KR20230037562A - 푸르니에렐라 마실리엔시스를 사용하여 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

푸르니에렐라 마실리엔시스를 사용하여 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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알리시아 발로크
로이스 프란시스코-앤더슨
케빈 후인
발레리아 크라비츠
오드리 맥브라이드
타일러 롬멜
마리아 시조바
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에벨로 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

치료제로서 유용한 푸르니에렐라 마실리엔시스의 박테리아 및 미생물 세포외 소포(mEV)와 관련된 방법 및 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다.

Description

푸르니에렐라 마실리엔시스를 사용하여 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2020년 8월 24일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 제63/069,434호, 2020년 10월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 제63/104,791호, 및 2020년 6월 11일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 제63/037,878호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
질환 또는 건강 장애(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세균불균형 및/또는 대사성 질환)의 치료 및/또는 예방에서 푸르니에렐라 마실리엔시스(Fournierella massiliensis) 박테리아 및/또는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터의 미생물 세포외 소포(mEV)의 사용과 관련된 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 개시된 바와 같이, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터 수득된 특정 유형의 mEV, 예컨대 분비된 미생물 세포외 소포(smEV) 또는 가공된 미생물 세포외 소포(pmEV)는 치료 효과를 가지며, 질환 또는 건강 장애(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세균불균형 및/또는 대사성 질환)의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아(예를 들어, 살아있는 박테리아, 사멸된 박테리아, 약독화된 박테리아)를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 pmEV를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 pmEV를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 pmEV를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV, 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 pmEV를 포함한다.
mEV를 포함하는 약제학적 조성물은 smEV, pmEV 또는 이 둘의 조합을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함하고, mEV는 고수율 균주로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 고수율 균주는 생물반응기-재배 배양물로부터 리터당 적어도 3x1013 mEV를 생성한다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 게놈 서열, 16S 서열, 및/또는 CRISPR 서열)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다(ATCC 수탁 번호 PTA-126696).
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주는 서열번호 1에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 16S 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A) 전체 박테리아의 적어도 1 x 106, 1 x 107, 또는 1 x 108 콜로니 형성 단위(CFU)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A) 전체 박테리아의 (예를 들어, 총 세포 수(TCC)에 의해 결정된 바와 같이) 1 x 106 내지 1 x 1012 총 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A) 전체 박테리아의 (예를 들어, 총 세포 수(TCC)에 의해 결정된 바와 같이) 적어도 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 또는 1 x 1012 총 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 전체 박테리아는 살아있거나, 사멸되거나, 약독화되거나, 동결건조되거나, 또는 조사될(예를 들어, UV 또는 감마 조사될) 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 분비된 mEV(smEV)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 가공된 mEV(pmEV)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 pmEV를 포함하고, pmEV는 살아있는 박테리아로부터 생성된다. 일부 구현예에서, pmEV는 사멸된 박테리아로부터 생성된다. 일부 구현예에서, pmEV는 감마선 조사, UV 조사, 열 비활성화, 산처리, 또는 산소 살포된 박테리아로부터 생성된다. 일부 구현예에서, pmEV는 비-복제 박테리아로부터 생성된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 동결건조된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함한다(예를 들어, 동결건조된 생성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다). 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 감마 조사된다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 UV 조사된다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 (예를 들어, 50℃에서 2시간 동안 또는 90℃에서 2시간 동안) 열 비활성화된다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 산 처리된다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 (예를 들어, 2시간 동안 0.1 vvm으로) 산소 살포된다.
일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 예를 들어, 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이, 20~200 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 예를 들어, 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이, 50~150 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 예를 들어, 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이, 75~125 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 예를 들어, 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이, 약 90 nm(예를 들어, 약 88 nm)의 평균 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자(예를 들어, 입자 수는 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨)의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)의 용량은 NTA에 의해 측정된 바와 같이, 약 1x107 내지 약 1x1015개 입자이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 5 mg 내지 약 900 mg 총 단백질(예를 들어, 총 단백질은 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정됨)의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)의 용량을 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 미생물 세포외 소포체(mEV, 예컨대 smEV 및 pmEV) 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 smEV를 포함하고, smEV는 살아있는 박테리아로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 smEV를 포함하고, smEV는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 고수율 균주로부터 생성된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 smEV를 포함하고, smEV는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 한 균주로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 mEV를 포함하고, mEV는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 한 균주로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)인, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 입자인, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)인, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 단백질인, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)인, 약제학적 조성물 내 총 지질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 지질인, 약제학적 조성물 내 총 지질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 smEV를 포함하고, smEV는 살아있는 박테리아로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 smEV를 포함하고, smEV는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 고수율 균주로부터 생성된다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본원에 제공된 약제학적 조성물은 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다 일부 구현예에서, 질환은 면역 장애, 염증성 장애(예를 들어, 피부염), 암(예를 들어, 결장직장암), 세균불균형, 또는 대사성 장애이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세균불균형이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 장애(예를 들어, 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기)가 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대사성 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 용량을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 2회 용량으로 제형화되며, 여기서 각각의 용량은 1일 용량의 절반이다.
바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 선천성 항원 제시 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 예를 들어 경구 투여되는 경우, 위장관 외부의 하나 이상의 유익한 면역 효과를 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어 경구 투여되는 경우, 대상체의 위장관 외부의 면역 효과를 조절한다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구, 직장, 설하, 국소, 피내, 복강내 또는 피하 투여용으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 분말(예를 들어, 재현탁용) 또는 고체 투여 형태, 예컨대 정제, 미니정제, 캡슐, 환제, 또는 분말; 또는 이러한 형태의 조합(예를 들어, 캡슐에 포함된 미니정제)으로서 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 동결건조된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 동결건조된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합은 정제, 미니정제, 캡슐, 환제, 또는 분말과 같은 고형 투여 형태(선택적으로 장용 코팅 포함)로 제형화될 수 있거나; 용액(선택적으로 약제학적 부형제(예를 들어, 수크로스 또는 글루코스)를 추가로 포함함)에 현탁될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 감마 조사된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 감마 조사된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합은 정제, 미니정제, 캡슐, 환제, 또는 분말과 같은 고형 투여 형태(선택적으로 장용 코팅 포함)로 제형화될 수 있거나; 용액(선택적으로 약제학적 부형제(예를 들어, 수크로스 또는 글루코스)를 추가로 포함함)에 현탁될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 국소로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어, 종양이 있는 대상체에게 종양내 또는 종양하 투여될 수 있다.
특정 양태에서, 질환의 치료 및/또는 예방에 유용한 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 제조하고/하거나 식별하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아 또는 이들의 임의의 조합은 (예를 들어, 지질다당류(LPS) 제거 또는 결실에 의한) 감소된 독성 및 부작용, (예를 들어, 내산성, 점막 부착 및/또는 담즙산에 대한 침투 및/또는 내성, 항미생물 펩타이드 및/또는 항체 중화에 대한 내성을 개선시킴으로써) 개선된 경구 전달, 원하는 세포 유형의 표적화(예를 들어, M-세포, 고블렛 세포, 장세포, 수지상 세포, 대식세포), 전신적으로 또는 적절한 틈새(예를 들어, 장간막 림프절, Peyer의 패치, 고유판, 종양 배액 림프절 및/또는 혈액)에서 개선된 생체이용률, 개선된 면역조절 및/또는 치료 효과(예를 들어, 단독으로 또는 또 다른 치료제와 함께), 개선된 면역 활성화 및/또는 제조 속성(예를 들어, 성장 특성, 수율, 더 큰 안정성, 개선된 동결-해동 내성, 더 짧은 세대 시간)과 같은 특정 바람직한 특성들에 기초하여 선택된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터 수득된다.
일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 특정 바람직한 특성을 향상시키기 위해 변형된 조작된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 조작된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 그로부터 생성된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 약제학적 조성물을 위한 박테리아 또는 이들의 임의의 조합이 (예를 들어, 지질다당류(LPS) 제거 또는 결실에 의한) 감소된 독성 및 부작용, (예를 들어, 내산성, 점막 부착 및/또는 담즙산에 대한 침투 및/또는 내성, 항미생물 펩타이드 및/또는 항체 중화에 대한 내성을 개선시킴으로써) 개선된 경구 전달, 원하는 세포 유형의 표적화(예를 들어, M-세포, 고블렛 세포, 장세포, 수지상 세포, 대식세포), 전신적으로 또는 적절한 틈새(예를 들어, 장간막 림프절, Peyer의 패치, 고유판, 종양 배액 림프절 및/또는 혈액)에서 개선된 생체이용률, 개선된 면역조절 및/또는 치료 효과(예를 들어, 단독으로 또는 또 다른 치료제와 함께), 개선된 면역 활성화 및/또는 개선된 제조 속성(예를 들어, 성장 특성, 수율, 더 큰 안정성, 개선된 동결-해동 내성, 더 짧은 세대 시간)을 가지도록 변형된다. 일부 구현예에서, 이러한 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 양태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 병태, 예를 들어, 암, 면역 장애, 대사성 질환, 신경계 질환, 또는 세균불균형의 치료(또는 예방)용 약제를 제조하기 위한 본원에 기재된 약제학적 조성물의 용도가 본원에 제공된다.
특정 양태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 병태, 예를 들어, 암, 면역 장애, 염증성 질환, 대사성 질환, 신경계 질환, 또는 세균불균형의 치료(또는 예방)에 사용하기 위한 본원에 기재된 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
특정 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)를 치료하는 데 본원에 기재된 약제학적 조성물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 대상체의 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 적어도 하나의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 약제학적 조성물의 용도는 대상체의 질환을 치료하거나 예방하기 위한 것이다. 질환의 비-제한적인 예에는 면역 장애(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 대사성 질환), 염증성 장애(예를 들어, 피부염), 암(예를 들어, 결장직장암), 또는 세균불균형이 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 용량을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 2회 용량으로 제형화되며, 여기서 각각의 용량은 1일 용량의 절반이다.
특정 구현예에서, 대상체의 종양 미세환경(TME)에서 IFNγ 및/또는 TNF 생성 CD8+ CTL, NK 세포, NKT 세포 및/또는 CD4+ 세포의 백분율을 증가시키는(예를 들어, 약제학적 조성물의 부재 하의 백분율과 비교하여 증가시키는) 방법으로서, 본원에 제공된 약제학적 조성물(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A mEV, 예를 들어, smEV를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 종양 침윤 CD8 T 세포, CD4 T세포, NK 세포 및 NK T 세포의 수를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 DC1 및/또는 DC2 하위세트의 활성화를 증가시키고/시키거나 IP-10 및/또는 TNFa 발현을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 대상체의 종양-침윤 수지상 세포(DC1 및/또는 DC2)를 증가시키는(예를 들어, 약제학적 조성물의 부재하의 양과 비교하여 증가시키는) 방법으로서, 본원에 제공된 약제학적 조성물(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A mEV, 예를 들어, smEV를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 대상체의 IP-10 및/또는 IFNγ 생성(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질 수준)을 증가시키는(예를 들어, 약제학적 조성물의 부재하의 양과 비교하여 증가시키는) 방법으로서, 본원에 제공된 약제학적 조성물(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A mEV, 예를 들어, smEV를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물의 방법 또는 용도는 추가 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 항생제이다. 일부 구현예에서, 방법 또는 용도는 대상체에게 하나 이상의 다른 암 요법(예를 들어, 종양의 외과적 제거; 화학요법제의 투여, 방사선 요법, 및/또는 면역관문 억제제, 암-특이적 항체, 암 백신, 프라이밍된 항원 제시 세포, 암-특이적 T 세포, 암-특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, 면역 활성화 단백질 및/또는 보조제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 면역요법)을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 용도는 하나 이상의 다른 박테리아 균주(예를 들어, 치료 박테리아)로부터의 또 다른 치료 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 면역 억제제 및/또는 항염증제의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대사성 질환 치료제의 투여를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 현탁액으로 제조하는 방법이 본원에 추가로 제공되며, 상기 방법은 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을, 약제학적으로 허용 가능한 완충액(예를 들어, PBS)과 조합하여; 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁액은 수크로스 또는 글루코스를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV, 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 약제학적으로 허용 가능한 완충액과 조합된 건조 형태(예를 들어, 분말)로 포함된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV, 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 약제학적으로 허용 가능한 완충액과 조합된 습윤 형태(예를 들어, 바이오매스 또는 펠릿 또는 다른 액체)로 포함된다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 고형물 투여 형태로 제조하는 방법이 본원에 또한 제공되며, 상기 방법은 (a) 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을, 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합하는 단계, 및 (b) 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합; 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 압축하여, 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 고형물 투여 형태를 장용 코팅하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 메가스파에라 종( Megasphaera sp .) mEV, 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합된 건조 형태(예를 들어, 분말)로 포함된다.
본원에 제공된 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 전달할 수 있다. 이와 유사하게, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합의 비-천연 양을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 전달할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 질환 또는 건강 장애를 치료하고/하거나 예방하는 것과 같이 대상체(예를 들어, 인간)에게 이득을 가져올 수 있다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 암의 CT26 전임상 모델에서의 종양 성장을 감소시킨다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 염증의 DTH(지연형 과민증) 전임상 모델의 귀 두께를 감소시킨다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 PMA-분화된 U937 세포로부터의 사이토카인 생산을 유도한다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 약제학적 조성물은 (예를 들어, 블랭크 대조군과 비교하여) IL-10; TNF-α; IL-6; IP-10; 및 IL-1β 중 하나 이상의 생산을 유도한다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 TLR2 수용체의 관여를 유도한다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 TME(종양 미세환경)에서 IFNg 생성 CD8+ CTL, NK 세포, NKT 세포 및 CD4+ 세포의 백분율을 증가시킨다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 종양-침윤 수지상 세포(DC1 및 DC2)를 증가시킨다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 IP-10의 생성을 증가시킨다.
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 박테리아, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 NOD2를 자극한다.
도 1은 22일째에 마우스 결장직장 암종 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클과 비교된 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 2는 일정 기간 동안 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 3은 23일째에 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 4는 일정 기간 동안 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 5는 21일째에 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 6은 일정 기간 동안 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 7은 22일째에 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 경구 전달된 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 8은 22일째에 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 소규모 배치 공정(M) 대 대규모 공정(F. 또는 Ferm.)으로부터 생성된 경구 전달된 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 9는 22일째에 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 효능과 비교되는 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV + 항-PD1의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 10은 24일째에 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A 전체 박테리아의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 11은 일정 기간 동안 마우스 결장직장암 모델에서 복강내(i.p.) 투여된 항-PD-1 또는 비히클의 효능과 비교하여, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A 전체 박테리아의 효능을 나타낸다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다.
도 12는 KLH-기반 지연형 과민 모델에서 항원 시험감염 후 비히클(음성 대조군) 및 덱사메타손(양성 대조군)과 비교하여 24시간에 항원-특이적 귀 종창(귀 두께)을 감소시키는 데 있어서, 2E+11 및 2E+07(용량당 입자 기준)의 2가지 용량으로 경구 투여된 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 효능을 나타낸다.
도 13은 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV가 PMA-분화된 U937 세포로부터의 사이토카인 생산을 유도한다는 것을 나타낸다. U937 세포는 1x106~1x109 농도의 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV와 TLR2(FSL) 및 TLR4(LPS) 작용제 대조군으로 24시간 처리되고, 사이토카인 생산이 측정되었다. 이 균주 smEV의 낮은 농도에서 보이는 강한 효과를 주목한다. "블랭크"는 배지 대조군을 나타낸다.
도 14는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV가 PMA-분화된 U937 세포로부터의 사이토카인 생산을 유도한다는 것을 나타낸다. U937 세포는 1x105~1x106 농도의 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A 전체 박테리아와 TLR2(FSL) 및 TLR4(LPS) 작용제 대조군으로 24시간 처리되고, 사이토카인 생산이 측정되었다. "블랭크"는 배지 대조군을 나타낸다.
도 15a는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV, 항-PD1 또는 비히클로 경구 처리된 마우스로부터의 11일차의 종양 소화물의 데이터를 나타낸다. CD8 T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포 및 CD4 T 세포 IFNg 생산을 평가하기 위해 유세포분석이 사용되었다.
도 15b는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV, 항-PD1 또는 비히클로 경구 처리된 마우스로부터의 11일차의 종양 소화물의 데이터를 나타낸다. 침윤 수지상 세포(DC) 하위집합을 평가하기 위해 유세포분석이 사용되었다.
도 15c는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV, 항-PD1 또는 비히클로 경구 처리된 마우스로부터의 11일차의 종양 소화물의 데이터를 나타낸다. 종양 미세환경(TME) 내에서 수반되는 IP-10 생성을 검출하기 위해 중간 규모 발견(MSD) 분석이 사용되었다.
도 16은 푸르니에렐라 마실리엔시스(F. massiliensis) smEV("smEV")에 대한 반응으로 U937 세포로부터의 IL-6, TNF-α 및 IL-10 방출을 유도하기 위해 TLR2/6 신호전달이 필요함을 나타낸다. 세포는 항-TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 또는 이소형 대조군 항체를 갖거나 갖지 않는, 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV로 처리되었다. 사이토카인 수준(pg/ml)은 MSD로 측정되었다.
도 17은 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV가 HEK293-SEAP 리포터 세포 검정 시스템에서 인간 TLR2 작용제 활성을 가짐을 나타낸다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 6개 배치가 테스트되었다.
도 18은 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV가 HEK293-SEAP 리포터 세포 검정 시스템에서 인간 NOD2를 고용량으로 자극함을 나타낸다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 6개 배치가 테스트되었다.
클로스트리디아 (Clostridia) 강에 속하는 오실로스피라세애 (Oscillospiraceae) 과의 미생물은 척추동물의 공생 유기체이다. 흥미롭게도, 단배엽(일반적으로 그람 양성으로 설명됨) 미생물임에도 불구하고 그들은 그람 음성으로 염색된다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아가 상업적으로 사용하기에 충분한 수율로 smEV를 생산할 수 있는지 여부에 관한 조사가 본원에 개시되어 있으며, 다른 그람-양성 유기체에 비해 이 과의 구성원은 높은 수준의 smEV를 생산함이 밝혀졌다. 이것은 그람-음성 유기체가 전형적으로 더 많은 수의 smEV를 생산하기 때문에 현장 내 smEV 생산에 대한 기존의 이해를 무시한다. 푸르니에렐라 마실리엔시스를 포함한 오실로스피라세애 ( Oscillospiraceae) 과 미생물은 일반적으로 단리 및 성장이 어렵기 때문에, 따라서 이 과의 smEV에 대한 이전의 조사는 제한적이었다. 본원의 조사로부터, 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV는 시험관내 공동배양에서 독특한 사이토카인 반응을 이끌어낸다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 [예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A]로부터의 smEV는 염증과 암의 동물 모델에서 높은 효능과 효과를 입증하였다. 질환 또는 건강 장애(예를 들어, 불리한 건강 장애)(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세균불균형 또는 대사성 질환)의 치료 및/또는 예방에서 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 및 이의 유도체(예를 들어, mEV, 예컨대 smEV 및/또는 pmEV)의 용도에 관한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
smEV 생산을 위한 고수율 기준: 생물반응기-성장 배양물로부터의 리터당 3x1013의 미정제 mEV 수율은 균주에 대한 "고수율" 지정의 최소 임계값이며, 이는 생산을 위해 합리적으로 확장할 수 있는 수준에서 smEV를 생산하는 참조 균주의 미정제 smEV 수율과 상기 수치의 차이가 10배 이내였기 때문이다.
[표 1]
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정의
"보조제" 또는 "보조제 요법"은 환자 또는 대상체(예를 들어, 인간)에서 면역학적 또는 생리학적 반응에 영향을 미치는 제제를 광범위하게 지칭한다. 예를 들어, 보조제는 시간이 지남에 따라 또는 종양과 같은 관심 영역으로 항원의 존재를 증가시키고, 항원 제시 세포 항원의 흡수를 돕고, 대식세포와 림프구를 활성화하고, 사이토카인 생성을 지원할 수 있다. 면역 반응을 변화시킴으로써, 보조제는 면역 상호작용제의 특정 용량의 효과 또는 안전성을 증가시키기 위해 더 적은 용량의 면역 상호작용제를 허용할 수 있다. 예를 들어, 보조제는 T 세포 고갈을 방지하여, 특정 면역 상호작용제의 효과 또는 안전성을 증가시킬 수 있다.
"투여"는 대상체에게 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 투여하는 경로를 광범위하게 지칭한다. 투여 경로의 예는 경구 투여, 직장 투여, 국소 투여, 흡입(비강) 또는 주사를 포함한다. 주사 투여는 정맥내(IV), 근육내(IM), 종양내(IT) 및 피하(SC) 투여를 포함한다. 본원에 기재된 약제학적 조성물은 종양내, 경구, 비경구, 장내, 정맥내, 복강내, 국소, 경피(예를 들어, 임의의 표준 패치 사용), 피내, 안과, 비강(내), 국소, 비구강, 예컨대 에어로졸, 흡입, 피하, 근육내, 협측, 설하, (경)직장, 질, 동맥내 및 척추강내, 경점막(예를 들어, 설하, 설측, (경)협측, (경)요도, 질(예를 들어, 경질 및 질주위)), 이식, 방광내, 폐내, 십이지장내, 위내, 및 기관지내를 포함하는(이에 한정되지 않음) 임의의 효과적인 경로에 의해 임의의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구, 직장, 종양내, 국소, 방광내, 배수 림프절 내로 또는 이에 인접하여 주사에 의해, 정맥내, 흡입 또는 에어로졸에 의해, 또는 피하 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구, 종양내, 또는 정맥내 투여된다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 온전한 항체 및 그의 항원 결합 단편 둘 다를 지칭할 수 있다. 온전한 항체는 이황화 결합으로 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는, 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 용어 "항체"는 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 단일-사슬 항체 및 항원-결합 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 항체의 "항원 결합 단편" 및 "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 이황화 결합 Fv, Fd, 디아바디, 단일-사슬 항체, NANOBODIES®, 단리된 CDRH3, 및 온전한 항체의 가변 영역의 적어도 일부를 보유하는 다른 항체 단편을 포함한다. 이들 항체 단편은 통상적인 재조합 및/또는 효소적 기술을 사용하여 수득될 수 있고, 온전한 항체와 동일한 방식으로 항원 결합에 대해 스크리닝될 수 있다.
"암"은 광범위하게, 주변 조직의 침입 및 잠재적으로 숙주의 비정상적인 세포 성장의 초기 부위 원위부 조직의 침입으로 이어지는 숙주 자신의 세포의 통제되지 않은 비정상적인 성장을 의미한다. 주요 부류에는 상피 조직(예를 들어, 피부, 편평 세포)의 암인 암종; 결합 조직(예를 들어, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관 등)의 암인 육종; 혈액 형성 조직(예를 들어, 골수 조직)의 암인 백혈병; 면역 세포의 암인 림프종 및 골수종; 및 뇌 및 척추 조직으로부터의 암을 포함하는 중추 신경계 암이 포함된다. "암(들) 및" "신생물(들)""은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "암"은 신규 또는 재발 여부에 관계없이 백혈병, 암종, 및 육종을 포함하는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양을 지칭한다. 암의 구체적인 예는: 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 및 혼합형 종양이다. 암의 비제한적 예는 뇌, 흑색종, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 두경부, 신장, 폐, 비소세포 폐, 중피종, 난소, 전립선, 육종, 위, 자궁 및 수모세포종의 신규 또는 재발 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 전이를 포함한다.
"탄수화물"은 당 또는 당의 중합체를 지칭한다. 용어 "당류," "다당류," "탄수화물," 및 "올리고당류"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 대부분의 탄수화물은 일반적으로 분자의 각 탄소 원자에 하나씩 많은 하이드록실기를 가진 알데하이드 또는 케톤이다. 탄수화물은 일반적으로 분자식 CnH2nOn을 갖는다. 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 또는 다당류일 수 있다. 가장 기본적인 탄수화물은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 리보스, 아라비노스, 자일로스, 및 프룩토스와 같은 단당류이다. 이당류는 2개의 결합된 단당류이다. 예시적인 이당류는 수크로스, 말토스, 셀로비오스 및 락토스를 포함한다. 전형적으로, 올리고당류는 3 내지 6개의 단당류 단위(예를 들어, 라피노스, 스타키오스)를 포함하고, 다당류는 6개 이상의 단당류 단위를 포함한다. 예시적인 다당류는 전분, 글리코겐 및 셀룰로스를 포함한다. 탄수화물은 하이드록실기가 제거된 2'-데옥시리보스, 하이드록실기가 불소로 대체된 2'-플루오로리보스, 또는 질소 함유 형태의 글루코스(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 데옥시리보스 및 헥소스)인 N-아세틸글루코사민과 같은 변형된 당류 단위를 함유할 수 있다. 탄수화물은 많은 다른 형태, 예를 들어, 콘포머, 환형 형태, 비환형 형태, 입체 이성질체, 호변 이성질체, 아노머 및 이성질체로 존재할 수 있다.
"세포 증강"은 조성물의 투여 전에 환경에 실질적으로 존재하지 않고 조성물 자체에는 존재하지 않는, 환경에서의 세포의 유입 또는 세포의 확장을 광범위하게 지칭한다. 환경을 증강시키는 세포에는 면역 세포, 기질 세포, 박테리아 및 균류 세포가 포함된다. 특히 관심 있는 환경은 암세포가 상주하거나 위치하는 미세환경이다. 일부 예에서, 미세환경은 종양 미세환경 또는 종양 배수 림프절이다. 다른 예에서, 미세환경은 전암성 조직 부위 또는 조성물의 국소 투여 부위 또는 원격 투여 후 조성물이 축적될 부위이다.
"분기군(clade)"은 계통수(phylogenetic tree)에서 통계적으로 유효한 노드의 다운스트림에 있는 계통수의 OTU 또는 구성원을 지칭한다. 분기군은 계통수에 있는 일련의 말단 잎으로 구성되며, 이는 별개의 단일계통 진화 단위이며, 어느 정도 서열 유사성을 공유한다.
둘 이상의 미생물 균주로부터 유래된 전체 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)의 "조합"은 동일한 물질 또는 생성물 또는 물리적으로 연결된 생성물에서의, 전체 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)가 얻어지는 미생물의 물리적 공존, 뿐만 아니라 두 균주로부터 유래된 전체 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)의 시간적 공동-투여 또는 공동-국재화를 포함한다.
용어 "감소" 또는 "고갈"은 치료 전 상태와 비교할 때 치료 후 차이가 상황에 따라 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1/100, 1/1000, 1/10,000, 1/100,000, 1/1,000,000이거나 검출할 수 없게 되는 변화를 의미한다. 감소될 수 있는 특성에는 면역 세포, 박테리아 세포, 기질 세포, 골수 유래 억제 세포, 섬유아세포, 대사 산물의 수; 사이토카인 수준; 또는 또 다른 물리적 매개변수(예컨대, 귀 두께(예를 들어, DTH 동물 모델) 또는 종양 크기(예를 들어, 동물 종양 모델))가 포함된다.
"세균불균형"은 예를 들어 점막 또는 피부 표면(또는 임의의 다른 미생물군집 틈새)을 포함하는 장 또는 기타 신체 영역의 미생물군 또는 미생물군집의 상태를 지칭하며, 여기서 숙주 장내 미생물군집 생태 네트워크("미생물군집")의 정상적인 다양성 및/또는 기능이 파괴된다 세균불균형의 상태는 질병 상태를 초래할 수 있거나, 특정 조건에서만 또는 장기간 존재하는 경우에만 건강에 해로울 수 있다. 세균불균형은 환경 요인, 감염원, 숙주 유전자형, 숙주 식이, 및/또는 스트레스를 포함한 다양한 요인으로 인한 것일 수 있다. 세균불균형은 하기를 초래할 수 있다: 하나 이상의 박테리아 유형(예를 들어, 혐기성), 종 및/또는 균주의 유병률 변화(예를 들어, 증가 또는 감소), 숙주 미생물군집 군집체 조성의 다양성 변화(예를 들어, 증가 또는 감소); 하나 이상의 유익한 효과의 감소 또는 손실을 초래하는 하나 이상의 공생 유기체 집단의 변화(예를 들어, 증가 또는 감소); 하나 이상의 병원체 집단(예를 들어, 병원성 박테리아)의 과성장; 및/또는 특정 조건이 존재할 때만 질병을 일으키는 공생 유기체의 존재 및/또는 과성장.
용어 "생태학적 컨소시엄"은 개선된 효능을 위해 상보적인 숙주 경로를 활성화화여 숙주 시너지를 유도하는 2개의 박테리아와 대조적으로, 대사산물을 교환하고 서로 양성적으로 공동조절하는 박테리아 그룹이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조작된 박테리아"는 인간 활동에 의해 자연 상태로부터 유전적으로 변경된 임의의 박테리아 및 이러한 박테리아의 자손이다. 조작된 박테리아에는 예를 들어 표적화된 유전자 변형의 산물, 무작위 돌연변이유발 스크리닝의 산물, 및 유도 진화의 산물이 포함된다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성된다. 특정 에피토프는 항체가 결합할 수 있는 아미노산의 특정 서열에 의해 정의될 수 있다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 지칭하기 위해 광범위하게 사용된다. 용어 "유전자"는 특정 게놈 서열뿐만 아니라 해당 게놈 서열에 의해 암호화된 cDNA 또는 mRNA에도 적용된다.
2개의 핵산 분자의 핵산 서열 사이의 "동일성"은 예를 들어, 문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에서와 같이, 예를 들어 기본 매개변수를 사용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 알려진 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 동일성의 백분율로 결정될 수 있다(다른 프로그램으로는 GCG 프로그램 패키지가 있음(문헌[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)]), BLASTP, BLASTN, FASTA [Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403(1990)]; [Guide to Huge Computers, Mrtin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994], 및 [Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073]). 예를 들어, 국립 생명공학 정보 센터 데이터베이스의 BLAST 기능을 사용하여 신원을 확인할 수 있다. 기타 상업적으로 또는 공개적으로 이용 가능한 프로그램에는 DNAStar "MegAlign" 프로그램(위스콘신주 매디슨) 및 위스콘신 대학교 유전학 컴퓨터 그룹(UWG) "갭" 프로그램(위스콘신주 매디슨)이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "면역 장애"는 자가면역 질환, 염증성 질환 및 알레르기를 포함하는, 면역계의 활성에 의해 야기되는 임의의 질환, 장애 또는 질환 증상을 지칭한다. 면역 장애는 자가면역 질환(예를 들어, 건선, 아토피성 피부염, 루푸스, 경피증, 용혈성 빈혈, 혈관염, 제1형 당뇨병, 그레이브병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 굿파스처 증후군, 악성 빈혈, 및/또는 근병증), 염증성 질환(예를 들어, 심상성 여드름, 천식, 체강 질환, 만성 전립선염, 사구체신염, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 이식 거부반응, 혈관염, 및/또는 간질성 방광염), 및/또는 알레르기(예를 들어, 음식 알레르기, 약물 알레르기, 및/또는 환경 알레르기)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"면역요법"은 질환(예를 들어, 면역 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 암)을 치료하기 위해 대상체의 면역계를 사용하는 치료법이며, 예를 들어 관문 억제제, 암 백신, 사이토카인, 세포 요법, CAR-T 세포, 및 수지상 세포 요법을 포함한다.
용어 "증가"는 치료 전 상태와 비교할 때 치료 후 차이가 상황에 따라 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 4배, 10배, 100배, 10^3배, 10^4배, 10^5배, 10^6배, 및/또는 10^7배 더 크게 되는 변화를 의미한다. 증가될 수 있는 특성에는 면역 세포, 박테리아 세포, 기질 세포, 골수 유래 억제 세포, 섬유아세포, 대사 산물의 수; 사이토카인 수준; 또는 또 다른 물리적 매개변수(예컨대, (예를 들어, DTH 동물 모델의) 귀 두께 또는 (예를 들어, 동물 종양 모델의) 종양 크기가 포함된다.
"선천성 면역 작용제" 또는 "면역 보조제"는 톨-유사 수용체(Toll-Like Receptors, TLR), NOD 수용체, RLR, C-형 렉틴 수용체, STING-cGAS 경로 구성요소, 인플라마좀 복합체를 비롯한 선천성 면역 수용체를 특이적으로 표적으로 하는 소분자, 단백질 또는 기타 제제이다. 예를 들어, LPS는 박테리아 유래 또는 합성된 TLR-4 작용제이며, 알루미늄은 면역 자극 보조제로 사용될 수 있다. 면역-보조제는 보다 광범위한 보조제 또는 보조제 요법의 특정 부류이다. STING 작용제의 예는 2'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-AMP, c-di-GMP, 2'2'-cGAMP, 및 2'3'-cGAM(PS)2(Rp/Sp)(2'3'-cGAMP의 비스-포스포로티오에이트 유사체의 Rp, Sp-이성질체)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. TLR 작용제의 예는 TLRl, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLRlO, 및 TLRI l을 포함하나 이에 한정되지 않는다. NOD 작용제의 예는 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(무라밀디펩티드(MDP)), 감마-D-글루타밀-메소-디아미노피멜산(iE-DAP), 및 데스무라밀펩티드(DMP)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"내부 전사된 스페이서" 또는 "ITS"는 진핵생물 종, 특히 진균의 동정에 흔히 사용되는 공통 전구체 전사체의 구조적 리보솜 RNA(rRNA) 사이에 위치한 비기능적 RNA 조각이다. 리보솜의 코어를 형성하는 진균류의 rRNA는 신호 유전자로서 전사되며, 8S와 5.8S 영역, 및 5.8S와 28S 영역 사이에 각각 ITS4 및 5를 갖는 8S, 5.8S 및 28S 영역으로 구성된다. 18S와 5.8S 영역, 및 5.8S와 28S 영역 사이의 이들 2개의 시스트론간 세그먼트는 스플라이싱에 의해 제거되며, 앞에서 설명한 바와 같이 바코드 목적을 위해 종간에 상당한 변화를 함유한다(문헌[Schoch et al Nuclear ribosomal internal transcribed spacer(ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. PNAS 109:6241-6246. 2012]). 18S rDNA는 전형적으로 계통발생적 재구성에 사용되지만, ITS는 일반적으로 고도로 보존되지만 대부분의 진균류의 속 및 종을 구별하기에 충분한 뉴클레오티드 다양성을 보유하는 초가변 영역을 함유하므로 이 기능을 수행할 수 있다.
용어 "단리된" 또는 "풍부한"은 (1)(자연 또는 실험 환경에서) 초기 생산 시에 관련되어 있던 구성요소 중 적어도 일부로부터 분리된, 및/또는 (2) 인간의 손에 의해 생산, 준비, 정제 및/또는 제조된 미생물, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV) 또는 기타 개체 또는 물질을 포함한다. 단리된 미생물 또는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 초기에 관련되었던 다른 성분의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 미생물 또는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없는 경우 "순수"하다. 용어들 "정제하다", "정제하는" 및 "정제된"은 초기 생산 또는 생성될 때(예를 들어, 자연에서 또는 실험 환경에서 발생했는지 여부에 관계없이), 또는 초기 생산 후 임의의 시점에, 관련된 구성요소 중 적어도 일부로부터 분리된 미생물 또는 mEV 또는 기타 물질을 의미한다. 미생물 또는 미생물 군집체 또는 mEV는, 미생물 또는 미생물 군집체 또는 mEV를 함유하는 물질 또는 환경으로부터와 같이, 생산 시 또는 후에 단리된 경우, 정제된 것으로 간주될 수 있으며, 그리고 정제된 미생물 또는 미생물 군집체 또는 mEV 군집체가 다른 물질을 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 90% 초과로 함유하고 여전히 "단리된" 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 미생물 또는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV) 또는 미생물 개체군은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에 제공된 미생물 조성물의 경우, 조성물에 존재하는 하나 이상의 미생물 유형은 해당 미생물 유형을 함유하는 물질 또는 환경에서 생산되고/되거나 존재하는 하나 이상의 다른 미생물로부터 독립적으로 정제될 수 있다. 미생물 조성물 및 미생물 성분, 예컨대 그의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 일반적으로 잔류 서식지 생성물로부터 정제된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지질"은 지방, 오일, 트리글리세리드, 콜레스테롤, 인지질, 유리 지방산을 포함하는 임의의 형태의 지방산을 포함한다. 지방, 오일, 및 지방산은 포화, 불포화(시스 또는 트랜스), 또는 부분 불포화(시스 또는 트랜스)일 수 있다.
용어 "LPS 돌연변이 또는 지질다당류 돌연변이"는 광범위하게, LPS의 손실을 포함하는 선택된 박테리아를 지칭한다. LPS의 손실은 lpxA, lpxC, 및 lpxD와 같은 지질 A 생합성과 관련된 유전자의 돌연변이 또는 파괴로 인한 것일 수 있다. LPS 돌연변이를 포함하는 박테리아는 아미노글리코시드 및 폴리믹신(폴리믹신 B 및 콜리스틴)에 내성이 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "대사산물"은 임의의 세포 또는 미생물 대사 반응에서 기질로 사용되거나 임의의 세포 또는 미생물 대사 반응으로부터 생성 화합물, 조성물, 분자, 이온, 보조인자, 촉매, 또는 영양소로서 생성되는 임의의 모든 분자 화합물, 조성물, 분자, 이온, 보조인자, 촉매, 또는 영양소를 지칭한다.
"미생물"은 고세균, 기생충, 박테리아, 균류, 미세조류, 원생동물, 및 유기체와 관련된 발달 단계 또는 생명 주기 단계 (예를 들어, 식물, 포자(포자 형성, 휴면, 및 발아 포함), 잠재성, 생물막)를 특징으로 하는 임의의 천연 또는 조작된 유기체를 지칭한다. 장내 미생물의 예는 다음을 포함한다: 악티노마이세스 그라에베니치 (Actinomyces graevenitzii ), 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스 ( Actinomyces odontolyticus), 아케르만시아 무시니필라 ( Akkermansia muciniphila ), 박테로이데스 카카에 ( Bacteroides caccae ), 박테로이데스 프라길리스 ( Bacteroides fragilis ), 박테로이데스 푸트레디니스 ( Bacteroides putredinis ), 박테로이데스 테타이오타오미크론 , 박테로이데스 벌타거스 ( Bacteroides vultagus ), 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테리움 비피둠 ( Bifidobacterium bifidum), 빌로필라 와드스워시아 ( Bilophila wadsworthia ), 블라우티아 , 부티리비브리오 (Butyrivibrio), 캄필로박터 그라실리스 ( Campylobacter gracilis ), 클로스트리디아 클러스터 III(Clostridia cluster III), 클로스트리디아 클러스터 IV, 클로스트리디아 클러스터 IX( 아시다미노코카세애 그룹), 클로스트리디아 클러스터 XI, 클로스트리디아 클러스터 XIII( 펩토스트렙토코커스 그룹), 클로스트리디아 클러스터 XIV , 클로스트리디아 클러스터 XV , 콜린셀라 아에로파시엔스 ( Collinsella aerofaciens), 코프로코커스 ( Coprococcus ), 코리네박테리움 선스발렌세 (Corynebacterium sunsvallense ), 데술포모나스 피그라 ( Desulfomonas pigra ), 도레아 포르미시게네란스 ( Dorea formicigenerans ), 도레아 론기카테나 ( Dorea longicatena), 에셰리키아 콜라이 ( Escherichia coli ), 유박테리움 하드룸 (Eubacterium hadrum ), 유박테리움 렉탈레 , 패칼리박테리아 프라우스니치 (Faecalibacteria prausnitzii ), 게멜라 ( Gemella ), 락토코커스 , 란크노스피라 (Lanchnospira), 몰리쿠테스 클러스터( Mollicutes cluster) XVI , 몰리쿠테스 클러스터 XVIII , 프레보텔라 , 로티아 무실라기노사 ( Rothia mucilaginosa ), 루미노코커스 칼리두스 ( Ruminococcus callidus ), 루미노코커스 그나부스 , 루미노코커스 토르케스 (Ruminococcus torques ), 및 스트렙토코커스 (Streptococcus).
"미생물 세포외 소포체"(mEV)는 박테리아, 고세균, 진균, 미세조류, 원생동물, 및 기생충과 같은 미생물로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 박테리아로부터 수득된다. mEV는 분비된 미생물 세포외 소포체(smEV) 및 가공된 미생물 세포외 소포체(pmEV)를 포함한다. "분비된 미생물 세포외 소포체"(smEV)는 미생물로부터 유래된 자연적으로 생성된 소포체이다. smEV는 미생물 지질 및/또는 미생물 단백질 및/또는 미생물 핵산 및/또는 미생물 탄수화물 모이어티로 구성되며, 배양 상청액으로부터 단리된다. 이러한 소포체의 자연적 생성은 박테리아 세포가 배양되는 환경의 조작(예를 들어, 배지 또는 온도 변경)을 통해 인위적으로 향상(예를 들어, 증가) 또는 감소될 수 있다. 또한, smEV 조성물은 효능, 면역 자극, 안정성, 면역 자극 능력, 안정성, 기관 표적화(예를 들어, 림프절), 흡수(예를 들어, 위장), 및/또는 수율(예를 들어, 이에 따른 효능 변경)을 변경하기 위해 미생물 성분 또는 이물질을 감소, 증가, 추가, 또는 제거하도록 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된 smEV 조성물" 또는 "smEV 조성물"은 원재료에서 발견되는 적어도 하나의 관련 물질로부터 분리된(예를 들어, 적어도 하나의 다른 미생물 성분으로부터 분리된) smEV의 제제, 또는 제제 생산에 사용된 임의의 공정에서 smEV와 관련된 임의의 재료를 지칭한다. 이는 또한 특정 성분에 대해 상당히 풍부한 조성물을 지칭할 수 있다. "가공된 미생물 세포외 소포체"(pmEV)는 인공적으로 용해된 미생물(예를 들어, 박테리아)로부터 정제된 미생물 막 성분(예를 들어, 다른 세포내 미생물 세포 성분으로부터 분리된 미생물 막 성분)의 비천연 집합체이며, 정제 방법에 따라 다양하거나 선택된 크기 범위의 입자를 포함할 수 있다. pmEV의 풀은 미생물 세포를 화학적으로(예를 들어, 리소자임 및/또는 리소스타핀에 의해) 파괴하고/하거나 물리적으로(예를 들어, 기계적 힘에 의해) 파괴하고, 원심분리 및/또는 초원심분리 또는 다른 방법을 통해 세포내 성분으로부터 미생물 막 성분을 분리함으로써 수득된다. 생성된 pmEV 혼합물은 전체 미생물에 비해 미생물 막 성분의 농도가 증가하고 세포내 내용물의 농도가 감소(예를 들어, 희석)되도록 미생물 막 및 이의 성분(예를 들어, 말초적으로 결합된 또는 통합 막단백질, 지질, 글리칸, 다당류, 탄수화물, 기타 중합체)의 농축물을 함유한다. 그람-양성 박테리아의 경우, pmEV는 세포막 또는 세포질막을 포함할 수 있다. 그람-음성 박테리아의 경우, pmEV는 내측 및 외측 막을 포함할 수 있다. pmEV는 순도를 높이고 조성물의 입자 크기를 조정하도록 변형될 수 있고/있거나, 효능, 면역 자극, 안정성, 면역 자극 능력, 안정성, 기관 표적화(예를 들어, 림프절), 흡수(예를 들어, 위장), 및/또는 수율(예를 들어, 이에 따른 효능 변경)을 변경하기 위해 미생물 성분 또는 이물질을 감소, 증가, 추가, 또는 제거하도록 변형될 수 있다. pmEV는 동일한 또는 다른 미생물의 세포내 성분을 비롯한 특정 성분을 추가, 제거, 농축, 또는 희석함으로써 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된 pmEV 조성물" 또는 "pmEV 조성물"은 원재료에서 발견되는 적어도 하나의 관련 물질로부터 분리된(예를 들어, 적어도 하나의 다른 미생물 성분으로부터 분리된) pmEV의 제제, 또는 제제 생산에 사용된 임의의 공정에서 pmEV와 관련된 임의의 재료를 지칭한다. 이는 또한 특정 성분에 대해 상당히 풍부한 조성물을 지칭할 수 있다.
"미생물군집"은 대상체 또는 환자의 신체 부위에 또는 그 안에 존재하는 미생물을 광범위하게 지칭한다. 미생물군집의 미생물에는 박테리아, 바이러스, 진핵 미생물 및/또는 바이러스가 포함될 수 있다. 미생물군집의 개별 미생물은 대사 활성, 휴면, 잠복할 수 있거나, 포자로 존재할 수 있으며, 플랑크톤 또는 생물막에 존재할 수 있거나, 지속 가능하거나 일시적인 방식으로 미생물군집에 존재할 수 있다. 미생물군집은 공생 또는 건강한 상태의 미생물군집 또는 질환 상태의 미생물군집일 수 있다. 미생물군집은 대상체 또는 환자의 고유한 것일 수도 있거나, 미생물군집의 성분은 건강 상태(예를 들어, 전암성 또는 암성 상태) 또는 치료 조건(예를 들어, 항생제 치료, 다른 미생물에 대한 노출)의 변화로 인해 조절, 도입 또는 고갈될 수 있다. 일부 양태에서, 미생물군집은 점막 표면에서 발생한다. 일부 양태에서, 미생물군은 장내 미생물군이다. 일부 양태에서, 미생물군은 종양 미생물군이다.
조직 또는 샘플의 "미생물군 프로파일" 또는 "미생물군 시그니처"는 미생물군의 박테리아 구성의 적어도 부분적인 특성화를 지칭한다. 일부 구현예에서, 미생물군 프로파일은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100가지 이상의 박테리아 균주가 미생물군에 존재하는지 부재하는지를 나타낸다. 일부 구현예에서, 미생물군 프로파일은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100가지 이상의 암-관련 박테리아 균주가 샘플에 존재하는지 여부를 나타낸다. 일부 구현예에서, 미생물군 프로파일은 샘플에서 검출된 각 박테리아 균주의 상대적 또는 절대적 양을 나타낸다. 일부 구현예에서, 미생물군 프로파일은 암-관련 미생물군 프로파일이다. 암-관련 미생물군 프로파일은 일반 집단에서보다 암에 걸린 대상체에서 더 자주 발생하는 미생물군 프로파일이다. 일부 구현예에서, 암-관련 미생물군 프로파일은 암이 없는 개체로부터 채취한 다른 동등한 조직 또는 샘플의 미생물군에 정상적으로 존재하는 것보다 더 많은 수 또는 양의 암-관련 박테리아를 포함한다.
박테리아와 관련하여 "변형된"은 광범위하게, 야생형 형태에서 변화를 겪은 박테리아를 지칭한다. 박테리아 변형은 박테리아를 조작함으로써 발생할 수 있다. 박테리아 변형의 예는 유전적 변형, 유전자 발현 변형, 표현형 변형, 제형 변형, 화학적 변형, 및 용량 또는 농도를 포함한다. 개선된 특성의 예는 본 명세서 전반에 걸쳐 기재되어 있으며, 예를 들어 약독화, 영양요구성, 귀소성, 또는 항원성을 포함한다. 표현형 변형은 예를 들어 독성을 증가시키거나 감소시키도록 박테리아의 표현형을 변형시키는 배지에서의 박테리아 성장을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "종양생물군"은 종양원성 및/또는 암-관련 미생물군집을 포함하며, 여기서 미생물군집은 바이러스, 박테리아, 진균, 원생생물, 기생충, 또는 다른 미생물 중 하나 이상을 포함한다.
"종양영양성" 또는 "종양친화성" 미생물 및 박테리아는 암 미세환경에 매우 연관되거나 존재하는 미생물이다. 그들은 환경 내에서 우선적으로 선택되거나, 암 미세환경에서 우선적으로 성장하거나, 상기 환경으로 귀소할 수 있다.
"조작 분류 단위(Operational taxonomic units)" 및 "OTU(들)"은 계통수에서 말단 잎을 지칭하며, 핵산 서열, 예를 들어 전체 게놈 또는 특정 유전자 서열, 및 종의 수준에서 이 핵산 서열에 대한 서열 동일성을 공유하는 모든 서열에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 특정 유전자 서열은 16S 서열 또는 16S 서열의 일부일 수 있다. 다른 구현예에서, 두 개체의 전체 게놈이 시퀀싱되고 비교된다. 또 다른 구현예에서, 다중좌표 서열 태그(MLST), 특정 유전자, 또는 유전자 세트와 같은 선택 영역이 유전적으로 비교될 수 있다. 16S의 경우, 전체 16S 또는 16S의 일부 가변 영역에 걸쳐 97% 이상의 평균 뉴클레오티드 동일성을 공유하는 OTU는 동일한 OTU로 간주된다. 예를 들어, 문헌[Claesson MJ, Wang Q, O'Sullivan O, Greene-Diniz R, Cole JR, Ross RP, and O'Toole PW. 2010. 탠덤 가변 16S rRNA 유전자 영역을 사용하여 고도로 복잡한 미생물총 조성물을 해결하기 위한 두 가지 차세대 시퀀싱 기술 비교. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantinidis KT, Ramette A, and Tiedje JM. 2006. 게놈 시대의 박테리아 종 정의. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1929-1940]을 참조한다. 완전한 게놈의 경우, 95% 이상의 평균 뉴클레오티드 동일성을 공유하는 MLST, 16S 이외의 특정 유전자, 또는 유전자 세트의 OTU는 동일한 OTU로 간주된다. 예를 들어, 문헌[Achtman M, and Wagner M. 2008. 미생물 다양성 및 미생물 종의 유전적 성질. Nat. Rev. Microbiol. 6: 431-440]을 참고한다. 문헌[Konstantinidis KT, Ramette A, and Tiedje JM. 2006. 게놈 시대의 박테리아 종 정의. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1929-1940]을 참조한다. OTU는 종종 유기체 간의 서열을 비교하여 정의된다. 일반적으로, 서열 동일성이 95% 미만인 서열은 동일한 OTU의 일부를 형성하는 것으로 간주되지 않는다. OTU는 또한 뉴클레오티드 마커 또는 유전자, 특히 고도로 보존된 유전자(예를 들어, "하우스-키핑" 유전자), 또는 이들의 조합의 임의의 조합을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어 속, 종 및 계통발생 분기군에 대한 분류학적 할당이 있는 조작 분류 단위(OTU)가 본원에 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자가 동일한 조건에서 같은 종의 야생형 박테리아에 의해 발현되는 것보다 적어도 일부 조건에서 조작된 박테리아에서 더 높은 수준으로 발현되는 경우, 유전자는 박테리아에서 "과발현"된다. 유사하게, 유전자가 동일한 조건에서 같은 종의 야생형 박테리아에 의해 발현되는 것보다 적어도 일부 조건에서 조작된 박테리아에서 더 낮은 수준으로 발현되는 경우, 유전자는 박테리아에서 "과소발현"된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"와 "핵산"은 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체 형태, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비암호화 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 사일런싱 RNA(siRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본원에 제공된 모든 핵산 서열에서, U 뉴클레오티드는 T 뉴클레오티드와 상호교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없는 경우 "순수"하다. 용어 "정제", "정제하기" 및 "정제된"은 (예를 들어, 자연에서든 실험 환경에서든) 초기에 생산 또는 생성될 때, 또는 초기 생산 후 임의의 시기 동안, 관련되었던 성분 중 적어도 일부로부터 분리된 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV) 제제 또는 기타 물질을 나타낸다. 전체 박테리아, mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV), 및/또는 MP 제제 또는 조성물은, 예를 들어 하나 이상의 다른 박테리아 성분으로부터, 생산 시점에 또는 이후에 단리된 경우 정제된 것으로 간주될 수 있고, 정제된 미생물 또는 미생물 집단은 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 90% 초과의 다른 물질을 함유하고, 여전히 "정제된" 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 전체 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 전체 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV) 조성물(또는 제제)은 예를 들어 잔류 서식지 생성물로부터 정제된다.
본원에서 사용되는 용어 "정제된 mEV 조성물" 또는 "mEV 조성물"은 원재료에서 발견되는 적어도 하나의 관련 물질로부터 분리된(예를 들어, 적어도 하나의 다른 박테리아 성분으로부터 분리된) mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)를 포함하는 제제, 또는 제제 생산에 사용된 임의의 공정에서 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)와 관련된 임의의 재료를 지칭한다. 이는 또한 상당히 풍부하거나 농축된 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)는 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 100배, 1000배, 10,000배, 또는 10,000배 초과로 농축된다.
"잔류 서식지 생성물"은 대상체 내부 또는 대상체 상의 미생물군집에 대한 서식지로부터 유래된 물질을 지칭한다. 예를 들어, 미생물의 발효 배양물은 오염물, 예를 들어 다른 미생물 균주 또는 형태(예를 들어, 박테리아, 바이러스, 마이코플라즘, 및/또는 진균)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 미생물은 위장관의 대변, 피부 자체, 타액, 호흡기의 점액 또는 비뇨생식기의 분비물(즉, 미생물 군집과 관련된 생물학적 물질)에 산다. 잔류 서식지 생성물이 실질적으로 없다는 것은 미생물 조성물이 배양물 또는 인간 또는 동물 대상체 상의 또는 그 안의 미생물 환경과 관련된 생물학적 물질을 더 이상 함유하지 않고 미생물 군집과 관련된 임의의 오염 생물학적 물질이 100% 없고, 99% 없고, 98% 없고, 97% 없고, 96% 없거나, 95% 없다는 것을 의미한다. 잔류 서식지 생성물에는 비생물적 물질(소화되지 않은 식품 포함)이 포함되거나, 원치 않는 미생물이 포함될 수 있다. 잔류 서식지 생성물이 실질적으로 없다는 것은 또한 미생물 조성물이 배양 오염물 또는 인간 또는 동물로부터 검출가능한 세포를 함유하지 않고 미생물 세포만이 검출가능하다는 것을 의미할 수 있다. 일 구현예에서, 잔류 서식지 생성물이 실질적으로 없다는 것은 또한 미생물 조성물이 검출가능한 바이러스(박테리아, 바이러스(예를 들어, 파지) 포함), 진균, 마이코플라스마 오염물을 함유하지 않는다는 것을 의미할 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 미생물 세포와 비교하여 미생물 조성물에서 생존 세포의 1x10-2%, 1x10-3%, 1x10-4%, 1x10-5%, 1x10-6%, 1x10-7%, 1x10-8% 미만이 인간 또는 동물임을 의미한다. 이 정도의 순도를 달성하는 방법에는 여러 가지가 있으며 그 중 어느 것도 제한적이지 않다. 따라서, 일련의 단일 콜로니로부터의 복제(예컨대, 2개, 이에 제한되지 않음) 줄무늬가 단일 콜로니 형태만을 나타낼 때까지 고체 배지에서 단일 콜로니로의 여러 단계의 스트리킹을 통해 원하는 성분을 단리함으로써 오염이 감소될 수 있다. 대안적으로, 오염의 감소는 다중 10배 연속 희석과 같은 단일의 원하는 세포에 대한 다중 라운드의 연속 희석(예를 들어, 10-8 또는 10-9의 희석)에 의해 달성될 수 있다. 이것은 여러 개의 단리된 콜로니가 유사한 세포 형태와 그람 염색 거동을 가짐을 보여줌으로써 추가로 확인될 수 있다. 적절한 순도를 확인하기 위한 다른 방법에는 유전자 분석(예를 들어, PCR, DNA 시퀀싱), 혈청학 및 항원 분석, 효소 및 대사 분석, 및 원하는 성분들을 오염물질과 구별하는 시약을 사용하는 유세포 분석과 같은 기기를 사용하는 방법이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "특이적 결합"은 항체가 소정의 항원에 결합하는 능력 또는 폴리펩티드가 소정의 결합 파트너에 결합하는 능력을 나타낸다. 일반적으로, 항체 또는 폴리펩티드는 약 10-7 M 이하의 KD에 상응하는 친화도로 소정의 항원 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하고, 비특이적 및 관련되지 않은 항원/결합 파트너(예를 들어, BSA, 카제인)에 대한 결합에 대한 친화도보다 적어도 10배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배 작은 친화도(KD로 표현됨)로 소정의 항원/결합 파트너에 결합한다. 대안적으로, 특이적 결합은 한 성분이 단백질, 지질 또는 탄수화물 또는 이들의 조합이고 특정 방식으로 단백질, 지질, 탄수화물 또는 이들의 조합인 두 번째 성분과 결합하는 2성분 시스템에 보다 광범위하게 적용된다.
"균주"는 동일한 박테리아 종의 밀접하게 관련된 구성원과 구별될 수 있도록 유전적 특징을 갖는 박테리아 종의 구성원을 지칭한다. 유전적 특징은 적어도 하나의 유전자의 전부 또는 일부의 부재, 적어도 조절 영역(예를 들어, 프로모터, 종결자, 리보스위치, 리보솜 결합 부위)의 전부 또는 일부의 부재, 적어도 하나의 천연 플라스미드의 부재("경화"), 적어도 하나의 재조합 유전자의 존재, 적어도 하나의 돌연변이 유전자의 존재, 적어도 하나의 외래 유전자(다른 종으로부터 유래된 유전자)의 존재, 적어도 하나의 돌연변이 조절 영역(예를 들어, 프로모터, 종결자, 리보스위치, 리보솜 결합 부위)의 존재, 적어도 하나의 비천연 플라스미드의 존재, 적어도 하나의 항생제 내성 카세트의 존재, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상이한 균주들 사이의 유전적 특징은 PCR 증폭에 의해 확인될 수 있고, 임의로 관심 게놈 영역(들) 또는 전체 게놈의 DNA 시퀀싱이 뒤따른다. (동일 종의 다른 균주와 비교하여) 한 균주가 항생제 내성을 얻었거나 잃었거나 생합성 능력을 얻었거나 잃은 경우(예컨대, 영양요구성 균주), 균주는 항생제 또는 영양소/대사산물을 각각 사용하는 선택 또는 역선택에 의해 구별될 수 있다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 임의의 포유류를 지칭한다. "필요로 하는"으로 기술된 대상체 또는 환자는 질환에 대한 치료(또는 예방)를 필요로 하는 대상체 또는 환자를 지칭한다. 포유류(즉, 포유류 동물)에는 인간, 실험 동물(예를 들어, 영장류, 래트, 마우스), 가축(예를 들어, 소, 양, 염소, 돼지), 및 가정용 애완동물(예를 들어, 개, 고양이, 설치류)이 포함된다. 대상체는 인간일 수 있다. 대상체는 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 당나귀, 염소, 낙타, 마우스, 래트, 기니피그, 양, 라마, 원숭이, 고릴라, 또는 침팬지를 포함하는 (이에 한정되지 않음) 비인간 포유류일 수 있다. 대상체는 건강할 수 있거나, 임의의 발달 단계의 암을 앓을 수 있거나(임의의 단계는 암 관련 또는 원인 병원체에 의해 유발되거나 우발적으로 확인됨), 암 발병 위험 또는 다른 대상체에게 암 관련 또는 암 원인 병원체가 전이될 위험이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에는 폐암, 방광암, 전립선암, 형질세포종, 대장암, 직장암, 메르켈세포 암종, 타액선 암종, 난소암, 및/또는 흑색종이 있다. 대상체에는 종양이 있을 수 있다. 대상체에는 강화된 거대음세포증을 나타내는 종양이 있을 수 있으며 이 과정의 기본 유전체학은 Ras 활성화를 포함한다. 다른 구현예에서, 대상체에는 다른 암이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 암 요법을 받았다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에서 질환을 "치료하는" 또는 질환을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체를 "치료하는"이라는 용어는 대상체에게 약제학적 치료를 투여하는 것, 예를 들어, 하나 이상의 제제를 투여하여, 질환의 적어도 하나의 증상이 감소되거나, 악화되는 것을 방지하도록 하는 것을 지칭한다. 따라서, 일 구현예에서, "치료"는 특히 진행 지연, 관해 촉진, 관해 유도, 관해 증대, 회복 가속화, 대체 요법에 대한 효능 증가 또는 내성 감소, 또는 이들의 조합을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 대상체에서 질환을 "예방하는"이라는 용어는 대상체에게 약제학적 치료를 투여하는 것, 예를 들어, 하나 이상의 제제를 투여하여, 질환의 적어도 하나의 증상이 지연되거나 예방되도록 하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 박테리아의 "유형"은 형태학, 생리학, 유전자형, 단백질 발현, 또는 당업계에 알려진 기타 특성에 기초하여, 속, 종, 아종, 균주, 또는 임의의 다른 분류학상 분류에 의해 다른 박테리아와 구별될 수 있다.
박테리아
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 고수율 균주이다. 일부 구현예에서, 고수율 균주는 생물반응기-재배 배양물로부터 리터당 적어도 3x1013 mEV를 생성한다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 독성 또는 기타 역효과를 감소시키고, mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV), 약제학적 조성물을 위한 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 전달(예를 들어, 경구 전달)을 향상시키고 (예를 들어, 내산성, 점막 부착성 및/또는 침투성 및/또는 담즙산, 소화 효소에 대한 내성, 항미생물성 펩타이드에 대한 내성 및/또는 항체 중화에 대한 내성을 개선하여), 원하는 세포 유형(예를 들어, M-세포, 고블렛 세포, 장세포, 수지상 세포, 대식세포)을 표적화하고, mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 면역조절 및/또는 치료 효과를 향상시키고(예를 들어, 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여), 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합에 의해(예를 들어, 다당류, 필리, 핌브리애(fimbriae), 아드헤신(adhesin)의 변형된 생산을 통해) 면역 활성화 또는 억제를 향상시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV), 약제학적 조성물을 위한 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 제조의 개선(예를 들어, 더 높은 산소 내성, 안정성, 개선된 동결-해동 내성, 더 짧은 생성 시간)을 위해 변형된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 박테리아 염색체 또는 내인성 플라스미드 및/또는 하나 이상의 외래 플라스미드 상에 함유된 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 전위, 또는 치환, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 유전자 변화를 보유하는 박테리아를 포함하며, 여기서 유전자 변화는 하나 이상의 유전자의 과발현 및/또는 과소발현을 초래할 수 있다. 조작된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 부위-지정 돌연변이유발, 트랜스포존 돌연변이유발, 녹아웃, 녹인, 중합효소 연쇄 반응 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, 자외선 돌연변이유발, 형질전환(화학적 또는 전기천공법), 파지 형질도입, 유도 진화, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 (이에 한정되지 않음) 임의의 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 균주는 표 2에 열거된 균주에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 게놈을 가진 박테리아 균주이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 표 2에 제공된 ATCC 수탁 번호로 기탁된 박테리아 균주의 게놈 서열에 대한 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)인 게놈 서열을 포함하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 균주로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 표 2에 제공된 16S 서열에 대한 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)인 16S 서열을 포함하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 균주로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 동결건조된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 (예를 들어, 17.5 또는 25 kGy로) 감마 조사된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 UV 조사된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 (예를 들어, 50℃에서 2시간 동안 또는 90℃에서 2시간 동안) 열 비활성화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 산 처리된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 (예를 들어, 0.1 vvm으로 2시간 동안) 산소 살포된다.
성장 단계는 박테리아 및/또는 박테리아에 의해 생성되는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)의 양 또는 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 박테리아 제조 방법에서, 박테리아는 예를 들어 성장 대수기의 시작시에, 대수기의 중간에, 및/또는 정지기 성장에 도달했을 때 배양물로부터 단리될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 제공된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV) 제조 방법에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)는 성장 대수기의 시작시에, 대수기의 중간에, 및/또는 정지기 성장에 도달했을 때 배양물로부터 제조될 수 있다.
[표 2]
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특허절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조건에 따라, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A는 2020년 3월 20일 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA 소재의 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 수탁 번호 PTA-126696으로 지정되었다.
출원인은 ATCC가 특허가 허가되는 경우에 기탁의 영속성을 제공하고 공개적으로 이에 대한 접근성을 제공하는 기탁임을 주장한다. 기탁된 물질의 공중에 의한 이용가능성에 대한 모든 제한은 특허의 허가 시 취소할 수 없게 제거될 것이다. 37 CFR 1.14 및 35 U.S.C. 122에 따라 특허 출원이 진행되는 동안 특허국장이 권한이 있다고 결정한 자는 해당 물질을 이용할 수 있을 것이다. 기탁된 물질은 기탁된 플라스미드 샘플의 가장 최근의 제공 요청 후 적어도 5년의 기간 동안 및 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 또는 특허의 유효 기간 중 더 긴 기간 동안 임의의 경우에 생존 및 오염되지 않음을 유지하기 위해 필요한 모든 주의를 기울여 유지될 것이다. 출원인은 기탁 조건으로 인해 요청받을 때 기탁소가 샘플을 제공할 수 없는 경우 기탁을 교체할 의무를 인정한다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 동결건조된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 (예를 들어, 17.5 또는 25 kGy로) 감마 조사된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 UV 조사된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 (예를 들어, 50℃에서 2시간 동안 또는 90℃에서 2시간 동안) 열 비활성화된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 산 처리된다. 일부 구현예에서, 푸 르 니 에렐라 마실리엔시스 박테리아는 (예를 들어, 0.1 vvm으로 2시간 동안) 산소 살포된다.
일부 구현예에서, mEV는 동결건조된다. 일부 구현예에서, mEV는 (예를 들어, 17.5 또는 25 kGy로) 감마 조사된다. 일부 구현예에서, mEV는 UV 조사된다. 일부 구현예에서, mEV는 (예를 들어, 50℃에서 2시간 동안 또는 90℃에서 2시간 동안) 열 비활성화된다. 일부 구현예에서, mEV는 산 처리된다. 일부 구현예에서, mEV는 (예를 들어, 0.1 vvm으로 2시간 동안) 산소 살포된다.
성장 단계는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 및/또는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아에 의해 생성되는 mEV의 양 또는 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 smEV 제조 방법에서, smEV는 예를 들어 성장 대수기의 시작시에, 대수기의 중간에, 및/또는 정지기 성장에 도달했을 때 배양물로부터 단리될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 제공된 pmEV 제조 방법에서, pmEV는 성장 대수기의 시작시에, 대수기의 중간에, 및/또는 정지기 성장에 도달했을 때 배양물로부터 제조될 수 있다.
변형된 mEV
일부 양태에서, 본원에 기재된 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)는 치료 모이어티를 포함하고/하거나, 이에 연결되고/되거나, 이에 의해 결합되도록 변형된다.
일부 구현예에서, 치료 모이어티는 암-특이적 모이어티이다. 일부 구현예에서, 암-특이적 모이어티는 암세포에 대한 결합 특이성(예를 들어, 암-특이적 항원에 대한 결합 특이성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 암-특이적 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 암-특이적 모이어티는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 암-특이적 모이어티는 암 세포의 표면 상에 발현된 수용체에 대한 리간드 또는 그의 수용체-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 암-특이적 모이어티는 2개의 부분: 즉 박테리아에 결합 및/또는 연결된 제1 부분 및 암세포에 결합할 수 있는 제2 부분(예를 들어, 암-특이적 항원에 대한 결합 특이성을 가짐)을 갖는 2부분 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 제1 부분은 PGRP와 같은 전장 펩티도글리칸 인식 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 제1 부분은 (예를 들어, 박테리아 항원에 대한 결합 특이성을 가짐으로써) mEV에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 부분은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 부분은 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 부분은 암세포의 표면에 발현된 수용체에 대한 리간드 또는 이의 수용체-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 암-특이적 모이어티와 mEV의 공동-투여(조합 또는 개별 투여)는 암 세포에 대한 mEV의 표적화를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 mEV는 자성 및/또는 상자성 모이어티(예를 들어, 자성 비드)를 포함하고, 이에 연결되고/거나 이에 의해 결합되도록 변형된다. 일부 구현예에서, 자성 및/또는 상자성 모이어티는 박테리아에 포함되고/되거나 박테리아에 직접 연결된다. 일부 구현예에서, 자성 및/또는 상자성 모이어티는 mEV에 결합하는 mEV-결합 모이어티에 연결되고/되거나 그의 일부이다. 일부 구현예에서, mEV-결합 모이어티는 PGRP와 같은 전장 펩티도글리칸 인식 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 구현예에서, mEV-결합 모이어티는 (예를 들어, 박테리아 항원에 대한 결합 특이성을 가짐으로써) mEV에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, mEV-결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, mEV-결합 모이어티는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, mEV-결합 모이어티는 암 세포의 표면 상에 발현된 수용체에 대한 리간드 또는 그의 수용체-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 자성 및/또는 상자성 모이어티와 mEV의 공동-투여(조합 또는 개별 투여)는 (예를 들어, 암 세포 및/또는 암세포가 있는 대상체의 일부에 대한) mEV의 표적화를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
가공된 미생물 세포외 소포체(pmEV)의 생성
특정 양태에서, 본원에 기재된 pmEV는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, pmEV는 pmEV 정제 단계 없이 제조된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 pmEV가 방출되는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 pmEV를 온전하게 남겨두는 방법을 사용하여 사멸되고, pmEV를 포함하여 생성된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 성분은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 항생제를 사용하여(예를 들어, 본원에 기재된 항생제를 사용하여) 사멸된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 UV 조사를 사용하여 사멸된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 pmEV는 하나 이상의 다른 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 성분으로부터 정제된다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 (및 임의로, 다른 박테리아 성분)로부터 pmEV를 정제하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, pmEV는 문헌[Thein, et al. (J. Proteome Res. 9(12):6135-6147 (2010)]) 또는 문헌[Sandrini, et al. (Bio-protocol 4(21): e1287 (2014)](이들 각각은 본원에서 그 전체가 참고에 의해 통합됨)에 기재된 방법을 이용하여 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 배양물로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 박테리아를 높은 광학 밀도로 배양한 다음, (예를 들어, 실온 또는 4℃에서 10~15분 동안 10,000~15,000 x g로) 원심분리하여 박테리아를 펠릿화한다. 일부 구현예에서, 상청액을 버리고 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시킨다. 일부 구현예에서, 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동하고, 1 mg/mL의 DLase I이 보충된 100 mM Tris-HCl, pH 7.5에 재현탁한다. 일부 구현예에서, 제조사가 권장하는 조건에서 Emulsiflex C-3(Avestin, Inc.)를 사용하여 세포를 용해한다. 일부 구현예에서, 잔해 및 용해되지 않은 세포를 4℃에서 15분 동안 10,000 x g로 원심분리하여 펠릿화한다. 일부 구현예에서, 이어서 상청액을 4℃에서 1시간 동안 120,000 x g로 원심분리한다. 일부 구현예에서, 펠릿을 빙냉 100 mM 탄산소듐, pH 11에 재현탁하고, 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션한 다음, 4℃에서 1시간 동안 120,000 x g로 원심분리한다. 일부 구현예에서, 펠릿을 100 mM Tris-HCl, pH 7.5에 재현탁하고, 4℃에서 20분 동안 120,000 x g로 다시 원심분리한 다음, 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5 또는 PBS에 재현탁한다. 일부 구현예에서, 샘플은 -20℃에서 보관된다.
특정 양태에서, pmEV는 문헌[Sandrini et al, 2014]에서 채택한 방법에 의해 수득된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 배양물을 실온 또는 4℃에서 10~15분 동안 10,000~15,500 x g로 원심분리한다. 일부 구현예에서, 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시키고 상청액을 버린다. 일부 구현예에서, 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동하고, 0.1 mg/mL의 리소자임이 보충된 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA에 재현탁한다. 일부 구현예에서, 샘플을 실온 또는 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 샘플을 -80℃에서 재동결시키고 얼음 위에서 다시 해동한다. 일부 구현예에서, 1.6 mg/mL의 최종 농도로 DNase I을 첨가하고, 100 mM의 최종 농도로 MgCl2를 첨가한다. 일부 구현예에서, 30초 ON 및 30초 OFF의 7회 사이클로 QSonica Q500 초음파처리기를 사용하여 샘플을 초음파처리한다. 일부 구현예에서, 잔해 및 용해되지 않은 세포를 4℃에서 15분 동안 10,000 x g로 원심분리하여 펠릿화한다. 일부 구현예에서, 이어서 상청액을 4℃에서 15분 동안 110,000 x g로 원심분리한다. 일부 구현예에서, 펠릿을 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% Triton X-100에 재현탁하고 실온에서 혼합하면서 30~60분간 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 샘플을 4℃에서 15분 동안 110,000 x g로 원심분리한다. 일부 구현예에서, 펠릿은 PBS에 재현탁되고 -20℃에서 보관된다.
특정 양태에서, 본원에 기재된, 단리된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 pmEV를 형성하는 (예를 들어, 제조하는) 방법은 (a) 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 배양물을 원심분리하여 제1 펠릿 및 제1 상청액을 형성하는 단계(제1 펠릿은 세포를 포함함); (b) 제1 상청액을 버리는 단계; (c) 제1 펠릿을 용액에 재현탁하는 단계; (d) 세포를 용해하는 단계; (e) 용해된 세포를 원심분리하여 제2 펠릿 및 제2 상청액을 형성하는 단계; (f) 제2 펠릿을 버리고 제2 상청액을 원심분리하여 제3 펠릿 및 제3 상청액을 형성하는 단계; (g) 제3 상청액을 버리고 제3 펠릿을 제2 용액에 재현탁하여 단리된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 pmEV를 형성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 이 방법은 (h) 단계 (g)의 용액을 원심분리하여 제4 펠릿 및 제4 상청액을 형성하는 단계; (i) 제4 상청액을 버리고 제4 펠릿을 제3 용액에 재현탁하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이 방법은 (j) 단계(i)의 용액을 원심분리하여 제5 펠릿 및 제5 상청액을 형성하는 단계; 및 (k) 제5 상청액을 버리고 제5 펠릿을 제4 용액에 재현탁하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)의 원심분리는 10,000 x g로 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 원심분리는 10~15분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 원심분리는 4℃ 또는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 제1 펠릿을 -80℃에서 동결시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)의 용액은 1 mg/ml의 DNase I이 보충된 100 mM Tris-HCl, pH 7.5이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)의 용액은 0.1 mg/ml의 리소자임이 보충된 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 37℃ 또는 실온에서 30분 동안 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 제1 펠릿을 -80℃에서 동결시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 1.6 mg/ml의 최종 농도로 DNase I을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 100 mM의 최종 농도로 MgCl2를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 균질화를 통해 단계 (d)에서 용해된다. 일부 구현예에서, 세포는 emulsiflex C3를 통해 단계 (d)에서 용해된다. 일부 구현예에서, 세포는 초음파처리를 통해 단계 (d)에서 용해된다. 일부 구현예에서, 세포는 7회 사이클로 초음파처리되고, 각 사이클은 초음파처리가 실행되는 30초와 초음파처리가 실행되지 않는 30초로 구성된다. 일부 구현예에서, 단계 (e)의 원심분리는 10,000 x g로 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (e)의 원심분리는 15분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (e)의 원심분리는 4℃ 또는 실온에서 수행된다.
일부 구현예에서, 단계 (f)의 원심분리는 120,000 x g로 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (f)의 원심분리는 110,000 x g로 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (f)의 원심분리는 1시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (f)의 원심분리는 15분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (f)의 원심분리는 4℃ 또는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (g)의 제2 용액은 100 mM 탄산소듐, pH 11이다. 일부 구현예에서, 단계 (g)의 제2 용액은 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% triton X-100이다. 일부 구현예에서, 단계 (g)는 용액을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (g)는 용액을 실온에서 30~60분 동안 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (h)의 원심분리는 120,000 x g로 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (h)의 원심분리는 110,000 x g로 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (h)의 원심분리는 1시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (h)의 원심분리는 15분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (h)의 원심분리는 4℃ 또는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)의 제3 용액은 100 mM Tris-HCl, pH 7.5이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)의 제3 용액은 PBS이다. 일부 구현예에서, 단계 (j)의 원심분리는 120,000 x g로 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (j)의 원심분리는 20분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (j)의 원심분리는 4℃ 또는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (k)의 제4 용액은 100 mM Tris-HCl, pH 7.5 또는 PBS이다.
본원에 제공된 방법에 의해 수득된 pmEV는 수크로스 구배 또는 Optiprep 구배의 사용을 포함할 수 있는 (이에 한정되지 않음) 방법을 사용하여, 크기 기반 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 구배 초원심분리에 의해 추가로 정제될 수 있다. 간략히 설명하면, 여과된 상청액을 황산암모늄 침전 또는 초원심분리를 사용하여 농축하는 경우, 수크로스 구배 방법을 사용하여, 펠릿을 60% 수크로스, 30 mM Tris, pH 8.0에 재현탁한다. 여과된 상청액을 여과를 사용하여 농축하는 경우, Amicon Ultra 컬럼을 사용하여 농축액을 60% 수크로스, 30 mM Tris, pH 8.0으로 완충액 교환한다. 샘플을 35~60% 불연속 수크로스 구배에 적용하고 4℃에서 3~24시간 동안 200,000 x g로 원심분리한다. 간략히 설명하면, 여과된 상청액을 황산암모늄 침전 또는 초원심분리를 사용하여 농축하는 경우, Optiprep 구배 방법을 사용하여, 펠릿을 PBS 중 35% Optiprep에 재현탁한다. 일부 구현예에서, 여과된 상청액을 여과를 사용하여 농축하는 경우, 60% Optiprep을 사용하여 농축액을 35% Optiprep의 최종 농도로 희석한다. 샘플을 35~60% 불연속 수크로스 구배에 적용하고 4℃에서 3~24시간 동안 200,000 x g로 원심분리한다.
일부 구현예에서, pmEV 제제의 무균성 및 단리를 확인하기 위해, pmEV를 시험 중인 박테리아의 통상적인 배양에 사용되는 한천 배지에 연속적으로 희석하고, 통상적인 조건을 사용하여 인큐베이션한다. 비멸균 제제를 0.22 μm 필터에 통과시켜 온전한 세포를 배제한다. 순도를 더 높이기 위해, 단리된 pmEV는 DNase 또는 프로테이나제 K로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, pmEV 제제의 무균성은 pmEV의 생성에 사용된 박테리아의 표준 배양을 위해 사용되는 한천 배지에 pmEV의 일부를 플레이팅하고 표준 조건을 사용하여 인큐베이션함으로써 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 선택된 pmEV는 크로마토그래피 및 pmEV 상의 결합 표면 모이어티에 의해 단리되고 농축된다. 다른 구현예에서, 선택된 pmEV는 친화성 시약, 화학 염료, 재조합 단백질을 사용하는 방법 또는 당업자에게 알려진 다른 방법으로 형광 세포 분류에 의해 단리 및/또는 농축된다.
pmEV는 예를 들어, 문헌[Jeppesen, et al. Cell 177:428(2019)]에 기재된 바와 같이 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, pmEV는 동결건조된다. 일부 구현예에서, pmEV는 (예를 들어, 17.5 또는 25 kGy로) 감마선 조사된다. 일부 구현예에서, pmEV는 UV 조사된다. 일부 구현예에서, pmEV는 (예를 들어, 50℃에서 2시간 동안 또는 90℃에서 2시간 동안) 열 비활성화된다. 일부 구현예에서, pmEV는 산처리된다. 일부 구현예에서, pmEV는 (예를 들어, 2시간 동안 0.1 vvm으로) 산소 살포된다.
성장 단계는 박테리아의 양 또는 특성에 영향을 미칠 수 있다. 본원에 제공된 pmEV 제조 방법에서, pmEV는 예를 들어 성장 대수기의 시작시에, 대수기의 중간에, 및/또는 정지기 성장에 도달했을 때 배양물로부터 단리될 수 있다.
분비된 미생물 세포외 소포체(smEV)의 생성
특정 양태에서, 본원에 기재된 smEV는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, smEV는 smEV 정제 단계 없이 제조된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 박테리아는 smEV를 온전하게 남겨두는 방법을 사용하여 사멸되고, smEV를 포함하여 생성된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 성분은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 항생제를 사용하여(예를 들어, 본원에 기재된 항생제를 사용하여) 사멸된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 UV 조사를 사용하여 사멸된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 열에 의해 사멸된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 smEV는 하나 이상의 다른 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 성분으로부터 정제된다. 박테리아로부터 smEV를 정제하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, smEV는 각각이 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[S. Bin Park, et al. PLoS ONE. 6(3):E17629 (2011)] 또는 문헌[G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015)] 또는 문헌[Jeppesen, et al. Cell 177:428 (2019)]에 기재된 방법을 사용하여 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 배양물로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 높은 광학 밀도로 배양한 다음, (예를 들어, 4℃에서 30분 동안 10,000 x g로, 4℃에서 15분 동안 15,500 x g로) 원심분리하여 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 펠릿화한다. 일부 구현예에서, 이어서 배양 상청액을 필터(예를 들어, 0.22 μm 필터)에 통과시켜 온전한 박테리아 세포를 배제한다. 일부 구현예에서, 이어서 상청액을 접선 유동 여과 처리하고, 그 동안 상청액이 농축되고, 100 kDa 미만의 종은 제거되고, 배지는 PBS로 부분적으로 교환된다. 일부 구현예에서, 여과된 상청액을 (예를 들어, 4℃에서 1~3시간 동안 100,000~150,000 x g로, 4℃에서 1~3시간 동안 200,000 x g로) 원심분리하여 박테리아 smEV를 펠릿화한다. 일부 구현예에서, 생성된 smEV 펠릿을 (예를 들어, PBS 중에) 재현탁하고, 재현탁된 smEV를 Optiprep(아이오딕사놀) 구배 또는 구배(예를 들어, 30~60% 불연속 구배, 0~45% 불연속 구배)에 적용한 후, (예를 들어, 4℃에서 4~20시간 동안 200,000 x g로) 원심분리하여 smEV를 추가로 정제한다. smEV 밴드를 수집하고, PBS로 희석하고, (예를 들어, 4℃에서 3시간 동안 150,000 x g로, 4℃에서 1시간 동안 200,000 x g로) 원심분리하여 smEV를 펠릿화할 수 있다. 정제된 smEV는 사용할 때까지 예를 들어 -80℃ 또는 -20℃에서 보관될 수 있다. 일부 구현예에서, smEV는 DNase 및/또는 프로테이나제 K로 처리되어 추가로 정제된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 배양물을 4℃에서 20~40분 동안 11,000 x g로 원심분리하여 박테리아를 펠릿화할 수 있다. 배양 상청액을 0.22 μm 필터에 통과시켜 온전한 박테리아 세포를 배제할 수 있다. 여과된 상청액은 이어서, 황산암모늄 침전, 초원심분리, 또는 여과를 포함할 수 있는 (이에 한정되지 않음) 방법을 사용하여 농축될 수 있다. 예를 들어, 황산암모늄 침전의 경우, 4℃에서 교반하면서 1.5~3 M 황산암모늄을 여과된 상청액에 천천히 첨가할 수 있다. 침전물을 4℃에서 8~48시간 동안 인큐베이션한 다음, 4℃에서 20~40분 동안 11,000 x g로 원심분리할 수 있다. 생성된 펠릿에는 박테리아 smEV 및 기타 잔해가 함유되어 있다. 초원심분리를 사용하여, 여과된 상청액을 4℃에서 1~16시간 동안 100,000~200,000 x g로 원심분리할 수 있다. 이 원심분리의 펠릿에는 박테리아 smEV 및 거대 단백질 복합체와 같은 기타 잔해가 함유되어 있다. 일부 구현예에서, Amicon Ultra 스핀 필터의 사용 또는 접선 유동 여과와 같은 여과 기술을 이용하여, 50 또는 100 kDa를 초과하는 분자량의 종을 보유하도록 상청액을 여과할 수 있다.
대안적으로, 예를 들어 생물반응기를 교번 접선 유동(ATF) 시스템(예를 들어, Repligen의 XCell ATF)에 연결하여, 성장 중에 연속적으로 또는 성장 중 선택된 시점에 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 배양물로부터 smEV를 수득할 수 있다. ATF 시스템은 온전한 세포(>0.22 μm)를 생물반응기 내에 보유하고, 더 작은 성분들(예를 들어, smEV, 유리 단백질)은 수집을 위해 필터를 통과할 수 있게 한다. 예를 들어, 시스템은 0.22 μm 미만의 여과액이 이후 100 kDa의 제2 필터를 통과하여 0.22 μm 내지 100 kDa의 smEV와 같은 종은 수집되고 100 kDa보다 작은 종은 다시 생물 반응기 내로 펌핑되도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 시스템은 생물반응기의 배지가 배양물의 성장 동안 보충 및/또는 변형되도록 구성될 수 있다. 이 방법에 의해 수집된 smEV는 여과된 상청액에 대해 전술한 바와 같이 초원심분리 또는 여과에 의해 추가로 정제 및/또는 농축될 수 있다.
본원에 제공된 방법에 의해 수득된 smEV는 수크로스 구배 또는 Optiprep 구배의 사용을 포함할 수 있는 (이에 한정되지 않음) 방법을 사용하여, 크기 기반 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 및 구배 초원심분리에 의해 추가로 정제될 수 있다. 간략히 설명하면, 여과된 상청액을 황산암모늄 침전 또는 초원심분리를 사용하여 농축하는 경우, 수크로스 구배 방법을 사용하여, 펠릿을 60% 수크로스, 30 mM Tris, pH 8.0에 재현탁한다. 여과된 상청액을 여과를 사용하여 농축하는 경우, Amicon Ultra 컬럼을 사용하여 농축액을 60% 수크로스, 30 mM Tris, pH 8.0으로 완충액 교환한다. 샘플을 35~60% 불연속 수크로스 구배에 적용하고 4℃에서 3~24시간 동안 200,000 x g로 원심분리한다. 간략히 설명하면, 여과된 상청액을 황산암모늄 침전 또는 초원심분리를 사용하여 농축하는 경우, Optiprep 구배 방법을 사용하여, 펠릿을 PBS에 재현탁하고 3 부피의 60% Optiprep을 샘플에 첨가한다. 일부 구현예에서, 여과된 상청액을 여과를 사용하여 농축하는 경우, 60% Optiprep을 사용하여 농축액을 35% Optiprep의 최종 농도로 희석한다. 샘플을 0~45% 불연속 Optiprep 구배에 적용하고, 4℃에서 3~24시간 동안, 예를 들어 4℃에서 4~24시간 동안 200,000 x g로 원심분리한다.
일부 구현예에서, smEV 제제의 무균성 및 단리를 확인하기 위해, smEV를 시험 중인 박테리아의 통상적인 배양에 사용되는 한천 배지에 연속적으로 희석하고, 통상적인 조건을 사용하여 인큐베이션한다. 비멸균 제제를 0.22 um 필터에 통과시켜 온전한 세포를 배제한다. 순도를 더 높이기 위해, 단리된 smEV는 DNase 또는 프로테이나제 K로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 생체내 주사에 사용되는 smEV의 제조를 위해, 정제된 smEV가 이전에 기재된 바와 같이 처리된다(문헌[G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015)]). 간략히 설명하면, 수크로스 구배 원심분리 후, smEV를 함유하는 밴드를 3% 수크로스를 함유하는 용액 또는 당업자에게 알려진 생체내 주사에 적합한 다른 용액 중에 50 μg/mL의 최종 농도로 재현탁한다. 이 용액은 또한 보조제, 예를 들어 0~0.5%(w/v) 농도의 수산화알루미늄을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 생체내 주사에 사용되는 smEV의 제조를 위해, PBS 중 smEV는 0.22 μm 미만까지 멸균-여과된다.
특정 구현예에서, 샘플을 추가 시험에 적합하게 하기 위해(예를 들어, TEM 이미징 또는 시험관내 분석 전에 수크로스를 제거하기 위해), 여과(예를 들어, Amicon Ultra 컬럼), 투석, 또는 초원심분리(200,000 x g, 3시간 이상, 4℃), 및 재현탁을 사용하여 샘플을 PBS 또는 30 mM Tris, pH 8.0으로 완충액 교환한다.
일부 구현예에서, smEV 제제의 무균성은 smEV의 생성에 사용된 박테리아의 표준 배양을 위해 사용되는 한천 배지에 smEV의 일부를 플레이팅하고 표준 조건을 사용하여 인큐베이션함으로써 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 선별된 smEV는 크로마토그래피 및 smEV 상의 결합 표면 모이어티에 의해 단리되고 농축된다. 다른 구현예에서, 선별된 smEV는 친화성 시약, 화학적 염료, 재조합 단백질 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하는 방법에 의한 형광 세포 분류에 의해 단리 및/또는 농축된다.
smEV는 예를 들어, 문헌[Jeppesen, et al. Cell 177:428 (2019)]에 기재된 바와 같이 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, smEV는 동결건조된다. 일부 구현예에서, smEV는 (예를 들어, 17.5 또는 25 kGy로) 감마 조사된다. 일부 구현예에서, smEV는 UV 조사된다. 일부 구현예에서, smEV는 (예를 들어, 50℃에서 2시간 동안 또는 90℃에서 2시간 동안) 열 비활성화된다. 일부 구현예에서, smEV는 산처리된다. 일부 구현예에서, smEV는 (예를 들어, 2시간 동안 0.1 vvm으로) 산소 살포된다.
성장 단계는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 및/또는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아에 의해 생성되는 smEV의 양 또는 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 smEV 제조 방법에서, smEV는 예를 들어 성장 대수기의 시작시에, 대수기의 중간에, 및/또는 정지기 성장에 도달했을 때 배양물로부터 단리될 수 있다.
성장 환경(예를 들어, 배양 조건)은 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아에 의해 생성되는 smEV의 양에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, smEV의 수율은 표 3에 제공된 바와 같이 smEV 유도제에 의해 증가될 수 있다.
[표 3]
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본원에 제공된 smEV 제조 방법에서, 방법은 박테리아 배양물로부터 smEV를 단리하기 전에 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 배양물을 smEV 유도제에 노출시키는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 배양물은 성장 대수기의 시작시에, 대수기의 중간에, 및/또는 정지기 성장에 도달했을 때 smEV 유도제에 노출될 수 있다.
약제학적 조성물
특정 양태에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터 수득된, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물(예를 들어, 박테리아 제형 또는 박테리아 조성물)이 본원에 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 푸르니에렐라 마실리엔시스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 또는 1 x 109, 1 x 1010, 2x1010, 2.1x1010, 2.2x1010, 2.3x1010, 2.4x1010, 2.5x1010, 2.6x1010, 2.7x1010, 2.8x1010, 2.9x1010, 3x1010, 3.1x1010, 3.2x1010, 3.3x1010, 3.4x1010, 3.5x1010, 3.6x1010, 3.7x1010, 3.8x1010, 3.9x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 1.1x1011, 1.2x1011, 1.3x1011, 1.4x1011, 1.5x1011, 1.6x1011, 1.7x1011, 1.8x1011, 1.9x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 3.1x1011, 3.2x1011, 3.3x1011, 3.4x1011, 3.5x1011, 3.6x1011, 3.7x1011, 3.8x1011, 3.9x1011, 4x1011 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012 콜로니 형성 단위(CFU)의 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 또는 1 x 109, 1 x 1010, 2x1010, 2.1x1010, 2.2x1010, 2.3x1010, 2.4x1010, 2.5x1010, 2.6x1010, 2.7x1010, 2.8x1010, 2.9x1010, 3x1010, 3.1x1010, 3.2x1010, 3.3x1010, 3.4x1010, 3.5x1010, 3.6x1010, 3.7x1010, 3.8x1010, 3.9x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 1.1x1011, 1.2x1011, 1.3x1011, 1.4x1011, 1.5x1011, 1.6x1011, 1.7x1011, 1.8x1011, 1.9x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 3.1x1011, 3.2x1011, 3.3x1011, 3.4x1011, 3.5x1011, 3.6x1011, 3.7x1011, 3.8x1011, 3.9x1011, 4x1011 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012 콜로니 형성 단위(CFU)의 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 최대 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 또는 1 x 109, 1 x 1010, 2x1010, 2.1x1010, 2.2x1010, 2.3x1010, 2.4x1010, 2.5x1010, 2.6x1010, 2.7x1010, 2.8x1010, 2.9x1010, 3x1010, 3.1x1010, 3.2x1010, 3.3x1010, 3.4x1010, 3.5x1010, 3.6x1010, 3.7x1010, 3.8x1010, 3.9x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 1.1x1011, 1.2x1011, 1.3x1011, 1.4x1011, 1.5x1011, 1.6x1011, 1.7x1011, 1.8x1011, 1.9x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 3.1x1011, 3.2x1011, 3.3x1011, 3.4x1011, 3.5x1011, 3.6x1011, 3.7x1011, 3.8x1011, 3.9x1011, 4x1011 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012 콜로니 형성 단위(CFU)의 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 또는 1 x 109, 1 x 1010, 2x1010, 2.1x1010, 2.2x1010, 2.3x1010, 2.4x1010, 2.5x1010, 2.6x1010, 2.7x1010, 2.8x1010, 2.9x1010, 3x1010, 3.1x1010, 3.2x1010, 3.3x1010, 3.4x1010, 3.5x1010, 3.6x1010, 3.7x1010, 3.8x1010, 3.9x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 1.1x1011, 1.2x1011, 1.3x1011, 1.4x1011, 1.5x1011, 1.6x1011, 1.7x1011, 1.8x1011, 1.9x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 3.1x1011, 3.2x1011, 3.3x1011, 3.4x1011, 3.5x1011, 3.6x1011, 3.7x1011, 3.8x1011, 3.9x1011, 4x1011 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012 총 세포의 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 또는 1 x 109, 1 x 1010, 2x1010, 2.1x1010, 2.2x1010, 2.3x1010, 2.4x1010, 2.5x1010, 2.6x1010, 2.7x1010, 2.8x1010, 2.9x1010, 3x1010, 3.1x1010, 3.2x1010, 3.3x1010, 3.4x1010, 3.5x1010, 3.6x1010, 3.7x1010, 3.8x1010, 3.9x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 1.1x1011, 1.2x1011, 1.3x1011, 1.4x1011, 1.5x1011, 1.6x1011, 1.7x1011, 1.8x1011, 1.9x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 3.1x1011, 3.2x1011, 3.3x1011, 3.4x1011, 3.5x1011, 3.6x1011, 3.7x1011, 3.8x1011, 3.9x1011, 4x1011 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012 총 세포의 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 최대 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 또는 1 x 109, 1 x 1010, 2x1010, 2.1x1010, 2.2x1010, 2.3x1010, 2.4x1010, 2.5x1010, 2.6x1010, 2.7x1010, 2.8x1010, 2.9x1010, 3x1010, 3.1x1010, 3.2x1010, 3.3x1010, 3.4x1010, 3.5x1010, 3.6x1010, 3.7x1010, 3.8x1010, 3.9x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 1.1x1011, 1.2x1011, 1.3x1011, 1.4x1011, 1.5x1011, 1.6x1011, 1.7x1011, 1.8x1011, 1.9x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 3.1x1011, 3.2x1011, 3.3x1011, 3.4x1011, 3.5x1011, 3.6x1011, 3.7x1011, 3.8x1011, 3.9x1011, 4x1011 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.5x1012 총 세포의 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)를 포함한다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 5 mg(예를 들어, 적어도 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, 220 mg, 230 mg, 240 mg, 250 mg, 260 mg, 270 mg, 280 mg, 290 mg, 300 mg, 310 mg, 320 mg, 330 mg, 340 mg, 350 mg, 360 mg, 370 mg, 380 mg, 390 mg, 400 mg, 410 mg, 420 mg, 430 mg, 440 mg, 450 mg, 460 mg, 470 mg, 480 mg, 490 mg, 500 mg, 510 mg, 520 mg, 530 mg, 540 mg, 550 mg, 560 mg, 570 mg, 580 mg, 590 mg, 600 mg, 610 mg, 620 mg, 630 mg, 640 mg, 650 mg, 660 mg, 670 mg, 680 mg, 690 mg, 700 mg, 710 mg, 720 mg, 730 mg, 740 mg, 750 mg, 760 mg, 770 mg, 780 mg, 790 mg, 800 mg, 810 mg, 820 mg, 830 mg, 840 mg, 850 mg, 860 mg, 870 mg, 880 mg, 890 mg, 또는 900 mg) 및 900 mg 이하(예를 들어, 890 mg, 880 mg, 870 mg, 860 mg, 850 mg, 840 mg, 830 mg, 820 mg, 810 mg, 800 mg, 790 mg, 780 mg, 770 mg, 760 mg, 750 mg, 740 mg, 730 mg, 720 mg, 710 mg, 700 mg, 690 mg, 680 mg, 670 mg, 660 mg, 650 mg, 640 mg, 630 mg, 620 mg, 610 mg, 600 mg, 590 mg, 580 mg, 570 mg, 560 mg, 550 mg, 540 mg, 530 mg, 520 mg, 510 mg, 500 mg, 490 mg, 480 mg, 470 mg, 460 mg, 450 mg, 440 mg, 430 mg, 420 mg, 410 mg, 400 mg, 390 mg, 380 mg, 370 mg, 360 mg, 350 mg, 340 mg, 330 mg, 320 mg, 310 mg, 300 mg, 290 mg, 280 mg, 270 mg, 260 mg, 250 mg, 240 mg, 230 mg, 220 mg, 210 mg, 200 mg, 190 mg, 180 mg, 170 mg, 160 mg, 150 mg, 140 mg, 130 mg, 120 mg, 110 mg, 100 mg, 90 mg, 80 mg, 70 mg, 60 mg, 50 mg, 40 mg, 30 mg, 20 mg, 또는 10 mg 이하)의 총 단백질 양(예를 들어, 브래드포드 검정에 의해서 결정된 바와 같음 또는 BCA 검정에 의해서 결정된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 10 mg, 약 20 mg, 약 30 mg, 약 40 mg, 약 50 mg, 약 60 mg, 약 70 mg, 약 80 mg, 약 90 mg, 약 100 mg, 약 110 mg, 약 120 mg, 약 130 mg, 약 140 mg, 약 150 mg, 약 160 mg, 약 170 mg, 약 180 mg, 약 190 mg, 약 200 mg, 약 210 mg, 약 220 mg, 약 230 mg, 약 240 mg, 약 250 mg, 약 260 mg, 약 270 mg, 약 280 mg, 약 290 mg, 약 300 mg, 약 310 mg, 약 320 mg, 약 330 mg, 약 340 mg, 약 350 mg, 약 360 mg, 약 370 mg, 약 380 mg, 약 390 mg, 약 400 mg, 약 410 mg, 약 420 mg, 약 430 mg, 약 440 mg, 약 450 mg, 약 460 mg, 약 470 mg, 약 480 mg, 약 490 mg, 약 500 mg, 약 510 mg, 약 520 mg, 약 530 mg, 약 540 mg, 약 550 mg, 약 560 mg, 약 570 mg, 약 580 mg, 약 590 mg, 약 600 mg, 약 610 mg, 약 620 mg, 약 630 mg, 약 640 mg, 약 650 mg, 약 660 mg, 약 670 mg, 약 680 mg, 약 690 mg, 약 700 mg, 약 710 mg, 약 720 mg, 약 730 mg, 약 740 mg, 약 750 mg, 약 760 mg, 약 770 mg, 약 780 mg, 약 790 mg, 약 800 mg, 약 810 mg, 약 820 mg, 약 830 mg, 약 840 mg, 약 850 mg, 약 860 mg, 약 870 mg, 약 880 mg, 약 890 mg, 또는 약 900 mg의 총 단백질(예를 들어, 브래드포드 검정에 의해서 결정된 바와 같음 또는 BCA 검정에 의해서 결정된 바와 같음)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 5 mg(예를 들어, 적어도 6 mg, 적어도 7 mg, 적어도 8 mg, 적어도 9 mg, 적어도 10 mg, 적어도 11 mg, 적어도 12 mg, 적어도 13 mg, 적어도 14 mg, 적어도 15 mg, 적어도 16 mg, 적어도 17 mg, 적어도 18 mg, 적어도 19 mg, 또는 적어도 20 mg) 및 20 mg 이하(예를 들어, 19 mg 이하, 18 mg 이하, 17 mg 이하, 16 mg 이하, 15 mg 이하, 14 mg 이하, 13 mg 이하, 12 mg 이하, 11 mg 이하, 10 mg 이하, 9 mg 이하, 8 mg 이하, 7 mg 이하, 6 mg 이하, 5 mg 이하)(예를 들어, 브래드포드 검정에 의해서 결정된 바와 같음 또는 BCA 검정에 의해서 결정된 바와 같음)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 총량을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg, 약 10 mg, 약 11 mg, 약 12 mg, 약 13 mg, 약 14 mg, 약 15 mg, 약 16 mg, 약 17 mg, 약 18 mg, 약 19 mg, 또는 약 20 mg(예를 들어, 브래드포드 검정에 의해서 결정된 바와 같음 또는 BCA 검정에 의해서 결정된 바와 같음)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 총량을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물(예를 들어, 투여되는 (예를 들어, 매일 1회 또는 2회) 총 용량의 조성물)은 적어도 1 x 1010개 총 세포(예를 들어, 적어도 1 x 1010개 총 세포, 적어도 2 x 1010개 총 세포, 적어도 3 x 1010개 총 세포, 적어도 4 x 1010개 총 세포, 적어도 5 x 1010개 총 세포, 적어도 6 x 1010개 총 세포, 적어도 7 x 1010개 총 세포, 적어도 8 x 1010개 총 세포, 적어도 9 x 1010개 총 세포, 적어도 1 x 1011개 총 세포)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 9 x 1011개 이하 총 세포(예를 들어, 1 x 1010개 이하 총 세포, 2 x 1010개 이하 총 세포, 3 x 1010개 이하 총 세포, 4 x 1010개 이하 총 세포, 5 x 1010개 이하 총 세포, 6 x 1010개 이하 총 세포, 7 x 1010개 이하 총 세포, 8 x 1010개 이하 총 세포, 9 x 1010개 이하 총 세포, 1 x 1011개 이하 총 세포, 2 x 1011개 이하 총 세포, 3 x 1011개 이하 총 세포, 4 x 1011개 이하 총 세포, 5 x 1011개 이하 총 세포, 6 x 1011개 이하 총 세포, 7 x 1011개 이하 총 세포, 8 x 1011개 이하 총 세포)의 메가스파에라 종 박테리아를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 6 x 109개 총 세포의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 및/또는 약제학적 조성물은 살아있고/있거나, 사멸되고/되거나, 약독화되고/되거나, 동결건조되고/되거나 조사될(예를 들어, UV 또는 감마 조사된) 박테리아를 포함한다. 박테리아는 저온살균, 멸균, 고온 처리, 분무 조리 및/또는 분무 건조에 의해 가열 사멸될 수 있다(가열 처리는 50℃, 65℃, 85℃ 또는 다양한 기타 온도 및/또는 다양한 시간에서 수행될 수 있다). 박테리아는 또한 γ-조사(감마선 조사), UV 광 노출, 포르말린 불활성화 및/또는 동결 방법, 또는 이들의 조합을 사용하여 사멸 또는 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 투여 전에 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50 kGy의 방사선에 노출될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아는 감마 조사를 사용하여 사멸된다. 일부 구현예에서, 박테리아는 전자 조사(예를 들어, 베타 방사선) 또는 x선 조사를 이용하여 사멸 또는 불활성화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 박테리아 및/또는 약제학적 조성물 내의 박테리아는 박테리아의 질환 조절 활성을 온전하게 남겨두는 방법을 사용하여 사멸되고, 생성된 박테리아 성분은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 박테리아는 항생제를 사용하여(예를 들어, 본원에 기재된 항생제를 사용하여) 사멸된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 박테리아는 UV 조사를 사용하여 사멸된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 박테리아는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 열(온도) 멸균, 여과 및 방사선을 사용하여 사멸된다(Garg M., 월드와이드웹 biologydiscussion.com/microorganisms/sterilizatiion/top-3-physical-methods-used-to-kill-microorganisms/55243 참조). 박테리아는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 E-빔을 통해 사멸될 수 있다(문헌[S
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R M. et al, FABAD J. Pharm. Sci., 34, 43-53, 2009]). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 내의 박테리아는 화학적 작용제, 예를 들어, 알데히드, 예를 들어, 포름알데히드, 글루타르알데히드 등; 식품 방부제, 예컨대 SO2, 소르빈산, 벤조산, 질산염 및 아질산염; 가스, 예컨대 에틸렌 옥사이드; 할로겐, 예컨대 요오드, 염소 등; 과산소, 예컨대 오존, 과산화물, 과아세트산; 비스페놀; 페놀; 페놀류; 비구아니드, 예를 들어, 클로르헥시딘; 등에 의해 사멸 및/또는 약독화된다.
박테리아는 다양한 성장 단계로 성장할 수 있고, 상이한 희석 및 성장 단계 중 상이한 시점에서 박테리아의 효능을 시험할 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 정지기(초기 또는 후기 정지기 포함)에서 투여 후에, 또는 지수기 동안의 다양한 시점에서 효능을 시험할 수 있다. 다양한 방법에 의한 불활성화 이외에도, 박테리아는 생 세포 대 불활성화된 세포의 상이한 비율, 또는 다양한 성장기에서의 세포의 상이한 비율을 사용하여 효능을 시험할 수 있다.
특정 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)(예를 들어, mEV 조성물(예를 들어, smEV 조성물 또는 pmEV 조성물))를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, mEV 조성물은 본원에 기재된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV) 및/또는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, smEV 조성물은 smEV 및/또는 본원에 기재된 smEV 및 약제학적으로 허용 가능한 담체의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, pmEV 조성물은 pmEV 및/또는 본원에 기재된 pmEV 및 약제학적으로 허용 가능한 담체의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 박테리아(예를 들어, 살아있는 박테리아, 사멸된 박테리아, 약독화된 박테리아)가 실질적으로 또는 완전히 없는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 mEV 및 전체 박테리아(예를 들어, 살아있는 박테리아, 사멸된 박테리아, 약독화된 박테리아)를 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 동결건조된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 감마 조사된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함한다. mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)는 mEV가 단리(예를 들어, 제조)된 후 감마선 조사될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A로부터의 mEV를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 샘플에 존재하는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV) 및/또는 박테리아의 수를 정량화하기 위해, 전자 현미경(예를 들어, 초박형 동결 절편의 EM)을 사용하여 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV) 및/또는 박테리아를 시각화하고, 이들의 상대적인 수를 계수할 수 있다. 대안적으로, 나노입자 추적 분석(NTA), Coulter 계수 또는, 동적 광산란(DLS) 또는 이러한 기술의 조합이 사용될 수 있다. NTA 와 Coulter 계수기는 입자를 계수하고 입자 크기를 보여준다. DLS는 입자의 크기 분포를 제공하지만 농도는 제공하지 않는다. 박테리아는 흔히 직경이 1~2 μm(미크론)이다. 전체 범위는 0.2~20 μm이다. Coulter 계수와 NTA의 조합된 결과로부터 소정 샘플 중의 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)의 수를 알 수 있다. Coulter 계수는 직경이 0.7~10 μm인 입자의 수를 나타낸다. 대부분의 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV) 샘플의 경우, Coulter 계수기만으로도 샘플 중의 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)의 수를 알 수 있다. pmEV는 직경이 20~600 nm이다. NTA의 경우, Malvern Pananlytical에서 Nanosight 기기를 입수할 수 있다. 예를 들어, NS300은 10~2000 nm 크기 범위의 부유 입자를 시각화하고 측정할 수 있다. NTA는 예를 들어 직경이 50~1000 nm인 입자의 수를 계수할 수 있다. DLS는 약 1 nm 내지 3 μm 범위 내의 다른 직경 입자들의 분포를 나타낸다.
mEV는 당업계에 공지된 분석 방법에 의해 특성화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Jeppesen, et al. Cell 177:428 (2019)]).
일부 구현예에서, mEV는 입자 수에 기초하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, mEV 제제의 입자 수는 NTA를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, mEV는 단백질, 지질, 또는 탄수화물의 양에 기초하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, mEV 제제의 총 단백질 함량은 Bradford 분석 또는 BCA 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, mEV는 공급원 박테리아의 하나 이상의 다른 박테리아 성분으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다른 박테리아 성분을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 공급원 박테리아로부터 수득된 mEV 제제는 하위집단의 물리적 특성(예를 들어, 크기, 밀도, 단백질 함량, 결합 친화도)에 기초하여 하위집단으로 분류될 수 있다. mEV 하위집단 중 하나 이상이 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 입자 카운트에 기초하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 총 입자 함량은 NTA를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 총 세포 수(total cell count: TCC)(예를 들어, Coulter 계수기에 의해 결정됨)에 기반하여 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 플레이트 카운트 분석(예를 들어, 박테리아를 연속적으로 희석하여 적절한 배지에서 성장시킨 다음 콜로니 수를 세는 방법)을 사용하여 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아는 단백질, 지질 또는 탄수화물의 양에 기초하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 제제의 총 단백질 함량은 Bradford 검정 또는 BCA 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
인간 대상체에 대한 경구 투여의 경우, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 용량은 예를 들어, 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x107 내지 약 1x1015, 약 1x108 내지 약 1x1014, 약 1x109 내지 약 1x1013, 약 1x1010 내지 약 1x1014, 또는 약 1x108 내지 약 1x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x106, 약 2x107, 약 2x108, 약 2x109, 약 1x1010, 약 2x1010, 약 2x1011, 약 2x1012, 약 2x1013, 약 2x1014, 또는 약 1x1015개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1010개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x1010개 입자일 수 있다. 입자 수는 예를 들어, NTA에 의해서 결정될 수 있다.
인간 대상체에 대한 경구 투여의 경우, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 용량은 예를 들어 총 단백질을 기준으로 할 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg의 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 20 mg 내지 약 800 mg, 약 50 mg 내지 약 700 mg, 약 75 mg 내지 약 600 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 250 mg 내지 약 750 mg, 또는 약 200 mg 내지 약 500 mg의 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 10 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 또는 약 750 mg의 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 10 mg의 총 단백질일 수 있다. 총 단백질은 예를 들어, 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정될 수 있다.
인간 대상체에 대한 주사 투여(예를 들어, 정맥내 투여)의 경우, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 용량은 예를 들어, 약 1x106 내지 약 1x1016개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x107 내지 약 1x1015, 약 1x108 내지 약 1x1014, 약 1x109 내지 약 1x1013, 약 1x1010 내지 약 1x1014, 또는 약 1x108 내지 약 1x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x106, 약 2x107, 약 2x108, 약 2x109, 약 1x1010, 약 2x1010, 약 2x1011, 약 2x1012, 약 2x1013, 약 2x1014, 또는 약 1x1015개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x1015개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1013개 입자일 수 있다. 입자 수는 예를 들어, NTA에 의해서 결정될 수 있다.
주사에 의한 투여(예를 들어, 정맥내 투여)의 경우, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아의 용량은 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg의 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 20 mg 내지 약 800 mg, 약 50 mg 내지 약 700 mg, 약 75 mg 내지 약 600 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 250 mg 내지 약 750 mg, 또는 약 200 mg 내지 약 500 mg의 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 10 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 또는 약 750 mg의 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 700 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 350 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 175 mg 총 단백질일 수 있다. 총 단백질은 예를 들어, 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물(예를 들어, 투여되는 (예를 들어, 매일 1회 또는 2회) 총 용량의 조성물)은 적어도 1 x 1010개 총 세포(예를 들어, 적어도 1 x 1010개 총 세포, 적어도 2 x 1010개 총 세포, 적어도 3 x 1010개 총 세포, 적어도 4 x 1010개 총 세포, 적어도 5 x 1010개 총 세포, 적어도 6 x 1010개 총 세포, 적어도 7 x 1010개 총 세포, 적어도 8 x 1010개 총 세포, 적어도 9 x 1010개 총 세포, 적어도 1 x 1011개 총 세포)의 프레보텔라 ( Prevotella ) 박테리아를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 9 x 1011개 이하 총 세포(예를 들어, 1 x 1010개 이하 총 세포, 2 x 1010개 이하 총 세포, 3 x 1010개 이하 총 세포, 4 x 1010개 이하 총 세포, 5 x 1010개 이하 총 세포, 6 x 1010개 이하 총 세포, 7 x 1010개 이하 총 세포, 8 x 1010개 이하 총 세포, 9 x 1010개 이하 총 세포, 1 x 1011개 이하 총 세포, 2 x 1011개 이하 총 세포, 3 x 1011개 이하 총 세포, 4 x 1011개 이하 총 세포, 5 x 1011개 이하 총 세포, 6 x 1011개 이하 총 세포, 7 x 1011개 이하 총 세포, 8 x 1011개 이하 총 세포)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함한다.
특정 양태에서, 질환 또는 건강 장애(예를 들어, 유해한 건강 장애)(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세균불균형 또는 대사성 질환)의 치료 및/또는 예방에 유용한 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)를 포함하는 약제학적 조성물, 뿐만 아니라 이러한 mEV를 제조 및/또는 확인하는 방법, 및 이러한 약제학적 조성물을(예를 들어, 질환 또는 건강 장애(예를 들어, 유해한 건강 장애)(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세균불균형 또는 대사 질환)의 치료 및/또는 예방을 위해, 단독으로 또는 다른 치료제와 함께) 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV) 및 전체 박테리아(예를 들어, 살아있는 박테리아, 사멸된 박테리아, 약독화된 박테리아)를 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 박테리아의 부재하에 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV)를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV) 및/또는 박테리아를 포함한다.
특정 양태에서, 제공된 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 및 본원에 기재된 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 박테리아는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A이다.
일부 구현예에서, 박테리아 및/또는 약제학적 조성물은 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 및/또는 1x1012개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 입자마다 적어도 1개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 및/또는 약제학적 조성물은 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 및/또는 1x1012개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 입자마다 약 1개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 및/또는 약제학적 조성물은 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 및/또는 1x1012개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 입자마다 1개 이하의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 및/또는 약제학적 조성물은 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 및/또는 1x1012개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아마다 적어도 1개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 및/또는 약제학적 조성물은 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 및/또는 1x1012개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아마다 약 1개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 및/또는 약제학적 조성물은 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 , 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 및/또는 1x1012개의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아마다 1개 이하의 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 입자들의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 단백질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 단백질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 단백질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 단백질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 단백질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 단백질의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 단백질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 지질의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 지질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 지질의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 지질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 지질의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 지질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 지질의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 지질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 지질의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV 지질이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내 총 지질의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 지질이다.
특정 양태에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에 투여하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 최종 생성물을 생성하기 위해 추가의 활성 및/또는 비활성 물질과 조합되며, 이는 단일 투여 단위 또는 다중-용량 형식일 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 면역-보조제(예를 들어, STING 작용제, TLR 작용제, 또는 NOD 작용제)와 같은 보조제와 조합된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 탄수화물을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 라우르산(12:0), 미리스트산(14:0), 팔미트산(16:0), 팔미톨레산(16:1), 마가르산(17:0), 헵타데센산(17:1), 스테아르산(18:0), 올레산(18:1), 리놀레산(18:2), 리놀렌산(18:3), 옥타데카테트라엔산(18:4), 아라키드산(20:0), 에이코센산(20:1), 에이코사디엔산(20:2), 에이코사테트라엔산(20:4), 에이코사펜타엔산(20:5)(EPA), 도코산산(22:0), 도코센산(22:1), 도코사펜타엔산(22:5), 도코사헥사엔산(22:6)(DHA) 및 테트라코사노산(24:0)으로부터 선택된 적어도 하나의 지방산을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 보충 미네랄 또는 미네랄 공급원을 포함한다. 미네랄의 예에는: 염화물, 나트륨, 칼슘, 철, 크롬, 구리, 요오드, 아연, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨 및 셀레늄이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 임의의 상기 미네랄의 적합한 형태는 가용성 미네랄 염, 난용성 미네랄 염, 불용성 미네랄 염, 킬레이트화된 미네랄, 미네랄 복합체, 카르보닐 미네랄 및 환원된 미네랄과 같은 비반응성 미네랄, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 보충 비타민을 포함한다. 적어도 하나의 비타민은 지용성 또는 수용성 비타민일 수 있다. 적합한 비타민에는 비타민 C, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 B12, 비타민 K, 리보플라빈, 니아신, 비타민 D, 비타민 B6, 엽산, 피리독신, 티아민, 판토텐산 및 비오틴이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 상기들 중 어느 하나의 적합한 형태는 비타민의 염, 비타민의 유도체, 비타민과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 화합물, 및 비타민의 대사산물이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 부형제를 포함한다. 적합한 부형제의 비제한적인 예는 완충제, 방부제, 안정화제, 결합제, 압축제, 윤활제, 분산 증진제, 붕해제, 향미제, 감미제 및 착색제를 포함한다.
일부 구현예에서, 부형제는 완충제이다. 적합한 완충제의 비제한적 예는 시트르산나트륨, 탄산마그네슘, 중탄산마그네슘, 탄산칼슘 및 중탄산칼슘을 포함한다.
일부 구현예에서, 부형제는 보존제를 포함한다. 적합한 방부제의 비제한적 예는 알파-토코페롤 및 아스코르베이트와 같은 항산화제, 및 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀과 같은 항균제를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 부형제로서 결합제를 포함한다. 적합한 결합제의 비제한적 예에는 전분, 전호화 전분, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐옥소아졸리돈, 폴리비닐알코올, C12-C18 지방산 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리올, 당류, 올리고당류, 및 이들의 조합이 포함된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 부형제로서 윤활제를 포함한다. 적합한 윤활제의 비제한적 예는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 스테로텍스, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트, 활석, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 및 경질 미네랄 오일을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 부형제로서 분산 증진제를 포함한다. 적합한 분산제의 비제한적 예는 고 HLB 유화제 계면활성제로서 전분, 알긴산, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 카올린, 벤토나이트, 정제된 우드 셀룰로스, 나트륨 전분 글리콜레이트, 동형 실리케이트, 및 미세결정질 셀룰로오스를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 부형제로서 붕해제를 포함한다. 일부 구현예에서, 붕해제는 비-발포성 붕해제이다. 적합한 비-발포성 붕해제의 비제한적 예는 전분, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 이의 전호화 및 변성 전분, 감미료, 클레이, 예컨대 벤토나이트, 미세결정질 셀룰로스, 알기네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 검, 예컨대 한천, 구아, 로커스트 빈, 카라야, 펙틴 및 트라가칸트를 포함한다. 일부 구현예에서, 붕해제는 발포성 붕해제이다. 적합한 발포성 붕해제의 비제한적 예는 시트르산과 조합된 중탄산나트륨, 및 타르타르산과 조합된 중탄산나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 식품(예를 들어, 식품 또는 음료), 예컨대 건강 식품 또는 음료, 유아용 식품 또는 음료, 임산부, 운동선수, 노인 또는 기타 특정군용 식품 또는 음료, 기능성 식품, 음료, 특정 건강용 식품 또는 음료, 식이 보충제, 환자용 식품 또는 음료, 또는 동물사료이다. 음식 및 음료의 구체적인 예는 다양한 음료, 예컨대 주스, 청량 음료, 차 음료, 드링크 제제, 젤리 음료, 및 기능성 음료; 알코올 음료, 예컨대 맥주; 탄수화물-함유 식품, 예컨대 쌀 식품, 국수, 빵, 및 파스타; 페이스트 제품, 예컨대 생선 햄, 소시지, 해산물 페이스트 제품; 레토르트 파우치 제품, 예컨대 카레, 걸쭉한 전분 소스를 곁들인 음식, 및 중화 수프; 수프; 유제품, 예컨대 우유, 유제품 음료, 아이스크림, 치즈, 및 요구르트; 발효 식품, 예컨대 된장, 요구르트, 발효 음료, 및 피클; 콩 제품; 비스킷, 쿠키 등을 포함한 다양한 제과 제품, 사탕, 츄잉 껌, 구미, 젤리, 크림 카라멜 및 냉동 디저트를 포함한 차가운 디저트; 인스턴트 식품, 예컨대 인스턴트 수프 및 인스턴트 콩 수프; 전자레인지용 식품; 등을 포함한다. 또한, 예로서 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 액상제, 페이스트, 및 젤리 형태로 제조된 건강식품 및 음료도 포함된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 인간을 포함한 동물용 식품이다. 인간 이외의 동물은 특별히 제한되지 않으며, 상기 조성물은 다양한 가축, 가금류, 애완동물, 실험동물 등에 사용될 수 있다. 동물의 구체적인 예로는 돼지, 소, 말, 양, 염소, 닭, 들오리, 타조, 집오리, 개, 고양이, 토끼, 햄스터, 마우스, 래트, 원숭이 등이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
투여 형태
푸르니에렐라 마실리엔시스로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어, 경구 투여를 위한 고체 투여 형태로 제형화될 수 있다. 고체 투여 형태는 하나 이상의 부형제, 예를 들어 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 고체 투여 형태의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 단리된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 선택적으로, 고체 투여 형태의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 동결건조될 수 있다. 선택적으로, 고체 투여 형태의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 감마 조사된다. 고체 투여 형태는 정제, 미니정제, 캡슐, 환제, 또는 분말; 또는 이러한 형태의 조합(예를 들어, 캡슐에 포함된 미니정제)을 포함할 수 있다.
고체 투여 형태는 정제(예를 들어, > 4 mm)를 포함할 수 있다.
고체 투여 형태는 미니 정제(예를 들어, 1~4 mm 크기의 미니정제, 예를 들어, 2 mm 미니정제 또는 3 mm 미니정제)를 포함할 수 있다.
고체 투여 형태는 캡슐, 예를 들어 크기 00, 크기 0, 크기 1, 크기 2, 크기 3, 크기 4 또는 크기 5 캡슐; 예를 들어, 크기 0 캡슐을 포함할 수 있다.
고체 투여 형태는 코팅을 포함할 수 있다. 고체 투여 형태는 단일층 코팅, 예를 들어 장용 코팅, 예를 들어 Eudragit-기반 코팅, 예를 들어 EUDRAGIT L30 D-55, 트리에틸시트레이트 및 탈크를 포함할 수 있다. 고체 투여 형태는 2개의 코팅 층을 포함할 수 있다. 예를 들어, 내부 코팅은 예를 들어 EUDRAGIT L30 D-55, 트리에틸시트레이트, 탈크, 시트르산 무수물, 및 수산화나트륨을 포함할 수 있고, 외부 코팅은 예를 들어 EUDRAGIT L30 D-55, 트리에틸시트레이트 및 탈크를 포함할 수 있다. EUDRAGIT는 다양한 폴리메타크릴레이트계 공중합체의 브랜드 이름이다. 여기에는 메타크릴산 및 메타크릴/아크릴 에스테르 또는 그의 유도체를 기반으로 하는 음이온성, 양이온성 및 중성 공중합체가 포함된다. Eudragit은 9 내지 > 150℃의 유리 전이 온도를 갖는 비정질 중합체이다. Eudragit은 비-생분해성, 비흡수성, 및 비독성이다. 음이온성 Eudragit L은 6 초과의 pH에서 용해되고 장용 코팅을 위해 사용되는 반면, 7 초과의 pH에서 가용성인 Eudragit S는 결장 표적화를 위해 사용된다. 4차 암모늄 기를 갖는 Eudragit RL 및 RS는 수불용성이지만, 지속 방출 필름 코팅 적용에 적합한 팽윤성/투과성 중합체이다. 5 이상의 pH에서 불용성인 양이온성 Eudragit E는 타액에서 약물 방출을 방지할 수 있다.
고체 투여 형태(예를 들어, 캡슐)는 단일 층 코팅, 예를 들어 HPMC(하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스) 또는 젤라틴과 같은 비-장용 코팅을 포함할 수 있다.
푸르니에렐라 마실리엔시스로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어, 경구 투여를 위한, 또는 주사를 위한 현탁액으로 제형화될 수 있다. 주사 투여는 정맥내(IV), 근육내(IM), 종양내(IT), 및 피하(SC) 투여를 포함한다. 현탁액을 위해, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 완충액, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 완충액, 예를 들어, 식염수 또는 PBS에 존재할 수 있다. 현탁액은 1종 이상의 부형제, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 수크로스 또는 글루코스를 포함할 수 있다. 현탁액의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 단리된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 선택적으로, 현탁액의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 동결건조될 수 있다. 선택적으로, 현탁액의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합은 감마 조사될 수 있다.
투약량
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터의 mEV의 용량은 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014개 입자(예를 들어, 입자 수는 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 결정됨)이다.
추가 예로서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터의 mEV는 예를 들어 NTA에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어 약 1x107 내지 약 1x1015개 입자들의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, mEV의 용량은 약 1 x 105 내지 약 7 x 1013개 입자(예를 들어, 입자 수는 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 결정됨)이다. 일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터의 mEV의 용량은 약 1 x 1010 내지 약 7 x 1013개 입자(예를 들어, 입자 수는 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 결정됨)이다.
또 다른 예로서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터의 mEV는 예를 들어, 브래드포드 검정에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg 총 단백질의 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아로부터의 mEV는 예를 들어, BCA 검정에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg 총 단백질의 용량으로 투여될 수 있다.
푸르니에렐라 마실리엔시스로부터의 mEV는 예를 들어 NTA에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어 약 1x107 내지 약 1x1015개 입자들의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, mEV의 용량은 약 1 x 105 내지 약 7 x 1013개 입자(예를 들어, 입자 수는 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨)이다. 일부 구현예에서, 박테리아로부터의 mEV의 용량은 약 1 x 1010 내지 약 7 x 1013개 입자(예를 들어, 입자 수는 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨)이다. 일부 구현예에서, 박테리아로부터의 mEV의 용량은 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014개 입자(예를 들어, 입자 수는 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨)이다.
또 다른 예로서, 푸르니에렐라 마실리엔시스로부터의 mEV는 예를 들어, 브래드포드 검정에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg 총 단백질의 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 박테리아로부터의 mEV는 예를 들어, BCA 검정에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg 총 단백질의 용량으로 투여될 수 있다.
인간 대상체에 대한 경구 투여를 위해, 푸르니에렐라 마실리엔시스로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 용량은 예를 들어, 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x107 내지 약 1x1015, 약 1x108 내지 약 1x1014, 약 1x109 내지 약 1x1013, 약 1x1010 내지 약 1x1014, 또는 약 1x108 내지 약 1x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x106, 약 2x107, 약 2x108, 약 2x109, 약 1x1010, 약 2x1010, 약 2x1011, 약 2x1012, 약 2x1013, 약 2x1014, 또는 약 1x1015개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1010개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x1010개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1011개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1013개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1014개 입자일 수 있다. 입자 수는 예를 들어, NTA에 의해 결정될 수 있다.
인간 대상체에 대한 경구 투여를 위해, 푸르니에렐라 마실리엔시스로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 용량은 예를 들어, 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x107 내지 약 1x1015, 약 1x108 내지 약 1x1014, 약 1x109 내지 약 1x1013, 약 1x1010 내지 약 1x1014, 또는 약 1x108 내지 약 1x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x106, 약 2x107, 약 2x108, 약 2x109, 약 1x1010, 약 2x1010, 약 2x1011, 약 2x1012, 약 2x1013, 약 2x1014, 또는 약 1x1015개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1010개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x1010개 입자일 수 있다. 인간 대상체에 대한 경구 투여를 위해, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 용량은 예를 들어 총 단백질을 기준으로 할 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 20 mg 내지 약 800 mg, 약 50 mg 내지 약 700 mg, 약 75 mg 내지 약 600 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 250 mg 내지 약 750 mg, 또는 약 200 mg 내지 약 500 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 10 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 또는 약 750 mg 총 단백질일 수 있다. 총 단백질은 예를 들어, 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정될 수 있다.
인간 대상체에 대한 주사(예를 들어, 정맥내 투여)에 의한 투여의 경우, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 용량은 예를 들어, 약 1x106 내지 약 1x1016개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x107 내지 약 1x1015, 약 1x108 내지 약 1x1014, 약 1x109 내지 약 1x1013, 약 1x1010 내지 약 1x1014, 또는 약 1x108 내지 약 1x1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x106, 약 2x107, 약 2x108, 약 2x109, 약 1x1010, 약 2x1010, 약 2x1011, 약 2x1012, 약 2x1013, 약 2x1014, 또는 약 1x1015개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1x1015개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1011개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1012개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1013개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 1 x 1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1014개 입자일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 2x1013개 입자일 수 있다. 입자 수는 예를 들어 NTA에 의해 결정될 수 있다.
주사(예를 들어, 정맥내 투여)에 의한 투여의 경우, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 용량은 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 900 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 20 mg 내지 약 800 mg, 약 50 mg 내지 약 700 mg, 약 75 mg 내지 약 600 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 250 mg 내지 약 750 mg, 또는 약 200 mg 내지 약 500 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 10 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 또는 약 750 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 700 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 350 mg 총 단백질일 수 있다. 용량은 예를 들어, 약 175 mg 총 단백질일 수 있다. 총 단백질은 예를 들어, 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정될 수 있다.
감마선 조사
분말(예를 들어, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합)은 주변 온도에서 17.5 kGy 방사선 단위로 감마선-조사될 수 있다.
동결된 바이오매스(예를 들어, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합)은 드라이 아이스의 존재 하에 25 kGy 방사선 단위로 감마선-조사될 수 있다.
추가 치료제
특정 양태에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 기재된 약제학적 조성물을 단독으로 또는 추가 치료제와 조합하여 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 암 치료제이다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스로부터의 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제가 투여되기 전에 대상체에게 투여된다(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 전 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 전). 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제가 투여된 후에 대상체에게 투여된다(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 후 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 후). 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합 및 추가 치료제를 포함하는 약제학적 조성물은 동시에 또는 거의 동시에 대상체에게 투여된다(예를 들어, 투여 간의 간격은 1시간 이내이다).
일부 구현예에서, 항생제는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물이 대상체에게 투여되기 전에 대상체에게 투여된다(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 전 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 전). 일부 구현예에서, 항생제는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물이 대상체에게 투여된 후에 대상체에게 투여된다(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 전 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 후). 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합 및 항생제를 포함하는 약제학적 조성물은 동시에 또는 거의 동시에 대상체에게 투여된다(예를 들어, 투여 간의 간격은 1시간 이내이다).
일부 구현예에서, 추가 치료제는 암 치료제이다. 일부 구현예에서, 암 치료제는 화학요법제이다. 이러한 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신, 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로소우레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항셍제, 예컨대 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마I 및 칼리케아마이신 오메가1; 다이네마이신(다이네마이신 A 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사성물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK 다당류 복합체); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A, 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀; 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오미틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 암 치료제는 암 면역요법제이다. 면역요법은 대상체의 면역계를 사용하여 암을 치료하는 치료를 의미한다(예를 들어, 관문 억제제, 암 백신, 사이토카인, 세포 요법, CAR-T 세포, 및 수지상 세포 요법). 면역요법의 비제한적 예는 관문 억제제로 니볼루맙(BMS, 항-PD-1), 펨브롤리주맙(Merck, 항-PD-1), 이필리무맙(BMS, 항-CTLA-4), MEDI4736(AstraZeneca, 항-PD-L1), 및 MPDL3280A(Roche, 항-PD-L1)를 포함한다. 기타 면역요법은 Gardail, Cervarix, BCG, sipulencel-T, Gp100:209-217, AGS-003, DCVax-L, Algenpantucel-L, Tergenpantucel-L, TG4010, ProstAtak, Prostvac-V/R-TRICOM, Rindopepimul, E75 펩티드 아세테이트, IMA901, POL-103A, Belagenpumatucel-L, GSK1572932A, MDX-1279, GV1001, 및 Tecemotide와 같은 종양 백신일 수 있다. 면역요법제는 주사를 통해(예를 들어, 정맥내, 종양내, 피하, 또는 림프절 내로) 투여될 수 있지만, 경구, 국소, 또는 에어로졸을 통해 투여될 수도 있다. 면역요법은 사이토카인과 같은 보조제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역요법제는 면역관문 억제제이다. 면역관문 억제는 광범위하게, 암세포가 면역 반응을 막거나 하향조절하기 위해 생성할 수 있는 관문을 억제하는 것을 지칭한다. 면역관문 단백질의 예는 CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 또는 VISTA를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 면역관문 억제제는 면역관문 단백질에 결합하여 이를 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 면역관문 억제제의 예에는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-224, AMP-514, STI-A1110, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB-0010718C(아벨루맙), AUR-012 및 STI-A1010이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역관문 억제제는 CTLA-4 억제제이다. 일부 구현예에서, 면역관문 억제제는 PD-1 억제제이다. 일부 구현예에서, 면역관문 억제제는 PD-L1 억제제이다. 일부 구현예에서, 면역관문 억제제는 항체이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 기재된 약제학적 조성물을 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 2종의 면역요법제(예를 들어, 면역관문 억제제)의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 PD-1 억제제(예컨대 펨롤리주맙 또는 니볼루맙 또는 피딜리주맙) 또는 CLTA-4 억제제(예컨대 이필리무맙) 또는 PD-L1 억제제(예컨대 아벨루맙)와 조합하여 본원에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역요법제는 예를 들어 암-관련 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 암-관련 항원의 예는 아디포필린, AIM-2, ALDH1A1, 알파-액티닌-4, 알파-태아단백질("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX(L), BCR-ABL 융합 단백질 b3a2, 베타-카테닌, BING-4, CA-125, CALCA, 암배아 항원("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, 사이클린 D1, 사이클린-A1, dek-can 융합 단백질, DKK1, EFTUD2, 신장 인자 2, ENAH(hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, 상피 종양 항원("ETA"), ETV6-AML1 융합 단백질, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, 글리피칸-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, 헵신, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13R알파2, 장 카복실 에스테라제, K-ras, 칼리크레인(Kallikrein) 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, CCDC110으로도 알려진 KMHN1, LAGE-1, LDLR-푸코실트랜스퍼라제 AS 융합 단백질, 렝신(Lengsin), M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, 말산 효소, 맘마글로빈-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, 멜로에(Meloe), 미드카인(Midkine), MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, 뮤신, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신, 미오신 클래스 I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P 폴리펩티드, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RAR알파 융합 단백질, 다형성 상피 뮤신("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, 세서린(secernin) 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, 서바이빈(survivin), SYT-SSX1 또는 -SSX2 융합 단백질, TAG-1, TAG-2, 텔로머라제, TGF-베타RII, TPBG, TRAG-3, 트리오세포스페이트 아이소머라제, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, 티로시나제, 티로시나제("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항원은 신생항원이다.
일부 구현예에서, 면역요법제는 암 백신 및/또는 암 백신의 성분(예를 들어, 항원성 펩타이드 및/또는 단백질)이다. 암 백신은 단백질 백신, 핵산 백신, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 암 백신은 암-관련 항원의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 암 백신은 암-관련 항원의 에피토프를 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대 mRNA)을 포함한다. 암-관련 항원의 예는 아디포필린, AIM-2, ALDH1A1, 알파-액티닌-4, 알파-태아단백질("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX(L), BCR-ABL 융합 단백질 b3a2, 베타-카테닌, BING-4, CA-125, CALCA, 암배아 항원("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, 사이클린 D1, 사이클린-A1, dek-can 융합 단백질, DKK1, EFTUD2, 신장 인자 2, ENAH(hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, 상피 종양 항원("ETA"), ETV6-AML1 융합 단백질, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, 글리피칸-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, 헵신, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13R알파2, 장 카복실 에스테라제, K-ras, 칼리크레인(Kallikrein) 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, CCDC110으로도 알려진 KMHN1, LAGE-1, LDLR-푸코실트랜스퍼라제 AS 융합 단백질, 렝신(Lengsin), M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, 말산 효소, 맘마글로빈-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, 멜로에(Meloe), 미드카인(Midkine), MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, 뮤신, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신, 미오신 클래스 I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P 폴리펩티드, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RAR알파 융합 단백질, 다형성 상피 뮤신("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, 세서린(secernin) 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, 서바이빈(survivin), SYT-SSX1 또는 -SSX2 융합 단백질, TAG-1, TAG-2, 텔로머라제, TGF-베타RII, TPBG, TRAG-3, 트리오세포스페이트 아이소머라제, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, 티로시나제, 티로시나제("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항원은 신생항원이다. 일부 구현예에서, 암 백신은 보조제와 함께 투여된다. 보조제의 예는 면역조절 단백질, 아주반트 65, α-GalCer, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 포스페이트, β-글루칸 펩티드, CpG ODN DNA, GPI-0100, 지질 A, 지질다당류, 리포반트, 몬타나이드, N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, Pam3CSK4, quil A, 콜레라 독소(CT) 및 이의 유도체(CTB, mmCT, CTA1-DD, LTB, LTK63, LTR72, dmLT)를 포함하는 장독소성 에셰리키아 콜라이(LT)로부터의 열분해성 독소, 및 트레할로스 디미콜레이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 면역요법제는 대상체에 대한 면역조절 단백질이다. 일부 구현예에서, 면역조절 단백질은 사이토카인 또는 케모카인이다. 면역 조절 단백질의 예에는 B 림프구 화학유인물질("BLC"), C-C 모티프 케모카인 11("에오탁신-1"), 호산구 화학주성 단백질 2("에오탁신-2"), 과립구 콜로니-자극 인자("G-CSF"), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자("GM-CSF"), 1-309, 세포간 접착 분자 1("ICAM-1"), 인터페론 알파("IFN-알파"), 인터페론 베타("IFN-베타") 인터페론 감마("IFN-감마"), 인터루킨-1 알파("IL-1 알파"), 인터루킨-1 베타("IL-1 베타"), 인터루킨1 수용체 길항제("IL-1 ra"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-4("IL-4"), 인터루킨-5("IL-5"), 인터루킨-6("IL-6"), 인터루킨-6 가용성 수용체("IL-6 sR"), 인터루킨-7("IL-7"), 인터루킨-8("IL-8"), 인터루킨- 10("IL-10"), 인터루킨- 11("IL-11"), 인터루킨- 12의 서브유닛 베타("IL-12 p40" 또는 "IL-12 p70"), 인터루킨-13("IL-13"), 인터루킨-15("IL-15"), 인터루킨-16("IL-16"), 인터루킨-17A-F("IL-17A-F"), 인터루킨-18("IL-18"), 인터루킨-21("IL-21"), 인터루킨-22("IL-22"), 인터루킨-23("IL-23"), 인터루킨-33("IL-33"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2("MCP-1"), 대식세포 콜로니-자극 인자("M-CSF"), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노카인("MIG"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2("MIP-1 알파"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 4("MIP-1 베타ta"), 대식세포 염증성 단백질-1-델타("MIP-1 델타"), 혈소판-유래 성장 인자 서브유닛 B("PDGF-BB"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 5, 활성화에 대한 조절, 정상 T 세포 발현 및 분비("RANTES"), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1("TIMP-1"), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 2("TIMP-2"), 종양 괴사 인자, 림프독소-알파("TNF 알파"), 종양 괴사 인자, 림프독소-베타("TNF 베타"), 가용성 TNF 수용체 유형 1("sTNFRI"), sTNFRIIAR, 뇌-유래 신경영양 인자("BDNF"), 기본 섬유아세포 성장 인자("bFGF"), 골형성 단백질 4("BMP-4"), 골형성 단백질 5("BMP-5"), 골형성 단백질 7("BMP-7"), 신경 성장 인자("b-NGF"), 표피 성장 인자("EGF"), 표피 성장 인자 수용체("EGFR"), 내분비선-유래 혈관 내피 성장 인자("EG-VEGF"), 섬유아세포 성장 인자 4("FGF-4"), 각질세포 성장 인자("FGF-7"), 성장 분화 인자 15("GDF-15"), 신경교 세포-유래 신경영양 인자("GDNF"), 성장 호르몬, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자("HB-EGF"), 간세포 성장 인자("HGF"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질1("IGFBP-1"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질2("IGFBP-2"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질3("IGFBP-3"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질4("IGFBP-4"), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질6("IGFBP-6"), 인슐린-유사 성장 인자 1("IGF-1"), 인슐린, 대식세포 콜로니-자극 인자("M-CSF R"), 신경 성장 인자 수용체("NGF R"), 뉴로트로핀-3("NT-3"), 뉴로트로핀-4("NT-4"), 파골세포형성 억제 인자("오스테오프로테게린"), 혈소판-유래 성장 인자 수용체("PDGF-AA"), 포스파티딜이노시톨-글리칸 생합성("PIGF"), Skp, Cullin, F-박스 함유 복합체("SCF"), 줄기 세포 인자 수용체("SCF R"), 변형 성장 인자 알파("TGF알파"), 변형 성장 인자 베타-1("TGF beta 1"), 변형 성장 인자 베타-3("TGF beta 3"), 혈관 내피 성장 인자("VEGF"), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2("VEGFR2"), 혈관 내피 성장 인자 수용체 3("VEGFR3"), VEGF-D 6Ckine, 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO("Axl"), 베타셀룰린("BTC"), 점막-관련 상피 케모카인("CCL28"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 27("CTACK"), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 16("CXCL16"), C-X-C 모티프 케모카인 5("ENA-78"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 26("에오탁신-3"), 과립구 주화성 단백질 2("GCP-2"), GRO, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 14("HCC-l"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 16("HCC-4"), 인터루킨-9("IL-9"), 인터루킨-17 F("IL-17F"), 인터루킨-18-결합 단백질("IL-18 BPa"), 인터루킨-28 A("IL-28A"), 인터루킨 29("IL-29"), 인터루킨 31("IL-31"), C-X-C 모티프 케모카인 10("IP-10"), 케모카인 수용체 CXCR3("I-TAC"), 백혈병 억제 인자("LIF"), 빛, 케모카인(C 모티프) 리간드("림포택틴"), 단핵구 화학유인 단백질 2("MCP-2"), 단핵구 화학유인 단백질 3("MCP-3"), 단핵구 화학유인 단백질 4("MCP-4"), 대식세포-유래 케모카인("MDC"), 대식세포 이동 억제 인자("MIF"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 20("MIP-3 알파"), C-C 모티프 케모카인 19("MIP-3 베타"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 23("MPIF-1"), 대식세포 자극 단백질 알파 사슬("MSP알파"), 뉴클레오솜 조립 단백질 1-유사 4("NAP-2"), 분비된 인단백질 1("오스테오폰틴"), 폐 및 활성화-조절 사이토카인("PARC"), 혈소판 인자 4("PF4"), 간질-세포 유래 인자-1 알파("SDF-1 알파"), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 17("TARC"), 흉선-발현 케모카인("TECK"), 흉선 간질 림프포이에틴("TSLP 4- IBB"), CD 166 항원("ALCAM"), 분화 클러스터 80("B7-1"), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 17("BCMA"), 분화 클러스터 14("CD14"), 분화 클러스터 30("CD30"), 분화 클러스터 40("CD40 리간드"), 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1(담즙 당단백질)("CEACAM-1"), 사멸 수용체 6("DR6"), 데옥시티미딘 키나제("Dtk"), 유형 1 막 당단백질("엔도글린"), 수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-3("ErbB3"), 내피-백혈구 부착 분자 1("E-Selectin"), 아폽토시스 항원 1("Fas"), Fms-유사 티로신 키나제 3("Flt-3L"), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 1("GITR"), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 14("HVEM"), 세포간 부착 분자 3("ICAM-3"), IL-1 R4, IL-1 RI, IL-10 R베타, IL-17R, IL-2R감마, IL-21R, 리소좀 막 단백질 2("LIMPII"), 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린("리포칼린-2"), CD62L("L-셀렉틴"), 림프 내피("LYVE-1"), MHC 클래스 I 폴리펩타이드-관련 서열 A("MICA"), MHC 클래스 I 폴리펩타이드-관련 서열 B("MICB"), NRGl-베타, 베타형 혈소판-유래 성장 인자 수용체("PDGF R베타"), 혈소판 내피 세포 부착 분자("PECAM-1"), RAGE, A형 간염 바이러스 세포 수용체 1("TIM-1"), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 IOC("TRAIL R3"), 트라핀 단백질 트랜스글루타미나제 결합 도메인("트라핀-2"), 우로키나제 수용체("uPAR"), 혈관 세포 부착 단백질 1("VCAM-1"), XEDARActivin A, Agouti-관련 단백질("AgRP"), 리보뉴클레아제 5("안지오게닌"), 안지오포이에틴 1, 안지오스타틴, 카테프린 S, CD40, 크립틱 패밀리 단백질 IB("Cripto-1"), DAN, Dickkopf-관련 단백질 1("DKK-1"), E-카드헤린, 상피 세포 부착 분자("EpCAM"), Fas 리간드(FasL 또는 CD95L), Fcg RIIB/C, 폴리스타틴, 갈렉틴-7, 세포간 부착 분자 2("ICAM-2"), IL-13 Rl, IL-13R2, IL-17B, IL-2 Ra, IL-2 Rb, IL-23, LAP, 신경 세포 부착 분자("NrCAM"), 플라스미노겐 활성화제 억제제- 1("PAI-1"),혈소판 유래 성장 인자 수용체("PDGF-AB"), 레지스틴, 기질 세포-유래 인자 1("SDF-1 베타"), sgpl30, 분비된 프리즐드-관련 단백질 2("ShhN"), 시알산-결합 면역글로불린형 렉틴("Siglec-5"), ST2, 형질전환 성장 인자-베타 2("TGF 베타 2"), Tie-2, 트롬보포이에틴("TPO"), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10D("TRAIL R4"), 골수 세포에서 발현된 트리거 수용체 1("TREM-1"), 혈관 내피 성장 인자 C("VEGF-C"), VEGFRl아디포넥틴, 아딥신("AND"), 알파-태아단백질("AFP"), 안지오포이에틴-유사 4("ANGPTL4"), 베타-2-마이크로글로불린("B2M"), 기저 세포 부착 분자("BCAM"), 탄수화물 항원 125("CA125"), 암 항원15-3("CA15-3"), 암배아 항원("CEA"), cAMP 수용체 단백질("CRP"), 인간 상피 성장 인자 수용체 2("ErbB2"), 폴리스타틴, 난포-자극 호르몬("FSH"), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1("GRO 알파"), 인간 융모막 성선자극호르몬("베타 HCG"), 인슐린-유사 성장 인자1 수용체("IGF-1 sR"), IL-1 sRII, IL-3, IL-18 Rb, IL-21, 렙틴, 매트릭스 메탈로프로테이나제-1("MMP-1"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-2("MMP-2"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-3("MMP-3"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-8("MMP-8"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-9("MMP-9"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-10("MMP-10"), 매트릭스 메탈로프로테이나제-13("MMP-13"), 신경 세포 부착 분자("NCAM-1"), 엔탁틴("니도겐-1"), 뉴런 특이적 에놀라제("NSE"), 온코스타틴 M("OSM"), 프로칼시토닌, 프로락틴, 전립선 특이적 항원("PSA"), 시알산-결합 Ig-유사 렉틴 9("Siglec-9"), ADAM 17 엔도펩티다제("TACE"), 티로글로불린, 메탈로프로테이나제 억제제 4("TIMP-4"), TSH2B4, 디스인테그린 및 메탈로프르 오테이나제 도메인-함유 단백질 9("ADAM-9"), 안지오포이에틴 2, 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 13/ 산성 류신-풍부 핵 인단백질 32 패밀리 구성원 B("APRIL"), 골 형태 형성 단백질 2("BMP-2"), 골 형태 형성 단백질 9("BMP-9"), 보체 성분 5a("C5a"), 카텝신 L, CD200, CD97, 케메린, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 6B("DcR3"), 지방산 결합 단백질 2("FABP2"), 섬유아세포 활성화 단백질, 알파("FAP"), 섬유아세포 성장 인자 19("FGF-19"), 갈렉틴-3, 간세포 성장 인자 수용체("HGF R"), IFN-감마알파/베타 R2, 인슐린-유사 성장 인자 2("IGF-2"), 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체("IGF-2 R"), 인터루킨-1 수용체 6("IL-1R6"), 인터루킨 24("IL-24"), 인터루킨 33("IL-33", 칼리크레인 14, 아스파라기닐 엔도펩티다제("레구마인(Legumain)"), 산화된 저밀도 지단백질 수용체 1("LOX-1"), 만노스-결합 렉틴("MBL"), 네프릴리신("NEP"), 노치 동족체 1, 전위 관련(초파리)("Notch-1"), 과발현된 신모세포종("NOV"), 오스테오액티빈, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1("PD-1"), N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제("PGRP-5"), 세르핀 A4, 분비된 프리즐드 관련 단백질 3("sFRP-3"), 트롬보모듈린, 톨라이크 수용체 2("TLR2"), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10A("TRAIL Rl"), 트랜스페린("TRF"), WIF-lACE-2, 알부민, AMICA, 안지오포이에틴 4, B-세포 활성화 인자("BAFF"), 탄수화물 항원 19-9("CA19-9"), CD 163, 클러스터린, CRT AM, 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 14("CXCL14"), 시스타틴 C, 데코린("DCN"), Dickkopf-관련 단백질 3("Dkk-3"), 델타-유사 단백질 1("DLL1"), 페투인 A, 헤파린-결합 성장 인자 1("aFGF"), 폴레이트 수용체 알파("FOLR1"), 푸린, GPCR-관련 분류 단백질 1("GASP-1"), GPCR-관련 분류 단백질 2("GASP-2"), 과립구 콜로니-자극 인자 수용체("GCSF R"), 세린 프로테아제 헵신("HAI-2"), 인터류킨-17B 수용체("IL-17B R"), 인터루킨 27("IL-27"), 림프구-활성화 유전자 3("LAG-3"), 아포지단백질 A-V("LDL R"), 펩시노겐 I, 레티놀 결합 단백질 4("RBP4"), SOST, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸("Syndecan-1"), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 13B("TACI"), 조직 인자 경로 억제제("TFPI"), TSP-1, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 10b("TRAIL R2"), TRANCE, 트로포닌 I, 우로키나제 플라스미노겐 활성화제("uPA"), 카드헤린 5, 유형 2 또는 CD144로도 알려진 VE-카드헤린(혈관 내피)("VE-카드헤린"), WNTl-유도성-시그날링 경로 단백질 1("WISP-1"), 및 핵 인자 κ B의 수용체 활성제("RANK")가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 암 치료제는 항암 화합물이다. 예시적인 항암 화합물은 알렘투주맙(Campath®), 알리트레티노인(Panretin®), 아나스트로졸(Arimidex®), 베바시주맙(Avastin®), 벡사로텐(Targretin®), 보르테조밉(Velcade®), 보수티닙(Bosulif®), 브렌툭시맙 베도틴(Adcetris®), 카보잔티닙(CometriqTM), 카르필조밉(KyprolisTM), 세툭시맙(Erbitux®), 크리조티닙(Xalkori®), 다사티닙(Sprycel®), 데닐류킨 디프티톡스(Ontak®), 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®), 에베롤리무스(Afinitor®), 엑세메스탄(Aromasin®), 풀베스트란트(Faslodex®), 게피티닙(Iressa®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 이마티닙 메실레이트(Gleevec®), 이필리무맙(YervoyTM), 라파티닙 디토실레이트(Tykerb®), 레트로졸(Femara®), 닐로티닙(Tasigna®), 오파투무맙(Arzerra®), 파니투무맙(Vectibix®), 파조파닙 하이드로클로라이드(Votrient®), 퍼투주맙(PerjetaTM), 프랄라트렉세이트(Folotyn®), 레고라페닙(Stivarga®), 리툭시맙(Rituxan®), 로미뎁신(Istodax®), 소라페닙 토실레이트(Nexavar®), 수니티닙 말레이트(Sutent®), 타목시펜, 템시롤리무스(Torisel®), 토레미펜(Fareston®), 토시투모맙 및 131I-토시투모맙(Bexxar®), 트라스투주맙(Herceptin®), 트레티노인(Vesanoid®), 반데타닙(Caprelsa®), 베무라페닙(Zelboraf®), 보리노스타트(Zolinza®), 및 지브-아플리버셉트(Zaltrap®)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
유전자 발현 및 기타 세포 기능을 조절하는 단백질의 기능을 변형시키는 예시적인 항암 화합물(예를 들어, HDAC 억제제, 레티노이드 수용체 리간드)은 보리노스타트(Vorinostat)(Zolinza®), 벡사로텐(Bexarotene)(Targretin®) 및 로미뎁신(Romidepsin)(Istodax®), 알리트레티노인(Alitretinoin)(Panretin®), 및 트레티노인(Tretinoin)(Vesanoid®)이다.
세포자멸사를 유도하는 예시적인 항암 화합물(예를 들어, 프로테아좀 억제제, 항엽산제)은 보르테조밉(Velcade®), 카르필조밉(KyprolisTM), 및 프랄라트렉세이트(Folotyn®)이다.
항종양 면역 반응을 증가시키는 예시적인 항암 화합물(예를 들어, 항 CD20, 항 CD52; 항-세포독성 T-림프구-관련 항원-4)은 리툭시맙(Rituxan®), 알렘투주맙(Campath®), 오파투무맙(Arzerra®), 및 이필리무맙(YervoyTM)이다.
독성 물질을 암세포에 전달하는 예시적인 항암 화합물(예를 들어, 항-CD20-방사성 핵종 융합체; IL-2-디프테리아 독소 융합체; 항-CD30-모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)-융합체)은 토시투모맙 및 131I-토시투모맙(Bexxar®) 및 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 데닐류킨 디프티톡스(Ontak®), 및 브렌툭시맙 베도틴(Adcetris®)이다.
기타 예시적인 항암 화합물은 예를 들어 야누스 키나제, ALK, Bcl-2, PARP, PI3K, VEGF 수용체, Braf, MEK, CDK, 및 HSP90의 소분자 억제제 및 이의 접합체이다.
예시적인 백금계 항암 화합물은 예를 들어 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 피코플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴, 및 리포플라틴을 포함한다. 치료에 적합한 기타 금속계 약물은 루테늄계 화합물, 페로센 유도체, 티타늄계 화합물, 및 갈륨계 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 암 치료제는 방사성핵종을 포함하는 방사성 모이어티이다. 예시적인 방사성 핵종은 Cr-51, Cs-131, Ce-134, Se-75, Ru-97, I-125, Eu-149, Os-189m, Sb-119, I-123, Ho-161, Sb-117, Ce-139, In-111, Rh-103m, Ga-67, Tl-201, Pd-103, Au-195, Hg-197, Sr-87m, Pt-191, P-33, Er-169, Ru-103, Yb-169, Au-199, Sn-121, Tm-167, Yb-175, In-113m, Sn-113, Lu-177, Rh-105, Sn-117m, Cu-67, Sc-47, Pt-195m, Ce-141, I-131, Tb-161, As-77, Pt-197, Sm-153, Gd-159, Tm-173, Pr-143, Au-198, Tm-170, Re-186, Ag-111, Pd-109, Ga-73, Dy-165, Pm-149, Sn-123, Sr-89, Ho-166, P-32, Re-188, Pr-142, Ir-194, In-114m/In-114, 및 Y-90을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 암 치료제는 항생제이다. 예를 들어, 암-관련 박테리아 및/또는 암-관련 미생물군 프로파일의 존재가 본원에 제공된 방법에 따라 검출되는 경우, 대상체로부터 암-관련 박테리아를 제거하기 위해 항생제가 투여될 수 있다. "항생제"는 광범위하게 박테리아 감염을 억제 또는 예방할 수 있는 화합물을 지칭한다. 항생제는 특정 감염에 대한 사용, 그들의 작용 기전, 그들의 생체이용률 또는 표적 미생물의 스펙트럼(예를 들어, 그람-음성 대 그람-양성 박테리아, 호기성 대 혐기성 박테리아, 등)을 포함하는 여러 방식으로 분류될 수 있으며, 이들은 숙주의 특정 영역("적소")에서 특정 박테리아를 사멸시키는 데 사용될 수 있다(문헌[Leekha, et al 2011. General Principles of Antimicrobial Therapy. Mayo Clin Proc. 86(2): 156-167]). 특정 구현예에서, 항생제는 특정 미세환경의 박테리아를 선택적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암 미세환경을 포함하는 특정 감염을 치료하는 것으로 알려진 항생제는 해당 미세환경 내의 암-관련 박테리아를 포함하여 암-관련 미생물을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 항생제는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, 항생제는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물 이전에 투여된다.
일부 양태에서, 항생제는 살균 또는 정균 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 살균 항생제는 세포벽(예를 들어, β-락탐), 세포막(예를 들어, 답토마이신) 또는 박테리아 DNA(예를 들어, 플루오로퀴놀론)를 파괴하는 작용 기전을 포함한다. 정균제는 박테리아 복제를 억제하며, 설폰아미드, 테트라사이클린, 및 마크로라이드를 포함하며, 단백질 합성을 억제함으로써 작용한다. 또한, 일부 약물은 특정 유기체에서는 살균성이고 다른 유기체에서는 정균성일 수 있지만, 표적 유기체를 알면 당업자는 적절한 특성을 갖는 항생제를 선택할 수 있다. 특정 치료 조건에서, 정균 항생제는 살균 항생제의 활성을 억제한다. 따라서, 특정 구현예에서, 살균 항생제와 정균 항생제는 조합되지 않는다.
항생제는 아미노글리코시드, 안사마이신, 카바세펨, 카바페넴, 세팔로스포린, 글리코펩티드, 린코사미드, 리포펩티드, 마크로라이드, 모노박탐, 니트로푸란, 옥사졸리도논, 페니실린, 폴리펩티드 항생제, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 설폰아미드, 테트라사이클린, 및 항마이코박테리아 화합물, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
아미노글리코시드는 아미카신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 토브라마이신, 파로모마이신, 및 스펙티노마이신을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 아미노글리코시드는 예를 들어 에셰리키아 콜라이, 클렙시엘라, 슈도모나스 아에루기노사, 및 프란시셀라 툴라렌시스와 같은 그람-음성 박테리아와 특정 호기성 박테리아에 대해 효과적이지만, 절대/통성 혐기성균에 대해서는 덜 효과적이다. 아미노글리코시드는 박테리아 30S 또는 50S 리보솜 서브유닛에 결합하여 박테리아 단백질 합성을 억제하는 것으로 믿어진다.
안사마이신은 겔다나마이신, 허비마이신, 리파마이신, 및 스트렙토바리신을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 겔다나마이신과 허비마이신은 열충격 단백질 90의 기능을 억제하거나 변경하는 것으로 여겨진다.
카바세펨은 로라카르베프를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 카바세펨은 박테리아의 세포벽 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
카바페넴은 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴/실라스타틴, 및 메로페넴을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 카바페넴은 광범위한 항생제로서 그람-양성 및 그람-음성 박테리아 모두에 대해 살균성이 있다. 카바페넴은 박테리아의 세포벽 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
세팔로스포린은 세파드록실, 세파졸린, 세팔로틴, 세팔로씬, 세팔렉신, 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심, 세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세페핌, 세프타롤린 포사밀, 및 세프토비프롤을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 선택된 세팔로스포린은 예를 들어 슈도모나스를 비롯한, 그람-음성 박테리아와 그람-양성 박테리아에 대해 효과적이며, 특정 세팔로스포린은 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)에 대해 효과적이다. 세팔로스포린은 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 층의 합성을 방해하여 박테리아 세포벽 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
글리코펩티드는 테이코플라닌, 반코마이신, 및 텔라반신을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 글리코펩티드는 예를 들어 MRSA 및 클로스트리디움 디피실레를 비롯한, 호기성 및 혐기성 그람-양성 박테리아에 대해 효과적이다. 글리코펩티드는 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 층의 합성을 방해하여 박테리아 세포벽 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
린코사미드는 클린다마이신 및 린코마이신을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 린코사미드는 예를 들어 혐기성 박테리아, 뿐만 아니라 스타필로코커스 및 스트렙토코커스에 대해 효과적이다. 린코사미드는 박테리아 50S 리보솜 서브유닛에 결합하여 박테리아 단백질 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
리포펩티드는 답토마이신을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 리포펩티드는 예를 들어 그람-양성 박테리아에 대해 효과적이다. 리포펩티드는 박테리아막에 결합하여 급속한 탈분극을 일으키는 것으로 여겨진다.
마크로라이드는 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 트롤레안도마이신, 텔리트로마이신, 및 스피라마이신을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 마크로라이드는 예를 들어 스트렙토코커스 및 마이코플라스마에 대해 효과적이다. 마크로라이드는 박테리아 또는 50S 리보솜 서브유닛에 결합하여 박테리아 단백질 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
모노박탐은 아즈트레오남을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 모노박탐은 예를 들어 그람-음성 박테리아에 대해 효과적이다. 모노박탐은 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 층의 합성을 방해하여 박테리아 세포벽 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
니트로푸란은 푸라졸리돈 및 니트로푸란토인을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
옥사졸리도논은 리네졸리드, 포시졸리드, 라데졸리드, 및 토레졸리드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 옥사졸리도논은 단백질 합성 억제제인 것으로 여겨진다.
페니실린은 아목시실린, 암피실린, 아즐로실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 테모실린, 및 티카르실린을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 페니실린은 예를 들어 그람-양성 박테리아, 통성혐기성균, 예를 들어 스트렙토코커스, 보렐리아, 및 트레포네마에 대해 효과적이다. 페니실린은 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 층의 합성을 방해하여 박테리아 세포벽 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
페니실린 조합은 아목시실린/클라불라네이트, 암피실린/설박탐, 피페라실린/타조박탐, 및 티카르실린/클라불라네이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
폴리펩티드 항생제는 바시트라신, 콜리스틴, 및 폴리믹신 B 및 E를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 폴리펩티드 항생제는 예를 들어 그람-음성 박테리아에 대해 효과적이다. 특정 폴리펩티드 항생제는 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 층의 합성에 관여하는 이소프레닐 피로포스페이트를 억제하는 반면, 다른 항생제는 박테리아 반대-이온을 대체하여 박테리아 외막을 불안정화시키는 것으로 여겨진다.
퀴놀론 및 플루오로퀴놀론은 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 제미플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 그레파플록사신, 스파플록사신, 및 테마플록사신을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 퀴놀론/플루오로퀴놀론은 예를 들어 스트렙토코커스 및 나이세리아에 대해 효과적이다. 퀴놀론/플루오로퀴놀론은 박테리아 DNA 자이라제 또는 토포이소머라제 IV를 억제하여 DNA 복제 및 전사를 억제하는 것으로 여겨진다.
설폰아미드는 마페니드, 설파세타미드, 설파디아진, 은 설파디아진, 설파디메톡신, 설파메티졸, 설파메톡사졸, 설파닐이미드, 설파살라진, 설피속사졸, 트리메토프림-설파메톡사졸(코-트리목사졸), 및 설폰아미도크리소이딘을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 설폰아미드는 디하이드로프테로에이트 합성효소의 경쟁적 억제에 의해 엽산 합성을 억제하여 핵산 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
테트라사이클린은 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 및 테트라사이클린을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 테트라사이클린은 예를 들어 그람-음성 박테리아에 대해 효과적이다. 테트라사이클린은 박테리아 30S 리보솜 서브유닛에 결합하여 박테리아 단백질 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
항마이코박테리아 화합물은 클로파지민, 답손, 카프레오마이신, 시클로세린, 에탐부톨, 에티오나미드, 이소니아지드, 피라진아미드, 리팜피신, 리파부틴, 리파펜틴, 및 스트렙토마이신을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
적합한 항생제는 또한 아르스페나민, 클로람페니콜, 포스포마이신, 푸시드산, 메트로니다졸, 무피로신, 플라텐시마이신, 퀴누프리스틴/달포프리스틴, 티게사이클린, 티니다졸, 트리메토프림 아목시실린/클라불라네이트, 암피실린/설박탐, 암포마이신 리스토세틴, 아지트로마이신, 바시트라신, 부포린 II, 카보마이신, 세크로핀 Pl, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 푸라졸리돈, 푸시드산, Na 푸시데이트, 그라미시딘, 이미페넴, 인돌리시딘, 조사마이신, 마가이난 II, 메트로니다졸, 니트로이미다졸, 미카마이신, 뮤타신 B-Ny266, 뮤타신 B-JHl 140, 뮤타신 J-T8, 니신, 니신 A, 노보비오신, 올레안도마이신, 오스트레오그리신, 피페라실린/타조박탐, 프리스티나마이신, 라모플라닌, 라날렉신, 류테린, 리팍시민, 로사마이신, 로사라마이신, 스펙티노마이신, 스피라마이신, 스타필로마이신, 스트렙토그라민, 스트렙토그라민 A, 시너기스틴, 타우롤리딘, 테이코플라닌, 텔리트로마이신, 티카르실린/클라불란산, 트리아세틸로레안도마이신, 틸로신, 티로시딘, 티로트리신, 반코마이신, 베마마이신, 및 버지니아마이신을 포함한다.
투여
특정 양태에서, 본원에는 본원에 기재된 약제학적 조성물(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물)을 대상체에게 전달하는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 방법들의 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가 치료제의 투여와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가 치료제와 공동-제형화된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제와 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물의 투여 전에(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 55분 전, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간 전, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 전) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물의 투여 후에(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 55분 후, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간 후, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 후) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 동일한 전달 방식을 사용하여 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물 및 추가 치료제 둘 다를 전달한다. 일부 구현예에서, 상이한 전달 방식을 사용하여 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물 및 추가 치료제를 투여한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물은 경구 투여되는 반면, 추가 치료제는 주사(예를 들어, 정맥내, 근육내 및/또는 종양내 주사)를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 용량을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1일 2회 용량으로 제형화되며, 여기서 각각의 용량은 1일 용량의 절반이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 투여 형태는 임의의 다른 통상적인 항암 치료, 예컨대 예를 들어, 방사선 요법 및 종양의 외과적 절제와 함께 투여될 수 있다. 이들 치료는 필요에 따라 및/또는 지시된 대로 적용될 수 있으며, mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본원에 기재된 투여 형태를 포함하는 약제학적 조성물의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 발생할 수 있다.
투여 요법은 다양한 방법 및 양 중 임의의 것일 수 있고, 공지된 임상 인자에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에서 알려진 바와 같이, 한 환자에 대한 투여량은 대상체의 종, 크기, 체표면적, 연령, 성별, 면역능력 및 일반적인 건강, 투여할 특정 미생물, 투여 기간 및 경로, 질환의 종류 및 병기, 예를 들어 종양 크기, 및 동시 또는 거의 동시에 투여되는 약물과 같은 다른 화합물을 비롯한 많은 인자에 따라 달라질 수 있다. 상기 인자뿐만 아니라, 이러한 수준은 당업자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 미생물의 감염성 및 미생물의 성질에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 방법에서, 미생물의 적절한 최소 투여량 수준은 미생물이 생존, 성장 및 복제하기에 충분한 수준일 수 있다. 본원에 기재된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 조성물의 용량은 투여 형태, 투여 경로, 표적 질환의 정도 또는 병기 등에 따라 적절하게 설정 또는 조정될 수 있다. 예를 들어, 제제의 일반적인 유효 용량은 0.01 mg/kg 체중/일 내지 1000 mg/kg 체중/일, 0.1 mg/kg 체중/일 내지 1000 mg/kg 체중/일, 0.5 mg/kg 체중/일 내지 500 mg/kg 체중/일, 1 mg/kg 체중/일 내지 100 mg/kg 체중/일, 또는 5 mg/kg 체중/일 내지 50 mg/kg 체중/일의 범위일 수 있다. 유효 용량은 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 mg/kg 체중/일 이상일 수 있지만, 용량은 여기에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 용량은 질환(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 질병, 세균불균형 또는 대사성 질환)을 예방하거나, 그의 발병을 지연시키거나, 그의 진행을 늦추거나 중지시키거나, 하나 이상의 질환 증상을 경감시키기에 충분하다. 당업자는 투여량이 대상체의 연령, 종, 상태 및 체중뿐만 아니라 사용된 특정 제제(예를 들어, 치료제)의 강도를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것임을 인식할 것이다. 투여량의 크기는 또한 투여 경로, 시기 및 빈도뿐만 아니라 특정 치료제의 투여에 수반될 수 있는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도 및 원하는 생리학적 효과에 의해 결정될 것이다.
적합한 투여량 및 투여 요법은 당업자에게 공지된 통상적인 범위 측정 기술에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 치료는 화합물의 최적 용량보다 적은 더 적은 용량으로 시작된다. 그 후, 상황에서 최적의 효과에 도달할 때까지 용량을 조금씩 증량한다. 효과적인 투여량 및 치료 프로토콜은 예를 들어 실험 동물에서 낮은 투여량으로 시작한 다음, 효과를 모니터링하면서 투여량을 늘리고, 투여 요법을 체계적으로 변경하는 등 일상적이고 통상적인 수단에 의해 결정될 수 있다. 동물 연구는 일반적으로 킬로그램 중량당 생물활성제의 최대 허용 용량("MTD")을 결정하는 데 사용된다. 당업자는 인간을 포함한 다른 종에서 독성을 피하면서 효능에 대한 용량을 정기적으로 추정한다.
상기에 따르면, 치료적 적용에서, 본 발명에 따라 사용되는 치료제의 투여량은 선택된 투여량에 영향을 미치는 다른 요인들 중에서 활성제, 수혜 환자의 연령, 체중 및 임상 상태, 및 치료를 투여하는 임상의 또는 개업의의 경험 및 판단에 따라 다양하다. 예를 들어, 암 치료의 경우, 용량은 종양 성장을 늦추기에 충분해야 하고, 바람직하게는 퇴행시키기에 충분해야 하며, 가장 바람직하게는 암의 완전 퇴행을 유발하거나 전이의 크기 또는 수를 감소시키기에 충분해야 한다. 다른 예로서, 용량은 치료 중인 대상체의 질환의 진행을 늦추기에 충분해야 하고, 바람직하게는 치료 중인 대상체의 질환의 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분해야 한다.
개별 투여는 2, 3, 4, 5, 또는 6회의 투여를 포함하는 2회 이상 임의의 횟수의 투여를 포함할 수 있다. 치료 방법을 모니터링하기 위한 당업계에 알려진 방법 및 본원에 제공된 다른 모니터링 방법에 따라 당업자는 수행할 투여 횟수 또는 1회 이상의 추가 투여를 수행하는 것이 바람직한지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 대상체에게 약제학적 조성물의 1회 이상의 투여를 제공하는 방법을 포함하며, 투여 횟수는 대상체를 모니터링하고 모니터링 결과에 기초하여 1회 이상의 추가 투여를 제공할지 여부를 결정함으로써 결정될 수 있다. 1회 이상의 추가 투여를 제공할지 여부는 다양한 모니터링 결과에 기초하여 결정될 수 있다.
투여 간격은 다양한 기간 중 임의의 것일 수 있다. 투여 간격은 투여 횟수와 관련하여 설명된 바와 같은 모니터링 단계, 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간을 비롯한 다양한 인자의 함수일 수 있다. 일례로, 간격은 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간의 함수일 수 있으며; 예를 들어, 간격은 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간보다 길 수 있고(예컨대, 약 1주 초과, 약 10일 초과, 약 2주 초과, 또는 약 1개월 초과); 또 다른 예에서, 간격은 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간보다 짧을 수 있다(예컨대, 약 1주 미만, 약 10일 미만, 약 2주 미만, 또는 약 1개월 미만).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물과 조합된 추가 치료제의 전달은 부작용을 감소시키고/시키거나 추가 치료제의 효능을 개선시킨다.
본원에 기재된 추가 치료제의 유효 용량은 대상체에 대한 최소한의 독성으로 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 추가 치료제의 양이다. 유효 투여량 수준은 본원에 기재된 방법을 사용하여 확인될 수 있고, 투여된 특정 조성물 또는 제제의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용 중인 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 대상체의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강 및 이전 병력 및 의학계에 잘 알려져 있는 유사 요인을 비롯한 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 추가 치료제의 유효 용량은 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 가장 낮은 용량인 추가 치료제의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 위에서 설명한 요인에 따라 달라진다.
추가 치료제의 독성은 치료 중 및 치료 후에 대상체가 경험하는 부작용의 수준이다. 추가 요법 독성과 관련된 이상 반응에는 복통, 위산 소화 불량, 위산 역류, 알레르기 반응, 탈모증, 아나필라식스, 빈혈, 불안, 식욕 부진, 관절통, 무력증, 운동 실조, 질소 혈증, 균형 소실, 뼈 통증, 출혈, 혈전, 저혈압, 혈압 상승, 호흡 곤란, 기관지염, 멍, 낮은 백혈구 수, 낮은 적혈구 수, 낮은 혈소판 수, 심장 독성, 방광염, 출혈성 방광염, 부정맥, 심장판막질환, 심근병증, 관상동맥질환, 백내장, 중추신경독성, 인지장애, 혼돈, 결막염, 변비, 기침, 경련, 방광염, 심부정맥혈전증, 탈수, 우울증, 설사, 현기증, 구강건조, 피부건조, 소화불량, 호흡곤란, 부종, 전해질 불균형, 식도염, 피로, 생식능력 상실, 발열, 고창, 홍조, 위역류, 위식도역류질환, 생식기 통증, 과립구감소증, 여성형유방증, 녹내장, 탈모, 수족증후군, 두통, 청력상실, 심부전, 심계항진, 속쓰림, 혈종, 출혈성 방광염, 간독성, 고아밀라아제혈증, 고칼슘혈증, 고염소혈증, 고혈당, 고칼륨혈증, 고지혈증, 고마그네슘혈증, 고나트륨혈증, 고인산혈증, 과색소침착, 고중성지방혈증, 고요산혈증, 저알부민혈증, 저칼슘혈증, 저염소혈증, 저혈당, 저칼륨혈증, 저마그네슘혈증, 저나트륨혈증, 저인산혈증, 발기부전, 감염, 주사부위 반응, 불면증, 철결핍, 가려움증, 관절통, 신부전, 백혈구감소증, 간기능장애, 기억상실, 갱년기, 구강염, 점막염, 근육통, 근육통, 골수억제, 심근염, 호중구감소성 발열, 메스꺼움, 신독성, 호중구감소증, 코피, 저림, 이독성, 통증, 손바닥-족저 홍반감각이상, 범혈구감소증, 말초신경증, 심낭염, 인두염, 광 공포증, 광과민성, 폐렴, 폐렴 염, 단백뇨, 폐색전증, 폐섬유증, 폐독성, 발진, 빠른 심장 박동, 직장 출혈, 안절부절, 비염, 발작, 숨가쁨, 부비동염, 혈소판 감소증, 이명, 요로 감염, 질 출혈, 질 건조, 현기증, 수분 보유, 쇠약함, 체중 감소, 체중 증가 및 구강 건조증이 포함될 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 일반적으로, 치료를 통해 얻은 대상체에 대한 이점이 치료로 인해 대상체가 경험하는 유해 사례보다 더 큰 경우 독성은 허용된다.
대사 장애
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 II형 당뇨병, 내당능 장애, 인슐린 저항성, 비만, 고혈당증, 고인슐린혈증, 지방간, 비알코올성 지방간염, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 고지질단백혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증, 케톤산증, 저혈당, 혈전성 장애, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH) 또는 관련 질환의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 관련 질환은 심혈관 질환, 죽상동맥경화증, 신장 질환, 신병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 성기능 장애, 피부병증, 소화불량 또는 부종이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)의 치료에 관한 것이다.
본원에 기재된 방법은 이를 필요로 하는 임의의 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "이를 필요로 하는 대상체"는 대사성 질환 또는 장애를 갖는 임의의 대상체 뿐만 아니라 이러한 질환 또는 장애를 얻을 가능성이 증가된 임의의 대상체를 포함한다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어 대사성 질환, 예컨대 II형 당뇨병, 내당능 장애, 인슐린 저항성, 비만, 고혈당, 고인슐린혈증, 지방간, 비알코올성 지방간염, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 고지질단백혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증, 케톤산증, 저혈당, 혈전성 장애, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 또는 관련 질환을 예방 또는 치료하기(질환의 부작용을 부분적으로 또는 완전히 감소시키기) 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 관련 질환은 심혈관 질환, 죽상동맥경화증, 신장 질환, 신병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 성기능 장애, 피부병증, 소화불량, 또는 부종이다.
면역 장애
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 자가면역 질환, 알레르기 반응 및/또는 염증성 질환과 같은 병리학적 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염)이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 건선이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 아토피성 피부염이다.
본원에 기재된 방법은 이를 필요로 하는 임의의 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "이를 필요로 하는 대상체"는 병리학적 면역 반응(예를 들어, 염증성 장 질환)과 관련된 질환 또는 장애가 있는 임의의 대상체뿐만 아니라 이러한 질환 또는 장애를 얻을 가능성이 증가된 임의의 대상체를 포함한다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어 자가면역 질환, 예컨대 만성 염증성 장 질환, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 머클웰 증후군, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 또는 하시모토병; 알레르기 질환, 예컨대 음식 알레르기, 꽃가루증 또는 천식; 감염성 질환, 예컨대 클로스트리디움 디피실리 감염; 염증성 질환, 예컨대 TNF-매개 염증성 질환(예를 들어, 낭염과 같은 위장관의 염증성 질환, 죽상동맥경화증과 같은 심혈관 염증 병태, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 염증성 폐 질환)을 예방 또는 치료하기(질환의 부작용을 부분적으로 또는 완전히 감소시키기) 위한 약제학적 조성물; 장기 이식 또는 기타 조직 거부 반응이 발생할 수 있는 상황에서 거부 반응을 억제하기 위한 약제학적 조성물; 면역 기능 개선을 위한 보충제, 식품 또는 음료; 또는 면역 세포의 증식 또는 기능을 억제하기 위한 시약으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 염증의 치료에 유용하다. 특정 구현예에서, 하기에 논의되는 바와 같이 근골격 염증, 혈관 염증, 신경 염증, 소화계 염증, 안구 염증, 생식계 염증, 및 기타 염증을 포함하는 신체의 임의의 조직 및 기관의 염증.
근골격계의 면역 장애에는 손, 손목, 팔꿈치, 어깨, 턱, 척추, 목, 엉덩이, 안면, 발목 및 발의 관절을 포함하는 골격 관절에 영향을 미치는 병태, 및 힘줄과 같은 뼈에 근육을 연결하는 조직에 영향을 미치는 병태가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 이러한 면역 장애의 예에는 관절염(예를 들어, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 급성 및 만성 감염성 관절염, 통풍 및 가성통풍과 관련된 관절염, 및 청소년 특발성 관절염 포함), 건염, 활액막염, 건활막염, 활액낭염, 섬유염(섬유근육통), 상과염, 근염 및 골염(예를 들어, 파제트병, 치골 골염 및 낭포성 골염 포함)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
안구 면역 장애는 눈꺼풀을 비롯한 눈의 임의의 구조에 영향을 미치는 면역 장애를 의미한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 안구 면역 장애의 예는 안검염, 안검피부이완증, 결막염, 누선염, 각막염, 건성 각결막염(안구 건조증), 공막염, 선모충, 및 포도막염을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 신경계 면역 장애의 예는 뇌염, 길랭-바레 증후군, 수막염, 신경근긴장증, 기면증, 다발성 경화증, 척수염 및 정신분열증을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 혈관계 또는 림프계 염증의 예는 관절경화증, 관절염, 정맥염, 혈관염, 및 림프관염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물로 치료될 수 있는 소화계 면역 장애의 예는 담관염, 담낭염, 장염, 소장대장염, 위염, 위장염, 염증성 장 질환, 회장염 및 직장염을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 염증성 장 질환은 예를 들어 관련 병태군의 특정 기술 분야에서 인식된 형태를 포함한다. 염증성 장 질환의 몇 가지 주요 형태가 알려져 있으며, 크론병(국소 장 질환, 예를 들어 비활성 및 활성 형태) 및 궤양성 대장염(예를 들어, 비활성 및 활성 형태)이 이러한 장애 중 가장 흔하다. 또한, 염증성 장 질환은 과민성 대장 증후군, 현미경적 대장염, 림프구-형질구성 장염, 체강 질환, 교원성 대장염, 림프구성 대장염, 및 호산구성 장염을 포함한다. 기타 덜 흔한 형태의 IBD에는 불확실한 대장염, 위막성 대장염(괴사성 대장염), 허혈성 염증성 장 질환, 베체트병, 사르코이드증, 경피증, IBD-관련 이형성, 이형성 관련 종괴 또는 병변, 및 원발성 경화성 담관염이 포함된다.
본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물로 치료될 수 있는 생식계 면역 장애의 예는 자궁경부염, 융모막양막염, 자궁내막염, 부고환염, 배꼽염, 난소염, 고환염, 난관염, 난소-난소 농양, 요도염, 질염, 외음부염, 및 외음부통을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 염증 성분을 갖는 자가면역 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 병태는 급성 파종성 보편성 탈모증, 베체트병, 샤가스병, 만성 피로 증후군, 자율신경이상증, 뇌척수염, 강직성 척추염, 재생불량성 빈혈, 화농한선염, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 체강 질환, 크론병, 제1형 진성당뇨병, 거대세포동맥염, 굿파스처 증후군, 그레이브병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 헤노흐-쇤라인 자반병, 가와사키병, 홍반루푸스, 현미경적 대장염, 현미경적 다발동맥염, 혼합결합조직병, 머클웰 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 간대 근경련 증후군, 시신경염, 요도 갑상선염, 천포창, 결절성 다발동맥염, 다발성 근육통, 류마티스 관절염, 라이터 증후군, 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염, 베게너 육아종증, 온열 자가면역 용혈성 빈혈, 간질성 방광염, 라임병, 모르페아, 건선, 사르코이드증, 경피증, 궤양성 대장염, 및 백반증을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 염증 성분을 갖는 T-세포 매개 과민성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 병태는 접촉 과민증, 접촉 피부염(덩굴옻나무로 인한 피부염 포함), 두드러기, 피부 알레르기, 호흡기 알레르기(건초열, 알레르기성 비염, 집먼지 진드기 알레르기), 및 글루텐-민감성 장병증(체강병)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
방법 및 약제학적 조성물로 치료될 수 있는 다른 면역 장애는 예를 들어 충수염, 피부염, 피부근염, 심내막염, 섬유염, 치은염, 설염, 간염, 화농성한선염, 홍채염, 후두염, 유방염, 심근염, 신장염, 중이염, 췌장염, 이하선염, 심낭염, 복막염, 인두염, 흉막염, 폐렴, 전립선염, 신우신염, 및 구내염, 이식 거부반응(신장, 간, 심장, 폐, 췌장(예를 들어, 섬세포) 등의 장기 포함), 골수, 각막, 소장, 피부 동종이식, 피부 동종 이식, 및 심장 판막 이종이식, 하혈병, 및 이식편대숙주병), 급성 췌장염, 만성 췌장염, 급성 호흡곤란 증후군, 섹서리 증후군, 선천성 부신 과형성, 비화농성 갑상선염, 암과 관련된 고칼슘혈증, 천포창, 포진 수포성 피부염, 중증 다형홍반, 박탈성 피부염, 지루성 피부염, 계절성 또는 다년성 알레르기성 비염, 기관지 천식, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 약물 과민 반응, 알레르기성 결막염, 각막염, 대상포진 안과염, 홍채염 및 홍채모양체염, 맥락망막염, 시신경염, 범발성 유육종증, 전격성 또는 파종성 폐결핵 화학요법, 성인의 특발성 혈소판 감소성 자반병, 성인의 이차성 혈소판 감소증, 후천성(자가면역) 용혈성 빈혈, 성인의 백혈병 및 림프종, 소아 급성 백혈병, 국소 장염, 자가면역 혈관염, 다발성 경화증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 고형 장기 이식 거부, 패혈증을 포함한다. 바람직한 치료는 이식 거부반응, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 천식, 염증성 장 질환, 전신홍반루푸스, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 감염성 병태를 수반하는 염증(예를 들어, 패혈증)의 치료를 포함한다.
암
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 암의 치료에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 임의의 암은 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장관, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁으로부터의 암 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 암은 구체적으로 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저세포 암종; 필로매트릭스 암종; 이행세포 암종; 유두 이행세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 결합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종성 폴립의 선암종; 선암종, 가족성 용종증 대장균; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 세기관지-폐포성 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산구 암종; 호산성 선암종; 호염기구 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 여포 선암종; 유두 및 여포 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀질 선암종; 점막표피양 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인환세포 암종; 침윤성 관암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유선; 포상세포 암종; 선편평 암종; 편평상피화생이 있는 선암종; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 테코마, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 남성모세포종, 악성; 세르톨리세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 갈색 세포종; 사구체육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재성 확산 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피세포 흑색종; 푸른 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮬러 혼합 종양; 신모세포종; 간모세포종; 암육종; 간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활액 육종; 중피종, 악성; 이상 생식세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 융모막암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유윙 육종; 치성 종양, 악성; 변색성 상아육종; 흑색모세포종, 악성; 변색성 섬유육종; 송과종, 악성; 척색종; 신경교종, 악성; 뇌실막종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경 모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경연종, 악성; 과립세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 부육아종; 악성 림프종, 소림프구성; 악성 림프종, 대세포, 확산성; 악성 림프종, 여포; 균상 식육종; 기타 특정 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적혈구백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수 육종; 및 모세포 백혈병.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법 및 약제학적 조성물은 백혈병의 치료에 관한 것이다. 용어 "백혈병"은 조혈 기관/시스템의 광범위하게 진행되는 악성 질환을 포함하며, 일반적으로 혈액 및 골수에서 백혈구 및 백혈구 전구체의 왜곡된 증식 및 발달을 특징으로 한다. 백혈병 질환의 비제한적 예는 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 무백혈성 백혈병, 백혈구 백혈병, 호염기성 백혈병, 아세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 진피백혈병, 배아백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스(Gross) 백혈병, 리더 세포 백혈병, 실링 백혈병, 줄기세포 백혈병, 아백혈병 백혈병, 미분화 세포 백혈병, 모세포 백혈병, 혈구 백혈병, 혈구아세포성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기세포 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프원성 백혈병, 림프 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 미세골수아구성 백혈병, 단핵구 백혈병, 골수아구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수 과립구성 백혈병, 골수단구성 백혈병, 네겔리 백혈병, 형질세포 백혈병, 형질구성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법 및 약제학적 조성물은 암종의 치료에 관한 것이다. 용어 "암종"은 주변 조직에 침투하고/하거나 생리학적 및 비생리학적 세포 사멸 신호에 저항하고 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포로 구성된 악성 성장을 의미한다. 암종의 비제한적인 예시적인 유형은 선상 암종, 포상 암종, 선낭성 암종, 선양 낭성 암종, 선종 암종, 부신 피질 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종, 암 기저 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저 편평 세포 암종, 기관지 폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 뇌형 암종, 담관 세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 면포 암종, 코퍼스 암종, 면상 암종, 흉곽 암종, 피부 암종, 원통 암종, 원통 세포 암종, 덕트 암종, 경질 암종, 배아 암종, 뇌양 암종, 상피 암종, 암 상피 선종, 외피 암종, 궤양 외 암종, 섬유질 암종, 젤라틴 모양 암종, 젤라틴 암종, 거대 세포 암종, 인장-고리 세포 암종, 암종 단순 암종, 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 구상 세포 암종, 방추 세포 암종, 암종 해면체, 편평 암종, 편평 세포 암종, 스트링 암종, 모세관 확장 암종, 모세관 암종, 이행 세포 암종, 결절 암종, 관상 암종, 사마귀 암종, 융모 암종, 거대 세포 암종, 선 암종, 육아종 세포 암종, 모발-기질 암종, 혈양 암종, 간세포 암종, 허슬 세포 암종, 유리질 암종, 고신성 암종, 유아 배아 암종, 제자리 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 크롬페처(Krompecher) 암종, 쿨치츠키-세포 암종, 대세포 암종, 수정체 암종, 수정체 암종, 지방종 암종, 림프 상피 암종, 수질 암종, 수질 암종, 흑색종 암종, 몰리 암종, 점액성 암종, 점막 암종, 점막 세포 암종, 점막 표피양 암종, 점막 암종, 점막 암종, 발암 점액종, 비인두 암종, 귀리 세포 암종, 화골 암종, 골양 암종, 유두 암종, 문맥 주위 암종, 침습 전 암종, 가시 세포 암종, 활상 암종, 신장의 신세포 암종, 예비 세포 암종, 암종 육종, 슈나이더 암종, 경피 암종 및 음낭암종을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법 및 약제학적 조성물은 육종의 치료에 관한 것이다. 용어 "육종"은 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 구성되고, 일반적으로 원섬유, 이종 또는 동종 물질에 내장된 밀접하게 포장된 세포로 구성된 종양을 나타낸다. 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 자궁내막 육종, 기질 육종, 유잉 육종, 근막 육종, 섬유아 육종, 거대 세포 육종, 아베메시 육종, 지방 육종, 지질육종, 폐포 연부 육종, 변색모세포 육종, 보트리로이드 육종, 엽록체 육종, 융모막 암종, 배아 육종, 윌름스(Wilms) 종양 육종, 과립구 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 색소성 출혈 육종, B 세포의 면역모세포 육종, 림프종, T-세포의 면역모세포성 육종, 젠슨 육종, 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종, 혈관 육종, 백혈육종, 악성 중간엽 육종, 관절낭육종, 망상적혈구 육종, 라우스 육종, 장낭포성 육종, 활액 육종, 및 모세혈관확장성 육종을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 추가의 예시적인 신생물은 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 소-세포 폐종양, 원발성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장선종, 악성 카르시노이드, 전암성 피부병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식도암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막 암, 형질세포종, 결장직장암, 직장암 및 부신피질암을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료되는 암은 흑색종이다. 용어 "흑색종"은 피부 및 기타 기관의 멜라닌세포 시스템에서 발생하는 종양을 의미하는 것으로 간주된다. 흑색종의 비제한적인 예는 하딩-패시 흑색종, 연소성 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 악성 흑색종, 견봉-흑색종 흑색종, 무색소성 흑색종, 양성 연소성 흑색종, 클라우드만 흑색종, S91 흑색종, 결절성 흑색종, 설하 흑색종 및 표재성 확산 흑색종이다.
일부 구현예에서, 암은 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암)을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 결장직장암(예를 들어, 현미부수체 안정(MSS) 결장직장암)을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 신세포 암종을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암)을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 방광암을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 위식도암을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 고형 종양을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 종양의 특정 범주에는 림프증식성 장애, 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 골암, 간암, 위암, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 두경부암, 중추신경계암, 말초신경계암, 피부암, 신장암 및 위의 모든 전이가 포함된다. 종양의 특정 유형은 간세포 암종, 간암, 간모세포종, 횡문근육종, 식도 암종, 갑상선 암종, 신경절모세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡상피육종, 침습성 관암종, 유두선암종, 흑색종, 폐편평세포 암종, 기저세포암종, 선암종(잘 분화, 중간 분화, 저분화 또는 미분화), 세기관지폐포암종, 신세포 암종, 부신종, 고신성 선암종, 담관암, 융모막암종, 정액종, 배아 암종, 윌름스 종양, 고환 종양, 소세포를 포함하는 폐암, 비소세포 및 대세포 폐암종, 방광암종, 신경아교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 망막모세포종, 신경모세포종, 결장암, 직장암, 하기를 포함하는 모든 유형의 백혈병 및 림프종을 포함한 조혈 악성종양: 급성 골수성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만 세포 백혈병, 다발성 골수종, 골수성 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 형질세포종, 대장암, 및 직장암을 포함한다.
특정 구현예에서 치료되는 암은 또한 전암성 병변, 예를 들어 광선각화증(일광각화증), 기태(이형성 모반), 광선 입술염(농부 입술), 피부 뿔, 바렛 식도, 위축성 위염, 선천성 각화이상증, 철구감소성 연하장애, 편평태선, 구강 점막하 섬유증, 광선(일광) 탄력증, 및 자궁경부 이형성증을 포함한다.
일부 구현예에서 치료되는 암은 예를 들어 담관종, 결장 폴립, 선종, 유두종, 낭선종, 간 세포 선종, 포상기태, 신세뇨관 선종, 편평 세포 유두종, 위 폴립, 혈관종, 골종, 연골종, 지방종, 섬유종, 림프관종, 평활근종, 횡문근종, 성상세포종, 모반, 수막종 및 신경절신경종을 포함하는 내배엽, 외배엽 또는 중간엽 기원의 비암성 또는 양성 종양을 포함한다.
세균불균형
최근 몇 년 동안, 장내 미생물군("장내 미생물군집"이라고도 함)이 미생물 활동을 통해 개인의 건강에 상당한 영향을 미치고 숙주의 면역 및 기타 세포에(국소 및/또는 말단) 영향을 미칠 수 있다는 것이 점점 더 분명해졌다(문헌[Walker, W.A., Dysbiosis. The Microbiota in Gastrointestinal Pathophysiology. Chapter 25. 2017]; [Weiss and Thierry, Mechanisms and consequences of intestinal dysbiosis. Cellular and Molecular Life Sciences. (2017) 74(16):2959-2977. Zurich Open Repository and Archive]).
건강한 숙주-장내 미생물군 항상성은 때때로 "유바이오시스(eubiosis)" 또는 "노모바이오시스(normobiosis)"라고 불리는 반면, 숙주 미생물군 구성 및/또는 다양성의 해로운 변화는 미생물군의 건강에 해로운 불균형 또는 "세균불균형"으로 이어질 수 있다(문헌[Hooks and O'Malley. Dysbiosis and its discontents. American Society for Microbiology. Oct 2017. Vol. 8. Issue 5. mBio 8:e01492-17]). 세균불균형 및 관련 국소 또는 원위 숙주의 염증 또는 면역 효과는 미생물군집 항상성이 상실되거나 감소되는 경우 발생하여 다음과 같은 결과를 초래할 수 있다: 병원체에 대한 감수성 증가; 변경된 숙주 박테리아 대사 활동; 숙주 전염증 활성의 유도 및/또는 숙주 항염증 활성의 감소. 이러한 효과는 숙주 면역세포(예를 들어, T세포, 수지상 세포, 비만세포, NK세포, 장 상피 림프구(IEC), 대식세포 및 식세포)와 사이토카인, 및 이러한 세포 및 기타 숙주 세포에서 방출되는 다른 물질 간의 상호작용에 의해 부분적으로 매개된다.
세균불균형은 위장관 내에서 발생할 수 있거나("위장 세균불균형" 또는 "장내 세균불균형"), 위장관 내강 외부에서 발생할 수 있다("원위 세균불균형"). 위장 세균불균형은 대개 장 상피 장벽의 완전성 감소, 밀착 접합 완전성 감소, 및 장 투과성 증가와 관련이 있다. 문헌[Citi, S. Intestinal Barriers protect against disease, Science 359:1098-99(2018); Srinivasan et al., TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom . 20:107-126 (2015)]. 위장 세균불균형은 위장관 내부와 외부에서 생리학적 및 면역 효과를 가질 수 있다.
세균불균형의 존재는 다음을 포함한 다양한 질환 및 병태와 관련이 있다: 감염, 암, 자가면역 장애(예를 들어, 전신홍반루푸스(SLE)) 또는 염증성 장애(예를 들어, 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염, 및 크론병과 같은 기능성 위장 장애), 신경염증 질환(예를 들어, 다발성 경화증), 이식 장애(예를 들어, 이식편대숙주 질환), 지방간 질환, I형 당뇨병, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 체강 질환, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD), 및 면역기능 장애와 관련된 기타 질환 및 병태. 문헌[Lynch et al., The Human Microbiome in Health and Disease, N. Engl . J. Med .375:2369-79(2016), Carding et al., Dysbiosis of the gut microbiota in disease. Microb . Ecol . Health Dis . (2015); 26: 10: 3402/mehd.v26.2619]; [Levy et al, Dysbiosis and the Immune System, Nature Reviews Immunology 17:219(April 2017)]
본원에 개시된 예시적인 약제학적 조성물은 세균불균형 부위에 존재하는 면역 활성을 변형함으로써 세균불균형 및 그의 효과를 치료할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 조성물은 예를 들어 항염증성 사이토카인 분비의 증가 및/또는 염증촉진성 사이토카인 분비의 감소를 유발하여 대상체 수혜자의 염증을 감소시키는 숙주 면역세포에 대한 효과를 통해 또는 대사산물 생성의 변화를 통해 세균불균형을 변형시킬 수 있다.
세균불균형과 관련된 장애의 치료에 유용한 본원에 개시된 예시적 약제학적 조성물은 하나 이상의 유형의 면역조절 박테리아(예를 들어, 항염증 박테리아), 이러한 박테리아로부터 유래된 mEV(미생물 세포외 소포체; 예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 이러한 조성물은 위장관에서의 수혜자 숙주의 면역 기능 및/또는 대상체의 위장관 외부의 원위 부위에서의 전신 효과에 영향을 미칠 수 있다.
세균불균형과 관련된 장애의 치료에 유용한 본원에 개시된 예시적 약제학적 조성물은 단일 박테리아 종(예를 들어, 단일 균주)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아(예를 들어, 항염증 박테리아) 집단, 이러한 박테리아로부터 유래된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 이러한 조성물은 위장관에서의 수혜자 숙주의 면역 기능 및/또는 대상체의 위장관 외부의 원위 부위에서의 전신 효과에 영향을 미칠 수 있다.
일부 구현예에서, 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아(예를 들어, 항염증 박테리아 세포)의 단리된 집단, 이러한 박테리아로부터 유래된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는 약제학적 조성물은 수혜자에서 세균불균형 및 그 영향 중 하나 이상을 치료하는 데 효과적인 양으로 포유동물 수혜자에게(예를 들어, 경구로) 투여된다. 세균불균형은 위장관 세균불균형 또는 원위 세균불균형일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 위장 세균불균형 및 숙주 면역 세포에 대한 그의 효과 중 하나 이상을 치료하여, 항염증성 사이토카인의 분비를 증가시키고/시키거나 전염증성 사이토카인의 분비를 감소시켜, 대상체 수혜자의 염증을 감소시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 장 상피 장벽의 완전성을 증가시킴으로써 장 투과성을 감소시키기 위해 세포 및 사이토카인 조절을 통해 수혜자 면역 반응을 조절함으로써 위장내 세균불균형 및 그의 효과 중 하나 이상을 치료할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 숙주 면역 세포의 조절을 통해 세균불균형 부위에서 수혜자 면역 반응을 조절함으로써 원위 세균불균형 및 그의 효과 중 하나 이상을 치료할 수 있다.
다른 예시적인 약제학적 조성물은 세균불균형과 관련된 장애의 치료에 유용하며, 이 조성물은 숙주 면역 세포 하위집단, 예를 들어, T 세포 하위집단, 면역 림프 세포, 수지상 세포, NK 세포 및 기타 면역 세포의 상대적 비율, 또는 수혜자내 이들의 기능을 변경할 수 있는 하나 이상의 유형의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, 이러한 박테리아로부터 유래된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 또는 이들의 임의의 집단을 함유한다.
다른 예시적인 약제학적 조성물은 세균불균형과 관련된 장애의 치료에 유용하며, 이 조성물은 수혜자 대상체에서 면역세포 하위집단, 예를 들어 T 세포 하위집단, 면역 림프 세포, NK 세포 및 기타 면역세포의 상대적 비율, 또는 이들의 기능을 변경할 수 있는 단일 박테리아 종의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV, 또는 이들의 임의의 조합을 함유한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세균불균형의 위치에 존재하는 미생물군집 군집체를 변경하는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 경구 투여함으로써 위장내 세균불균형 및 이의 하나 이상의 효과를 치료하는 방법을 제공한다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 유형의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 단일 박테리아 종(예를 들어, 단일 균주)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV, 또는 이들의 임의의 조합의 집단을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 위장관 외부에서 대상체의 면역 반응을 변경하는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 경구 투여함으로써 원위부 세균불균형 및 그의 효과 중 하나 이상을 치료하는 방법을 제공한다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 유형의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 단일 박테리아 종(예를 들어, 단일 균주)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아, mEV, 또는 이들의 임의의 조합의 집단을 함유할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 세균불균형과 관련된 장애의 치료에 유용한 약제학적 조성물은 숙주 면역 세포에 의한 하나 이상의 항염증성 사이토카인의 분비를 자극한다. 항염증성 사이토카인은 IL-10, IL-13, IL-9, IL-4, IL-5, TGFβ, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 다른 예시적인 구현예에서, 숙주 면역 세포에 의한 하나 이상의 전염증성 사이토카인의 분비를 감소(예를 들어, 억제)시키는 세균불균형과 관련된 장애의 치료에 유용한 약제학적 조성물. 염증촉진성 사이토카인은 IFNγ, IL-12p70, IL-1α, IL-6, IL-8, MCP1, MIP1α, MIP1β, TNFα, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 예시적 사이토카인은 당업계에 알려져 있으며 본원에 기재되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 세균불균형과 관련된 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 박테리아, mEV, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 프로바이오틱 또는 의료 식품 형태의 치료 조성물을 세균불균형과 관련된 장애가 치료되도록 세균불균형 부위의 미생물군을 변경하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여(예를 들어, 경구 투여)하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 프로바이오틱 또는 의료 식품 형태의 본 발명의 치료 조성물은 세균불균형이 발생할 위험이 있는 대상체에서 세균불균형의 발병을 예방하거나 지연시키기 위해 사용될 수 있다.
다른 질환 및 장애
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 간 질환의 치료에 관한 것이다. 이러한 질환에는 알라길 증후군, 알코올-관련 간 질환, 알파-1 항트립신 결핍증, 자가면역 간염, 양성 간 종양, 담도 폐쇄증, 간경변증, 갈락토스혈증, 길버트 증후군, 혈색소증, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 간성 뇌병증, 임신성 간내 담즙 정체(ICP), 리소좀산 리파제 결핍(LAL-D), 간 낭종, 간암, 신생아 황달, 원발성 담즙성 담관염(PBC), 원발성 경화성 담관염(PSC), 라이 증후군, 유형 I 글리코겐 축적 질환 및 윌슨병이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 약제학적 조성물은 신경퇴행성 및 신경계 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 신경퇴행성 및/또는 신경계 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온병, 헌팅턴병, 운동 뉴런 질환(MND), 척수소뇌 운동실조, 척수 근위축, 근긴장이상, 특발성 두개내 고혈압, 간질, 신경계 질환, 중추신경계 질환, 운동 장애, 다발성 경화증, 뇌병증, 말초 신경병증, 또는 수술후 인지기능 장애이다.
강화 박테리아를 만드는 방법
특정 양태에서, 본원에 기재된 mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV)의 생산을 위한 조작된 박테리아, 약제학적 조성물을 위한 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 박테리아는 특정 바람직한 특성을 향상시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 박테리아는 (예를 들어, 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여) mEV(예컨대 smEV 및/또는 pmEV), 약제학적 조성물을 위한 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합의 면역조절 및/또는 치료 효과의 향상, 독성의 감소, 및/또는 박테리아 및/또는 mEV(예컨대, smEV 및/또는 pmEV) 제조의 개선(예를 들어, 더 높은 산소 내성, 개선된 동결-해동 내성, 더 짧은 생성 시간)을 위해 변형된다. 조작된 박테리아는 부위-지정 돌연변이유발, 트랜스포존 돌연변이유발, 녹아웃, 녹인, 중합효소 연쇄 반응 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, 자외선 돌연변이유발, 형질전환(화학적 또는 전기천공법), 파지 형질도입, 유도 진화, CRISPR/Cas9, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 (이에 한정되지 않음) 임의의 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
본원에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 박테리아는 유도 진화에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 환경 조건에 박테리아를 노출시키는 단계 및 환경 조건에서 생존 및/또는 성장이 개선된 박테리아를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 방법은 강화된 박테리아를 식별하는 분석을 사용하여 돌연변이 박테리아를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (예를 들어, 화학적 돌연변이원 및/또는 UV 방사선에 대한 노출에 의해) 박테리아를 돌연변이화하거나, 치료제(예를 들어, 항생제)에 노출시킨 후 원하는 표현형을 갖는 박테리아를 검출하는 분석(예를 들어, 생체내 분석, 생체외 분석 또는 시험관내 분석)을 추가로 포함한다.
실시예
실시예 1: 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주에 대한 배양 및 저장 조건
헤모글로빈이 보충된 혐기성 트립틱 소이 브로쓰 ( TSB ) 배지:
조성 (g/L):
1. 카제인의 췌장 소화물 17.0 g
2. 대두 식이의 펩틱 소화물 3.0 g
3. 디포타슘 포스페이트 K2HPO4 2.5 g
4. 효모 추출물 5.0 g
5. 덱스트로스 2.5 g
6. 염화나트륨 5.0 g
7. L-시스테인-HCL 0.5 g
8. FeCl2 0.05 g
9. 헤모글로빈 0.02 g
섭씨 25도에서 최종 pH 6.8 +/- 0.3
환원제 100Х 제조:
a. H20 100 ml 중에 L-시스테인-HCl 5 g 용해
b. FeCl2 0.5 g 첨가
c. 혐기성 조건에서 용액 저장
헤모글로빈 용액 100Х 제조:
a. 0.01N NaOH 100 ml에 헤모글로빈 2 g을 용해시킨다.
b. 용액을 오토클레이브한다
c. 용액은 직사광선을 피하여 4C에 보관한다
d. 멸균 배지에 용액을 첨가한다
오실로스피라세아에 균주(예를 들어, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A)는 단일 콜로니가 브루셀라(Brucella) 혈액 플레이트에서 옮겨지면 액체 TSB 배지에서 헤모글로빈 없이 성장할 수 있다.
혐기성 브루셀라( Brucella ) 혈액 한천 플레이트, 혐기성 시스템 #AS-141.
동결방지제로서의 혐기성 글리세롤(GSS), 혐기성 시스템 #AS-9045:
조성 (g/L):
1. 글리세롤 400 g
2. 황산마그네슘, 칠수화물 0.1 g
3. 인산칼륨, 일염기성 0.2 g
4. 염화칼륨 0.2 g
5. 인산나트륨, 이염기성 1.15 g
6. 염화나트륨 3.0 g
7. 티오글리콜산나트륨 1.0 g
8. L-시스테인(25.0% 용액) 2.0 mL
혐기성 글리세롤과 박테리아 현탁액을 1:1 부피로 혼합하고, 급속 동결하고, -80℃에서 저장; 37℃에서 1~3일 동안 인큐베이션; 혐기성 조건: a) 혐기성 가스 팩을 구비한 Mitsubishi 혐기성 병에서의 한천 플레이트; b) 폐쇄된 혐기성 Hungate 또는 Balch 시험관에서의 액체 배양.
실시예 2: CT26 종양 연구에서 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 균주 A의 경구 전달
제1 대표적인 종양학 연구
8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 3주일 동안 순응시켰다. 0일째에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, PBS 및 Corning(GFR) 페놀 레드-프리 마트리겔(Phenol Red-Free Matrigel)(1:1)로 제조된 1.0e5 CT-26 세포(0.1 mL)를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 CT-26 접종 후 9일 동안 쉬게 하여 만져지는 종양이 형성되도록 하였다. 9일차에, 종양은 추정된 종양 부피((L x W x W)/2)=TVmm3))를 계산하기 위해 (밀리미터로) 측정된 길이와 너비를 수집하기 위해 슬라이딩 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 마우스를 그룹당 총 9 또는 10마리의 마우스로 다른 치료 그룹으로 무작위 배정했다. 모든 치료 그룹의 균형을 맞추기 위해 무작위 배정을 수행하여, 각 그룹이 유사한 평균 종양 부피 및 표준 편차로 치료를 시작할 수 있도록 했다. 13일 연속 투여를 위해, 투여는 10일째에 시작하여 22일째에 종료되었다. 마우스에게 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV를 BID로 경구 투여하거나, 200 ug 항-마우스 PD-1 항체를 복강 내 Q4D로 투여했다. 체중 및 종양 측정은 MWF(월요일-수요일-금요일) 일정에 따라 수집하였다. NTA에 의한 입자 수에 의해 smEV의 투여량을 결정하였다.
도 1의 22일차 종양 부피 요약은 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(2e11) 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(2e11) + 항-PD-1을 음성 대조군(비히클 PBS), 및 양성 대조군(항-PD-1)과 비교한다. 비히클 PBS와 비교한 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 치료 그룹들은 모두 통계적으로 유의한 효능을 보였고, 항-PD-1과 유의하게 다르지 않았다. 도 2의 종양 부피 곡선은 치료 13일 후 지속적인 효능과 함께 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 그룹 및 항-PD-1 모두와 유사한 성장 경향을 보여준다.
제2 대표적인 종양학 연구
8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 1주일 동안 순응시켰다. 0일째에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, PBS 및 Corning(GFR) 페놀 레드-프리 마트리겔(Phenol Red-Free Matrigel)(1:1)로 제조된 1.0e5 CT-26 세포(0.1 mL)를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 CT-26 접종 후 9일 동안 쉬게 하여 만져지는 종양이 형성되도록 하였다. 9일차에, 종양은 추정된 종양 부피((L x W x W)/2)=TVmm3))를 계산하기 위해 (밀리미터로) 측정된 길이와 너비를 수집하기 위해 슬라이딩 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 마우스를 그룹당 총 9마리의 마우스로 다른 치료 그룹으로 무작위 배정했다. 모든 치료 그룹의 균형을 맞추기 위해 무작위 배정을 수행하여, 각 그룹이 유사한 평균 종양 부피 및 표준 편차로 치료를 시작할 수 있도록 했다. 14일 연속 투여를 위해, 투여는 10일째에 시작하여 23일째에 종료되었다. 마우스에게 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV를 BID로 경구 투여하거나, 200 ug 항-마우스 PD-1 항체를 복강 내 Q4D로 투여했다. 체중 및 종양 측정은 MWF 일정에 따라 수집하였다. NTA에 의한 입자 수에 의해 smEV의 투여량을 결정하였다.
도 3의 23일차 종양 부피 요약은 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(2e11), 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(2e9), 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(2e11) + 항-PD-1을 음성 대조군(비히클 PBS) 및 양성 대조군(항-PD-1)과 비교한다. 비히클 PBS와 비교한 모든 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 치료 그룹들은 비히클(PBS)와 통계적으로 유의한 효능을 보였다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(2e9 및 2e11)의 용량은 항-PD-1과 유의하게 다르지 않다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(2e11) + 항-PD-1은 항-PD-1 치료 단독에 대해 유의하게 개선된 효능을 나타낸다. 도 4의 종양 성장 곡선은 항-PD-1과 유사한 치료 14일 동안 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 치료 그룹의 지속적인 효능을 보여준다.
제3 대표적인 종양학 연구
8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 1주일 동안 순응시켰다. 0일째에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, PBS 및 Corning(GFR) 페놀 레드-프리 마트리겔(Phenol Red-Free Matrigel)(1:1)로 제조된 1.0e5 CT-26 세포(0.1 mL)를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 CT-26 접종 후 9일 동안 쉬게 하여 만져지는 종양이 형성되도록 하였다. 9일차에, 종양은 추정된 종양 부피((L x W x W)/2)=TVmm3))를 계산하기 위해 (밀리미터로) 측정된 길이와 너비를 수집하기 위해 슬라이딩 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 마우스를 그룹당 총 9마리의 마우스로 다른 치료 그룹으로 무작위 배정했다. 모든 치료 그룹의 균형을 맞추기 위해 무작위 배정을 수행하여, 각 그룹이 유사한 평균 종양 부피 및 표준 편차로 치료를 시작할 수 있도록 했다. 12일 연속 투여를 위해, 투여는 10일째에 시작하여 21일째에 종료되었다. 마우스에게 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV를 각각 QD 및 BID로 경구 투여하거나, 200 μg 항-마우스 PD-1 항체를 복강 내 Q4D로 투여했다. 체중 및 종양 측정은 MWF 일정에 따라 수집하였다. NTA에 의한 입자 수에 의해 smEV의 투여량을 결정하였다.
도 5의 좌측의 21일 종양 부피 요약은 12일 동안 QD로 투여된 3가지 용량(4e11, 4e9, & 4e7)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV를 각각의 음성 대조군(비히클 PBS) 및 양성 대조군(항-PD-1)과 비교한다. 도 5의 종양 부피 요약은 또한 각각 4e11 및 4e7의 총 일일 용량에 대해 BID 투여된 2가지 용량(2e11 및 2e7)의 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV를 그들의 상응하는 음성 대조군(비히클 PBS BID) 및 양성 대조군(항-PD-1)과 비교한다.
비히클 PBS와 비교한 QD 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 치료 아암은 (4e11)에서 고용량의 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV에 대해 증가된 유의성 및 효능 경향과 함께 명백한 용량 효과를 나타낸다. 비히클 PBS BID와 비교한 BID 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 치료 아암은 명백한 용량 효과 없이 유의미한 효능을 보여준다. 이 결과는 두 용량 BID 2e11 및 2e7이 비슷하고 QD에 비해 BID를 투여하는 효과적인 이점을 보여준다는 것을 나타낸다. 도 6의 종양 성장 곡선은 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV(4e11) QD와 비교하여 BID 치료 그룹에 대한 유사한 성장 추세뿐만 아니라 투여 12일 후에 QD 아암에 대해 지속적인 용량 효과를 보여준다.
제4 대표적인 종양학 연구
푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV로의 종양-보유 마우스의 경구 치료는 면역관문 억제(항-PD-1) 또는 온전한 미생물과 비교하여 종양 성장의 우수한 제어를 나타낸다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV는 종양 미세환경(TME)에서 IFNγ 및/또는 TNF 생성 CD8+ CTL, NK 세포, NKT 세포 및 CD4+ 세포의 백분율을 유의하게 증가시킨다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV는 또한 종양-침윤 수지상 세포(DC1 및 DC2)를 증가시켰다. TME에서의 사이토카인 분석은 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV로 처리된 마우스에서의 IP-10 및 IFNγ 생산이 크게 증가하여, 항종양 림프구의 동원 및 활성화에 도움이 되는 환경이 조성되었음을 보여주었다.
제5 대표적인 종양학 연구
8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 1주일 동안 순응시켰다. 0일째에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, PBS 및 Corning(GFR) 페놀 레드-프리 마트리겔(Phenol Red-Free Matrigel)(1:1)로 제조된 1.0e5 CT-26 세포(0.1 mL)를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 CT-26 접종 후 9일 동안 쉬게 하여 만져지는 종양이 형성되도록 하였다. 9일차에, 종양은 추정된 종양 부피((L x W x W)/2)=TVmm3))를 계산하기 위해 (밀리미터로) 측정된 길이와 너비를 수집하기 위해 슬라이딩 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 마우스를 그룹당 총 9마리의 마우스로 다른 치료 그룹으로 무작위 배정했다. 모든 치료 그룹의 균형을 맞추기 위해 무작위 배정을 수행하여, 각 그룹이 유사한 평균 종양 부피 및 표준 편차로 치료를 시작할 수 있도록 했다. 13일 연속 투여를 위해 투여는 10일째에 시작하여 22일째에 종료되었다. 마우스에게 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV를 BID로 경구 투여하거나, 200 μg 항-마우스 PD-1 항체를 복강 내 Q4D로 투여했다. 체중 및 종양 측정은 were collected on a MWF(월요일-수요일-금요일) 일정에 따라 수집하였다. NTA에 의한 입자 수에 의해 smEV의 투여량을 결정하였다.
도 7의 22일 종양 부피 요약은 여러 용량의 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV, 및 3가지 용량의 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV + 항-PD-1을 음성 대조군(비히클) 및 양성 대조군(항-PD-1)과 비교한다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 용량(2e7 내지 2e11)은 상당한 효능을 보였고 항-PD-1과 유의하게 상이하지 않았다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 용량(2e4 내지 2e6)은 효능의 손실을 나타냈다(유의하지 않음). 3가지 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV + 항-PD-1 아암은 효능이 있었지만 각각의 단일 제제에 비해 크게 개선되지는 않았다.
제6 대표적인 종양학 연구
8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 1주일 동안 순응시켰다. 0일째에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, PBS 및 Corning(GFR) 페놀 레드-프리 마트리겔(Phenol Red-Free Matrigel)(1:1)로 제조된 1.0e5 CT-26 세포(0.1 mL)를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 CT-26 접종 후 9일 동안 쉬게 하여 만져지는 종양이 형성되도록 하였다. 9일차에, 종양은 추정된 종양 부피((L x W x W)/2)=TVmm3))를 계산하기 위해 (밀리미터로) 측정된 길이와 너비를 수집하기 위해 슬라이딩 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 마우스를 그룹당 총 10마리의 마우스로 다른 치료 그룹으로 무작위 배정했다. 모든 치료 그룹의 균형을 맞추기 위해 무작위 배정을 수행하여, 각 그룹이 유사한 평균 종양 부피 및 표준 편차로 치료를 시작할 수 있도록 했다. 13일 연속 투여를 위해, 투여는 10일째에 시작하여 22일째에 종료되었다. 마우스에게 푸르니에렐라 마실리엔시스, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV를 BID로 경구 투여하거나, 200ug 항-마우스 PD-1 항체를 복강 내 Q4D로 투여했다. 체중 및 종양 측정은 MWF(월요일-수요일-금요일) 일정에 따라 수집하였다. NTA에 의한 입자 수에 의해 smEV의 투여량을 결정하였다. 모체 미생물의 용량은 총 세포 수(TCC)로 결정하였다.
본 연구에서 22일 종양 부피 요약(도 8)은 소규모 배치 공정(M) 대 대규모 공정(F 또는 Ferm.)으로부터 생산된 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 여러 용량을 비교하였다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV는 또한 TCC에 매칭되는 입자에서 각각의 모체 미생물에 대해 비교되었다. 각각의 비히클과 비교하여, 소규모 및 대규모 공정 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 치료 그룹은 모두 통계적으로 유의한 효능을 나타냈고, 항-PD-1 치료와 크게 상이하지 않았다. 모체 미생물 푸르니에렐라 마실리엔시스는 2e9 용량에서 유의미한 효능을 나타내지만 2e7에서는 그렇지 않다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 2e7 치료(소규모 및 대규모) 모두 효과적이며, 매칭되는 용량의 모체 미생물 푸르니에렐라 마실리엔시스에 비해 통계적으로 유의미한 효능을 갖는다.
제7 대표적인 종양학 연구
8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 1주일 동안 순응시켰다. 0일째에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, PBS 및 Corning(GFR) 페놀 레드-프리 마트리겔(Phenol Red-Free Matrigel)(1:1)로 제조된 1.0e5 CT-26 세포(0.1 mL)를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 CT-26 접종 후 9일 동안 쉬게 하여 만져지는 종양이 형성되도록 하였다. 9일차에, 종양은 추정된 종양 부피((L x W x W)/2)=TVmm3))를 계산하기 위해 측정시에 길이와 너비(밀리미터)를 수집하기 위해 슬라이딩 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 마우스를 그룹당 총 10마리의 마우스로 다른 치료 그룹으로 무작위 배정했다. 모든 치료 그룹의 균형을 맞추기 위해 무작위 배정을 수행하여, 각 그룹이 유사한 평균 종양 부피 및 표준 편차로 치료를 시작할 수 있도록 했다. 13일 연속 투여를 위해, 투여는 10일째에 시작하여 22일째에 종료되었다. 마우스에게 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV를 BID로 경구 투여하거나, 100 μg 항-마우스 PD-1 항체를 복강 내 Q4D로 투여했다. 체중 및 종양 측정은 MWF(월요일-수요일-금요일) 일정에 따라 수집하였다. NTA에 의한 입자 수에 의해 smEV의 투여량을 결정하였다. 모체 미생물의 용량은 총 세포 수(TCC)로 결정하였다.
도 9의 22일 종양 부피 요약은 여러 용량의 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV, 및 3가지 용량의 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV + 항-PD-1을 음성 대조군(비히클) 및 양성 대조군(항-PD-1)과 비교한다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 용량(2e7 내지 2e11)은 상당한 효능을 보였고 항-PD-1과 유의하게 상이하지 않았다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 용량(2e4 내지 2e6)은 효능의 손실을 나타냈다. 3가지 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV + 항-PD-1 아암은 효능이 있었지만 각각의 단일 제제에 비해 크게 개선되지는 않았다.
실시예 3: CT26 종양 연구에서 푸르니에렐라 마실리엔시스 전체 박테리아 균주 A의 경구 전달
8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 1주일 동안 순응시켰다. 0일째에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, PBS 및 Corning(GFR) 페놀 레드-프리 마트리겔(Phenol Red-Free Matrigel)(1:1)로 제조된 1.0e5 CT-26 세포(0.1 mL)를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 CT-26 접종 후 8일 동안 쉬게 하여 만져지는 종양이 형성되도록 하였다. 8일차에, 종양은 추정된 종양 부피((L x W x W)/2)=TVmm3))를 계산하기 위해 측정시에 길이와 너비(밀리미터)를 수집하기 위해 슬라이딩 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 마우스를 그룹당 총(10)마리의 마우스로 다른 치료 그룹으로 무작위 배정했다. 모든 치료 그룹의 균형을 맞추기 위해 무작위 배정을 수행하여, 각 그룹이 유사한 평균 종양 부피 및 표준 편차로 치료를 시작할 수 있도록 했다. 16일 연속 투여를 위해 투여는 9일째에 시작하여 24일째에 종료되었다. 마우스에게 푸르니에렐라 마실리엔시스 미생물을 QD로 경구 투여하거나, 200 μg 항-마우스 PD-1 항체를 복강 내 Q4D로 투여했다. 체중 및 종양 측정은 월요일-수요일-금요일(MWF) 일정에 따라 수집하였다.
도 10에 도시된 24일 종양 부피 요약은 푸르니에렐라 마실리엔시스(10e11 세포)를 음성 대조군(비히클 PBS), 및 양성 대조군(항-PD-1)과 비교한다. 비히클 PBS BID와 비교한 푸르니에렐라 마실리엔시스 치료 그룹은 통계적으로 유의한 효능을 나타내지 않았으며, 푸르니에렐라 마실리엔시스는 항-PD-1과 유의하게 상이하지 않았다. 도 11에 도시된 종양 부피 곡선은 푸르니에렐라 마실리엔시스 그룹의 성장 경향이 투여 기간 동안 음성 대조군(비히클 PBS)보다 훨씬 더 낮은 종양 성장을 나타냈으며, 푸르니에렐라 마실리엔시스 그룹도 또한 특히 치료 8일 후 양성 대조군(항-PD-1)보다 더 낮은 성장 속도를 나타냈음을 보여준다.
실시예 4: 지연형 과민증(DTH)의 마우스 모델에서 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV
지연형 과민증(DTH)은 Petersen et al.에 의해 검토된 바와 같이 아토피 피부염(또는 알레르기성 접촉 피부염)의 동물 모델이다 (문헌[In vivo pharmacological disease models for psoriasis and atopic dermatitis in drug discovery. Basic & Clinical Pharm & Toxicology. 2006. 99(2): 104-115]; 또한, 문헌[Irving C. Allen (ed.) Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2013. vol. 1031, DOI 10.1007/978-1-62703-481-4_13] 참조). DTH 모델의 여러 변형이 사용되었고, 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Irving C. Allen (ed.). Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Vol. 1031, DOI 10.1007/978-1-62703-481-4_13, Springer Science + Business Media, LLC 2013]).
제1 KLH DTH 연구:
5주령 암컷 C57BL/6 마우스를 Taconic Biosciences에서 구입하여 사육장에서 1주일 동안 순응시켰다. 0일차에 피하 면역화에 의해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 완전 프로인트 아쥬반트(CFA)(1:1)의 에멀젼으로 마우스를 프라이밍하였다. 마우스에게 smEV를 매일 경구 위관영양 공급하거나, 1~8일에 덱사메타손 1 mg/kg을 복강 내 투여했다. 8일째에 투여한 후, 마우스를 이소플루란으로 마취하고, Fowler 캘리퍼스로 기준선 측정을 위해 왼쪽 귀를 측정하고, 마우스에 식염수(10 μl) 중 KLH를 왼쪽 귀에 피내 시험감염시키고, 귀 두께를 24시간에 측정했다. NTA에 의한 입자 수에 의해 투여량을 결정하였다.
24시간 귀 측정 결과는 도 12에 도시되어 있다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A로부터 제조된 smEV는 2E+11 및 2E+07(용량 당 입자 기준)의 2가지 용량에서 비교하였다. smEV는 효과적이었으며, 시험감염 24시간 후에 귀 염증 수준 감소를 보였다.
실시예 5: smEV 단리 및 계산
필요한 장비:
SLA-3000 회전자가 장착된 Sorvall RC-5C 원심분리기
Beckman-Coulter의 Optima XE-90 초원심분리기
45Ti 회전자
Thermo Scientific의 Sorvall wX+ Ultra 시리즈 원심분리기
Fiberlite F37L-8x100 회전자
1. 미생물 상청액 수집 및 여과:
미생물이 아닌 smEV를 회수하려면 미생물을 펠릿화하고 상청액에서 여과해야 한다.
a. 펠릿 미생물 배양물
i. 최소 7,000 rpm에서 최소 15분 동안 SLA-3000 회전자가 있는 Sorvall RC-5C 원심분리기를 사용하고 배양액을 원심분리한다.
ii. 새롭고 멸균된 용기에 상청액을 따른다.
b. 상청액 여과
i. 0.2 μm 필터를 통해 상청액을 여과한다.
ii. 여과력이 안좋은 상청액(300 ml 미만의 상청액이 필터를 통과함)의 경우, 0.45 μg 캡슐 필터를 0.2 um 진공 필터 앞에 부착한다.
iii. 4℃에서 '여과된' 상청액을 저장한다.
iv. 그런 다음, 여과된 상청액을 TFF를 사용하여 농축시킬 수 있다.
2. 초원심분리를 사용한 smEV의 단리
초원심분리기에서 농축된 상청액을 원심분리하면, 더 작은 생체분자에서 smEV를 단리하는 펠릿 smEV가 될 것이다.
i. 속도를 200,000 x g으로, 시간을 1시간으로, 그리고 온도를 4℃로 설정한다.
ii. 회전자가 정지하면 초원심분리기에서 튜브를 제거하고, 상청액을 조심스럽게 붓는다.
iii. 상청액을 더 첨가하고, 밸런싱하고, 튜브를 다시 원심분리한다.
iv. 모든 농축된 상청액을 원심분리한 후, 생성된 펠릿을 '미정제' smEV 펠릿이라고 한다.
v. 펠릿에 멸균 1xPBS를 추가하고, 용기에 넣는다. 용기를 속도 70으로 설정된 셰이커에 놓고 4℃ 냉장고에서 밤새 또는 그 이상 보관한다.
vi. smEV 펠릿을 추가의 멸균 1xPBS와 함께 재현탁한다.
1. 재현탁된 미정제 smEV 샘플을 4℃ 또는 -80℃에서 보관한다.
3. 밀도 구배를 사용한 smEV 정제
밀도 구배는 smEV 정제에 사용한다. 초원심분리 동안 샘플의 입자는 '부력' 밀도에 따라 등급이 매겨진 밀도 매질 내에서 이동하고 분리된다. 이러한 방식으로 smEV는 샘플에서 당, 지질 또는 다른 단백질과 같은 다른 입자로부터 분리된다.
a. 밀도 배지의 제조
i. smEV 정제를 위해, 밀도 배지(60% Optiprep)의 4가지 다른 백분율, 즉 45% 층, 35% 층, 25% 및 15% 층을 사용한다. 이렇게 하면 등급이 지정된 층이 생성된다. 멸균 1xPBS로 구성된 상단에 0% 층을 추가한다.
ii. 45% 구배 층애는 미정제 smEV 샘플이 함유되어야 한다. 샘플 5 ml를 Optiprep 15 ml에 첨가한다. 미정제 smEV 샘플이 5 ml 미만인 경우, 멸균 1xPBS를 사용하여 해당 부피까지 가져온다.
b. 밀도 구배 어셈블리
i. 혈청학적 피펫을 사용하여, 45% 구배 혼합물을 위아래로 조심스럽게 피펫하여 혼합한다. 그런 다음, 샘플을 표지된 깨끗하고 멸균된 초원심분리기 튜브에 피펫한다.
ii. 다음으로, 10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여, 35% 구배 혼합물 13 ml를 천천히 추가한다.
iii. 25% 구배 혼합물 13 ml로 계속하고, 15% 혼합물 13 ml를 첨가하고, 마지막으로 멸균 1xPBS 6 ml를 첨가한다.
iv. 멸균 1xPBS로 초원심분리기 튜브를 밸런싱한다.
v. 회전자에 구배를 조심스럽게 배치하고 초원심분리기를 200,000 x g으로 설정하고 온도를 4℃로 설정한다. 최소 16시간 동안 원심분리한다.
c. 정제된 smEV를 밀도 구배로부터 제거
i. 깨끗한 피펫을 사용하여 관심 부분(들)을 제거하고, 15 ml 코니컬 튜브에 추가한다.
ii. '정제된' smEV 샘플을 4℃로 유지한다.
d. 정제된 smEV로부터 Optiprep 물질 제거
i. smEV에서 잔류 optiprep을 세척하고 제거하기 위해, 10배 부피의 PBS를 정제된 smEV에 첨가해야 한다.
ii. 초원심분리기를 200,000 x g으로 설정하고 온도를 4℃로 설정한다. 1시간 동안 원심분리한다.
iii. 초원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 상청액을 가만히 따른다.
iv. 모든 샘플이 펠릿화될 때까지 정제된 smEV를 계속 '세척'한다.
v. 정제된 펠릿에 멸균 1xPBS를 추가하고, 용기에 넣는다. 용기를 속도 70으로 설정된 셰이커에 놓고 4℃ 냉장고에서 밤새 또는 그 이상 보관한다.
vi. '정제된' smEV 펠릿을 추가의 멸균 1xPBS와 함께 재현탁한다.
1. 재현탁된 정제된 smEV 샘플을 4℃ 또는 -80℃에서 보관한다.
실시예 6: 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV U937 시험 프로토콜
세포주 제조
1. U937 단핵구 세포주(ATCC)를 FBS HEPES, 피루브산나트륨 및 항생제가 첨가된 RPMI 배지에서 37℃에서 5% CO2와 함께 증식시켰다.
2. 생존력을 결정하기 위해 살아있는/죽은 염색을 사용하는 셀로미터를 사용하여 세포를 계수하였다.
3. 세포를 20 nM 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)가 포함된 RPMI 배지에서 ml당 5x105 세포의 농도로 희석하여 단핵구를 대식세포-유사 세포로 분화시켰다.
4. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 72시간 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다.
5. 부착된 분화된 세포를 세척하고, 실험 전에 PMA가 없는 새로운 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
실험 설정
1. smEV를 항생제가 없는 RPMI 배지(전형적으로 1x105~1x1010)에서 적당한 농도로 희석했다.
2. 무처리 및 TLR 2 및 4 효능제 대조군 샘플도 제조한다.
3. 분화된 U937 세포를 함유하는 96-웰 플레이트를 항생제가 없는 신선한 RPMI 배지로 세척하여 잔류 항생제를 제거하였다.
4. smEV의 현탁액을 세척된 플레이트에 첨가하였다.
5. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
실험 평가변수
1. 24시간의 공동 인큐베이션 후, 상청액을 U937 세포로부터 별도의 96-웰 플레이트로 제거하였다. 세포는 웰에서 명백한 용해(플라크)에 대해 관찰되었다.
2. 2개의 무처리 웰은 상청액을 제거하지 않았으며, 용해 완충액을 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 세포를 용해시켰다(최대 용해 대조군).
3. 50 마이크로리터의 각 상청액 또는 최대 용해 대조군을 새로운 96-웰 플레이트에 첨가하고, 제조업체의 지침에 따라 세포 용해를 측정했다(CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega).
4. 제조업체의 지침에 따라 U-plex MSD 플레이트(Meso Scale Discovery)를 사용하여 상청액에서 사이토카인을 측정했다.
푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A로부터의 smEV는 PMA-분화된 U937 세포에서 사이토카인 생성을 유도한다(도 13). U937 세포는 1x106~1x109 농도의 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV와 TLR2(FSL) 및 TLR4(LPS) 작용제 대조군으로 24시간 처리되고, 사이토카인 생산이 측정되었다. 이 균주로부터의 smEV의 저농도에서 보이는 강한 효과를 주목한다. "블랭크"는 배지 대조군을 나타낸다.
실시예 7: 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A 감마-조사된 전체 박테리아 U937 테스트 프로토콜
세포주 제조
1. U937 단핵구 세포주(ATCC)를 FBS HEPES, 피루브산나트륨 및 항생제가 첨가된 RPMI 배지에서 37℃에서 5% CO2와 함께 증식시켰다.
2. 생존력을 결정하기 위해 살아있는/죽은 염색을 사용하는 셀로미터를 사용하여 세포를 계수하였다.
3. 세포를 20 nM 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)가 포함된 RPMI 배지에서 ml당 5x105 세포의 농도로 희석하여 단핵구를 대식세포-유사 세포로 분화시켰다.
4. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 72시간 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다.
5. 부착된 분화된 세포를 세척하고, 실험 전에 PMA가 없는 새로운 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
실험 설정
1. 박테리아 세포를 항생제가 없는 RPMI 배지(전형적으로 1x105~1x1010)에서 적당한 농도로 희석했다.
2. 무처리 및 TLR 2 및 4 효능제 대조군 샘플도 제조한다
3. 분화된 U937 세포를 함유하는 96-웰 플레이트를 항생제가 없는 신선한 RPMI 배지로 세척하여 잔류 항생제를 제거하였다.
4. 박테리아의 현탁액을 세척된 플레이트에 첨가하였다.
5. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
실험 평가변수
1. 24시간의 공동 인큐베이션 후, 상청액을 U937 세포로부터 별도의 96-웰 플레이트로 제거하였다. 세포는 웰에서 임의의 명백한 용해(플라크)에 대해 관찰되었다.
2. 2개의 무처리 웰은 상청액을 제거하지 않았으며, 용해 완충액을 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 세포를 용해시켰다(최대 용해 대조군).
3. 50 마이크로리터의 각 상청액 또는 최대 용해 대조군을 새로운 96-웰 플레이트에 첨가하고, 제조업체의 지침에 따라 세포 용해를 측정했다(CytoTox 96®　Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega).
4. 사이토카인은 제조업체의 지침에 따라 U-plex MSD 플레이트(Meso Scale Discovery)를 사용하여 상청액에서 측정했다.
푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A 전체 감마-조사된 미생물은 PMA-분화된 U937 세포로부터 사이토카인 생산을 유도한다(도 14). U937 세포는 1x105 및 1x106 농도의 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A와 TLR2(FSL) 및 TLR4(LPS) 작용제 대조군으로 24시간 처리되고, 사이토카인 생산이 측정되었다. "블랭크"는 배지 대조군을 나타낸다.
실시예 8: 마우스 종양 모델을 치료하기 위한 pmEV 조성물 투여
실시예 2에 기재된 바와 같이, 종양 세포주 또는 환자-유래 종양 샘플을 피하 주사하여 건강한 마우스에 이식함으로써 암 마우스 모델을 생성한다. 본원에 제공된 방법은 흑색종의 동소 모델로서 B16-F10 또는 B16-F10-SIY 세포, 췌장암의 동소 모델로서 Panc02 세포(Maletzki et al., 2008, Gut 57:483-491), 폐암의 동소 모델로서 LLC1 세포, 및 전립선암의 동소 모델로서 RM-1을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 여러 상이한 종양 세포주 중 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, B16-F10 모델에서 pmEV의 효능을 연구하기 위한 방법이 본원에서 심층적으로 제공되지만, 이에 한정되지 않는다.
매우 높은 전이 빈도를 갖는 자발적 흑색종의 동계 마우스 모델을 사용하여 박테리아가 종양 성장 및 전이 확산을 감소시키는 능력을 테스트한다. 이 분석을 위해 선택된 pmEV는 면역 세포 하위집합의 향상된 활성화를 표시하고 시험관 내에서 종양 세포의 향상된 사멸을 자극할 수 있는 조성물이다. 마우스 흑색종 세포주 B16-F10은 ATCC로부터 수득된다. 세포는 공기 중 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 10% 열-불활성화 소태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 단층으로 시험관 내에서 배양된다. 기하급수적으로 성장하는 종양 세포는 트립신 처리에 의해 수확하고, 차가운 1x PBS로 3회 세척하고, 5E6 세포/ml의 현탁액을 투여를 위해 준비한다. 암컷 C57BL/6 마우스를 이 실험에 사용한다. 마우스는 6~8주령이고, 체중은 약 16~20 g이다. 종양 발달을 위해, 각 마우스에 B16-F10 세포 현탁액 100 μl를 옆구리에 SC 주사하였다. 마우스는 세포 이식 전에 케타민과 자일라진으로 마취한다. 실험에 사용된 동물은 카나마이신(0.4 mg/ml), 겐타마이신(0.035 mg/ml), 콜리스틴(850 U/ml), 메트로니다졸(0.215 mg/ml) 및 반코마이신(0.045 mg/ml)의 칵테일을 2일에서 5일까지 음용수에 점적하고, 종양 주사 후 7일에 클린다마이신(10 mg/kg)을 복강내 주사하여 항생제 치료를 시작할 수 있다.
원발성 옆구리 종양의 크기는 2~3일마다 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피는 하기 공식을 사용하여 계산한다: 종양 부피 = 종양 폭 Х 종양 길이 Х 0.5. 원발성 종양이 대략 100 mm3에 도달한 후, 동물을 체중을 기준으로 여러 그룹으로 분류한다. 그런 다음 마우스를 각 그룹에서 무작위로 선택하여 처리 그룹에 할당한다. pmEV 조성물은 이전에 설명한 대로 준비한다. 마우스에 대략 7.0e+09 내지 3.0e+12 pmEV 입자를 위관영양법으로 경구 접종한다. 대안적으로, pmEV를 정맥내 주사한다. 마우스는 치료 기간 동안 매일, 매주, 격주, 매월, 격월로 또는 기타 임의의 투여 일정에 따라 pmEV를 받는다. 마우스에 꼬리 정맥에 pmEV를 IV 주사하거나, 종양에 직접 주사할 수 있다. 생 박테리아가 있거나 없는 pmEV, 및/또는 불활성화/약화되거나 사멸된 박테리아가 있거나 없는 pmEV를 마우스에 주사할 수 있다. 마우스에 매주 또는 한 달에 한 번 주사하거나 경구 위관영양을 공급할 수 있다. 마우스는 종양-살해 잠재력을 최대화하기 위해 정제된 pmEV와 살아있는 박테리아의 조합을 받을 수 있다. 모든 마우스는 승인된 프로토콜에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육된다. 종양 크기, 마우스 체중 및 체온은 3~4일마다 모니터링하고, B16-F10 마우스 흑색종 세포 주사 6주 후 또는 원발성 종양의 부피가 1000 mm3에 도달할 때 마우스를 인도적으로 희생시켰다. 매주 채혈을 하고, 프로토콜 종료 시 멸균 조건에서 전체 부검을 수행한다.
암세포는 멜라닌 생성으로 인해 마우스 B16-F10 흑색종 모델에서 쉽게 시각화될 수 있다. 표준 프로토콜에 따라, 목과 가슴 부위의 림프절 및 기관에서 조직 샘플을 수집하고, 다음 분류 규칙을 사용하여 미세 전이 및 거대 전이의 존재를 분석한다. 림프절 또는 기관당 최소 2개의 미세-전이성 병변과 1개의 거대-전이성 병변이 발견되면 기관은 전이에 대해 양성으로 분류된다. 미세-전이는 당업자에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린-에오신으로 파라핀-포매 림프 조직 절편을 염색함으로써 검출된다. 전체 전이 수는 원발성 종양의 부피와 상관관계가 있으며, 종양 부피는 종양 성장 시간 및 림프절 및 내장 기관의 거대-전이 및 미세-전이 수 및 관찰된 모든 전이 합과 상관관계가 있다. 25개의 상이한 전이 부위가 이전에 기재된 바와 같이 확인되었다(문헌[Bobek V., et al., Syngeneic lymph-node-targeting model of green fluorescent protein-expressing Lewis lung carcinoma, Clin. Exp. Metastasis, 2004;21(8):705-8]).
종양 조직 샘플을 종양 침윤 림프구에 대해 추가로 분석한다. CD8+ 세포독성 T 세포는 FACS에 의해 단리될 수 있으며, 그 다음 맞춤형 p/MHC 클래스 I 마이크로어레이를 사용하여 추가로 분석하여 그의 항원 특이성을 나타낼 수 있다(예를 들어, 문헌[Deviren G., et al., Detection of antigen-specific T cells on p/MHC microarrays, J. Mol. Recognit., 2007 Jan-Feb;20(1):32-8]). CD4+ T 세포는 맞춤형 p/MHC 클래스 II 마이크로어레이를 사용하여 분석할 수 있다.
다양한 시점에서, 마우스를 희생시키고, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 생체외 유세포 분석을 위해 종양, 림프절 또는 다른 조직을 제거할 수 있다. 예를 들어, 종양을 제조업체의 지시에 따라 Miltenyi 종양 해리 효소 칵테일을 사용하여 해리한다. 종양 중량을 기록하고 종양을 잘게 자른 다음, 효소 칵테일을 함유하는 15ml 튜브에 넣고, 얼음 위에 놓는다. 이어서 샘플을 37℃에서 45분 동안 완만한 진탕기에 넣고, 최대 15 ml의 완전한 RPMI로 켄칭하였다. 각 세포 현탁액을 70 μm 필터를 통해 50 ml 팔콘 튜브에 넣고 1000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 세포를 FACS 완충액에 재현탁시키고, 세척하여 남아있는 잔해물을 제거한다. 필요한 경우 샘플을 두 번째 70 μm 필터를 통해 새 튜브로 다시 변형시킨다. 세포는 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 유세포 분석법에 의해 분석을 위해 염색된다. 염색 항체는 항-CD11c(수지상 세포), 항-CD80, 항-CD86, 항-CD40, 항-MHCII, 항-CD8a, 항-CD4, 및 항-CD103을 포함할 수 있다. 분석할 수 있는 다른 마커로는 범면역 세포 마커 CD45, T 세포 마커(CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Rorγt, 그랜자임 B, CD69, PD-1, CTLA-4), 및 대식세포/골수성 마커(CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1)가 포함된다. 면역표현형 외에도, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES, 및 MCP-1을 포함하는(이에 한정되지 않음) 혈청 사이토카인이 분석될 수 있다. 사이토카인 분석은 림프절 또는 다른 조직으로부터 얻은 면역 세포, 및/또는 생체 외에서 얻은 정제된 CD45+ 종양-침윤된 면역 세포에서 수행될 수 있다. 최종적으로, 면역조직화학은 종양 섹션에서 수행되어, T 세포, 대식세포, 수지상세포 및 관문 분자 단백질 발현을 측정한다.
다발성 폐 흑색종 전이의 마우스 모델에서도 동일한 실험을 수행하였다. 마우스 흑색종 세포주 B16-BL6을 ATCC로부터 수득하고, 세포를 상기 기재된 바와 같이 시험관내 배양한다. 암컷 C57BL/6 마우스를 이 실험에 사용한다. 마우스는 6~8주령이고, 체중은 약 16~20 g이다. 종양 발달을 위해, 각 마우스에 B16-BL6 세포의 2E6 세포/ml 현탁액 100 μl를 꼬리 정맥에 주사하였다. IV 주입 시 생착되는 종양 세포는 결국 폐에 도달한다.
마우스는 9일 후에 인도적으로 살해된다. 폐의 중량을 측정하고 폐 표면에 폐 결절이 있는지 분석한다. 추출된 폐를 Fekete 용액으로 표백하는데, 종양 결절은 B16 세포의 멜라닌 때문에 표백되지 않지만, 결절의 작은 부분에는 멜라닌 색소가 없다(즉, 흰색). 종양 결절의 수는 마우스의 종양 부담을 결정하기 위해 신중하게 계산된다. 전형적으로, 200~250개의 폐 결절이 대조군 마우스의 폐에서 발견된다(즉, PBS 위관영양).
3개의 처리군에 대해 종양 부담 백분율을 계산한다. 백분율 종양 부담은 대조군 마우스의 폐 표면에 있는 평균 폐 결절 수로 나눈, 처리 그룹에 속하는 마우스의 폐 표면에 있는 평균 폐 결절 수로 정의된다.
종양 생검 및 혈액 샘플은 LCMS 기술 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 통한 대사 분석을 위해 제출된다. 테스트 그룹 사이의 다른 대사산물 중에서 아미노산, 당, 젖산염의 차등 수준은 종양 대사 상태를 방해하는 미생물 조성물의 능력을 보여준다.
작용 메커니즘을 결정하기 위한 RNA 서열
수지상 세포는 종양, Peyers 패치 및 장간막 림프절에서 정제된다. RNAseq 분석은 당업자에게 공지된 표준 기술에 따라 수행 및 분석된다(문헌[Z. Hou. Scientific Reports. 5(9570):doi:10.1038/srep09570 (2015)]. 분석에서, TLR, CLR, NLR, 및 STING, 사이토카인, 케모카인, 항원 처리 및 제시 경로, 교차 제시, T 세포 공동 자극을 포함한 선천적 염증 경로 유전자에 특별한 주의를 기울인다.
일부 마우스는 희생시키는 대신 반대쪽 옆구리(또는 다른 영역)에 종양 세포 주입을 다시 시도하여 종양 성장에 대한 면역 체계의 기억 반응의 영향을 확인할 수 있다.
실시예 9: PD-1 또는 PD-L1 억제와 조합하여 마우스 종양 모델을 치료하기 위한 pmEV 투여
종양 마우스 모델에서 pmEV의 효능을 결정하기 위해 PD-1 또는 PD-L1 억제와 조합하여 마우스 종양 모델을 위에서 설명한 바와 같이 사용할 수 있다.
pmEV는 단독으로 또는 전체 박테리아 세포와 조합하여 항-PD-1 또는 항-PD-L1과 함께 또는 없이 마우스 종양 모델에서의 효능에 대해 테스트된다. pmEV, 박테리아 세포 및/또는 항-PD-1 또는 항-PD-L1은 다양한 시점과 다양한 용량으로 투여된다. 예를 들어, 종양 주입 후 10일째에 또는 종양 부피가 100 mm3에 도달한 후, 마우스를 pmEV 단독으로 또는 항-PD-1 또는 항-PD-L1과 조합하여 처리한다.
마우스에 pmEV를 경구, 정맥내 또는 종양내 투여할 수 있다. 예를 들어, 일부 마우스는 7.0e+09 내지 3.0e+12개 pmEV 입자를 정맥 주사한다. 일부 마우스는 정맥내 주사를 통해 pmEV를 받고, 다른 마우스는 복강내(i.p.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 비강 투여, 경구 위관영양 또는 기타 투여 수단을 통해 pmEV를 받을 수 있다. 일부 마우스는 매일 pmEV를 받을 수 있고(예를 들어, 1일차 시작), 다른 마우스는 다른 간격(예를 들어, 격일 또는 3일에 한 번)으로 pmEV를 받을 수 있다. 마우스 그룹은 pmEV 및 박테리아 세포의 혼합물을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여받을 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1:1(pmEV:박테리아 세포) 내지 1~1x1012:1(pmEV:박테리아 세포)의 비율로 pmEV 입자 및 전체 박테리아를 포함할 수 있다.
대안적으로, 마우스의 일부 그룹은 pmEV 투여와 별도로 또는 병행 투여로 1x104 내지 5x109개의 박테리아 세포를 투여받을 수 있다. pmEV와 마찬가지로, 박테리아 세포 투여는 투여 경로, 용량 및 일정에 따라 달라질 수 있다. 박테리아 세포는 살아 있거나 죽었거나 약화되었을 수 있다. 박테리아 세포는 신선하게(또는 냉동) 수확하여 투여할 수 있으며, 또는 pmEV를 투여하기 전에 방사선을 조사하거나 가열하여 죽일 수 있다. 일부 그룹의 마우스에도 유효량의 관문 억제제를 주사한다. 예를 들어, 마우스는 100 μg의 항-PD-L1 mAB(클론 10f.9g2, BioXCell) 또는 100 μl PBS 중 또 다른 항-PD-1 또는 항-PD-L1 mAB를 받고, 일부 마우스는 비히클 및/또는 기타 적절한 대조군(예를 들어, 대조군 항체)을 받는다. 마우스는 초기 주사 후 3, 6 및 9일에 mAb를 주사받는다. 관문 억제 및 pmEV 면역요법이 부가적인 항종양 효과를 갖는지 여부를 평가하기 위해, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 mAb를 투여받는 대조군 마우스를 표준 대조군 패널에 포함시켰다. 1차(종양 크기) 및 2차(종양 침윤 림프구 및 사이토카인 분석) 평가변수를 평가하고, 일부 그룹의 마우스는 기억 반응에 대한 치료 효과를 평가하기 위해 후속 종양 세포 접종을 다시 시도할 수 있다.
실시예 10: 박테리아 pmEV 표지화
pmEV는 생체 내에서의 생체 분포를 추적하고 다양한 제제 및 포유동물 세포로 수행된 분석에서 세포 국소화를 정량화 및 추적하기 위해 표지될 수 있다. 예를 들어, pmEV는 방사성 표지, 염료와 함께 인큐베이션, 형광 표지, 발광 표지 또는 금속 및 금속 동위원소를 함유하는 접합체로 표지될 수 있다.
예를 들어, pmEV는 NHS-에스테르, 클릭-화학 기, 스트렙타비딘 또는 비오틴과 같은 작용기에 접합된 염료와 함께 인큐베이션될 수 있다. 표지 반응은 다양한 온도에서 몇 분 또는 몇 시간 동안, 교반 또는 회전을 수반 또는 수반하지 않고 발생할 수 있다. 그런 다음 프로토콜에 따라 소 혈청 알부민(BSA) 또는 유사 제제와 같은 시약을 추가하여 반응을 중단할 수 있으며, 한외 원심분리, 여과, 원심 여과, 컬럼 친화성 정제 또는 투석에 의해 유리 또는 결합되지 않은 염료 분자를 제거할 수 있다. 세척 완충액 및 와동 또는 교반을 포함하는 추가 세척 단계를 사용하여 유리 염료 분자를 완전히 제거할 수 있으며, 문헌[Su Chul Jang et al, Small. 11, No.4, 456-461(2017)]에 기재된 바와 같다.
선택적으로, pmEV는 5.0 E12 입자/ml(300 ug)로 농축될 수 있고, 2X 농축 PBS 완충액 pH 8.2를 사용하여 1.8 mo까지 희석되고, 벤치탑 초원심분리기를 사용하여 4℃에서 165,000 x g에서 원심분리에 의해 펠릿화될 수 있다. 펠릿을 300 ul 2X PBS pH 8.2에 재현탁하고, NHS-에스테르 형광 염료를 10 mM 염료 스톡(DMSO에 용해됨)으로부터 0.2 mM의 최종 농도로 첨가한다. 샘플을 24℃에서 1.5시간 동안 부드럽게 교반한 다음, 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 유리 미반응 염료는 1X PBS 완충액을 사용하고 300 ul 최종 부피에 재현탁하여, 위에서 설명한 대로 2회 반복되는 희석/펠릿화 단계에 의해 제거된다.
형광 표지된 pmEV는 공초점 현미경, 나노입자 추적 분석, 유세포 분석, 형광 활성화 세포 분류(FAC) 또는 Odyssey CLx LICOR와 같은 형광 이미징 시스템에 의해 세포 또는 기관, 또는 시험관내 및/또는 생체외 샘플에서 검출된다(예를 들어, 문헌[Wiklander et al. 2015. J. Extracellular Vesicles. 4:10.3402/Jev.v4.26316] 참조). 또한, H-I에서와 같이 IVIS 스펙트럼 CT(Perkin Elmer) 또는 Pearl Imager와 같은 기기를 사용하여 전체 동물 및/또는 해부된 장기 및 조직에서 형광 표지된 pmEV를 검출한다(문헌[Choi, et al. Experimental & Molecular Medicine. 49: e330 (2017)]).
pmEV는 위에 설명된 프로토콜을 사용하여 금속 및 금속의 동위원소를 함유하는 접합체로 표지될 수 있다. 금속-접합 pmEV는 생체 내에서 동물에게 투여될 수 있다. 그런 다음 다양한 시점에서 장기에서 세포를 수확하고, 생체 외에서 분석할 수 있다. 대안적으로, 동물, 인간 또는 불멸화된 세포주로부터 유래된 세포는 시험관내에서 금속-표지된 pmEV로 처리될 수 있고, 이후에 세포는 금속-접합 항체로 표지되고, Helios CyTOF(Fluidigm)와 같은 CyTOF(Cytometry by Time of Flight) 기기를 사용하여 표현형이 지정되거나, Hyperion Imaging System(Fluidigm)과 같은 영상 질량 세포측정 기기를 사용하여 이미지화 및 분석이 이루어질 수 있다. 또한, pmEV는 pmEV의 생체 분포를 추적하기 위해 방사성 동위원소로 표지될 수 있다(예를 들어, 문헌[Miller et al., Nanoscale. 2014 May 7;6(9):4928-35] 참조).
실시예 11: 박테리아 pmEV를 시각화하기 위한 투과 전자 현미경
pmEV는 박테리아 배치 배양물로부터 제조된다. 투과 전자 현미경(TEM)은 정제된 박테리아 pmEV를 시각화하는 데 사용할 수 있다(문헌[S. Bin Park, et al. PLoS ONE. 6(3):e17629 (2011)]). pmEV를 300 또는 400 메쉬-크기의 탄소-코팅된 구리 그리드(Electron Microscopy Sciences, USA)에 2분 동안 장착하고, 탈이온수로 세척한다. pmEV를 2%(w/v) 우라닐 아세테이트를 사용하여 20초~1분 동안 음성 염색한다. 구리 그리드를 멸균수로 세척하고, 건조한다. 100~120 kV 가속 전압의 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지를 획득한다. 염색된 pmEV는 20~600 nm 사이의 직경을 나타내며, 전자 밀도가 높다. 각 그리드의 10~50 필드가 스크리닝된다.
실시예 12: pmEV 조성 및 함량 프로파일링
pmEV는 NanoSight 특성화, SDS-PAGE 겔 전기영동, 웨스턴 블롯, ELISA, 액체 크로마토그래피-질량 분석 및 질량 분석, 동적 광산란, 지질 수준, 총 단백질, 지질 대 단백질 비율, 핵산 분석 및/또는 제타 전위를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 방법 중 하나로 특성화될 수 있다.
pmEV의 NanoSight 특성화
나노입자 추적 분석(NTA)은 정제된 박테리아 pmEV의 크기 분포를 특성화하는 데 사용된다. 정제된 pmEV 제제는 NanoSight 기계(Malvern Instruments)에서 실행되어, pmEV 크기 및 농도를 평가한다.
SDS-PAGE 겔 전기영동
정제된 pmEV의 단백질 성분을 확인하기 위해, 샘플은 표준 기술을 사용하여 겔, 예를 들어 Bolt Bis-Tris Plus 4~12% 겔(Thermo-Fisher Scientific)에서 실행한다. 샘플을 1x SDS 샘플 완충액에서 10분 동안 끓이고, 4℃까지 냉각한 다음, 16,000 x g에서 1분 동안 원심분리한다. 그런 다음, 샘플을 SDS-PAGE 겔에서 실행하고, 밴드의 시각화를 위해 여러 표준 기술(예를 들어, 실버(Silver) 염색, 쿠마시 블루(Coomassie Blue), 겔 코드 블루(Gel Code Blue)) 중 하나를 사용하여 염색한다.
웨스턴 블롯 분석
정제된 pmEV의 특정 단백질 성분을 확인하고 정량화하기 위해, pmEV 단백질을 위에서 설명한 대로 SDS-PAGE로 분리하고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하고(문헌[Cvjetkovic et al., Sci . Rep. 6, 36338 (2016)]), ELISA를 통해 정량화한다.
pmEV 단백질체학 및 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS) 및 질량분석법(MS)
pmEV에 존재하는 단백질은 질량 분석 기술에 의해 확인되고 정량화된다. pmEV 단백질은 Erickson et al, 2017(Molecular Cell, VOLUME 65, ISSUE 2, P361-370, JANUARY 19, 2017)에 설명된 대로 디티오트레이톨 용액(DTT)을 사용한 단백질 환원 및 LysC 및 트립신과 같은 효소를 사용한 단백질 분해를 포함한 표준 기술을 사용하여 LC-MS/MS용으로 준비할 수 있다. 대안적으로, 펩타이드는 Liu et al. 2010(문헌[JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2010, p. 2852-2860 Vol. 192, No. 11]), Kieselbach 및 Oscarsson 2017(문헌[Data Brief. 2017 Feb; 10: 426-431.]), Vildhede et al, 2018(문헌[Drug Metabolism and Disposition February 8, 2018])에 기재된 대로 제조한다. 분해 후, 펩타이드 제제는 단일 샘플 내에서 단백질 식별을 위해 액체 크로마토그래피 및 질량 분석 장치에서 직접 실행된다. 샘플 간 단백질의 상대적 정량화를 위해, 다른 샘플로부터의 펩타이드 분해물은 iTRAQ Reagent-8plex Multiplex 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA) 또는 TMT 10plex 및 11plex Label 시약(Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA, USA)을 사용하여 동위원소 태그로 표지된다. 각 펩타이드 분해물을 다른 동위원소 태그로 라벨링한 다음, 라벨링된 분해물을 하나의 샘플 혼합물로 조합한다. 결합된 펩타이드 혼합물은 식별 및 정량화 모두를 위해 LC-MS/MS에 의해 분석한다. LC-MS/MS 데이터를 사용하여 데이터베이스 검색을 수행하여, 표지된 펩타이드 및 해당 단백질을 식별한다. 동중 원소 라벨링의 경우, 부착된 태그의 단편화는 각 pmEV에 존재하는 펩타이드 및 단백질의 상대적 정량을 얻는 데 사용되는 저분자량 리포터 이온을 생성한다.
추가로, 대사 함량은 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 확인된다. 다양한 샘플의 대사체 함량을 결정하기 위한 다양한 기술이 존재하며, 용매 추출, 크로마토그래피 분리 및 질량 측정에 결합된 다양한 이온화 기술을 포함한다(문헌[Roberts et al 2012 Targeted Metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. 30: 1-24]; [Dettmer et al 2007, Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26(1):51-78]). 비제한적 예로서, LC-MS 시스템에는 1100 시리즈 펌프(Agilent) 및 HTS PAL 오토샘플러(Leap Technologies)와 결합된 4000 QTRAP 삼중 사중극자 질량 분석기(AB SCIEX)가 포함된다. 배지 샘플 또는 기타 복합성 대사 혼합물(약 10 μL)은 안정 동위원소-표지 내부 표준(발린-d8, Isotec; 및 페닐알라닌-d8, Cambridge Isotope Laboratories)을 포함하는 74.9:24.9:0.2(v/v/v) 아세토니트릴/메탄올/포름산의 9개 부피를 사용하여 추출한다. 표준은 관심 대사 산물에 따라 조정되거나 변형될 수 있다. 샘플을 원심분리(10분, 9,000 x g, 4℃)하고, 상청액 용액을 HILIC 컬럼(150 Х 2.1 mm, 3 μm 입자 크기)에 주입하여 상청액(10 μL)을 LCMS에 보낸다. 5% 이동상[10 mM 포름산 암모늄, 물 중 0.1% 포름산]을 1분 동안 250 μL/분의 속도로 흐르게 한 다음, 10분에 걸쳐 선형 구배를 40% 이동상의 용액[0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴]으로 흐르게 하여 컬럼을 용리한다. 이온 스프레이 전압은 4.5 kV로 설정되고, 공급 온도는 450℃이다.
질량 스펙트럼 피크 통합을 위해 AB SCIEX의 Multiquant 1.2와 같은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 관심 피크를 수동으로 선별하고 표준과 비교하여, 피크의 정체를 확인해야 한다. 박테리아 컨디셔닝 후 및 종양 세포 성장 후, 적절한 표준을 사용한 정량화가 수행되어 초기 배지에 존재하는 대사 산물의 수를 결정한다. 피크 식별을 위해 NIST 데이터베이스와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 대사물 데이터베이스를 사용하여 비표적 대사체학 접근법이 사용될 수도 있다.
동적 광산란(DLS)
DynaPro NanoStar(Wyatt Technology) 및 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)와 같은 기기를 사용하여 다양한 pmEV 제제에서 다양한 크기의 입자 분포를 포함하는 DLS 측정을 수행한다.
지질 수준
지질 수준은 FM4-64(Life Technologies)를 사용하여, 문헌[A.J. McBroom et al. J Bacteriol 188:5385-5392] 및 [A. Frias, et al. Microb Ecol . 59:476-486 (2010)]에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 정량화된다. 샘플을 FM4-64 (암실에서 37℃에서 10분간 PBS에서 3.3 μg/mL)와 함께 인큐베이션한다. 515 nm에서의 여기 후, Spectramax M5 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 635 nm에서의 방출을 측정한다. 절대 농도는 알려지지 않은 샘플을 알려진 농도의 표준(예컨대 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG) 소포)과 비교하여 결정된다. 지질학은 pmEV에 존재하는 지질을 식별하는 데 사용할 수 있다.
총 단백질
단백질 수준은 Bradford 및 BCA 분석과 같은 표준 분석에 의해 정량화된다. Bradford 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 Quick Start Bradford 1x 염료 시약(Bio-Rad)을 사용하여 실행된다. BCA 분석은 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo-Fisher Scientific)를 사용하여 실행된다. 절대 농도는 알려진 농도의 BSA로부터 생성된 표준 곡선과 비교하여 결정된다. 대안적으로, Nanodrop 분광광도계(Thermo-Fisher Scientific)에서 측정한 280 nm(A280)에서의 샘플 흡광도를 사용하여 Beer-Lambert 식을 사용하여 단백질 농도를 계산할 수 있다. 또한 단백질체학을 사용하여 샘플에서 단백질을 식별할 수 있다.
지질:단백질 비율
지질:단백질 비율은 지질 농도를 단백질 농도로 나눔으로써 산출된다. 이들은 각 제제의 유리 단백질과 비교하여 소포 순도의 측정치를 제공한다.
핵산 분석
핵산은 pmEV로부터 추출되고, Qubit 형광계를 사용하여 정량화된다. 크기 분포는 BioAnalyzer를 사용하여 평가하고, 재료를 시퀀싱한다.
제타 전위
다양한 제제의 제타 전위는 Zetasizer ZS(Malvern Instruments)와 같은 기기를 사용하여 측정한다.
실시예 13: 종양 세포와 함께 인큐베이션된 경우 CD8+ T 세포 사멸의 강화된 활성화를 위한 pmEV의 시험관내 선별
종양 세포의 CD8+ T 세포 사멸을 활성화할 수 있는 pmEV를 선별하기 위한 시험관내 방법이 기재되어 있다. 간단히 말해서, DC는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 인간 PBMC 또는 마우스 비장으로부터 단리되고, 단일-균주 pmEV, pmEV의 혼합물 및/또는 적절한 대조군과 함께 시험관내에서 인큐베이션된다. 또한, CD8+ T 세포는 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 자성 비드-기반 마우스 CD8a+ T 세포 분리 키트 및 자성 비드-기반 인간 CD8+ T 세포 단리 키트(둘다 Miltenyi Biotech, Cambridge, MA)를 사용하여 인간 PBMC 또는 마우스 비장으로부터 얻는다. 일정 시간 동안(예를 들어, 24시간 동안) pmEV와 함께 DC를 인큐베이션하거나, pmEV-자극된 상피 세포와 함께 DC를 인큐베이션한 후, PBS 세척을 사용하여 pmEV를 세포 배양물에서 제거하고, 항생제가 포함된 100 μl의 신선한 배지를 각 웰에 추가하고, 200,000개의 T 세포를 96-웰 플레이트의 각 실험 웰에 추가한다. 항-CD3 항체는 2 ug/ml의 최종 농도로 첨가한다. 그런 다음 공동 배양물은 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시킨다.
예를 들어, 공동 배양 인큐베이션 약 72시간에, 종양 세포를 당업계에 공지된 기술을 사용하여 분석에 사용하기 위해 플레이팅한다. 예를 들어, 50,000개의 종양 세포/웰을 새로운 96-웰 플레이트에 웰당 플레이팅한다. 사용된 마우스 종양 세포주는 B16.F10, SIY+ B16.F10 및 기타를 포함할 수 있다. 인간 종양 세포주는 공여자와 HLA-매칭되며, PANC-1, UNKPC960/961, UNKC, 및 HELA 세포주를 포함할 수 있다. 96-시간의 공동 배양 완료 후, 100 μl의 CD8+ T 세포 및 DC 혼합물을 종양 세포를 함유하는 웰로 옮긴다. 플레이트를 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 스타우로스파우린은 세포 사멸을 설명하기 위한 음성 대조군으로 사용될 수 있다.
이 인큐베이션 후, 유세포 분석을 사용하여 종양 세포 사멸을 측정하고 면역 세포 표현형을 특성화한다. 간단히 말해서, 종양 세포가 생존 염료로 염색된다. FACS 분석은 종양 세포를 특이적으로 게이트하여 죽은(사멸된) 종양 세포의 백분율을 측정하는 데 사용한다. 데이터는 또한 웰당 죽은 종양 세포의 절대 수로 표시된다. 세포독성 CD8+ T 세포 표현형은 하기 방법에 의해 특징지어질 수 있다: a) 하기 기재된 바와 같은 배양 상청액에서 상청액 그랜자임 B, IFNγ 및 TNFa의 농도, b) DC69, CD25, CD154, PD-1, 감마/델타 TCR, Foxp3, T-bet, 그랜자임 B와 같은 활성화 마커의 CD8+ T 세포 표면 발현, c) CD8+ T 세포에서 IFNγ, 그랜자임 B, TNFa의 세포내 사이토카인 염색. CD4+ T 세포 표현형은 INFγ, TNFα, IL-12, IL-4, IL-5, IL-17, IL-10, 케모카인 등을 포함하는 상청액 사이토카인 농도 외에 세포내 사이토카인 염색으로 평가할 수도 있다.
CD8+ T 세포 활성화의 추가 측정으로서, T 세포를 DC와 함께 96시간 인큐베이션한 후 웰에서 배양 상청액 100 μl를 제거하고 멀티플렉스 루미넥스 맥픽스(Luminex Magpix) 키트(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 분비된 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자에 대해 분석한다. 간단히 말해서, 웰은 완충액으로 미리 적시고, 1x 항체-코팅 자성 비드 25 μl를 첨가하고, 자석을 사용하여 모든 웰에서 2x 200 μl의 세척 완충액을 수행한다. 50 μl의 인큐베이션 완충액, 50 μl의 희석제 및 50 μl의 샘플을 첨가하고, 암실 상온에서 2시간 동안 진탕하여 혼합한다. 그런 다음 비드를 200 μl 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 1X 비오틴화된 검출기 항체 100 μl를 첨가하고, 현탁액을 암실에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 2개의 200 μl 세척액을 세척 완충액으로 수행한다. 100 μl의 1x SAV-RPE 시약을 각 웰에 첨가하고, 암실에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3회 200 μl 세척이 수행되고, 125 μl의 세척 완충액이 2~3분 진탕 발생과 함께 첨가된다. 그런 다음, 웰을 Luminex xMAP 시스템에서 분석을 위해 제출한다.
표준은 GM-CSF, IFN-g, IFN-a, IFN-B IL-1a, IL-1B, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-12(p40/p70), IL-17, IL-23, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP1a, TNFa, 및 VEGF를 포함한 사이토카인의 신중한 정량화를 허용한다. 이들 사이토카인은 마우스 및 인간 기원의 샘플에서 평가된다. 박테리아 처리된 샘플에서 이들 사이토카인의 증가는 숙주로부터 단백질 및 사이토카인의 생산 증가를 나타낸다. 사이토카인을 방출하는 특정 세포 유형의 능력을 검사하는 이 분석법의 다른 변형은 분류 방법을 통해 이들 세포를 획득함으로써 평가되며, 당업자에게 인지된다. 또한, 사이토카인 mRNA는 또한 pmEV 조성에 대한 반응으로 사이토카인 방출을 처리하기 위해 평가된다. 숙주 세포의 이러한 변화는 암 미세 환경에서 생체 내 반응과 유사하게 면역 반응을 자극한다.
이 CD8+ T 세포 자극 프로토콜은 면역 자극 잠재력을 최대화하기 위해 정제된 pmEV 및 살아있는 박테리아 균주의 조합을 사용하여 반복될 수 있다.
실시예 14: PBMC에 의한 향상된 종양 세포 사멸에 대한 pmEV의 시험관내 선별
PBMC를 자극하여 결과적으로 CD8+ T 세포를 활성화시켜 종양 세포를 사멸시키는 능력에 대해 pmEV를 선별하는 데 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, PBMC는 마우스 또는 인간 혈액에 대한 ficoll-paque 구배 원심분리에 의해, 또는 마우스 혈액으로부터 림프액 세포 분리 배지(Cedarlane Labs, Ontario, Canada)를 사용하여 건강한 인간 공여자로부터 헤파린처리된 정맥혈로부터 단리된다. PBMC는 단일-균주 pmEV, pmEV 혼합물 및 적절한 대조군과 함께 인큐베이션한다. 또한, CD8+ T 세포는 인간 PBMC 또는 마우스 비장에서 얻는다. pmEV와 함께 PBMC를 24시간 인큐베이션한 후, PBS 세척을 사용하여 pmEV를 세포에서 제거한다. 항생제가 포함된 신선한 배지 100 μl를 각 웰에 첨가한다. 적절한 수의 T 세포(예를 들어, 200,000개 T 세포)를 96웰 플레이트의 각 실험 웰에 첨가한다. 항-CD3 항체는 2 μg/ml의 최종 농도로 첨가한다. 그런 다음 공동 배양물은 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시킨다.
예를 들어, 공동 배양 인큐베이션 72시간 후에 50,000개의 종양 세포/웰을 새로운 96-웰 플레이트에 웰당 플레이팅한다. 사용된 마우스 종양 세포주는 B16.F10, SIY+ B16.F10 및 기타를 포함한다. 인간 종양 세포주는 공여자와 HLA-매칭되며, PANC-1, UNKPC960/961, UNKC, 및 HELA 세포주를 포함할 수 있다. 96-시간의 공동 배양 완료 후, 100 μl의 CD8+ T 세포 및 PBMC 혼합물을 종양 세포를 함유하는 웰로 옮긴다. 플레이트를 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 스타우로스파우린은 세포 사멸을 설명하기 위한 음성 대조군으로 사용된다.
이 인큐베이션 후, 유세포 분석을 사용하여 종양 세포 사멸을 측정하고 면역 세포 표현형을 특성화한다. 간단히 말해서, 종양 세포가 생존 염료로 염색된다. FACS 분석은 종양 세포를 특이적으로 게이트하여 죽은(사멸된) 종양 세포의 백분율을 측정하는 데 사용한다. 데이터는 또한 웰당 죽은 종양 세포의 절대 수로 표시된다. 세포독성 CD8+ T 세포 표현형은 하기 방법에 의해 특징지어질 수 있다: a) 하기 기재된 바와 같은 배양 상청액에서 상청액 그랜자임 B, IFNγ 및 TNFa의 농도, b) DC69, CD25, CD154, PD-1, 감마/델타 TCR, Foxp3, T-bet, 그랜자임 B와 같은 활성화 마커의 CD8+ T 세포 표면 발현, c) CD8+ T 세포에서 IFNγ, 그랜자임 B, TNFa의 세포내 사이토카인 염색. CD4+ T 세포 표현형은 INFγ, TNFα, IL-12, IL-4, IL-5, IL-17, IL-10, 케모카인 등을 포함하는 상청액 사이토카인 농도 외에 세포내 사이토카인 염색으로 평가할 수도 있다.
CD8+ T 세포 활성화의 추가 측정으로서, T 세포를 DC와 함께 96시간 인큐베이션한 후 웰에서 배양 상청액 100 μl를 제거하고 멀티플렉스 루미넥스 맥픽스(Luminex Magpix) 키트(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 분비된 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자에 대해 분석한다. 간단히 말해서, 웰은 완충액으로 미리 적시고, 1x 항체-코팅 자성 비드 25 μl를 첨가하고, 자석을 사용하여 모든 웰에서 2x 200 μl의 세척 완충액을 수행한다. 50 μl의 인큐베이션 완충액, 50 μl의 희석제 및 50 μl의 샘플을 첨가하고, 암실 상온에서 2시간 동안 진탕하여 혼합한다. 그런 다음 비드를 200 μl 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 1X 비오틴화된 검출기 항체 100 μl를 첨가하고, 현탁액을 암실에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 2개의 200 μl 세척액을 세척 완충액으로 수행한다. 100 μl의 1x SAV-RPE 시약을 각 웰에 첨가하고, 암실에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3회 200 μl 세척이 수행되고, 125 μl의 세척 완충액이 2~3분 진탕 발생과 함께 첨가된다. 그런 다음, 웰을 Luminex xMAP 시스템에서 분석을 위해 제출한다.
표준은 GM-CSF, IFN-g, IFN-a, IFN-B IL-1a, IL-1B, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-12(p40/p70), IL-17, IL-23, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP1a, TNFa, 및 VEGF를 포함한 사이토카인의 신중한 정량화를 가능하게 한다. 이들 사이토카인은 마우스 및 인간 기원의 샘플에서 평가된다. 박테리아 처리된 샘플에서 이들 사이토카인의 증가는 숙주로부터 단백질 및 사이토카인의 생산 증가를 나타낸다. 사이토카인을 방출하는 특정 세포 유형의 능력을 검사하는 이 분석법의 다른 변형은 분류 방법을 통해 이들 세포를 획득함으로써 평가되며, 당업자에게 인지된다. 또한, 사이토카인 mRNA는 또한 pmEV 조성에 대한 반응으로 사이토카인 방출을 처리하기 위해 평가된다. 숙주 세포의 이러한 변화는 암 미세 환경에서 생체 내 반응과 유사하게 면역 반응을 자극한다.
이 PBMC 자극 프로토콜은 면역 자극 잠재력을 최대화하기 위해 살아있는, 죽은 또는 비활성화/약화된 박테리아 균주의 조합이 있거나 없는 정제된 pmEV의 조합을 사용하여 반복될 수 있다.
실시예 15: 항원-제시 세포에서 pmEV의 시험관내 검출
고유판의 수지상 세포는 장 상피를 가로질러 수상돌기를 확장하여 장 내강의 살아있는 박테리아, 죽은 박테리아 및 미생물 산물을 지속적으로 샘플링하며, 이는 장 내강의 박테리아에 의해 생성된 pmEV가 수지상 세포를 직접 자극할 수 있는 한 가지 방법이다. 하기 방법은 항원-제시 세포에 의한 pmEV의 차등 흡수를 평가하는 방법을 나타낸다. 선택적으로, 이러한 방법은 환자에게 투여된 pmEV의 면역조절 거동을 평가하기 위해 적용될 수 있다.
수지상 세포(DC)는 표준 방법 또는 키트 프로토콜에 따라 인간 또는 마우스 골수, 혈액 또는 비장에서 단리된다(예를 들어, 문헌[Inaba K, Swiggard WJ, Steinman RM, Romani N, Schuler G, 2001. Isolation of dendritic cells. Current Protocols in Immunology. Chapter 3:Unit3.7]).
DC로의 pmEV 진입 및/또는 존재를 평가하기 위해, 완전한 RPMI-1640 배지의 원형 커버 슬립에 250,000개의 DC를 시딩한 다음, 단일 박테리아 균주로부터의 pmEV 또는 다양한 비율의 조합 pmEV와 함께 인큐베이션한다. 정제된 pmEV는 형광색소 또는 형광 단백질로 표지될 수 있다. 다양한 시점(예를 들어, 1시간, 2시간) 동안 인큐베이션한 후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 트립신을 사용하여 플레이트로부터 분리하였다. 세포는 그대로 유지되거나 용해된다. 그런 다음 샘플은 유세포 분석을 위해 처리된다. 총 내부화된 pmEV는 용해된 샘플에서 정량화되고, pmEV를 흡수하는 세포의 백분율은 형광 세포를 계산하여 측정된다. 위에서 설명된 방법은 DC 대신에 대식세포 또는 상피 세포주(ATCC에서 얻음)를 사용하여 실질적으로 동일한 방식으로 수행할 수도 있다.
실시예 16: 표적 세포와 함께 인큐베이션된 경우 NK 세포 사멸을 활성화하는 향상된 능력을 갖는 pmEV의 시험관내 스크리닝
종양 세포에 대한 강력한 NK 세포 세포독성을 유도하는 선택된 pmEV 조성물의 능력을 입증하기 위해, 다음 시험관내 분석을 사용한다. 간단히 말해서, 헤파린처리된 혈액으로부터의 단핵 세포는 건강한 인간 공여자로부터 얻는다. 선택적으로, NK 세포의 수를 증가시키는 확장 단계는 이전에 설명된 대로 수행된다(예를 들어, 문헌[Somanschi et al., J Vis Exp . 2011; (48):2540] 참조). 세포는 5% 인간 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 세포/ml의 농도로 조정될 수 있다. 그런 다음 PMNC 세포를 적절한 항체로 표지하고, NK 세포를 FACS를 통해 CD3-/CD56+ 세포로 단리하고 후속 세포독성 분석을 위해 준비한다. 대안적으로, NK 세포는 제조업체의 지침(Miltenyl Biotec)에 따라 autoMAC 기기 및 NK 세포 단리 키트를 사용하여 단리된다.
NK 세포를 계수하고, 웰당 20,000개 이상의 세포로 96웰 형식으로 플레이팅하고, 항원 제시 세포(예를 들어, 동일한 공여자로부터 유래된 단핵구), 박테리아 균주 혼합물로부터의 pmEV, 및 적절한 대조군을 추가하거나 추가하지 않고 단일-균주 pmEV와 함께 인큐베이션한다. pmEV와 함께 NK 세포를 5~24시간 인큐베이션한 후, PBS 세척으로 세포에서 pmEV를 제거하고, NK 세포를 항생제가 포함된 10 mL 신선한 배지에 재현탁하고, 20,000개 표적 종양 세포/웰을 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가한다. 사용된 마우스 종양 세포주는 B16.F10, SIY+ B16.F10 및 기타를 포함한다. 인간 종양 세포주는 공여자와 HLA-매칭되며, PANC-1, UNKPC960/961, UNKC, 및 HELA 세포주를 포함할 수 있다. 플레이트를 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 2~24시간 동안 인큐베이션한다. 스타우로스파우린은 세포 사멸을 설명하기 위한 음성 대조군으로 사용된다.
이 인큐베이션 후, 유세포 분석을 사용하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 종양 세포 사멸을 측정한다. 간단히 말해서, 종양 세포가 생존 염료로 염색된다. FACS 분석은 종양 세포를 특이적으로 게이트하여 죽은(사멸된) 종양 세포의 백분율을 측정하는 데 사용한다. 데이터는 또한 웰당 죽은 종양 세포의 절대 수로 표시된다.
이 NK 세포 자극 프로토콜은 면역 자극 잠재력을 최대화하기 위해 정제된 pmEV 및 살아있는 박테리아 균주의 조합을 사용하여 반복될 수 있다.
실시예 17: pmEV 조성물의 생체내 암 면역요법 효능을 예측하기 위한 시험관내 면역 활성화 분석의 사용
시험관내 면역 활성화 분석은 수지상 세포를 자극하여 결과적으로 CD8+ T 세포 사멸을 활성화할 수 있는 pmEV를 식별한다. 따라서, 위에서 설명한 시험관 내 분석은 잠재적인 면역요법 활성에 대한 많은 후보 pmEV의 예측 스크린으로 사용된다. 수지상 세포의 강화된 자극, CD8+ T 세포 사멸의 강화된 자극, PBMC 사멸의 강화된 자극 및/또는 NK 세포 사멸의 강화된 자극을 나타내는 pmEV는 생체내 암 면역요법 효능 연구를 위해 우선적으로 선택된다.
실시예 18: 마우스에 경구 전달될 때 pmEV의 생체 분포 측정
야생형 마우스(예를 들어, C57BL/6 또는 BALB/c)에 관심 pmEV 조성을 경구 접종하여 정제된 pmEV의 생체내 생체 분포 프로파일을 결정한다. pmEV는 다운스트림 분석을 돕기 위해 표지된다. 대안적으로, 종양-보유 마우스 또는 일부 면역 장애가 있는 마우스(예를 들어, 전신 홍반성 루푸스, 실험적 자가면역 뇌척수염, NASH)는 주어진 시간 경과에 따른 pmEV의 생체내 분포에 대해 연구될 수 있다.
마우스는 pmEV의 단일 용량(예를 들어, 25~100 μg) 또는 정의된 시간 경과에 걸쳐 여러 용량(25~100 μg)을 받을 수 있다. 대안적으로, pmEV 투여량은 입자 수(예를 들어, 7e+08 내지 6e+11 입자)를 기반으로 투여될 수 있다. 마우스는 승인된 프로토콜에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육된다. 대안적으로, 마우스는 무균, 세균-없는 조건에서 사육되고 유지될 수 있다. 혈액, 대변 및 기타 조직 샘플을 적절한 시점에 채취할 수 있다.
pmEV 조성물의 투여 후 다양한 시점(즉, 수시간 내지 수일)에 마우스를 인도적으로 희생시키고, 멸균 조건하에서 전체 부검을 수행한다. 표준 프로토콜에 따라 림프절, 부신, 간, 결장, 소장, 맹장, 위, 비장, 신장, 방광, 췌장, 심장, 피부, 폐, 뇌 및 기타 관심 조직을 채취하여 직접 사용하거나 추가 테스트를 위해 스냅 동결시켰다. 조직 샘플을 해부하고 균질화하여 당업자에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 단일-세포 현탁액을 제조한다. 샘플에 존재하는 pmEV의 수는 유세포 분석을 통해 정량화된다. 정량화는 또한 전체 마우스 조직의 적당한 처리 후 형광 현미경의 사용으로 진행될 수 있다(Vankelecom H., Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization, Cold Spring Harb . Protoc., 2009). 대안적으로, 동물은 pmEV 표지화 기술에 따라 라이브-이미징을 사용하여 분석할 수 있다.
생체 분포는 CT-26 및 B16과 같지만 이에 한정되지 않는 암 마우스 모델(예를 들어, 문헌[Kim et al., Nature Communications vol. 8, no. 626(2017)] 참조) 또는 EAE 및 DTH와 같지만 이에 한정되지 않는 자가면역(예를 들어, 문헌[Turjeman et al., PLoS One 10(7): e0130442(20105)] 참조)에서 수행될 수 있다.
실시예 19: 박테리아로부터의 분비된 미생물 세포외 소포( smEV )의 정제 및 제조
정제
분비된 미생물 세포외 소포(smEV)는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 박테리아 배양물(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2로부터의 박테리아)로부터 정제 및 제조된다(문헌[S. Bin Park, et al. PLoS ONE. 6(3):e17629 (2011)]).
예를 들어, 박테리아 배양물을 4℃ 또는 실온에서 10~40분 동안 10,000~15,500 xg에서 원심분리하여 박테리아를 펠릿화한다. 그런 다음 배양 상청액은 0.22 μm 이하의 물질을 포함하고(예를 들어, 0.22 μm 또는 0.45 μm 필터를 통해), 온전한 박테리아 세포를 배제하도록 여과된다. 그 여과된 상청액은 황산암모늄 침전, 초원심분리 또는 여과를 포함할 수 있지만 이들로 한정되지 않는 방법을 사용하여 농축한다. 간단히 말해서, 암모늄 설페이트 침전의 경우 1.5~3 M 암모늄 설페이트를 4℃에서 교반하면서 여과된 상청액에 천천히 첨가한다. 침전물은 4℃에서 8~48시간 동안 인큐베이션한 다음 4℃에서 20~40분 동안 11,000 x g에서 원심분리한다. 펠릿에는 smEV 및 기타 잔해가 함유되어 있다. 간단히 말해서, 초원심분리를 사용하여, 여과된 상청액을 4℃에서 1~16시간 동안 100,000~200,000 x g에서 원심분리한다. 이 원심분리의 펠릿에는 smEV 및 기타 잔해가 함유되어 있다. 간단히 말해서, 여과 기술을 사용하거나, Amicon Ultra 스핀 필터를 사용하거나, 접선 흐름 여과를 사용하여 상청액을 여과하여 분자량이 > 50, 100, 300 또는 500 kDa인 종을 유지한다.
대안적으로, 제조업체의 지침에 따라, smEV는 생물반응기를 교대 접선 유동(ATF) 시스템(예를 들어, Repligen의 XCell ATF)에 연결함으로써 성장 동안 또는 성장 중 선택된 시점에서 연속적으로 박테리아 배양물로부터 수득된다. ATF 시스템은 생물 반응기에서 온전한 세포(>0.22 μm)를 유지하고, 더 작은 성분들(예를 들어, smEV, 유리 단백질)이 수집을 위해 필터를 통과할 수 있도록 한다. 예를 들어, 시스템은 0.22 μm 미만의 여과액이 100 kDa의 제2 필터를 통과하여 0.22 μm 내지 100 kDa의 smEV와 같은 종을 수집하고 100 kDa보다 작은 종을 다시 생물 반응기로 펌핑하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 시스템은 생물반응기의 배지가 배양물의 성장 동안 보충 및/또는 변형되도록 구성될 수 있다. 이 방법에 의해 수집된 smEV는 여과된 상청액에 대해 위에서 설명한 바와 같이 초원심분리 또는 여과에 의해 추가로 정제 및/또는 농축될 수 있다.
상기 기재된 방법에 의해 얻은 smEV는 수크로스 구배 또는 Optiprep 구배의 사용을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 방법을 사용하여, 구배 초원심분리에 의해 추가로 정제될 수 있다. 간단히 말해서, 수크로스 구배 방법을 사용하여, 황산암모늄 침전 또는 초원심분리를 사용하여 여과된 상청액을 농축하는 경우, 펠릿을 60% 수크로스, 30 mM Tris, pH 8.0에 재현탁한다. 여과된 상청액을 여과를 사용하여 농축하는 경우, Amicon Ultra 컬럼을 사용하여 농축액을 60% 수크로스, 30 mM Tris, pH 8.0으로 완충액 교환한다. 샘플을 35~60% 불연속 수크로스 구배에 적용하고 4℃에서 3~24시간 동안 200,000 x g로 원심분리한다. 간략히 설명하면, 여과된 상청액을 황산암모늄 침전 또는 초원심분리를 사용하여 농축하는 경우, Optiprep 구배 방법을 사용하여, 펠릿을 PBS 중 45% Optiprep에 재현탁한다. 여과를 사용하여 여과된 상청액을 농축하는 경우, 농축물은 60% Optiprep을 사용하여 45% Optiprep의 최종 농도로 희석된다. 샘플을 0~45% 불연속 수크로스 구배에 적용하고 4℃에서 3~24시간 동안 200,000 x g에서 원심분리한다. 대안적으로, 고해상도 밀도 구배 분류를 사용하여 밀도를 기반으로 smEV를 분리할 수 있다.
제조
smEV 제제의 무균 및 단리를 확인하기 위해, smEV는 시험되는 박테리아의 일상적인 배양에 사용되는 한천 배지 상에 연속적으로 희석되고, 일상적인 조건을 사용하여 인큐베이션된다. 비멸균 제제는 0.22 μm 필터를 통과하여 온전한 세포를 배제할 수 있다. 순도를 더욱 높이기 위해 단리된 smEV를 DNase 또는 단백질효소 K로 처리할 수 있다.
대안적으로, 생체내 주사에 사용되는 smEV의 제조를 위해, 정제된 smEV가 이전에 기재된 바와 같이 처리된다(문헌[G. Norheim, et al. PLoS ONE. 10(9): e0134353 (2015)]). 간략히 설명하면, 수크로스 구배 원심분리 후, smEV를 함유하는 밴드를 3% 수크로스를 함유하는 용액 또는 당업자에게 알려진 생체내 주사에 적합한 다른 용액 중에 50 μg/mL의 최종 농도로 재현탁한다. 이 용액은 또한 보조제, 예를 들어 0~0.5%(w/v) 농도의 수산화알루미늄을 함유할 수 있다.
샘플을 추가 시험과 양립가능하게 만들기 위해(예를 들어, TEM 영상화 또는 시험관내 분석 전에 수크로스를 제거하기 위해), 샘플을 여과(예를 들어, Amicon Ultra 컬럼), 투석 또는 초원심분리(PBS에서 15배 이상 희석, 200,000 x g, 1~3시간, 4℃) 및 PBS에서의 재현탁을 사용하여 PBS 또는 30 mM Tris, pH 8.0으로 완충제 교환한다.
이러한 모든 연구의 경우, smEV를 투여 전에 가열, 조사 및/또는 동결건조시킬 수 있다(실시예 49에 기재된 바와 같음).
실시예 20: 다양한 양의 smEV를 생산하고/하거나 smEV의 함량을 변화시키기 위해 스트레스를 통해 박테리아를 조작
스트레스, 특히 외피 스트레스는 일부 박테리아 균주에 의한 smEV의 생산을 증가시키는 것으로 나타났다(문헌[I. MacDonald, M. Kuehn. J Bacteriol 195(13): doi: 10/1128/JB.02267-12). 박테리아에 의한 smEV의 생산을 다양화하기 위해, 박테리아는 다양한 방법을 사용하여 스트레스를 받는다.
박테리아는 단일 스트레스 요인 또는 조합된 스트레스 요인에 노출될 수 있다. 다른 박테리아에 대한 다양한 스트레스 요인의 영향은 스트레스 조건을 변화시키고 IC50 값(세포 성장을 50% 억제하는 데 필요한 조건)을 결정함으로써 경험적으로 결정된다. smEV 정제, 정량화 및 특성화가 발생한다. smEV 생산은 (1) 나노입자 추적 분석(NTA) 또는 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 박테리아 및 smEV의 복합체 샘플에서 정량화되거나; (2) NTA, 지질 정량 또는 단백질 정량화에 의한 smEV 정제 후 정량화된다. smEV 함량은 위에서 설명한 방법으로 정제한 후 평가한다.
항생제 스트레스
박테리아는 치사량 이하의 농도의 항생제가 첨가된 표준 성장 조건 하에 배양한다. 여기에는 0.1~1 μg/mL 클로람페니콜 또는 0.1~0.3 μg/mL 겐타마이신 또는 유사한 농도의 다른 항생제(예를 들어, 암피실린, 폴리믹신 B)가 포함될 수 있다. 라이소자임, 디펜신 및 Reg 단백질과 같은 숙주 항균 생성물을 항생제 대신 사용할 수 있다. 박테리오신(bacteriocin)과 마이크로신(microcin)을 포함하여 세균으로-생산된 항균 펩타이드도 사용할 수 있다.
온도 스트레스
박테리아는 표준 성장 조건하에서 배양되지만, 성장을 위한 전형적인 온도보다 높거나 낮은 온도에서 배양한다. 대안적으로, 표준 조건에서 박테리아를 성장시킨 다음, 저온 또는 고온에서 각각 짧은 시간 동안 인큐베이션하여 저온 충격 또는 열 충격을 가한다. 예를 들어, 37℃에서 성장한 박테리아는 저온 쇼크의 경우 4℃~18℃, 열 쇼크의 경우 42℃~50℃에서 1시간 동안 인큐베이션된다.
굶주림 및 영양 제한
영양 스트레스를 유도하기 위해, 박테리아를 하나 이상의 영양소가 제한된 조건에서 배양한다. 박테리아는 성장하는 동안 영양 스트레스를 받거나 풍부한 배지에서 불량 배지로 이동할 수 있다. 제한된 배지 성분들의 몇 가지 예는 탄소, 질소, 철 및 황이다. 배지의 예는 유일한 탄소원으로 낮은 포도당을 함유하는 M9 최소 배지(Sigma-Aldrich)이다. 배지 성분은 또한 EDTA 및 데페록사민과 같은 킬레이트제의 첨가에 의해 조작된다.
포화
박테리아는 포화 상태로 성장하고 다양한 기간 동안 포화점을 지나 인큐베이션된다. 대안적으로, 컨디셔닝된 배지는 기하급수적 성장 동안 포화 환경을 모방하는 데 사용된다. 컨디셔닝된 배지는 원심분리 및 여과에 의해 포화된 배양물로부터 온전한 세포를 제거함으로써 제조되며, 컨디셔닝된 배지는 특정 성분을 농축하거나 제거하기 위해 추가 처리될 수 있다.
염분 스트레스
박테리아는 NaCl, 담즙염 또는 기타 염을 함유하는 배지에서 배양되거나 짧은 기간 동안 노출된다.
UV 스트레스
UV 스트레스는 UV 램프 아래에서 박테리아를 배양하거나, Stratalinker(Agilent)와 같은 기기를 사용하여 박테리아를 UV에 노출시킴으로써 달성된다. UV는 전체 배양 기간 동안, 단기간에 또는 성장 후 단일 정의된 기간 동안 투여될 수 있다.
반응성 산소 스트레스
박테리아는 활성 산소 종의 형태로 스트레스를 유발하기 위해 치사량 이하의 농도의 과산화수소(250~1,000 μM)의 존재 하에 배양된다. 혐기성 박테리아는 이들에게 독성인 농도의 산소에서 배양되거나 여기에 노출된다.
세제 스트레스
박테리아는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 또는 데옥시콜레이트와 같은 세제에서 배양되거나 세제에 노출된다.
pH 스트레스
박테리아는 다양한 pH의 배지에서 배양되거나 제한된 시간 동안 노출된다.
실시예 21: smEV -없는 박테리아의 제조
최소량의 smEV를 함유하는 박테리아 샘플을 준비한다. smEV 생산은 (1) NTA 또는 TEM에 의해 박테리아 및 세포외 성분의 복합체 샘플에서 정량화되거나; (2) NTA, 지질 정량화 또는 단백질 정량화에 의해 박테리아 샘플에서 smEV 정제 후 정량화된다.
a. 원심분리 및 세척: 박테리아 배양물을 11,000 x g에서 원심분리하여, 상청액(유리 단백질 및 소포 포함)으로부터 온전한 세포를 분리한다. 펠릿을 PBS와 같은 완충액으로 세척하고, 안정적인 방법으로 보관한다(예를 들어, 글리세롤과 혼합, 급속 냉동, -80℃에서 보관).
b. ATF: 박테리아와 smEV는 생물 반응기를 ATF 시스템에 연결하여 분리된다. smEV-없는 박테리아는 생물반응기 내에 유지되며, 위에서 설명한 대로 원심분리 및 세척에 의해 잔류 smEV에서 추가로 분리될 수 있다.
c. 박테리아는 smEV 생산을 제한하는 것으로 확인된 조건에서 성장한다. 조건은 변경될 수 있다.
실시예 22: 결장직장암 모델
종양 모델에서 pmEV의 효능을 연구하기 위해, 당업계에 공지된 설치류 종양 모델에 따라 많은 암 세포주 중 하나를 사용할 수 있다.
예를 들어, 암컷 6~8주령 Balb/c 마우스는 Taconic(Germantown, NY) 또는 기타 공급업체로부터 입수한다. 100,000 CT-26 결장직장 종양 세포(ATCC CRL-2638)를 멸균 PBS에 재현탁하고, 50% Matrigel의 존재하에 접종한다. CT-26 종양 세포를 각 마우스의 뒷 옆구리에 피하 주사한다. 종양 부피가 평균 100 mm3에 도달할 때(종양 세포 접종 후 대략 10~12일), 동물을 다양한 치료 그룹(예를 들어, 비히클, smEV, 항-PD-1 항체 포함 또는 포함하지 않음)으로 분류한다. 항체는 총 3회로, 1일차부터 시작하여 4일마다(Q4Dx3) 200 μg/마우스(100 μl 최종 부피)로 복강 내(ip) 투여하고, smEV는 다양한 용량 및 다양한 시간으로 경구 또는 정맥내 투여한다. 예를 들어, smEV(5 μg)는 총 4회로, 1일째부터 시작하여 3일마다(Q3Dx4) 정맥내(i.v.) 주사되고, 마우스는 종양 성장에 대해 평가된다. 일부 마우스에는 10, 15 또는 20 μg smEV/마우스로 smEV를 정맥 주사할 수 있다. 다른 마우스는 마우스당 25, 50 또는 100 mg의 smEV를 받을 수 있다. 대안적으로, 일부 마우스는 용량당 7.0e+09 ~ 3.0e+12 smEV 입자를 받는다.
대안적으로, 종양 부피가 평균 100 mm3에 도달할 때(종양 세포 접종 후 대략 10~12일), 동물을 하기 그룹으로 분류한다: 1) 비히클; 2) smEV; 및 3) 항-PD-1 항체. 항체는 1일째부터 시작하여 4일마다 200 ug/마우스(100 μl 최종 부피)로 복강내(i.p.) 투여하고, smEV는 연구 1일째부터 시작하여 연구 종료까지 매일 복강내(i.p.) 투여한다.
종양 부피가 평균 100 mm3(종양 세포 접종 후 대략 10~12일)에 도달할 때, 동물을 하기 그룹으로 분배하였다: 1) 비히클; 2) 항-PD-1 항체; 및 3) smEV(7.0 e+10 입자 수). 항체는 1일째부터 시작하여 4일마다 200 μg/마우스(100 μl 최종 부피)로 복강내(i.p.) 투여하고, smEV는 연구 1일째부터 시작하여 연구 종료까지 매일 정맥내(i.v.) 투여하였고, 성장에 대해 종양을 측정하였다. 11일째에, smEV 그룹은 항-PD-1 그룹에서 관찰된 것보다 유의하게 더 나은 종양 성장 억제를 나타냈다. Welch의 검정이 치료 대 비히클에 대해 수행된다. smEV의 용량-반응을 조사한 연구에서 가장 높은 용량의 smEV가 가장 큰 효능을 나타냈지만, smEV를 사용한 연구에서는 더 높은 용량의 smEV가 반드시 더 큰 효능에 해당하는 것은 아니다.
실시예 23: 마우스 종양 모델을 치료하기 위한 smEV 조성물 투여
실시예 17에 기재된 바와 같이 종양 세포주 또는 환자-유래 종양 샘플을 피하 주사하여 건강한 마우스에 이식함으로써 암 마우스 모델을 생성한다. 본원에 제공된 방법은 흑색종의 동소 모델로서 B16-F10 또는 B16-F10-SIY 세포, 췌장암의 동소 모델로서 Panc02 세포(Maletzki et al., 2008, Gut 57:483-491), 폐암의 동소 모델로서 LLC1 세포, 및 전립선암의 동소 모델로서 RM-1을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 여러 상이한 종양 세포주 중 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, B16-F10 모델에서 smEV의 효능을 연구하기 위한 방법이 본원에서 심층적으로 제공되지만, 이에 한정되지 않는다.
매우 높은 전이 빈도를 갖는 자발적 흑색종의 동계 마우스 모델을 사용하여 박테리아가 종양 성장 및 전이 확산을 감소시키는 능력을 테스트한다. 이 분석을 위해 선택된 smEV는 면역 세포 하위집합의 향상된 활성화를 표시하고 시험관 내에서 종양 세포의 향상된 사멸을 자극할 수 있는 조성물이다. 마우스 흑색종 세포주 B16-F10은 ATCC로부터 수득된다. 세포는 공기 중 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 10% 열-불활성화 소태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 단층으로 시험관 내에서 배양된다. 기하급수적으로 성장하는 종양 세포는 트립신 처리에 의해 수확하고, 차가운 1x PBS로 3회 세척하고, 5E6 세포/ml의 현탁액을 투여를 위해 준비한다. 암컷 C57BL/6 마우스를 이 실험에 사용한다. 마우스는 6~8주령이고, 체중은 약 16~20 g이다. 종양 발달을 위해, 각 마우스에 B16-F10 세포 현탁액 100 μl를 옆구리에 SC 주사하였다. 마우스는 세포 이식 전에 케타민과 자일라진으로 마취한다. 실험에 사용된 동물에 카나마이신(0.4 mg/ml), 겐타마이신(0.035 mg/ml), 콜리스틴(850 U/ml), 메트로니다졸(0.215 mg/ml) 및 반코마이신(0.045 mg/ml)의 칵테일을 2일에서 5일까지 음용수에 점적하고, 종양 주사 후 7일에 클린다마이신(10 mg/kg)을 복강내 주사하여 항생제 치료를 시작할 수 있다.
원발성 옆구리 종양의 크기는 2~3일마다 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피는 하기 공식을 사용하여 계산한다: 종양 부피 = 종양 폭 Х 종양 길이 Х 0.5. 원발성 종양이 대략 100 mm3에 도달한 후, 동물을 체중을 기준으로 여러 그룹으로 분류한다. 그런 다음 마우스를 각 그룹에서 무작위로 선택하여 처리 그룹에 할당한다. smEV 조성물은 이전에 설명한 대로 준비한다. 마우스에 대략 7.0e+09 내지 3.0e+12 smEV 입자를 위관영양법으로 경구 접종한다. 대안적으로, smEV를 정맥내 주사한다. 마우스는 치료 기간 동안 매일, 매주, 격주, 매월, 격월로 또는 기타 임의의 투여 일정에 따라 smEV를 받는다. 마우스의 꼬리 정맥에 smEV를 IV 주사하거나, 종양에 직접 주사할 수 있다. 생 박테리아가 있거나 없는 smEV, 및/또는 불활성화/약화되거나 사멸된 박테리아가 있거나 없는 smEV를 마우스에 주사할 수 있다. 마우스는 매주 또는 한 달에 한 번 주사되거나 경구 위관영양을 공급받을 수 있다. 마우스는 종양-살해 잠재력을 최대화하기 위해 정제된 smEV와 살아있는 박테리아의 조합을 받을 수 있다. 모든 마우스는 승인된 프로토콜에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육된다. 종양 크기, 마우스 체중 및 체온은 3~4일마다 모니터링하고, B16-F10 마우스 흑색종 세포 주사 6주 후 또는 원발성 종양의 부피가 1000 mm3에 도달할 때 마우스를 인도적으로 희생시켰다. 매주 채혈을 하고, 프로토콜 종료 시 멸균 조건에서 전체 부검을 수행한다.
암세포는 멜라닌 생성으로 인해 마우스 B16-F10 흑색종 모델에서 쉽게 시각화될 수 있다. 표준 프로토콜에 따라, 목과 가슴 부위의 림프절 및 기관에서 조직 샘플을 수집하고, 다음 분류 규칙을 사용하여 미세 전이 및 거대 전이의 존재를 분석한다. 림프절 또는 기관당 최소 2개의 미세-전이성 병변과 1개의 거대-전이성 병변이 발견되면 기관은 전이에 대해 양성으로 분류된다. 미세-전이는 당업자에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린-에오신으로 파라핀-포매 림프 조직 절편을 염색함으로써 검출된다. 전체 전이 수는 원발성 종양의 부피와 상관관계가 있으며, 종양 부피는 종양 성장 시간 및 림프절 및 내장 기관의 거대-전이 및 미세-전이 수 및 관찰된 모든 전이의 합과 상관관계가 있다. 25개의 상이한 전이 부위가 이전에 기재된 바와 같이 확인되었다(문헌[Bobek V., et al., Syngeneic lymph-node-targeting model of green fluorescent protein-expressing Lewis lung carcinoma, Clin. Exp. Metastasis, 2004;21(8):705-8] 참조).
종양 조직 샘플을 종양 침윤 림프구에 대해 추가로 분석한다. CD8+ 세포독성 T 세포는 FACS에 의해 단리될 수 있으며, 그 다음 맞춤형 p/MHC 클래스 I 마이크로어레이를 사용하여 추가로 분석하여 그의 항원 특이성을 나타낼 수 있다(예를 들어, 문헌[Deviren G., et al., Detection of antigen-specific T cells on p/MHC microarrays, J. Mol. Recognit., 2007 Jan-Feb;20(1):32-8] 참조). CD4+ T 세포는 맞춤형 p/MHC 클래스 II 마이크로어레이를 사용하여 분석할 수 있다.
다양한 시점에서, 마우스를 희생시키고, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 생체외 유세포 분석을 위해 종양, 림프절 또는 다른 조직을 제거할 수 있다. 예를 들어, 종양을 제조업체의 지시에 따라 Miltenyi 종양 해리 효소 칵테일을 사용하여 해리한다. 종양 중량을 기록하고 종양을 잘게 자른 다음, 효소 칵테일을 함유하는 15ml 튜브에 넣고, 얼음 위에 놓는다. 이어서 샘플을 37℃에서 45분 동안 완만한 진탕기에 넣고, 최대 15 ml의 완전한 RPMI로 켄칭하였다. 각 세포 현탁액을 70 μm 필터를 통해 50 ml 팔콘 튜브에 넣고 1000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 세포를 FACS 완충액에 재현탁시키고, 세척하여 남아있는 잔해물을 제거한다. 필요한 경우 샘플을 두 번째 70 μm 필터를 통해 새 튜브로 다시 변형시킨다. 세포는 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 유세포 분석법에 의해 분석을 위해 염색된다. 염색 항체는 항-CD11c(수지상 세포), 항-CD80, 항-CD86, 항-CD40, 항-MHCII, 항-CD8a, 항-CD4, 및 항-CD103을 포함할 수 있다. 분석할 수 있는 다른 마커로는 범면역 세포 마커 CD45, T 세포 마커(CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, T-bet, Gata3, Rorγt, 그랜자임 B, CD69, PD-1, CTLA-4), 및 대식세포/골수성 마커(CD11b, MHCII, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1)가 포함된다. 면역표현형 외에도, TNFa, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL12p40, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP10, MIP1b, RANTES, 및 MCP-1을 포함하는(이에 한정되지 않음) 혈청 사이토카인이 분석될 수 있다. 사이토카인 분석은 림프절 또는 다른 조직으로부터 얻은 면역 세포, 및/또는 생체 외에서 얻은 정제된 CD45+ 종양-침윤된 면역 세포에서 수행될 수 있다. 최종적으로, 면역조직화학은 종양 섹션에서 수행되어, T 세포, 대식세포, 수지상세포 및 관문 분자 단백질 발현을 측정한다.
다발성 폐 흑색종 전이의 마우스 모델에서도 동일한 실험을 수행하였다. 마우스 흑색종 세포주 B16-BL6을 ATCC로부터 수득하고, 세포를 상기 기재된 바와 같이 시험관내 배양한다. 암컷 C57BL/6 마우스를 이 실험에 사용한다. 마우스는 6~8주령이고, 체중은 약 16~20 g이다. 종양 발달을 위해, 각 마우스에 B16-BL6 세포의 2E6 세포/ml 현탁액 100 μl를 꼬리 정맥에 주사하였다. IV 주입 시 생착되는 종양 세포는 결국 폐에 도달한다.
마우스는 9일 후에 인도적으로 살해된다. 폐의 중량을 측정하고 폐 표면에 폐 결절이 있는지 분석한다. 추출된 폐를 Fekete 용액으로 표백하는데, 종양 결절은 B16 세포의 멜라닌 때문에 표백되지 않지만, 결절의 작은 부분에는 멜라닌 색소가 없다(즉, 흰색). 종양 결절의 수는 마우스의 종양 부담을 결정하기 위해 신중하게 계산된다. 전형적으로, 200~250개의 폐 결절이 대조군 마우스의 폐에서 발견된다(즉, PBS 위관영양).
다양한 처리군에 대해 종양 부담 백분율을 계산한다. 백분율 종양 부담은 대조군 마우스의 폐 표면에 있는 평균 폐 결절 수로 나눈 처리 그룹에 속하는 마우스의 폐 표면에 있는 평균 폐 결절 수로 정의된다.
종양 생검 및 혈액 샘플은 LCMS 기술 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 통한 대사 분석을 위해 제출된다. 테스트 그룹 사이의 다른 대사산물 중에서 아미노산, 당, 젖산염의 차등 수준은 종양 대사 상태를 방해하는 미생물 조성물의 능력을 보여준다.
작용 메커니즘을 결정하기 위한 RNA 서열
수지상 세포는 종양, Peyers 패치 및 장간막 림프절에서 정제된다. RNAseq 분석은 당업자에게 공지된 표준 기술에 따라 수행 및 분석된다(문헌[Z. Hou. Scientific Reports. 5(9570):doi:10.1038/srep09570 (2015)]. 분석에서, TLR, CLR, NLR, 및 STING, 사이토카인, 케모카인, 항원 처리 및 제시 경로, 교차 제시, T 세포 공동 자극을 포함한 선천적 염증 경로 유전자에 특별한 주의를 기울인다.
일부 마우스는 희생시키는 대신 반대쪽 옆구리(또는 다른 영역)에 종양 세포 주입을 다시 시도하여 종양 성장에 대한 면역 체계의 기억 반응의 영향을 확인할 수 있다.
실시예 24: PD-1 또는 PD-L1 억제와 조합하여 마우스 종양 모델을 치료하기 위한 smEV 투여
PD-1 또는 PD-L1 억제와의 조합으로 종양 마우스 모델에서 smEV의 효능을 결정하기 위해 마우스 종양 모델을 위에서 설명한 바와 같이 사용할 수 있다.
smEV는 단독으로 또는 전체 박테리아 세포와 조합하여 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1과 함께 또는 없이 마우스 종양 모델에서의 효능에 대해 테스트된다. smEV, 박테리아 세포 및/또는 항-PD-1 또는 항-PD-L1은 다양한 시점과 다양한 용량으로 투여된다. 예를 들어, 종양 주입 후 10일째에 또는 종양 부피가 100 mm3에 도달한 후, 마우스를 smEV 단독으로 또는 항-PD-1 또는 항-PD-L1과 조합하여 처리한다.
마우스에 smEV를 경구, 정맥내 또는 종양내 투여할 수 있다. 예를 들어, 일부 마우스에 7.0e+09 내지 3.0e+12개 smEV 입자를 정맥 주사한다. 일부 마우스는 정맥내 주사를 통해 smEV를 받고, 다른 마우스는 복강내(i.p.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 비강 투여, 경구 위관영양 또는 기타 투여 수단을 통해 smEV를 받을 수 있다. 일부 마우스는 매일 smEV를 받을 수 있고(예를 들어, 1일차 시작), 다른 마우스는 다른 간격(예를 들어, 격일 또는 3일에 한 번)으로 smEV를 받을 수 있다. 마우스 그룹은 smEV 및 박테리아 세포의 혼합물을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여받을 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1:1(smEV:박테리아 세포) 내지 1~1x1012:1(smEV:박테리아 세포)의 비율로 smEV 입자 및 전체 박테리아를 포함할 수 있다.
대안적으로, 마우스의 일부 그룹은 smEV 투여와 별도로 또는 병행 투여로 1x104 내지 5x109개의 박테리아 세포를 투여받을 수 있다. smEV와 마찬가지로, 박테리아 세포 투여는 투여 경로, 용량 및 일정에 따라 달라질 수 있다. 박테리아 세포는 살아 있거나 죽었거나 약화되었을 수 있다. 박테리아 세포는 신선하게(또는 냉동) 수확하여 투여할 수 있으며, 또는 smEV를 투여하기 전에 방사선을 조사하거나 가열하여 죽일 수 있다.
일부 그룹의 마우스에도 유효량의 관문 억제제를 주사한다. 예를 들어, 마우스는 100 μg의 항-PD-L1 mAB(클론 10f.9g2, BioXCell) 또는 100 μl PBS 중 또 다른 항-PD-1 또는 항-PD-L1 mAB를 받고, 일부 마우스는 비히클 및/또는 기타 적절한 대조군(예를 들어, 대조군 항체)을 받는다. 마우스는 초기 주사 후 3, 6 및 9일에 mAb를 주사받는다. 관문 억제 및 smEV 면역요법이 부가적인 항종양 효과를 갖는지 여부를 평가하기 위해, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 mAb를 투여받는 대조군 마우스를 표준 대조군 패널에 포함시켰다. 1차(종양 크기) 및 2차(종양 침윤 림프구 및 사이토카인 분석) 평가변수를 평가하고, 일부 그룹의 마우스는 기억 반응에 대한 치료 효과를 평가하기 위해 후속 종양 세포 접종을 다시 시도할 수 있다.
실시예 25: 박테리아 smEV 표지화
smEV는 생체 내에서의 생체 분포를 추적하고 다양한 제제 및 포유동물 세포로 수행된 분석에서 세포 국소화를 정량화 및 추적하기 위해 표지될 수 있다. 예를 들어, smEV는 방사성 표지, 염료와 함께 인큐베이션, 형광 표지, 발광 표지 또는 금속 및 금속 동위원소를 함유하는 접합체로 표지될 수 있다.
예를 들어, smEV는 NHS-에스테르, 클릭-화학 기, 스트렙타비딘 또는 비오틴과 같은 작용기에 접합된 염료와 함께 인큐베이션될 수 있다. 표지 반응은 다양한 온도에서 몇 분 또는 몇 시간 동안, 교반 또는 회전을 수반 또는 수반하지 않고 발생할 수 있다. 그런 다음 프로토콜에 따라 소 혈청 알부민(BSA) 또는 유사 제제와 같은 시약을 추가하여 반응을 중단할 수 있으며, 한외 원심분리, 여과, 원심 여과, 컬럼 친화성 정제 또는 투석에 의해 유리 또는 결합되지 않은 염료 분자를 제거할 수 있다. 세척 완충액 및 와동 또는 교반을 포함하는 추가 세척 단계를 사용하여 유리 염료 분자를 완전히 제거할 수 있으며, 문헌[Su Chul Jang et al, Small. 11, No.4, 456-461(2017)]에 기재된 바와 같다.
형광 표지된 smEV는 공초점 현미경, 나노입자 추적 분석, 유세포 분석, 형광 활성화 세포 분류(FAC) 또는 Odyssey CLx LICOR와 같은 형광 이미징 시스템에 의해 세포 또는 기관, 또는 시험관내 및/또는 생체외 샘플에서 검출된다(예를 들어, 문헌[Wiklander et al. 2015. J. Extracellular Vesicles. 4:10.3402/Jev.v4.26316] 참조). 또한, H-I에서와 같이 IVIS 스펙트럼 CT(Perkin Elmer) 또는 Pearl Imager와 같은 기기를 사용하여 전체 동물 및/또는 해부된 장기 및 조직에서 형광 표지된 smEV를 검출한다(문헌[Choi, et al. Experimental & Molecular Medicine. 49: e330 (2017)]).
smEV는 위에 설명된 프로토콜을 사용하여 금속 및 금속의 동위원소를 함유하는 접합체로 표지될 수 있다. 금속-접합 smEV는 생체 내에서 동물에게 투여될 수 있다. 그런 다음 다양한 시점에서 장기에서 세포를 수확하고, 생체 외에서 분석할 수 있다. 대안적으로, 동물, 인간 또는 불멸화된 세포주로부터 유래된 세포는 시험관내에서 금속-표지된 smEV로 처리될 수 있고, 이후에 세포는 금속-접합 항체로 표지되고, Helios CyTOF(Fluidigm)와 같은 CyTOF(Cytometry by Time of Flight) 기기를 사용하여 표현형이 지정되거나, Hyperion Imaging System(Fluidigm)과 같은 영상 질량 세포측정 기기를 사용하여 이미지화 및 분석이 이루어질 수 있다. 또한, smEV는 smEV의 생체 분포를 추적하기 위해 방사성 동위원소로 표지될 수 있다(예를 들어, 문헌[Miller et al., Nanoscale. 2014 May 7;6(9):4928-35] 참조).
실시예 26: 정제된 박테리아 smEV를 시각화하기 위한 투과 전자 현미경
smEV는 박테리아 배치 배양물로부터 정제된다. 투과 전자 현미경(TEM)은 정제된 박테리아 smEV를 시각화하는 데 사용할 수 있다(문헌[S. Bin Park, et al. PLoS ONE. 6(3):e17629 (2011)]). smEV를 300 또는 400메쉬-크기의 탄소-코팅된 구리 그리드(Electron Microscopy Sciences, USA)에 2분 동안 장착하고, 탈이온수로 세척한다. smEV를 2%(w/v) 우라닐 아세테이트를 사용하여 20초 - 1분 동안 음성 염색한다. 구리 그리드를 멸균수로 세척하고, 건조한다. 100~120 kV 가속 전압의 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지를 획득한다. 염색된 smEV는 20~600 nm 사이의 직경을 나타내며, 전자 밀도가 높다. 각 그리드의 10~50 필드가 스크리닝된다.
실시예 27: smEV 조성 및 함량 프로파일링
smEV는 NanoSight 특성화, SDS-PAGE 겔 전기영동, 웨스턴 블롯, ELISA, 액체 크로마토그래피-질량 분석 및 질량 분석, 동적 광산란, 지질 수준, 총 단백질, 지질 대 단백질 비율, 핵산 분석 및/또는 제타 전위를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 방법 중 하나로 특성화될 수 있다.
smEV의 NanoSight 특성화
나노입자 추적 분석(NTA)은 정제된 smEV의 크기 분포를 특성화하는 데 사용된다. 정제된 smEV 제제는 NanoSight 기계(Malvern Instruments)에서 실행되어, smEV 크기 및 농도를 평가한다.
SDS-PAGE 겔 전기영동
정제된 smEV의 단백질 성분을 확인하기 위해, 샘플은 표준 기술을 사용하여 겔, 예를 들어 Bolt Bis-Tris Plus 4~12% 겔(Thermo-Fisher Scientific)에서 실행한다. 샘플을 1x SDS 샘플 완충액에서 10분 동안 끓이고, 4℃까지 냉각한 다음, 16,000 x g에서 1분 동안 원심분리한다. 그런 다음, 샘플을 SDS-PAGE 겔에서 실행하고, 밴드의 시각화를 위해 여러 표준 기술(예를 들어, 실버(Silver) 염색, 쿠마시 블루(Coomassie Blue), 겔 코드 블루(Gel Code Blue)) 중 하나를 사용하여 염색한다.
웨스턴 블롯 분석
정제된 smEV의 특정 단백질 성분을 확인하고 정량화하기 위해, smEV 단백질을 위에서 설명한 대로 SDS-PAGE로 분리하고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하고(문헌[Cvjetkovic et al., Sci. Rep. 6, 36338 (2016)]), ELISA를 통해 정량화한다.
smEV 단백질체학 및 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS) 및 질량분석법(MS)
smEV에 존재하는 단백질은 질량 분석 기술에 의해 확인되고 정량화된다. smEV 단백질은 Erickson et al, 2017(Molecular Cell, VOLUME 65, ISSUE 2, P361-370, JANUARY 19, 2017)에 설명된 대로 디티오트레이톨 용액(DTT)을 사용한 단백질 환원 및 LysC 및 트립신과 같은 효소를 사용한 단백질 분해를 포함한 표준 기술을 사용하여 LC-MS/MS용으로 준비할 수 있다. 대안적으로, 펩타이드는 Liu et al. 2010(문헌[JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2010, p. 2852-2860 Vol. 192, No. 11]), Kieselbach 및 Oscarsson 2017(문헌[Data Brief. 2017 Feb; 10: 426-431.]), Vildhede et al, 2018(문헌[Drug Metabolism and Disposition February 8, 2018])에 기재된 대로 제조한다. 분해 후, 펩타이드 제제는 단일 샘플 내에서 단백질 식별을 위해 액체 크로마토그래피 및 질량 분석 장치에서 직접 실행된다. 샘플 간 단백질의 상대적 정량화를 위해, 다른 샘플로부터의 펩타이드 분해물은 iTRAQ Reagent-8plex Multiplex 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA) 또는 TMT 10plex 및 11plex Label 시약(Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA, USA)을 사용하여 동위원소 태그로 표지된다. 각 펩타이드 분해물을 다른 동위원소 태그로 라벨링한 다음, 라벨링된 분해물을 하나의 샘플 혼합물로 조합한다. 결합된 펩타이드 혼합물은 식별 및 정량화 모두를 위해 LC-MS/MS에 의해 분석한다. LC-MS/MS 데이터를 사용하여 데이터베이스 검색을 수행하여, 표지된 펩타이드 및 해당 단백질을 식별한다. 동중 원소 라벨링의 경우, 부착된 태그의 단편화는 각 smEV에 존재하는 펩타이드 및 단백질의 상대적 정량을 얻는 데 사용되는 저분자량 리포터 이온을 생성한다.
추가로, 대사 함량은 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 확인된다. 다양한 샘플의 대사체 함량을 결정하기 위한 다양한 기술이 존재하며, 용매 추출, 크로마토그래피 분리 및 질량 측정에 결합된 다양한 이온화 기술을 포함한다(문헌[Roberts et al 2012 Targeted Metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. 30: 1-24]; [Dettmer et al 2007, Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26(1):51-78]). 비제한적 예로서, LC-MS 시스템에는 1100 시리즈 펌프(Agilent) 및 HTS PAL 오토샘플러(Leap Technologies)와 결합된 4000 QTRAP 삼중 사중극자 질량 분석기(AB SCIEX)가 포함된다. 배지 샘플 또는 기타 복합성 대사 혼합물(약 10 μL)은 안정 동위원소-표지 내부 표준(발린-d8, Isotec; 및 페닐알라닌-d8, Cambridge Isotope Laboratories)을 포함하는 74.9:24.9:0.2(v/v/v) 아세토니트릴/메탄올/포름산의 9개 부피를 사용하여 추출한다. 표준은 관심 대사 산물에 따라 조정되거나 변형될 수 있다. 샘플을 원심분리(10분, 9,000 x g, 4℃)하고, 상청액 용액을 HILIC 컬럼(150 Х 2.1 mm, 3 μm 입자 크기)에 주입하여 상청액(10 μL)을 LCMS에 보낸다. 5% 이동상[10 mM 포름산 암모늄, 물 중 0.1% 포름산]을 1분 동안 250 μL/분의 속도로 흐르게 한 다음, 10분에 걸쳐 선형 구배를 40% 이동상의 용액[0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴]으로 흐르게 하여 컬럼을 용리한다. 이온 스프레이 전압은 4.5 kV로 설정되고, 공급 온도는 450℃이다.
질량 스펙트럼 피크 통합을 위해 AB SCIEX의 Multiquant 1.2와 같은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 관심 피크를 수동으로 선별하고 표준과 비교하여, 피크의 정체를 확인해야 한다. 박테리아 컨디셔닝 후 및 종양 세포 성장 후, 적절한 표준을 사용한 정량화가 수행되어 초기 배지에 존재하는 대사 산물의 수를 결정한다. 피크 식별을 위해 NIST 데이터베이스와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 대사물 데이터베이스를 사용하여 비표적 대사체학 접근법이 사용될 수도 있다.
동적 광산란(DLS)
DynaPro NanoStar(Wyatt Technology) 및 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)와 같은 기기를 사용하여 다양한 smEV 제제에서 다양한 크기의 입자 분포를 포함하는 DLS 측정을 수행한다.
지질 수준
지질 수준은 FM4-64(Life Technologies)를 사용하여, 문헌[A.J. McBroom et al. J Bacteriol 188:5385-5392] 및 [A. Frias, et al. Microb Ecol . 59:476-486 (2010)]에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 정량화된다. 샘플을 FM4-64 (암실에서 37℃에서 10분간 PBS에서 3.3 μg/mL)와 함께 인큐베이션한다. 515 nm에서의 여기 후, Spectramax M5 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 635 nm에서의 방출을 측정한다. 절대 농도는 알려지지 않은 샘플을 알려진 농도의 표준(예컨대 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG) 소포)과 비교하여 결정된다. 지질학은 smEV에 존재하는 지질을 식별하는 데 사용할 수 있다.
총 단백질
단백질 수준은 Bradford 및 BCA 분석과 같은 표준 분석에 의해 정량화된다. Bradford 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 Quick Start Bradford 1x 염료 시약(Bio-Rad)을 사용하여 실행된다. BCA 분석은 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo-Fisher Scientific)를 사용하여 실행된다. 절대 농도는 알려진 농도의 BSA로부터 생성된 표준 곡선과 비교하여 결정된다. 대안적으로, Nanodrop 분광광도계(Thermo-Fisher Scientific)에서 측정한 280 nm(A280)에서의 샘플 흡광도를 사용하여 Beer-Lambert 식을 사용하여 단백질 농도를 계산할 수 있다. 또한 단백질체학을 사용하여 샘플에서 단백질을 식별할 수 있다.
지질:단백질 비율
지질:단백질 비율은 지질 농도를 단백질 농도로 나눔으로써 산출된다. 이들은 각 제제의 유리 단백질과 비교하여 소포 순도의 측정치를 제공한다.
핵산 분석
핵산은 smEV로부터 추출되고, Qubit 형광계를 사용하여 정량화된다. 크기 분포는 BioAnalyzer를 사용하여 평가하고, 재료를 시퀀싱한다.
제타 전위
다양한 제제의 제타 전위는 Zetasizer ZS(Malvern Instruments)와 같은 기기를 사용하여 측정한다.
실시예 28: 수지상 세포의 강화된 활성화를 위한 smEV의 시험관내 선별
시험관 내 면역 반응은 예를 들어 암 미세환경에 대한 반응으로 생체 내에서 면역 반응이 유도되는 메커니즘을 시뮬레이션하는 것으로 생각된다. 간단히 말해서, PBMC는 Lymphoprep(Nycomed, Oslo, Norway)을 사용하여 구배 원심분리에 의해 건강한 공여자로부터의 헤파린 처리된 정맥혈로부터, 또는 자성 비드-기반 인간 혈액 수지상 세포 분리 키트(Miltenyi Biotech, Cambridge, MA)를 사용하여 마우스 비장 또는 골수로부터 단리된다. 항-인간 CD14 mAb를 사용하여, 단핵구를 Moflo로 정제하고 37℃에서 7일 동안 96웰 플레이트(Costar Corp)에서 5e5 세포/ml의 세포 밀도로 cRPMI에서 배양한다. 수지상 세포의 성숙을 위해 0.2 ng/mL IL-4 및 1000 U/ml GM-CSF로 배양물을 37℃에서 1주일 동안 자극한다. 대안적으로, 성숙은 1주일 동안 재조합 GM-CSF와 함께 인큐베이션하거나, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 달성된다. 마우스 DC는 비드 농축을 사용하여 비장에서 직접 수확되거나, 조혈 줄기 세포에서 분화될 수 있다. 간단히 말해서, 골수는 마우스의 대퇴골에서 얻을 수 있다. 세포가 회복되고 적혈구가 용해된다 줄기 세포는 4일 동안 20 ng/ml 마우스 GMCSF의 세포 배양 배지에서 배양된다. 20ng/ml 마우스 GM-CSF를 함유하는 추가 배지를 첨가한다. 6일째에, 배지 및 비-부착 세포를 제거하고, 20 ng/ml GMCSF를 함유하는 새로운 세포 배양 배지로 교체하였다. 20 ng/ml GM-CSF를 사용한 세포 배양 배지의 최종 첨가는 7일에 첨가된다. 10일째에, 비부착 세포를 수확하고, 밤새 세포 배양 플레이트에 접종하고 필요에 따라 자극한다. 그런 다음 수지상 세포를 항생제를 수반 또는 수반하지 않고 다양한 용량의 smEV로 처리한다. 예를 들어, 항생제와 함께 24시간 동안 25~75 μg/mL smEV. 테스트된 smEV 조성물은 단일 박테리아 종 또는 균주로부터의 smEV, 또는 1개 이상의 속, 1개 이상의 종, 또는 1개 이상의 균주(예를 들어, 한 종 내의 하나 이상의 균주)의 smEV 혼합물을 포함할 수 있다. PBS는 음성 대조군으로서 포함되며, LPS, 항-CD40 항체, 및/또는 smEV가 양성 대조군으로 사용된다. 배양 후 DC는 항 CD11b, CD11c, CD103, CD8a, CD40, CD80, CD83, CD86, MHCI 및 MHCII로 염색되고 유세포 분석으로 분석된다. 음성 대조군과 비교하여 CD40, CD80, CD83 및 CD86에서 유의하게 증가된 DC는 관련 박테리아 smEV 조성에 의해 활성화되는 것으로 간주된다. 이러한 실험은 최소 세 번 반복된다.
DC를 자극하는 smEV-활성화 상피 세포의 능력을 스크리닝하기 위해, DC와 함께 인큐베이션하기 전에 24시간 상피 세포 smEV 공동 배양물을 첨가하는 단계가 상기 프로토콜을 뒤따른다. 상피 세포는 smEV와 함께 인큐베이션 후 세척되고, 그런 다음 위와 같이 처리되기 전에 24시간 동안 smEV의 부재 하에 DC와 공동 배양된다. 상피 세포주는 Int407, HEL293, HT29, T84 및 CACO2를 포함할 수 있다.
DC 활성화의 추가 측정으로서, DC를 smEV 또는 smEV-처리된 상피 세포와 24시간 인큐베이션한 후 100 μl의 배양 상청액을 웰에서 제거하고, 멀티플렉스 루미넥스 맥픽스(Luminex Magpix) 키트(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 분비된 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자에 대해 분석한다. 간단히 말해서, 웰은 완충액으로 미리 적시고, 1x 항체-코팅 자성 비드 25 μl를 첨가하고, 자석을 사용하여 모든 웰에서 2x 200 μl의 세척 완충액을 수행한다. 50 μl의 인큐베이션 완충액, 50 μl의 희석제 및 50 μl의 샘플을 첨가하고, 암실 상온에서 2시간 동안 진탕하여 혼합한다. 그런 다음 비드를 200 μl 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 1X 비오틴화된 검출기 항체 100 μl를 첨가하고, 현탁액을 암실에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 2개의 200 μl 세척액을 세척 완충액으로 수행한다. 100 μl의 1x SAV-RPE 시약을 각 웰에 첨가하고, 암실에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3회 200 μl 세척이 수행되고, 125 μl의 세척 완충액이 2~3분 진탕 발생과 함께 첨가된다. 그런 다음, 웰을 Luminex xMAP 시스템에서 분석을 위해 제출한다.
표준은 GM-CSF, IFN-g, IFN-a, IFN-B, IL-1a, IL-1B, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-12(p40/p70), IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 IL-23, IL-25, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP1a, TNFa, 및 VEGF를 포함한 사이토카인의 신중한 정량화를 허용한다. 이들 사이토카인은 마우스 및 인간 기원의 샘플에서 평가된다. 박테리아 처리된 샘플에서 이들 사이토카인의 증가는 숙주로부터 단백질 및 사이토카인의 생산 증가를 나타낸다. 사이토카인을 방출하는 특정 세포 유형의 능력을 검사하는 이 분석법의 다른 변형은 분류 방법을 통해 이들 세포를 획득함으로써 평가되며, 당업자에게 인지된다. 또한, 사이토카인 mRNA는 또한 smEV 조성에 대한 반응으로 사이토카인 방출을 처리하기 위해 평가된다.
이 DC 자극 프로토콜은 면역 자극 잠재력을 최대화하기 위해 정제된 smEV 및 살아있는 박테리아 균주의 조합을 사용하여 반복될 수 있다.
실시예 29: 종양 세포와 함께 인큐베이션된 경우 CD8+ T 세포 사멸의 강화된 활성화를 위한 smEV의 시험관내 선별
종양 세포의 CD8+ T 세포 사멸을 활성화할 수 있는 smEV를 선별하기 위한 시험관내 방법이 기재되어 있다. 간단히 말해서, DC는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 인간 PBMC 또는 마우스 비장으로부터 단리되고, 단일-균주 smEV, smEV의 혼합물 및/또는 적절한 대조군과 함께 시험관내에서 인큐베이션된다. 또한, CD8+ T 세포는 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 자성 비드-기반 마우스 CD8a+ T 세포 분리 키트 및 자성 비드-기반 인간 CD8+ T 세포 단리 키트(둘다 Miltenyi Biotech, Cambridge, MA)를 사용하여 인간 PBMC 또는 마우스 비장으로부터 얻는다. 일정 시간 동안(예를 들어, 24시간 동안) smEV와 함께 DC를 인큐베이션하거나, smEV-자극된 상피 세포와 함께 DC를 인큐베이션한 후, PBS 세척을 사용하여 smEV를 세포 배양물에서 제거하고, 항생제가 포함된 100 μl의 신선한 배지를 각 웰에 추가하고, 200,000개의 T 세포를 96-웰 플레이트의 각 실험 웰에 추가한다. 항-CD3 항체는 2 μg/ml의 최종 농도로 첨가한다. 그런 다음 공동 배양물은 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시킨다.
예를 들어, 공동 배양 인큐베이션 약 72시간에, 종양 세포를 당업계에 공지된 기술을 사용하여 분석에 사용하기 위해 플레이팅한다. 예를 들어, 50,000개의 종양 세포/웰을 새로운 96-웰 플레이트에 웰당 플레이팅한다. 사용된 마우스 종양 세포주는 B16.F10, SIY+ B16.F10 및 기타를 포함할 수 있다. 인간 종양 세포주는 공여자와 HLA-매칭되며, PANC-1, UNKPC960/961, UNKC, 및 HELA 세포주를 포함할 수 있다. 96-시간의 공동 배양 완료 후, 100 μl의 CD8+ T 세포 및 DC 혼합물을 종양 세포를 함유하는 웰로 옮긴다. 플레이트를 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 스타우로스파우린은 세포 사멸을 설명하기 위한 음성 대조군으로 사용될 수 있다.
이 인큐베이션 후, 유세포 분석을 사용하여 종양 세포 사멸을 측정하고 면역 세포 표현형을 특성화한다. 간단히 말해서, 종양 세포가 생존 염료로 염색된다. FACS 분석은 종양 세포를 특이적으로 게이트하여 죽은(사멸된) 종양 세포의 백분율을 측정하는 데 사용한다. 데이터는 또한 웰당 죽은 종양 세포의 절대 수로 표시된다. 세포독성 CD8+ T 세포 표현형은 하기 방법에 의해 특징지어질 수 있다: a) 하기 기재된 바와 같은 배양 상청액에서 상청액 그랜자임 B, IFNγ 및 TNFa의 농도, b) DC69, CD25, CD154, PD-1, 감마/델타 TCR, Foxp3, T-bet, 그랜자임 B와 같은 활성화 마커의 CD8+ T 세포 표면 발현, c) CD8+ T 세포에서 IFNγ, 그랜자임 B, TNFa의 세포내 사이토카인 염색. CD4+ T 세포 표현형은 INFγ, TNFα, IL-12, IL-4, IL-5, IL-17, IL-10, 케모카인 등을 포함하는 상청액 사이토카인 농도 외에 세포내 사이토카인 염색으로 평가할 수도 있다.
CD8+ T 세포 활성화의 추가 측정으로서, T 세포를 DC와 함께 96시간 인큐베이션한 후 웰에서 배양 상청액 100 μl를 제거하고 멀티플렉스 루미넥스 맥픽스(Luminex Magpix) 키트(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 분비된 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자에 대해 분석한다. 간단히 말해서, 웰은 완충액으로 미리 적시고, 1x 항체-코팅 자성 비드 25 μl를 첨가하고, 자석을 사용하여 모든 웰에서 2x 200 μl의 세척 완충액을 수행한다. 50 μl의 인큐베이션 완충액, 50 μl의 희석제 및 50 μl의 샘플을 첨가하고, 암실 상온에서 2시간 동안 진탕하여 혼합한다. 그런 다음 비드를 200 μl 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 1X 비오틴화된 검출기 항체 100 μl를 첨가하고, 현탁액을 암실에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 2개의 200 μl 세척액을 세척 완충액으로 수행한다. 100 μl의 1x SAV-RPE 시약을 각 웰에 첨가하고, 암실에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3회 200 μl 세척이 수행되고, 125 μl의 세척 완충액이 2~3분 진탕 발생과 함께 첨가된다. 그런 다음, 웰을 Luminex xMAP 시스템에서 분석을 위해 제출한다.
표준은 GM-CSF, IFN-g, IFN-a, IFN-B IL-1a, IL-1B, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-12(p40/p70), IL-17, IL-23, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP1a, TNFa, 및 VEGF를 포함한 사이토카인의 신중한 정량화를 허용한다. 이들 사이토카인은 마우스 및 인간 기원의 샘플에서 평가된다. 박테리아 처리된 샘플에서 이들 사이토카인의 증가는 숙주로부터 단백질 및 사이토카인의 생산 증가를 나타낸다. 사이토카인을 방출하는 특정 세포 유형의 능력을 검사하는 이 분석법의 다른 변형은 분류 방법을 통해 이들 세포를 획득함으로써 평가되며, 당업자에게 인지된다. 또한, 사이토카인 mRNA는 또한 smEV 조성에 대한 반응으로 사이토카인 방출을 처리하기 위해 평가된다. 숙주 세포의 이러한 변화는 암 미세 환경에서 생체 내 반응과 유사하게 면역 반응을 자극한다.
이 CD8+ T 세포 자극 프로토콜은 면역 자극 잠재력을 최대화하기 위해 정제된 smEV 및 살아있는 박테리아 균주의 조합을 사용하여 반복될 수 있다.
실시예 30: PBMC에 의한 향상된 종양 세포 사멸에 대한 smEV의 시험관내 선별
PBMC를 자극하여 결과적으로 CD8+ T 세포를 활성화시켜 종양 세포를 사멸시키는 능력에 대해 smEV를 선별하는 데 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, PBMC는 마우스 또는 인간 혈액에 대한 ficoll-paque 구배 원심분리에 의해, 또는 마우스 혈액으로부터 림프액 세포 분리 배지(Cedarlane Labs, Ontario, Canada)를 사용하여 건강한 인간 공여자로부터 헤파린처리된 정맥혈로부터 단리된다. PBMC를 단일-균주 smEV, smEV 혼합물 및 적절한 대조군과 함께 인큐베이션한다. 또한, CD8+ T 세포는 인간 PBMC 또는 마우스 비장에서 얻는다. smEV와 함께 PBMC를 24시간 인큐베이션한 후, PBS 세척을 사용하여 smEV를 세포에서 제거한다. 항생제가 포함된 신선한 배지 100 ul를 각 웰에 첨가한다. 적절한 수의 T 세포(예를 들어, 200,000개 T 세포)를 96웰 플레이트의 각 실험 웰에 첨가한다. 항-CD3 항체를 2 μg/ml의 최종 농도로 첨가한다. 그런 다음 공동 배양물을 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시킨다.
예를 들어, 공동 배양 인큐베이션 72시간 후에 50,000개의 종양 세포/웰을 새로운 96-웰 플레이트에 웰당 플레이팅한다. 사용된 마우스 종양 세포주는 B16.F10, SIY+ B16.F10 및 기타를 포함한다. 인간 종양 세포주는 공여자와 HLA-매칭되며, PANC-1, UNKPC960/961, UNKC, 및 HELA 세포주를 포함할 수 있다. 96-시간의 공동 배양 완료 후, 100 μl의 CD8+ T 세포 및 PBMC 혼합물을 종양 세포를 함유하는 웰로 옮긴다. 플레이트를 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 스타우로스파우린은 세포 사멸을 설명하기 위한 음성 대조군으로 사용된다.
이 인큐베이션 후, 유세포 분석을 사용하여 종양 세포 사멸을 측정하고 면역 세포 표현형을 특성화한다. 간단히 말해서, 종양 세포가 생존 염료로 염색된다. FACS 분석은 종양 세포를 특이적으로 게이트하여 죽은(사멸된) 종양 세포의 백분율을 측정하는 데 사용한다. 데이터는 또한 웰당 죽은 종양 세포의 절대 수로 표시된다. 세포독성 CD8+ T 세포 표현형은 하기 방법에 의해 특징지어질 수 있다: a) 하기 기재된 바와 같은 배양 상청액에서 상청액 그랜자임 B, IFNγ 및 TNFa의 농도, b) DC69, CD25, CD154, PD-1, 감마/델타 TCR, Foxp3, T-bet, 그랜자임 B와 같은 활성화 마커의 CD8+ T 세포 표면 발현, c) CD8+ T 세포에서 IFNγ, 그랜자임 B, TNFa의 세포내 사이토카인 염색. CD4+ T 세포 표현형은 INFγ, TNFα, IL-12, IL-4, IL-5, IL-17, IL-10, 케모카인 등을 포함하는 상청액 사이토카인 농도 외에 세포내 사이토카인 염색으로 평가할 수도 있다.
CD8+ T 세포 활성화의 추가 측정으로서, T 세포를 DC와 함께 96시간 인큐베이션한 후 웰에서 배양 상청액 100 μl를 제거하고 멀티플렉스 루미넥스 맥픽스(Luminex Magpix) 키트(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 분비된 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자에 대해 분석한다. 간단히 말해서, 웰은 완충액으로 미리 적시고, 1x 항체-코팅 자성 비드 25 μl를 첨가하고, 자석을 사용하여 모든 웰에서 2x 200 μl의 세척 완충액을 수행한다. 50 μl의 인큐베이션 완충액, 50 μl의 희석제 및 50 μl의 샘플을 첨가하고, 암실 상온에서 2시간 동안 진탕하여 혼합한다. 그런 다음 비드를 200 μl 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 1X 비오틴화된 검출기 항체 100 μl를 첨가하고, 현탁액을 암실에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 2개의 200 μl 세척액을 세척 완충액으로 수행한다. 100 μl의 1x SAV-RPE 시약을 각 웰에 첨가하고, 암실에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3회 200 μl 세척이 수행되고, 125 μl의 세척 완충액이 2~3분 진탕 발생과 함께 첨가된다. 그런 다음, 웰을 Luminex xMAP 시스템에서 분석을 위해 제출한다.
표준은 GM-CSF, IFN-g, IFN-a, IFN-B IL-1a, IL-1B, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-12(p40/p70), IL-17, IL-23, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP1a, TNFa, 및 VEGF를 포함한 사이토카인의 신중한 정량화를 허용한다. 이들 사이토카인은 마우스 및 인간 기원의 샘플에서 평가된다. 박테리아 처리된 샘플에서 이들 사이토카인의 증가는 숙주로부터 단백질 및 사이토카인의 생산 증가를 나타낸다. 사이토카인을 방출하는 특정 세포 유형의 능력을 검사하는 이 분석법의 다른 변형은 분류 방법을 통해 이들 세포를 획득함으로써 평가되며, 당업자에게 인지된다. 또한, 사이토카인 mRNA는 또한 smEV 조성에 대한 반응으로 사이토카인 방출을 처리하기 위해 평가된다. 숙주 세포의 이러한 변화는 암 미세 환경에서 생체 내 반응과 유사하게 면역 반응을 자극한다.
이 PBMC 자극 프로토콜은 면역 자극 잠재력을 최대화하기 위해 살아있는, 죽은 또는 비활성화/약화된 박테리아 균주의 조합이 있거나 없는 정제된 smEV의 조합을 사용하여 반복될 수 있다.
실시예 31: 항원-제시 세포에서 smEV의 시험관내 검출
고유판의 수지상 세포는 장 상피를 가로질러 수상돌기를 확장하여 장 내강의 살아있는 박테리아, 죽은 박테리아 및 미생물 산물을 지속적으로 샘플링하며, 이는 장 내강의 박테리아에 의해 생성된 smEV가 수지상 세포를 직접 자극할 수 있는 한 가지 방법이다. 하기 방법은 항원-제시 세포에 의한 smEV의 차등 흡수를 평가하는 방법을 나타낸다. 선택적으로, 이러한 방법은 환자에게 투여된 smEV의 면역조절 거동을 평가하기 위해 적용될 수 있다.
수지상 세포(DC)는 표준 방법 또는 키트 프로토콜에 따라 인간 또는 마우스 골수, 혈액 또는 비장에서 단리된다(예를 들어, 문헌[Inaba K, Swiggard WJ, Steinman RM, Romani N, Schuler G, 2001. Isolation of dendritic cells. Current Protocols in Immunology. Chapter 3:Unit3.7]).
DC로의 smEV 진입 및/또는 존재를 평가하기 위해, 완전한 RPMI-1640 배지의 원형 커버 슬립에 250,000개의 DC를 시딩한 다음, 단일 박테리아 균주로부터의 smEV 또는 다양한 비율의 조합 smEV와 함께 인큐베이션한다. 정제된 smEV는 형광색소 또는 형광 단백질로 표지될 수 있다. 다양한 시점(예를 들어, 1시간, 2시간) 동안 인큐베이션한 후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 트립신을 사용하여 플레이트로부터 분리하였다. 세포는 그대로 유지되거나 용해된다. 그런 다음 샘플은 유세포 분석을 위해 처리된다. 총 내부화된 smEV는 용해된 샘플에서 정량화되고, smEV를 흡수하는 세포의 백분율은 형광 세포를 계산하여 측정된다. 위에서 설명된 방법은 DC 대신에 대식세포 또는 상피 세포주(ATCC에서 얻음)를 사용하여 실질적으로 동일한 방식으로 수행할 수도 있다.
실시예 32: 표적 세포와 함께 인큐베이션된 경우 NK 세포 사멸을 활성화하는 향상된 능력을 갖는 smEV의 시험관내 스크리닝
종양 세포에 대한 강력한 NK 세포 세포독성을 유도하는 선택된 smEV 조성물의 능력을 입증하기 위해, 다음 시험관내 분석을 사용한다. 간단히 말해서, 헤파린처리된 혈액으로부터의 단핵 세포는 건강한 인간 공여자로부터 얻는다. 선택적으로, NK 세포의 수를 증가시키는 확장 단계는 이전에 설명된 대로 수행된다(예를 들어, 문헌[Somanschi et al., J Vis Exp. 2011; (48):2540] 참조). 세포는 5% 인간 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 세포/ml의 농도로 조정될 수 있다. 그런 다음 PMNC 세포를 적절한 항체로 표지하고, NK 세포를 FACS를 통해 CD3-/CD56+ 세포로 단리하고 후속 세포독성 분석을 위해 준비한다. 대안적으로, NK 세포는 제조업체의 지침(Miltenyl Biotec)에 따라 autoMAC 기기 및 NK 세포 단리 키트를 사용하여 단리된다.
NK 세포를 계수하고, 웰당 20,000개 이상의 세포로 96웰 형식으로 플레이팅하고, 항원 제시 세포(예를 들어, 동일한 공여자로부터 유래된 단핵구), 박테리아 균주 혼합물로부터의 smEV, 및 적절한 대조군을 추가하거나 추가하지 않고 단일-균주 smEV와 함께 인큐베이션한다. smEV와 함께 NK 세포를 5~24시간 인큐베이션한 후, PBS 세척으로 세포에서 smEV를 제거하고, NK 세포를 항생제가 포함된 10 mL 신선한 배지에 재현탁하고, 20,000개 표적 종양 세포/웰을 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가한다. 사용된 마우스 종양 세포주는 B16.F10, SIY+ B16.F10 및 기타를 포함한다. 인간 종양 세포주는 공여자와 HLA-매칭되며, PANC-1, UNKPC960/961, UNKC, 및 HELA 세포주를 포함할 수 있다. 플레이트를 정상적인 산소 조건에서 37℃에서 2~24시간 동안 인큐베이션한다. 스타우로스파우린은 세포 사멸을 설명하기 위한 음성 대조군으로 사용된다.
이 인큐베이션 후, 유세포 분석을 사용하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 종양 세포 사멸을 측정한다. 간단히 말해서, 종양 세포가 생존 염료로 염색된다. FACS 분석은 종양 세포를 특이적으로 게이트하여 죽은(사멸된) 종양 세포의 백분율을 측정하는 데 사용한다. 데이터는 또한 웰당 죽은 종양 세포의 절대 수로 표시된다.
이 NK 세포 자극 프로토콜은 면역 자극 잠재력을 최대화하기 위해 정제된 smEV 및 살아있는 박테리아 균주의 조합을 사용하여 반복될 수 있다.
실시예 33: smEV 조성물의 생체내 암 면역요법 효능을 예측하기 위한 시험관내 면역 활성화 분석의 사용
시험관내 면역 활성화 분석은 수지상 세포를 자극하여 결과적으로 CD8+ T 세포 사멸을 활성화할 수 있는 smEV를 식별한다. 따라서, 위에서 설명한 시험관 내 분석은 잠재적인 면역요법 활성에 대한 많은 후보 smEV의 예측 스크린으로 사용된다. 수지상 세포의 강화된 자극, CD8+ T 세포 사멸의 강화된 자극, PBMC 사멸의 강화된 자극 및/또는 NK 세포 사멸의 강화된 자극을 나타내는 smEV는 생체내 암 면역요법 효능 연구를 위해 우선적으로 선택된다.
실시예 34: 마우스에 경구 전달될 때 smEV의 생체 분포 측정
야생형 마우스(예를 들어, C57BL/6 또는 BALB/c)에 관심 있는 smEV 조성을 경구 접종하여 정제된 smEV의 생체내 생체 분포 프로파일을 결정한다. smEV는 다운스트림 분석을 돕기 위해 표지된다. 대안적으로, 종양-보유 마우스 또는 일부 면역 장애가 있는 마우스(예를 들어, 전신 홍반성 루푸스, 실험적 자가면역 뇌척수염, NASH)는 주어진 시간 경과에 따른 smEV의 생체내 분포에 대해 연구될 수 있다.
마우스는 smEV의 단일 용량(예를 들어, 25~100 μg) 또는 정의된 시간 경과에 걸쳐 여러 용량(25~100 μg)을 받을 수 있다. 대안적으로, smEV 투여량은 입자 수(예를 들어, 7e+08 내지 6e+11 입자)를 기반으로 투여될 수 있다. 마우스는 승인된 프로토콜에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육된다. 대안적으로, 마우스는 무균, 세균-없는 조건에서 사육되고 유지될 수 있다. 혈액, 대변 및 기타 조직 샘플을 적절한 시점에 채취할 수 있다.
smEV 조성물의 투여 후 다양한 시점(즉, 수시간 내지 수일)에 마우스를 인도적으로 희생시키고, 멸균 조건하에서 전체 부검을 수행한다. 표준 프로토콜에 따라 림프절, 부신, 간, 결장, 소장, 맹장, 위, 비장, 신장, 방광, 췌장, 심장, 피부, 폐, 뇌 및 기타 관심 조직을 채취하여 직접 사용하거나 추가 테스트를 위해 스냅 동결시켰다. 조직 샘플을 해부하고 균질화하여 당업자에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 단일-세포 현탁액을 제조한다. 샘플에 존재하는 smEV의 수는 유세포 분석을 통해 정량화된다. 정량화는 또한 전체 마우스 조직의 적당한 처리 후 형광 현미경의 사용으로 진행될 수 있다(Vankelecom H., Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization, Cold Spring Harb . Protoc., 2009). 대안적으로, 동물은 smEV 표지화 기술에 따라 라이브-이미징을 사용하여 분석할 수 있다.
생체 분포는 CT-26 및 B16과 같지만 이에 한정되지 않는 암 마우스 모델(예를 들어, 문헌[Kim et al., Nature Communications vol. 8, no. 626(2017)] 참조) 또는 EAE 및 DTH와 같지만 이에 한정되지 않는 자가면역(예를 들어, 문헌[Turjeman et al., PLoS One 10(7): e0130442(20105)] 참조)에서 수행될 수 있다.
실시예 35: 제조 조건
시험관내 및 생체내 사용, 궁극적으로 pmEV 및 smEV 제제를 위해 박테리아를 성장시키고 준비하는 데 농축 배지를 사용한다. 예를 들어, 배지에는 당, 효모 추출물, 식물성 펩톤, 완충액, 염, 미량 원소, 계면활성제, 소포제 및 비타민이 함유될 수 있다. 효모 추출물 및 펩톤과 같은 복합 성분의 구성은 정의되지 않거나 부분적으로 정의될 수 있다(아미노산, 당 등의 대략적인 농도 포함). 미생물 대사는 탄소 및 질소와 같은 자원의 가용성에 따라 달라질 수 있다. 다양한 당 또는 기타 탄소원을 테스트할 수 있다. 대안적으로, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Saarela et al., J. Applied Microbiology. 2005. 99: 1330-1339]에 나타낸 바와 같이, 배지를 준비하고, 선택된 박테리아를 성장시켰다. 우유-기반 성분없이 생성된 선택된 박테리아의 동결-건조 생존, 저장 안정성 및 산 및 담즙 노출에 대한 세포 농축물의 발효시간, 동결방지제 및 중화의 영향.
대규모로, 배지를 멸균시킨다. 살균은 초고온(UHT) 처리에 의해 달성될 수 있다. UHT 처리는 매우 높은 온도에서 짧은 시간 동안 수행한다. UHT 범위는 135 내지 180℃일 수 있다. 예를 들어, 배지는 135℃에서 10 내지 30초간 멸균될 수 있다.
접종물은 플라스크 또는 더 작은 생물반응기에서 제조할 수 있으며, 성장을 모니터링한다. 예를 들어, 접종물 크기는 전체 생물반응기 부피의 대략 0.5 내지 3%일 수 있다. 적용 및 재료의 필요성에 따라, 생물반응기 부피는 적어도 2 L, 10 L, 80 L, 100 L, 250 L, 1000 L, 2500 L, 5000 L, 10,000 L일 수 있다.
접종 전에, 생물반응기는 원하는 pH, 온도 및 산소 농도의 배지로 제조된다. 배양 배지의 초기 pH는 공정 설정점과 다를 수 있다. 낮은 세포 농도에서 pH 스트레스가 해로울 수 있으며, 초기 pH는 pH 7.5 내지 공정 설정점 사이일 수 있다. 예를 들어, pH는 4.5 내지 8.0에서 설정될 수 있다. 발효 동안 pH는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 또는 수산화 암모늄의 사용을 통해 제어될 수 있다. 온도는 25℃ 내지 45℃, 예를 들어 37℃에서 제어될 수 있다. 혐기성 조건은 배양 브로쓰의 산소 수준을 약 8 mg/L에서 0 mg/L로 감소시킴으로써 생성된다. 예를 들어, 혐기성 조건을 확립하기 위해 질소 또는 가스 혼합물(N2, CO2 및 H2)을 사용할 수 있다. 대안적으로, 가스가 사용되지 않고 배지에서 남은 산소를 소비하는 세포에 의해 혐기성 조건이 설정된다. 균주 및 접종물 크기에 따라 생물반응기 발효 시간이 달라질 수 있다. 예를 들어, 발효 시간은 약 5시간에서 48시간까지 다양할 수 있다.
냉동 상태로부터 미생물을 되살리는 것은 특별한 고려가 필요할 수 있다. 생산 배지는 해동 후 세포에 스트레스를 줄 수 있으며; 해동된 재료로부터 시드 트레인을 일관되게 시작하려면 특정 해동 배지가 필요할 수 있다 시드 부피를 증가시키거나 미생물 성장 상태를 유지하기 위한 목적으로 시드 물질을 신선한 배지로 옮기거나 통과시키는 동역학은 미생물의 현재 상태(예를 들어, 기하급수적 성장, 정지 성장, 스트레스 없음, 스트레스 받음)에 의해 영향을 받을 수 있다.
생산 발효기(들)의 접종은 성장 동역학 및 세포 활성에 영향을 미칠 수 있다. 생물 반응기 시스템의 초기 상태는 성공적이고 일관된 생산을 촉진하기 위해 최적화되어야 한다. 전체 배지에 대한 시드 배양물의 비율(예를 들어, 백분율)은 성장 동력학에 극적인 영향을 미친다. 범위는 발효기 작업량의 1~5%일 수 있다. 배양 배지의 초기 pH는 공정 설정점과 다를 수 있다. pH 스트레스는 낮은 세포 농도에서 해로울 수 있으며; 초기 pH는 pH 7.5와 공정 설정점 사이일 수 있다. 접종 중 시스템으로의 교반 및 가스 흐름은 공정 설정값과 다를 수 있다. 두 조건으로 인한 물리적 및 화학적 스트레스는 낮은 세포 농도에서 해로울 수 있다.
공정 조건 및 제어 설정은 미생물 성장 및 세포 활성의 동역학에 영향을 미칠 수 있다. 공정 조건의 변화는 막 조성, 대사산물의 생성, 성장 속도, 세포 스트레스 등을 변화시킬 수 있다. 성장을 위한 최적 온도 범위는 균주에 따라 달라질 수 있다. 범위는 20~40℃일 수 있다. 세포 성장 및 다운스트림 활성의 성능을 위한 최적의 pH는 균주에 따라 다를 수 있다. 범위는 pH 5 내지 8일 수 있다. 배지에 용해된 가스는 세포에 의해 대사에 사용될 수 있다. 공정 전반에 걸쳐 O2, CO2 및 N2의 농도를 조정하는 것이 필요할 수 있다. 영양소의 가용성은 세포 성장을 변화시킬 수 있다. 미생물은 과잉 영양소를 이용할 수 있을 때 대체 역학을 가질 수 있다.
발효 종료 및 수확 중 미생물의 상태는 세포 생존 및 활성에 영향을 미칠 수 있다. 미생물은 분리 및 다운스트림 처리와 관련된 물리적 및 화학적 스트레스에 대해 더 잘 준비하기 위해 수확 직전에 사전 조절될 수 있다. 온도 변화(종종 20~5℃까지 감소)는 발효기로부터 제거될 때 세포 대사를 감소시키고, 성장(및/또는 사멸)을 늦추고, 생리학적 변화를 감소시킬 수 있다. 원심 농축의 효과는 배양 pH에 의한 영향을 받을 수 있다. pH를 1~2 포인트 올리면 농도의 효율성을 높일 수 있지만, 세포에 해로울 수도 있다. 미생물은 배지의 염 및/또는 당 농도를 증가시켜 수확 직전에 스트레스를 받을 수 있다. 이러한 방식으로 스트레스를 받은 세포는 다운스트림 동안 동결 및 동결건조에서 더 잘 생존할 수 있다.
분리 방법 및 기술은 미생물이 배양 배지로부터 얼마나 효율적으로 분리되는지에 영향을 미칠 수 있다. 원심분리 기술을 사용하여 고형물을 제거할 수 있다. 원심 농축의 효과는 배양 pH 또는 응집제의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다. pH를 1~2 포인트 올리면, 농도의 효율성을 높일 수 있지만, 세포에 해로울 수도 있다. 미생물은 배지의 염 및/또는 당 농도를 증가시켜 수확 직전에 스트레스를 받을 수 있다. 이러한 방식으로 스트레스를 받은 세포는 다운스트림 동안 동결 및 동결건조에서 더 잘 생존할 수 있다. 또한, 미생물은 여과를 통해 분리될 수도 있다. 세포가 성공적으로 원심분리하기 위해 과도한 g-분이 필요한 경우 여과는 정제를 위한 원심분리 기술보다 우수하다. 부형제는 분리 전후에 첨가될 수 있다. 부형제는 동결 보호 또는 동결 건조 동안 보호를 위해 첨가될 수 있다. 부형제는 수크로스, 트레할로스 또는 락토스를 포함할 수 있지만 이들로 한정되지 않으며, 이들은 대안적으로 완충제 및 항산화제와 혼합될 수 있다. 동결건조 전에, 부형제와 혼합된 세포 펠릿의 방울을 액체 질소에 함침시킨다.
수확은 연속 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 생성물은 원하는 최종 농도까지 다양한 부형제와 함께 재현탁될 수 있다. 부형제는 동결 보호 또는 동결 건조 동안 보호를 위해 첨가될 수 있다. 부형제는 수크로스, 트레할로스 또는 락토스를 포함할 수 있지만 이들로 한정되지 않으며, 이들은 대안적으로 완충제 및 항산화제와 혼합될 수 있다. 동결건조 전에, 부형제와 혼합된 세포 펠릿의 방울을 액체 질소에 함침시킨다.
살아있는 박테리아, 소포 또는 기타 박테리아 유도체를 포함하는 물질의 동결건조에는 동결, 1차 건조 및 2차 건조 단계가 포함된다. 동결건조는 동결로 시작된다. 생성물 재료는 동결 단계 전에 동결보호제 또는 안정화제와 혼합되거나 혼합되지 않을 수 있다. 생성물은 동결건조기의 적재 전에 또는 동결건조기 선반의 통제된 조건 하에서 동결될 수 있다. 다음 단계인 1차 건조 단계동안, 승화를 통해 얼음을 제거한다. 이때 진공이 생성되어, 재료에 적절한 양의 열이 공급된다. 얼음은 생성물 온도를 빙점 미만, 그리고 재료의 임계 온도(Tc) 미만으로 유지하면서 승화된다. 재료가 적재되는 선반의 온도와 챔버 진공을 조작하여 원하는 생성물 온도를 얻을 수 있다. 2차 건조 단계에서 생성물에 결합된 물 분자가 제거된다. 여기에서 온도는 일반적으로 물 분자와 생성물 재료 사이에 형성된 모든 물리화학적 상호작용을 끊기 위해 1차 건조 단계보다 더 높여진다. 동결-건조 공정이 완료된 후, 챔버는 질소와 같은 불활성 기체로 채워질 수 있다. 생성물은 건조한 상태의 동결 건조기 내에서 유리 바이알 또는 기타 유사한 용기에 밀봉되어, 대기 중 물 및 오염물질에 대한 노출을 방지할 수 있다.
실시예 36: smEV 및 pmEV 준비
smEV : smEV의 다운스트림 처리는 생물반응기의 수확 직후에 시작된다. 20,000 g에서 원심분리하여 브로쓰에서 세포를 제거한다. 생성된 상청액은 0.22 m 필터를 사용하여 정화한다. smEV를 농축하고 100 kDa 분자량 컷오프(MWCO)가 있는 평면 시트 카세트 한외여과(UF) 멤브레인으로의 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 세척한다. 5부피의 인산염 완충 용액(PBS)을 사용하여 소분자 및 소단백질을 세척하는 데 정용여과(DF)를 사용한다. TFF로부터의 잔류물을 200,000 x g의 초원심분리기에서 1시간 동안 회전시켜 고속 펠릿(HSP)이라고 하는 smEV가 풍부한 펠릿을 형성한다. 펠릿을 최소 PBS로 재현탁하고, optiprepTM 밀도 구배 배지로 구배를 제조하고, 200,000 g에서 16시간 동안 초원심분리한다. 결과 분획 중, 2개의 중간 대역에 smEV가 함유된다. 분획을 15배 PBS로 세척하고, smEV를 200,000 x g에서 1시간 동안 회전시켜 분획화된 HSP 또는 fHSP를 생성한다. 이어서 이를 최소 PBS로 재현탁하고, 풀링하고, mL당 입자 및 단백질 함량에 대해 분석한다. 원하는 농도를 달성하기 위해 입자/mL 수로부터 투여량을 준비한다. smEV는 532 nm 레이저를 사용하여 산란 모드에서 Malvern Panalytical의 NanoSight NS300을 사용하여 특성화한다.
pmEV:
세포 펠릿을 냉동고에서 꺼내 얼음 위에 놓는다. 펠릿 중량을 기록한다.
차가운 100 mM Tris-HCl pH 7.5를 냉동 펠릿에 첨가하고, 펠릿을 4℃에서 회전하면서 해동시킨다.
10 mg/ml DNase 스톡을 1 mg/ml의 최종 농도로 해동된 펠릿에 첨가한다.
펠릿을 RT(실온)에서 40분 동안 인버터에서 인큐베이션한다.
샘플은 Emulsiflex를 통과하기 전에 70 um 셀 스트레이너에서 여과한다.
샘플은 22,000 psi에서 8개의 개별 사이클로 Emulsiflex를 사용하여 용해한다.
용해된 샘플에서 세포 잔해를 제거하기 위해, 샘플을 12,500 x g, 15분, 4℃에서 원심분리한다.
샘플을 12,500 x g, 15분, 4℃에서 2회 추가로 원심분리하고, 매번 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다.
막 단백질을 펠릿화하기 위해 샘플을 120,000 x g, 1시간, 4℃에서 원심분리한다.
펠릿을 pH 11의 빙냉 0.1M 탄산나트륨 10 mL에 재현탁시킨다. 샘플을 인버터에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
샘플을 120,000 x g, 1시간, 4℃에서 원심분리한다.
10 mL의 100 mM Tris-HCl pH 7.5를 펠릿에 첨가하고 4℃에서 O/N(밤샘) 인큐베이션한다.
펠릿을 재현탁하고, 샘플을 4℃에서 1시간 동안 120,000 x g에서 원심분리한다.
상청액을 버리고, 펠릿을 최소 부피의 PBS에 재현탁시킨다.
pmEV의 투여는 제조업체 지침에 따라 NanoSight NS300(Malvern Panalytical)을 사용하여 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 평가된 바와 같이, 입자 수를 기반으로 한다. 각 샘플에 대한 카운트는 프레임당 40~140개의 입자를 계산하여, 각각 30초 길이의 최소 3개의 비디오를 기반으로 한다.
감마선 조사: 감마선 조사를 위해, pmEV를 동결된 형태로 제조하고, 25 kGy 방사선량으로 드라이아이스에 감마선 조사하고; 전체 미생물 동결건조 분말을 17.5 kGy 방사선량으로 주위 온도에서 감마선 조사한다.
동결건조: 샘플을 동결건조 장비에 넣고, -45℃에서 동결시킨다. 동결건조 주기에는 -45℃에서 10분 동안 유지 단계가 포함된다. 진공을 시작하여 100 mTorr로 설정하고, 샘플을 -45℃에서 10분 더 유지한다. 1차 건조는 300분에 걸쳐 -25℃까지의 온도 램프로 시작하였으며, 이 온도에서 4630분 동안 유지된다. 2차 건조는 진공을 20 mTorr로 감소시키면서 200분에 걸쳐 20℃까지의 온도 램프로 시작한다. 이 온도 및 압력에서 1200분 동안 유지한다. 마지막 단계에서는 온도를 20℃로부터 25℃로 높여, 10분 동안 20 mTorr의 진공 상태를 유지한다.
실시예 37: 종양 미세환경 효과
푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV를 사용한 경구 치료가 종양 미세환경(TME)에서 효과기 림프구 집단의 원위 활성화에 미치는 영향을 조사하기 위한 연구를 수행하였다. 도 15a~15c에 도시된 바와 같이, 경구 전달된 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV는 TME에서 IFNg+ 세포용해 및 헬퍼 림프구, DC 및 IP-10을 활성화하고 유지한다. 연구는 CT-26 암 모델에서 수행하였다. 마우스를 PBS, 경구 전달된 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV, 또는 항-PD-1(복강내)로 처리하고, 연구 종료 시(d11) 마우스의 종양을 소화시켰다. CD8, NK, NKT 및 CD4 T 세포 IFNg 생성(도 15a) 및 침윤 DC 하위집합(도 15b)을 평가하기 위해 유세포 분석법을 사용하였다. TME 내 부수적인 IP-10 생성은 MSD 검정에 의해 검출되었다(도 15c).
이들 연구는 경구 전달된 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV가 TME에서 IFNg 생성 CD8+ CTL, NK 세포, NKT 세포 및 CD4+ 세포의 백분율을 유의하게 증가시켰음을 입증한다.
또한, 연구는 경구 전달된 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV가 종양-침윤 수지상 세포(DC1 및 DC2) 및 IP-10 생산을 증가시켜, 항종양 림프구의 동원 및 활성화에 도움이 되는 환경을 생성함을 입증한다.
실시예 38: 형광 생체분포 분석
경구 투여된 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV가 위장관에 국한되는지, 그리고 이들이 전신 기관에서 검출되는지를 조사하기 위한 연구를 수행하였다. IRDye800으로 공유 표지된 2x1011 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV를 마우스에 경구 투여하고, 소형 동물 이미징 시스템(Licor Pearl®)을 사용하여 10분, 60분, 6시간 및 24시간 시점에서 기관 형광을 정량화했다. 이 연구는 경구로 전달되는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV가 위장관에 국한되어 전신 기관에서는 검출되지 않는다는 사실을 밝혔다.
실시예 39: 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV에 반응하여 IL-6, TNF -알파 및 IL-10 방출을 유도하기 위해 TLR2 /6 신호전달이 요구된다
인간 단핵구 세포주 U937 세포를 96웰 플레이트에 웰당 250,000개 세포의 최종 농도로 플레이팅하고, PMA를 함유하는 분화 배지에서 배양하였다. 24시간 후, 분화 배지를 씻어내고 완전 배지로 교체하고, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV +/- 5 μg /mL 항-TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 또는 이소형 대조군을 첨가하기 전에 세포를 24시간 동안 휴지시켰다. 세포를 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 존재 하에 24시간 동안 배양하고, 상청액을 수집하고, MSD에 의해 IL-6, TNF-알파 및 IL-10 반응에 대해 분석하였다.
결과는 도 16에 제시되어 있다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV는 U937 세포로부터 IL-6, TNF-알파 및 IL-10 방출을 자극하며, 이는 TLR2 또는 TLR6의 항체-매개 차단에 의해 손상되지만, TLR1 및 TLR4에 의해 손상되지 않는다.
실시예 40: 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV 는 강력한 인간 TLR2 작용제 활성을 가지고 있다
인간 TLR1, TLR2 및 TLR6 조합을 발현하는 HEK293-SEAP 리포터 세포(Invivogen)를 96웰 플레이트에서 웰당 20,000개 세포의 최종 농도로 플레이팅하고 적절한 선택 배지에서 배양하였다. 48시간 후, 선택 배지를 씻어내고 완전 배지로 교체하고 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 6개의 다른 배치를 웰당 표시된 농도로 첨가하였다. 세포는 24시간 동안 smEV의 존재 하에 배양하였다. 상청액을 수집하고 HEK-Blue 시약(Invivogen)과 함께 30분 동안 인큐베이션한 다음, TLR2 이종이량체의 자극을 위해 OD 630 nm에서 흡광도를 판독했다.
결과는 도 17에 나타내었다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV는 TLR1/2 이종이량체가 아니라 TLR2/6 이종이량체를 자극한다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 6개 배치를 테스트하였으며, 일관된 TLR 참여 프로필을 가졌다.
실시예 41: 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV는 더 높은 용량에서 NOD2를 자극한다
인간 NOD1 또는 NOD2를 발현하는 HEK293-SEAP 리포터 세포(Invivogen)를 96웰 플레이트에 웰당 80,000개 세포의 최종 농도로 플레이팅하고 적절한 선택 배지에서 배양하였다. 24시간 후, 선택 배지를 씻어내고 완전 배지로 교체하고, 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV의 6개의 다른 배치를 웰당 표시된 농도로 첨가하였다. 세포는 24시간 동안 smEV의 존재 하에 배양되었다. 상청액을 수집하고 HEK-Blue 시약(Invivogen)과 30분 동안 인큐베이션한 다음, NOD1 및 NOD2 수용체의 자극을 위해 OD 630 nm에서 흡광도를 판독했다.
결과는 도 18에 제시되어 있다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A smEV는 더 높은 용량에서 NOD1이 아닌 NOD2를 자극한다. 푸르니에렐라 마실리엔시스 smEV의 6개 배치를 테스트하였으며, NOD2 효능작용이 나타났다.
참조에 의한 포함
본원에 언급된 모든 공보 또는 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 포함된 것으로 표시된 것처럼 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 본원에서의 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 우선한다.
균등물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Evelo Biosciences, Inc. <120> Compositions And Methods For Treating Diseases and Disorders Using Fournierella massiliensis <130> ETB-08225 <140> PCT/US21/36927 <141> 2021-06-11 <150> 63/037,878 <151> 2020-06-11 <150> 63/069,434 <151> 2020-08-24 <150> 63/104,791 <151> 2020-10-23 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1526 <212> DNA <213> Fournierella massiliensis <400> 1 tatgaagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgcgcctaac acatgcaagt 60 cgaacggagc ttgcttgtca gatcctttcg gggtgacgac ttgtaagctt agtggcgaac 120 gggtgagtaa cacgtgagta acctgcccca gagtggggga caacagttgg aaacgactgc 180 taataccgca taagcccacg gaaccgcatg gttctgaggg aaaaggagca attcgctttg 240 ggatggactc gcgtccgatt agctagatgg tgaggtaacg gcccaccatg gcgacgatcg 300 gtagccggac tgagaggttg atcggccaca ttgggactga gacacggccc agactcctac 360 gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggggaaacc ctgatgcagc gacgccgcgt 420 ggaggaagaa ggccttcggg ttgtaaactc ctgtcgtaag ggacgatagt gacggtacct 480 tacaagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taaaacgtag gtggcaagcg 540 ttgtccggaa ttactgggtg taaagggagc gcaggcgggt ctgcaagttg gaagtgaaac 600 tcatgggctc aacccatgaa ctgctttcaa aactgcggat cttgagtggt gtagaggtag 660 gcggaattcc cggtgtagcg gtggaatgcg tagatatcgg gaggaacacc agtggcgaag 720 gcggcctact gggcactaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagca aacaggatta 780 gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gattactagg tgtgggagga ttgacccctt 840 ccgtgccgca gttaacacaa taagtaatcc acctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc agtggagtat gtggtttaat tcgaagcaac 960 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccg atgcatagtg tagagataca tgaagtcctt 1020 cgggacatcg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080 aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcgt tagttactac gcaagaggac tctagcgaga 1140 ctgccgttga caaaacggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cctttatgac 1200 ctgggctaca cacgtactac aatggcaatt aacaaagaga agcgaagccg cgaggtggag 1260 caaacctcat aaaaattgtc tcagttcaga ttgcaggctg caactcgcct gcatgaagtc 1320 ggaattgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccatga gagccggggg gacccgaagt ccgtagccta accgcaagga 1440 gggcgcggcc gaaggtaaaa ctggtgattg gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtatcg 1500 gaaggtgcgg ctggatcacc tccttt 1526

Claims (116)

  1. 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함하는 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99% 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 서열번호 1에 대해 적어도 99%의 16S 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 중 박테리아의 적어도 50%가 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 중 박테리아의 적어도 90%가 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 중 박테리아의 실질적으로 전부가 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A인, 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아 조성물은 적어도 1 x 106개 총 세포의 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A를 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아 조성물은 적어도 1 x 107개 총 세포의 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A를 포함하는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아 조성물은 적어도 1 x 108개 총 세포의 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A를 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 생 박테리아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 약독화된 박테리아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 사멸된 박테리아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 동결건조된 박테리아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 조사된 박테리아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 감마선 조사된 박테리아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  18. 푸르니에렐라 마실리엔시스로부터 생성된 단리된 세포외 소포(mEV)를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99% 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 서열번호 1에 대해 적어도 99%의 16S 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)인, 약제학적 조성물.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%가 mEV인, 약제학적 조성물.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 분비된 mEV(smEV)를 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 가공된 mEV(pmEV)를 포함하는, 약제학적 조성물.
  26. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV는 pmEV를 포함하고, pmEV는 감마선 조사, UV 조사, 열 비활성화, 산 처리, 또는 산소 살포된 박테리아로부터 생성된, 약제학적 조성물.
  27. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV는 pmEV를 포함하고, pmEV는 생 박테리아로부터 생성되는, 약제학적 조성물.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV가 동결건조되는(예를 들어, 동결건조된 생성물이 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는), 약제학적 조성물.
  29. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV가 감마선 조사되는, 약제학적 조성물.
  30. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV가 UV 조사되는, 약제학적 조성물.
  31. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV가 (예를 들어, 50℃에서 2시간 동안 또는 90℃에서 2시간 동안) 열 불활성화되는, 약제학적 조성물.
  32. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV가 산 처리되는, 약제학적 조성물.
  33. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mEV가 (예를 들어, 2시간 동안 0.1 vvm으로) 산소 살포되는, 약제학적 조성물.
  34. 제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    mEV의 용량이 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자인(예를 들어, 여기서 입자 수는 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨), 약제학적 조성물.
  35. 제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    mEV의 용량이 약 5　mg 내지 약 900 mg의 총 단백질인(예를 들어, 여기서 총 단백질은 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정됨), 약제학적 조성물.
  36. 푸르니에렐라 마실리엔시스 미생물 세포외 소포(mEV) 및 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아를 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  38. 제36항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99% 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  39. 제36항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 서열번호 1에 대해 적어도 99%의 16S 서열 동일성을 포함하는 균주인, 약제학적 조성물.
  40. 제36항에 있어서,
    상기 푸르니에렐라 마실리엔시스는 푸르니에렐라 마실리엔시스 균주 A(ATCC 수탁 번호 PTA-126696)인, 약제학적 조성물.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 총 입자의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV인, 약제학적 조성물.
  42. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 총 입자의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 입자인, 약제학적 조성물.
  43. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 총 단백질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV인, 약제학적 조성물.
  44. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 총 단백질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 단백질인, 약제학적 조성물.
  45. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 총 지질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 mEV인, 약제학적 조성물.
  46. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 총 지질의 적어도, 약, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하는 푸르니에렐라 마실리엔시스 박테리아 지질인, 약제학적 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 질환 치료를 위한 것인, 약제학적 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 면역 장애(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 대사성 질환)의 치료를 위한 것인, 약제학적 조성물.
  49. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 염증성 장애(예를 들어, 피부염) 치료를 위한 것인, 약제학적 조성물.
  50. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 암(예를 들어, 결장직장암) 치료를 위한 것인, 약제학적 조성물.
  51. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 세균불균형 치료를 위한 것인, 약제학적 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 면역 반응을 유도하는, 약제학적 조성물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 선천성 항원 제시 세포를 활성화시키는, 약제학적 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구, 직장, 설하, 피내, 복강내 또는 피하 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 예를 들어, 경구 투여될 때 위장관 외부에서 하나 이상의 유익한 면역 효과를 갖는, 약제학적 조성물.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 예를 들어, 경구 투여될 때 대상체에서 위장관 외부의 면역 효과를 조절하는, 약제학적 조성물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 고체 투여 형태를 포함하는, 약제학적 조성물.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 고체 투여 형태가 정제, 미니정제, 캡슐제, 환제, 또는 분말제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    상기 고체 투여 형태가 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고체 투여 형태가 장용 코팅을 포함하는, 약제학적 조성물.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고체 투여 형태가 경구 투여를 위한 것인, 약제학적 조성물.
  62. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 현탁액을 포함하는, 약제학적 조성물.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 현탁액이 경구 투여를 위한 것인(예를 들어, 현탁액이 PBS, 및 선택적으로, 수크로스 또는 글루코스를 포함하는), 약제학적 조성물.
  64. 제62항에 있어서,
    상기 현탁액이 정맥내 투여를 위한 것인(예를 들어, 현탁액이 PBS를 포함하는), 약제학적 조성물.
  65. 제62항에 있어서,
    상기 현탁액이 복강내 투여를 위한 것인(예를 들어, 현탁액이 PBS를 포함하는), 약제학적 조성물.
  66. 제62항에 있어서,
    상기 현탁액이 종양내 투여를 위한 것인(예를 들어, 현탁액이 PBS를 포함하는), 약제학적 조성물.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁액은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁액은 완충액(예를 들어, PBS)을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 하나 이상의 추가 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 일일 용량으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  71. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 1일 2회 용량으로 제형화되고, 각 용량이 일일 용량의 절반인, 약제학적 조성물.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세균불균형, 및/또는 대사성 질환)을 치료하는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  73. 질환(예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세균불균형, 및/또는 대사성 질환) 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  74. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)를 치료하는 방법.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 대상체가 면역 장애 또는 대사성 장애에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
  76. 제74항에 있어서,
    상기 대상체가 암에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
  77. 제74항에 있어서,
    상기 대상체가 염증성 질환에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
  78. 제74항에 있어서,
    상기 대상체가 세균불균형에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
  79. 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체에게 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는, 방법.
  81. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 종양내 투여되는, 방법.
  82. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 종양하(subtumorally) 투여되는, 방법.
  83. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 주사, 예를 들어 피하, 피내, 또는 복강내 주사로 투여되는, 방법.
  84. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 경구 투여되는, 방법.
  85. 제74항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 1종 이상의 추가 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
  86. 제74항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 내 mEV의 용량이 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자인(예를 들어, 여기서 입자 수가 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨), 방법.
  87. 제74항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 mEV의 용량이 약 5　mg 내지 약 900 mg의 총 단백질인(예를 들어, 여기서 총 단백질은 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정됨), 방법.
  88. 제74항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 1일 1회 투여되는, 방법.
  89. 제74항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 1일 2회 투여되는, 방법.
  90. 제74항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 일일 용량으로 제형화되는, 방법.
  91. 제74항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 1일 2회 용량으로 제형화되고, 각 용량이 일일 용량의 절반인, 방법.
  92. 현탁액 중의 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서, mEV, 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을, 약제학적으로 허용 가능한 완충액(예를 들어, PBS)과 조합하여; 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서,
    상기 현탁액이 수크로스 또는 글루코스를 추가로 포함하는, 방법.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서,
    상기 현탁액은 경구 투여를 위한 것인, 방법.
  95. 제92항 또는 제93항에 있어서,
    상기 현탁액은 정맥내 투여를 위한 것인, 방법.
  96. 제92항 또는 제93항에 있어서,
    상기 현탁액은 복강내 투여를 위한 것인, 방법.
  97. 제92항 또는 제93항에 있어서,
    상기 현탁액은 종양내 투여를 위한 것인, 방법.
  98. 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁액은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
  99. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁액은 완충액(예를 들어, PBS)을 추가로 포함하는, 방법.
  100. 제92항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 1종 이상의 추가 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
  101. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 경구 투여되는, 방법.
  102. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는, 방법.
  103. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 종양내 투여되는, 방법.
  104. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 종양하(subtumorally) 투여되는, 방법.
  105. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 주사, 예를 들어 피하, 피내, 또는 복강내 주사로 투여되는, 방법.
  106. 제92항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 내 mEV의 용량이 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자인(예를 들어, 여기서 입자 수가 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨), 방법.
  107. 제92항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 mEV의 용량이 약 5　mg 내지 약 900 mg의 총 단백질인(예를 들어, 여기서 총 단백질은 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정됨), 방법.
  108. 제92항 내지 제107항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 약제학적 조성물.
  109. 고체 투여 형태로 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항의 mEV, 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합을 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합하는 단계, 및
    b) mEV, 박테리아, 또는 이들의 임의의 조합; 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 압축시켜, 약제학적 조성물을 제조하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서,
    상기 방법은 상기 고체 투여 형태를 장용으로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서,
    상기 고체 투여 형태가 정제, 미니정제, 캡슐제, 환제, 또는 분말제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 1종 이상의 추가 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 경구 투여되는, 방법.
  114. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 내 mEV의 용량이 약 2x106 내지 약 2x1016개 입자인(예를 들어, 여기서 입자 수가 NTA(나노입자 추적 분석)에 의해 결정됨), 방법.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물 내 mEV의 용량이 약 5　mg 내지 약 900 mg의 총 단백질인(예를 들어, 여기서 총 단백질은 브래드포드 검정 또는 BCA 검정에 의해서 결정됨), 방법.
  116. 제109항 내지 제115항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 약제학적 조성물.
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