KR20230038465A - 2성분 바이러스 유사 입자를 조립하는 방법 - Google Patents

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스캇 알 셰퍼드
한스 알 리엔
로스 엠 테일러
찰스 리처드슨
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아이코사백스, 인크.
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Abstract

전단 응력을 최소화하는 조건하에서 성분 A(compA) 단백질을 성분 B(compB) 단백질을 포함하는 용액에 첨가하여 compA:compB 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법이 제공된다. (i) 제1 단백질을 포함하는 제1 유입 유체 스트림 및 제2 단백질을 포함하는 제2 유입 유체 스트림을 제공하고, (ii) 상기 제1 유입 유체 스트림을 상기 제2 유입 유체 스트림과 접촉시켜서 유출 스트림을 형성하고, 상기 유출 스트림에서 상기 제1 단백질과 제2 단백질의 혼합이 발생하도록 하여, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 단백질 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법이 제공된다. 미세유체 혼합기를 사용할 수 있다. 상기 방법은 1,000 kDa 막 또는 이의 균등물을 이용하여 용액을 여과함으로써 과량의 compA, 과량의 compB, 및/또는 다른 불순물로부터 compA:compB 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

Description

2성분 바이러스 유사 입자를 조립하는 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, 2020년 6월 9일에 출원된 미국 가출원 63/036,505호에 대한 우선권을 주장한다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되고, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 ICVX_009_01WO_ST25.txt이다. 그 텍스트 파일은 2021년 6월 9일에 생성된 838 KB이고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되어 있다.
발명의 분야
본 개시는 일반적으로 자기 조립 단백질 나노구조체에 관한 것으로, 특히 나노구조체 기반 백신을 비롯하여, 나노구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
배경
단백질 기반 바이러스 유사 입자(pbVLP)는 나노구조체라고도 알려져 있는 것으로, 단백질 또는 기타 거대 분자를 대칭적으로 제시하는 유용한 플랫폼을 제공한다. 이들 입자는 바이러스 캡시드 단백질(예: 외피가 없는 바이러스 유래) 또는 지질 포함(lipid-embedded) 단백질(예: 외피가 있는 바이러스로부터 추출되거나 지질과 혼합된 재조합 막 단백질을 사용하여 제조됨)로 부터 제조한 기존의 VLP와 구별될 수 있다. 후자의 경우는 일반적으로 정의된 대칭이 ?榴?. 전자의 경우는 일반적으로 바이러스 캡시드에 단백질을 부착하는 문제로 인해 단백질 디스플레이 능력에 한계가 있다.
일반적으로는 VLP 및 특히 pbVLP의 하나의 적용은 백신으로서의 적용이다. 연구 결과, pbVLP에서 디스플레이된 항원은 기존의 서브유닛 백신 및 비대칭 VLP보다 더욱 강력한 항체 반응을 유도한다는 것이 실험적으로 확인되었다.
문헌[Bale 등, Science 353:389-394 (2016)]에는 성분 A(compA) 및 성분 B(compB)로 지정된 단백질 성분으로부터 제조된 pbVLP 세트를 비롯한 다양한 2성분 정20면체 pbVLP가 개시되어 있다.
단백질 기반 바이러스 유사 입자를 발현, 정제 및 조립하는 방법에 대한 필요성이 당업계에 남아 있다. 본 개시는 이러한 필요를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 pbVLP를 조립하고 정제하는 방법에 관한 것이다.
본원에서는 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 성분 A(compA) 단백질을 성분 B(compB) 단백질을 포함하는 용액에 첨가하여 compA:compB 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, compA:compB 복합체는 정20면체 대칭을 갖는 복합체이다. 몇몇 구현예에서, compA:compB 복합체는 pbVLP이다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 전단 응력을 최소화하는 조건하에서, 항원성 단백질에 연결된 compA 단백질을 포함하는 융합 단백질을 성분 B(compB) 단백질을 포함하는 용액에 첨가하여 compA:compB 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 용액의 표면 아래의 compB 단백질에 compA 단백질을 첨가하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 기계적 혼합 없이 용액을 혼합하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 교반 막대(stir bar)가 없이 용액을 혼합하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 임펠러가 없이 없이 용액을 혼합하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 회전 교반(orbital agitation)을 사용하여 용액을 혼합하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 미세유체 혼합기(microfluidic mixer)를 사용하여 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 미세유체 혼합기는 Nanoassembler® Ignite™ 카트리지 또는 이의 임의의 균등물이다.
몇몇 구현예에서, 방법은 compB 단백질에 compA 단백질을 과량으로 첨가하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 compA 단백질을 compB 단백질에 첨가하는 것을 포함하며, compA 단백질의 몰 농도와 compB 단백질의 몰 농도는 실질적으로 동일하다.
몇몇 구현예에서, 방법은 실질적인 침전이 없이 compA와 compB의 혼합을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 compA 및 compB의 용액의 기계적 혼합에 비해 실질적인 침전이 없이 compA 및 compB의 혼합을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 방법은, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 적어도 약 40%인 양으로 compA:compB 복합체의 형성을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 방법은, 에를 들어, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 양으로 compA:compB 복합체의 형성을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 1,000 kDa 막 또는 이의 균등물을 이용하여 용액을 여과함으로써 과량의 compA, 과량의 compB, 및/또는 다른 불순물로부터 compA:compB 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 약 300 kDa 내지 3,000 kDa의 기공 크기(pore size)를 갖는 친수성 막을 이용하여 용액을 여과함으로써 과량의 compA, 과량의 compB, 및/또는 다른 불순물로부터 compA:compB 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 기공 크기는 약 800 kDa, 약 900 kDa, 약 1000 kDa, 약 1100 kDa, 약 1200 kDa, 약 1300 kDa, 약 1400 kDa, 또는 약 1500 kDa이다. 몇몇 구현예에서, 친수성 막은 PVD 셀룰로오스, 복합 재생 셀룰로오스(CRC), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 나일론 및 폴리에테르술폰으로부터 선택된 물질을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 1,000 kDa 막은 복합 재생 셀룰로오스(CRC) 막이다.
몇몇 구현예에서, 1,000 kDa 막은 Ultracel® 1000 kDa 막 또는 이의 균등물이다.
몇몇 구현예에서, 여과는 접선 흐름 여과(TFF)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 여과는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 약 80% 이상의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 여과는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 여과는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 약 90 내지 99%의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 소수성 막(예를 들어, Pellicon Biomax 1000 kDa), 부틸 대류 상호작용 매질(CIM) 컬럼, Captocore700 컬럼 또는 이의 균등물을 이용하여 용액을 정제하는 것을 포함하지 않는다.
몇몇 구현예에서, 방법은 연속적 또는 반-연속적 공정이다.
몇몇 구현예에서, compA 단백질은 첨가 단계 이전에 연속적으로 생성된다.
몇몇 구현예에서, compB 단백질은 하나 이상의 냉동 배치(batch)로서 제공된다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 (i) 제1 단백질을 포함하는 제1 유입(inlet) 유체 스트림 및 제2 단백질을 포함하는 제2 유입 유체 스트림을 제공하고, (ii) 제1 유입 유체 스트림을 제2 유입 유체 스트림과 접촉시켜서 유출 스트림(outlet stream)을 형성하고, 유출 스트림에서 제1 단백질과 제2 단백질의 혼합이 발생하도록 하여, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 단백질 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 (i) compA 단백질을 포함하는 제1 단백질을 포함하는 제1 유입 유체 스트림 및 compB 단백질을 포함하는 제2 단백질을 포함하는 제2 유입 유체 스트림을 제공하고, (ii) 제1 유입 유체 스트림을 제2 유입 유체 스트림과 접촉시켜서 유출 스트림을 형성하고, 유출 스트림에서 제1 단백질과 제2 단백질의 혼합이 발생하도록 하여, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 단백질 기반 (pbVLP) 복합체를 형성하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제1 유입 유체 스트림 및 제2 유입 유체 스트림은 3방향 구조(three-way configuration)에서 합류하여 유출 스트림을 형성하고, 선택적으로 3방향 구조는 T자형 또는 Y자형 구조이다. 몇몇 구현예에서, 제1 유입 유체 스트림 및 제2 유입 유체 스트림은 합류하여 유출 스트림을 형성하고, 유출 스트림은 정적 혼합기(예를 들어, 파이프 혼합기)를 통과하고, 유출 스트림이 정적 혼합기를 통과함에 따라 제1 단백질(예를 들어, compA ) 및 제2 단백질(예: compB)의 혼합이 발생함으로써, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 복합체(예: pbVLP 복합체)를 형성한다.
몇몇 구현예에서, 제1 유입 유체 스트림 및 제2 유입 유체 스트림은 미세유체 혼합기를 사용하여 합류하여 유출 스트림을 형성한다. 몇몇 구현예에서, 미세유체 혼합기는 Nanoassembler® Ignite™ 카트리지 또는 이의 임의의 균등물이다. 몇몇 구현예에서, 미세유체 혼합기는 제1 단백질과 제2 단백질의 혼합을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 수동식 혼합 구성요소를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 유출 스트림은 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도를 초과하는 몰 농도의 제1 단백질(예를 들어, compA)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 유출 스트림은 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도와 실질적으로 동일한 몰 농도의 제1 단백질(예를 들어, compA)을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)의 혼합은 제1 단백질, 제2 단백질, 복합체 또는 이들의 조합의 실질적인 침전이 없이 발생한다.
몇몇 구현예에서, 복합체는, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피로 측정한 것으로 총 단백질의 약 40% 이상의 양으로 형성된다. 몇몇 구현예에서, 방법은, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피로 측정한 것으로 총 단백질의 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 양으로 compA:compB 복합체의 형성을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 1,000 kDa 막 또는 이의 균등물로 용액을 여과함으로써 과량의 제2 단백질 및/또는 다른 불순물로부터 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 약 300 kDa 내지 3,000 kDa의 기공 크기를 갖는 친수성 막을 이용하여 용액을 여과함으로써 과량의 compA, 과량의 compB, 및/또는 다른 불순물로부터 compA:compB 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 기공 크기는 약 800 kDa, 약 900 kDa, 약 1000 kDa, 약 1100 kDa, 약 1200 kDa, 약 1300 kDa, 약 1400 kDa, 또는 약 1500 kDa이다. 몇몇 구현예에서, 친수성 막은 PVD 셀룰로오스, 합성 재생 셀룰로오스(CRC), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 나일론 및 폴리에테르술폰으로부터 선택된 물질을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 1,000 kDa 막은 복합 재생 셀룰로오스(CRC) 막이다.
몇몇 구현예에서, 1,000 kDa 막은 Ultracel® 1000 kDa 막 또는 이의 균등물이다.
몇몇 구현예에서, 여과는 접선 흐름 여과(TFF)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 여과는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 약 80% 이상의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 여과는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 여과는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 90 내지 99%의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 소수성 막(예를 들어, Pellicon Biomax 1000 kDa), 부틸 대류 상호작용 매질(CIM) 컬럼, Captocore700 컬럼, 또는 이의 균등물을 이용하여 용액을 정제하는 것을 포함하지 않는다.
몇몇 구현예에서, 상기 방법은 연속적 또는 반-연속적 공정이다.
몇몇 구현예에서, 제1 단백질은 첨가 단계 이전에 연속적으로 생산된다.
몇몇 구현예에서, 제2 단백질은 하나 이상의 냉동 배치로서 제공된다.
몇몇 구현예에서, 제1 성분은 본원에 기재된 성분 A(compA)이고/이거나 제1 성분은 본원에 기재된 성분 B(compB)이다. 몇몇 구현예에서, compA는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 29 내지 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, compB는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 28, 32-34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 및 58 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, compA 및 compB는 각각 하기 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다: (i) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2; (ii) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4; (iii) 각각 서열번호 3 및 서열번호 24; (iv) 각각 서열번호 23 및 서열번호 4; (v) 각각 서열번호 35 및 서열번호 36; (vi) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6; (vii) 각각 서열번호 5 및 서열번호 27; (viii) 각각 서열번호 5 및 서열번호 28; (ix) 각각 서열번호 25 및 서열번호 6; (x) 각각 서열번호 25 및 서열번호 27; (xi) 각각 서열번호 25 및 서열번호 28; (xii) 각각 서열번호 26 및 서열번호 6; (xiii) 각각 서열번호 26 및 서열번호 27; (xiv) 각각 서열번호 26 및 서열번호 28; (xv) 각각 서열번호 37 및 서열번호 38; (xvi) 각각 서열번호 7 및 서열번호 8; (xvii) 각각 서열번호 7 및 서열번호 32; (xviii) 각각 서열번호 7 및 서열번호 33; (xix) 각각 서열번호 7 및 서열번호 34; (xx) 각각 서열번호 29 및 서열번호 8; (xxi) 각각 서열번호 29 및 서열번호 32; (xxii) 각각 서열번호 29 및 서열번호 33; (xxiii) 각각 서열번호 29 및 서열번호 34; (xxiv) 각각 서열번호 30 및 서열번호 8; (xxv) 각각 서열번호 30 및 서열번호 32; (xxvi) 각각 서열번호 30 및 서열번호 33; (xxvii) 각각 서열번호 30 및 서열번호 34; (xxviii) 각각 서열번호 31 및 서열번호 8; (xxix) 각각 서열번호 31 및 서열번호 32; (xxx) 각각 서열번호 31 및 서열번호 33; (xxxi) 각각 서열번호 31 및 서열번호 34; (xxxii) 각각 서열번호 39 및 서열번호 40; (xxxiii) 각각 서열번호 9 및 서열번호 10; (xxxiv) 각각 서열번호 11 및 서열번호 12; (xxxv) 각각 서열번호 13 및 서열번호 14; (xxxvi) 각각 서열번호 15 및 서열번호 16; (xxxvii) 각각 서열번호 19 및 서열번호 20; (xxxviii) 각각 서열번호 21 및 서열번호 22; (xxxix) 각각 서열번호 23 및 서열번호 24; (xl) 각각 서열번호 41 및 서열번호 42; (xli) 각각 서열번호 43 및 서열번호 44; (xlii) 각각 서열번호 45 및 서열번호 46; (xliii) 각각 서열번호 47 및 서열번호 48; (xliv) 각각 서열번호 49 및 서열번호 50; (xlv) 각각 서열번호 51 및 서열번호 44; (xlvi) 각각 서열번호 53 및 서열번호 52; (xlvii) 각각 서열번호 55 및 서열번호 54; (xlviii) 각각 서열번호 57 및 서열번호 56; 및 (xlix) 각각 서열번호 59 및 서열번호 58.
몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 compA 단백질을 포함하고, compA 단백질은 항원성 단백질에 연결되어 있다. 몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 링커에 의해 항원성 단백질에 연결된 compA 단백질을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 HIV Env, RSV F, EBV gp350, CMV gB, CMV UL128, CMV UL130, CMV UL131A,CMV gH, CMV gL, Lyme OspA, Pertussis 독소, Dengue E, SARS S, MERS S, Zaire 에볼라바이러스 GP, Sudan 에볼라바이러스 GP, Marburg 바이러스 GP, Hanta 바이러스 Gn, Hanta 바이러스 Gc, HepB 표면 항원, Measles H, Zika 외피 도메인 III, Malaria CSP, Malaria Pfs25, Nipah 바이러스 F, Nipah 바이러스 G, Rotavirus VP4, Rotavirus VP8*, hMPV F, hMPV G, PV F, PV HN, MenB fHbp, MenB NadA, 코로나바이러스 S 단백질, 코로나바이러스 RBD, 및 MenB NHBA로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 파라믹소바이러스 및/또는 페뉴모바이러스 F 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 호흡기 합포체 바이러스(RSV) F 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 서열번호 64 내지 135 및 206 내지 209로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 서열번호 64 내지 136 및 206 내지 209로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 compA 단백질과 항원성 단백질 사이에 위치한 펩티드 링커를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 펩티드 링커는 Gly-Ser 링커이다. 몇몇 구현예에서, Gly-Ser 링커는 서열번호 213 내지 215로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, Gly-Ser 링커는 서열번호 213 내지 215로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다.
몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 61 및 167 내지 193로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 60, 137 내지 166 및 194 내지 199로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 200 내지 205로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 융합단백질을 성분 B(compB) 단백질을 포함하는 용액에 첨가하여 compA:compB 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법으로서, 융합 단백질은 항원성 단백질에 연결된 compA 단백질을 포함하고, 융합 단백질은 서열번호 137 내지 205로부터 선택된 폴리펩티드와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 정20면체 대칭을 갖는 복합체를 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 복합체를 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 복합체 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 복합체를 포함하는 백신을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 복합체, 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 본원에 기재된 백신을 대상체에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 질환 또는 장애는 바이러스 감염이다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 면역 반응의 생성을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 본원에 기재된 복합체, 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 본원에 기재된 백신을 대상체에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 복합체, 본원에 기재된 약학적 조성물, 또는 본원에 기재된 백신을 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 복합체, 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 본원에 기재된 백신을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 개시는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 본원에 기재된 복합체, 본원에 기재된 약학적 조성물 또는 본원에 기재된 백신을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면 및 구현예는 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1A는 본 개시에 따른 단백질 기반 바이러스 유사 입자(pbVLP)의 예시적인 구현예를 도시한다. pbVLP는 (i) 삼량체를 형성하는 본원에 기재된 성분 A(compA) 단백질에 융합된 항원; 및 (ii) 오량체를 형성하는 본원에 기재된 성분 B(compB) 단백질로 부터 형성된다. compA 및 compB 단백질을 조립하면 pbVLP이 형성된다.
도 1B는 VLP 및 VLP 성분의 추가의 예시적인 구현예를 도시한다(G 단백질은 도시하지 않음).
도 2는 compA 및 compB 단백질의 최근접 이웃 연결 트리(nearest-neighbor joining tree)를 보여준다.
도 3A는 적가(dropwise addition)에 사용되는 compA 함유 바늘 및 compB 함유 튜브의 구조를 나타낸다. 교반 막대를 사용하여 기계적 혼합을 수행했다.
도 3B는 적가에 의해 생성된 탁한 용액을 도시낸다. 화살표는 혼합물에서 단백질 침전물의 존재를 나타낸다.
도 4는 조립된 pbVLP의 HPLC 분석 결과를 도시한다. 피펫을 사용하여 compB 용액의 아래에 compA 용액을 첨가하고 회전 교반기(orbital shaker)를 사용하여 혼합함으로써 pbVLP를 제조하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 분석 결과, 고분자량(HMW) 응집체로 인한 작은 피크를 갖는 조립된 pbVLP의 존재, 조립되지 않은 CompA 단백질 및 불순물의 존재가 확인되었다.
도 5A 내지 도 5D는 접선 흐름 여과(TFF)에 의한 정제 전 또는 후의 조립된 pbVLP의 HPLC 분석 결과를 보여준다. 도 5A는 정제 전 미정제(crude) pbVLP 혼합물의 SEC-HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 5B 내지 도 5D는 TFF 후 pbVLP의 SEC-HPLC 분석 결과를 보여준다.
도 6은 Captocore700을 사용한 크로마토그래피 정제의 결과를 보여준다. VLP 집단의 SEC-HPLC 프로필이 유의적으로 변화했다.
도 7은 Pellicon Biomax 1000 kDa 막 및 Captocore 둘 모두가 순차적으로 사용된 크로마토그래피 정제 후의 조립된 pbVLP의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한다. "로딩 TFF"는 여과 전의 pbVLP 혼합물을 나타낸다. "TFF Ultracel 1000 kDa"는 TFF 이후의 pbVLP 혼합물을 나타내고, "Captocore 통과"는 TFF 이후 Captocore 이후의 pbVLP 혼합물을 나타낸다. 실험 결과는 멤브레인 및 Captocore 정제가 불필요함을 보여주었다. Captocore는 SEC-HPLC 프로필에 영향을 미쳤다(HMW 피크는 여과 후 VLP의 13.6% 및 Captocore 후 VLP의 20.4%이다). 하단 패널은 피크의 중첩(overlay)을 나타낸다.
도 8A는 피펫 또는 Ignite 미세유체 혼합 시스템을 사용하여 혼합을 수행하면서 인간 MPV 항원에 융합된 CompA 삼량체를 CompB 오량체에 첨가한 후에 조립된 pbVLP에 대한 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한다. 조립되지 않은 CompA-hMPV 삼량체(R1), 피펫에 의해 혼합된 CompA-hMPV/CompB(R2), 또는 2mL/분 또는 10mL/분(각각 R3 및 R4)의 유속을 사용하여 Ignite 미세유체 혼합 시스템에 의해 혼합된 CompA-hMPV/CompB의 분석 결과가 도시되어 있다.
도 8B는 피펫 또는 Ignite 미세유체 혼합 시스템을 사용하여 혼합을 수행하면서 인간 RSV 항원에 융합된 CompA의 삼량체를 CompB 펜타머에 첨가한 후에 조립된 pbVLP의 SEC-HPLC 분석 결과을 보여준다. 조립되지 않은 CompA-RSV 삼량체(R9), 피펫에 의해 혼합된 CompA-RSV/CompB(R10), 또는 2mL/분 또는 10mL/분(각각 R11 및 R12)의 유속을 사용하여 Ignite 미세유체 혼합 시스템에 의해 혼합된 CompA-RSV/CompB의 분석 결과가 도시되어 있다.
도 9A 및 도 9B는 피펫을 사용하여 혼합하면서 인간 RSV 항원(도 9A) 또는 인간 MPV 항원(도 9B)에 융합된 CompA의 삼량체를 CompB 펜타머에 첨가한 후에 조립된 pbVLP의 SEC-HPLC 분석 결과를 보여준다. AAV 캡시드를 함유하는 기준물, 단백질 표준 세트 또는 조립되지 않은 CompA와의 비교를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 성분 A(compA) 단백질을 성분 B(compB) 단백질의 용액에 연속적으로 첨가함으로써 2성분 단백질 기반 바이러스 유사 입자(bpVLP)를 제조하는 것을 입증한다. 유리하게는, 전단 응력을 최소화하는 조건(예를 들어, compB 용액의 표면에 첨가 및/또는 기계적 교반 없이 첨가) 하에서 compB에 천천히 첨가함으로써 compA 단백질을 compB 단백질과 혼합한다. compA:compB 조립체는 1000kDa 막 또는 균등물을 이용한 여과에 의해 과량의 compA로부터 정제될 수 있다. 선택적으로, 막은 재생 셀룰로스 막(예를 들어, Pellicon® Ultracel® 1000 kDa 멤브레인 또는 등가물)이다.
정의
도면 및 부록을 포함하여 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원, 도면 또는 부록이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로포함되도록 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.
용어 "바이러스-유사 입자" 또는 "VLP"는 바이러스와 유사하지만 바이러스 단백질 또는 당단백질의 항원 단백질 또는 이의 항원 단편을 디스플레이하는 비감염성인 분자 조립체를 의미한다. "단백질 기반 VLP"는 단백질 또는 당단백질로 부터 형성되고 다른 성분(예: 지질)이 실질적으로 없는 VLP를 의미한다. 단백질 기반 VLP는 번역 후 변형 및 화학적 변형을 포함할 수 있지만, 미셀(micellar) VLP 및 살아있는 바이러스 백신 제제 또는 살아있는 불활성화된 바이러스 제제로부터 바이러스 단백질을 추출함으로써 형성된 VLP와 구별되어야 한다. 용어 "설계된 VLP"는 전산(computational) 단백질 설계에 의해 생성된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 VLP를 의미한다. 예시적인 설계된 VLP는 도 1B에 도시된 나노구조체를 포함하는 VLP이다. 용어 "대칭적 VLP"는 도 1B에 도시된 바와 같이 대칭적 코어를 갖는 단백질 기반 VLP를 의미한다. 이에는 설계된 VLP가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 단백질 페리틴은 자연적으로 발생하는 페리틴 서열을 사용하여 대칭적 단백질-기반 VLP를 생성하는데 사용되어 왔다. 페리틴 기반 VLP는 바이러스 단백질을 페리틴 분자에 융합시키는 것 외에 페리틴으로부터 대칭 VLP를 형성하기 위해 단백질 공학이 필요하지 않다는 점에서 설계된 VLP와 구별된다. 단백질 설계 방법은 주형 구조체(예: 단백질 데이터 뱅크에 기탁된 구조체)에 기반하여 또는 새로이(de novo)(즉, 원하는 구조를 갖지만 자연 발생 단백질과 상동성이 거의 없는 새로운 단백질의 전산설계를 통해) 유사한 나노구조체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 1성분 및 2성분 나노구조체는 설계된 VLP의 코어로서 사용될 수 있다.
용어 "정20면체 입자"는 정20면체 대칭을 갖는 코어를 갖는 설계된 pbVLP를 의미한다(예를 들어, 하기 표 1에서 I53 및 I52로 표시된 입자). I53은 오량체 및 삼량체로 구성된 정20면체 입자를 의미한다. I52는 오량체와 이량체로 구성된 정20면체 입자를 의미한다. T33은 삼량체의 두 세트로 구성된 사면체 입자를 의미한다. T32는 삼량체와 이량체로 구성된 사면체 입자를 의미한다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 및 선택적으로 하나 이상의 번역후 변형(예를 들어, 글리코실화) 및/또는 다른 변형(형광 태그와 같은 마커 또는 보조제로 사용되는 폴리펩티드 부분의 접합을 포함하지만 이에 제한되지 않음)에 의해 서로 결합된 일련의 아미노산 잔기를 의미한다.
용어 "변이체"는 기준(reference) 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 갖지만 기준 단백질의 하나 이상의 특성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "기능적 변이체"는 기준 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 기능적 효과(들)를 나타내는 변이체를 의미한다. 예를 들어, 다량체화 도메인의 기능적 변이체는 기준 다량체화 도메인과 동일한 정도로 또는 유사한 정도로 다량체화를 촉진할 수 있고/있거나 기준 다량체화 도메인과 동일한 동족(cognate) 다량체화 도메인을 이용하여 다량체화할 수 있다.
용어 "단편"은 기준 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 N-말단 또는 C-말단 절단부(truncation)를 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "기능적 단편"은 단편의 기능적 변이체를 의미한다.
용어 "아미노산 치환"은 서열 내의 단일 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 아미노산 치환에 대한 표준 형태의 약어가 사용된다. 예를 들어, V94R은 기준 서열에서 발린(V)이 아르기닌(R)으로 치환된 것을 의미한다. 약어 Arg94는 기준 서열을 기준으로 94번째 잔기가 아르기닌(Arg)인 임의의 서열을 의미한다.
용어 "나선" 또는 "나선형"은 발생하는 것으로 알려져 있거나 발생할 것으로 예상되는 폴리펩티드의 α-나선형 2차 구조를 의미한다. 예를 들어, 전산 모델링의 결과 서열이 나선형 형태를 채택할 가능성이 있다고 암시되는 경우 그 서열은 나선형으로 기재될 수 있다.
용어 "성분"은 적절한 조건 하에서 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있는 단백질 또는 단백질 복합체(예를 들어, 다량체화 도메인을 포함하는 항원 또는 폴리펩티드)를 의미한다. "성분 A" 또는 "compA" 및 "성분 B" 또는 "compB"는 본원에 기재된 pbVLP를 형성하기 위해 모일 수 있는 2개의 단백질을 의미한다. CompA 및 compB는 pbVLP의 조립에 사용하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 이량체, 삼량체 또는 오량체 구조를 독립적으로 형성할 수 있다. 몇몇 구현예에서, compA는 항원에 연결되어 융합 단백질을 형성한다.
용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 동물 또는 인간의 생체내에서 사용하기에 생물학적 또는 약리학적으로 적합한 부형제를 의미하며, 동물, 특히 인간에게 사용을 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 나열된 부형제를 의미할 수 있다.
용어 "제조"는 적어도 25-mL, 50-mL, 1-L, 1,000-L, 50,000-L 또는 그 이상의 규모를 포함하는 임의의 규모에서 재조합 폴리펩티드 또는 바이러스-유사 입자를 생산하는 것을 의미한다.
용어 "배양" 및 "배양 배지"는 표준 세포 배양 및 재조합 단백질 발현 기법을 의미한다.
용어 "숙주 세포"는 재조합 폴리펩티드의 발현에 사용할 수 있는 임의의 세포를 의미한다.
용어 "혼합"은 용액이 혼합될 수 있도록 두 용액을 접촉시키는 것을 의미한다.
용어 "정제하다"는 조성물에 존재하는 다른 물질로부터 분자를 분리하는 것을 의미한다. 폴리펩티드는 친화성(예를 들어, 항체 또는 태그(예를 들어, His-태그 포획 수지를 사용)에 대한 친화성), 전하(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피), 크기(예를 들어, 예비 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피) 등에 의해 정제될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 약 100개 초과의 뉴클레오티드로 이루어진 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 따라서, 이 용어는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드를 포함하거나, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 단일 또는 이중 가닥 DNA의 약 5개 내지 약 100개 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 그러나, 본 개시의 목적상, 올리고뉴클레오티드의 길이에 대한 상한은 없다. 올리고뉴클레오티드는 "올리고머" 또는 "올리고(oligo)"로도 알려져 있으며, 유전자로부터 분리되거나 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 설명되는 구현예에 적용 가능한 경우, 단일 가닥(예: 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "동일성", "동일한" 및 "서열 동일성"은 서로 동일하고 서로 동일한 상대 위치에 있는 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 염기 또는 아미노산의 백분율을 의미한다. 이와 같이 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 또 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 특정 백분율의 서열 동일성을 갖는다. 서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열이 그에 시험 서열이 비교되는 기준 서열로 작용한다. 용어 "기준 서열"은 그에 시험 서열이 비교되는 분자를 의미한다.
퍼센트 서열 동일성의 비교 및 결정을 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리즘의 전산화된 실시(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, Brent 등, (2003) Current Protocols in Molecular Biology 참조), 문헌[Altschul 등, (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul 등, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0를 비롯하여 당업계에 알려져 있는 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 사용할 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정 또는 결정되는 방식, 예를 들어, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존하여, 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 또는, "약"은 최대 20%, 최대 10% 또는 최대 5%의 플러스 또는 마이너스 범위를 의미할 수 있다.
본원에서 언급된 모든 중량 백분율(즉, "중량%" 및 "wt%" 및 w/w)은 달리 나타내지 않는 한 약학적 조성물의 총 중량을 기준으로 측정된 값된다.
본원에서 사용되는 것으로 "실질적으로" 또는 "실질적인"은 작용, 특성, 물성, 상태, 구조, 항목 또는 결과의 완전하거나 거의 완전한 범위 또는 정도를 의미한다. 예를 들어 "실질적으로" 둘러싸인 물체는 물체가 완전히 둘러싸여 있거나 거의 완전히 둘러싸여 있음을 의미한다. 절대적 완전성으로부터 허용되는 정확한 편차 정도는 경우에 따라 특정 상황에 따라 달라질 수 있다. 그러나 일반적으로 완성의 근접성은 마치 절대적이고 총체적인 완성이 얻어지는 것과 같은 전체적인 결과를 가지게 될 것이다. "실질적으로"의 사용은 작용, 특성, 물성, 상태, 구조, 항목 또는 결과가 완전하거나 거의 완전하지 않음을 나타내는 부정적인 의미로 사용될 때에도 동일하게 적용된다. 예를 들어, 다른 활성제(active agent)가 "실질적으로 없는" 조성물은 다른 활성제가 완전히 결여되거나, 다른 활성제가 거의 완전히 결여되어 그 효과가 마치 다른 활성제가 완전히 결여된 것과 동일할 것이다. 즉, 성분 또는 구성요소 또는 다른 활성제가 "실질적으로 없는" 조성물은 그의 측정 가능한 효과가 없는 한 이러한 항목을 여전히 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변성"은 폴리펩티드가 모든 또는 실질적으로 모든 3차 구조를 잃도록 하거나, 잘못 접힌 단백질의 경우, 응집된 형태에서 가용성의 펼쳐진(unfolded) 형태로 전환되도록 하는 접혀진 폴리펩타이드 분자의 구조의 변화를 의미한다. 또한, 용어 "변성된"은 단백질의 고유한 3차원 구조가 파괴되는 조건 하에서 봉입체를 가용화한 후, 재조합 생산 과정의 생성물로서 수득되는 발현된 단백질의 생물학적으로 불활성인 형태를 의미한다.
용어 "리폴딩" 또는 "탈변성(renaturing")은 변성된 단백질이 본래의 형태 및 생물학적 활성을 회복하도록 하는 과정을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "회수"는 예를 들어 원심분리 및/또는 하나 이상의 세척 단계에 의해 제제 내의 다른 물질로부터 물질(예를 들어 봉입체 및/또는 관심 단백질)을 분리함으로써 물질을 얻는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "봉입체"는 형질전환된 숙주 세포의 세포질에 존재하는 재조합 단백질을 함유하는 불용성 응집체를 의미한다. 이들은 현미경 하에서 밝은 반점으로 나타나며 세포의 세포질로부터 봉입체의 분리를 통해 회복될 수 있다. 종래 기술에서, 봉입체는 일반적으로 고농도의 카오트로픽제(예: > 8 M 우레아 및/또는 > 3 M 구아니디늄), 강한 이온성 세제(예: N-라우로일사르코신), 및/또는 알칼리성 pH를 사용하여 가용화된다. 본 개시에 따르면, 보다 낮은 농도의 이들 작용제를 사용하여 온화하게 가용화할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "나노구조체"는 제1 성분 분자(예를 들어, compA) 및 제2 성분 분자(예를 들어, compB)를 조립된 구조체로 배향시키는 대칭적으로 반복되는 비천연 비공유 단백질-단백질 계면을 포함한다. 나노구조체로는 전달체(delivery vehicle)가 있으나 이에 제한되지 않는데, 나노구조체는 관심 분자를 캡슐화할 수 있고/있거나 제1 및/또는 제2 단백질은 관심 분자(진단제, 치료제, 영상화 및 기타 적용을 위한 검출가능한 분자 등)에 결합하도록 변형될 수 있기 때문이다. 본 개시의 나노구조체는 백신 설계, 치료제의 표적 전달 및 바이오에너지를 포함하는 여러 용도에 매우 적합하다.
본원에서 사용되는 용어 "가용화"는 생물학적 샘플의 세포를 파괴함으로써 생물학적 샘플 내에 포함된 단백질을 수성 용매와 같은 용매에 전달하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 "가용화" 또는 "가용화하다"는 "용해하다" 또는 "추출하다"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "가용화"는 예를 들어 봉입체를 용해함으로써 봉입체로부터 단백질를 방출하는 것을 의미한다.
하기의 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 구체적으로 또는 암시적으로 언급된 모든 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
구현예
제조 능력은 여러 요인에 의해 결정된다. 배치(batch)를 만들고 출하하는데 필요한 시간(실행 속도)은 이러한 요인 중 하나이다. 제조에 대한 지속적인 접근 방식은 배치 제조 및 출하 시간을 상당히 단축하여 주어진 시설 또는 신규 투자의 용량을 증가시킬 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 성분 유량은 성분의 적절한 첨가 순서 및 몰비를 유지하도록 조절될 수 있다. 본 개시의 방법에서, compA 단백질은 사전 제조된 compB와 혼합된다. compA 단백질은 compB 단백질보다 과량으로 제공될 수 있다. 선택적으로, compA 단백질은 이의 정제 공정의 마지막 단계에서 나올 때 compA 단백질이 compB 단백질에 첨가된다. 성분들의 혼합은 정적 혼합 구성요소 또는 등가물에 의해 수행될 수 있다. 경우에 따라 혼합된 성분은 연속 조립 반응으로부터 1000kDa 막 처리 장치(processing unit)에 직접 전달된다. 이 장치는 단일-패스(single-pass) 접선 흐름 여과(TFF) 모드에서 작동할 수 있다. 유리하게는, 상기 방법은 동결 보관을 위해 준비된 제형화된 약물 물질(DS)의 꾸준한 스트림을 산출한다. 이러한 접근법은 pbVLP 조립 전에 compA 공정에서 compA TFF 제형화 단계 및 여러 용기 및 보유 단계를 생략할 수 있다. 유리하게는, compA 배치 출하 및 관련 행위가 필요하지 않을 수 있다.
몇몇 구현예에서, compA는 연속 공정을 통해 제조될 수도 있다. 연속적인 compA 제조 및 조립 공정은 생물반응기 수확으로부터 완제품 pbVLP DS로 직접 진행되는 하나의 연속 공정으로 통합될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 하나의 통합된, compA 에서 DS로의 연속 공정 라인은 약 6개의 생물 반응기와 일치하는 크기를 갖는다. 생물반응기는 일련의 방식으로 수확될 것이다. 예를 들어, 하나의 생물반응기가 수확되고 3일 후(약 ~60시간 주기) 약물 물질이 제조된다.
백신접종은 박테리아, 바이러스 및 기생충을 포함한 다양한 감염체로 인한 감염의 중증도를 예방하거나 줄이기 위해 사용되는 치료 방법이다. 새로운 백신의 개발은 상업적 및 공중 보건에 중요한 영향을 미친다. 특히, 라임병, 백일해, 헤르페스 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 뉴모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 코로나바이러스 및 말라리아는 이에 대한 백신이 이미 존재하거나 개발 중이거나 바람직하게 되는 감염체이다.
서브유닛 백신은 분리된 항원, 일반적으로는 박테리아, 곤충 또는 포유류 세포 숙주에서 재조합적으로 발현되는 단백질로 만든 백신이다. 일반적으로, 서브유닛 백신의 항원성 성분은 감염 시 자연 면역 반응을 유도하는 것으로 관찰되는 감염체의 단백질 중에서 선택되지만, 몇몇의 경우에는 감염체의 다른 성분이 사용될 수 있다. 서브유닛 백신에 사용하기 위한 일반적인 항원은 바이러스의 표면 발현 외피 당단백질과 같이, 표적 감염체의 표면에서 발현되는 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 항원은 중화 항체에 대한 표적이다. 보다 바람직하게는, 항원은 항원에 대한 면역 반응이 감염체의 여러 변종에 대한 면역성을 커버하도록 광범위한 중화 항체에 대한 표적이다. 몇몇의 경우에는 서브유닛 백신에 N-연결 또는 O-연결된 글리칸도 항원의 에피토프에 기여함으로써 또는 입체 장애에 의해 항원의 특정 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하므로 백신 접종에서 중요할 수 있다. 백신 접종에 대한 반응으로 발생하는 면역 반응은 단백질 자체, 글리칸, 또는 단백질 및 연결된 글리칸 모두에 대해 직접적일 수 있다. 서브유닛 백신은 살아 있는 병원균이 포함되어 있지 않아 백신에 의한 환자 감염에 대한 염려가 없고, 표준 유전 공학 기법을 사용하여 설계될 수 있고, 다른 형태의 백신보다 더 균질하고, 잘 특성규명된 발현 시스템을 사용하여 표준화된 재조합 단백질 발현 생산 시스템에서 제조될 수 있는 것을 포함하는 다양한 이점이 있다. 몇몇의 경우에, 항원은 중화 항체 또는 광범위 중화 항체와 같은 바람직한 항체의 생성을 선호하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 특히, X선 결정 분석, 전자현미경 분석 또는 핵자기공명 실험으로 얻은 관심 항원에 대한 구조적 정보는 서브유닛 백신의 합리적인 설계를 가이드하는데 사용될 수 있다.
서브유닛 백신의 알려진 한계는 유도된 면역 반응이 때때로 전체 바이러스, 생백신 또는 약독화 생백신과 같은 다른 유형의 백신에 대한 면역 반응보다 약할 수 있다는 것이다. 설계된 및/또는 단백질 기반의 VLP 백신은 서브유닛 백신의 장점을 활용하는 동시에, 대칭적으로 정렬된 배열에서 항원의 다가 디스플레이(multivalent display)를 통해 백신-유도 면역 반응의 효능 및 폭을 증가시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 본 개시에서, 단백질 기반 VLP는 나노입자 백신과 구별되는데, 그 이유는 나노입자 백신이라는 용어가 단백질 기반 또는 당단백질 기반 백신(예를 들어, 미국 특허 9,441,019호 참조), 리포솜(예를 들어, 미국 특허 7,285,289호 참조), 계면활성제 미셀(예를 들어, 미국 특허 공개 2004/0038406 A1호 참조), 및 합성 생분해성 입자(예를 들어, 미국 특허 8,323,696호 참조)를 지칭하기 위해 당업계에서 사용되어 왔기 때문이다.
구현예의 비제한적인 예가 도 1A에 도시되어 있다. 도 1A는 선택적으로 숙주 세포(예를 들어, 293F 세포)에서 재조합적으로 발현되는 pbVLP의 성분 A(compA) 단백질, 및 숙주 세포(예를 들어, 대장균 세포)에서 재조합적으로 발현되는 성분 B(compB) 단백질 조립체에 유전적으로 융합된 단백질 항원을 도시하고 있다. 이들 두 성분은 정20면체 코어 주위에 단백질 항원의 20개 카피를 디스플레이하는 pbVLP로 자기 조립된다.
몇몇 구현예에서, compA는 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compA는 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compA는 오량체이다.
몇몇 구현예에서, compB는 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compA는 오량체이다.
몇몇 구현예에서, compA는 서열번호 13, 17 또는 41로부터 선택되는 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compA는 서열번호 5, 7, 9, 19, 21, 25, 26, 29, 30, 31, 37, 39, 43, 45, 47, 49 또는 51로부터 선택되는 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compA는 서열번호 3, 11, 15, 23, 또는 35로부터 선택된 오량체이다.
몇몇 구현예에서, compB는 서열번호 12, 16, 20 또는 22로부터 선택되는 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 서열번호 4, 18, 24, 34, 36, 42, 44, 46, 48 또는 50으로부터 선택되는 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 서열번호 2, 6, 8, 10, 14, 27, 28, 32, 33, 38 또는 40으로부터 선택되는 오량체이다.
몇몇 구현예에서, compA는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 29 내지 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, compB는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 28, 32 내지 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 및 58 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, compA 및 Comp B는 "I53" 아키텍처를 형성한다. I53 아키텍처는 문헌[Bale 등, Science 353:389-394 (2016)]에 기재된 바와 같이 5중 및 3중 정20면체 대칭 축을 따라 정렬된 12개의 오량체 빌딩 블록 및 20개의 삼량체 빌딩 블록의 조합이다. 몇몇 구현예에서, compA는 I53 오량체이다. 몇몇 구현예에서, compA는 I53 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 I53 오량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 I53 삼량체이다.
몇몇 구현예에서, compA 및 compB는 "I52" 아키텍처를 형성한다. I52 아키텍처는 그의 해당하는 정20면체 대칭 축을 따라 12개의 오량체 및 30개의 이량체로 구성된다. 몇몇 구현예에서, compA는 I52 오량체이다. 몇몇 구현예에서, compA는 I52 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 I52 오량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 I52 이량체이다.
몇몇 구현예에서, compA 및 compB는 "I32" 아키텍처를 형성한다. I32 아키텍처는 그의 해당하는 정20면체 대칭 축을 따라 각각 정렬된 20개의 삼량체 및 30개의 이량체의 조합이다. 몇몇 구현예에서, compA는 I32 삼량체이다. 몇몇 구현예에서,compA는 I32 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 I32 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compB는 I32 이량체이다.
몇몇 구현예에서, compA와 compB의 혼합물은 정20면체 나노구조체를 형성한다. 몇몇 구현예에서, compA 및 compB의 혼합물은 사면체 나노구조체를 형성한다. 몇몇 구현예에서, compA 및 compB의 혼합물은 팔면체 나노구조체를 형성한다.
몇몇 구현예에서, 소분자 약물(즉, 700 미만의 분자향을 갖는), 생물학적 약물(즉, 박테리아, 효모, 세포 또는 장기로부터 분리된 약물, 특히 재조합 폴리펩티드 포함) 또는 생합성 약물(예: 앱타머, 안티센스 핵산, siRNA, 재조합 핵산, 뉴클레오시드 유사체, 재조합 폴리펩티드, 폴리펩티드 약물, 항원 등)이 compA에 융합된다.
몇몇 구현예에서, 항원이 compA에 융합된다.
몇몇 구현예에서, compA 및 compB는 나노구조체를 형성한다.
몇몇 구현예에서, 나노구조체는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 29 내지 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 중 어느 하나로부터 선택되는 compA와, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 28, 32 내지 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 중 어느 하나로부터 선택되는 compB를 결합함으로써 형성된다.
몇몇 구현예에서, 나노구조체는 하기 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 compA 및 compB 폴리펩티드 서열로 구성된다:
(i) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2;
(ii) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4;
(iii) 각각 서열번호 3 및 서열번호 24;
(iv) 각각 서열번호 23 및 서열번호 4;
(v) 각각 서열번호 35 및 서열번호 36;
(vi) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6;
(vii) 각각 서열번호 5 및 서열번호 27;
(viii) 각각 서열번호 5 및 서열번호 28;
(ix) 각각 서열번호 25 및 서열번호 6;
(x) 각각 서열번호 25 및 서열번호 27;
(xi) 각각 서열번호 25 및 서열번호 28;
(xii) 각각 서열번호 26 및 서열번호 6;
(xiii) 각각 서열번호 26 및 서열번호 27;
(xiv) 각각 서열번호 26 및 서열번호 28;
(xv) 각각 서열번호 37 및 서열번호 38;
(xvi) 각각 서열번호 7 및 서열번호 8;
(xvii) 각각 서열번호 7 및 서열번호 32;
(xviii) 각각 서열번호 7 및 서열번호 33;
(xix) 각각 서열번호 7 및 서열번호 34;
(xx) 각각 서열번호 29 및 서열번호 8;
(xxi) 각각 서열번호 29 및 서열번호 32;
(xxii) 각각 서열번호 29 및 서열번호 33;
(xxiii) 각각 서열번호 29 및 서열번호 34;
(xxiv) 각각 서열번호 30 및 서열번호 8;
(xxv) 각각 서열번호 30 및 서열번호 32;
(xxvi) 각각 서열번호 30 및 서열번호 33;
(xxvii) 각각 서열번호 30 및 서열번호 34;
(xxviii) 각각 서열번호 31 및 서열번호 8;
(xxix) 각각 서열번호 31 및 서열번호 32;
(xxx) 각각 서열번호 31 및 서열번호 33;
(xxxi) 각각 서열번호 31 및 서열번호 34;
(xxxii) 각각 서열번호 39 및 서열번호 40;
(xxxiii) 각각 서열번호 9 및 서열번호 10;
(xxxiv) 각각 서열번호 11 및 서열번호 12;
(xxxv) 각각 서열번호 13 및 서열번호 14;
(xxxvi) 각각 서열번호 15 및 서열번호 16;
(xxxvii) 각각 서열번호 19 및 서열번호 20;
(xxxviii) 각각 서열번호 21 및 서열번호 22;
(xxxix) 각각 서열번호 23 및 서열번호 24;
(xl) 각각 서열번호 41 및 서열번호 42;
(xli) 각각 서열번호 43 및 서열번호 44;
(xlii) 각각 서열번호 45 및 서열번호 46;
(xliii) 각각 서열번호 47 및 서열번호 48;
(xliv) 각각 서열번호 49 및 서열번호 50;
(xlv) 각각 서열번호 51 및 서열번호 44;
(xlvi) 각각 서열번호 53 및 서열번호 52;
(xlvii) 각각 서열번호 55 및 서열번호 54;
(xlviii) 각각 서열번호 57 및 서열번호 56; 및
(xlix) 각각 서열번호 59 및 서열번호 58.
몇몇 구현예에서, compA는 나선형 연장부(helical extension)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 나선형 연장부는 compA의 N-말단에 위치한다. 몇몇 구현예에서, 나선형 연장부는 EKAAKAEEAARK(서열번호 62)이다.
몇몇 구현예에서, compB는 나선형 연장부를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 나선형 연장부는 compB의 N-말단에 위치한다. 몇몇 구현예에서, 나선형 연장부는 EKAAKAEEAARK(서열번호 62)이다.
몇몇 구현예에서, 나노구조체는 pbVLP이다. 몇몇 구현예에서, pbVLP는 백신이다.
본 발명의 다른 compA/compB 조립체가 도 1B에 도시되어 있다. 몇몇 구현예에서, pbVLP는 최대 8개의 삼량체; 8개의 삼량체 및 12개의 이량체; 6개의 사량체 및 12개의 이량체; 6개의 사량체 및 8개의 삼량체; 20개의 삼량체 및 30개의 이량체; 4개의 삼량체 및 6개의 이량체; 4개의 제1 삼량체 및 4개의 제2 이량체, 또는 8개의 삼량체; 12개의 오량체 및 20개의 삼량체; 또는 12개의 오량체 및 30개의 이량체; 또는 4개의 삼량체를 디스플레이하도록 조정된다. 몇몇의 경우, 대칭 축 중 하나는 항원 디스플레이에 사용되지 않으며, 따라서 몇몇 구현예에서, pbVLP는 최대 8개의 삼량체, 12개의 이량체; 6개의 사량체; 20개의 삼량체; 30개의 이량체; 4개의 삼량체; 6개의 이량체; 8개의 삼량체; 또는 12개의 오량체를 디스플레이하도록 조정된다. 몇몇의 경우에는, 단량체 항원이 디스플레이되고, 따라서 pbVLP는 최대 12, 24, 60 또는 70개의 단량체 항원을 디스플레이하도록 조정된다. 몇몇의 경우에, pbVLP는, pbVLP 코어의 동일한 폴리펩티드가 상이한 항원을 디스플레이하거나 항원을 디스플레이하지 않도록 혼합된 다수의 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 폴리펩티드의 비율에 따라, pbVLP는 몇몇의 경우에 1 내지 130개의 항원의 디스플레이(예를 들어, I52 입자에서)를 위해 조정되며, 여기서 디스플레이된 각각의 항원은 동일한 것이거나, 임의의 선택한 비율에 비례하여 혼합 집단의 상이한 구성원일 수 있다. 항원은 재조합 발현 시스템에서 동시 발현될 수 있고 정제 전에 자기 조립될 수 있다. 비제한적인 예시적인 pbVLP는 문헌[Bale 등, Science 353:389-94 (2016); Heinze 등, J. Phys. Chem B. 120:5945-5952 (2016); King 등, Nature 510:103-108 (2014); 및 King 등, Science 336:1171-71 (2012)]에 제공되어 있다.
본 개시의 compA 및 compB 단백질은 임의의 다양한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 미국 특허 공개 2015/0356240 A1호는 단백질 조립체를 설계하는 다양한 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 공개 2016/0122392 A1호 및 국제 특허 공개 WO 2014/124301 A1호에 기재된 바와 같이, 서열번호 1 내지 51의 분리된 폴리펩티드는 pbVLP, 예컨대 정20면체 입자를 형성하기 위해 쌍으로 자기 조립하는 능력을 가지도록 설계되었다. 그 설계는 pbVLP를 형성하기 위해 조립될 수 있는 폴리펩티드 쌍의 각 구성원에 대한 적합한 계면 잔기의 설계를 포함했다. 이렇게 형성된 pbVLP는 제1 조립체 및 제2 조립체를 pbVLP, 예를 들어 정20면체 대칭을 갖는 것으로 배향하는 대칭적으로 반복되는 비천연 비공유 폴리펩티드-폴리펩티드 계면을 포함한다. 따라서, 몇몇 구현예에서 compA 및 compB(즉, pbVLP의 코어의 2개의 폴리티이드)는 서열번호 1 내지 51로 구성된 군으로부터 선택된다. 각각의 경우에, 전장 단백질에 존재하지만 일반적으로 융합체을 만들기 위해 제거되는 N-말단 메티오닌 잔기는 서열에 포함되지 않는다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 추가의 잔기가 N-말단으로부터 결실되고/되거나 추가의 잔기가 N-말단에 추가된다(예를 들어, 나선형 연장부를 형성하기 위해). 도 2에 도시된 바와 같이. 아래에 개시된 서열은 관련된 단백질 서열의 여러 패밀리로 그룹화된다.
명칭 성분 다량체 아미노산 서열 확인된 계면 잔기
I53-34A
서열번호 1		 삼량체 EGMDPLAVLAESRLLPLLTVRGGEDLAGLATVLELMGVGALEITLRTEKGLEALKALRKSGLLLGAGTVRSPKEAEAALEAGAAFLVSPGLLEEVAALAQARGVPYLPGVLTPTEVERALALGLSALKFFPAEPFQGVRVLRAYAEVFPEVRFLPTGGIKEEHLPHYAALPNLLAVGGSWLLQGDLAAVMKKVKAAKALLSPQAPG I53-34A: 28,32,36,37,186,188,191,192,195
I53-34B
서열번호 2		 오량체 TKKVGIVDTTFARVDMAEAAIRTLKALSPNIKIIRKTVPGIKDLPVACKKLLEEEGCDIVMALGMPGKAEKDKVCAHEASLGLMLAQLMTNKHIIEVFVHEDEAKDDDELDILALVRAIEHAANVYYLLFKPEYLTRMAGKGLRQGREDAGPARE I53-34B: 19,20,23,24,27,109,113,116,117,120,124,148
I53-40A
서열번호 3		 오량체 TKKVGIVDTTFARVDMASAAILTLKMESPNIKIIRKTVPGIKDLPVACKKLLEEEGCDIVMALGMPGKAEKDKVCAHEASLGLMLAQLMTNKHIIEVFVHEDEAKDDAELKILAARRAIEHALNVYYLLFKPEYLTRMAGKGLRQGFEDAGPARE I53-40A: 20,23,24,27,28,109,112,113,116,120,124
I53-40B
서열번호 4		 삼량체 STINNQLKALKVIPVIAIDNAEDIIPLGKVLAENGLPAAEITFRSSAAVKAIMLLRSAQPEMLIGAGTILNGVQALAAKEAGATFVVSPGFNPNTVRACQIIGIDIVPGVNNPSTVEAALEMGLTTLKFFPAEASGGISMVKSLVGPYGDIRLMPTGGITPSNIDNYLAIPQVLACGGTWMVDKKLVTNGEWDEIARLTREIVEQVNP I53-40B: 47,51,54,58,74,102
I53-47A
서열번호 5		 삼량체 PIFTLNTNIKATDVPSDFLSLTSRLVGLILSKPGSYVAVHINTDQQLSFGGSTNPAAFGTLMSIGGIEPSKNRDHSAVLFDHLNAMLGIPKNRMYIHFVNLNGDDVGWNGTTF I53-47A: 22,25,29,72,79,86,87
I53-47B
서열번호 6		 오량체 NQHSHKDYETVRIAVVRARWHADIVDACVEAFEIAMAAIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVIDGMMNVQLSTGVPVLSAVLTPHRYRDSAEHHRFFAAHFAVKGVEAARACIEILAAREKIAA I53-47B: 28,31,35,36,39,131,132,135,139,146
I53-50A
서열번호 7		 삼량체 MEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE I53-50A: 25,29,33,54,57
I53-50B
서열번호 8		 오량체 NQHSHKDYETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAMADIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVIDGMMNVQLSTGVPVLSAVLTPHRYRDSDAHTLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA I53-50B: 24,28,36,124,125,127,128,129, 131,132,133,135,139
I53-51A
서열번호 9		 삼량체 FTKSGDDGNTNVINKRVGKDSPLVNFLGDLDELNSFIGFAISKIPWEDMKKDLERVQVELFEIGEDLSTQSSKKKIDESYVLWLLAATAIYRIESGPVKLFVIPGGSEEASVLHVTRSVARRVERNAVKYTKELPEINRMIIVYLNRLSSLLFAMALVANKRRNQSEKIYEIGKSW I53-51A: 80,83,86,87,88,90,91,94,166,172,176
I53-51B
서열번호 10		 오량체 NQHSHKDYETVRIAVVRARWHADIVDQCVRAFEEAMADAGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVIDGMMNVQLSTGVPVLSAVLTPHRYRSSREHHEFFREHFMVKGVEAAAACITILAAREKIAA I53-51B: 31,35,36,40,122,124,128,131,135,139,143,146,147
I52-03A
서열번호 11		 오량체 GHTKGPTPQQHDGSALRIGIVHARWNKTIIMPLLIGTIAKLLECGVKASNIVVQSVPGSWELPIAVQRLYSASQLQTPSSGPSLSAGDLLGSSTTDLTALPTTTASSTGPFDALIAIGVLIKGETMHFEYIADSVSHGLMRVQLDTGVPVIFGVLTVLTDDQAKARAGVIEGSHNHGEDWGLAAVEMGVRRRDWAAGKTE I52-03A: 28,32,36,39,44,49
I52-03B
서열번호 12		 이량체 YEVDHADVYDLFYLGRGKDYAAEASDIADLVRSRTPEASSLLDVACGTGTHLEHFTKEFGDTAGLELSEDMLTHARKRLPDATLHQGDMRDFQLGRKFSAVVSMFSSVGYLKTVAELGAAVASFAEHLEPGGVVVVEPWWFPETFADGWVSADVVRRDGRTVARVSHSVREGNATRMEVHFTVADPGKGVRHFSDVHLITLFHQREYEAAFMAAGLRVEYLEGGPSGRGLFVGVPA I52-03B: 94,115,116,206,213
I52-32A
서열번호 13		 이량체 GMKEKFVLIITHGDFGKGLLSGAEVIIGKQENVHTVGLNLGDNIEKVAKEVMRIIIAKLAEDKEIIIVVDLFGGSPFNIALEMMKTFDVKVITGINMPMLVELLTSINVYDTTELLENISKIGKDGIKVIEKSSLKM I52-32A: 47,49,53,54,57,58,61,83,87,88
I52-32B
서열번호 14		 오량체 KYDGSKLRIGILHARWNLEIIAALVAGAIKRLQEFGVKAENIIIETVPGSFELPYGSKLFVEKQKRLGKPLDAIIPIGVLIKGSTMHFEYICDSTTHQLMKLNFELGIPVIFGVLTCLTDEQAEARAGLIEGKMHNHGEDWGAAAVEMATKFN I52-32B: 19,20,23,30,40
I52-33A
서열번호 15		 오량체 AVKGLGEVDQKYDGSKLRIGILHARWNRKIILALVAGAVLRLLEFGVKAENIIIETVPGSFELPYGSKLFVEKQKRLGKPLDAIIPIGVLIKGSTMHFEYICDSTTHQLMKLNFELGIPVIFGVLTCLTDEQAEARAGLIEGKMHNHGEDWGAAAVEMATKFN I52-33A: 33,41,44,50
I52-33B
서열번호 16		 이량체 GANWYLDNESSRLSFTSTKNADIAEVHRFLVLHGKVDPKGLAEVEVETESISTGIPLRDMLLRVLVFQVSKFPVAQINAQLDMRPINNLAPGAQLELRLPLTVSLRGKSHSYNAELLATRLDERRFQVVTLEPLVIHAQDFDMVRAFNALRLVAGLSAVSLSVPVGAVLIFTAR I52-33B: 61,63,66,67,72,147,148,154,155
I32-06A
서열번호 17		 이량체 TDYIRDGSAIKALSFAIILAEADLRHIPQDLQRLAVRVIHACGMVDVANDLAFSEGAGKAGRNALLAGAPILCDARMVAEGITRSRLPADNRVIYTLSDPSVPELAKKIGNTRSAAALDLWLPHIEGSIVAIGNAPTALFRLFELLDAGAPKPALIIGMPVGFVGAAESKDELAANSRGVPYVIVRGRRGGSAMTAAAVNALASERE I32-06A: 9,12,13,14,20,30,33,34
I32-06B
서열번호 18		 삼량체 ITVFGLKSKLAPRREKLAEVIYSSLHLGLDIPKGKHAIRFLCLEKEDFYYPFDRSDDYTVIEINLMAGRSEETKMLLIFLLFIALERKLGIRAHDVEITIKEQPAHCWGFRGRTGDSARDLDYDIYV I32-06B: 24,71,73,76,77,80,81,84,85,88,114,118
I32-19A
서열번호 19		 삼량체 GSDLQKLQRFSTCDISDGLLNVYNIPTGGYFPNLTAISPPQNSSIVGTAYTVLFAPIDDPRPAVNYIDSVPPNSILVLALEPHLQSQFHPFIKITQAMYGGLMSTRAQYLKSNGTVVFGRIRDVDEHRTLNHPVFAYGVGSCAPKAVVKAVGTNVQLKILTSDGVTQTICPGDYIAGDNNGIVRIPVQETDISKLVTYIEKSIEVDRLVSEAIKNGLPAKAAQTARRMVLKDYI I32-19A: 208,213,218,222,225,226,229,233
I32-19B
서열번호 20		 이량체 SGMRVYLGADHAGYELKQAIIAFLKMTGHEPIDCGALRYDADDDYPAFCIAAATRTVADPGSLGIVLGGSGNGEQIAANKVPGARCALAWSVQTAALAREHNNAQLIGIGGRMHTLEEALRIVKAFVTTPWSKAQRHQRRIDILAEYERTHEAPPVPGAPA I32-19B: 20,23,24,27,117,118,122,125
I32-28A
서열번호 21		 삼량체 GDDARIAAIGDVDELNSQIGVLLAEPLPDDVRAALSAIQHDLFDLGGELCIPGHAAITEDHLLRLALWLVHYNGQLPPLEEFILPGGARGAALAHVCRTVCRRAERSIKALGASEPLNIAPAAYVNLLSDLLFVLARVLNRAAGGADVLWDRTRAH I32-28A: 60,61,64,67,68,71,110,120,123,124,128
I32-28B
서열번호 22		 이량체 ILSAEQSFTLRHPHGQAAALAFVREPAAALAGVQRLRGLDSDGEQVWGELLVRVPLLGEVDLPFRSEIVRTPQGAELRPLTLTGERAWVAVSGQATAAEGGEMAFAFQFQAHLATPEAEGEGGAAFEVMVQAAAGVTLLLVAMALPQGLAAGLPPA I32-28B: 35,36,54,122,129,137,140,141,144,148
I53-40A.1
서열번호 23		 오량체 TKKVGIVDTTFARVDMASAAILTLKMESPNIKIIRKTVPGIKDLPVACKKLLEEEGCDIVMALGMPGKKEKDKVCAHEASLGLMLAQLMTNKHIIEVFVHEDEAKDDAELKILAARRAIEHALNVYYLLFKPEYLTRMAGKGLRQGFEDAGPARE I53-40A: 20,23,24,27,28,109,112,113,116,120,124
I53-40B.1SEQ ID NO:24 삼량체 DDINNQLKRLKVIPVIAIDNAEDIIPLGKVLAENGLPAAEITFRSSAAVKAIMLLRSAQPEMLIGAGTILNGVQALAAKEAGADFVVSPGFNPNTVRACQIIGIDIVPGVNNPSTVEQALEMGLTTLKFFPAEASGGISMVKSLVGPYGDIRLMPTGGITPDNIDNYLAIPQVLACGGTWMVDKKLVRNGEWDEIARLTREIVEQVNP I53-40B: 47,51,54,58,74,102
I53-47A.1
서열번호 25		 삼량체 PIFTLNTNIKADDVPSDFLSLTSRLVGLILSKPGSYVAVHINTDQQLSFGGSTNPAAFGTLMSIGGIEPDKNRDHSAVLFDHLNAMLGIPKNRMYIHFVNLNGDDVGWNGTTF I53-47A: 22,25,29,72,79,86,87
I53-47A.1NegT2
서열번호 26		 삼량체 PIFTLNTNIKADDVPSDFLSLTSRLVGLILSEPGSYVAVHINTDQQLSFGGSTNPAAFGTLMSIGGIEPDKNEDHSAVLFDHLNAMLGIPKNRMYIHFVDLDGDDVGWNGTTF I53-47A: 22,25,29,72,79,86,87
I53-47B.1
서열번호 27		 오량체 NQHSHKDHETVRIAVVRARWHADIVDACVEAFEIAMAAIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVIDGMMNVQLDTGVPVLSAVLTPHRYRDSDEHHRFFAAHFAVKGVEAARACIEILNAREKIAA I53-47B: 28,31,35,36,39,131,132,135,139,146
I53-47B.1NegT2
서열번호 28		 오량체 NQHSHKDHETVRIAVVRARWHADIVDACVEAFEIAMAAIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVDGGIYDHEFVASAVIDGMMNVQLDTGVPVLSAVLTPHEYEDSDEDHEFFAAHFAVKGVEAARACIEILNAREKIAA I53-47B: 28,31,35,36,39,131,132,135,139,146
I53-50A.1
서열번호 29		 삼량체 EELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHDILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGDALVKGDPDEVREKAKKFVEKIRGCTE I53-50A: 25,29,33,54,57
I53-50A.1NegT2
서열번호 30		 삼량체 EELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHDILKLFPGEVVGPEFVEAMKGPFPNVKFVPTGGVDLDDVCEWFDAGVLAVGVGDALVEGDPDEVREDAKEFVEEIRGCTE I53-50A: 25,29,33,54,57
I53-50A.1PosT1
서열번호 31		 삼량체 EELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHDILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCKWFKAGVLAVGVGKALVKGKPDEVREKAKKFVKKIRGCTE I53-50A: 25,29,33,54,57
I53-50B.1
서열번호 32		 오량체 NQHSHKDHETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAMRDIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVIDGMMNVQLDTGVPVLSAVLTPHRYRDSDAHTLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA I53-50B: 24,28,36,124,125,127,128,129,131,132,133,135,139
I53-50B.1NegT2
서열번호 33		 오량체 NQHSHKDHETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAMRDIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVDGGIYDHEFVASAVIDGMMNVQLDTGVPVLSAVLTPHEYEDSDADTLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA I53-50B: 24,28,36,124,125,127,128,129,131,132,133,135,139
I53-50B.4PosT1
서열번호 34		 삼량체 NQHSHKDHETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAMRDIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVINGMMNVQLNTGVPVLSAVLTPHNYDKSKAHTLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA I53-50B: 24,28,36,124,125,127,128,129,131,132,133,135,139
I53-40A genus
서열번호 35		 오량체 TKKVGIVDTTFARVDMASAAILTLKMESPNIKIIRKTVPGIKDLPVACKKLLEEEGCDIVMALGMPGK(A/K)EKDKVCAHEASLGLMLAQLMTNKHIIEVFVHEDEAKDDAELKILAARRAIEHALNVYYLLFKPEYLTRMAGKGLRQGFEDAGPARE
I53-40B genus
서열번호 36		 삼량체 (S/D)(T/D)INNQLK(A/R)LKVIPVIAIDNAEDIIPLGKVLAENGLPAAEITFRSSAAVKAIMLLRSAQPEMLIGAGTILNGVQALAAKEAGA(T/D)FVVSPGFNPNTVRACQIIGIDIVPGVNNPSTVE(A/Q)ALEMGLTTLKFFPAEASGGISMVKSLVGPYGDIRLMPTGGITP(S/D)NIDNYLAIPQVLACGGTWMVDKKLV(T/R)NGEWDEIARLTREIVEQVNP
I53-47A genus
서열번호 37		 삼량체 PIFTLNTNIKA(T/D)DVPSDFLSLTSRLVGLILS(K/E)PGSYVAVHINTDQQLSFGGSTNPAAFGTLMSIGGIEP(S/D)KN(R/E)DHSAVLFDHLNAMLGIPKNRMYIHFV(N/D)L(N/D)GDDVGWNGTTF
I53-47B genusSEQ ID NO:38 오량체 NQHSHKD(Y/H)ETVRIAVVRARWHADIVDACVEAFEIAMAAIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVV(N/D)GGIY(R/D)HEFVASAVIDGMMNVQL(S/D)TGVPVLSAVLTPH(R/E)Y(R/E)DS(A/D)E(H/D)H(R/E)FFAAHFAVKGVEAARACIEIL(A/N)AREKIAA
I53-50A genus
서열번호 39		 삼량체 EELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGH(T/D)ILKLFPGEVVGP(Q/E)FV(K/E)AMKGPFPNVKFVPTGGV(N/D)LD(N/D)VC(E/K)WF(K/D)AGVLAVGVG(S/K/D)ALV(K/E)G(T/D/K)PDEVRE(K/D)AK(A/E/K)FV(E/K)(K/E)IRGCTE
I53-50B genus
서열번호 40		 오량체 NQHSHKD(Y/H)ETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAM(A/R)DIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVV(N/D)GGIY(R/D)HEFVASAVI(D/N)GMMNVQL(S/D/N)TGVPVLSAVLTPH(R/E/N)Y(R/D/E)(D/K)S(D/K)A(H/D)TLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA
T32-28A
서열번호 41		 이량체 GEVPIGDPKELNGMEIAAVYLQPIEMEPRGIDLAASLADIHLEADIHALKNNPNGFPEGFWMPYLTIAYALANADTGAIKTGTLMPMVADDGPHYGANIAMEKDKKGGFGVGTYALTFLISNPEKQGFGRHVDEETGVGKWFEPFVVTYFFKYTGTPK
T32-28B
서열번호 42		 삼량체 SQAIGILELTSIAKGMELGDAMLKSANVDLLVSKTISPGKFLLMLGGDIGAIQQAIETGTSQAGEMLVDSLVLANIHPSVLPAISGLNSVDKRQAVGIVETWSVAACISAADLAVKGSNVTLVRVHMAFGIGGKCYMVVAGDVLDVAAAVATASLAAGAKGLLVYASIIPRPHEAMWRQMVEG
T33-09A
서열번호 43		 삼량체 EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYRWQGSVVSDHELLLLVKTTTHAFPKLKERVKALHPYTVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG
T33-09B
서열번호 44		 삼량체 VRGIRGAITVEEDTPAAILAATIELLLKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARLIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLNEAVRLRPDLESAQ
T33-15A
서열번호 45		 삼량체 SKAKIGIVTVSDRASAGITADISGKAIILALNLYLTSEWEPIYQVIPDEQDVIETTLIKMADEQDCCLIVTTGGTGPAKRDVTPEATEAVCDRMMPGFGELMRAESLKEVPTAILSRQTAGLRGDSLIVNLPGDPASISDCLLAVFPAIPYCIDLMEGPYLECNEAMIKPFRPKAK
T33-15B
서열번호 46		 삼량체 VRGIRGAITVNSDTPTSIIIATILLLEKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARQIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLSEAVRLRPDLESAQ
T33-21A
서열번호 47		 삼량체 RITTKVGDKGSTRLFGGEEVWKDSPIIEANGTLDELTSFIGEAKHYVDEEMKGILEEIQNDIYKIMGEIGSKGKIEGISEERIAWLLKLILRYMEMVNLKSFVLPGGTLESAKLDVCRTIARRALRKVLTVTREFGIGAEAAAYLLALSDLLFLLARVIEIEKNKLKEVRS
T33-21BSEQ ID NO:48 삼량체 PHLVIEATANLRLETSPGELLEQANKALFASGQFGEADIKSRFVTLEAYRQGTAAVERAYLHACLSILDGRDIATRTLLGASLCAVLAEAVAGGGEEGVQVSVEVREMERLSYAKRVVARQR
T33-28A
서열번호 49		 삼량체 ESVNTSFLSPSLVTIRDFDNGQFAVLRIGRTGFPADKGDIDLCLDKMIGVRAAQIFLGDDTEDGFKGPHIRIRCVDIDDKHTYNAMVYVDLIVGTGASEVERETAEEEAKLALRVALQVDIADEHSCVTQFEMKLREELLSSDSFHPDKDEYYKDFL
T33-28B
서열번호 50		 삼량체 PVIQTFVSTPLDHHKRLLLAIIYRIVTRVVLGKPEDLVMMTFHDSTPMHFFGSTDPVACVRVEALGGYGPSEPEKVTSIVTAAITAVCGIVADRIFVLYFSPLHCGWNGTNF
T33-31A
서열번호 51		 삼량체 EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG
명칭 분자량 올리고머 분자량 등전점 소수성(%)("ILVMFW")
I53-34A 21427 64281 5.82 0.33
I53-34B 17083 85414 6.1 0.31
I53-40A 17091 85455 6.85 0.32
I53-40B 21789 65367 4.91 0.34
I53-47A 12191 36572 6.47 0.34
I53-47B 16956 84781 6.31 0.31
I53-50A 21783 65350 6.91 0.35
I53-50B 16839 84195 5.95 0.32
I53-51A 19967 59900 8.74 0.34
I53-51B 17178 85892 6.31 0.3
I52-03A 21026 105129 6.16 0.31
I52-03B 25875 51749 5.32 0.3
I52-32A 15015 30029 5.43 0.42
I52-32B 16877 84383 6.58 0.35
I52-33A 17914 89569 7.17 0.36
I52-33B 19215 38430 7.12 0.37
I32-06A 21632 43263 6.78 0.3
I32-06B 14736 44208 6.48 0.34
I32-19A 25405 76214 7.86 0.3
I32-19B 17186 34373 6.57 0.24
I32-28A 16648 49944 5.23 0.32
I32-28B 16173 32347 4.76 0.31
I53-40A.1 17148 85740 7.66 0.32
I53-40B.1 22070 66211 4.74 0.34
I53-47A.1 12233 36698 5.65 0.34
I53-47A.1NegT2 12209 36626 4.4 0.34
I53-47B.1 17045 85226 6.04 0.31
I53-47B.1NegT2 16902 84509 4.75 0.31
I53-50A.1 21765 65296 6.17 0.35
I53-50A.1NegT2 21746 65237 4.62 0.35
I53-50A.1PosT1 21790 65369 9.07 0.35
I53-50B.1 16926 84631 6.04 0.32
I53-50B.1NegT2 16810 84049 4.8 0.32
I53-50B.4PosT1 16867 50602 6.77 0.32
I53-40A genus 17091 85455 6.85 0.32
I53-40B genus 21789 65367 4.91 0.34
I53-47A genus 12191 36572 6.47 0.34
I53-47B genus 16956 84781 6.31 0.31
I53-50A genus 21652 64956 7.15 0.35
I53-50B genus 16839 84195 5.95 0.32
T32-28A 17168 34337 4.79 0.29
T32-28B 18711 56132 5.52 0.36
T33-09A 11321 33963 6.08 0.36
T33-09B 13279 39838 5.14 0.34
T33-15A 18902 56705 4.53 0.3
T33-15B 13298 39895 5.65 0.34
T33-21A 19158 57474 6.04 0.35
T33-21B 13128 39383 5.73 0.28
T33-28A 17637 52910 4.5 0.31
T33-28B 12302 36907 6.59 0.38
T33-31A 11329 33987 4.88 0.35
T33_dn2A 13632 40896 4.7 0.19
T33_dn2B 13687 41061 5.57 0.19
T33_dn5A 13528 40583 4.07 0.19
T33_dn5A 19741 59222 5.45 0.29
T33_dn10A 13883 41649 4.26 0.2
T33_dn10B 30222 90666 6.31 0.3
I53_dn5A 17004 85019 7.14 0.35
I53_dn5B 14138 70688 4.94 0.19
표 1 및 2는 본 발명의 구현예의 compA 및 compB의 아미노산 서열을 제공한다. 각각의 경우에, 서열 쌍은 함께 정20면체 대칭을 갖는 I53 다량체를 형성한다. 표 1의 오른쪽 열은 얻어지는 조립된 바이러스 유사 입자의 계면에 존재하는 것으로 확인된 각각의 예시적인 폴리펩티드의 잔기 번호(즉, "확인된 계면 잔기")를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 1 내지 34의 예시적인 폴리펩티드의 경우 계면 잔기의 수는 4 내지 13의 범위이다. 몇몇 구현예에서, compA 및 compB는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 계면 잔기를 갖는다. 다양한 구현예에서, compA 및 compBs는, 서열번호 1 내지 34로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 비교하여 그 길이에 걸쳐서 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 확인된 계면 위치(주어진 폴리펩티드에 대한 계면 잔기의 수에 따라)가 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 35 내지 51은 본 개시의 구현예의 compA 및 compB의 다른 아미노산 서열을 나타낸다. 다양한 구현예에서, compA 및/또는 compB는, 서열번호 1 내지 51로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 비교하여 그 길이에 걸쳐서 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 확인된 계면 잔기 위치와 적어도 20%, 25%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
표 2에 나타낸 바와 같이, compA 단백질과 compB 단백질은 유사한 분자량(MW), 등전점(pI) 및 소수성 잔기 백분율을 가지므로, 이들은 유사한 방법을 사용하여 발현 및 정제될 수 있음을 알 수 있다.
일반적으로 단백질의 경우와 마찬가지로, 폴리펩티드는 바이러스 유사 입자로의 후속 조립을 방해하지 않고 설계된 서열의 일부 변형을 허용할 것으로 예상되는데, 특히 이러한 변형이 보존적 아미노산 치환을 포함하는 경우에 그러하다. 본원에서 사용되는 "보존적 아미노산 치환"은 소수성 아미노산(Ala, Cys, Gly, Pro, Met, Val, Ile, Leu)이 다른 소수성 아미노산으로만 치환될 수 있는 것; 벌키한(bulky) 측쇄를 갖는 소수성 아미노산(Phe, Tyr, Trp)이 벌키한 측쇄를 갖는 다른 소수성 아미노산으로만 치환될 수 있는 것; 양전하 측쇄를 갖는 아미노산(Arg, His, Lys)이 양전하 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로만 치환될 수 있는 것; 음전하 측쇄를 갖는 아미노산(Asp, Glu)이 음전하 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로만 치환될 수 있는 것; 극성의 하전되지 않은 측쇄를 갖는 아미노산(Ser, Thr, Asn, Gln)이 극성의 하전되지 않은 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로만 치환될 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 pbVLP의 다양한 구현예에서, compA 및 compB 또는 그 반대의 순서는 하기의 쌍 또는 이의 변형된 버전(즉, 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 개시된 바와 같은 허용 가능한 변형: 서열번호로 나타낸 아미노산 서열과 비교하여, 그 길이에 걸쳐서 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100% 이상 동일하고/하거나 적어도 하나의 확인된 계면 잔기 위치가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드)을 포함한다:
서열번호 1 및 서열번호 2 (I53-34A 및 I53-34B);
서열번호 3 및 서열번호 4 (I53-40A 및 I53-40B);
서열번호 3 및 서열번호 24 (I53-40A 및 I53-40B.1);
서열번호 23 및 서열번호 4 (I53-40A.1 및 I53-40B);
서열번호 35 및 서열번호 36 (I53-40A genus 및 I53-40B genus);
서열번호 5 및 서열번호 6 (I53-47A 및 I53-47B);
서열번호 5 및 서열번호 27 (I53-47A 및 I53-47B.1);
서열번호 5 및 서열번호 28 (I53-47A 및 I53-47B.1NegT2);
서열번호 25 및 서열번호 6 (I53-47A.1 및 I53-47B);
서열번호 25 및 서열번호 27 (I53-47A.1 및 I53-47B.1);
서열번호 25 및 서열번호 28 (I53-47A.1 및 I53-47B.1NegT2);
서열번호 26 및 서열번호 6 (I53-47A.1NegT2 및 I53-47B);
서열번호 26 및 서열번호 27 (I53-47A.1NegT2 및 I53-47B.1);
서열번호 26 및 서열번호 28 (I53-47A.1NegT2 및 I53-47B.1NegT2);
서열번호 37 및 서열번호 38 (I53-47A genus 및 I53-47B genus);
서열번호 7 및 서열번호 8 (I53-50A 및 I53-50B);
서열번호 7 및 서열번호 32 (I53-50A 및 I53-50B.1);
서열번호 7 및 서열번호 33 (I53-50A 및 I53-50B.1NegT2);
서열번호 7 및 서열번호 34 (I53-50A 및 I53-50B.4PosT1);
서열번호 29 및 서열번호 8 (I53-50A.1 및 I53-50B);
서열번호 29 및 서열번호 32 (I53-50A.1 및 I53-50B.1);
서열번호 29 및 서열번호 33 (I53-50A.1 및 I53-50B.1NegT2);
서열번호 29 및 서열번호 34 (I53-50A.1 및 I53-50B.4PosT1);
서열번호 30 및 서열번호 8 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B);
서열번호 30 및 서열번호 32 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B.1);
서열번호 30 및 서열번호 33 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B.1NegT2);
서열번호 30 및 서열번호 34 (I53-50A.1NegT2 및 I53-50B.4PosT1);
서열번호 31 및 서열번호 8 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B);
서열번호 31 및 서열번호 32 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B.1);
서열번호 31 및 서열번호 33 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B.1NegT2);
서열번호 31 및 서열번호 34 (I53-50A.1PosT1 및 I53-50B.4PosT1);
서열번호 39 및 서열번호 40 (I53-50A genus 및 I53-50B genus);
서열번호 9 및 서열번호 10 (I53-51A 및 I53-51B);
서열번호 11 및 서열번호 12 (I52-03A 및 I52-03B);
서열번호 13 및 서열번호 14 (I52-32A 및 I52-32B);
서열번호 15 및 서열번호 16 (I52-33A 및 I52-33B)
서열번호 17 및 서열번호 18 (I32-06A 및 I32-06B);
서열번호 19 및 서열번호 20 (I32-19A 및 I32-19B);
서열번호 21 및 서열번호 22 (I32-28A 및 I32-28B);
서열번호 23 및 서열번호 24 (I53-40A.1 및 I53-40B.1);
서열번호 41 및 서열번호 42 (T32-28A 및 T32-28B);
서열번호 43 및 서열번호 44 (T33-09A 및 T33-09B);
서열번호 45 및 서열번호 46 (T33-15A 및 T33-15B);
서열번호 47 및 서열번호 48 (T33-21A 및 T33-21B);
서열번호 49 및 서열번호 50 (T33-28A 및 T32-28B); 및
서열번호 51 및 서열번호 서열번호 44 (T33-31A 및 T33-09B(T33-31B라고도 나타냄)). 여기서, "A"로 끝나는 것은 compA이고 "B"로 끝나는 것은 compB이다(예를 들어, I53-34A는 compA이고 I53-34B는 compB이다).
본 개시의 단백질 기반 VLP에 유용한 설계된 단백질 복합체의 비제한적 예로는 그 각각의 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 9,630,994호, 국제 특허 공개 WO2018187325A1호, 미국 특허 공개 2018/0137234 A1호, 미국 특허 공개 2019/0155988 A2호에 기재된 것들이 있다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 (i) 항원 단백질 또는 이의 항원 단편에 연결된 compA 및 (ii) 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 compB의 융합 단백질을 포함하는 pbVLP를 제공한다. 용어 "항원 단편"은 생체내에서 단백질에 대한 면역 반응(체액 또는 T 세포 반응)을 생성하는 단백질의 임의의 단편을 의미한다. 항원 단편은 선형 에피토프, 불연속 에피토프 또는 구조적(conformation) 에피토프(예: 접힌 도메인)일 수 있다. 항원 단편은 전장 단백질의 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 보존할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 항원 단편은 중화 에피토프를 포함한다. 이러한 경우, VLP는 중화 항체 반응을 발생할 수 있다. 항원 단편은, 예를 들어, 2차 구조를 예측하고 N- 또는 C-말단의 구조화되지 않은 영역 또는 내부 루프 또는 전체 구조적 요소(알파 나선 및/또는 베타 시트)를 합리적으로 제거함으로써 컴퓨터로 설계될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 항원 단편은 HIV Env, RSV F, EBV gp350, CMV gB, CMV UL128, CMV UL130, CMV UL131A,CMV gH, CMV gL, Lyme OspA, Pertussis 독소, Dengue E, SARS S, MERS S, Zaire 에볼라바이러스 GP, Sudan 에볼라바이러스 GP, Marburg 바이러스 GP, Hanta 바이러스 Gn, Hanta 바이러스 Gc, HepB 표면 항원, Measles H, Zika 외피 도메인 III, Malaria CSP, Malaria Pfs25, Nipah 바이러스 F, Nipah 바이러스 G, Rotavirus VP4, Rotavirus VP8*, hMPV F, hMPV G, PV F, PV HN, MenB fHbp, MenB NadA, 코로나바이러스 S 단백질, 코로나바이러스 RBD, 및 MenB NHBA로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 파라믹소바이러스 및/또는 뉴모바이러스 F 단백질, 또는 이의 항원성 단편이다. 예시적인 파라믹소바이러스 및/또는 뉴모바이러스로는 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 및 인간 메타뉴모바이러스(hMPV)가 있으나 이에 제한되지 않는다. (C. L. Afonso et al., Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Arch. Virol. 161, 2351-2360 (2016)).
몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 서열번호 64 내지 136 및 206 내지 209로부터 선택된 아미노산 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 항원성 단백질은 가공 동안 절단되는 신호 펩티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 210 내지 212에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 compA 단백질과 항원성 단백질 사이에 위치하는 링커를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 compA 단백질과 항원성 단백질 사이에 위치하는 아미노산 링커를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 아미노산 링커는 임의의 적합한 길이의 Gly-Ser 링커(즉, 글리신 및 세린 잔기로 이루어진 링커)이다. 몇몇 구현예에서, Gly-Ser 링커는 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산이다. 몇몇 구현예에서, Gly-Ser 링커는 서열번호 213 내지 215로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 61 및 167 내지 193으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 137 내지 166 및 194 내지 199으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 200 내지 205로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
하기 표 3은 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 또는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)로부터 유래된 항원성 단백질에 연결된 CompA 성분을 포함하는 융합 단백질에 대한 예시적인 서열을 제공한다.
Figure pct00001
본 개시의 pbVLP의 다양한 구현예에서, compA 및 compB 단백질은 하기 쌍 또는 이의 변형된 버전(즉, 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 개시된 허용 가능한 변형: 서열번호로 나타낸 아미노산 서열과 비교하여, 그 길이에 걸쳐서 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100% 이상 동일하고/하거나 적어도 하나의 확인된 계면 잔기 위치가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드)으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다:
서열번호 52 및 서열번호 53 (T33_dn2A 및 T33_dn2B);
서열번호 54 및 서열번호 55 (T33_dn5A 및 T33_dn5B);
서열번호 56 및 서열번호 57 (T33_dn10A 및 T33_dn10B); 또는
서열번호 58 및 서열번호 59 (I53_dn5A 및 I53_dn5B).
여기서, "dn5B"로 끝나는 것은 compA이고 "dn5A"로 끝나는 것은 compB이다(예를 들어, I53_dn5B는 compA이고 dn5A는 compB이다).
T33_dn2A(서열번호 52)
NLAEKMYKAGNAMYRKGQYTIAIIAYTLALLKDPNNAEAWYNLGNAAYKKGEYDEAIEAYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYKKALRLDPRNVDAIENLIEAEEKQG
T33_dn2B(서열번호 53)
EEAELAYLLGELAYKLGEYRIAIRAYRIALKRDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYREAIRYYLRALKLDPENAEAWYNLGNALYKQGKYDLAIIAYQAALEEDPNNAEAKQNLGNAKQKQG
T33_dn5A(서열번호 54)
NSAEAMYKMGNAAYKQGDYILAIIAYLLALEKDPNNAEAWYNLGNAAYKQGDYDEAIEYYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYEKALELDPNNAEALKNLLEAIAEQD
T33_dn5B(서열번호 55)
TDPLAVILYIAILKAEKSIARAKAAEALGKIGDERAVEPLIKALKDEDALVRAAAADALGQIGDERAVEPLIKALKDEEGLVRASAAIALGQIGDERAVQPLIKALTDERDLVRVAAAVALGRIGDEKAVRPLIIVLKDEEGEVREAAAIALGSIGGERVRAAMEKLAERGTGFARKVAVNYLETHK
T33_dn10A(서열번호 56)
EEAELAYLLGELAYKLGEYRIAIRAYRIALKRDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYEKALELDPENLEALQNLLNAMDKQG
T33_dn10B(서열번호 57)
IEEVVAEMIDILAESSKKSIEELARAADNKTTEKAVAEAIEEIARLATAAIQLIEALAKNLASEEFMARAISAIAELAKKAIEAIYRLADNHTTDTFMARAIAAIANLAVTAILAIAALASNHTTEEFMARAISAIAELAKKAIEAIYRLADNHTTDKFMAAAIEAIALLATLAILAIALLASNHTTEKFMARAIMAIAILAAKAIEAIYRLADNHTSPTYIEKAIEAIEKIARKAIKAIEMLAKNITTEEYKEKAKKIIDIIRKLAKMAIKKLEDNRT
I53_dn5A(서열번호 58)
KYDGSKLRIGILHARWNAEIILALVLGALKRLQEFGVKRENIIIETVPGSFELPYGSKLFVEKQKRLGKPLDAIIPIGVLIKGSTMHFEYICDSTTHQLMKLNFELGIPVIFGVLTCLTDEQAEARAGLIEGKMHNHGEDWGAAAVEMATKFN
I53_dn5B(서열번호 59)
EEAELAYLLGELAYKLGEYRIAIRAYRIALKRDPNNAEAWYNLGNAYYKQGRYREAIEYYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYERGEYEEAIEYYRKALRLDPNNADAMQNLLNAKMREE
pbVLP의 조립
몇몇 구현예에서, 단일 성분은 pbVLP로 자기 조립된다. 몇몇 구현예에서, 단일 성분은 compA이다. 몇몇 구현예에서, pbVLP를 형성하는데 사용하기 위한 제1 및 제2 성분 중 하나 이상의 정제된 샘플은 수성 조건에서 대략 등몰비로 혼합된다(예를 들어, I53-50A/B 20면체 pbVLP). 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 성분은 각각 compA 및 compB이다. 제1 및 제2 성분(다량체화 도메인을 통해 그리고 선택적으로 엑토도메인을 통해)는 서로 상호작용하여 표적 pbVLP의 조립을 유도한다. 표적 pbVLP의 성공적인 조립은, 크기 배제 크로마토그래피, 고유(비변성) 겔 전기영동, 동적 광산란, 다각도 광산란, 분석용 초원심분리, 음성 염색 전자 현미경 분석, 저온 전자 현미경 분석 또는 X선 결정 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는, 단백질 또는 단백질 조립체의 물리적 크기를 평가하기 위해 사용되는 일반적인 생화학적 또는 생물물리학적 방법을 통해 시험관내 조립 반응을 분석함으로써 확인할 수 있다. 필요한 경우, 조립된 pbVLP는, 크기 배제 크로마토그래피, 분취(preparative) 초원심분리, 접선 흐름 여과 또는 분취 겔 전기영동을 포함하나 이에 제한되지 않는, 물리적 크기에 따라 단백질을 분리하는데 일반적으로 사용되는 분취 기법을 사용하여 시험관내 조립 반응에 존재하는 다른 종 또는 분자로부터 정제될 수 있다. pbVLP에서 항원성 단백질의 존재 여부는 SDS-PAGE, 질량 분석법, 단백질 시퀀싱, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭법 또는 아미노산 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는, 수용액에서 단백질 분자의 정체를 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 기법에 의해 평가될 수 있다. 입자의 외부에 있는 단백질의 접근성 및 그의 형태 또는 항원성은 단클론 항체에 의한 결합, 형태 특이적 단클론 항체, 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭법 또는 항원에 특이적인 항혈청을 포함하나 이에 제한되지 않는, 항원의 존재 및 형태를 검출하는데 일반적으로 사용되는 기법에 의해 평가될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 개시의 pbVLP는 유전적 융합체로서 상이한 항원성 단백질을 보유하는 2개 이상의 별개의 compA를 포함하고; 이러한 pbVLP는 동일한 pbVLP에서 여러 상이한 단백질을 동시에 디스플레이한다. 이들 다중-항원 pbVLP는 다량체화 도메인을 각각 포함하는 2개 이상의 항원의 혼합물을 이용하여 시험관내 조립을 수행함으로써 생성된다. 혼합물에서 각 항원의 분율은 생성된 pbVLP에서 각 항원 단백질의 평균 원자가(valency)를 결정한다. 주어진 샘플에서 각각의 항원의 존재 및 평균 원자가는 전체 원자가(full-valency) pbVLP에서 항원 단백질의 존재를 평가하기 위해 위에서 설명한 기법을 이용한 정량 분석에 의해 평가될 수 있다.
다양한 구현예에서, pbVLP는 직경이 약 20나노미터(nm) 내지 약 40nm이고, 내부 루멘은 가로가 약 15nm 내지 약 32nm 사이이고, 단백질 껍질의 기공 크기는 가장 긴 치수가 약 1nm 내지 약 14nm 이다.
몇몇 구현예에서, pbVLP는 정20면체 대칭을 갖는다. 이러한 구현예에서, pbVLP는 제1 성분의 60개 카피 및 제2 성분의 60개 카피를 포함할 수 있다. 하나의 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체에서 동일한 compA의 수는 각각의 제2 조립체에서의 동일한 compA의 수와 상이하다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, pbVLP는 12개의 제1 조립체 및 20개의 제2 조립체를 포함하고; 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체는 예를 들어 동일한 제1 성분의 5개의 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 조립체는 예를 들어 동일한 제2 성분의 3개의 카피를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, pbVLP는 12개의 제1 조립체 및 30개의 제2 조립체를 포함하고; 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체는 예를 들어 동일한 제1 성분의 5개의 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 조립체는 예를 들어 동일한 제2 성분의 2개의 카피를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, pbVLP는 20개의 제1 조립체 및 30개의 제2 조립체를 포함하고; 이러한 구현예에서, 각각의 제1 조립체는 예를 들어 동일한 제1 성분의 3개의 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 조립체는 예를 들어 동일한 제2 성분의 2개의 카피를 포함할 수 있다. 이들 구현예 모두는 정20면체 대칭을 갖는 단백질 기반 pbVLP를 형성할 수 있다.
다양한 추가의 구현예에서, 제1 및 제2 다량체화 도메인의 올리고머 상태는 다음과 같다:
I53-34A: 삼량체 + I53-34B: 오량체;
I53-40A: 오량체 + I53-40B: 삼량체;
I53-47A: 삼량체 + I53-47B: 오량체;
I53-50A: 삼량체 + I53-50B: 오량체;
I53-51A: 삼량체 + I53-51B: 오량체;
I32-06A: 이량체 + I32-06B: 삼량체;
I32-19A: 삼량체 + I32-19B: 이량체;
I32-28A: 삼량체 + I32-28B: 이량체;
I52-03A: 오량체 + I52-03B: 이량체;
I52-32A: 이량체 + I52-32B: 오량체; 및
I52-33A: 오량체 + I52-33B: 이량체.
나노구조체의 제조 방법
본 개시는 단백질 나노구조체의 형성을 제공하는 조건하에서 하나 이상의 단백질(예를 들어, compA 및/또는 compB)을 결합하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 제2 단백질(예를 들어, compB)을 포함하는 용액에 제1 단백질(예를 들어, compA)을 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 첨가는 제1 및 제2 단백질의 부분적으로 또는 실질적으로 균질한 용액, 즉 용액 전체에 걸쳐 물리적 조성이 일관되거나 균일한 용액을 제공하고, 제1 단백질과 제2 단백질이 모여 나노구조체를 형성한다. 예를 들어 혼합 블레이드, 교반 막대 또는 임펠러를 사용한 기계적 혼합은 종종 혼합 가능한 액체를 혼합하는데 사용된다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, 기계적 혼합을 사용하여 compB의 용액에 compA를 첨가하면 compA 및/또는 compB의 침전으로 인해 상당한 탁도를 갖는 pbVLP의 조성물이 얻어지는 것으로 확인되었다. 대조적으로, 최소화된 전단 응력으로 compA 및 compB의 블렌딩을 유도하는 조건하에서 compB의 용액에 compA를 첨가하면(예를 들어, compB 용액의 표면 아래에 및/또는 추가로 기계적 교반 없이 compA를 첨가하면) compA 및/또는 compB의 침전이 최소화 또는 제한되면서 pbVLP가 형성된 것으로 확인되었다. 또한, compA를 포함하는 용액과 compB를 포함하는 용액의 강력하고 균질하고 신속한 액-액 혼합이 미세유체 혼합을 사용하여 달성됨으로써 compA 및 compB를 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)의 형성이 가능하다는 것이 입증되었다.
따라서, 본 개시는 (i) 제2 단백질(예를 들어, compB)을 포함하는 용액에 제1 단백질(예를 들어, compA)을 첨가하고, (ii) 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 제1 단백질과 제2 단백질을 혼합함으로써 단백질 나노구조체(예: pbVLP)를 형성하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 혼합 방법은 예를 들어, 블레이드, 교반 막대 또는 임펠러를 사용하는 기계적 혼합과 비교하여 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 혼화성 액체(예를 들어, 저점도 액체)를 블렌딩, 혼합 또는 결합하기에 적합한 것으로 당업계에 알려진 임의의 방법이다. 본원에 기재된 것으로 "전단 응력"은 예를 들어 교반되는 유동 용기 내의 유체 전체에 걸친 속도의 차이를 의미하며, 여기서 유체 내의 속도 차이가 클수록 전단 응력의 정도는 크다. 유체에서 전단 응력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 레이저 도플러 유속계(laser doppler velocimetry)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은, 예를 들어 블레이드, 교반 막대 또는 임펠러를 사용하는 기계적 혼합에 의해 제1 및 제2 단백질을 혼합하는 것과 비교하여 혼탁도가 감소된 단백질 나노구조체(예를 들어, pbVLP)의 현탁액을 제공한다. 광학 측정 또는 광학 산란 측정을 사용하여 탁도를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 예를 들어 블레이드, 교반 막대 또는 임펠러를 사용하는 기계적 혼합과 비교하여 나노구조체, 제1 단백질(예를 들어, compA) 및/또는 제2 단백질(예를 들어, compB)의 침전이 감소된 단백질 나노구조체(예를 들어, pbVLP)의 형성을 결과한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 제2 단백질(예를 들어, compB)을 포함하는 용액에 제1 단백질(예를 들어, compA)을 첨가한 후 기계적 혼합하는 것과 비교하여 감소된 전단 응력을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 기계적 혼합 없이 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 교반 막대 없이 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건은 임펠러 없이 혼합하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은 회전 교반을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 단백질을 포함하는 용액은 회전 교반 플랫폼을 사용한 회전 교반에 의해 움직이는 용기에 함유된다. 몇몇 구현예에서, 회전 교반에 의해 유도된 움직임은 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)의 충분한 벌크 혼합을 제공하여 제1 단백질 및 제2 단백질의 부분적으로 또는 실질적으로 균질한 혼합물을 형성함으로써, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)의 형성을 가능하게 한다. 몇몇 구현예에서, 수용 용기(vessel)는 약 100mL(예를 들어, 250mL, 500mL, 750mL)를 초과하는 작업 부피를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 수용 용기는 약 1L, 10L, 50L, 100L, 250L, 500L, 750L 또는 1000L를 초과하는 작업 부피를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 회전 교반은 주위 온도(예를 들어, 약 20 내지 25℃)에서 수행된다. 몇몇 구현예에서, 회전 교반은 상승된 온도(예를 들어, 약 30 내지 37℃)에서 수행된다. 몇몇 구현예에서, 회전 교반의 속도는 은 혼합의 전단 응력을 최소화하도록 선택된다. 몇몇 구현예에서, 수용 용기는 약 30 내지 100rpm의 속도로 교반된다. 몇몇 구현예에서, 수용 용기는 약 70rpm의 속도로 교반된다. 몇몇 구현예에서, 수용 용기는 약 80rpm의 속도로 교반된다. 몇몇 구현예에서, 수용 용기는 약 90rpm의 속도로 교반된다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은 (i) 제1 유입 유체 스트림, (ii) 제2 유입 유체 스트림, 및 (iii) 유출 스트림을 제공하는 것을 포함하고, 여기서 (i), (ii) 및 (iii)은 3방향 구조(예: T자형 구조, Y자형 구조)에서 분기점(branch point)에서 합류되고, (i)의 유체 스트림과 (ii)의 유체 스트림은 서로 접촉하여 (iii)의 유출 스트림을 형성한다. 몇몇 구현예에서, 제1 유입 유체 스트림은 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액을 포함하고, 제2 유입 유체 스트림은 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질과 제2 단백질의 혼합, 블렌딩 또는 결합은 유출 스트림에서 발생한다. 몇몇 구현예에서, 혼합, 블렌딩 또는 결합은 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)의 형성을 결과한다.
몇몇 구현예에서, 유출 스트림에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)의 혼합, 블렌딩 또는 결합은 정적 혼합 요소에 의해 매개된다. "정적 혼합 구성요소" 또는 "정적 혼합기"는 움직이는 부분을 사용하지 않고 흐름 스트림이 층들을 분할하거나, 재결합하거나, 가속/감속하거나, 확산하거나, 소용돌이치게 하거나 또는 층을 형성하도록 함으로써 혼합을 촉진할 목적으로 흐름 경로에 삽입된 장치를 의미한다. 정적 혼합 장치는 당업계에 알려져 있으며, 일반적으로 흐름을 유도하고 흐름 스트림의 난류를 증가시키기 위해 정확한 각도로 배치된 개별 혼합 구성요소(예: 플레이트, 배플, 나선형 구성요소 또는 기하학적 격자)로 구성된다. 이러한 장치는 유사하거나 매우 상이한 점도 및 체적 유량을 갖는 액체들을 혼합할 수 있다. 2개 이상의 유입 유체 스트림의 균일한 혼합을 용이하게 하기 위해 특정 혼합 구성요소, 특정 형상 및 크기의 단면 및 장치 길이를 갖는 정적 혼합 장치를 선택하는 것은 당업자의 지식 내에 있다. 혼합의 품질을 평가하는 방법은 흐름 경로의 단면 내에서 평균으로부터 국부적 농도의 편차를 나타내는 방사형 변동 계수(CoV)를 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 CoV가 낮을수록 더 균일한 혼합을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 정적 혼합 구성요소는 약 0.05 미만의 CoV를 달성하도록 선택된다(즉, 유동 경로 단면으로부터 취해지는 모든 농도 측정치의 95%가 ±10% 이내임).
몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 제1 라인을 통해, 예를 들어 펌프를 통해 펌핑되어 제1 유입 유체 스트림을 형성한다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 적어도 약 100 mL/분의 유속으로 제1 라인을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 약 100 mL/분, 약 200 mL/분, 약 300 mL/분, 약 400 mL/분, 약 500mL/분, 약 600mL/분, 약 700mL/분, 약 800mL/분, 또는 약 900mL/분의 유속으로 제1 라인을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 약 1 L/분 또는 1 L/분 초과(예를 들어, 약 2 L/분, 약 3 L/분, 약 4 L/분, 약 5 L/분, 약 6 L/분, 약 7 L/분 , 약 8L/분, 약 9L/분, 약 10L/분, 약 20L/분, 약 30L/분, 약 40L/분 또는 약 50L/분)의 유속으로 제1 라인을 통해 펌핑된다.
몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 제2 라인을 통해, 예를 들어 펌프를 통해 펌핑되어 제2 유입 유체 스트림을 형성한다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 적어도 약 100 mL/분의 유속으로 제2 라인을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 약 100 mL/분, 약 200 mL/분, 약 300 mL/분, 약 400 mL/분, 약 500mL/분, 약 600mL/분, 약 700mL/분, 약 800mL/분, 또는 약 900mL/분의 유속으로 제2 라인을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 약 1 L/분 또는 1 L/분 초과(예를 들어, 약 2 L/분, 약 3 L/분, 약 4 L/분, 약 5 L/분, 약 6 L/분, 약 7 L/분 , 약 8L/분, 약 9L/분, 약 10L/분, 약 20L/분, 약 30L/분, 약 40L/분 또는 약 50L/분)의 유속으로 제2 라인을 통해 펌핑된다.
몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액을 포함하는 제1 유출 스트림 및 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 포함하는 제2 유출 스트림은 결합되어 유출 스트림을 형성하고 정적 혼합 구성요소를 통과한다. 몇몇 구현예에서, 제1 유출 스트림 및 제2 유출 스트림은 결합되어 정적 혼합 구성요소 내에서 유출 스트림을 형성한다. 몇몇 구현예에서, 유출 스트림은 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액 및 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 포함하고, 여기서 제1 단백질의 용액 및 제2 단백질의 용액은 유출 스트림이 정적 혼합 구성요소를 빠져나갈 때 실질적으로 균질, 즉, 균일하게 혼합되어 있다.
미세유체공학을 이용하여 나노구조체를 제조하는 방법
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은 미세유체 혼합(microfluidic mixing)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본 개시는 미세유체 혼합(예를 들어, Whitesides, George, M. Nature (2006) 442:368-373; Stroock 등, Science (2002) 295:647-651; Valencia 등, ACS Nano (2013) DOI/101.1021/nn403370e 참조)을 사용하여 하나 이상의 단백질 성분(예를 들어, compA 및/또는 compB)을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 제조하는 방법을 제공한다. 비제한적인 예로서, 제어된 미세유체 방법(formulation)은 예를 들어 문헌[Stroock 등, Science (2002) 295:647-651]에 기재된 바와 같이 낮은 레이놀즈 수에서 미세 채널에서 일정한 압력 구동 흐름의 스트림을 혼합하기 위한 수동 방법을 포함한다.
미세유체공학(Microfluidics)는 서브밀리미터 단면의 채널 내부의 유체 흐름 거동의 연구를 설명하는데 일반적으로 사용되는 용어이다. 상기 미세유체장치는 일반적으로 미세기술(microtechnology)로 분류되는 물리적 현상이 유체채널 및 이의 내부에 배치된 챔버와 관련이 있는 것을 특징으로 한다. 여기에는 예를 들어 모세관 효과, 및 유체의 표면 장력과 관련된 효과(특히 기계적 효과)가 포함된다. 여기에는 열 영동(thermophoresis) 및 전기 영동과 같은 효과가 추가로 포함된다. 미세 유체 공학에서, 상기 현상은 일반적으로 중력과 같은 효과보다 지배적이다. 또한, 미세유체 장치는 적어도 부분적으로 층별 방법(layer-by-layer method)을 사용하여 생산되고 층 구조의 층들 사이에 채널이 배열되는 것을 특징으로 할 수 있다. 한 챔버에서 다른 챔버로 또는 채널 내에서 유체 또는 용질의 편리한 수송/조작을 위해 PDMS(폴리디메틸실록산)와 같은 친수성 기판에, 챔버 및 상호 연결 채널로 이루어진 미세유체 배열이 제공될 수 있다. 이와 같은 미세유체 배열을 갖는 기판은 미세유체 "칩" 또는 "장치"로 불릴 수 있다. 또한, 용어 "미세 유체"는 유체를 안내하는 역할을 하는 장치 내의 단면 또는 채널을 통해 특징지어질 수 있다. 예를 들어 단면은 일반적으로 약 100μm x 100μm 내지 800μm x 800μm이다. 예시적인 미세유체 칩 또는 미세유체 장치는 하나 이상의 유체 입구, 채널 및 혼합 영역, 및 하나 이상의 출구를 포함하는 강성 재료, 예를 들어 열가소성 재료의 몸체를 포함한다. 미세유체 장치는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 공개 2020/0023358호, 2012/0276209호, 2014/0328759호, 2016/0022580호 및 2018/0111830호에 추가로 기재되어 있다.
몇몇 구현예에서, 하나 이상의 단백질 성분(예를 들어, compA 및/또는 compB)을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 제조하는 방법은 미세유체 장치를 사용하여 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 미세유체 장치는 (i) 제1 단백질(예를 들어, CompA)의 용액을 수용하기 위한 제1 입구; (ii) 제2 단백질(예를 들어, CompB)의 용액을 수용하기 위한 제2 입구; (iii) 제1 단백질 용액을 포함하는 제1 유입 유체 스트림을 제공하도록 제1 입구와 유체 연통하는 제1 채널; (iv) 제2 단백질의 용액을 포함하는 제2 유입 유체 스트림을 제공하도록 제2 입구와 유체 연통하는 제2 채널; (v) 제1 및 제2 유입 유체 스트림을 수용하기 위한 중첩 영역; 및 (vi) 중첩 영역과 유체 연통하는 제3 채널을 포함하고, 제1 및 제2 유입 유체 스트림은 유입 유체 스트림을 형성하기 위해 제3 채널을 통해 흘러야 하고, 제1 단백질 용액과 제2 단백질 용액의 혼합은 유입 유체 스트림 내에서 발생함으로써 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 나노구조체(예를 들어, VLP)를 형성한다.
본원에서 사용되는 용어 "채널"은 유체 스트림이 통과하거나 지향될 수 있는 임의의 원하는 형상 또는 구조의 도관을 의미한다. 몇몇 구현예예에서, 채널의 하나 이상의 치수는 서브밀리미터(예를 들어, 500 미크론 미만)이다. 몇몇 구현예에서, 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널의 단면은 직사각형, 원형, 정사각형, 원형, 타원형, 또는 반원형으로부터 독립적으로 선택된다. 몇몇 구현예에서, 제1 채널의 단면은 1mm 미만의 하나 이상의 치수를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 제1 채널의 단면은 약 30nm 내지 약 300nm의 하나 이상의 치수를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 제2 채널의 단면은 1mm 미만의 하나 이상의 치수를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 제2 채널의 단면은 약 30nm 내지 약 300nm의 하나 이상의 치수를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 제3 채널의 단면은 1mm 미만의 하나 이상의 치수를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 제3 채널의 단면은 약 30nm 내지 약 300nm의 하나 이상의 치수를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "중첩 영역"은 유입 유체 스트림을 포함하는 2개 이상의 채널이 교차점(junction)을 형성하고 있는, 미세유체 장치의 구역을 의미하는 것으로, 유입 유체 스트림은 중첩 영역을 향하는 주요 흐름 방향을 갖고, 2개 이상의 채널의 유입 유체 스트림은 중첩 영역 내에서 유체 연통한다. 몇몇 구현예에서, 미세유체 장치는 제1 채널과 제2 채널 사이에 중첩 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 중첩 영역은 제3 채널과 연결된다. 몇몇 구현예에서, 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널은 중첩 영역에서 수렴한다. 몇몇 구현예에서, 중첩 영역은 제1 채널에서 유체 스트림을 수용하고 제2 채널에서 유체 스트림을 수용한다. 몇몇 구현예에서,유체 스트림은 중첩 영역을 통해 제3 채널로 흐른다. 몇몇 구현예에서, 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널은 T자형 또는 Y자형 중첩 영역을 통해 수렴한다.
몇몇 구현예에서, 제3 채널은 혼합 채널을 포함한다. 온칩(on-chip) 혼합을 위한 마이크로 믹서는 층류를 방해하는 다양한 메커니즘을 기반으로 개발되어 왔다(예를 들어, Ward, K. (2015) J. Micromech. Microeng. 25:094001 참조). 이러한 마이크로믹서는 수동 및 능동 마이크로믹서의 두 그룹으로 나눌 수 있다(예를 들어, Nguyne and Wu (2005) J. Micromech. Microeng. 15:1 참조). 능동 혼합기는 마이크로 채널에서 무질서한 흐름 패턴을 생성하기 위해 어떤 형태의 외부 에너지 교란에 의존한다. 일반적으로, 외부 에너지 힘은 마이크로믹서 자체의 움직임 구성요소, 예를 들어 자기 작동식 교반기에 의해, 또는 외부 전기력의 적용, 예를 들어 압력, 초음파, 음향, 전기 유체 역학, 유전영동, 동전기학, 자기 유체 역학, 열 등에 의해 발생된다. 수동 혼합 채널은 난류 조건이 없고 움직이는 구성요소를 사용하지 않고 두 개 이상의 유입 유체 흐름을 혼합한다. 수동 혼합 채널은 층류 및/또는 무질서한 이류(chaotic advection)를 유발하기 위해 마이크로채널의 기하학적 레이아웃에 의존한다. 수동 혼합 채널을 위한 디자인으로는 스트림을 분할하고 특정 거리 이후에 스트림을 다시 결합하는 층류 기반 디자인(예를 들어, Ansari 등, (2009) Chem Eng J. 146:439 참조); 엇갈린-헤링본(staggered-herringbone) 디자인(예를 들어, Stroock 등, (2002) Science 295:647 참조), 및 평면 나선형 마이크로채널(예를 들어, Sudarsan 등, (2006) Lab on a Chip, 6:74-82 참조)가 있다.
몇몇 구현예에서, 제3 채널은 수동 혼합 채널을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 수동 혼합 채널은 층류를 포함하는 주요 흐름 방향을 갖고 혼합을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 수동 구성요소를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 수동 구성요소는 스트림 분할 및 재결합을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 수동 구성요소는 경사진 웰, 리지 또는 홈을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 수동 구성요소는 채널 중첩부, 슬릿, 수렴/발산 영역, 턴(turn), 및/또는 개구를 포함하고, 여기서 하나 이상의 수동 구성요소는 둘 이상의 유체 스트림 사이의 신속하고 제어된 혼합을 촉진한다. 몇몇 구현예에서, 본 개시에서 사용하기에 적합한 수동 혼합 채널은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 공개 WO 97/00125호, 미국 특허 6,890,093호, 6,264,900호, 7,160,025호, 및 미국 출원 2004/0262223, 2007/026377, 2021/0069699, 2020/0023358호 참조. 몇몇 구현예에서, 제3 채널은 층류 조건하에서 제1 및 제2 유입 유체 스트림을 흐르게 하기에 적합한 제1 영역, 및 수동 혼합 채널인 제2 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제2 영역은 능동 마이크로믹서를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제3 채널은 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 나노구조체(예를 들어, VLP)를 제공하는 조건하에서 제1 및 제2 유입 유체 스트림의 내용물의 혼합을 가능하게 한다.
몇몇 구현예에서, 하나 이상의 단백질 성분(예를 들어, compA 및/또는 compB)을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 제조하기 위한 본 개시의 방법은 (i) 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액을 포함하는 제1 유체 스트림을 미세유체 장치의 제1 입구에 도입하고; (ii) 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 포함하는 제2 유체 스트림을 미세유체 장치의 제2 유입 유체 스트림에 도입하고, (iii) 제1 유입 유체 스트림을 층류 조건하에서 미세유체 장치의 제1 채널을 통해 미세유체 장치의 제3 채널로 흐르게 하고; (iv) 제2 유입 유체 스트림을 층류 조건하에서 미세유체 장치의 제2 채널을 통해 미세유체 장치의 제3 채널로 흐르게 하는 것을 포함함으로써, 하나 이상의 단백질 성분을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 제공하는 것을 포함하고, 여기서 제1 유입 유체 스트림과 제2 유입 유체 스트림은 유입 유체 스트림을 형성하고, 제1 유체 스트림과 제2 유체 스트림의 내용물의 혼합은 제3 채널에서 발생한다.
몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 제1 미세유체 펌프, 예를 들어 주사기 펌프를 사용하여 제1 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 약 1 mL/분 내지 약 20 mL/분의 유속으로 제1 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 약 2 mL/분의 유속으로 제1 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 약 10 mL/분의 유속으로 제1 채널을 통해 펌핑된다.
몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 제2 미세유체 펌프, 예를 들어 주사기 펌프를 사용하여 제2 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 약 1 mL/분 내지 약 20 mL/분의 유속으로 제2 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 약 2 mL/분의 유속으로 제2 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제2 용액은 약 10 mL/분의 유속으로 제2 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 약 10 mL/분, 약 100 mL/분, 약 200 mL/분, 약 300 mL/분, 약 400mL/분, 약 500mL/분, 약 600mL/분, 약 700mL/분, 약 800mL/분 또는 약 900mL/분의 유속으로 제2 채널을 통해 펌핑된다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 약 1 L/분 또는 1 L/분 초과(예를 들어, 약 2 L/분, 약 3 L/분, 약 4 L/분, 약 5 L/분, 약 6 L/분, 약 7 L/분, 약 8L/분, 약 9L/분, 약 10L/분, 약 20L/분, 약 30L/분, 약 40L/분 또는 약 50L/분)의 유속으로 제2 채널을 통해 펌핑된다.
몇몇 구현예에서, 제1 채널을 통해 펌핑되는 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액에 대한 유속은 제2 채널을 통해 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 펌핑하는데 사용되는 유속과 동일하다. 몇몇 구현예에서, 제1 채널을 통해 펌핑되는 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액에 대한 유속은 제2 채널을 통해 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 펌핑하는데 사용되는 유속보다 크다. 몇몇 구현예에서, 제1 채널을 통해 펌핑되는 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액에 대한 유속은 제2 채널을 통해 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 펌핑하는데 사용되는 유속보다 낮다.
몇몇 구현예에서, 하나 이상의 단백질 성분(예를 들어, compA 및/또는 compB)을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 제조하기 위한 본 개시의 방법은 (i) 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액을 포함하는 제1 유체 스트림을 미세유체 장치의 제1 입구에 약 2 ml/분 내지 약 15 mL/분의 제1 유속으로 도입하고, (ii) 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액을 포함하는 제2 유체 스트림을 미세유체 장치의 제2 유입 유체 스트림에 약 2 mL/분 내지 약 15 mL/분의 제2 유속으로 으로 도입하고, (iii) 제1 유입 유체 스트림을 층류 조건하에서 미세유체 장치의 제1 채널을 통해 미세유체 장치의 제3 채널로 흐르게 하고, (iv) 제2 유입 유체 스트림을 층류 조건하에서 미세유체 장치의 제2 채널을 통해 미세유체 장치의 제3 채널로 흐르게 하는 것을 포함하고, 여기서 제1 유체 스트림과 제2 유체 스트림의 내용물의 혼합이 제3 채널에서 발생하고, 제3 채널은 하나 이상의 단백질 성분을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 포함하는 유입 유체 스트림을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 혼합 속도는 제1 유속 및 제2 유속에 의해 조절된다. 몇몇 구현예에서, 제1 유속 및 제2 유속은 신속한 혼합을 달성하도록 선택된다. 몇몇 구현예에서, 제1 유속과 제2 유속의 비율은 1:1이다. 몇몇 구현예에서, 제1 유속은 제2 유속보다 크고, 이때 제1 유속과 제2 유속의 비율은 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1이다. 몇몇 구현예에서, 제2 유속은 제1 유속보다 크고, 이때 제2 유속과 제1 유속의 비율은 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1이다.
몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 용액은 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도를 포함하고, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 용액은 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도를 포함하고, 이때 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 제2 단백질의 몰 농도와 실질적으로 동일하다(즉, 약 1:1). 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도보다 크다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도보다 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5배 더 크다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도는 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도보다 크다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도는 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도보다 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5배 더 크다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 약 1 내지 5 μM, 1 내지 10 μM, 1 내지 20 μM, 5 내지 10 μM, 5 내지 20 μM, 10 내지 20 μM, 10 내지 30μM, 10 내지 40μM 또는 10 내지 50μM이다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 약 50 μM, 약 60 μM, 약 70 μM, 약 80 μM, 약 90 μM, 약 100 μM, 약 200 μM, 약 300 μM, 또는 약 500μM이다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도는 약 1 내지 5 μM, 1 내지 10 μM, 1 내지 20 μM, 5 내지 10 μM, 5 내지 20 μM, 10 내지 20 μM, 10 내지 30μM, 10 내지 40μM 또는 10 내지 50μM이다. 몇몇 구현예에서, 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도는 약 50 μM, 약 60 μM, 약 70 μM, 약 80 μM, 약 90 μM, 약 100 μM, 약 200 μM, 약 300 μM, 또는 약 500μM이다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 약 1 내지 20 μM이고 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도는 약 1 내지 20 μM이다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 약 10 μM이고 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도는 약 8 μM이다. 몇몇 구현예에서, 제1 단백질(예를 들어, compA)의 몰 농도는 약 100 내지 500 μM이고 제2 단백질(예를 들어, compB)의 몰 농도는 약 100 내지 500 μM이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 나노구조체는 Harvard Apparatus(Holliston사, Mass), Dolomite Microfluidics(Royston사, UK), Precision Nanosystems(Vancouver사, BC), 또는 Cytiva (Marlborough사, MA)의 것들과 같은 마이크로믹서 칩을 사용하여 제조된다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 나노구조체는 본원에 참조로 포함되는 US20200023358호에 기재된 마이크로믹서 칩을 사용하여 제조된다. 몇몇 구현예에서, 본 개시의 나노구조체는 NanoAssembler 플랫폼(Precision Nanosystems(Vancouver사, BC); Cytiva(Marlborough사, MA))에 기반한 미세유체 혼합 기기를 사용하여 제조된다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 나노구조체는 NanoAssembler Ignite 시스템을 사용하여 제조된다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건(예를 들어, 미세유체 혼합) 하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은 제1 및 제2 단백질의 기계적 혼합(예: 블레이드, 교반 막대 또는 임펠러를 사용)과 비교하여, 제1 및 제2 단백질을 포함하는 나노구조체(예: pbVLP)를 개선된 수율로 제공한다. 나노구조체(예를 들어, pbVLP)의 수율을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래프(SEC)를 사용하여 나노구조체로 형성된 총 단백질의 중량 퍼센트를 정량화하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은 SEC에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 그 이상의 수율로 나노구조체(예: pbVLP)를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 SEC에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 약 40%인 중량%로 형성된다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 SEC에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 약 45%인 중량%로 형성된다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 SEC에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 약 55%인 중량%로 형성된다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 SEC에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 약 60%인 중량%로 형성된다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 SEC에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%인 중량 퍼센트로 형성된다.
몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건(예를 들어, 미세유체 혼합) 하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은, 제1 및 제2 단백질의 기계적 혼합(예를 들어, 블레이드, 교반 막대 또는 임펠러를 사용함)과 비교하여 감소된 다분산 지수를 갖는 제1 및 제2 단백질을 포함하는 나노구조체(예: pbVLP)의 형성을 제공한다. 나노구조체의 다분산도를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, SEC, 광산란(예를 들어, 동적 광산란) 및 투과 전자 현미경 분석(TEM)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 제1 단백질(예를 들어, compA) 및 제2 단백질(예를 들어, compB)을 혼합, 블렌딩 또는 결합하는 방법은 다분산 지수가 약 0.4, 약 0.35, 약 0.3, 약 0.25, 약 0.2, 약 0.15 또는 약 0.1인 나노구조체의 형성을 제공한다.
나노구조체를 정제하는 방법
본 개시는 과량의 가용성 단백질(예를 들어, compA 및/또는 compB) 및/또는 불순물을 제거하기 위해 본원에 기재된 나노구조체(예를 들어, pbVLP 입자)를 정제하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 친수성 막(예를 들어, 재생 셀룰로오스(CRC) 막)을 갖는 큰 기공(예를 들어, 약 1,000kDa) 필터를 통해 pbVLP의 혼합물을 통과시키면, pbVLP의 수율을 실질적으로 감소시키지 않고 고순도(예를 들어, >90%)의 pbVLP의 용액이 제공된다는 것을 확인하였다. 대조적으로, pbVLP의 혼합물을 소수성 막(예: Pellicon Biomax 1000 kDa)이 있는 큰 기공 필터를 통해 통과시키거나 대체 정제 방법(예: Butyl Convective Interaction Media(CIM) 컬럼 또는 Captocore700 컬럼)을 사용하면 pbVLP의 수율이 상당히 감소된다는 것을 확인하였다.
따라서, 몇몇 구현예에서, 본 개시는 큰 기공 친수성 막을 통한 여과에 의해 본원에 기재된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 정제하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 여과는 접선 흐름 여과(TFF)에 의해 수행된다. 몇몇 구현예에서, 친수성 막은 약 1,000kDa의 기공 크기를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 막은 약 300 kDa, 약 400 kDa, 약 500 kDa, 약 600 kDa, 약 700 kDa, 약 800 kDa 또는 약 900 kDa의 기공 크기를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 막은 약 1,000kDa보다 큰 기공 크기를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 막은 약 1100 kDa, 약 1200 kDa, 약 1300 kDa, 약 1400 kDa, 약 1500 kDa, 약 2000 kDa, 약 2500 kDa 또는 약 3000 kDa의 기공 크기를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 친수성 막은 셀룰로오스, CRC, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 나일론 및 폴리에테르술폰으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 큰 기공 친수성 막은 기공 크기가 약 1,000kDa인 CRC 막이다. 몇몇 구현예에서, 큰 기공 친수성 막은 Ultracel® 1000 kDa 막 또는 이의 균등물이다.
몇몇 구현예에서, 정제는 SEC에 의해 측정된 것으로 고순도, 예를 들어 최소 과량(minimal excess)의 가용성 단백질(예를 들어, CompA 및/또는 CompB) 및/또는 불순물을 갖는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 순도는, 예를 들어 SEC를 사용하여, 나노구조로 형성되는 여과된 용액 중 총 단백질의 백분율로서 측정된다. 몇몇 구현예에서, 순도는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 >99%이다. 몇몇 구현예에서, 정제는 예를 들어 SEC에 의해 측정된 바와 같이, 여과 전의 나노구조체의 혼합물에 비해 실질적인 손실 없이 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 여과 전의 혼합물에서 나노구조체(예를 들어, pbVLP)의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 >99%는 예를 들어 SEC에 의해 측정된 바와 같이 큰 기공 친수성 막을 통과한 후에 회수된다.
나노구조체를 제조하는 예시적인 방법
몇몇 구현예에서, 본 개시는 compA 및 compB 단백질을 포함하는 pbVLP를 제조하는 방법으로서, (i) compA 단백질을 compB 단백질을 포함하는 용액에, 선택적으로 compA가 그의 정제 공정의 마지막 단계(예를 들어, 여과)로부터 나올 때 첨가하고, (ii) 예를 들어, compA 및 compB의 기계적 혼합과 비교하여 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 compA를 혼합, 블렌딩 또는 결합함으로써 compA 및 compB 단백질을 포함하는 pbVLP를 형성하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 조건은 기계적 혼한(예를 들어, 블레이드, 교반 막대 또는 임펠러를 사용함)이 없이 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 조건은 회전 교반 또는 미세유체 혼합을 포함한다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 조건은 pbVLP를 형성하기 위한 compA 및 compB의 조립을 용이하게 하는 compA 및 compB의 부분적 또는 실질적으로 균질한 혼합물을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 (i) compA 단백질을 compB 단백질을 포함하는 용액에, 선택적으로 compA가 그의 정제 공정의 마지막 단계(예를 들어, 여과)로부터 나올 때 첨가하고, (ii) 회전 교반에 의해 compA 및 compB 단백질을 혼합, 블렌딩 또는 결합함으로써 compA 및 compB 단백질을 포함하는 pbVLP를 형성하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 (i) compA 단백질을 compB 단백질을 포함하는 용액에, 선택적으로 compA가 그의 정제 공정의 마지막 단계(예를 들어, 여과)로부터 나올 때 첨가하고, (ii) pbVLP를 형성하기 위해 회전 교반에 의해 용액을 혼합, 블렌딩 또는 결합하기 위한 조건을 제공하고, (iii) TFF에 의해 큰 기공 친수성 막을 이용하여 용액을 여과하는 것을 포함하여 과량의 compA, 과량의 compB, 및/또는 불순물을 제거하기 위해 pbVLP를 정제하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 회전 교반은 회전 교반 플랫폼의 사용을 포함한다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 회전 교반은 약 20 내지 25℃에서 수행된다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 회전 교반은 약 6 내지 약 24시간 동안 수행된다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 회전 교반은 약 8 내지 약 12시간 동안 수행된다. 몇몇 구현예에서, (ii)의 회전 교반은 약 80 내지 약 100rpm의 속도로 수행된다. 몇몇 구현예에서, (iii)의 큰 기공 친수성 막은 약 300 내지 3000 kDa, 약 800 kDa, 약 900 kDa, 약 1,000 kDa, 약 1100 kDa, 약 1200 kDa, 약 13 kDa, 약 1400kDa 또는 약 1500kDa이 기콩 크기를 포함하는 CRC 막이다. 몇몇 구현예에서, (iii)의 큰 기공 친수성 막은 약 1000 kDa의 기공 크기를 포함하는 CRC 막이다. 몇몇 구현예에서,(iii)의 큰 기공 친수성 막은 Ultracel® 1000 kDa 막 또는 이의 균등물인 1,000 kDa 막이다. 몇몇 구현예에서, compB 단백질을 포함하는 용액은 compB 단백질의 하나 이상의 냉동 배치로부터 제조된다. 몇몇 구현예에서, (i) 및 (ii)의 단계는 연속 공정이다. 몇몇 구현예에서, (i), (ii) 및 존재하는 경우 (iii)의 단계는 연속 공정이다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 (i)의 첨가 전에 연속적으로 생산된다.
몇몇 구현예에서, compA 단백질 및 compB 단백질을 포함하는 pbVLP를 제조하는 방법은 미세유체 장치를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 (i) compA 단백질을 포함하는 제1 유입 유체 스트림 및 compB 단백질을 포함하는 제2 유입 유체 스트림을 제공하고, (ii) 제1 유입 유체 스트림과 제2 유입 유체 스트림을 접촉시켜서 유출 스트림을 형성하는 것을 포함하고, 여기서 compA 단백질과 compB 단백질의 혼합, 블렌딩 또는 결합은 유출 스트림에서 발생하여 pbVLP를 형성한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 (i) 미세유체 장치의 제1 채널을 통해 흐르는 compA를 포함하는 제1 유입 유체 스트림 및 미세유체 장치의 제2 채널을 통해 흐르는 compB 단백질을 포함하는 제2 유입 유체 스트림을 제공하고, (iii) 제1 유입 유체 스트림과 제2 유입 유체 스트림을 접촉시켜서 미세유체 장치의 제3 채널을 통해 흐르는 유출 스트림을 형성하는 것을 포함하고, 여기서 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널은 예를 들어 T자형 또는 Y자형 구조를 갖는 중첩 영역에서 연결되어 있고, 제1 유입 유체 스트림과 제2 유입 유체 스트림의 접촉은 compA 및 compB의 혼합, 블렌딩 또는 조합을 가능하게 함으로써 pbVLP를 형성한다. 몇몇 구현예에서, 혼합, 블렌딩 또는 결합은, 예를 들어, 분할 및 재결합 채널, 홈, 경사진 웰 또는 리지로서 유출 스트림에 존재하는 하나 이상의 수동 확산 구성요소에 의해 촉진된다. 몇몇 구현예에서, 미세유체 장치는 NanoAssemblr Ignite 카트리지이다. 몇몇 구현예에서, 방법은 TFF에 의해 큰 기공 친수성 막을 이용하여 용액을 여과하는 것에 의해 pbVLP를 정제하여 과량의 compA, 과량의 compB, 및/또는 불순물을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 큰 기공 친수성 막은 약 300 내지 3000 kDa, 약 800 kDa, 약 900 kDa, 약 1,000 kDa, 약 1100 kDa, 약 1200 kDa, 약 13 kDa, 약 1400kDa 또는 약 1500kDa의 기공 크기를 포함하는 CRC 막이다. 몇몇 구현예에서, 큰 기공 친수성 막은 약 1000kDa의 기공 크기를 포함하는 CRC 막이다. 몇몇 구현예에서, 큰 기공 친수성 막은 Ultracel® 1000 kDa 또는 이의 균등물인 1,000 kDa 막이다. 몇몇 구현예에서, 유출 스트림의 흐름 경로는 TFF에 직접 공급되어 pbVLP의 생산 및 정제를 위한 연속 공정을 제공한다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 제1 유입 유체 스트림에 도입되기 전에 연속적으로 생산된다.
몇몇 구현예에서, 방법은 SEC에 의해 측정된 것으로 예를 들어 최소 과량의 가용성 단백질(예를 들어, CompA 및/또는 CompB), 및/또는 불순물을 갖는 compA 및 compB를 포함하는 pbVLP의 실질적으로 순수한 조성물을 제공한다. 몇몇 구현예에서, pbVLP의 순도는 SEC에 의해 측정되는 바와 같이 pbVLP인 정제된 용액 중 총 단백질의 중량 퍼센트로 결정된다. 몇몇 구현예에서, 정제된 용액 중의 총 단백질의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 >99%는 pbVLP이다.
몇몇 구현예에서, compA 단백질은 본원에 기재된 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 본원에 기재된 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 본원에 기술된 오량체이다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 29 내지 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, compB 단백질은 본원에 기재된 이량체이다. 몇몇 구현예에서, compB 단백질은 본원에 기재된 삼량체이다. 몇몇 구현예에서, compB 단백질은 본원에 기재된 펜타머이다. 몇몇 구현예에서, compB 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 28, 32 내지 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 및 58 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, compA 단백질은 삼량체이고 compB 단백질은 오량체이다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질 및 compB 단백질은 각각 서열번호 39 및 40과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 서열번호 7과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, compB 단백질은 서열번호 8, 32, 33 및 34 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 서열번호 29와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, compB 단백질은 서열번호 8, 32, 33 및 34 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 서열번호 30과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, compB 단백질은 서열번호 8, 32, 33 및 34 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, compA 단백질은 서열번호 31과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, compB 단백질은 서열번호 8, 32, 33 및 34 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
핵산
또 다른 측면에서, 본 개시는 본 개시의 항원, 제1 성분 및/또는 제2 성분을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 분리된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "분리된 핵산"은 게놈 또는 cDNA 서열에 있는 그의 정상적인 주변 핵산 서열로부터 제거된 것들이다. 이러한 분리된 핵산 서열은 폴리A 서열, 변형된 Kozak 서열, 및 에피토프 태그, 수송(export) 신호 및 분비 신호, 핵 국소화 신호, 및 원형질막 국소화 신호를 암호화하는 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 암호화된 단백질의 발현 및/또는 정제를 촉진하는데 유용한 추가의 서열을 포함할 수 있다. 본원의 교시에 기초하여 어떤 핵산 서열이 본 개시의 단백질을 암호화할 것인지는 당업자에게 명백할 것이다.
추가의 측면에서, 본 개시는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 개시의 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 분리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. "재조합 발현 벡터"는 핵산 코딩 영역 또는 유전자를 유전자 산물의 발현에 영향을 미칠 수 있는 임의의 조절 서열에 작동가능하게 연결하는 벡터를 포함한다. 본 개시의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 "조절 서열"은 핵산 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 핵산 서열이다. 조절 서열은 핵산 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 핵산 서열과 인접할 필요가 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지는 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 핵산 서열 사이에 개재될 수 있고, 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 여전히 간주될 수 있다. 다른 이러한 조절 서열로는 폴리아데닐화 신호, 종결 신호 및 리보솜 결합 부위가 있지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 발현 벡터는 플라스미드 및 바이러스 기반 발현 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 유형일 수 있다. 포유동물 시스템에서 개시된 핵산 서열의 발현을 유도하는데 사용되는 조절 서열은 구성적(CMV, SV40, RSV, 액틴, EF를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 프로모터 중 임의의 것에 의해 구동됨) 또는 유도성(테트라사이클린, 엑디손, 스테로이드 반응성을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 유도성 프로모터에 의해 구동됨)일 수 있다. 또한, 원핵 세포를 형질감염시키는데 사용하기 위한 발현 벡터의 제작은 당업계에 잘 알려져 있으며, 따라서 표준 기법(예를 들어, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J. 참조), 및 Ambion 1998 Catalog(Ambion, Austin, TX)를 통해 달성될 수 있다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA로의 통합에 의해 숙주 유기체에서 복제 가능해야 한다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 플라스미드를 포함한다. 그러나, 본 개시는 바이러스 벡터와 같은, 동등한 기능을 제공하는 다른 발현 벡터를 포함하도록 의도된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 본원에 개시된 재조합 발현 벡터로 형질감염 또는 형질도입된 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 세포는 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염되거나 형질도입될 수 있다. 원핵 및 진핵 세포로의 발현 벡터의 이러한 형질감염 또는 형질도입은 표준 박테리아 형질전환, 인산칼슘 공침전, 전기천공 또는 리포솜 매개-, DEAE 덱스트란 매개-, 다가양이온 매개 또는 바이러스 매개 형질감염을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 기법을 통해 달성될 수 있다.(예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY 참조).
또 다른 측면에서, 본 개시는 본 개시에 따른 항원, 성분, 또는 pbVLP를 생산하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 방법은 (a) 폴리펩티드의 발현에 도움이 되는 조건하에서 본 개시의 이러한 측면에 따라 숙주를 배양하는 단계, 및 (b) 선택적으로, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 항원을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하여 숙주 세포가 항원을 배양 배지로 분비하도록 하고; 선택적으로 배양 배지로부터 항원을 정제하고; 항원을, 항원과 다량체화되어 pbVLP를 형성하는 제2 성분과 혼합하고; 선택적으로 pbVLP를 정제하는 것을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 어느 하나의 pbVLP의 두 성분을 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 숙주 세포가 제1 성분 및 제2 성분을 배양 배지내로 분비하도록 하고, 선택적으로 배양 배지로부터 pbVLP를 정제하는 것을 포함하는, 백신 제조 방법을 제공한다.
예시적인 숙주 세포로는 대장균 세포, 293 및 293F 세포, HEK293 세포, Sf9 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 및 재조합 단백질의 생산에 사용되는 임의의 다른 세포주가 있다.
제형화
몇몇 구현예에서, 조성물 내의 완충제는 트리스 완충제, 히스티딘 완충제, 인산염 완충제, 구연산염 완충제 또는 아세테이트 완충제이다. 또한, 조성물은 동결보호제, 예를 들어 자당, 소르비톨 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 보존제, 예를 들어 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 페닐수은 질산염, 티메로살, 벤조산, 및 이들의 다양한 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 글리신과 같은 증량제(bulking agent)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트를 포함한다 , 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올레이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또한, 조성물은 등장성(tonicity) 조절제, 예를 들어 제형이 인간 혈액과 실질적으로 등장성 또는 등삼투성이 되도록 하는 화합물을 포함할 수 있다. 예시적인 등장성 조절제로는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 덱스트로스, 이노시톨, 염화나트륨, 아르기닌 및 아르기닌 히드로클로라이드가 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 안정화제, 예를 들어 동결건조된 형태 또는 액체 형태의 pbVLP의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 실질적으로 방지하거나 감소시키는 분자를 추가로 포함한다. 예시적인 안정화제로는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 이노시톨, 염화나트륨, 메티오닌, 아르기닌 및 아르기닌 히드로클로라이드가 있다.
사용 방법
몇몇 구현예에서, 본 개시는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 개시는 면역 반응의 유도, 촉진 또는 증가를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도, 촉진 또는 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 하나 이상의 항원을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 항원은 나노구조체의 표면에 디스플레이된다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 외부에 부착되고/되거나 케이지 내부에 캡슐화된 하나 이상의 면역자극 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 면역자극 분자는 이것이 단독으로 또는 다른 작용제(예를 들어, 항원)와 조합하여 투여되는 대상체에서 면역 반응을 자극(기존 면역 반응을 강화하는 것을 포함함)하는 화합물이다. 예시적인 면역자극 분자는 TLR 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 면역 반응의 유도, 촉진 또는 증가를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도, 촉진 또는 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 면역원성 조성물 또는 백신으로서 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 숙주에 도입되면, 면역원성 조성물 또는 백신은 면역 반응을 유발한다. "면역 반응"은 선천적 또는 후천적 면역의 활성화 또는 효율을 유도, 증가 또는 지속시키는 반응을 의미한다. 몇몇 구현예에서, 면역 반응은 항체 및/또는 사이토카인의 생성을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 면역 반응은 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포, B 세포 및/또는 다른 세포 반응의 활성화를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 항체 반응의 유도, 촉진 또는 증가를 필요로 하는 대상체에서 항체 반응을 유도, 촉진 또는 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 면역원성 조성물 또는 백신으로서 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 여기서, 나노구조체는 하나 이상의 항원을 디스플레이하고, 항체 반응은 하나 이상의 항원에 존재하는 에피토프에 대한 반응이다. 대상체에서 항체 반응을 분석하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 항원-특이적 항체 역가를 결정하기 위해 ELISA에 의해 면역 반응의 증가를 측정한다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 개선된 B-기억 세포 반응을 포함하는 면역 반응의 유도, 촉진 또는 증가를 필요로 하는 대상체에서 개선된 B-기억 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유도, 촉진 또는 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 면역화된 대상체에게 면역원성 조성물 또는 백신으로서 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 개선된 B-기억 세포 반응은 시험관내 분화의 자극에 의해 측정되는 바와 같이, 항원과 마주할 때 항체-분비 형질 세포로 분화할 수 있는 말초 혈액 B 세포의 증가된 빈도를 의미하는 것으로 의도된다. 몇몇 구현예에서, 본 개시는 항체-분비 B 세포의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 항체-분비 B 세포는 골수 형질 세포 또는 배아 B 세포이다. 몇몇 구현에에서, B 세포를 분비하는 항체를 측정하는 방법은 면역화 후 다양한 시점에서 수집된 형질 세포 또는 배중심(germinal center) B 세포의 항원-특이적 ELISPOT 분석법 및 유세포 분석법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
몇몇 구현예에서, 나노구조체(예를 들어, pbVLP)는 예방적 면역원성 조성물 또는 백신의 일부로서 투여되며, 이 경우 면역원성 조성물 또는 백신은 감염체에의 후속 노출에 대한 저항성을 대상체에 부여한다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체(예를 들어, pbVLP)는 치료적 면역원성 조성물 또는 백신의 일부로서 투여되며, 이경우 면역원성 조성물 또는 백신은 이미 존재하는 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 개시하거나 향상시킨다. 몇몇 구현예에서, 이미 존재하는 항원은 감염체 또는 신생물로 감염된 대상체에 있는 바이러스 항원이다. 몇몇 구현예에서, 이미 존재하는 항원은 종양 또는 악성 종양이 있는 대상체의 암 항원이다. 예방적 또는 치료적 면역 반응의 원하는 결과는 당업계에 잘 알려진 원칙에 따르면, 치료되는 질병 또는 상태에 따라 다르다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 감염체에 대한 면역 반응은 감염체의 콜로니화 및 복제를 완전히 방지할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 감염체에 대한 백신은 증상의 수, 중증도 또는 지속 기간을 감소시키는 경우, 증상이 있는 집단에서 개체의 수를 감소시키거나 감염체의 전파를 감소시키는 경우 효과적인 것으로 간주된다. 몇몇 구현예에서, 암, 알레르겐 또는 감염체에 대한 면역 반응은 질병을 완전히 치료하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 대한 전반적인 치료 개입에 기여하는데 효과적이다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 급성 또는 만성 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 급성 또는 만성 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체 (예를 들어, pbVLP)를 면역원성 조성물 또는 백신으로서 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체(예를 들어, pbVLP)는 하나 이상의 감염성 질병 항원을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 감염성 질병 항원은 미생물 항원이다. 미생물 항원은 미생물 종, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충 또는 마이코박테리움에서 유래된 항원이다. 몇몇 구현예에서, 본 개시는 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 면역원성 조성물 또는 백신으로서 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 이 경우 나노구조체는 바이러스에서 유래된 하나 이상의 감염성 질병 항원을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 감염은 면역결핍(예를 들어, HIV), 유두종(예를 들어, HPV), 헤르페스(예를 들어, HSV), 뇌염, 인플루엔자(예를 들어, 인간 인플루엔자 바이러스 A), COVID-19(예를 들어, SARS-CoV- 2) 및 일반 감기(예를 들어, 인간 라이노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스)이다. 몇몇 구현예에서, 본 개시는 바이러스 감염의 감소를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 비정상적인 아폽토시스, 분화 과정(예를 들어, 세포 증식성 장애, 예를 들어, 과증식성 장애), 또는 세포 분화 장애(예를 들어, 암)와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 세포 증식성 및/또는 분화성 장애의 예로는 암(예를 들어, 암종, 전이성 장애, 또는 조혈 신생물 장애)이 있다. 몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신은 암을 앓는 대상체에게 투여된다. 용어 "암"은 폐, 유방, 갑상선, 림프 조직, 위장 기관 및 비뇨생식관에 영향을 미치는 것들을 비롯한, 다양한 장기 시스템의 악성 종양뿐만 아니라, 대부분의 결장암, 신세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함하는 것으로 일반적으로 간주되는 선암종을 의미한다. 몇몇 구현예에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 임의의 유형의 암을 앓고 있거나, 가질 것으로 의심되거나, 발병 위험이 높을 수 있는 대상체를 치료하기 위해 사용된다.
몇몇 구현예에서, 본 개시는 암을 앓는 대상체에서 항종양 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 나노구조체는 하나 이상의 항원을 포함하고, 항원은 암 항원이다. 암 항원은 바람직하게는 암 세포에서 발현되고(즉, 암이 아닌 세포보다 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현됨) 몇몇의 경우에는 암 세포에서만 발현되는 항원이다. 암 항원은 암 세포 내에서 또는 암 세포 표면에서 발현될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 암 항원을 포함하는 나노구조체(예를 들어, pbVLP)를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신의 투여는 항종양 면역 반응을 유도함으로써 대상체에서 암을 예방하거나 치료한다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 CompA 용액의 표면 아래의 CompA에 CompB를 천천히 첨가하는 것을 이용함으로써 2성분 나노구조에 대한 조립 공정을 개선하는 것을 입증한다. RSV 항원에 융합된 정제된 성분 A(compA) 단백질(I53-50A) 및 정제된 성분 B(compB) 단백질(I53-50B)을 조립 완충액 내로 별도로 정제하였다. compA 샘플은 1:1 compA:compB의 최종 몰비가 될 때까지 약 10분에 걸쳐 자기 교반 막대로 100rpm으로 교반하면서 약 0.6mL/분의 유속으로 22G ½ 바늘로부터 compB 샘플에 적가하였다. 실험 설정은 도 3A에 도시되어 있다. 혼탁한 용액이 형성되었다(도 3B, 좌측). 그러나, 펠릿(도 3B, 오른쪽)은 용액에 남아 있는 compA:compB 조립체를 포함하지 않았다.
다음으로, 교반 막대 없이 CompB 용액의 표면 아래의 25μM CompB에 25μM CompA(각각 약 30mL 부피)를 20 mL/분이 유속으로 천천히 분배하는 혈청학적 피펫을 사용하여 동일한 조립 반응을 수행했다. CompA 용액을 CompB 용액에 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 80rpm으로 밤새 회전 교반 플랫폼에만 두었다. 2000xg에서 5분 동안 원심분리하여 약간의 탁도를 제거했다. 도 4의 하부 패널에 도시된 바와 같이. 고성능 액체 크로마토그래프(HPLC) 분석 결과, 고분자량(HMW) 응집체(7.6%), 과량의 CompA(9.5%) 및 기타 불순물(31.6%)에 대한 작은 피크를 갖는 VLP 조립체(50%)의 형성이 확인되었다.
결론적으로, 조립 동안 용액에 배치된 교반 막대를 이용하여 혼합하면 생성물 품질이 저하되었다(SE-HPLC로 평가됨). 회전 교반 플랫폼을 이용하여 용액을 혼합하면 생성물 품질이 향상되었다.
실시예 2
본 실시예는 저분자량 불순물로부터 pbVLP를 분리하기 위해 복합 재생 셀룰로오스(Pellicon Ultracel 1000kDa)로 구성된 1000kDa 분자량 컷오프 막을 사용함으로써 2성분 나노구조체의 조립 공정의 개선하는 것을 입증한다. RSV에 융합된 CompA 용액을 CompB 용액에 몰비 1:1로 분배한 다음, 실시예 1에 기재된 바와 같이 회전 교반함으로써 미정제 pbVLP 혼합물을 제조하였다. pbVLP는 45% w/w 총 단백질로부터 97% w/w 총 단백질로 95%의 수율로 정제된다(2Х 정제). 대조적으로, 다른 정제 전략은 불량한 수율을 나타냈다. 수율이 불량한 정제 전략에는 소수성(Pellicon Biomax 1000 kDa) 막 여과(수율 17%), 부틸 CIM 크로마토그래피(수율 0%) 및 Captocore700 크로마토그래피가 포함되었다. Pellicon Biomax 1000 kDa 막을 사용한 접선 흐름 여과(TFF)의 데이터는 하기 표 4에 요약되어 있다. 여과를 위해 로딩된 미정제 pbVLP 혼합물("TFF 로딩")은 1.18mg/mL의 총 단백질 농도를 갖고 70.8mg의 총 단백질을 함유하였다. 미정제 pbVLP를 로딩 부피보다 10배 또는 5배 더 큰 정용여과 부피를 사용하여 여과하였다. pbVLP의 순도 및 수율은 두 조건 모두에서 높았다.
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결론적으로, pbVLP 조립체를 1,000 킬로달톤 분자량 컷오프 막과 접촉시켜서 pbVLP를 정제하면 생성물 품질에 영향을 주지 않으면서 순도가 증가했다. 데이터는 SE 프로필이 영향을 받지 않았음을 보여준다(도 5). 몇몇 다른 정제 방법은 SE 프로파일을 저하시켰다(도 6). VLP를 정제하기 위해 Pellicon Biomax 1000 kDa를 사용하면 17%이 수율을 얻어졌고 SE-HPLC 프로필이 변경되었다. Pellicon Ultracel 1000 kDa 막을 사용하면 거의 100% 수율을 얻을 수 있다.
실시예 3
2성분 CompA/CompB 시스템을 사용한 바이러스 유사 입자의 규모확대 가능한 조립에는 입력 프로세스 솔루션의 견고하고 균일하며 신속한 혼합을 제공하는 단위 조작이 필요하고, 원하는 생성물 품질 특성을 가진 pbVLP가 생성된다. 이상적으로는 조립 단위 조작이 연속 제조 구성에 추가로 적용될 수 있다. NanoAssemblr® IgniteTM 시스템(제품 코드 NIN0001)은 정밀한 유속 및 비율로 공정 솔루션을 제공하고 정밀하게 정의된 혼합 흐름 경로가 포함된 일회용 카트리지를 이용하는 미세유체 혼합 장치이다. Ignite 시스템은 연속 제조가 가능하도록 구성할 수 있는 공정 장비를 사용하여 직접 규모 확대할 수 있는 혼합 조작을 평가하기 위한 대표적인 소규모 모델을 제공하도록 설계되어 있다.
미세유체 혼합 접근법을 사용한 pbVLP 조립을 평가하기 위해, Ignite 시스템을 사용하여 his-태그를 갖는 hMPV 항원에 융합된 CompA (I53-50A)의 삼량체(CompA-hMPV-his; 표 3에 나타낸 서열번호 63과 상동성을 가짐) 및 CompB-01 오량체(표 3에 나타낸 서열번호 63)로부터 pbVLP를 조립했다. Ignite 미세유체 혼합 시스템을 사용한 VLP 조립을 위해, 개별 성분을 조립 버퍼(20mM Tris, 250mM 염화나트륨, 5% 글리세롤, pH-7.4)에서 규정 농도(10 μm CompA/8 μm CompB)로 조정하고 일회용 1mL BD 주사기에 로딩했다. 로딩된 주사기를 일회용 Ignite NxGen 미세유체 카트리지의 개별 채널에 부착하고, 1:1 부피비 및 두 가지 총 시스템 유속(2mL/분 및 10mL/분)으로 카트리지를 통해 스톡 용액을 통과시켜서 조립 반응을 수행하였다. compA 융합체를 compB에 첨가하기 위해 피펫을 사용하여 1:1 부피비로 마이크로원심분리기 튜브에 스톡 용액을 첨가한 후, 혼합을 달성하기 위해 회전 교반에 의해 표준 조립 반응을 수행하였다. HPLC-SEC 분석 결과를 사용하여 CompA 대조군(10 uM CompA-hMPV-his; 도 8A의 R1)과 비교하여 pbVLP 조립을 평가했다. 도 8A에 도시된 바와 같이. 표준 조립(R2) 및 2mL/분(R3) 또는 10mL/분(R4)에서 Ignite 미세유체 혼합 시스템에 의한 조립은 pbVLP를 산출했다.
또한 RSV 항원에 융합된 CompA(I53-50A)의 삼량체(CompA-RSV-02; 표 3에 나타낸 서열번호 61) 및 CompB-01 오량체(표 3에 나타낸 서열번호 63)로부터 pbVLP를 조립하기 위한 Ignite 시스템의 사용을 평가했다. 조립 반응은 CompA-RSV-02의 μm 스톡 용액과 CompB의 8 μm 스톡 용액으로부터 위에서 설명한 Ignite 미세유체 혼합 시스템을 사용하여 수행하였다. 첨가 및 혼합을 위해 피펫을 사용하여 1:1 부피비로 스톡 용액을 마이크로원심분리기 튜브에 첨가함으로써 표준 조립 반응을 수행하였다. VLP 조립 반응은 HPLC-SEC 분석에 의해 평가하였고 CompA 대조군(10uM CompA-RSV-02; 0.5mL 총 로딩 부피; 도 8B의 R9)과 비교하였다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 표준 조립(R10; 0.5mL 총 로딩 부피), 및 2mL/분(R11; 1.0mL 총 로딩 부피) 또는 10mL/분(R12; 1.0mL 총 로딩 부피)에서 Ignite 미세유체 혼합 시스템에 의한 조립은 조립된 VLP를 산출했다.
비교를 위해, pbVLP 조립은 간단한 혼합으로 평가하였다. 간략히 말해서, CompA-hMPV-his 또는 CompA-RSV-02의 10μM 스톡 용액을 피펫으로 CompB 오량체(I53-50B)의 8μM 용액에 1:1 부피로 첨가했다. 그런 다음, 용액을 회전 교반에 의해 혼합하고 분석 전에 2 시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 얻어지는 혼합물을 HPLC-SEC(Agilent Bio SEC-5 1000Å 컬럼; 0.4mL/분의 유속; 25mM NaPi + 300mM NaCl의 이동상, pH 6.6)로 평가하였다. 직경이 30nm인 AAV 캡시드인 표준, 단백질 표준물(티로글로불린(660kDa), IgG(150kDa), BSA(66kDa) 및 미오글로빈(17kDa))의 세트 및 각각의 CompA 단백질과의 비교를 수행하였다. 도 9A에 도시된 바와 같이. 단순 혼합은 양호한 수율 및 균일성을 갖는 CompA-RSV 융합을 위한 조립된 pbVLP를 제공하였다. 그러나 이 경우 도 9B에 도시된 바와 같이. CompA-hMPV-his + CompB의 단순 혼합은 상당한 양의 고분자량 응집체를 갖는 pbVLP 혼합물을 생성하였다. 단순 혼합(즉, 회전 교반을 통한 혼합과 함께 compA를 compB에 피펫으로 첨가)을 사용한 pbVLP 조립의 변화는 pbVLP 성분의 미세유체 혼합을 사용하여 회피된다.
종합하면, 이러한 데이터는 효율적인 pbVLP 조립은 미세유체 혼합 시스템을 사용하여 달성되고 스케일업 GMP 제조를 위한 접근 방식의 유용성을 나타낸다.
본 발명은 이의 제안된 특정 구현예와 관련하여 설명되었지만, 추가의 변경이 가능하고 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 조정을 커버하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 실시 또는 통상적인 실시 내에 있고 위에서 설명된 필수 특징에 적용될 수 있고 첨부된 청구범내에 속하는 본 개시로부터의 이러한 일탈을 포함하는 것으로 의도됨이 이해될 것이다.

Claims (59)

  1. 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 성분 A(compA) 단백질을 성분 B(compB) 단백질을 포함하는 용액에 첨가하여 compA:compB 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전단 응력을 최소화하는 조건은 상기 용액의 표면 아래의 상기 compB 단백질에 상기 compA 단백질을 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전단 응력을 최소화하는 조건은 기계적 혼합 없이 상기 용액을 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전단 응력을 최소화하는 조건은 교반 막대가 없이 상기 용액을 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전단 응력을 최소화하는 조건은 임펠러가 없이 없이 상기 용액을 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전단 응력을 최소화하는 조건은 회전 교반을 사용하여 상기 용액을 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전단 응력을 최소화하는 조건은 미세유체 혼합기를 사용하여 상기 용액을 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 compB 단백질에 compA 단백질을 과량으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건은, 선택적으로 compA 및 compB의 용액의 기계적 혼합에 비해 실질적인 침전이 없이 compA 및 compB의 혼합을 제공하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compA:compB 복합체는, 선택적으로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 것으로 총 단백질의 약 40% 이상인 양으로 형성되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 1,000 kDa 막 또는 이의 균등물을 이용하여 용액을 여과함으로써 과량의 compA, 과량의 compB, 및/또는 다른 불순물로부터 상기 compA:compB 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 1,000 kDa 막은 복합 재생 셀룰로오스(CRC) 막인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 1,000 kDa 막은 Ultracel® 1000 kDa 막 또는 이의 균등물인, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여과는 접선 흐름 여과(TFF)를 포함하는, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 약 80% 이상의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 소수성 막(예를 들어, Pellicon Biomax 1000 kDa), 부틸 대류 상호작용 매질(CIM) 컬럼, Captocore700 컬럼 또는 이의 균등물을 이용하여 상기 용액을 정제하는 것을 포함하지 않는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 연속적 또는 반-연속적 공정인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compA 단백질은 상기 첨가 단계 이전에 연속적으로 생성되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compB 단백질은 하나 이상의 냉동 배치로서 제공되는, 방법.
  20. (i) 제1 단백질을 포함하는 제1 유입 유체 스트림 및 제2 단백질을 포함하는 제2 유입 유체 스트림을 제공하고,
    (ii) 상기 제1 유입 유체 스트림을 상기 제2 유입 유체 스트림과 접촉시켜서 유출 스트림을 형성하고, 상기 유출 스트림에서 상기 제1 단백질과 제2 단백질의 혼합이 발생하도록 하여, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 단백질 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 나노구조체를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제1 유입 유체 스트림 및 제2 유입 유체 스트림은 3방향 구조에서 합류하여 상기 유출 스트림을 형성하고, 선택적으로 상기 3방향 구조는 T자형 또는 Y자형 구조인, 방법.
  22. 제20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 제1 유입 유체 스트림 및 제2 유입 유체 스트림은 미세유체 혼합기를 사용하여 합류되어 상기 유출 스트림을 형성하고, 선택적으로 상기 미세유체 혼합기는 Nanoassembler® Ignite™ 카트리지 또는 이의 임의의 균등물인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 미세유체 혼합기는 상기 제1 단백질과 제2 단백질의 혼합을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 수동식 혼합 구성요소를 포함하는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유출 스트림은 상기 제2 단백질의 몰 농도를 초과하는 몰 농도의 제1 단백질을 포함하는, 방법.
  25. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유출 스트림은 상기 제2 단백질의 몰 농도와 실질적으로 동일한 몰 농도의 제1 단백질을 포함하는, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질의 혼합은 상기 제1 단백질, 제2 단백질, 복합체, 또는 이들의 조합의 실질적인 침전이 없이 발생하는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는, 선택적으로 크기 배제 크로마토그래피로 측정한 것으로 총 단백질의 약 40% 이상의 양으로 형성되는, 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 1,000 kDa 막 또는 이의 균등물을 이용하여 상기 용액을 여과함으로써 과량의 제2 단백질 및/또는 다른 불순물로부터 상기 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 1,000 kDa 막은 복합 재생 셀룰로오스(CRC) 막인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 1,000 kDa 막은 Ultracel® 1000 kDa 막 또는 이의 균등물인, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여과는 접선 흐름 여과(TFF)를 포함하는, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제는 총 단백질의 중량 퍼센트를 기준으로 측정한 것으로 약 90% 이상의 순도를 갖는 compA:compB 복합체를 제공하는, 방법.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 소수성 막(예를 들어, Pellicon Biomax 1000 kDa), 부틸 대류 상호작용 매질(CIM) 컬럼, Captocore700 컬럼, 또는 이의 균등물을 이용하여 상기 용액을 정제하는 것을 포함하지 않는, 방법.
  34. 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 방법은 연속적 또는 반-연속적 공정인, 방법.
  35. 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 단백질은 상기 첨가 단계 이전에 연속적으로 생성되는, 방법.
  36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단백질은 하나 이상의 냉동 배치로서 제공되는, 방법.
  37. 제20항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 성분은 성분 A(compA)이고/이거나 상기 제1 성분은 성분 B(compB)인, 방법.
  38. 제1항 내지 제19항 또는 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compA는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 29 내지 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59 중 어느 하나와 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법.
  39. 제1항 내지 제19항 또는 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compB는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 28, 32 내지 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 및 58 중 어느 하나와 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제19항 또는 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compA 및 compB는 각각 하기 서열 중 어느 하나와 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법:
    (i) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2;
    (ii) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4;
    (iii) 각각 서열번호 3 및 서열번호 24;
    (iv) 각각 서열번호 23 및 서열번호 4;
    (v) 각각 서열번호 35 및 서열번호 36;
    (vi) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6;
    (vii) 각각 서열번호 5 및 서열번호 27;
    (viii) 각각 서열번호 5 및 서열번호 28;
    (ix) 각각 서열번호 25 및 서열번호 6;
    (x) 각각 서열번호 25 및 서열번호 27;
    (xi) 각각 서열번호 25 및 서열번호 28;
    (xii) 각각 서열번호 26 및 서열번호 6;
    (xiii) 각각 서열번호 26 및 서열번호 27;
    (xiv) 각각 서열번호 26 및 서열번호 28;
    (xv) 각각 서열번호 37 및 서열번호 38;
    (xvi) 각각 서열번호 7 및 서열번호 8;
    (xvii) 각각 서열번호 7 및 서열번호 32;
    (xviii) 각각 서열번호 7 및 서열번호 33;
    (xix) 각각 서열번호 7 및 서열번호 34;
    (xx) 각각 서열번호 29 및 서열번호 8;
    (xxi) 각각 서열번호 29 및 서열번호 32;
    (xxii) 각각 서열번호 29 및 서열번호 33;
    (xxiii) 각각 서열번호 29 및 서열번호 34;
    (xxiv) 각각 서열번호 30 및 서열번호 8;
    (xxv) 각각 서열번호 30 및 서열번호 32;
    (xxvi) 각각 서열번호 30 및 서열번호 33;
    (xxvii) 각각 서열번호 30 및 서열번호 34;
    (xxviii) 각각 서열번호 31 및 서열번호 8;
    (xxix) 각각 서열번호 31 및 서열번호 32;
    (xxx) 각각 서열번호 31 및 서열번호 33;
    (xxxi) 각각 서열번호 31 및 서열번호 34;
    (xxxii) 각각 서열번호 39 및 서열번호 40;
    (xxxiii) 각각 서열번호 9 및 서열번호 10;
    (xxxiv) 각각 서열번호 11 및 서열번호 12;
    (xxxv) 각각 서열번호 13 및 서열번호 14;
    (xxxvi) 각각 서열번호 15 및 서열번호 16;
    (xxxvii) 각각 서열번호 19 및 서열번호 20;
    (xxxviii) 각각 서열번호 21 및 서열번호 22;
    (xxxix) 각각 서열번호 23 및 서열번호 24;
    (xl) 각각 서열번호 41 및 서열번호 42;
    (xli) 각각 서열번호 43 및 서열번호 44;
    (xlii) 각각 서열번호 45 및 서열번호 46;
    (xliii) 각각 서열번호 47 및 서열번호 48;
    (xliv) 각각 서열번호 49 및 서열번호 50;
    (xlv) 각각 서열번호 51 및 서열번호 44;
    (xlvi) 각각 서열번호 53 및 서열번호 52;
    (xlvii) 각각 서열번호 55 및 서열번호 54;
    (xlviii) 각각 서열번호 57 및 서열번호 56; 및
    (xlix) 각각 서열번호 59 및 서열번호 58.
  41. 제1항 내지 제19항 또는 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compA 단백질은, 선택적으로 링커를 통해 항원 단백질에 연결되어 융합 단백질을 형성하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 HIV Env, RSV F, EBV gp350, CMV gB, CMV UL128, CMV UL130, CMV UL131A,CMV gH, CMV gL, Lyme OspA, Pertussis 독소, Dengue E, SARS S, MERS S, Zaire 에볼라바이러스 GP, Sudan 에볼라바이러스 GP, Marburg 바이러스 GP, Hanta 바이러스 Gn, Hanta 바이러스 Gc, HepB 표면 항원, Measles H, Zika 외피 도메인 III, Malaria CSP, Malaria Pfs25, Nipah 바이러스 F, Nipah 바이러스 G, Rotavirus VP4, Rotavirus VP8*, hMPV F, hMPV G, PV F, PV HN, MenB fHbp, MenB NadA, 코로나바이러스 S 단백질, 코로나바이러스 RBD, 및 MenB NHBA로부터 선택되는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 파라믹소바이러스 및/또는 페뉴모바이러스 F 단백질 또는 이의 항원성 단편, 선택적으로 호흡기 합포체 바이러스(RSV) F 단백질 또는 이의 항원성 단편, 또는 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 서열번호 64 내지 136 및 206 내지 209로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
  45. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 compA 단백질은 펩티드 링커를 통해 항원 단백질에 연결되어 있는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 Gly-Ser 링커이고, 선택적으로 상기 Gly-Ser 링커는 서열번호 213 내지 215 중 어느 하나인, 방법.
  47. 제41항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 137 내지 205로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  48. 나노구조체를 제조하는 방법으로서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 융합 단백질을 성분 B(compB) 단백질을 포함하는 용액에 첨가하여 compA:compB 복합체를 형성하는 것을 포함하고, 상기 융합 단백질은 항원성 단백질에 연결된 compA 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  49. 나노구조체를 제조하는 방법으로서, 전단 응력을 최소화하는 조건하에서 융합단백질을 성분 B(compB) 단백질을 포함하는 용액에 첨가하여 compA:compB 복합체를 형성하는 것을 포함하고, 상기 융합 단백질은 항원성 단백질에 연결된 compA 단백질을 포함하고, 상기 융합 잔백질은 서열번호 137 내지 205로부터 선택된 폴리펩티드와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  50. 제1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 정20면체 대칭을 갖는, 방법.
  51. 제1항 내지 제 49항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 복합체.
  52. 제51항의 복합체 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  53. 제51항의 복합체를 포함하는 백신.
  54. 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제51항의 복합체, 제52항의 약학적 조성물, 또는 제53항의 백신을 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 바이러스 감염인, 방법.
  56. 면역 반응의 생성을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 제51항의 복합체, 제52항의 약학적 조성물, 또는 제53항의 백신을 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제51항의 복합체, 제52항의 약학적 조성물, 또는 제53항의 백신을 포함하는 키트.
  58. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 또는 약제로서의 제51항의 복합체, 제52항의 약학적 조성물, 또는 제53항의 백신의 용도.
  59. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 또는 약제로서의 제51항의 복합체, 제52항의 약학적 조성물, 또는 제53항의 백신.
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