KR20230036728A - 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 효과적으로 추출하는 방법 - Google Patents
탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 효과적으로 추출하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 효과적으로 추출하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 (1) 분리된 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계 및 (2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 세포외 기질을 추출하는 단계를 포함하는 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법; RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 포함하는 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질 추출용 조성물; 본 발명의 방법으로 추출된 마트리좀(matrisome) 형태의 세포외 기질 관련 단백질을 함유한 세포외 기질; 및 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질을 이용한 질환의 진단 또는 치료를 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 효과적으로 대량 추출하는 방법에 관한 것이다.
세포외 기질(ECM; extracellular matrix)은 세포와 조직에 물리적 지원을 제공하고 증식, 분화 및 이동을 포함한 다양한 세포 과정을 조절하는 가교 및 글리코실화된 단백질의 복잡한 네트워크로 형성되어 있다. 전자 현미경을 사용한 체적 연구에 따르면 세포외 기질이 쥐 뇌의 20%를 차지한다고 알려져 있고, 중추 신경계(CNS) 발달 동안 뇌의 특정 ECM 구성 요소는 시간적, 공간적 방식으로 조절된다. 모세혈관 내피 글리코칼릭스와 혈관주위세포 유래 라미닌은 혈액뇌장벽(BBB)을 보호하며, 콜라겐은 축삭 유도 및 시냅스 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 이들은 myelinating Schwann 세포의 말단 분화와도 관련되어 있다. 세포외 기질의 구조 및 기능에 대한 변화와 결함은 뇌졸중, 노화, 자폐증, 간질, 외상성 뇌 손상, 알츠하이머병, 정신분열증과 같은 병리학적 상태와 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 정상적인 구조와 기능을 가진 세포외 기질의 재구성은 의료, 제약 및 조직 공학 응용 분야에 매우 필요하다.
그러나 세포외 기질 및 세포외 기질관련 단백질은 구성 및 구조적 복잡성으로 인해 기존의 화학적 및 물리적 방법으로는 쉽게 얻을 수 없는 문제가 있다.
한편, 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC/MS)은 단백질체학 분석을 위한 분석 화학기술이며 단백질체학을 연구하는데 많이 활용되고 있는 방법이다. 그러나 이러한 LC/MS 분석은 비교적 많은 단백질을 연구하는데 용이하게 사용할 수 있으나, 구조가 복잡하고 불용성 단백질을 많이 함유하고 있는 ECM를 연구하는데 있어서 한계가 있다. 특히 세포외 기질 단백질은 분자량이 크고 다수의 가교결합 및 공유결합이 있으며 강한 글리코실화 등 복잡한 구성으로 이루어져 있어 생화학적 분석이 어려운 문제점이 있다.
따라서 세포외 기질(ECM)에 대한 구체적인 연구를 위해서는 우선적으로 세포외 기질을 대량 얻을 수 있는 기술의 개발이 필요하다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 현재 탈당화 및 농축과정을 통한 세포외 기질의 생산방법이 개발된 바 있으나, 이러한 종래 방법은 추출과정에서 세포외 기질이 상당량 손실되는 문제점이 있다.
그러므로 종래의 문제점을 해결할 수 있는 새로운 세포외 기질의 대량 추출방법에 대한 기술개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 탈세포화된 뇌 조직으로부터 세포외 기질(ECM) 및 matrisomal 단백질을 효과적으로 추출하기 위한 방법을 연구하던 중, 탈세포화된 뇌 조직을 RIPA, PNGase F 및 콘카나발린 A로 순차적으로 처리할 경우, 탈세포화된 뇌 조직으로부터 손실을 최소화하면서 다량의 세포외 기질(ECM) 및 matrisomal 단백질을 성공적으로 분리할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (1) 분리된 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 세포외 기질을 추출하는 단계를 포함하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 포함하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질 추출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된, 마트리좀(matrisome) 형태의 세포외 기질 관련 단백질을 함유한 세포외 기질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질을 이용한 질환의 진단 또는 치료를 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 분리된 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 세포외 기질을 추출하는 단계를 포함하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 탈세포화는, (a) 탈세포 대상의 조직을 준비하고, (b) 상기 탈세포 대상의 조직을 고정액에 첨가하여 상기 조직에 고정액을 침투시키고, (c) 상기 고정액이 침투된 조직을 오일에 침지시키고 37℃~45℃ 온도로 2~4시간 동안 중합 반응시켜 조직 중합체(polymerization)를 제조하고, 및 (d) 상기 (c) 단계에서 제조된 조직 중합체를 계면활성제 용액에 첨가하고 전기영동하는 과정으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고정액은 아크릴아마이드(acrylamide), 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 아조-개시제(azo-initiator) 및 PBS(Phosphate-buffered saline)로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조직은 뇌 조직, 간 조직, 폐 조직, 위 조직, 근육 조직, 신장 조직, 또는 췌장 조직일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, RIPA 용액의 처리는 1~2%(w/v)의 RIPA 용액을 상기 탈세포화된 조직에 첨가하고 균질화시킨 후, 4°C에서 18~24시간 동안 반응시켜 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, PNGase F 처리는 RIPA 용액 처리로 수득한 RIPA 용해물의 원심분리 상층액에 PNGase F를 첨가하고 37°C에서 2~6시간 동안 반응시켜 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 콘카나발린 A(concanavalin A) 처리는 RIPA 용액 및 PNGase F 처리로 수득한 탈세포 조직 용해물에 콘카나발린 A를 첨가하여 상기 탈세포 조직 용해물로부터 콘카나발린 A와 결합된 세포외 기질을 분리하는 것으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 콘카나발린 A와 결합된 세포외 기질을 분리하는 것은 콘카나발린 A를 레진으로 이용한 풀 다운(pull down) 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, RIPA 용액 처리로 수득한 RIPA 용해물은 PNGase F를 처리하기 전에 탈염(desalting) 처리하는 단계를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 포함하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질 추출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된, 마트리좀(matrisome) 형태의 세포외 기질 관련 단백질을 함유한 세포외 기질을 제공한다.
나아가 본 발명은, (1) 개체로부터 분리된 병변부위의 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계; (2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 상기 병변부위로부터 세포외 기질을 추출하는 단계; 및 (3) 정상 대조군의 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질과 상기 (2) 단계의 병변부위로부터 추출한 세포외 기질을 비교 분석하는 단계를 포함하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질을 이용한 질환의 진단 또는 치료를 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계의 분석은 세포외 기질 관련 단백질의 발현수준 또는 단백질 변형(Protein Modification) 또는 단백질 이동에 대한 변화여부를 분석하는 것일 수 있다.
본 발명은 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 효과적으로 추출하는 방법에 관한 것으로, 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화된 조직 지지체를 대상으로 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)의 순차적 처리에 따른 용해, 탈당화 및 농축과정으로 세포외 기질을 추출할 경우, 종래 방법의 문제점이었던 다량의 세포외 기질 손실을 감소시킬 수 있으며, 세포외 기질 관련 다양한 단백질들을 대량으로 동정할 수 있을 뿐만 아니라 분석의 효율성도 증진시킬 수 있다. 나아가 본 발명의 세포외 기질 추출방법을 적용하여 정상 및 질환군의 세포외 기질을 분석할 경우, 질병의 진단 및 치료제 발굴 등 다양한 분야에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 12주령 마우스의 뇌 조직을 탈세포화하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 각기 다른 방법으로 탈세포화를 진행한 후, 뇌 형태의 보존 정도를 분석한 결과로서, A는 서로 다른 방법으로 탈세포화된 마우스 뇌의 크기와 모양을 확인한 결과이고, B는 물리적 교반 또는 전기영동 방법을 수행한 후의 조직 투명도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER) 및 오일 처리 없이 조직 중합 및 탈세포화 방법(CASPER)으로 처리된 마우스의 뇌 조직으로부터 세포외 기질을 추출하는 방법에 대한 과정(A)을 나타낸 것이고, 추출된 세포외 기질을 쿠마시에 및 실버염색법으로 확인한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 4는 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 수득한 탈세포화된 뇌 조직(뇌 지지체)에 대하여 각기 다른 방법으로 세포외 기질을 추출하는 방법에 대한 모식도(A) 및 추출한 세포외 기질을 실버 염색법으로 확인한 결과(B)와, 대표적인 세포외 기질 성분인 콜라겐 I, 콜라겐 IV 및 Lamin 단백질의 함량을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 오일 기반의 탈세포화 방법으로 수득한 뇌 지지체로부터 본 발명의 방법으로 추출한 세포외 기질 성분 및 matrisome 단백질을 LC-MS/MS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 각기 다른 방법으로 탈세포화를 진행한 후, 뇌 형태의 보존 정도를 분석한 결과로서, A는 서로 다른 방법으로 탈세포화된 마우스 뇌의 크기와 모양을 확인한 결과이고, B는 물리적 교반 또는 전기영동 방법을 수행한 후의 조직 투명도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER) 및 오일 처리 없이 조직 중합 및 탈세포화 방법(CASPER)으로 처리된 마우스의 뇌 조직으로부터 세포외 기질을 추출하는 방법에 대한 과정(A)을 나타낸 것이고, 추출된 세포외 기질을 쿠마시에 및 실버염색법으로 확인한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 4는 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 수득한 탈세포화된 뇌 조직(뇌 지지체)에 대하여 각기 다른 방법으로 세포외 기질을 추출하는 방법에 대한 모식도(A) 및 추출한 세포외 기질을 실버 염색법으로 확인한 결과(B)와, 대표적인 세포외 기질 성분인 콜라겐 I, 콜라겐 IV 및 Lamin 단백질의 함량을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 오일 기반의 탈세포화 방법으로 수득한 뇌 지지체로부터 본 발명의 방법으로 추출한 세포외 기질 성분 및 matrisome 단백질을 LC-MS/MS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 손실 없이 대량 추출할 수 있는 방법을 제공함에 특징이 있다.
앞서 종래기술에서도 기술한 바와 같이, 최근 세포외 기질의 구조와 기능의 변화 및 결합 등이 많은 질환과 관련성이 있음이 밝혀지면서 세포외 기질에 대한 연구가 집중되고 있다.
세포외 기질은 비세포성 3차원 구조를 갖는 거대분자 네트워크로서 콜라겐, 프로테오글리칸/당-아미모노글리코사미노글리칸, 엘라스틴, 피섬유결합소(파이브로넥틴), 라미닌, 당단백질 등으로 구성되어 있고, 모든 조직과 기관에 있는 세포들과 복잡한 구조를 이루며 각 구성 요소들이나 세포부착 수용체들이 서로 결속되어 있다. 또한 세포 표면에 존재하는 각종 수용체는 세포외 기질로부터 세포로 생존, 성장, 이동, 분화 등과 같은 신호를 전달하는 역할도 한다.
한편, 이러한 세포외 기질은 조직으로부터 추출하는 종래 방법은 추출과정에서 다량의 세포외 기질이 손실되는 문제점이 있고, 세포외 기질 관련 또는 세포외 기질과 결합된 다수의 단백질 및 분자들 역시 다량 손실되어 기존의 추출방법으로 세포외 기질의 기능과 역할을 정확하게 연구하는데 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 추출 과정에서의 손실을 최소화 하면서 세포외 기질 관련 단백질들도 다량 함유하고 있는 세포외 기질의 효과적인 추출방법을 개발하기 위해 연구하던 중, 오일 기반의 탈세포화로 수득된 탈세포 조직 지지체를 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)으로 순차적 처리하여 추출할 경우, 추출 과정에서의 손실을 억제하면서 다수의 세포외 기질 관련 단백질을 포함하고 있는 세포외 기질을 생산할 수 있음을 확인하였다.
그러므로 본 발명은, (1) 분리된 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 세포외 기질을 추출하는 단계를 포함하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (1) 단계의 탈세포화는 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 과정을 통해, 생체조직 고유의 구조 붕괴 없이 고유의 조직 형태를 유지하면서 세포외기질을 추출할 수 있다.
조직의 탈세포화는 생체로부터 획득한 조직에서 세포 성분을 선별적으로 제거한 후, 잔류의 세포외기질을 이용하기 위한 기술로, 탈세포화된 조직은 조직재건수술, 인공장기 이식용 소재, 피부 대체재 등으로 광범위한 조직공학 분야에 이용되고 있다. 따라서 이상적인 탈세포화는 면역반응을 최소화할 수 있도록 세포 성분을 완전히 제거하고 조직자체의 물리적 성질을 잘 유지하고 단백질과 같은 구성성분의 손상이 없도록 하여 재세포화(recellularization)에 적합한 세포외 기질의 완벽한 보존이라고 할 수 있다.
본 발명에서 수행한 상기 오일 기반의 탈세포화는 바람직하게, (a) 탈세포 대상의 조직을 준비하고, (b) 상기 탈세포 대상의 조직을 고정액에 첨가하여 상기 조직에 고정액을 침투시키고, (c) 상기 고정액이 침투된 조직을 오일에 침지시키고 37℃~45℃의 온도로 2~4시간 동안 중합 반응시켜 조직 중합체(polymerization)를 제조한 후, 및 (d) 상기 (c) 단계에서 제조된 조직 중합체를 계면활성제 용액에 첨가하고 전기영동하는 과정을 통해 수행한다.
상기 탈세포 대상의 조직은 사체, 살아있는 개체(포유동물) 또는 개체(포유동물)를 희생한 직후로부터 수득한 것을 사용할 수 있으며, 또는 특정 질환을 갖는 개체로부터 분리된 조직을 사용할 수 있다.
상기 고정액은 세포 또는 조직 내 대사 작용을 정지시키고 썩지 않게 하며 형태의 고정화를 위해 처리하는 용액으로, 아크릴아마이드(acrylamide), 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 아조-개시제(azo-initiator) 및 PBS(Phosphate-buffered saline)으로 구성되며, 바람직하게 상기 고정액에는 18~22 wt%의 아크릴아마이드(acrylamide), 0.1~0.2wt%의 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 0.2~0.3 wt%의 아조-개시제(azo-initiator) 및 0.01~0.02%의 소듐 아자이드가 함유된 PBS 용액을 함유하고 있다.
상기 고정액은 아크릴아마이드(acrylamide)와 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide)가 함유되어 있어 적절하게 온도를 올려주면 공유결합에 의해 중합반응이 시작되어 중합체를 형성할 수 있게 된다.
상기 본 발명에서 탈세포 대상 조직에 고정액을 침투시키는 것은 상기 고정액에 조직을 첨가하고 4~6℃의 저온에서 2~4시간 동안 교반함으로써 삼투압에 의해 조직 내로 고정액이 잘 침투할 수 있도록 한다.
조직으로의 고정액 침투 단계가 완료되면, 이후 오일을 이용하여 조직 중합체(polymerization)를 제조한다.
조직 중합체의 제조는, 상기 고정액이 침투된 조직을 오일 내에 침지시키고 진공 상태에서 37℃~45℃ 온도로 2~4시간 동안 중합 반응시켜 조직 중합체(polymerization)를 제조한다.
조직 중합체 제조를 위해 먼저 고정액이 침투된 조직을 오일 내에 첨가하여, 오일 내에서 친수성 성분끼리 모이려는 성질을 이용하여 조직 내 침투시킨 고정액이 조직 안에서 보다 효과적으로 모이게 한 상태로 겔 중합반응을 시킴으로써, 조직의 형태 뿐만 아니라 조직 내 단백질 및 세포외기질의 성분이 그대로 보존될 수 있도록 하였다.
조직 내에 침투된 아크릴아마이드를 포함한 고정액은 최대한 조직 밖으로 나오지 않고 그 자리에서 중합되어야 조직의 구성 성분을 잘 보존할 수 있으므로, 고정액을 침투시킨 조직이 어떠한 환경 하에서 중합되는지는 온전한 조직형태가 보존된 탈세포 지지체를 제조에 매우 중요한 요소라고 할 수 있다.
그런데 중합체의 제조가 친수성 환경에서 진행될 경우, 삼투현상에 따라 고정액이 다시 조직 밖으로 이동되며, 동일 구성의 고정액 내에서 조직을 중합할 경우 조직 뿐만 아니라 고정액 전체가 하나의 큰 겔로 형성될 수 있어 조직만을 추출하는데 번거로움이 발생한다.
그러나 본 발명과 같이 고정액이 침투된 조직의 중합체 제조를 오일 내에서 처리할 경우, 상기와 같은 문제점을 해소시킬 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 오일은 생체 무해한 오일이라면 모두 사용가능하며, 구체적으로 이에 제한되지는 않으나 옥수수유, 올리브유 또는 미네랄오일을 사용할 수 있다.
조직 중합체의 형성 원리는, 고정액에 함유된 아크릴아마이드 단량체가 선형 구조로, 비스-아크릴아마이드 단량체가 아크릴아마이드 선형구조 사이에 짧게 중합되어 메쉬(mesh) 형태를 형성하도록 하고, 또한 열 개시제(thermal initiator)가 37℃ 이상의 온도가 되면 크로스링커(crosslinker)로 작용하게 되어 겔 형태의 중합체가 형성되어 진다. 중합체 형성에 따른 원리는 도 1에 나타내었다.
조직 중합체의 제조가 완료되면, 이후 조직 중합체를 계면활성제 용액에 첨가하고 전기영동 또는 물리적 교반을 통해 탈세포화 하여 본 발명에 따른 조직재생용 탈세포 지지체를 제조한다. 바람직하게는 전기영동을 통해 탈세포화 한다.
본 발명의 방법을 통해 젤이 중합되어 구조가 효과적으로 유지된 조직 중합체는 계면활성제를 사용하여 지질을 제거하는 조직투명화 기법으로 탈세포화 할 수 있다. 탈세포 속도는 계면활성제의 농도에 비례하지만, 고농도의 계면활성제를 사용할수록 유실되는 성분이 많고 너무 저농도의 계면활성제를 사용하면 탈세포 효율이 미비한 단점이 있다. 이러한 점을 고려하여 본 발명에서는 뇌조직과 같은 연한 조직의 탈세포화를 위해서는 3~5wt%의 SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 4wt%의 SDS를 사용하였다.
본 발명의 탈세포화는 전기영동 또는 물리적 교반을 통한 조직투명화 방법을 적용할 수 있는데, 조직투명화에서는 조직-하이드로겔 복합체로부터 계면활성제인 SDS(Sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 전기장 안에서 또는 물리적으로 교반하여 지방을 제거한다.
본 발명의 일실시예에서는 4% SDS 용액을 사용하였는데, 일반적인 탈세포에 사용하는 1% SDS 보다 농도가 높아 탈세포가 효과적이며, 전기장 안에서 전기영동과 병행할 경우 시간을 단축시킬 수 있어 높은 생산성을 도출할 수 있는 효과가 있다.
상기 탈세포화 과정을 위해 전기영동을 수행할 경우, 상기 전기영동은 1.2Å으로 37℃에서 수행할 수 있고, 상기 물리적 교반을 수행할 경우에는 37℃에서 200~300rpm으로 2~3일 동안 교반기로 교반하여 수행할 수 있으며, 탈세포화의 시간은 조직의 크기에 따라 적절하게 변경할 수 있다.
본 발명에 따른 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 추출하기 위해 상기와 같이 탈세포화된 조직 지지체를 수득한 다음에는, 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 세포외 기질을 추출한다.
먼저, 상기 RIPA 용액의 처리는 1~2%(w/v)의 RIPA 용액을 상기 탈세포화된 조직 지지체에 첨가하고 균질화시킨 후, 4°C에서 18~24시간 동안 반응시켜 수행한다. RIPA 용액은 세포 혹은 조직에서 용해물을 얻기 위하여 사용하는 다른 종류의 용해액(lysis solution)에 비해 이온성 및 비이온성 계면활성제를 모두 함유하고 있어서 탈세포화 과정에 사용된 SDS에 의해 용해되지 않은 잔존성분을 탈세포화된 조직에서 분리하는데 적합하다. 이러한 RIPA 용액의 처리에 의해 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 균질화시켜 세포외 기질의 용해물을 수득할 수 있고 또한 세포외 기질과의 결합 단백질들을 제거할 수 있다.
RIPA 용액 처리로 수득한 세포외 기질의 용해물은 이후 원심분리를 수행하여 상층액을 얻는다.
이후, 상기 수득한 상층액은 탈염 컬럼을 이용하여 탈염(desalting) 처리한다.
그런 뒤, 탈염 처리된 상기 상층액에 PNGase F(20ug 용해물에 1unit 사용)를 첨가하고 37°C에서 2~6시간 동안 반응시켜 탈당화 과정을 수행한다. 주로 세포외 기질 단백질들은 많은 N-링크결합 올리고 당화된 단백질로 알려져 있고, 다른 세포외 기질 단백질과의 수많은 당화사슬 망을 이루어 복잡한 구조를 이루고 있다. 따라서 PNGase F는 많은 당단백질의 N-결합 올리고당(oligosaccharides)을 절단하여 세포외 기질 성분들만 아니라 이들과 결합된 단백질들도 쉽게 다량으로 분리 및 수득할 수 있다.
RIPA 용액 및 PNGase F를 처리하여 수득한 탈세포 조직 지지체의 용해물은 다음으로 세포외 기질 단백질의 농축 및 분리를 위해 콘카나발린 A(concanavalin A)를 처리한다.
콘카나발린 A(concanavalin A)는 당단백질의 고체상 고정이 필요한 응용 분야, 특히 기존의 공유 결합으로 고정하기 어려운 응용 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에서는 콘카나발린 A를 상기 탈세포 조직 지지체의 용해물에 처리하여 탈세포 조직 용해물로부터 콘카나발린 A와 결합된 세포외 기질 단백질을 분리 및 농축하였다.
바람직하게는 콘카나발린 A를 레진으로 이용한 풀 다운(pull down) 방법을 수행하여 세포외 기질을 분리할 수 있다.
콘카나발린 A는 당 사슬과 특이적 결합을 하는 특성을 갖는데, 세포외 기질은 당단백질인 콜라겐과 프로테오글리칸 및 다당류로 구성되어 있어, 콘카나발린 A를 이용함으로써 세포외 기질에 함유된 N-링크된 당 단백질과의 특이적 결합을 통해 용이하게 세포외 기질을 분리 및 추출할 수 있도록 하였다.
구체적으로, 상온에서 1.5mg의 용해물과 50% 콘카나발린 A 레진 200ul 를 혼합한 후, 회전자를 이용하여 1시간동안 반응을 시킨다음 원심분리를 수행하여 상기 레진에 결합한 세포외 기질 성분이외의 상층액은 제거한다.
이후 상기 레진에 결합된 세포외 기질 성분들은 추출버퍼를 첨가하여 상온에서 5분간 반응 후 원심분리를 수행하여 세포외 기질 성분을 함유한 상층액을 수득한다.
이와 같이, 탈세포화된 조직 지지체를 대상으로 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리함으로써, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 모두 처리하여 추출한 세포외 기질 추출물; 우레아(Urea) 단독 처리 후, 가열을 통한 종래 추출방법으로 추출한 세포외 기질 추출물; 및 본원발명의 방법에서 PNGase F의 처리 없이 추출한 세포외 기질 추출물에 대해 SDS-PAGE 전기영동과 실버 염색을 수행하여 세포외 기질의 추출 수준을 비교하였는데, 그 결과 본 발명의 방법이 가장 많은 양의 세포외 기질을 추출할 수 있는 것으로 나타났다.
즉, RIPA 용액 단독 또는 우레아(Urea) 단독의 처리만으로는 탈세포 조직 지지체로부터 세포외 기질의 추출이 충분히 추출되지 않는 것으로 나타났고, 상당량이 손실되는 것으로 나타났다.
또한, 각기 다른 방법으로 추출된 세포외 기질 단백질의 전기영동 분석결과, 본 발명의 방법으로 추출된 군이 다른 군에 비해 가장 많은 수의 단백질 밴드를 확인할 수 있었고, 단백질의 양도 가장 많은 것으로 나타났으며, 추출된 단백질이 밴드 형태로 분리될 수 있어 세포외 기질 단백질 동정도 가능할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 세포외 기질 단백질로 잘 알려진 콜라겐 I, 콜라겐 IV 및 Lamin 단백질을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과, 본 발명의 방법으로 추출된 군이 다른 방법으로 추출된 군에 비해 세포외 기질 단백질이 월등히 많이 존재하는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명은 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 포함하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질 추출용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 추출하기 위한 시약 조성물로 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된, 마트리좀(matrisome) 형태의 세포외 기질 관련 단백질을 포함하는 세포외 기질을 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 방법으로 추출된 탈세포화된 뇌조직 유래의 세포외 기질을 분석하기 위해 LC-MS/MS 분석을 수행하였는데, 그 결과, 세포외 기질 및 다수의 세포외 기질 관련 단백질들이 함께 추출되어 동정됨을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명은 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질을 이용한 질환의 진단 또는 치료를 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
최근들어 세포외 기질과 각종 질병과의 관련성이 있음이 보고되고 있고, 질병의 발병에 따른 세포외 기질의 구조 변화 또는 성분 변화 등이 보고되면서 질병의 병리기전 및 치료제 개발의 새로운 타겟으로 세포외 기질이 주목을 받고 있다.
이러한 점에서 본 발명에 따른 세포외 기질의 추출방법 및 상기 방법으로 추출된 세포외 기질은 다양한 질환의 연구를 위한 용도로 사용될 수 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질을 이용한 질환의 진단 또는 치료를 위한 정보제공방법은, (1) 개체로부터 분리된 병변부위의 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계; (2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 상기 병변부위로부터 세포외 기질을 추출하는 단계; 및 (3) 정상 대조군의 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질과 상기 (2) 단계의 병변부위로부터 추출한 세포외 기질을 비교 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에서 (3) 단계의 분석은, 세포외 기질 관련 단백질의 발현수준 또는 단백질 변형(Protein Modification) 또는 단백질 이동에 대한 변화여부 등을 확인함으로써 질병과의 관련성을 분석할 수 있다.
예컨대, 정상군과 질병군 유래의 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 각 세포외 기질 및 세포외 기질 관련 단백질을 비교분석하여, 질병 특이적 변화를 보이는 세포외 기질 단백질들을 질병 진단을 위한 마커로 사용할 수 있으며, 또는 후보 약물 처리 시 세포외 기질의 구조 또는 성분이 정상군에 가깝게 회복되어 질 경우, 상기 후보 약물을 질병 치료제로 판단하여 치료제 스크리닝 분야에도 활용될 수 있다.
본 발명의 방법으로 추출할 수 있는 상기 세포외 기질은 체내 각종 조직으로부터 추출할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되지는 않으나, 뇌 조직, 간 조직, 폐 조직, 위 조직, 근육 조직, 신장 조직, 또는 췌장 조직일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실험방법>
실험동물 준비
모든 동물실험은 한국뇌연구원(IACUC-19-00012)에서 제정한 승인된 동물 프로토콜 및 지침사항에 따라 수행하였다. C57BL/6J WT 마우스는 Jackson 연구소로부터 구입하였고, 배아 18.5일(E18.5), 출생 후 1일(P1), 출생 후 5일(P5) 및 12주령의 마우스를 사용하였다. 마우스는 주변 온도 22°C, 상대 습도 40 ± 5% 및 12시간 주기의 명암 조건에서 특정 병원체 없는 시설에서 사육하였고, 먹이와 물을 임의로 제공하였다.
탈세포화 및 중합체 제조
뇌 조직의 탈세포화는 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 수행하였다. 구체적으로 뇌 조직을 E18.5, P1, P5 및 12주령의 마우스로부터 각각 추출한 후, 각각의 뇌 조직을 20% 아크릴아미드, 0.1% 비스-아크릴아미드, 0.25% 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판] 디히드로클로라이드(VA-044)를 함유하는 하이드로겔 단량체 용액에서 배양하였다. 이후 중합개시제인 0.01% 아지드화나트륨을 인산완충식염수(PBS)에 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 그런 뒤 O-CASPER(Oil-Based Clinically and Experimentally Applicable Acellular Tissue Scaffold Production for Tissue Engineering and Regenerative Medicine)화를 위해 하이드로겔이 주입된 뇌를 X-Clarity 중합 시스템(Logos Biosystems, Korea)을 사용하여 옥수수유(corn oil; Merck사 제품)에서 37°C의 온도로 2시간 동안 중합반응 시킨 후, 4% SDS 용액에서 37°C에서 교반하였다. 이후, 탈이온수로 밤새도록 실온에서 세척한 다음, 중합된 뇌를 전기영동 조직 탈세포화 챔버(electrophoretic tissue decellularization chamber)에 넣고 크기에 따라 적절한 시간 동안 37℃에서 1.2A의 전기영동을 통해 탈세포화된 뇌조직 중합체를 제조하였다. 상기 기술된 전반적인 과정은 도 1에 나타내었다.
또한 본 발명의 실험에서 대조군으로는 상기 기술된 방법에서 옥수수유를 사용하지 않고 제조된 탈세포화된 뇌조직 중합체를 사용하였다. 이와 관련하여 도 2의 A는 옥수수유를 처리한 군과 처리하지 않은 군의 뇌조직 탈세포화 과정을 나타낸 것이고, B는 옥수수유를 처리하여 제조된 뇌조직 중합체를 37°C에서 교반하거나 전기영동을 수행하여 제조된 탈세포화된 뇌조직 중합체(탈세포화된 뇌 지지체)의 투명화 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
세포외 기질(ECM)의 분리
상기 방법으로 수득한 탈세포 뇌 지지체로부터 ECM 관련 단백질인 matrisome을 포함하는 세포외 기질을 다음과 같은 방법으로 분리하였다. ECM의 분리를 위해, 탈세포화된 뇌 지지체를 1% RIPA 용액 또는 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Fisher)을 포함하는 3M Urea 용액으로 균질화시키고, 4°C에서 24시간 동안 반응시키거나 또는 2시간 동안 가열하였다. 이후 4°C에서 20분 동안 12,000 x g에서 원심분리하였고 상층액을 수집하였으며, 스핀 탈염 컬럼(Pierce)을 이용하여 탈염을 수행하였다. 후속 실험에서는 탈염된 샘플만 사용하였다. 또한 상기 1% RIPA 용액을 이용하여 수득한 RIPA 용해물의 원심분리 상층액에는 PNGase F를 첨가하고 37°C에서 4시간 동안 반응시켰다. RIPA 및 PNGase F를 처리하여 수득한 탈세포 뇌 지지체의 용해물을 LC-MS/MS로 분석하였다. 상기 RIPA 및 PNGase F를 처리하여 수득한 탈세포 뇌 지지체의 용해물로부터 ECM 단백질의 농축을 위해 콘카나발린 A(concanavalin A)를 이용하여 풀 다운(pull down)을 수행하였다. 상기 콘카나발린 A를 이용한 풀 다운은 Glycoprotein Isolation Kit(Pierce)를 이용하여 수행하였는데, 즉, 1-1.5mg의 총 단백질을 포함하는 탈세포 뇌 지지체의 용해물을 5X 결합/세척 버퍼 스톡용액으로 4:1의 비율로 희석하고, 콘카나발린 A를 레진으로 사용하는 튜브의 컬럼에 희석된 시료를 첨가하고, 원심분리 및 세척을 반복하였고, 용출버퍼로 탈세포 뇌 지지체로부터 본 발명에 따른 세포외 기질(ECM)을 추출하였다.
쿠마시에(Coomassie) 염색 및 실버(Silver) 염색
단백질 분석을 위해 쿠마시에(Coomassie) 및 실버(Silver) 염색을 수행하였다. 이를 위해, 전기영동된 겔을 50%(v/v) 에탄올 및 10%(v/v) 아세트산을 포함하는 겔 고정 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. HPLC 등급용 물로 세척한 후, 제조사의 지침에 따라 Imperial™ 단백질 염색(Pierce) 및 Pierce™ Silver 염색 키트(Pierce)로 쿠마시에(Coomassie) 및 실버(silver) 염색을 각각 수행하였다. 모든 염색된 겔은 겔 분해(in gel digestion)를 수행할 때까지 4°C에서 5% 아세트산 용액에 보관하였다. 겔 이미지는 LAS 4000 이미징 시스템(Fujifilm)을 사용하여 확보하였다.
LC-MS/MS 분석
LC-MS/MS 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 단백질 시료를 전기영동시켜 염색한 겔을 탈색시키고 아세틸화된 단백질 밴드를 10mm 크기로 절단하여 나누고, 트립신을 처리하여 겔 내에 존재하는 단백질 분해를 수행하였다. 트립신 분해물은 Thermo Scientific사의 Acclaim PepMap™ 100 역상 펩티드 트랩(내경- 75μm, 길이- 2 cm) 및 PepMap™ RSLC C18 역상 분석 컬럼(내경- 75 μm, 길이- 15 cm, 입자 크기- 3 μm) 이용하여 자동 샘플러가 장착된 Thermo Scientific Easy Nano LC 1200 울트라-고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 통해 역상 크로마토그래피로 분리하였고, 분리된 분해물은 300 nl/min의 유속으로 전자분무 이온화시켰다. 크로마토그래피 시스템은 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기와 연결되어 있으며, 획득한 스펙트럼은 SEQUEST 기반 검색 알고리즘과 함께 Proteome Discoverer Sorcerer 2.2를 사용하여 UniProt 마우스 데이터베이스에 대해 검색을 수행하였다. 또한 동정된 단백질은 Scaffold 4 Q+S를 사용하여 비교분석하였다.
웨스턴 블럿
단백질 농도는 비신코닌산 분석(bicinchoninic acid assay, Pierce사)으로 측정하였다. 단백질 샘플은 8-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 전기영동하여 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(Millipore)으로 이동시켰다. 이후 막을 5% 탈지유로 1시간 동안 차단한 다음, Abcam에서 구입한 콜라겐 I(ab270993) 및 IV(ab227616)에 대한 항체와 시그마에서 구입한 라미닌(L9393)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. LAS 4000 이미징 시스템(Fujifilm)을 사용하여 웨스턴 블롯의 이미지를 얻었다.
<실시예 1>
오일 기반의 탈세포화 방법으로 제조된 탈세포 뇌 지지체의 형태 분석
먼저 본 발명자들은 오일(옥수수유)을 기반으로 하는 상기 실험방법에 기재된 뇌 조직의 중합 및 탈세포화 방법으로 수득한 탈세포화된 뇌조직의 형태를 분석하였다. 도 1은 본 발명에서 마우스의 뇌 조직을 탈세포화하는 전반적인 과정을 나타낸 것이며, 여기서 비교를 위한 대조군으로는 오일을 처리하지 않고 탈세포화한 뇌 조직을 사용하였다.
탈세포화된 뇌 조직(탈세포화된 뇌 지지체)분석 결과, 오일을 이용한 중합과정 없이 탈세포화시킨 뇌 조직은 탈세포화 과정에서 쉽게 손상되거나 크기가 현저하게 감소하여 뇌 조직의 형태가 상당히 손상되어 있는 것으로 나타났다. 한편, 본 발명의 방법에 따라 오일로 중합된 탈세포화된 뇌 조직은 형태의 특별한 손상 없이 온전한 모양을 유지하는 것을 확인할 수 있었다(도 2A). 또한, 오일을 처리하여 중합반응 시킨 뇌조직 중합체를 전기영동 또는 물리적 교반을 수행하였고, 각각 제조된 탈세포화된 뇌 조직의 투명화 정도를 분석한 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 오일 처리 후, 물리적 교반 보다는 전기영동을 수행한 군이 더 투명해진 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 오일을 기반으로 하는 조직 중합 및 탈세포화 방법을 수행할 경우, 조직의 손상 없이 온전한 형태를 유지한 상태로 조직의 탈세포 지지체를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 2>
탈세포 뇌 지지체로부터 세포외 기질의 분리 확인
본 발명자들은 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 수득한 탈세포 뇌 지지체를 대상으로 앞서 실험방법에서 기재한 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 수득한 탈세포 뇌 지지체 유래의 세포외 기질의 성분을 분석하였다. 이때 상기 분석은 코마시에 및 실버 염색을 통해 수행하였다. 상기 과정은 도 3A에 나타내었다.
분석결과, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 탈세포 뇌 지지체 유래의 세포외 기질 성분들은 본 발명의 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)을 처리한 군이 오일 처리 없이 조직 중합 및 탈세포화 방법을 처리한 군에 비해 더 효과적으로 얻을 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 조직으로부터 풍부한 세포외 기질을 추출하기 위해서는 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법을 수행한 탈세포화 조직을 이용하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
<실시예 3>
RIPA, PNGase F 및 Concanavalin A 처리에 따른 탈세포 뇌 지지체로부터 효과적인 세포외 기질의 추출 확인
나아가 본 발명자들은 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 수득한 탈세포 뇌 지지체로부터 세포외 기질의 효과적인 추출을 위해, 앞서 실험방법에 기재된 바와 같이 탈세포화된 뇌 지지체에 RIPA, PNGase F및 Concanavalin A를 순차적으로 처리한 후, 수득한 세포외 기질 성분을 분석하였다. 이때 비교군으로는 PNGase F 처리 없이 RIPA 단독 처리 후, Concanavalin A를 처리하여 수득한 세포외 기질 추출물을 사용하였고, 또 다른 비교군으로는 종래 추출방법인 Urea 처리 후, 2시간 동안 가열하여 수득한 세포외 기질 추출물을 사용하였다(도 4A 참조). 상기 방법으로 추출된 세포외 기질 추출물은 실버 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, PNGase F 처리 없이 RIPA 단독처리 군 및 Urea 단독 처리 군은 RIPA, PNGase 및 Concanavalin A를 순차적으로 모두 처리한 군에 비해 탈세포화된 뇌 지지체로부터 세포외 기질의 추출 정도가 낮은 것으로 나타났고, 세포외 기질의 대표적인 성분으로 알려진 콜라겐 I, 콜라겐 IV 및 Laminin의 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과, 이들 단백질에 해당하는 밴드가 RIPA 단독처리 군 및 Urea 단독 처리 군에서는 없거나 매우 희미하게 나타난 반면, RIPA, PNGase F 및 Concanavalin A를 모두 처리한 군에서는 매우 뚜렷하게 높은 수준의 상기 단백질들의 밴드를 확인할 수 있었다(도 4C).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 수득한 탈세포 조직 지지체로부터 RIPA, PNGase F 및 Concanavalin A를 순차적으로 처리할 경우, 상기 탈세포 조직 지지체로부터 세포외 기질 및 세포외 기질 관련 단백질(matrisome)을 다량 추출할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
LC-MS/MS 분석을 통한 탈세포 뇌 지지체로부터 추출된 세포외 기질 성분의 확인
본 발명자들은 오일 기반의 조직 중합 및 탈세포화 방법(O-CASPER)으로 수득한 탈세포 조직 지지체로부터 RIPA, PNGase F 및 Concanavalin A의 순차적 처리에 의해 추출된 세포외 기질 성분들을 LC-MS/MS 분석으로 확인하였다.
LC-MS/MS 분석으로 동정된 단백질들은 Mascot로 검색하였고, Scaffold 4 Q+S로 검증된 단백질을 매트릭스 데이터베이스(http://matrisomeproject.mit.edu)를 사용하여 주석을 달았다.
하기 표 1은 본 발명의 방법으로 탈세포화된 뇌 지지체에서 일반적으로 확인되는 matrisome 단백질들을 나타낸 것이다. 이들은 ECM 당단백질, 콜라겐, 프로테오글리칸을 포함한 core matrisome 단백질과 ECM 관련 단백질, ECM 조절자 및 분비 인자를 포함한 matrisome 관련 단백질로 분류된다. core matrisome 단백질은 주로 라미닌 계열 단백질(Lama1, Lama2, Lama4, Lama5, Lamb1, Lamb2 및 Lamc1), 콜라겐 계열 단백질(Col1a2, Col4a1 및 Col4a2) 및 프로테오글리칸 계열단백질(Hapn1, Hapln4, Hspg2, Ncan 및 Vcan)이 포함된다. matrisome 관련 단백질에는 세마포린 7A(Sema7A), ERGIC-53(Lman1), 보체 C1q 하위 구성 요소 소단위 B(C1qb), 브레비칸(Bcan) 및 아넥신 계열 단백질(Anxa2, Anxa5 및 Anxa6)과 같은 ECM 관련 단백질이 포함된다. 뿐만 아니라 clade A(Serpin) 패밀리에 속하는 세린(또는 시스테인) 펩티다제 억제제 단백질(Serpinb6a), 셉틴 패밀리 단백질(Sept4, Sept5, Sept7, Sept8) 및 인터-알파-트립신 억제제 중쇄를 포함하는 ECM 조절제 H5(Itih5)도 포함된다.
본 발명의 방법으로 추출된 오일 기반의 중합 및 탈세포화된 뇌 지지체를 대상으로 RIPA, PNGase F 및 Concanavalin A의 순차적 처리에 의해 추출된 세포외 기질 성분들을 분석한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 많은 종류의 세포외 기질 관련 단백질들이 다량으로 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 다량 추출할 수 있음을 알 수 있었고, 본 발명의 방법으로 수득한 세포외 기질은 다양한 질병의 진단 및 치료제 발굴을 위한 연구에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (13)
- (1) 분리된 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계; 및
(2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 세포외 기질을 추출하는 단계를 포함하는,
탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (1) 단계의 탈세포화는,
(a) 탈세포 대상의 조직을 준비하고,
(b) 상기 탈세포 대상의 조직을 고정액에 첨가하여 상기 조직에 고정액을 침투시키고,
(c) 상기 고정액이 침투된 조직을 오일에 침지시키고 37℃~45℃의 온도로 2~4시간 동안 중합 반응시켜 조직 중합체(polymerization)를 제조하고, 및
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 조직 중합체를 계면활성제 용액에 첨가하고 전기영동하는 과정으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제2항에 있어서,
상기 고정액은 아크릴아마이드(acrylamide), 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 아조-개시제(azo-initiator) 및 PBS(Phosphate-buffered saline)로 구성된 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 조직은 뇌 조직, 간 조직, 폐 조직, 위 조직, 근육 조직, 신장 조직, 또는 췌장 조직인 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제1항에 있어서,
RIPA 용액의 처리는 1~2%(w/v)의 RIPA 용액을 상기 탈세포화된 조직에 첨가하고 균질화시킨 후, 4℃에서 18~24시간 동안 반응시켜 수행하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제1항에 있어서,
PNGase F 처리는 RIPA 용액 처리로 수득한 RIPA 용해물의 원심분리 상층액에 PNGase F를 첨가하고 37℃에서 2~6시간 동안 반응시켜 수행하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제1항에 있어서,
콘카나발린 A(concanavalin A) 처리는 RIPA 용액 및 PNGase F 처리로 수득한 탈세포 조직 용해물에 콘카나발린 A를 첨가하여 상기 탈세포 조직 용해물로부터 콘카나발린 A와 결합된 세포외 기질을 분리하는 것으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 콘카나발린 A와 결합된 세포외 기질을 분리하는 것은 콘카나발린 A를 레진으로 이용한 풀 다운(pull down) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - 제1항에 있어서,
RIPA 용액 처리로 수득한 RIPA 용해물은 PNGase F를 처리하기 전에 탈염(desalting) 처리하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질을 대량 추출하는 방법. - RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 포함하는,
탈세포화된 조직 지지체로부터 세포외 기질 추출용 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된, 마트리좀(matrisome) 형태의 세포외 기질 관련 단백질을 함유한 세포외 기질.
- (1) 개체로부터 분리된 병변부위의 조직을 탈세포화하여 탈세포화된 조직 지지체를 제조하는 단계;
(2) 상기 탈세포화된 조직 지지체에 RIPA 용액, PNGase F 및 콘카나발린 A(concanavalin A)를 순차적으로 처리하여 상기 병변부위로부터 세포외 기질을 추출하는 단계; 및
(3) 정상 대조군의 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질과 상기 (2) 단계의 병변부위로부터 추출한 세포외 기질을 비교 분석하는 단계를 포함하는,
탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질을 이용한 질환의 진단 또는 치료를 위한 정보제공방법. - 제12항에 있어서,
상기 (3) 단계의 분석은 세포외 기질 관련 단백질의 발현수준 또는 단백질 변형(Protein Modification) 또는 단백질 이동에 대한 변화여부를 분석하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 조직 지지체로부터 추출된 세포외 기질을 이용한 질환의 진단 또는 치료를 위한 정보제공방법.
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|---|---|---|---|---|
| US20160053231A1 (en) | 2013-04-10 | 2016-02-25 | Tufts University | Two and three dimensional decellularized ecm constructs and uses therefor |
| KR20210035149A (ko) | 2018-06-21 | 2021-03-31 | 연세대학교 산학협력단 | 탈세포화된 뇌조직 매트릭스 기반 뇌 오가노이드 배양용 조성물 및 이의 제조방법 |
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