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-TfR 항체 중 어느 하나는 생물학적 샘플에서 트랜스페린 수용체의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 혈액, CSF 및 BBB-함유 조직을 포함한다. 생물학적 샘플은 시험관내 샘플 (예를 들어, 배양된 것) 또는 생체내 샘플 (예를 들어, 대상체 내의 것)일 수 있다. 본 개시내용은 또한 연구 용도에서의 (예를 들어, 면역 검정, 예컨대 웨스턴 블롯팅, 면역염색, ELISA 및/또는 (예를 들어, 및) FACS를 위한 시약으로서의) 본원에 기재된 항-TfR 항체 중 어느 하나의 용도를 고려한다.
일부 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-TfR 항체가 제공된다. 일부 측면에서, 생물학적 샘플에서 트랜스페린 수용체의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-TfR 항체와 트랜스페린 수용체에 대한 항-TfR 항체의 결합을 가능하게 하는 조건 하에 접촉시키고, 항-TfR 항체와 트랜스페린 수용체 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-TfR 항체는, 예를 들어 트랜스페린 수용체가 환자의 선택을 위한 바이오마커인, 항-TfR 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는 데 사용된다.
본원에 기재된 항-TfR 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는, 트랜스페린 수용체가 망상적혈구에서 발현되고 이에 따라 본 발명의 임의의 항체에 의해 검출가능하다는 사실로 인해, 미성숙 적혈구를 수반하는 장애를 포함한다. 이러한 장애는 빈혈 및 망상적혈구의 감소된 수준으로부터 발생하는 다른 장애, 또는 선천성 다혈구혈증 또는 신생물성 진성 다혈구혈증을 포함하며, 여기서 예를 들어 망상적혈구의 과다증식으로 인한 상승된 적혈구 수는 혈액의 증점 및 수반되는 생리학적 증상을 유발한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 트랜스페린 수용체의 존재/수준을 검출하기 위해, 표지된 항-TfR 항체가 사용된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색단, 전자-고밀도, 화학발광 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 시험관내 세포에서 트랜스페린 수용체를 검출하는 데 적합한 작용제이며, 이는 방사성 분자, 방사성약제 또는 산화철 입자일 수 있다. 생체내 영상화에 적합한 방사성 분자는 122I, 123I, 124I, 125I, 131I, 18F, 75Br, 76Br, 77Br, 211At, 225Ac, 177Lu, 153Sm, 186Re, 188Re, 67Cu, 213Bi, 212Bi, 212Pb 및 67Ga를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 생체내 영상화에 적합한 예시적인 방사성제약은 111In 옥시퀴놀린, 131I 아이오딘화나트륨, 99mTc 메브로페닌 및 99mTc 적혈구, 123I 아이오딘화나트륨, 99mTc 엑사메타짐, 99mTc 거대응집체 알부민, 99mTc 메드로네이트, 99mTc 메르티아티드, 99mTc 옥시드로네이트, 99mTc 펜테테이트, 99mTc 퍼테크네테이트, 99mTc 세스타미비, 99mTc 황 콜로이드, 99mTc 테트로포스민, 탈륨-201 또는 크세논-133을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체는 (예를 들어, 형광 현미경검사에 의해 또는 자기 공명 영상화 (MRI)에 의한) 세포 또는 조직의 가시화를 위해 검출가능한 표지를 표적 세포 또는 조직으로 (예를 들어, 근육 세포로 또는 혈액 뇌 장벽을 가로질러 뇌로) 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 검출가능한 표지가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용되는 항-TfR 항체는 이펙터 기능이 결여되거나 또는 감소된 이펙터 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 진단/검출 방법에 사용되는 항-TfR 항체는 이펙터 기능을 갖지 않거나 감소된 이펙터 기능을 갖도록 조작된다 (예를 들어, Fab의 사용, Ig 백본의 변형, 이펙터 기능을 감소 또는 제거하는 1개 이상의 Fc 돌연변이의 도입 및/또는 (예를 들어, 및) 항체의 글리코실화 상태의 변형에 의해).
트랜스페린 수용체에 대한 항체의 결합을 결정하기 위한 다양한 기술이 이용가능하다. 하나의 이러한 검정은 인간 트랜스페린 수용체 (및 뇌 항원)에 결합하는 능력을 확인하기 위한 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)이다. 이러한 검정에 따라, 항원 (예를 들어, 재조합 트랜스페린 수용체)으로 코팅된 플레이트는 항-TfR 항체를 포함하는 샘플과 함께 인큐베이션되고, 관심 항원에 대한 항체의 결합이 결정된다.
생체내 진단 검정을 수행하기 위해, 표지 (예를 들어, 영상화제 또는 조영제)와 접합된 적합한 양의 항-TfR 항체가 검사를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 표지된 항체의 존재는 상용 방법에 의해 표지로부터 방출된 신호에 기초하여 검출될 수 있다. 전신 투여된 항체의 흡수 및 항체의 다른 생물학적 활성을 평가하기 위한 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
과학적 연구 검정을 수행하기 위해, 항-TfR 항체는 트랜스페린 수용체의 생물활성을 연구하고/거나 (예를 들어, 연구하고) 세포내 트랜스페린 수용체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 양의 항-TfR 항체가 트랜스페린 수용체를 생산하는 것으로 의심되는 샘플 (예를 들어, 이전에 트랜스페린 수용체 생산 세포로서 확인되지 않은 새로운 세포 유형)과 접촉될 수 있다. 항체 및 샘플은 트랜스페린 수용체 항원에 대한 항체의 결합을 가능하게 하는 적합한 기간 동안 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다. 이어서 이러한 상호작용은 상용 방법, 예를 들어 ELISA, 조직학적 염색 또는 FACS를 통해 검출될 수 있다.
b. 치료 방법
본원에 기재된 항-TfR 항체는 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 펩티드/단백질, 핵산 구축물 등)인 분자 페이로드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 제공한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체는 근육 질환 (예를 들어, 희귀 근육 질환 또는 근육 위축)을 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 복합체는 표 6에 제공된 희귀 근육 질환을 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 근육 질환은 질환 대립유전자와 연관되며, 예를 들어 특정한 근육 질환에 대한 질환 대립유전자는 표 6에 열거된 상응하는 유전자 내의 유전자 변경을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 복합체는 표 6에 "근육 위축 유전자 표적" 섹션 하에 열거된 1종 이상의 유전자의 활성과 연관된 근육 위축을 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 근육 위축은 AIDS, 울혈성 심부전, 암, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 신부전 또는 근육 불사용을 포함한 만성 질병으로 인한 것이다.
다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체는 신경계 질환을 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 신경계 질환은 신경병증, 아밀로이드증, 암, 안구 질환 또는 장애, 바이러스 또는 미생물 감염, 염증, 허혈, 신경변성 질환, 발작, 행동 장애 및 리소솜 축적 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 출원의 목적상, CNS는 혈액-망막 장벽에 의해 신체의 나머지로부터 정상적으로 격리되는 눈을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 신경계 장애의 구체적 예는 신경변성 질환 (예컨대, 비제한적으로, 루이 소체 질환, 회색질척수염후 증후군, 샤이-드래거 증후군, 올리브교뇌소뇌 위축, 파킨슨병, 다계통 위축, 선조체흑질 변성, 타우병증 (예컨대, 비제한적으로, 알츠하이머병 및 핵상 마비), 프리온 질환 (예컨대, 비제한적으로, 소 해면상 뇌병증, 스크래피, 크로이츠펠트-야콥 증후군, 쿠루병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커병, 만성 소모성 질환 및 치명적 가족성 불면증), 연수 마비, 운동 뉴런 질환 및 신경계 이종변성 장애 (예컨대, 비제한적으로, 카나반병, 헌팅톤병, 신경 세로이드-리포푸신증, 알렉산더병, 투렛 증후군, 멘케스 킨키 헤어 증후군, 코케인 증후군, 할러보르덴-스파츠 증후군, 라포라병, 레트 증후군, 간렌즈핵 변성, 레쉬-니한 증후군 및 운베리히트-룬트보르크 증후군), 치매 (예컨대, 비제한적으로, 픽병 및 척수소뇌성 운동실조), 암 (예를 들어, 신체 내 다른 곳의 암으로부터 생성된 뇌 전이를 포함한 CNS의 암)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 신경계 질환을 치료하기 위해, 복합체는 신경계 질환을 치료하기 위한 약물 (예를 들어, 표 7에 열거된 약물)에 접합된 본원에 기재된 항-TfR 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체, 비-인간 영장류 대상체, 설치류 대상체 또는 임의의 적합한 포유동물 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 표 6에 제공된 근육 질환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 근육 위축을 가질 수 있거나 또는 근육 위축이 발생할 위험이 있을 수 있다.
본 개시내용의 한 측면은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 복합체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물의 유효량이 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 복합체를 포함하는 제약 조성물은 정맥내 투여를 포함할 수 있는 적합한 경로에 의해, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정맥내 투여는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내 또는 척수강내 경로에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 고체 형태, 수성 형태 또는 액체 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 수성 또는 액체 형태는 네뷸라이징되거나 동결건조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 네뷸라이징 또는 동결건조 형태는 수성 또는 액체 용액으로 재구성될 수 있다.
정맥내 투여를 위한 조성물은 다양한 담체, 예컨대 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 수용성 항체가 점적 방법에 의해 투여될 수 있고, 이에 의해 항체 및 생리학상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 제제가 주입된다. 생리학상 허용되는 부형제는, 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제제는 제약 부형제, 예컨대 주사용수, 0.9% 염수 또는 5% 글루코스 용액 중에 용해되어 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물은 부위-특이적 또는 국부 전달 기술을 통해 투여된다. 이들 기술의 예는 복합체의 이식가능한 데포 공급원, 국부 전달 카테터, 부위 특이적 담체, 직접 주사 또는 직접 적용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물은 대상체에 대해 치료 효과를 부여하는 유효 농도로 투여된다. 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 질환의 중증도, 치료될 대상체의 고유한 특징, 예를 들어 연령, 신체 상태, 건강 또는 체중, 치료 지속기간, 임의의 공동 요법의 성질, 투여 경로 및 관련 인자에 따라 달라진다. 이들 관련 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 단지 상용에 지나지 않는 실험으로 다루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효 농도는 환자에게 안전한 것으로 간주되는 최대 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효 농도는 최대 효능을 제공하는 최저 가능한 농도일 것이다.
경험적 고려사항, 예를 들어 대상체에서의 복합체의 반감기는 일반적으로 치료에 사용되는 제약 조성물의 농도의 결정에 기여할 것이다. 투여 빈도는 치료 효능을 최대화하기 위해 실험적으로 결정되고 조정될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 임의의 복합체의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 상기 기재된 인자, 예를 들어 안전성 또는 효능에 따라 약 1 내지 100 mg/kg 또는 그 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 1회 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, 치료는 매일, 격주, 매주, 격월, 매월 또는 대상체에 대한 안전성 위험을 최소화하면서 최대 효능을 제공하는 임의의 시간 간격으로 투여될 것이다. 일반적으로, 효능 및 치료 및 안전성 위험은 치료 과정 전반에 걸쳐 모니터링될 수 있다.
치료 효능은 임의의 적합한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 효능은 근육 질환 및/또는 (예를 들어, 및) 근육 위축과 연관된 증상의 관찰의 평가에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물은 표적 유전자의 활성 또는 발현을 대조군, 예를 들어 치료 전의 유전자 발현의 기준선 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 억제하는 데 충분한 유효 농도로 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 본원에 기재된 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물의 단일 용량 또는 투여는 표적 유전자의 활성 또는 발현을 적어도 1-5, 1-10, 5-15, 10-20, 15-30, 20-40, 25-50일 또는 그 초과 동안 억제하는 데 충분하다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 본원에 기재된 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물의 단일 용량 또는 투여는 표적 유전자의 활성 또는 발현을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주 동안 억제하는 데 충분하다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 본원에 기재된 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물의 단일 용량 또는 투여는 표적 유전자의 활성 또는 발현을 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 억제하는 데 충분하다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 분자 페이로드에 공유 연결된 항-TfR 항체를 포함하는 1종 초과의 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체, 예를 들어 근육 질환 (예를 들어, 표 6에 제공된 근육 질환)을 갖는 인간 대상체의 치료를 위한 임의의 다른 적합한 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 치료제는 본원에 기재된 복합체의 유효성을 증진 또는 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 치료제는 본원에 기재된 복합체와 상이한 증상 또는 질환을 치료하는 기능을 할 수 있다.
c. 치료 및 진단 용도를 위한 키트
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 치료 또는 진단 용도를 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 항-TfR 항체, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 것을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 본원에 기재된 것과 같은 표적 질환을 치료하거나, 그의 발병을 지연시키거나 또는 그를 완화시키기 위한 항-TfR 항체의 투여에 대한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 표적 질환을 갖는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지침서는 표적 질환의 위험이 있는 개체에게 항체를 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.
항-TfR 항체의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 보유된 지침서)가 또한 허용된다.
라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 면역 반응을 조정함으로써 치료가능한 질환 또는 장애, 예컨대 자가면역 질환의 치료, 그의 발병 지연 및/또는 (예를 들어, 및) 그의 완화에 사용된다는 것을 나타낸다. 지침서는 본원에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 단지, 가요성 포장 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 것과 같은 항-TfR 항체이다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
샘플에서 트랜스페린 수용체를 검출하는 데 사용하기 위한 키트가 또한 본원에 제공된다. 이러한 키트는 본원에 기재된 임의의 항-TfR 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항-TfR 항체는 본원에 기재된 것과 같은 검출가능한 표지와 접합될 수 있다. 본원에 사용된 "접합된" 또는 "부착된"은 2개의 개체가 회합된 것, 바람직하게는 2개의 개체 사이의 회합의 치료/진단 이익이 실현되기에 충분한 친화도로 회합된 것을 의미한다. 2개의 개체 사이의 회합은 직접적이거나 또는 링커, 예컨대 중합체 링커를 통한 것일 수 있다. 접합된 또는 부착된은 공유 또는 비공유 결합뿐만 아니라 다른 형태의 회합, 예컨대, 예를 들어 한 개체의 다른 개체 상의 또는 내의 포획, 또는 어느 하나 또는 둘 다의 개체의 제3 개체, 예컨대 미셀 상의 또는 내의 포획을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 키트는 항-TfR 항체에 결합할 수 있는 2차 항체를 포함할 수 있다. 키트는 트랜스페린 수용체를 검출하기 위한 항-TfR 항체의 사용에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간화 항-TfR1 항체
표 2에 제시된 항-TfR 항체를 제조성 문제를 줄이기 위해 인간화 및 돌연변이유발에 적용하였다. 인간화 변이체를 그의 결합 특성 및 생물학적 활성에 대해 스크리닝하고 시험하였다. 항-TfR1 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간화 변이체 (각각 5종의 변이체)를 복합 인간 기술을 사용하여 설계하였다. 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 Fab를 코딩하는 유전자를 합성하고, 각각의 인간화 중쇄 및 경쇄 변이체를 발현시키도록 벡터를 구축하였다. 후속적으로, 각각의 벡터를 소규모로 발현시키고, 생성된 인간화 항-TfR1 Fab를 분석하였다. 표적 항원에 대한 항체 친화도의 비아코어 검정, 상대 발현, 인간 배선 서열에 대한 퍼센트 상동성 및 MHC 부류 II 예측된 T 세포 에피토프의 수 (iTope™ MCH 부류 II 인 실리코 분석을 사용하여 결정됨)를 포함한 여러 기준에 기초한 추가의 시험을 위해 인간화 Fab를 선택하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역에 아미노산 치환을 도입함으로써 일부 항체의 모 서열 내에서 잠재적 문제를 확인하였다. 이들 치환은 상대 발현 수준, iTope™ 점수 및 비아코어 단일 주기 동역학 분석으로부터의 상대 KD에 기초하여 선택하였다. 인간화 변이체를 시험하였으며, 변이체는 초기에 표적 항원에 대한 친화도에 기초하여 선택하였다. 후속적으로, 선택된 인간화 Fab를 표 8 및 표 9에 제시된, 각각의 분석된 변이체의 안정성 및 응집 및 분해에 대한 감수성의 일련의 생물물리학적 평가에 기초하여 추가로 스크리닝하였다. 선택된 Fab를 동역학 분석에 의해 TfR1에 결합하는 그의 특성에 대해 분석하였다. 이들 분석의 결과가 표 10에 제시된다. 표 8 및 표 9에 제시된 접합체의 경우, 선택된 인간화 Fab를 DMPK-표적화 올리고뉴클레오티드 ASO300에 접합시켰다. 선택된 Fab는 노출 전과 비교하여 9일 동안 고온 (40℃)에 노출된 후 인간 및 시노 TfR1에 대한 대등한 결합 친화도에 의해 나타난 바와 같이 열적으로 안정하다 (표 10 참조).
표 8. 인간화 항-TfR Fab에 대한 생물물리학적 평가 데이터
Figure pct00077
*접합 후에 시노 결합을 회복함;
표 9. 인간화 항-TfR Fab 및 접합체에 대한 열 안정성
Figure pct00078
표 10. TfR1에 대한 인간화 항-TfR Fab 결합의 동역학 분석
Figure pct00079
TfR1에 대한 인간화 항-TfR1 Fab의 결합 (ELISA)
TfR1에 대한 인간화 항-TfR 항체의 결합을 측정하기 위해, ELISA를 수행하였다. 고결합, 흑색, 편평 바닥, 96 웰 플레이트 (코닝(Corning)# 3925)를 먼저 PBS 중 1 μg/mL의 재조합 huTfR1 100 μL/웰로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 웰을 비우고, 잔류 액체를 제거하였다. 200 μL의 PBS 중 1%BSA (w/w)를 각각의 웰에 첨가함으로써 차단을 수행하였다. 진탕기 상에서 300 rpm으로 실온에서 2시간 동안 차단이 진행되도록 하였다. 차단 후, 액체를 제거하고, 웰을 300 μL의 TBST로 3회 세척하였다. 이어서, 항-TfR1 항체를 0.5% BSA/TBST 중에 8 포인트 연속 희석 (희석 범위 5 μg/mL - 5 ng/mL)으로 삼중으로 첨가하였다. 양성 대조군 및 이소형 대조군을 또한 ELISA 플레이트 상에 포함시켰다. 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 300 rpm으로 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 300 μL의 TBST로 3회 세척하였다. 항-(H+L)IgG-A488 (1:500) (인비트로젠 #A11013)을 TBST 중 0.5% BSA 중에 희석하고, 100 μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 300 rpm으로 실온에서 60분 동안 인큐베이션되도록 하였다. 액체를 제거하고, 플레이트를 300 μL의 TBST로 4회 세척하였다. 이어서, 플레이트 판독기 상에서 495 nm 여기 및 50 nm 방출 (15 nm 대역폭)에서 흡광도를 측정하였다. 데이터를 기록하고, EC50에 대해 분석하였다. 인간화 3M12, 3A4 및 5H12 Fab에 대한 인간 TfR1 (hTfR1)에의 결합에 관한 데이터가 각각 도 1a, 1c 및 1e에 제시된다. hTfR1에 대해 상기 기재된 것과 동일한 프로토콜에 따라 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) TfR1 (cTfR1)을 사용하여 ELISA 측정을 수행하였으며, 결과가 도 1b, 1d 및 1f에 제시된다.
hTfR1 및 cTfR1에의 인간화 항-TfR Fab의 결합에 대한 이들 2 세트의 ELISA 분석의 결과는 인간화 3M12 Fab가 hTfR1 및 cTfR1 둘 다에 대해 일관된 결합을 나타내고, 인간화 3A4 Fab가 hTfR1에 비해 cTfR1에 대해 감소된 결합을 나타낸다는 것을 입증한다.
각각 DMPK 표적화 올리고뉴클레오티드 ASO300에 접합된 6종의 인간화 항-TfR Fab를 사용하여 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 제조하였다. 접합 효율 및 하류 정제를 특징화하고, 생성물 접합체의 다양한 특성을 측정하였다. 결과는 접합 효율이 시험된 10종의 모든 변이체에 걸쳐 강건하고, 정제 공정 (소수성 상호작용 크로마토그래피에 이어서 히드록시아파타이트 수지 크로마토그래피)이 효과적이라는 것을 입증한다. 정제된 접합체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석 시에 >97% 순도를 나타냈다.
여러 인간화 Fab를 세포 흡수 실험에서 TfR1-매개 내재화를 평가하기 위해 시험하였다. 항체에 의해 매개되는 이러한 세포 흡수를 측정하기 위해, 인간화 항-TfR Fab 접합체를 pH-감수성 염료인 사이퍼5e로 표지하였다. 횡문근육종 (RD) 세포를 4시간 동안 100 nM의 접합체로 처리하고, 트립신처리하고, 2회 세척하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 애튠 NxT 소프트웨어를 사용하여 평균 사이퍼5e 형광 (흡수를 나타냄)을 계산하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, 인간화 항-TfR Fab는 양성 대조군 항-TfR1 Fab와 비교하여 유사하거나 더 큰 엔도솜 흡수를 나타낸다. 유사한 내재화 효율이 상이한 올리고뉴클레오티드 페이로드에 대해 관찰되었다. 항-마우스 TfR 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 저온 (비-내재화) 조건은 양성 대조군 항체-접합체의 형광 신호를 제거하였으며 (데이터는 제시되지 않음), 이는 양성 대조군 및 인간화 항-TfR Fab-접합체에서의 양성 신호가 Fab-접합체의 내재화로 인한 것임을 나타낸다.
6종의 인간화 항-TfR Fab의 접합체를 또한 ELISA에 의해 hTfR1 및 cTfR1에의 결합에 대해 시험하고, 비접합된 형태의 인간화 Fab와 비교하였다. 결과는 인간화 3M12 및 5H12 Fab가 그의 비접합된 형태에 비해 접합 후에 유사한 수준의 hTfR1 및 cTfR1 결합을 유지한다는 것을 입증한다 (3M12, 도 3a 및 3b; 5H12, 도 3e 및 3f). 흥미롭게도, 3A4 클론은 그의 비접합된 형태에 비해 접합 후에 cTfR1에 대한 개선된 결합을 나타낸다 (도 3c 및 3d).
이 실시예에 사용된 용어 '비접합된'은 항체가 올리고뉴클레오티드에 접합되지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 시험관내 항체-올리고뉴클레오티드 접합체에 의해 용이해진 DMPK mRNA 수준의 녹다운
인간화 항-TfR Fab 3M12 (VH3/Vk2), 3M-12 (VH4/Vk3) 및 3A4 (VH3-N54S/Vk4)를 함유하는 접합체를 DMPK-표적화 안티센스 올리고뉴클레오티드 ASO300에 접합시키고, 횡문근육종 (RD) 세포에서 DMPK 전사체 발현의 녹다운에 대해 시험하였다. 항체를 화학식 (C)에 제시된 링커를 통해 ASO300에 접합시켰다.
RD 세포를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된, 글루타민 함유 DMEM의 성장 배지에서 거의 전면생장까지 배양하였다. 이어서, 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 20K 세포로 시딩하고, 24시간 동안 회복되도록 하였다. 이어서, 세포를 접합체로 3일 동안 처리하였다. 세포로부터 총 RNA를 수집하고, cDNA를 합성하고, qPCR에 의해 DMPK 발현을 측정하였다.
도 4의 결과는 DMPK 발현 수준이 PBS-처리된 세포에서의 발현에 비해 각각의 나타낸 접합체로 처리된 세포에서 감소되었다는 것을 보여주며, 이는 인간화 항-TfR Fab가 RD 세포에 의한 DMPK-표적화 올리고뉴클레오티드의 흡수를 매개할 수 있고 내재화된 DMPK-표적화 올리고뉴클레오티드가 DMPK mRNA 수준을 녹다운시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 3. 항-TfR 항체와 분자 페이로드를 연결하는 링커의 혈청 안정성
실시예에서 항체에 연결된 올리고뉴클레오티드를 화학식 (C)에 제시된 절단가능한 링커를 통해 접합시켰다. 링커가 혈청에서 안정성을 유지하고 표적화된 근육 세포에서 충분한 페이로드 축적에 유리한 방출 동역학을 제공하는 것이 중요하다. 이러한 혈청 안정성은 전신 정맥내 투여, 혈류 중 접합된 올리고뉴클레오티드의 안정성, 근육 조직으로의 전달 및 근육 세포에의 치료 페이로드의 내재화에 중요하다. 링커는 Fab에 대한 다중 유형의 페이로드 (ASO, siRNA 및 PMO 포함)의 정확한 접합을 용이하게 하는 것으로 확인되었다. 이러한 유연성은 각각의 근육 질환의 유전적 기초를 다루기 위한 적절한 유형의 페이로드의 합리적인 선택을 가능하게 하였다. 추가적으로, 링커 및 접합 화학은 각각의 유형의 페이로드에 대한 각각의 Fab에 부착된 페이로드 분자의 비의 최적화를 가능하게 하였고, 다양한 근육 질환 적용에서 사용할 수 있도록 분자의 신속한 설계, 생산 및 스크리닝을 가능하게 하였다.
도 5는 생체내 링커의 혈청 안정성을 보여주며, 이는 정맥내 투여 후 72시간의 과정에 걸쳐 다수의 종에 걸쳐 대등하였다. 각각의 경우에 투여 72시간 후에 적어도 75% 안정성이 측정되었다.
실시예 4. DMD 환자 근관에서의 항-TfR 접합체의 엑손-스킵핑 활성
이 연구에서, DMD 엑손51-스킵핑 올리고뉴클레오티드에 접합된 항-TfR Fab (3M12 VH3/VK2, 3M12 VH4/VK3 및 3A4 VH3 N54S/VK4)를 함유하는 항-TfR 접합체의 엑손-스킵핑 활성을 평가하였다. 엑손 52 결실을 보유하는 불멸화 인간 근모세포를 해동시키고, 프로모셀 골격 세포 성장 배지 (5% FBS 및 1x Pen-Strep 함유) 중에 1e6개 세포/플라스크의 밀도로 시딩하고, 전면생장률로 성장하도록 하였다. 전면생장되면, 세포를 트립신처리하고, 원심분리를 통해 펠릿화하고, 신선한 프로모셀 골격 세포 성장 배지 중에 재현탁시켰다. 세포 수를 계수하고, 세포를 매트리겔-코팅된 96-웰 플레이트에 50k개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 24시간 동안 회복되도록 하였다. 성장 배지를 흡인하고 혈청이 없는 분화 배지로 교체함으로써 세포가 분화되도록 유도하였다. 이어서, 세포를 10 μM의 접합된 또는 비접합된 DMD 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포를 시험 물품과 함께 10일 동안 인큐베이션한 다음, 96 웰 플레이트로부터 총 RNA를 수거하였다. cDNA 합성을 75 ng의 총 RNA에 대해 수행하고, 돌연변이 특이적 PCR을 수행하여 각각의 세포 유형에서 엑손 51 스킵핑의 정도를 평가하였다. 돌연변이-특이적 PCR 생성물을 4% 아가로스 겔 상에서 실행시키고, SYBR 골드를 사용하여 가시화하였다. 밀도측정법을 사용하여 스킵핑된 앰플리콘 및 스킵핑되지 않은 앰플리콘의 상대량을 계산하고, 엑손 51 스킵핑된 앰플리콘을 존재하는 앰플리콘의 총량으로 나눈 비로서 엑손 스킵핑을 결정하였다:
Figure pct00080
데이터는 DMD 엑손 51-스킵핑 올리고뉴클레오티드에 접합된 3M12 VH3/Vκ2 또는 3M12 VH4/Vκ3 Fab를 갖는 접합체가 환자 근관에서 비접합된 DMD 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증진된 엑손 스킵핑을 유발하였다는 것을 입증한다 (도 6).
이 실시예에 사용된 용어 '비접합된'은 올리고뉴클레오티드가 항체에 접합되지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 5. hTfR1 마우스에서의 항-TfR 접합체의 생체내 활성
DM1에서, 정상보다 더 많은 수의 CUG 반복부는 큰 헤어핀 루프를 형성하여 핵에 포획된 채 남아, 핵 병소를 형성하며, 이는 스플라이싱 단백질에 결합하고 스플라이싱 단백질이 그의 정상 기능을 수행하는 능력을 억제한다. 독성 핵 DMPK 수준이 감소되는 경우에, 핵 병소는 감소되어, 스플라이싱 단백질을 방출하고, 정상 mRNA 프로세싱의 회복을 허용하며, 잠재적으로 질환 진행을 정지 또는 역전시킨다.
마우스에 전신 정맥내 투여 후 다수의 근육 조직에서의 DMPK mRNA 수준을 감소시키는 데 있어서 DMPK-표적화 올리고뉴클레오티드 ASO300에 접합된 항-TfR Fab (대조군, 3M12 VH3/VK2, 3M12 VH4/VK3, 3A4 VH3 N54S/VK4)를 함유하는 접합체의 생체내 활성을 평가하였다.
하나의 TfR1 대립유전자가 인간 TFR1 대립유전자로 대체된 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 5 내지 15주령에 표 11 및 도 7a에 약술된 투여 스케줄에 따라 투여하였다. 마우스를 제1 주사 14일 후에 희생시키고, 선택된 근육을 표 12에 나타낸 바와 같이 수집하였다.
Figure pct00081
Figure pct00082
제조업체 (프로메가(Promega))에 의해 제공된 키트를 사용하여 맥스웰 급속 샘플 농축기 (RSC) 기기 상에서 총 RNA를 추출하였다. 정제된 RNA를 역전사시키고, 특이적 택맨 검정을 사용한 qRT-PCR (써모피셔(ThermoFIsher))에 의해 Dmpk 및 Ppib 전사체의 수준을 결정하였다. 참조 유전자로서 Ppib를 사용하고 대조군으로서 비히클을 주사한 마우스를 사용하여 2-ΔΔCT 방법에 따라 Dmpk 발현의 로그 배수 변화를 계산하였다. 다중 비교를 위한 던넷 보정과 함께 일원 ANOVA에 의해 대조군 마우스와 접합체가 투여된 마우스 사이의 Dmpk 발현 차이의 통계적 유의성을 결정하였다. 도 7b-7e에 제시된 바와 같이, 시험된 접합체는 다양한 근육 조직에서 생체내 DMPK mRNA 수준을 감소시키는 데 있어서 강건한 활성을 나타냈다.
실시예 6. 에피토프 맵핑
hTfR1/항-TfR Fab (3M12 VH4/Vk3) 복합체의 에피토프를 고해상도로 결정하기 위해, 단백질 복합체를 중수소화 가교제와 함께 인큐베이션하고, 다중-효소적 절단에 적용하였다. 가교된 펩티드의 풍부화 후에, 샘플을 고해상도 질량 분광측정법 (nLC-LTQ-오비트랩(Orbitrap) MS)에 의해 분석하고, 생성된 데이터를 엑스퀘스트(XQuest) 및 스타브록스(Stavrox) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
20 μL의 제조된 hTfR1 (서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 인간 TfR1의 세포외 도메인, 아미노산 C89-F760)/항-TfR 혼합물을 2 μL의 DSS d0/d12 (2mg/mL;DMF)와 혼합한 후에, 실온에서 180분 인큐베이션 시간을 가졌다. 인큐베이션 후, 1μL의 중탄산암모늄 (20 mM 최종 농도)을 첨가함으로써 반응을 정지시킨 후에, 실온에서 1시간 인큐베이션 시간을 가졌다. 이어서, 용액을 스피드백을 사용하여 건조시킨 후에, H2O 8M 우레아 현탁액 (20μL)을 첨가하였다. 혼합 후, 2 μl의 DTT (500 mM)를 용액에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 2 μl의 아이오도아세트아미드 (1M)를 첨가한 후에, 암실 내 실온에서 1시간 인큐베이션 시간을 가졌다. 인큐베이션 후, 80 μl의 단백질분해 완충제를 첨가하였다. 트립신 완충제는 50mM Ambic pH 8.5, 5% 아세토니트릴을 함유하고; 키모트립신 완충제는 트리스 HCl 100mM, CaCl2 10mM pH 7.8을 함유하고; ASP-N 완충제는 포스페이트 완충제 50MM pH 7.8을 함유하고; 엘라스타제 완충제는 트리스 HCl 50mM pH 8.0을 함유하고, 써모리신 완충제는 트리스 HCl 50mM, CaCl2 0.5mM pH 9.0을 함유한다.
100 μl의 환원된/알킬화된 hTfR1/항-TfR Fab 혼합물을 4 μl의 트립신 (프로메가)과 1/100 비로 혼합하였다. 단백질분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
100 μl의 환원된/알킬화된 hTfR1/항-TfR Fab 혼합물을 2 μl의 키모트립신 (프로메가)과 1/200 비로 혼합하였다. 단백질분해 혼합물을 25℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
100 μl의 환원된/알킬화된 hTfR1/항-TfR Fab 혼합물을 2 μl의 ASP-N (프로메가)과 1/200 비로 혼합하였다. 단백질분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
100 μl의 환원된/알킬화된 hTfR1/항-TfR Fab 혼합물을 4 μl의 엘라스타제 (프로메가)와 1/100 비로 혼합하였다. 단백질분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
100 μl의 환원된/알킬화된 hTfR1/항-TfR Fab 혼합물을 8 μl의 써모리신 (프로메가)과 1/50 비로 혼합하였다. 단백질분해 혼합물을 70℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 분해 후, 최종 1% 포름산을 용액에 첨가하였다.
샘플을 사용된 LTQ-오비트랩 질량 분광측정법과 조합된 nLC 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 가교된 펩티드를 엑스퀘스트 버전 2.0 및 스타브록스 3.6. 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. nLC-오비트랩 MS/MS 분석은 hTfr1과 항-TfR Fab 사이의 15개의 가교된 펩티드를 검출하였다. 분석은 이러한 상호작용이 hTfR1 상에 하기 아미노산: 서열식별번호: 105의 K261, S273, Y282, T362, S368, S370 및 K371을 포함한다는 것을 나타낸다.
실시예 7. 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3의 결합 활성의 특징화
인간 및 시노몰구스 원숭이 TfR1 결합에 대한 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3의 특이성을 시험하고 인간 TfR1 대 TfR2에 대한 그의 선택성을 확인하기 위해 시험관내 연구를 수행하였다. 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 다양한 종으로부터의 TfR1에 대한 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3의 결합 친화도를 결정하였다. 재조합 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스 또는 래트 TfR1로 사전코팅된 플레이트에 Fab의 연속 희석물을 첨가하였다. 짧은 인큐베이션 후에, 형광 태그부착된 항-(H+L) IgG 2차 항체의 첨가 및 495nm 여기 및 520nm 방출에서의 형광 강도의 측정에 의해 Fab의 결합을 정량화하였다. Fab는 인간 및 시노몰구스 원숭이 TfR1에 대한 강한 결합 친화도를 나타냈고, 마우스 또는 래트 TfR1의 검출가능한 결합은 관찰되지 않았다 (도 8). 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 측정을 또한 수행하였으며, 결과가 표 13에 제시된다. 인간 TfR1 수용체에 대한 Fab의 Kd는 7.68x10-10 M인 것으로 계산되었고, 시노몰구스 원숭이 TfR1 수용체에 대해서는 5.18x10-9 M인 것으로 계산되었다.
표 13. 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된, 인간 및 시노몰구스 원숭이 TfR1 또는 인간 TfR2에 대한 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3 결합의 동역학 분석
Figure pct00083
ND = SPR에 의한 검출가능한 결합 없음 (10pM - 100 uM)
인간 TfR2에 대한 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3의 교차-반응성을 시험하기 위해, ELISA를 수행하였다. 재조합 인간 TfR2 단백질을 2 μg/mL로 밤새 플레이팅하고, PBS 중 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 1시간 동안 차단하였다. 0.5% BSA/TBST 중 Fab 또는 양성 대조군 항-TfR2 항체의 연속 희석물을 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후에, 항-(H+L) IgG-A488 (인비트로젠 #MA5-25932) 형광 2차 항체를 0.5% BSA/TBST 중 1:500 희석물로 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 바이오텍 시너지(Biotek Synergy) 플레이트 판독기를 사용하여 495nm 여기 및 520nm 방출에서 상대 형광을 측정하였다. hTfR2에 대한 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3의 결합은 관찰되지 않았다 (도 9).
실시예 8. 항-TfR Fab-ASO 접합체의 혈청 안정성
항-TfR Fab VH4/Vk3을 화학식 (C)에 제시된 바와 같은 링커를 통해 대조군 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 접합시키고, 생성된 접합체를, Fab를 ASO에 접합시키는 링커의 안정성에 대해 시험하였다. PBS에서 또는 래트, 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간 혈청에서 형광 표지된 접합체를 인큐베이션하고 시간 경과에 따른 상대 형광 강도를 측정함으로써 혈청 안정성을 측정하였으며, 여기서 보다 높은 형광은 보다 많은 접합체가 무손상으로 남아있다는 것을 나타낸다. 도 10은 혈청 안정성이 다수의 종에 걸쳐 유사하였고, 72시간 후에 높게 유지되었다는 것을 보여준다.
실시예 9. 시노몰구스 원숭이에서의 생체내 항-TfR Fab-ASO 접합체의 엑손 스킵핑 활성
항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3을 DMD 엑손 51 내의 엑손 스플라이싱 인핸서 (ESE) 서열을 표적화하는 디스트로핀 (DMD) 엑손51-스킵핑 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 접합시켰다. 엑손51 스킵핑 올리고뉴클레오티드는 30개의 뉴클레오티드 길이의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이다. 접합체의 엑손 스킵핑 활성을 건강한 비-인간 영장류에서 생체내 시험하였다. 나이브 수컷 시노몰구스 원숭이 (군당 n= 4-5마리)에게 제1일 및 제8일에 2회 용량의 비히클, 30 mg/kg ASO 단독 또는 122 mg/kg 접합체 (30 mg/kg ASO 등가량)를 정맥내 주입을 통해 투여하였다. 동물을 희생시키고, 제1 용량을 투여한지 2주 또는 4주 후에 조직을 수거하였다. 프로메가 맥스웰(Promega Maxwell)® RSC 기기를 사용하여 조직 샘플로부터 총 RNA를 수집하고, q스크립트 cDNA 슈퍼믹스를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 종점 PCR을 사용하여 엑손 51 스킵핑의 평가를 수행하였다.
PCR 생성물의 모세관 전기영동을 사용하여 엑손 스킵핑을 평가하고, % 엑손 51 스킵핑을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00084
계산된 엑손 51 스킵핑 결과가 표 14에 제시된다.
표 14. 시노몰구스 원숭이 디스트로핀에서의 디스트로핀의 엑손 51 스킵핑
Figure pct00085
aASO = 안티센스 올리고뉴클레오티드.
b접합체 용량은 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3-ASO 접합체의 mg/kg으로서 열거된다.
cASO 용량은 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3-ASO 용량의 mg/kg ASO 등가량으로서 열거된다.
d엑손 스킵핑 값은 괄호 안의 표준 편차를 갖는 평균 % 엑손 51 스킵핑 (n=5)이다.
ASO 서열에 대해 상보적인 프로브에 의한 혼성화 ELISA를 사용하여 조직 ASO 축적을 또한 정량화하였다. 표준 곡선을 생성하고, 표준 곡선의 선형 회귀로부터 ASO 수준 (ng/g)을 유도하였다. ASO는 비접합된 ASO의 투여와 비교하여 항-TfR Fab VH4/Vk3-ASO 접합체의 투여 후에 더 높은 수준으로, 평가된 모든 조직에 분포되었다. 비접합된 ASO의 정맥내 투여는 제1 용량이 투여된지 2 및 4주 후에 평가된 모든 조직에서 배경 수준에 근접한 ASO의 수준을 유발하였다. 항-TfR Fab VH4/Vk3-ASO 접합체의 투여는 제1 투여 2주 후에 심장>횡격막>이두근>사두근>비복근>전경골근의 순위 순서로, 평가된 조직을 통한 ASO의 분포를 유발하였다. 조직 농도의 지속기간을 또한 평가하였다. 사두근, 이두근 및 횡격막에서의 ASO의 농도는 평가된 기간 (2 내지 4주)에 걸쳐 50% 미만만큼 감소한 반면, 심장, 전경골근 및 비복근에서의 ASO의 수준은 실질적으로 변하지 않고 유지되었다 (표 15).
이 실시예에 사용된 용어 '비접합된'은 올리고뉴클레오티드가 항체에 접합되지 않았다는 것을 나타낸다.
표 15. 시노몰구스 원숭이에서의 DMD 엑손51 스킵핑 ASO의 조직 분포
Figure pct00086
aASO = 안티센스 올리고뉴클레오티드.
b접합체 용량은 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3 ASO 접합체의 mg/kg으로서 열거된다.
cASO 용량은 항-TfR Fab 3M12 VH4/Vk3-ASO 접합체 용량의 mg/kg ASO 또는 ASO 등가량으로서 열거된다.
dASO 값은 괄호 안의 표준 편차를 갖는 ng/g으로서의 조직 내 ASO의 평균 농도 (n=5)이다.
추가의 실시양태
1. 하기를 포함하는, 인간 트랜스페린 수용체 (TfR)에 결합하는 인간화 항체:
(i) 서열식별번호: 69에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(ii) 서열식별번호: 71에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(iii) 서열식별번호: 72에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(iv) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(v) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(vi) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(vii) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(viii) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(ix) 서열식별번호: 79에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
(x) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
2. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
3. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
4. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
5. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
6. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
7. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
8. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
9. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
10. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
11. 실시양태 1에 있어서, 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체.
12. 실시양태 1-11 중 어느 하나에 있어서, 전장 IgG, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된 인간화 항체.
13. 실시양태 12에 있어서, 전장 IgG인 인간화 항체.
14. 실시양태 13에 있어서, 이소형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함하는 인간화 항체.
15. 실시양태 13 또는 실시양태 14에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 항체:
(i) 서열식별번호: 84에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ii) 서열식별번호: 86에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iii) 서열식별번호: 87에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iv) 서열식별번호: 88에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(v) 서열식별번호: 88에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vi) 서열식별번호: 91에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vii) 서열식별번호: 91에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(viii) 서열식별번호: 92에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 93에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ix) 서열식별번호: 94에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(x) 서열식별번호: 92에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
16. 실시양태 12에 있어서, Fab 단편인 인간화 항체.
17. 실시양태 16에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 항체:
(i) 서열식별번호: 97에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ii) 서열식별번호: 98에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iii) 서열식별번호: 99에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iv) 서열식별번호: 100에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(v) 서열식별번호: 100에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vi) 서열식별번호: 101에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vii) 서열식별번호: 101에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(viii) 서열식별번호: 102에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 93에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ix) 서열식별번호: 103에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(x) 서열식별번호: 102에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
18. 실시양태 17에 있어서, 하기를 포함하는 인간화 항체:
(i) 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ii) 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iii) 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iv) 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(v) 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vi) 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(vii) 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(viii) 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ix) 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(x) 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 트랜스페린 수용체에 대한 항체의 결합의 평형 해리 상수 (KD)가 10-11 M 내지 10-6 M의 범위인 인간화 항체.
20. 실시양태 1-19 중 어느 하나에 있어서, 트랜스페린 수용체의 트랜스페린 결합 부위에 특이적으로 결합하지 않고/거나 트랜스페린 수용체에 대한 트랜스페린의 결합을 억제하지 않는 인간화 항체.
21. 실시양태 1-20 중 어느 하나에 있어서, 인간, 비-인간 영장류 및 설치류 트랜스페린 수용체 중 2종 이상의 세포외 에피토프와 교차-반응성인 인간화 항체.
22. 실시양태 1-21 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 핵산.
23. 실시양태 22의 핵산을 포함하는 벡터.
24. 실시양태 23의 벡터를 포함하는 세포.
25. 실시양태 24의 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 항-TfR 항체를 생산하는 방법.
26. 분자 페이로드에 공유 연결된 실시양태 1-21 중 어느 하나의 항체를 포함하는 복합체.
27. 실시양태 26에 있어서, 분자 페이로드가 진단제 또는 치료제인 복합체.
28. 실시양태 26에 있어서, 분자 페이로드가 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 소분자인 복합체.
29. 실시양태 26-28 중 어느 하나에 있어서, 항체 및 분자 페이로드가 링커를 통해 연결된 것인 복합체.
30. 실시양태 29에 있어서, 링커가 절단가능한 링커인 복합체.
31. 실시양태 30에 있어서, 링커가 발린-시트룰린 서열을 포함하는 것인 복합체.
32. 실시양태 1-21 중 어느 하나의 항체, 실시양태 22의 핵산, 실시양태 23의 벡터 또는 실시양태 26-31 중 어느 하나의 복합체를 포함하는 조성물.
33. 실시양태 32에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
34. 실시양태 1-21 중 어느 하나의 항체를 생물학적 샘플과 접촉시키고, 생물학적 샘플에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 트랜스페린 수용체를 검출하는 방법.
35. 실시양태 34에 있어서, 항체가 진단제에 공유 연결된 것인 방법.
36. 실시양태 35에 있어서, 생물학적 샘플이 트랜스페린 수용체와 연관된 질환을 갖는 것으로 의심되거나 또는 그의 위험이 있는 인간 대상체로부터 수득된 것인 방법.
37. 실시양태 36에 있어서, 접촉 단계가 대상체에게 유효량의 항-TfR 항체를 투여함으로써 수행되는 것인 방법.
38. 실시양태 26-31 중 어느 하나의 복합체를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 분자 페이로드를 전달하는 방법.
39. 실시양태 38에 있어서, 세포가 근육 세포인 방법.
40. 실시양태 38 또는 실시양태 39에 있어서, 세포가 시험관내 세포인 방법.
41. 실시양태 40에 있어서, 세포가 대상체 내의 세포인 방법.
42. 실시양태 41에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
43. 대상체에게 유효량의 실시양태 26-31 중 어느 하나의 복합체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 뇌 또는 근육에 분자 페이로드를 전달하는 방법.
44. 실시양태 43에 있어서, 투여가 정맥내 투여인 방법.
45. 대상체에게 유효량의 실시양태 26-31 중 어느 하나의 복합체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 분자 페이로드는 치료제인, 질환을 치료하는 방법.
46. 실시양태 45에 있어서, 질환이 신경계 질환이고, 분자 페이로드가 신경계 질환을 치료하기 위한 약물인 방법.
47. 실시양태 45에 있어서, 질환이 근육 질환이고, 분자 페이로드가 근육 질환을 치료하기 위한 약물인 방법.
48. 실시양태 47에 있어서, 근육 질환이 희귀 근육 질환 또는 근육 위축인 방법.
49. 하기를 포함하는, 인간 트랜스페린 수용체 (TfR)에 결합하는 항체:
(i) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(ii) 서열식별번호: 69에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(iii) 서열식별번호: 71에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(iv) 서열식별번호: 72에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(v) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(vi) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(vii) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(viii) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(ix) 서열식별번호: 79에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
(x) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
50. 번역후 변형으로부터 생성된 피로글루타메이트 형성을 겪은, 인간 트랜스페린 수용체 (TfR)에 결합하는 항체.
등가물 및 용어
본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원의 각각의 예에서, 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진" 중 임의의 용어는 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되었으며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 제시 및 기재된 특색 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 본 개시내용의 범주 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 임의적인 특색, 변형 및 변경이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 간주된다고 이해될 것이다.
추가로, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 군의 면에서 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 마쿠쉬 군 또는 다른 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 면에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 서열 목록에 제시된 서열은 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산의 구조를 기재하는 데 언급될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 이러한 실시양태에서, 실제 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산은 명시된 서열과 본질적으로 동일하거나 유사한 상보적 특성을 보유하면서 명시된 서열과 비교하여 1개 이상의 대안적 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 뉴클레오티드의 RNA 대응부 또는 RNA 뉴클레오티드의 DNA 대응부) 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 다른 변형을 가질 수 있다.
본 발명을 기재하는 문맥에서 (특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석될 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함한" 및 "함유하는"은 달리 나타내지 않는 한 개방형 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지는 않음"을 의미함)로서 해석될 것이다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 본원에 달리 나타내지 않는 한, 단지 상기 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 제공되는 것으로 의도되고, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 어휘 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하는 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 부과하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 어휘도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변경은 상기 설명을 읽으면 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해질 수 있다.
본 발명자들은 통상의 기술자가 이러한 변경을 적절하게 사용할 것으로 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같은 본원에 첨부된 청구범위에 언급된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변경에서 상기 기재된 요소들의 임의의 조합은 본원에 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 본 발명에 의해 포괄된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 상용에 지나지 않는 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.
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Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Tyr Pro Tyr His Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr 225 <210> 104 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 104 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 105 <211> 760 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 105 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe 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Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu 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Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asp 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Val Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Thr Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Val Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Arg Asn Ala Glu Lys Arg Asp Lys Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg 705 710 715 720 Gln Asn Asn Ser Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 107 <211> 760 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 107 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Gly Val Asp Glu Glu Glu Asn Thr 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Gly Thr Lys Pro Lys Arg Cys Gly Gly 50 55 60 Asn Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Ile Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Ala Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Glu Glu Asp Phe Pro Ala Ala Pro Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Leu Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Gly 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Asp Ser Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Lys Ala Asp Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Gln Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Lys Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Asn Lys Ser Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Thr 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Ser Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asp 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Val Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Thr Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Val Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Arg Asn Ala Glu Lys Arg Asp Lys Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg 705 710 715 720 Gln Asn Asn Ser Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 108 <211> 763 <212> PRT <213> mus musculus <400> 108 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Ala Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Met Lys Ala Ser Val Arg Lys Pro Lys Arg Phe Asn Gly 50 55 60 Arg Leu Cys Phe Ala Ala Ile Ala Leu Val Ile Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ser Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Arg Val Glu Gln Lys Glu 85 90 95 Glu Cys Val Lys Leu Ala Glu Thr Glu Glu Thr Asp Lys Ser Glu Thr 100 105 110 Met Glu Thr Glu Asp Val Pro Thr Ser Ser Arg Leu Tyr Trp Ala Asp 115 120 125 Leu Lys Thr Leu Leu Ser Glu Lys Leu Asn Ser Ile Glu Phe Ala Asp 130 135 140 Thr Ile Lys Gln Leu Ser Gln Asn Thr Tyr Thr Pro Arg Glu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Gln Lys Asp Glu Ser Leu Ala Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Phe His 165 170 175 Glu Phe Lys Phe Ser Lys Val Trp Arg Asp Glu His Tyr Val Lys Ile 180 185 190 Gln Val Lys Ser Ser Ile Gly Gln Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser 195 200 205 Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val Glu Ser Pro Glu Gly Tyr Val Ala Phe 210 215 220 Ser Lys Pro Thr Glu Val Ser Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly 225 230 235 240 Thr Lys Lys Asp Phe Glu Glu Leu Ser Tyr Ser Val Asn Gly Ser Leu 245 250 255 Val Ile Val Arg Ala Gly Glu Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn 260 265 270 Ala Gln Ser Phe Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Lys Asn 275 280 285 Lys Phe Pro Val Val Glu Ala Asp Leu Ala Leu Phe Gly His Ala His 290 295 300 Leu Gly Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His 305 310 315 320 Thr Gln Phe Pro Pro Ser Gln Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val 325 330 335 Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Lys Met Glu 340 345 350 Gly Ser Cys Pro Ala Arg Trp Asn Ile Asp Ser Ser Cys Lys Leu Glu 355 360 365 Leu Ser Gln Asn Gln Asn Val Lys Leu Ile Val Lys Asn Val Leu Lys 370 375 380 Glu Arg Arg Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Tyr Glu Glu 385 390 395 400 Pro Asp Arg Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Leu Gly Ala 405 410 415 Gly Val Ala Ala Lys Ser Ser Val Gly Thr Gly Leu Leu Leu Lys Leu 420 425 430 Ala Gln Val Phe Ser Asp Met Ile Ser Lys Asp Gly Phe Arg Pro Ser 435 440 445 Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser Trp Thr Ala Gly Asp Phe Gly Ala Val 450 455 460 Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys 465 470 475 480 Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Val Val Leu Gly Thr Ser Asn 485 490 495 Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Met Gly Lys Ile 500 505 510 Met Gln Asp Val Lys His Pro Val Asp Gly Lys Ser Leu Tyr Arg Asp 515 520 525 Ser Asn Trp Ile Ser Lys Val Glu Lys Leu Ser Phe Asp Asn Ala Ala 530 535 540 Tyr Pro Phe Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe 545 550 555 560 Cys Glu Asp Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Arg Leu Asp Thr Tyr 565 570 575 Glu Ala Leu Thr Gln Lys Val Pro Gln Leu Asn Gln Met Val Arg Thr 580 585 590 Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln Leu Ile Ile Lys Leu Thr His Asp Val 595 600 605 Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu Met Tyr Asn Ser Lys Leu Leu Ser Phe 610 615 620 Met Lys Asp Leu Asn Gln Phe Lys Thr Asp Ile Arg Asp Met Gly Leu 625 630 635 640 Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Tyr Phe Arg Ala Thr 645 650 655 Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe His Asn Ala Glu Lys Thr Asn Arg Phe 660 665 670 Val Met Arg Glu Ile Asn Asp Arg Ile Met Lys Val Glu Tyr His Phe 675 680 685 Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro Arg Glu Ser Pro Phe Arg His Ile Phe 690 695 700 Trp Gly Ser Gly Ser His Thr Leu Ser Ala Leu Val Glu Asn Leu Lys 705 710 715 720 Leu Arg Gln Lys Asn Ile Thr Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn 725 730 735 Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Val Ala Asn Ala Leu 740 745 750 Ser Gly Asp Ile Trp Asn Ile Asp Asn Glu Phe 755 760

Claims (27)

  1. 하기를 포함하는, 인간 트랜스페린 수용체 (TfR)에 결합하는 항체:
    (i) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (ii) 서열식별번호: 69에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (iii) 서열식별번호: 71에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (iv) 서열식별번호: 72에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (v) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (vi) 서열식별번호: 73에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 75에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (vii) 서열식별번호: 76에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 74에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (viii) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
    (ix) 서열식별번호: 79에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는
    (x) 서열식별번호: 77에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 80에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
  2. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
    (i) 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (ii) 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (iii) 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (iv) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (v) 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (vi) 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (vii) 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (viii) 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (ix) 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (x) 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv 및 전장 IgG로 이루어진 군으로부터 선택된 항체.
  4. 제3항에 있어서, Fab 단편인 항체.
  5. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
    (i) 서열식별번호: 101에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (ii) 서열식별번호: 97에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (iii) 서열식별번호: 98에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (iv) 서열식별번호: 99에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 85에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (v) 서열식별번호: 100에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (vi) 서열식별번호: 100에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 90에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (vii) 서열식별번호: 101에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 89에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (viii) 서열식별번호: 102에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 93에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (ix) 서열식별번호: 103에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (x) 서열식별번호: 102에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열식별번호: 95에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  6. 제5항에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
    (i) 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (ii) 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (iii) 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (iv) 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (v) 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (vi) 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (vii) 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (viii) 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (ix) 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (x) 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스페린 수용체에 대한 항체의 결합의 평형 해리 상수 (KD)가 10-11 M 내지 10-6 M의 범위인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스페린 수용체의 트랜스페린 결합 부위에 특이적으로 결합하지 않고/거나 트랜스페린 수용체에 대한 트랜스페린의 결합을 억제하지 않는 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 비-인간 영장류 및 설치류 트랜스페린 수용체 중 2종 이상의 세포외 에피토프와 교차-반응성인 항체.
  10. 분자 페이로드에 공유 연결된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 분자 페이로드가 진단제 또는 치료제인 복합체.
  12. 제10항에 있어서, 분자 페이로드가 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 소분자인 복합체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 및 분자 페이로드가 링커를 통해 연결된 것인 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 링커가 절단가능한 링커인 복합체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 링커가 발린-시트룰린 서열을 포함하는 것인 복합체.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 세포를 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제16항 또는 제17항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 분자 페이로드를 전달하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 근육 세포인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 세포가 시험관내 세포인 방법.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 세포가 대상체 내의 세포인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  23. 대상체에게 유효량의 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제16항 또는 제17항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 근육에 분자 페이로드를 전달하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 투여가 정맥내 투여인 방법.
  25. 대상체에게 유효량의 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제16항 또는 제17항의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 분자 페이로드는 치료제인, 질환을 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 질환이 근육 질환이고, 분자 페이로드가 근육 질환을 치료하기 위한 약물인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 근육 질환이 희귀 근육 질환 또는 근육 위축인 방법.
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