KR20230028496A - 트러플 유래 감미 단백질 - Google Patents

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마리나 나달
안토니 제이. 클락
첸저위엔 구오
스테판 에이. 그라비나
안토니 웨스트게이트
바쌈 엘코타이니.
애슐리 한
브렌단 샤키
에반 스트라스버거
죠셉 메이렌
형 챵
알란 디. 한
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마이코테크놀로지, 인코포레이티드
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Abstract

새로 규명된 진균의 단맛 변형 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 cDNA가 기재되어 있다. 구체적으로, 단맛 활성화에 활성인 Myd 단백질 및 이를 코딩하는 cDNA가 이러한 cDNA를 분리하고 이러한 단백질을 분리 및 발현하는 방법과 함께 설명된다. 또한 본 발명의 단백질을 포함하는 감미 조성물의 용도 및 경구 투여용 제품에 개선된 풍미를 제공하는 방법이 개시되어 있다.

Description

트러플 유래 감미 단백질
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 2020년 6월 25일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/044,245의 우선권을 주장하며, 이는 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
본 명세서와 동시에 제출되고 다음과 같이 확인된 컴퓨터 판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록이 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다: 2021년 6월 25일에 생성된 "338820_640_30A_WO_ST25.TXT"라는 이름의 86,678바이트 ASCII(텍스트) 파일 1개.
영양 감미료의 과잉 섭취는 오랫동안 비만, 심장 질환, 대사 장애 및 치아 문제와 같은 식이 관련 건강 문제와 관련되어 왔다. 따라서 소비자들은 식단에서 영양 감미료의 양을 줄이는 방법을 점점 더 찾고 있다. 제조업체는 영양 감미료의 바람직한 맛과 기능적 특성을 더 잘 모방할 수 있는 영양 감미료의 대체물을 개발함으로써 이러한 요구에 대응하고 있다.
바람직하게는 높은 설탕 소비의 부정적인 영향(예, 당뇨병 및 비만)을 제한하기 위해 천연 공급원에서 추출한 제로 또는 저칼로리 감미료가 요구된다. 일반적으로 알려진 제로 또는 저칼로리 감미료에는 아스파탐, 아세설팜 칼륨, 루오 한 궈(몽크) 과일 추출물, 네오탐, 사카린, 스테비아 및 수크랄로스가 포함된다. 그러나 이러한 감미료에는 쓴맛과 같은 미각 결함이 있다.
트러플은 Pezizomycetes 목 Pezizales 강에 속하는 속을 포함하는 일부 자낭균류의 지하 자실체이다. 트러플은 외생균근균이므로 일반적으로 나무 뿌리와 밀접하게 연관되어 발견된다.
지금까지 브라제인(brazzein), 타우마틴(thaumatin), 모넬린(monellin), 커쿨린(curculin), 마빈린(mabinlin), 미라쿨린(miraculin) 및 펜타딘(pentadin)과 같은 7가지 단맛과 맛을 조절하는 단백질이 알려져 있다. 생물학적 활동을 담당하는 단백질 표면의 핵심 잔기는 아직 이러한 단백질에 대해 확실하게 확인되지 않았다. 모넬린은 몰 기준으로 수크로스 보다 10만 배 더 달고, 그 다음으로 그램 기준으로 수크로스 보다 500배, 3000배 더 센 브라제인과 토마틴이 그 뒤를 이었다. 이 모든 단백질은 열대 우림에서 자라는 식물에서 분리되었다. 이들 대부분은 서열 상동성이나 구조적 유사성을 공유하지 않지만 타우마틴은 다른 식물에서 발견되는 특정 달지 않은 단백질과 단백질 서열 수준에서 광범위한 유사성을 공유한다. 단맛을 조절하는 단백질은 균류에서 알려져 있지 않다.
천연 소스로부터 개선된 맛을 갖는 새로운 저칼로리 또는 제로 칼로리 감미료를 생산하기 위한 요구가 당업계에 남아있다. 당업계에서는 감미 조성물의 잠재적 공급원, 특히 자낭균류 진균 종으로부터 이러한 감미 조성물을 경제적으로 생산할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 새롭게 확인된 진균 유래 감미 단백질, 및 본원에서 MYD/Myd라고도 불리는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 cDNA에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 새롭게 확인된 감미 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 cDNA, 및 이러한 단백질, 유전자 및 cDNA를 식품의 맛 조절에 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 본원에서 MYD1로 확인된 신규 감미 단백질 및 해당 폴리펩티드 Myd1(마이코둘세인으로도 지칭됨)을 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. Myd1은 균류에서 확인된 최초의 감미 단백질이다. Myd1은 음식과 음료의 신맛, 쓴맛 또는 떫은맛을 감소시키며, 추가적으로 Myd1은 음식과 음료의 맛을 향상시키는 활성, 즉 맛을 조절하는 활성을 갖는다.
본 발명은 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드)를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 (a) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 및 SEQ ID NO:75로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열; (b) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및 (c) 24개 이하의 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 부가에 의해 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열로부터 변형된 폴리펩티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
하나의 양태에서, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 폴리펩티드 서열, 또는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 또 다른 양태에서, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니다.
또 다른 양태에서, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1-11, 17-32, 39, 40, 45-67, 73-100 및 110-121을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 적어도 하나의 치환 변형을 갖는 SEQ ID NO:2에 제시된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b) SEQ ID NO:2에 기재된 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 폴리뉴클레오티드가 아니다), 및 (c) (i) SEQ ID NO:2에 기재된 핵산 서열 및 (ii) 히스티딘 태그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다);로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드(예, 단리된 폴리뉴클레오티드)를 제공한다.
하나의 양태에서, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 또는 SEQ ID NO:75를 포함한다. 특히, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, 또는 SEQ ID NO: 68을 포함한다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO; 63, SEQ ID NO: 65, 또는 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열을 포함한다.
단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 임의로 이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 추가로 또는 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질 태그 또는 라벨을 추가로 코딩한다. 단백질 태그는 선택적으로 친화성 태그이다. 상기 단백질은 임의로 히스티딘 태그이다.
하나의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 E. coli에서 His 태그가 부착된 마이코둘세인에 대한 코딩 서열에 해당하는 SEQ ID NO: 20을 포함한다(여기서 잔기 364-381은 선택적 His 태그 서열에 해당함). SEQ ID NO: 20은 E. coli에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 S. cerevisiae에서 His 태그가 부착된 마이코둘세인에 대한 코딩 서열에 해당하는 SEQ ID NO: 22를 포함한다(여기서 잔기 364-381은 임의의 His 태그 서열에 해당함). SEQ ID NO: 22는 S. cerevisiae에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. SEQ ID NO: 21의 상응하는 폴리펩티드는 His-태그된 마이코둘세인 단백질(여기서 잔기 122-127은 임의의 His 태그 서열에 상응함)에 상응하며, 이 폴리펩티드 서열은 E. coli 및 S. cerevisiae에서의 발현에 대해 동일하다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 발현 카세트 뿐만 아니라 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 단맛 조절 활성을 갖는 단백질을 생산하는 조건 하에서 숙주 세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 단맛 조절 활성을 갖는 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17으로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드(예, 단리된 폴리펩타이드)를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 하나의 치환 또는 변형을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 임의로 단백질 태그, 특히 히스티딘 태그를 추가로 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다.
하나의 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니다.
또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1-11, 17-32, 39, 40, 45-67, 73-100 및 110-121을 포함한다.
하나의 양태에서, 폴리펩티드(예, 단리된 폴리펩티드)는 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 및 SEQ ID NO:75로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3이 아니다. 특히, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, 또는 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 (a) 경구 투여용 제품(여기서, 상기 제품은 마티로로마이세스 테르페지오이데스(Mattirolomyces terfezioides) 트러플이 아님), 및 (b) 폴리펩티드를 포함하는 감미 조성물의 조합(여기서, 상기 조합은 경구 투여용 제품에 비해 단맛이 강화됨)을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖고, 상기 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 하나의 치환 변형을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 선택적으로 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니며, 상기 폴리펩티드는 임의로 히스티딘 태그를 추가로 포함하며, 상기 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다. 예를 들어, 감미료 조성물 내의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 또는 SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, 또는 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 감미 조성물을 제공한다. 여기서 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드이다.
본 발명은 경구 투여용 제품을 유효량의 폴리펩티드를 포함하는 감미 조성물과 조합하는 단계를 포함하는, 경구용 제품의 맛을 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 경구 투여용 제품은 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플이 아니며, 상기 조합은 경구 투여용 제품에 비해 단맛이 강화된다. 하나의 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖고; 여기서 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 하나의 치환 변형을 임의로 포함하며, 상기 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니고, 상기 폴리펩티드는 임의로 히스티딘 태그를 추가로 포함하며, 상기 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다. 예를 들어, 감미료 조성물 내의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 또는 SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 포함하고 임의로 SEQ ID NO:3으로 구성되지 않는다. 특히, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, 또는 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함한다.
경구 투여용 제품은 식품, 음료, 식이 보충제 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다. 식품의 예로는 제과; 감미 베이커리 제품, 감미 베이커리 제품을 준비하기 위한 미리 만들어진 감미 베이커리 믹스; 파이 필링 및 기타 감미 필링, 젤라틴 및 푸딩; 냉동 디저트; 요거트; 스낵 바; 빵 제품; 빵 제품을 준비하기 위한 미리 만들어진 빵 믹스; 소스, 시럽 및 드레싱; 감미 스프레드; 제과 제품; 및 가당 아침 시리얼을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 음료 제품의 예로는 탄산 음료; 무탄산 음료; 및 음료 농축액으로 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 얻는 단계, 및 (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 조성물을 정제하는 단계를 포함하는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖고; 상기 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 하나의 치환 변형을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니며, 상기 폴리펩티드는 임의로 히스티딘 태그를 추가로 포함하고, 상기 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다. 예를 들어, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 또는 SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 SEQ ID NO:3으로 구성되지 않는다. 특히, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66 또는 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태 및 실시예는 본 명세서의 도면, 상세한 설명 및 비제한적인 예를 검토하면 명백해질 것이다.
따라서 본 발명은 단맛을 조절할 수 있는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자 및 이들이 코딩하는 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 단독으로 또는 식품, 음료, 식이 보충제 또는 약제와 함께 단맛 인식을 매개한다. 본 발명은 또한 단맛을 변형시킬 수 있는 단리된 폴리펩티드, 및 식품, 음료, 식이 보조제, 또는 약학적 조성물과 함께 단맛을 갖는 생성된 조합물의 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 사용하여 식품, 음료, 식이 보충제 또는 약학적 조성물의 단맛을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본원에서 Myd1이라 명명된 새로 동정된 진균 감미 단백질이 제공된다. 용어 "Myd 폴리펩티드"는 예를 들어, SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며 또한 단맛 변형 활성을 갖는 본 발명에 따른 임의의 폴리펩티드를 확인하기 위해 본원에서 사용된다. Myd 폴리펩티드는 또한 단맛 변형 활성을 갖는 펩티드 SEQ ID NO:8 내지 SEQ ID NO:17을 포함한다. M. 테르페지오이데스 글레바의 단맛이 나는 부분적으로 정제된 추출물을 20-mer N-말단 서열(SEQ ID NO:4)을 확인하기 위해 de novo 아미노산 시퀀싱하였다. M. 테르페지오이데스 글레바의 전체 전사체가 RNAseq 판독을 사용하여 de novo 조립된 후 Myd1 코딩 서열(추정적으로 MYD1 유전자에서 파생됨)이 확인되었다. 20-mer N-말단 서열을 사용하여 M. 테르페지오이데스 전체 전사체를 스크리닝하여 N-말단에서 100% 동일성을 갖는 단백질을 코딩할 것으로 예상되는 전사물을 확인하였다. 식별된 전사물은 121개의 아미노산 단백질을 코딩하는 것으로 예측된다. 이 방법으로 SEQ ID NO:1을 확인하였다. 개시 및 정지 코돈을 전사물에서 확인하여 추정되는 코딩 서열 SEQ ID NO:2를 확인하였다. SEQ ID NO: 3은 121개의 아미노산 단백질인 추정 단백질이다. 예측된 단백질 SEQ ID NO:3과 GENBANK의 다른 단백질 서열 사이의 동일성은 31% 이하였다. E. coli 및 사카로마이세스 세레비시애에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 천연 마이코둘세인의 코딩 서열은 각각 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22의 핵산 서열에 해당한다 (임의의 6 잔기 히스티딘 태그를 갖는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열, 즉, SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 코딩함).
하나의 양태에서, 본원의 "Myd 폴리펩티드"는 추출에 의해 M. 테르페지오이데스 글레바로부터 분리된 자연 발생 Myd 폴리펩티드와 비교하여 적어도 10% 이상(예, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상)의 단맛 변형 활성을 갖는다. 다른 양태에서, 본원의 "Myd 폴리펩티드"는 추출에 의해 M. 테르페지오이데스 글레바로부터 분리된 자연 발생 Myd 폴리펩티드와 비교하여 적어도 50% 이상의 단맛 변형 활성을 갖는다. 하나의 양태에서, 본원의 "Myd 폴리펩티드"는 추출에 의해 M. 테르페지오이데스 글레바로부터 분리된 자연 발생 Myd 폴리펩티드와 비교하여 적어도 80% 이상의 단맛 변형 활성을 갖는다. 단맛 변형 활성은 당업계에 공지된 임의의 비교 방법, 특히 본원의 실시예에 기재된 임의의 방법, 보다 구체적으로는 본원에 기재된 바와 같은 감각 패널을 사용하는 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
임의의 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, Myd1은 단맛 활성화에 관여하는 것으로 여겨지며, 예를 들어 미각 1 수용체 2(T1R2) 및/또는 미각 1 수용체 3(T1R3)의 작용제이다. 하지만 Myd1은 쓴맛, 감칠맛, 신맛, 짠맛과 같은 다른 미각 수용체를 자극할 수 있다. 분리 또는 정제된 Myd 폴리펩티드는 식품 및 제약 산업에서 맛을 맞춤화하기 위해, 예를 들어 식품 또는 약물의 단맛을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예, 단리된 폴리뉴클레오티드)를 포함하며, 싱기 폴리펩티드 서열은 (a) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17에 기재된 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% (예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90% 이상, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 (c) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17에 기재된 아미노산 서열로부터 24개 이하(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 및 이의 임의의 범위) 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 첨가에 의해 변형된 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 이루어진다.
일부 구현예에서, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열, SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 24개 이하의 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 첨가에 의해 아미노산 서열 SEQ ID NO:3에서 변형된 아미노산이다.
특정 양태에서, 본 발명은 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예, 단리된 폴리뉴클레오티드)를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 (a) SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열; (b) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및 (c) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열로부터 24개 이하의 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 첨가에 의해 변형된 폴리펩티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하며, 여기서 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니다.
다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드(예, 단리된 폴리뉴클레오티드)를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 (a) 임의로 적어도 하나(예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 및 이러한 값의 범위)의 변형(예, 결실, 삽입, 치환 또는 추가)을 포함하는 SEQ ID NO: 2에 기재된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) SEQ ID NO: 2에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%(예, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90% 이상, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 임의로 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 폴리뉴클레오티드가 아니다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일 구현예에서, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드)를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 (a) 적어도 하나(예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 및 이러한 값의 범위)의 치환 변형이 있는 SEQ ID NO:2에 기재된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b) SEQ ID NO:2에 제시된 핵산 서열과 적어도 90%(적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 SEQ ID NO:2의 폴리뉴클레오티드가 아님), 및 (c) (i) SEQ ID NO:2에 기재된 핵산 서열 및 (ii) 히스티딘 태그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이루어지며, 상기 폴리뉴클레오티드는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 Myd를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, RNA 또는 인공 핵산의 형태일 수 있거나, cDNA 또는 어떠한 인트론도 포함하지 않는 화학적으로 합성된 DNA일 수 있다..
용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시-리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이 용어는 또한 합성 백본을 갖는 핵산 유사 구조를 포함한다(예를 들어, Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, ed. F. Eckstein, Oxford Univ. Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the N.Y. Academy of Sciences, Vol. 600, Eds. Baserga et al. (NYAS 1992); Milligan J. Med. Chem. 36:1923-1937 (1993); Antisense Research and Applications (1993, CRC Press), WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197 (1997); Strauss-Soukup, Biochemistry 36:8692-8698 (1997); Samstag, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 6:153-156 (1996) 참조).
달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예, 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 예를 들어 하나 이상의 선택된 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081). (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 같은 의미로 사용된다.
본 발명은 또한 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80%(예, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%)의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이루어지는 폴리펩티드(예, 단리된 폴리펩티드)를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 임의로 적어도 하나(예, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 및 이러한 값의 범위)의 변형(예, 결실, 삽입, 치환 또는 부가)을 함유하고, 여기서 폴리펩티드는 임의로 히스티딘 태그를 추가로 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다.
"본질적으로 구성된"이라는 용어는 고결방지제, 충진제, 안정제(열 안정제 등), 증량제(예, 말토덱스트로스, 아카시아 검 등) 등 제품의 기능이나 활동에 필수적이지 않고 기능이나 활동에 중대한 영향을 미치지 않는 성분을 포함하는 것을 허용한다.
폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 9에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 10에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 11과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 12와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 13과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 14와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 15와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 17과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다.
하나의 구현예에서, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된다. 하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드가 아니다.
하나의 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1-11, 17-32, 39, 40, 45-67, 73-100 및 110-121을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1-11, 17-32, 39, 40, 45-67, 73-100 및 110-121을 포함하나 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 아니다.
또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1-121을 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 12-16, 33-38, 41-44, 68-72, 또는 101-109에는 열거된 잔기의 SEQ ID NO: 3에 비해 적어도 1(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 또는 그 값의 범위)의 아미노산 치환, 추가, 삽입 또는 결실이 있다.
또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 1-121을 포함하는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 12-16, 33-38, 41-44, 68-72, 또는 101-109에는 열거된 잔기의 SEQ ID NO: 3과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 추가, 삽입 또는 결실이 있고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이종 신호 펩티드 또는 전이 펩티드에 융합된 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17에 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이루어지는 단맛 조절 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 포함한다. "본질적으로 구성된"이라는 용어는 고결방지제, 충진제, 안정제(열안정제 등), 증량제(예, 말토덱스트로스, 아카시아 검 등) 등 제품의 기능이나 활동에 필수적이지 않고 기능이나 활동에 중대한 영향을 미치지 않는 성분을 포함하는 것을 말한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3(또는 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 , SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17)에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%)의 서열 동일성을 갖고 SEQ ID NO 3(또는 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 , SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17)에 대해 적어도 하나의 치환 변형을 함유하는 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 이루어지는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 상응하는 아미노산과 비교하여 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 또는 121에서 1 내지 24개의 아미노산 치환을 포함한다. "본질적으로 구성된"이라는 용어는 고결방지제, 충진제, 안정제(열안정제 등), 증량제(예, 말토덱스트로스, 아카시아 검 등) 등 제품의 기능이나 활동에 필수적이지 않고 기능이나 활동에 중대한 영향을 미치지 않는 성분을 포함하는 것을 말한다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, 또는 SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 71(공통 서열 1)은 위치 3, 11-16, 26, 33, 34, 36-38, 41-43, 51, 57, 66, 68-72, 85, 86, 89, 97, 101-110, 117, 및 120이 임의의 아미노산인 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 3에 해당한다. 본 발명은 SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
SEQ ID NO: 72(공통 서열 2)는 위치 3, 11-16, 26, 33, 37, 38, 41, 43, 51, 57, 66, 68-70, 72, 85, 86, 89, 97, 101-103, 105-110, 117, 및 120이 임의의 아미노산인 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 3에 해당한다 (즉, SEQ ID NO: 3의 위치 34, 36, 42, 71 및 104에 있는 프롤린은 유지됨). 본 발명은 SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
SEQ ID NO: 73(공통 서열 3) 및 SEQ ID NO: 74(공통 서열 4)는 위치 3, 11-16, 26, 33, 37, 38, 41, 43, 51, 57, 66, 68-70, 72, 85, 86, 89, 97, 101-103, 105-110, 117, 및 120이 본원에 기재된 바와 같은 보존적 변형을 포함할 수 있다는 점을 제외하고 SEQ ID NO: 3에 해당한다. 본 발명은 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
SEQ ID NO: 75(공통 서열 5)는 위치 3, 11, 26, 51, 57, 66, 69, 85, 86, 89, 97, 103, 106, 110, 117, 및 120이 본원에 기재된 바와 같은 보존적 변형을 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 SEQ ID NO: 3에 해당한다. 본 발명은 SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
특정 양태에서, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 3의 잔기 3, 11, 26, 51, 57, 66, 69, 85, 86, 89, 97, 103, 106, 110, 117, 및 120에서 하나 이상(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16개)의 변형을 갖는 SEQ ID NO: 3을 포함한다. SEQ ID NO: 3(폴리펩티드에 대한)에 대한 예시적인 변형이 본원에 제시되어 있다(실시예 8; 표 3 참조). 예를 들어, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO; 64, SEQ ID NO: 66, 또는 SEQ ID NO: 68 또는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO; 64, SEQ ID NO: 66, 또는 SEQ ID NO: 68과 적어도 80% (예, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 24(D3E) 또는 SEQ ID NO: 24와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 26(K11R) 또는 SEQ ID NO: 26과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 30(K26R) 또는 SEQ ID NO: 30과 적어도 80% 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 38(K51R) 또는 SEQ ID NO: 38과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성은 SEQ ID NO: 42(R57K) 또는 SEQ ID NO: 42와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 44(R66K) 또는 SEQ ID NO: 44에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 46(D69E) 또는 SEQ ID NO: 46과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열 활성은 SEQ ID NO: 50(D85E) 또는 SEQ ID NO: 50과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 52(E86D) 또는 SEQ ID NO: 52와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 54(E89D) 또는 SEQ ID NO: 54에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 58(D97E) 또는 SEQ ID NO: 58과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 60(K103R) 또는 SEQ ID NO: 60과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 62(R106K) 또는 SEQ ID NO: 62와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열 조절 활성은 SEQ ID NO: 64(R110K) 또는 SEQ ID NO: 64와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 66(E117D) 또는 SEQ ID NO: 66과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 68(K120R) 또는 SEQ ID NO: 68과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다.
다른 양태에서, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO; 63, SEQ ID NO: 65, 또는 SEQ ID NO: 67 또는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO; 63, SEQ ID NO: 65, 또는 SEQ ID NO: 67과 적어도 80%(예, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23(D3E에 해당) 또는 SEQ ID NO: 23과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 25(K11R에 해당) 또는 SEQ ID NO: 25와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 29(K26R에 해당) 또는 SEQ ID NO: 29와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 37(K51R에 해당) 또는 SEQ ID NO: 37과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 41(R57K에 해당) 또는 SEQ ID NO: 41과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 43(R66K에 해당) 또는 SEQ ID NO: 43과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 45(D69E에 해당) 또는 SEQ ID NO: 45와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 49(D85E) 또는 SEQ ID NO: 49와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 51(E86D에 해당) 또는 SEQ ID NO: 51과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 53(E89D에 해당) 또는 SEQ ID NO: 53과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 57(D97E에 해당) 또는 SEQ ID NO: 57과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 59(K103R에 해당) 또는 SEQ ID NO: 59와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 61(R106K에 해당) 또는 SEQ ID NO: 61과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 63(R110K) 또는 SEQ ID NO: 63과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 65(E117D) 또는 SEQ ID NO: 65와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 67(K120R) 또는 SEQ ID NO: 67과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다.
하나의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 대장균에서 His 태그가 부착된 마이코둘세인의 코딩 서열에 해당하는 SEQ ID NO: 20을 포함한다 (여기서, 잔기 364-381은 선택적 His 태그 서열에 해당함). SEQ ID NO: 20은 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 S. 세레비시애(S. cerevisiae)에서 His 태그된 마이코둘세인의 코딩 서열에 해당하는 SEQ ID NO: 22를 포함한다 (여기서, 잔기 364-381은 선택적 His 태그 서열에 해당함). SEQ ID NO: 22는 S. 세레비시애에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. SEQ ID NO: 21의 해당 폴리펩티드는 His-태그된 마이코둘세인 단백질(여기서, 잔기 122-127은 임의의 His 태그 서열에 해당함)에 해당하며, 이 폴리펩티드 서열은 대장균 및 S. 세레비시애에서의 발현에 대해 동일하다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드도 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, 또는 SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, 또는 SEQ ID NO: 56과 적어도 80%(예, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28(R20K) 또는 SEQ ID NO: 28과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 32(E35D) 또는 SEQ ID NO: 32와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 34(K44R) 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 36(D46E) 또는 SEQ ID NO: 36과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 40(D52E) 또는 SEQ ID NO: 40과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 48(R75K) 또는 SEQ ID NO: 48과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 56(D94E) 또는 SEQ ID NO: 56과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다.
또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, 또는 SEQ ID NO:55, 또는 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, 또는 SEQ ID NO:55에 적어도 80%(예, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 27(R20K에 해당) 또는 SEQ ID NO: 27과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 31(E35D에 해당) 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 33(K44R에 해당) 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 35(D46E에 해당) 또는 SEQ ID NO: 35와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 39(D52E에 해당) 또는 SEQ ID NO: 39와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 47(R75K에 해당) 또는 SEQ ID NO: 47과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 55(D94E에 해당) 또는 SEQ ID NO: 55와 적어도 80%의 서열 동일성을 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 천연 발생 또는 비천연 발생(예를 들어, 합성, 재조합, 변형 및/또는 변이체 산물)일 수 있다. 하나의 양태에서, 천연 발생 또는 비천연 발생 산물은 분리 또는 정제된다.
하나의 양태에서, "단리된"이라는 용어는 생물학적 환경(예, 세포, 조직, 배양 배지, 체액 등)으로부터 제거되었거나 순도가 어느 정도로 증가된(예, 합성 배지에서 분리) 산물을 포함한다. 따라서 단리된 산물은 합성이거나 자연적으로 생산될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 때 자연적으로 발생하는 것과 상이한 정제 또는 농축의 상태를 의미한다. (1) 자연적으로 발생하는 다른 연관 구조 또는 화합물로부터의 정제, 또는 (2) 일반적으로 체내에서 연관되지 않는 구조 또는 화합물과의 연관을 포함하여 자연적으로 발생하는 것 보다 더 큰 정제 또는 농축 정도는 본원에서 사용된 "단리된"의 의미 내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "재조합"은 인비트로에서 합성되거나 달리 조작된 폴리뉴클레오티드(예, "재조합 폴리뉴클레오티드"), 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 유전자 산물을 생산하기 위해 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드("재조합 단백질")를 의미한다. "재조합 수단"은 또한 본 발명의 전좌 도메인 및 본 발명의 프라이머를 사용하여 증폭된 핵산 서열을 포함하는 융합 단백질의 발현, 예 유도적 또는 구성적 발현을 위한 발현 카세트 또는 벡터로의 다양한 코딩 영역 또는 도메인, 또는 상이한 소스로부터의 프로모터 서열을 갖는 핵산의 연결을 포함한다. .
"변형된" 또는 "변이체" 산물은 원래(예, 자연 발생) 구조에서 변경된 산물(예, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, 변이체는 각각 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 변화를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 변형에는 추가, 삭제, 삽입 및 치환을 포함하여 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 수정이 포함된다. 변형된 또는 변형된 산물은 또한 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 원래 구조에 비해 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "증폭하는" 및 "증폭"이라는 용어는 하기에 상세히 기재된 바와 같이 재조합 또는 자연적으로 발현된 핵산을 생성 또는 검출하기 위한 임의의 적합한 증폭 방법론의 사용을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명은 인비보 또는 인비트로에서 본 발명의 천연 발현(예, 게놈 또는 mRNA) 또는 재조합(예, cDNA) 핵산(예를 들어, 본 발명의 미각 자극-결합 서열)을 (예, 중합효소 연쇄 반응, PCR에 의해) 증폭하기 위한 방법 및 시약(예를 들어, 특정 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍)을 제공한다.
용어 "라이브러리"는 상이한 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 혼합물, 예컨대 축퇴 프라이머 쌍으로 핵산 증폭에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 Myd 관련 폴리뉴클레오티드의 라이브러리 또는 증폭된 리간드-결합 도메인을 포함하는 벡터의 분리된 집합체, 또는 MYD를 코딩하는 적어도 하나의 벡터로 각각 무작위로 형질감염된 세포의 혼합물인 제제를 의미한다.
본원에 사용된 "핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 화학 결합 유형을 통해, 일반적으로 상보적 염기쌍을 통해, 일반적으로 수소 결합 형성을 통해 상보적인 서열의 표적 핵산에 결합할 수 있는 핵산으로 정의된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 프로브는 천연(즉, A, G, C 또는 T) 또는 변형된 염기(7-데아자구아노신, 이노신 등)를 포함할 수 있다. 또한, 프로브의 염기는 혼성화를 방해하지 않는 한 포스포디에스테르 결합 이외의 결합에 의해 연결될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프로브는 구성 염기가 포스포다이에스터 결합이 아닌 펩티드 결합에 의해 연결된 펩티드 핵산일 수 있다. 프로브가 혼성화 조건의 엄격성에 따라 프로브 서열과 완전한 상보성이 결여된 표적 서열에 결합할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 프로브는 임의로 동위원소, 발색단, 발광단, 발색체와 같이 직접 표지되거나 스트렙타비딘 복합체가 나중에 결합할 수 있는 비오틴과 같이 간접적으로 표지된다. 프로브의 존재 또는 부재에 대해 검정함으로써, 선택 서열 또는 서브서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
핵산의 일부와 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 일반적으로 새로운 기능적 핵산, 예, 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 코딩 영역을 만들기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 갖는 재조합 방식으로 생성된다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 서브서열을 포함함을 나타낸다(예, 융합 단백질).
"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열의 배열로 정의된다. 본원에서 사용된 프로모터는 중합효소 II 유형 프로모터의 경우 TATA 요소와 같이 전사 시작 부위 근처에 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함하며, 이는 전사 시작 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼 위치할 수 있다. "구성" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건 하에서 활성화되는 프로모터이다. "조절" 프로모터는 환경 또는 발달 규제 하에 활성화되는 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터 또는 전사 인자 결합 부위 배열)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 상기 발현 제어 서열은 제2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 지시한다.
용어 "MYD 패밀리"는 약 25개 아미노산, 임의로 50-100개 아미노산의 윈도우에 걸쳐 SEQ ID NO:3에 대해 적어도 약 35 내지 50% 아미노산 서열 동일성, 임의로 약 60, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 천연 대립유전자, 돌연변이, 대립유전자 및 종간 상동체를 포함하는 다형성 변이체를 지칭할 수 있다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 카세트"는 원핵생물, 효모, 진균, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포를 포함하는 임의의 세포에서 구성적으로 또는 유도적으로 인비트로 또는 인비보에서 본 발명의 핵산 서열을 발현시키기 위한 임의의 재조합 발현 시스템을 지칭한다. 이 용어에는 선형 또는 원형 발현 시스템이 포함된다. 이 용어는 에피솜으로 남아 있거나 숙주 세포 게놈으로 통합되는 발현 시스템을 포함한다. 발현 시스템은 자기 복제 능력을 가질 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 즉, 세포에서 일시적인 발현만 유도할 수 있다. 이 용어는 재조합 핵산의 전사에 필요한 최소한의 요소만을 포함하는 재조합 표현 "카세트"를 포함한다.
"숙주 세포"는 발현 벡터를 함유하고 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지원하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵 세포, 또는 진핵 세포, 예컨대 효모, 곤충, 양서류, 또는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, HeLa, HEK-293 등, 예, 배양 세포, 외식편 및 인비보 세포일 수 있다. .
하나의 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 옥시토카, 아나에로바이오스피릴룸 숙시니시프로듀덴스, 악티노바실러스 숙시노게네스, 만헤이미아 숙시니시프로듀덴스, 리조비움 에틀리, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 글루코노박터 옥시단스, 자이모모나스 모빌리스, 락토코쿠스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 스트렙토마이세스 코엘리컬러, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 사카로마이세스 세레비시애, 쉬조사카로마이세스 폼베, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 아스페르길루스 테레우스, 아스페르길루스 나이거, 피키아 파스토리스, 리조푸스 아르히주스, 리조푸스 오리자에, 야로위아 리폴리티카, 칸디다 알비칸스, 이사첸키아 오리엔탈리스, 셰퍼소마이세스 스티피티스, 야로위아 리폴리티카, 오가타에아 폴리모르파, 파피아 로도자임, 칸디다 우틸리스, 아르술라 아데니니보란스, 데바리오마이세스 한세니이, 데바리오마이세스 폴리모르푸스 및 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스로 이루어진 군에서 선택된다.
또 다른 측면에서, 숙주 세포는 그람 양성 무포자 형성 박테리아, 그람 양성 포자 형성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 효모 및 원생생물/조류로 이루어진 군에서 선택된다.
그람 양성 무포자 형성 박테리아의 비제한적 예는 비피도박테리움 아델레스슨티스, 비피도박테리움 애니멀리스, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 롱검, 카르노박테리움 다이버젠스, 코리네박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 아밀로리티쿠스, 락토바실러스 아밀로보루스, 락토바실러스 애니말리스, 락토바실러스 알리멘타리우스, 락토바실러스 아비리에, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부크네리, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 셀로비오수스, 락토바실러스 콜리노이데스, 락토바실러스 코리니포르미스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 쿠르바투스, 락토바실러스 델브루에키, 락토바실러스 덱스트리니쿠스, 락토바실러스 디올리보란스, 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 갈리나룸, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 힐가르디, 락토바실러스 존슨니, 락토바실러스 케피라노파시엔스, 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 무코사에, 락토바실러스 파니스, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 파라파라기니스, 락토바실러스 파라플란타룸, 락토바실러스 펜토수스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 폰티스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 사케이, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 산프란시스센시스, 락토코커스 락티스, 류코노스톡 시트리움, 류코노스톡 락티스, 류코노스톡 메센테로이드, 류코노스톡 슈도메센테로이데스, 마이크로박테리움 임페리얼, 오에노코쿠스 오에니, 파스튜리아 니시자와에, 페디오코쿠스 아시디락트, 페디오코쿠스 파르불루스, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 프로피오니박테리움 아시디프로피오니, 프로피오니박테리움 프로이덴레이치이, 및 스트렙토코쿠스 써모필레스를 포함한다.
그람 양성 포자 형성 박테리아의 비제한적 예는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 아트로페우스, 바실러스 서쿨란스, 바실러스 클라우시이, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 플렉서스, 바실러스 푸시포르미스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 모자벤시스, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 스미시이, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 발레스모르티스, 바실러스 벨레젠시스, 지오바실러스 스테아로모필러스, 파에니바실러스 일리노이센시스, 및 파라게오바실러스 써모글루코시다시우스를 포함한다. 그램 음성 박테리아의 비제한적 예는 큐프리아비두스 네카토르, 글루코노박터 옥시단스, 코마가타에이박터 수크로페르멘탄스 및 크산토모나스 캄페스트리스를 포함한다.
효모의 비제한적 예는 칸디다 실린드라세아, 데바리오마이세스 한세니이, 한세니아스포라 우바룸, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 파피, 린드네라 자디니이, 오가타에아 앙구스타, 사카로마이세스 바야누스, 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 파스토리아누스, 쉬조사카로마이세스 폼베, 위커하모마이세스 아노말루스, 크산토필로마이세스 덴드로하우스, 야로위아 리폴리티카 및 지고사카로마이세스 루시이를 포함한다.
원생생물/조류의 비제한적 예는 아우란티오키트리움 리마시눔, 유글레나 박근 및 테트라셀미스 추이를 포함한다.
본원에 기재된 Myd 단백질은 또한 예시적인 서열에 실질적으로 상응하는 구조 및 활성을 갖는 "유사체" 또는 "보존적 변이체" 및 "모방체"("펩티도모방체")를 포함한다. 따라서, 용어 "보존적 변이체" 또는 "유사체" 또는 "모사체"는 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말하며, 변형(들)은 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드(보존적 변이체)의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경하지 않는다. 여기에는 아미노산 서열의 보존적으로 변형된 변형, 즉 아미노산 치환, 단백질 활성에 중요하지 않은 잔기의 추가 또는 결실 또는 유사한 특성(예, 산성, 염기성, 양전하 또는 음전하, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 잔기로 아미노산의 치환이 포함되며, 중요한 아미노산의 치환이 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경하지 않도록 한다.
보다 구체적으로, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산이 주어진 단백질을 코딩한다.
예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않고 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다.
이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 일반적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기술된 서열에 함축되어 있다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 보존적 치환을 선택하기 위한 하나의 예시적인 가이드라인은 다음을 포함한다(예시적 치환이 뒤따르는 원래 잔기): ala/gly 또는 ser; arg/lys; asn/gln 또는 his; asp/glu; cys/ser; gln/asn; gly/asp; gly/ala 또는 pro; his/asn 또는 gln; ile/leu 또는 val; leu/ile 또는 val; lys/arg 또는 gln 또는 glu; met/leu 또는 tyr 또는 ile; phe/met 또는 leu 또는 tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp 또는 phe; val/ile 또는 leu. 다른 예시적인 가이드라인은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함하는 다음 6개의 그룹을 사용한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(I); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); (예를 들어, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company (1984); Schultz and Schimer, Principles of Protein Structure, Springer-Vrlag (1979) 참조). 또 다른 예시적인 가이드라인은 다음 6개 그룹을 사용하며, 여기서 프롤린은 고유하다: 1) Gly(G), Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I); 2) Ser(S), Cys(C), Thr(T), Met(M); 3) 프로(P); 4) Phe(F), Tyr(Y), Try(W); 5) His(H), Lys(K), Arg(R); 및 6) Asp(D), Glu(E), Gln(N). 당업자는 상기 확인된 치환이 유일하게 가능한 보존적 치환이 아님을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 목적을 위해 모든 전하를 띤 아미노산이 양성이든 음성이든 서로에 대한 보존적 치환으로 간주할 수 있다. 또한, 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산을 변경, 추가 또는 삭제하는 개별 치환, 삭제 또는 추가도 "보존적으로 변형된 변이"로 간주될 수 있다. 당업자는 해당 단백질을 발현하는 주어진 숙주에서 코돈 선택에 익숙할 것이다.
용어 "모방체" 및 "펩티드모방체"는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 전좌 도메인, 리간드-결합 도메인 또는 키메라 수용체의 실질적으로 동일한 구조적 및/또는 기능적 특징이 합성 화학적 화합물을 지칭한다. 모방체는 아미노산의 합성, 비천연 유사체로 완전히 구성되거나 천연 펩티드 아미노산 일부 및 아미노산의 비천연 유사체 일부의 키메라 분자일 수 있다. 모방체는 또한 이러한 치환이 모방체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한 임의의 양의 천연 아미노산 보존적 치환을 포함할 수 있다.
보존적 변이체인 본 발명의 폴리펩티드와 마찬가지로, 일상적인 실험은 모방체가 본 발명의 범위 내에 있는지, 즉 그 구조 및/또는 기능이 실질적으로 변경되지 않았는지 여부를 결정할 것이다. 폴리펩티드 모방체 조성물은 비천연 구조 성분의 임의의 조합을 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 3개의 구조 그룹에 속한다: a) 천연 아미드 결합("펩티드 결합") 결합 이외의 잔기 결합기; b) 천연 발생 아미노산 잔기 대신에 비천연 잔기; 또는 c) 2차 구조 모방을 유도하는, 즉 2차 구조, 예를 들어 베타 회전, 감마 회전, 베타 시트, 알파 나선 형태 등을 유도하거나 안정화시키는 잔기. 폴리펩티드는 그 잔기의 전부 또는 일부가 천연 펩티드 결합 이외의 화학적 수단에 의해 연결될 때 모방체로 특징지어질 수 있다. 개별 펩티도미메틱 잔기는 펩티드 결합, 기타 화학 결합 또는 커플링 수단, 예컨대, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이관능성 말레이미드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)에 의해 연결될 수 있다. 전통적인 아미드 결합("펩티드 결합") 연결에 대한 대안이 될 수 있는 결합기로는 예를 들어 케토메틸렌(예, -C(O)--NH--의 경우 -C(O)--CH2--), 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2-O), 티오에테르(CH-S), 테트라졸(CN4), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드 또는 에스테르를 포함한다 (예를 들어, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NY (1983) 참조). 폴리펩티드는 또한 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 대신에 비천연 잔기의 전부 또는 일부를 함유함으로써 모방체로 특징지어질 수 있다; 비천연 잔류물은 과학 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있다. Phyre2는 단백질 구조, 기능 및 돌연변이를 예측하고 분석하기 위해 웹에서 사용할 수 있는 툴 모음이다.
단백질 폴딩 분석을 PHYRE Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0 및 단백질 2차 구조 예측 서버인 JPred를 포함한 툴을 사용하여 수행한다. 이들 툴은 SEQ ID NO:3이 상당한 β-시트 섹션 및 일부 짧은 α-나선 섹션을 갖는 β 시트-우세 구형 단백질을 예측한다는 것을 드러낸다. 구체적으로, Jpred 툴은 SEQ ID NO:3의 대략 잔기 5-11, 16-19, 28-29, 39-40, 61-67, 71-77 및 98-101에서 추정 β 시트 및 대략 잔기 20-25, 45-55, 111-119에서 α-나선을 예측한다; PHYRE 툴은 SEQ ID NO:3의 대략 잔기 5-12, 17-32, 38-40, 45-57, 62-66, 73-81, 98-104에서 β 시트 및 대략 잔기 84-89 및 116-118에서 α-나선을 예측한다. 도 1 참조.
Myd1 단백질 구조의 보존적으로 변형된 변이의 예는 상동성 모델링 알고리즘을 사용하여 유도될 수 있다: SWISS-MODEL, PHYRE2.0 및 Jpred는 당업계에 공지된 바와 같이 서열 기반 컨센서스 루프 영역을 식별하기 위해, 예를 들어, Pechmann, S. & Frydman, J. Interplay between Chaperones and Protein Disorder Promotes the Evolution of Protein Networks. PLoS Computational Biology 10, e1003674 (2014) 참조하시오.
추정상 Myd1과 유사한 구조 및 기능을 갖는 대체 단백질 서열이 SEQ ID NO:8 내지 SEQ ID NO:17로서 본원에서 제공된다. SEQ ID NO:8 내지 SEQ ID NO:17을 유도하기 위해, 대부분의 삽입 및 결실이 일반적으로 2차 구조 요소 사이의 영역에서 발견되기 때문에 공통 루프 영역을 돌연변이 부위로 선택하였으며, 단백질의 전체 접힘에서 큰 왜곡 없이 더 쉽게 수용될 수 있다. 이 단백질의 핵심은 4JOX 내에서 발견된 것과 같이 서열 보존 정도가 더 높다.
공통 루프 영역 내의 29개의 가능한 아미노산 위치 중에서, 12개의 아미노산이 보존적 대체를 사용하여 대체되었다. 돌연변이를 위해 선택된 경우, 야생형 아미노산은 보존적 아미노산 잔기 중에서 동일한 확률로 주어졌다. (Gly는 동일한 20% 확률로 Ala,Cys,Asp,Glu,Arg로 대체될 수 있다).
MYD/Myd 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 특정 영역을 사용하여 Myd 패밀리 구성원의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자를 확인할 수 있다. 이러한 확인은 인비트로에서, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건 또는 PCR(예, 본원에서 확인된 Myd 서열을 코딩하는 프라이머 사용)에서 또는 다른 뉴클레오티드 서열과 비교하기 위해 컴퓨터 시스템에서 서열 정보를 사용하여 이루어질 수 있다. 단일 종 개체군 내 MYD 유전자의 다른 대립유전자는 대립유전자 서열의 차이가 개체군 구성원 간의 미각 인식 차이와 상관관계가 있는지 여부를 결정하는 데에도 유용할 것이다. 고전적인 PCR 유형 증폭 및 클로닝 기술은 예를 들어 축퇴 프라이머가 종 전체에서 관련 유전자를 검출하기에 충분한 오르토로그를 분리하는데 유용하다.
예를 들어, 본원에 개시된 서열을 사용하여 설계된 프라이머는 상이한 진균 게놈으로부터의 MYD-관련 유전자를 증폭 및 클로닝하는데 사용될 수 있다. 대조적으로, MYD와 관련된 단일 종 내 유전자는 관련 서열을 찾기 위해 서열 패턴 인식 소프트웨어를 사용하여 가장 잘 식별된다. 일반적으로, MYD 패밀리 구성원의 다형성 변이체 및 대립유전자의 식별은 약 25개 이상의 아미노산, 예를 들어 50-100개 아미노산의 아미노산 서열을 비교함으로써 이루어질 수 있다. 대략 적어도 35 내지 50%, 및 임의로 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95-99% 또는 그 이상의 아미노산 동일성은 일반적으로 단백질이 다형성 변이체, 종간 상동체 또는 MYD 패밀리 구성원의 대립유전자임을 입증한다. 서열 비교는 아래 논의된 서열 비교 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. Myd 폴리펩티드 또는 이의 보존 영역에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 대립유전자, 종간 동족체 및 다형성 변이체를 식별하는데 사용될 수 있다.
MYD 계열 구성원에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 정보는 또한 컴퓨터 시스템에서 단맛 조절 폴리펩티드의 모델 및 이들이 단맛 수용체와 상호 작용하는 방식 및 동일한 컴퓨터 시스템 모델을 구성하는데 사용될 수 있다. 단맛 수용체는 맛 1 수용체 멤버 2(T1R2)와 맛 1 수용체 멤버 3(T1R3)의 헤테로다이머로 구성된다. 이러한 모델은 후속적으로 단 수용체의 활성화를 증가시킬 수 있는 Myd의 변이 및 돌연변이를 식별하고 보다 활성인 Myd 버전을 식별하는데 사용될 수 있다.
다양한 보존적 돌연변이 및 치환은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 예를 들어, PCR, 유전자 클로닝, cDNA의 부위 지정 돌연변이유발, 숙주 세포의 형질감염 및 인비트로 전사를 포함하는 재조합 유전자 기술의 공지된 프로토콜을 사용하여 아미노산 치환을 수행하는 것은 당업계의 기술 수준 내에 있다. 그런 다음 변이체를 미각 수용체 작용제 기능 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
일 구현예에서, Myds 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 하이브리드 단백질-코딩 서열이 구축될 수 있다. 이들 핵산 서열은 전사 또는 번역 제어 요소, 예를 들어 전사 및 번역 개시 서열, 프로모터 및 인핸서, 전사 및 번역 터미네이터, 폴리아데닐화 서열, 및 DNA를 RNA로 전사하는데 유용한 기타 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 융합 단백질은 C-말단 또는 N-말단 전위 서열을 포함할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 예를 들어, 단백질 검출, 정제 또는 기타 적용을 위한 추가 요소를 포함할 수 있다. 검출 및 정제 촉진 도메인은 예를 들어, 금속 킬레이트 펩티드, 예컨대 폴리히스티딘 트랙(polyhistidine tract), 히스티딘-트립토판 모듈 또는 고정된 금속에서 정제할 수 있는 기타 도메인; 말토스 결합 단백질; 고정된 면역글로불린에서 정제할 수 있는 단백질 A 도메인; 또는 FLAGS 확장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp, Seattle Wash.)에서 사용되는 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 펩티드 또는 단백질 태그(예, 단백질 정제 또는 검출용)를 포함한다. 펩티드/단백질 태그는 문헌 Johnson, “Protein/Peptide Tags,” DOI //dx.doi.org/10.13070/mm.en.2.116.에 설명된 것과 같이 당업계에 알려져 있으며, 녹색 형광 단백질(GFP), FLAG, Myc 에피토프, 폴리히스티딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), HA, V5, ABDz1-태그, 아데닐레이트 키나아제(AK-태그), BC2-태그, 칼모듈린-결합 펩티드, CusF, Fc, Fh8, Halo 태그, 헤파린 결합 펩티드(HB-tag), 케토스테로이드 이성질화효소(KSI), 말토오스 결합 단백질(MBP), 티오레독신, PA(NZ-1), Poly-Arg, Poly-Lys, S-tag, SBP/스트렙타비딘 결합 펩티드, SNAP, Strep-II(Twin-Strep) 및 SUMO/SUMO2을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
친화성 태그는 단백질이 친화성 기술을 사용하여 조 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있도록 단백질에 부착되는 일종의 단백질 태그이다. 친화성 태그는 문헌 Kimple et al. Curr Protoc Protein Sci.; 73: Unit-9.9. doi:10.1002/0471140864.ps0909s73에 설명된 것과 같이 당업계에 알려져 있다. 여기에 폴리히스티딘, GST, MBP, 칼모듈린-결합 펩티드, 인테인 키틴 결합 도메인, 스트렙타비딘/비오틴 기반 태그 및 His-패치 티오레독신(ThioFusion)이 포함된다. 친화성 태그에는 작은(예, 20개 이하의 아미노산 잔기) 또는 큰 친화성 태그가 포함된다. 작은 친화성 태그의 예로는 His, FLAG, Strep II 및 S-펩티드가 포함되며, 큰 친화성 태그의 예에는 MBP, GST, 셀룰로오스 결합 도메인, 칼모듈린 결합 펩티드 및 His-패치 티오레독신이 포함된다.
친화성 태그는 에피토프 태그 및 리포터 태그를 포함한다. 리포터 태그는 단백질 발현 및 단백질-단백질 상호 작용의 리포터 역할을 한다. 리포터 태그에는 β-갈락토시다아제(β-gal), 알칼리 포스파타아제(AP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT) 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)와 같은 효소가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
에피토프 태그는 FLAG, 헤마글루티닌(HA), c-myc, T7 및 Glu-Glu를 포함하며, 이들은 인비트로 및 세포 배양물에서 융합 단백질의 검출에 사용된다. 이들의 짧은 선형 인식 모티프는 관심있는 단백질의 특성에 거의 영향을 미치지 않으며 일반적으로 각각의 1차 항체에 대해 매우 특이적이다. 항-myc 항체를 사용하는 경우, HRP- 또는 AP-항-myc 접합체를 단독으로 사용하는 대신 접합된 항-myc 1차 항체를 검출하기 위해 효소 결합된 2차 항체를 사용함으로써 특이성을 증가시킬 수 있다.
태그는 표적 단백질의 양쪽 말단에 있을 수 있다. FLAG와 같은 일부 에피토프 태그는 원하는 기능을 증가시키기 위해 종종 함께 사용되거나 His-Myc 및 His-V5의 구조에서와 같이 다른 태그와 함께 사용된다.
탠덤 친화성 정제(TAP)는 관심있는 단백질에 대한 2개의 친화성 태그의 융합에 기초한 이중-친화성 정제 방법이며, 이는 태그된 단백질의 정제 및 관심있는 단백질과 상호작용하는 단백질 복합체의 분리를 가능하게 한다. TAP의 사용은 본 발명에 포함된다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 2-10개(예, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 태그를 포함한다. 예를 들어, 히스티딘 태그는 6개의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다.
(효율적인 원형질막 발현용) 전위 도메인과 새로 번역된 폴리펩티드의 나머지 사이에서 절단 가능한 링커 서열, 예컨대 인자 Xa(예, Ottavi, Biochimie 80:289-293 (1998) 참조), 서브틸리신 프로테아제 인식 모티프(예, Polyak, Protein Eng. 10:615-619 (1997) 참조); 엔테로키나아제(Invitrogen, San Diego, Calif.) 등의 포함은 정제를 촉진하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 작제물은 6개의 히스티딘 잔기에 이어 티오레독신, 엔테로키나아제 절단 부위(예, Williams, Biochemistry 34:1787-1797 (1995) 참조) 및 C-말단 전좌 도메인에 연결된 핵산 서열을 코딩하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 히스티딘 잔기는 검출 및 정제를 용이하게 하는 반면 엔테로키나아제 절단 부위는 나머지 융합 단백질로부터 원하는 단백질(들)을 정제하기 위한 수단을 제공한다. 융합 단백질을 코딩하는 벡터와 융합 단백질의 적용에 관한 기술은 과학 및 특허 문헌, 예, Kroll, DNA Cell. Biol. 12:441-53 (1993)에 잘 설명되어 있다.
융합 단백질은 하나 이상의 링커(예, 가요성 링커, 강성 링커 및 인비보 절단 가능한 링커)를 함유할 수 있다. 게다가 (유연하고 견고한 링커에서와 같이) 기능성 도메인을 함께 연결하거나 (인비보에서서 절단 가능한 링커에서와 같이) 인비보에서 자유 기능성 도메인을 방출하는 기본 역할 외에도 링커는 융합 단백질의 생산을 위한 많은 다른 이점, 에컨대 생물학적 활성 개선, 발현 수율 증가, 바람직한 약동학 프로파일 달성 등을 제공한다. 링커는 당업계에 공지되어 있다(예, Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369 (2013) 참조).
유연한 링커는 결합된 도메인이 어느 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 할 때 사용된다. 이들은 일반적으로 작은 비극성(예, Gly) 또는 극성(예, Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성된다. 이러한 아미노산의 작은 크기는 유연성을 제공하고 연결 기능 도메인의 이동성을 허용한다. Ser 또는 Thr의 혼입은 물 분자와 수소 결합을 형성하여 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있으므로 링커와 단백질 부분 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 감소시킨다.
가장 통상적으로 사용되는 유연한 링커는 주로 Gly 및 Ser 잔기("GS" 링커)의 스트레치로 구성된 서열을 갖는다. 가장 널리 사용되는 유연한 링커의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO: 69)의 서열을 갖는다. 카피 번호 "n"을 조정하면 이 GS 링커의 길이를 최적화하여 기능적 도메인을 적절하게 분리하거나 필요한 도메인 간 상호 작용을 유지할 수 있다. GS 링커 외에도 재조합 융합 단백질을 위해 다른 많은 유연한 링커가 설계되었다. 이러한 유연한 링커는 또한 Gly 및 Ser과 같은 작거나 극성 아미노산이 풍부하지만 유연성을 유지하기 위해 Thr 및 Ala와 같은 추가 아미노산과 용해도를 향상시키기 위해 Lys 및 Glu와 같은 극성 아미노산을 포함할 수 있다.
단단한 링커는 도메인 간에 고정된 거리를 유지하고 이들의 독립적인 기능을 유지한다. 단단한 링커의 예는 (EAAAK)n(SEQ ID NO: 70)의 서열을 갖는 알파 나선-형성 링커 및 Pro-풍부 서열(XP)n을 갖는 링커를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 Ala, Lys 또는 Glu를 나타낸다. , .
본 발명의 폴리펩티드는 또한 신호 펩티드(즉, 신호 서열, 표적화 신호, 국소화 신호, 국소화 서열, 전이 펩티드, 리더 서열 또는 리더 펩티드)를 함유할 수 있는데, 이는 분비 경로로 향하는 대부분의 새로 합성된 단백질의 N-말단 또는 때때로 C-말단에 존재하는 짧은 펩티드이다. 이러한 단백질에는 특정 소기관(소포체, 골지체 또는 엔도솜) 내부에 존재하거나 세포에서 분비되거나 대부분의 세포막에 삽입되는 단백질이 포함된다. 예시적인 신호 펩티드는 당업계에 공지되어 있고 당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 특정 신호 펩티드를 선택하는 방법을 인식할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "적어도 80% 동일성"은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 의미한다.
본 명세서에서 "하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 서열"의 예로는 1개 이상 내지 30개 이하, 바람직하게는 20개 이하, 보다 바람직하게는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 이들의 임의의 범위)의 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 부가에 의해 수식된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 "하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환 또는 부가에 의해 변형된 염기 서열"의 예로는 1개 이상 내지 90개 이하, 바람직하게는 60개 이하, 보다 바람직하게는 30개 이하, 더욱 바람직하게는 15개 이하, 더욱 바람직하게는 10개 이하(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 또는 이들의 임의의 범위)의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환 또는 부가에 의해 수식된 뉴클레오티드 서열을 들 수 있다 .
예를 들어, 서열 비교에서, 일반적으로 하나의 서열은 테스트 서열이 비교되는 레퍼런스 서열 역할을 한다. 염기서열 비교 알고리즘을 사용할 때 테스트 및 레퍼런스 염기서열을 컴퓨터에 입력하고 필요에 따라 염기서열 좌표를 지정하고 염기서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 대해 아래에 설명된 대로 기본 프로그램 매개변수를 사용하거나 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기반으로 레퍼런스 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 20 내지 600개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군에서 선택된 연속 위치의 수 중 임의의 하나의 세그먼트에 대한 레퍼런스를 포함하며, 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 동일한 수의 연속 위치의 레퍼런스 서열과 서열을 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬이 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 고리즘의 전산화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement) 참조) 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 문헌 Altschul at al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J Mol. Biol. 215:403-410 (1990), 각각에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 사용할 수 있다. 이 알고리즘은 먼저 쿼리 시퀀스에서 길이가 W인 짧은 단어를 식별하여 높은 점수 시퀀스 쌍(HSP)을 식별하는 작업을 포함한다. 이 단어는 데이터베이스 시퀀스에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양수 임계값 점수 T와 일치하거나 만족한다. T는 이웃 단어 점수 임계값이라고 한다 (Altschul et al., Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). 이러한 초기 이웃 단어 적중은 검색을 시작하여 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 씨드 역할을 한다. 단어 적중은 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각 시퀀스를 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 매개변수 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수, 항상 >0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 점수, 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 누적 정렬 점수는 최대 달성 값에서 수 X만큼 떨어질 때 각 방향의 워드 적중 확장이 중단되고; 누적 점수는 하나 이상의 음수 스코링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하가 되며, 또는 시퀀스의 끝에 도달하였다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 기본값으로 11의 워드 길이(W), 기대값(E) 또는 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 기본값으로 워드 길이 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5,N=-4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 PILEUP이다. PILEUP은 점진적인 쌍별 정렬을 사용하여 관련 시퀀스 그룹에서 다중 시퀀스 정렬을 생성하여 관계 및 시퀀스 동일성 백분율을 표시한다. 또한 정렬을 생성하는 데 사용되는 클러스터링 관계를 보여주는 소위 "트리" 또는 "덴도그램"을 플로팅한다(예, 도 2 참조). PILEUP은 Feng & Doolittle, J Mol. Evol. 35:351-360 (1987)의 점진적 정렬 방법을 단순화하여 사용한다. 사용된 방법은 Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153(1989)에 의해 기술된 방법과 유사하다. 이 프로그램은 각각 최대 길이가 5,000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산인 최대 300개의 서열을 정렬할 수 있다. 다중 정렬 절차는 두 개의 정렬된 시퀀스의 클러스터를 생성하는 두 개의 가장 유사한 시퀀스의 쌍별 정렬로 시작된다. 그런 다음 이 클러스터는 다음으로 가장 관련된 시퀀스 또는 정렬된 시퀀스의 클러스터에 정렬된다. 서열의 2개 클러스터는 2개의 개별 서열의 쌍별 정렬의 단순 확장에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 점진적인 쌍별 정렬에 의해 달성된다. 프로그램은 특정 서열과 서열 비교 영역에 대한 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고 프로그램 매개변수를 지정하여 실행된다. PILEUP을 사용하여 레퍼런스 서열을 다른 테스트 서열과 비교하여 기본 갭 가중치(3.00), 기본 갭 길이 가중치(0.10) 및 가중 말단 갭 매개변수를 사용하여 서열 동일성 관계 비율을 결정한다. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어 버전 7.0(Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984))에서 얻을 수 있으며 유전자에 의해 코딩된 해당 오픈 리딩 프레임의 개념적 번역에 의해 파생되었다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Myd의 아미노산 서열에 기초하여 화학적으로 또는 유전 공학에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 전단백질(preprotein)의 아미노산 서열에 기초하여 화학적으로 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성을 위해 핵산의 수탁 합성 서비스(예, Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Genscript 등에서 제공)를 사용할 수 있다. 또한, 합성된 폴리뉴클레오티드는 PCR 및 클로닝 등에 의해 증폭될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현함으로써 생산될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 Myd 폴리펩티드는 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체로부터 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Myd 폴리펩티드는 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환체를 얻고 형질전환체를 적절한 배지에서 배양한 후 형질전환체에 도입된 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 생산된다. 본 발명의 단백질은 생산된 Myd 폴리펩티드를 배양물로부터 분리 또는 정제하여 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 숙주에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환체의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체 또는 이를 포함하는 벡터를 세포 외부로부터 도입한 형질전환체를 제공한다. 본 발명은 추가로 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 Myd 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터, 및 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자외선 조사 및 부위-지정 돌연변이유발과 같은 공지된 돌연변이유발 방법으로 절차에 따라 합성된 폴리뉴클레오티드에 돌연변이를 도입함으로써 생성될 수 있다. 공지된 방법으로 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 폴리뉴클레오티드에 변이를 도입하고, 얻어진 폴리뉴클레오티드를 발현하며, 발현된 단백질의 단맛-변형 활성을 조사하고, 그리고 원하는 단맛 변형 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선택함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 부위 지정 돌연변이유발은 예를 들어 역 PCR 및 어닐링과 같은 임의의 방법으로 수행될 수 있다 (Muramatsu et al. edit., "Revised 4th edition New genetic engineering handbook", YODOSHA, p. 82-88). 특정 부위 돌연변이 유발을 위한 다양한 시판 키트, 예컨대 Stratagene의 QuickChange II 부위 지정 돌연변이 유발 키트 및 QuickChange 다중 부위-지정 돌연변이 유발 키트를 필요에 따라 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 종류의 예로는 제한 없이 유전자 클로닝에 일반적으로 사용되는 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, YAC 및 BAC를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터의 예로는 플라스미드(예, DNA 플라스미드), 효모(예, Saccharomyces) 및 바이러스 벡터, 예컨대 스바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 알파바이러스, 바큘로바이러스, 신드비스 바이러스, 식물 바이러스(예, Alphaflexiviridae 또는 Potyviridae) 및 곤충 바이러스(예, Baculoviridae)을 포함한다.
이 중에서도 플라스미드 벡터가 바람직하고, 예를 들면 시판되고 있는 단백질 발현용 플라스미드 벡터, 예를 들면 pUC19, pUC118, pUC119, pBR322 등(모두 TAKARA BIO INC. 제품)을 사용할 수 있다.
벡터는 복제 개시 영역 또는 DNA의 복제 기점을 포함하는 DNA 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전자의 전사를 개시하는 프로모터 영역, 발현된 단백질을 세포 외부로 분비하는 터미네이터 영역 또는 분비 신호 영역과 같은 조절 서열은 벡터 내의 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(즉, 본 발명의 MYD 유전자)의 업스트림에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 및 조절 서열이 "작동 가능하게 유사하다"는 것은 유전자 및 조절 영역이 위치하여 유전자가 조절 영역에 의한 조절 하에서 발현될 수 있는 상태를 의미한다.
프로모터 영역, 터미네이터 및 분비 신호 영역 등의 조절 서열의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 사용되는 프로모터 및 분비 신호 서열은 서열이 도입되는 숙주에 따라 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터에 도입될 수 있는 조절 서열의 바람직한 예로는 트로커도마 레세이 유래의 cbh1 프로모터 서열을 포함한다 (Curr, Genet, 1995, 28(1):71-79).
대안적으로, 벡터가 적절하게 도입될 숙주를 선택하기 위한 마커 유전자(예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 카나마이신 및 클로람페니콜과 같은 제제에 대한 내성 유전자)가 본 발명의 벡터에 추가로 도입될 수 있다. 대안적으로, 영양요구성 균주를 숙주로 사용하는 경우, 필요한 영양소의 합성 효소를 코딩하는 유전자를 마커 유전자로서 벡터에 도입할 수 있다. 대안적으로, 성장을 위해 특정 대사를 요구하는 선택 배지를 사용하는 경우, 대사 관련 유전자를 마커 유전자로서 벡터에 도입할 수 있다. 이러한 대사 관련 유전자의 예로는 아세트아마이드를 질소원으로 사용하기 위한 아세트아미다제 유전자를 들 수 있다.
본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 조절서열 및 마커 유전자 간의 연결은 SOE(splicing byoverlap extension)-PCR(Gene, 1989, 77: 61-68)과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 연결된 단편을 벡터에 도입하는 절차는 당업계에 공지되어 있다.
벡터가 도입되는 형질전환체의 숙주로서는 세균, 사상균 등의 미생물을 들 수 있다. 세균의 예로는 대장균, 포도상구균, 엔테로코쿠스, 리스테리아, 바실러스에 속하는 세균을 포함하고, 이 중에서 대장균 및 바실러스속 세균(예를 들면, 바실러스 서브틸리스 또는 이의 변이체)이 바람직하다. 바실러스 서브틸리스 변이체의 예로는 J. Biosci. Bioeng., 2007, 104 (2): 135-143에 기술된 프로테아제 9 이중 결핍 균주 KA8AX, 및 Biotechnol. Lett., 2011, 33 (9): 1847-1852에 기술된 프로테아제 8 이중 결핍 균주로부터의 돌연변이인 DBPA 균주를 포함할 수 있으며, 이 중 단백질 폴딩 효율은 개선된다. 사상균의 예로는 트리코더마, 아스페르길루스 및 리조푸스가 있다. 또한, 예를 들어 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비시애, 한세눌라 폴리모르파, 야로위아 리폴리티카, 쉬조사카로마이세스 폼베, 클루이베로마이세스 락티스가 적절한 발현 숙주이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서의 발현과 양립할 수 있는 제어 요소에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 세포는 예를 들어 포유류 세포(예, BHK, VERO, HT1080, 293, RD, COS-7 또는 CHO 세포), 곤충 세포(예, Trichoplusia ni(Tn5) 또는 Sf9), 박테리아 세포, 식물 세포 또는 효모 세포일 수 있다.
Myd-코딩 발현 카세트로부터의 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 일반적으로 용해된 세포 또는 배양 배지로부터 분리된다. 정제는 염 분별, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 크기 분별 및 친화성 크로마토그래피를 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, Gag 항원에 기초하여 생성된 항체를 사용하여 면역친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
본 발명은 (a) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 얻는 단계, 및 (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 상기 조성물을 정제하는 단계를 포함하는, 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 가지며; (a) 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 하나의 치환 변형을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니거나, 또는 (b) 여기서 폴리펩티드는 히스티딘 태그를 추가로 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다.
당업자는 적절한 컬럼, 완충액 및 용출 용액의 선택을 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 정제 기술에 익숙하다. 예시적인 HIC 및 SEC 정제 기술은 본원의 실시예 11에 기재되어 있다. 예시적인 양태에서, HIC 및 SEC에 의한 정제 후 폴리펩티드의 정제율은 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 임의의 값 범위이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드 및/또는 이종 폴리펩티드를 포함하는 형질전환 식물을 고려한다. 식물은 이종 핵산 서열의 발현으로 인해 표현형이 변경되었다. 변경된 표현형은 과일을 포함한 모든 식물 부분에서 단맛이 증가된 표현형을 포함할 수 있다. 형질전환 식물은 식물의 일부로서 본원에 정의된 바와 같은 발현 카세트를 포함할 수 있으며, 카세트는 본 발명의 벡터로 식물을 형질전환시켜 도입하였다. 이러한 발현 카세트는 식물-발현가능한 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 식물에서 이종 코딩 서열의 발현을 위한 조절 서열을 포함한다. 형질전환 식물은 본원에 기재된 이종 핵산 서열을 발현할 수 있는 임의의 유형의 식물일 수 있다. "식물"이라는 용어는 전체 식물, 식물 기관(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자 및 식물 세포 및 이들의 자손을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물 부류는 일반적으로 외떡잎 식물(쌍떡잎 식물) 및 쌍자엽 식물을 모두 포함하는 형질전환 기술에 적합한 고등 식물 부류만큼 광범위하다. 여기에는 배수체, 이배체 및 반수체를 포함하여 다양한 배수체 수준의 식물이 포함된다. 예를 들어, 형질전환 식물은 사과 또는 딸기일 수 있다.
매우 다양한 식물 종을 형질전환시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 기술 및 과학 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet., 22:421-477 and Joung et al. (2015) “Plant Transformation Methods and Applications,” in Current Technology in Plant Molecular Breeding, (Koh et al., eds) Springer Dordrecht Heidelberg New York London, Chapter 9, pages 297-344 참조하시오. 식물 원형질체 또는 식물 조직을 포함하는 식물 세포의 형질전환을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 식물 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 식물 형질전환을 위한 특정 방법은 무엇보다도 볼리스틱 방법(유전자 총), 전기천공법, 미세주입, 원형질체 융합 및 아그로박테리움-매개 형질전환을 포함한다. 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환은 에스케리치아 콜라이 및 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 다른 아그로박테리움 균주에서 복제하는 이원 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 다양한 이원 벡터는 당업계에 공지되어 있고 식물 세포 및 식물 조직에 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 식물 세포 및 식물 조직에서 식물-발현가능한 프로모터 서열 및 다른 식물 조절 서열을 포함하는 이종 코딩 서열의 발현을 위한 조절 서열을 포함하는 식물 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 발현하도록 식물을 형질전환시키는데 사용될 수 있다. .
다양한 식물-발현가능한 프로모터가 당업계에 공지되어 있고, 단맛 조절 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 본원의 이종 구조물, 벡터 및 형질전환된 식물 물질에서 사용하기 위해 이용 가능하다. 식물-발현가능한 프로모터는 천연 식물 공급원, 식물 바이러스 공급원 및 식물-발현가능한 프로모터를 갖는 아그로박테리움 균주와 같은 박테리아로부터 유래될 수 있다. 식물-발현가능한 프로모터는 무엇보다도 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터(CaMV 35S), 옥토핀 및 노팔린 신타제 프로모터(예, nos 프로모터), 식물 유비퀴틴 프로모터(Ubi), 벼 액틴 프로모터(Act-1) 및 옥수수 알코올 탈수소효소 (Adh-1)를 포함한다. 식물-발현가능한 프로모터는 구성적 프로모터, 유도가능한 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 발달 단계-특이적 프로모터를 포함하며, 각 유형의 프로모터의 예는 당업계에 공지되어 있다. 조직 특이적 프로모터는 특히 식물 뿌리, 식물 잎, 과일, 꽃, 꽃가루 또는 활성 광합성에 관여하는 세포에서 발현을 지시하는 프로모터(예, 포스포에놀피루베이트 프로모터(PEP))를 포함한다. 개발 단계 특정 프로모터에는 과일 숙성, 개화 또는 종자 세트 동안 발현을 지시하는 것들이 포함된다. 합성 식물 프로모터는 또한 당업계에 공지되어 있고 이종 구조물, 벡터 및 형질전환된 식물 물질에서 유용하다(예, Ali S. & Kim W-C (2019) Frontiers in Plant Science, 10, article 1433 참조).
형질전환된 원형질체, 식물 세포, 캘러스 또는 기타 식물 조직으로부터 식물을 재생하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며 이러한 형질전환된 식물 물질로부터 재생된 전체 식물 및 식물 부분에 사용될 수 있다. 재생 방법에는 기관형성 및 배아형성이 포함된다. 참조: Handbook of plant cell culture. Volume 1: Techniques for propagation and breeding (1983) Edited by D. A. Evans et al., Macmillan (New York); R.H. Smith, Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments, 3rd Edition (2012) Academic Press (New York); M.R. Davey & P. Anthony, Plant Cell Culture: Essential Methods (2010) John Wiley & Sons (New York), 특히 Chapters 3 및 9 참조.
벡터를 숙주에 도입하는 방법으로는 원형질체법, 전기천공법 등 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 마커 유전자의 발현 및/또는 영양요구성 등의 지표를 이용하여 벡터가 적절하게 도입된 균주를 선택하여 관심 형질전환체를 얻을 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 조절 서열 및 마커 유전자가 연결된 단편은 숙주의 게놈에 직접 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 연결된 단편의 양 말단에 숙주의 게놈에 상보적인 서열이 부가된 DNA 단편을 구성하고, 단편을 숙주에 도입하고 SOE-PCR에 의해 숙주 게놈과 DNA 단편 간의 상동 재조합을 유도함으로써 숙주의 게놈에 도입된다.
본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 벡터가 도입되어 이렇게 얻은 형질전환체를 적절한 배지에서 배양하면 벡터 상에서 MYD cDNA가 발현되고, 이어서 본 발명의 Myd 폴리펩타이드가 생성된다. 이러한 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 이러한 형질전환체의 미생물의 종류에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 Myd 폴리펩티드는 무세포 번역 시스템을 사용하여 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 전사 산물로부터 발현될 수 있다. "무세포 번역 시스템"은 수주가 되는 세포를 기계적으로 파괴하여 얻은 현탁액에 단백질 번역에 필요한 아미노산 등의 시약을 첨가하여 구축된 인비트로 전사-번역 시스템 또는 인비트로 번역 시스템을 말한다.
배양 또는 무세포 번역 시스템에서 생산된 본 발명의 Myd 폴리펩티드는 단백질 정제에 사용되는 일반적인 방법, 예를 들어 원심분리, 황산암모늄 침전, 겔 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합 사용하여 분리 또는 정제할 수 있다. 여기서, 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 분비 신호 서열이 형질전환체 내의 벡터에 작동가능하게 연결되어 있는 경우, 생성된 Myd 폴리펩티드는 Myd 폴리펩티드가 세포 외부로 분비되기 때문에 상기 배양물로부터 보다 용이하게 수집될 수 있다. 배양물로부터 수집된 Myd 폴리펩티드는 공지된 수단으로 추가로 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포를 공지된 감미제 또는 화합물과 유사한 단맛 조절 활성을 갖는 단백질을 생성시키는 조건 하에 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 단맛 조절 활성을 갖는 단백질을 생산하는 방법을 포함한다.
본원에 사용된 "감미제", "감미 화합물" 또는 "단맛 수용체 활성화 화합물"은 대상체에서 검출가능한 달콤한 맛을 유도하는 조성물, 예를 들어 수크로스, 프록토스, 글루코스 및 기타 공지된 천연 사카라이드계 감미료, 또는 본원에서 추가로 논의되는 사카린, 시클라메이트, 아스파탐 등과 같은 공지된 인공 감미료, 또는 인비트로에서 T1R2/T1R3 수용체를 활성화시키는 물질을 말할 수 있다. 대상체는 인간 또는 동물일 수 있다.
감미제 또는 감미 조성물은 유효량으로 사용될 수 있으며, 이는 경구 투여용 제품에 존재할 때 대상체에서 단맛을 유도하기에 충분한 본 발명의 감미 조성물의 양을 말한다.
일 구현예에서, 인스턴트 감미 단백질은 단맛 조절 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 Myd 폴리펩티드는 예를 들어 단맛 수용체와 같은 미각 수용체에서 기능적, 물리적 및 화학적 효과를 가질 수 있다. "단맛 조절 활성"은 미각 전달에 대한 인비트로 및 인비보 검정을 사용하여 확인된 본 발명의 폴리펩티드의 억제, 활성화, 예를 들어 작용제 또는 길항제 특성을 의미할 수 있다. 억제 활성을 갖는 단백질은 자극에 결합하거나, 부분적으로 또는 전체적으로 자극을 차단하거나, 감소시키거나, 방지하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화시키거나, 둔감하게 하거나, 미각 전달을 하향 조절(예, 길항제)할 수 있다. 활성화 폴리펩티드는 미각 전달, 예를 들어 작용제에 결합하거나, 자극하거나, 증가시키거나, 개방하거나, 활성화시키거나, 용이하게 하거나, 활성화를 향상시키거나, 민감하게 하거나, 상향 조절(예, 작용제)할 수 있다. 활성화 폴리펩티드가 바람직하다.
단맛 조절은 또한 조합으로 투여될 때 경구 투여를 위한 특정 제품의 단맛과 같은 맛을 향상시키는 것을 의미한다.
단맛 조절 활성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 인비트로 방법, 또는 동물 또는 인간 감각 시험에 의해 인비보에서 검출될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, Myd는 단맛 활성화에 관여하며, 예를 들어 미각 1 수용체 2(T1R2) 및/또는 미각 1 수용체 3(T1R3)의 작용제이다. 그러나 Myd는 쓴맛, 감칠맛, 신맛, 짠맛과 같은 다른 미각 수용체를 자극한다. 이러한 기능적 효과는 당업자에게 공지된 임의의 수단, 예를 들어 분광 특성(예, 형광, 흡광도, 굴절률), 유체역학(예, 형상), 크로마토그래피 또는 용해도 특성, 패치 클램핑, 전압 민감성 염료, 전체 세포 전류, 방사성동위원소 유출, 유도 마커, T1R 유전자의 전사 활성화에서의 변화를 통한 미각 수용체 T1R에 대한 결합의 측정; 리간드 결합 분석; 전압, 막 전위 및 컨덕턴스 변화; 이온 플럭스 분석; cAMP, cGMP 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3)와 같은 세포내 2차 메신저의 변화; 세포내 칼슘 수치의 변화; 신경 전달 물질 방출 등에 의해 측정될 수 있다.
관능 검사(인간 또는 동물)는 또한 Myd 후보 폴리펩티드가 단맛 조절 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 관능 평가는 음식과 음료의 구성에 대한 인간의 반응, 예, 외관, 촉감, 냄새, 질감, 온도 및 맛을 분석하고 측정하는 과학 분야이다. 때때로 사람을 도구로 사용하는 측정이 필요하다. 감미를 결정하기 위한 적절한 방법의 선택은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어, 두 제품이 지각할 수 있을 정도로 다를 가능성을 측정하도록 설계된 식별 테스트 또는 차이 테스트를 포함한다. 평가자의 응답은 정확성에 대해 집계되고 우연만으로 인해 예상되는 것보다 더 정확한 응답이 있는지 통계적으로 분석된다.
관능 평가는 식품 및 음료의 조성에 대한 인간 반응, 예 외관, 촉감, 냄새, 질감, 온도 및 맛을 분석하고 측정하는 과학 분야이다. 때때로 사람을 도구로 사용하는 측정이 필요하다. 식품 산업은 풍미와 질감의 관능적 특성이 기기로 쉽게 측정할 수 없는 명백한 속성이었기 때문에 이 측정 도구를 개발할 필요가 있었다. 관능적 품질, 예를 들어, 본 발명에 개시된 단백질의 단맛을 결정하기 위한 적절한 방법의 선택은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어, 두 제품이 지각할 수 있을 정도로 다를 가능성을 측정하도록 설계된 식별 테스트 또는 차이 테스트를 포함한다. 단맛 지각을 위해, 예를 들어, 5% 수크로스, 6% 수크로스, 7% 수크로스, 8% 수크로스, 9% 수크로스, 10% 수크로스 중 하나 이상의 샘플 및 테스트 샘플은 낮은 단맛에서 높은 단맛까지 단맛 강도의 순서로 훈련된 패널리스트에 의해 순위가 매겨질 수 있다. 본 발명에서, 당업자가 감각 차이를 측정할 수 있는 많은 방법이 있음을 이해해야 한다.
Brix 측정(또는 Brix 척도)은 식음료 산업에서 잘 알려진 적용으로서, 물의 순수한 수크로스 함량을 결정한다: 1도 브릭스(°Bx) = 1g의 수크로스/100g의 용액이며 용액을 질량 백분율로 표시한다. 8°Bx는 대략 8% 설탕 용액과 같다. 실시예에 기재된 바와 같이, SEQ ID NO: 21에 해당하는 정제된 폴리펩티드는 숙련된 관능 과학자에 의해 0.03mg/ml(0.2mL 분취량)로 맛을 보았고 8°Bx(약 8% 설탕 용액)에 해당하는 단맛을 갖는 것으로 밝혀졌다. (실시예 4, 5, 9 및 10 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 Myd 폴리펩티드는 적어도 당(w/w 기준)만큼 달거나(예를 들어, 1X), 또는 대안적으로 상기 기술되거나 문헌에 공지된 임의의 방법으로 측정할 때 설탕보다 2X, 5X, 10X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, 1000X, 1500X, 2000X, 3000X, 5000X, 10,000X, 20,000X 이상 더 단맛이 높은 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시예에서, Myd 폴리펩티드는 적어도 1%(적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 최소 95%) 설탕만큼 달다.
식품, 음료, 보조제, 의약품
일 구현예에서, 본 발명은 경구 투여용 제품 및 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 단리된 Myd 폴리펩티드를 포함하는 감미 조성물의 조합을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 이루어진 조성물을 포함한다. 하나의 양태에서, 조합은 Myd 폴리펩티드가 결여된 경구 투여용 제품(대조군)과 비교하여 향상된 단맛을 갖는다. 일 구현예에서, 경구 투여용 제품은 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플이 아니다. "본질적으로 구성된"이라는 용어는 제품의 기능이나 활성에 필수적이지 않고 기능이나 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 구성 요소, 예를 들어 케이킹 방지제, 충전제, 안정제(예: 열 안정제) 및 팽창제(예를 들어, 말토덱스트로스, 검 아카시아 등)를 포함하는 것을 허용한다.
일 구현예에서, 본 발명의 단리된 Myd 단백질을 포함하는 조성물은 단리된 Myd 단백질에 향상된 기능성을 제공하는 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 열, 삼투압, pH 또는 다른 유형의 분해에 대해 Myd 단백질을 안정화시키는 제형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제제는 열 분해에 대해 Myd 단백질을 안정화시킨다. Myd 단백질을 안정화하기 위한 예시적인 화합물은 예를 들어 L-아르기닌 글리신, L-프롤린, L-히스티딘, β-알라닌, L-세린, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, L-아르기닌아미드 디하이드로클로라이드, 6-아미노헥산산, gly-gly, gly-gly-gly, 트립톤, 베타인 일수화물, D-(+)-트레할로스 이수화물, 자일리톨, D-소르비톨, 수크로스, 하이드록시엑토인, 트리메틸아민 n-옥사이드 이수화물, 메틸-α-d-글루코피라노사이드, 트리에틸렌 글리콜, 스페르민 테트라히드로클로라이드, 스페르미딘, 5-아미노발레르산, 글루타르산, 아디프산, 에틸렌디아민디히드로클로라이드, 구아니딘히드로클로라이드, 우레아, N-메틸우레아, N-에틸우레아, N-메틸포름아미드, 하이포타우린, TCEP 염산염, GSH(l-글루타치온 환원), 벤즈아미딘 염산염, 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨 이수화물, 염화마그네슘 6수화물, 염화카드뮴 수화물, 비계면활성제 설포베타인 195(ndsb-195), 비계면활성제 설포베타인 201(NDSB-201), 비계면활성제 설포베타인 211(NDSB-211), 비계면활성제 설포베타인 221(NDSB-221), 비계면활성제 설포베타인 256(NDSB-256), 타우린, 아세트아미드, 옥살산 이수화물, 소듐 말로네이트 pH 7.0, 숙신산 pH 7.0, 탁시메이트 pH 7.0, 테트라에틸암모늄 브로마이드, 콜린 아세테이트, 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 아세테이트, 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 클로라이드, 에틸암모늄나이트레이트, 황산암모늄, 염화암모늄, 황산마그네슘 수화물, 티오시안산칼륨, 염화가돌리늄(III) 6수화물, 염화세슘, 4-아미노부티르산(GABA), 질산리튬, DL-말산 pH 7.0, 구연산 리튬 3염기 4수화물, 아세트산 암모늄, 벤젠술폰산 나트륨, p-톨루엔술폰산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산나트륨 1염기 1수화물, 황산나트륨 10수화물, 염화리튬, 브롬화나트륨, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 200, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 550, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 750, 포름아미드, 폴리에틸렌 글리콜 400, 펜타에리트리톨 에톡실레이트(15/4 EO/OH), 1,2-프로판디올, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 1,900, 폴리에틸렌 글리콜 3,350, 폴리에틸렌 글리콜 8,000, 폴리비닐피롤리돈 k15, 폴리에틸렌 글리콜 20,000, (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린을 포함한다.
하나의 양태에서, 감미 조성물의 Myd 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3(또는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17)과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, Myd 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖고; (a) 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 하나의 치환 변형을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니거나, 또는 (b) 폴리펩티드는 히스티딘 태그를 추가로 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다. 예를 들어, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 또는 SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 포함하고 SEQ ID NO:3으로 구성되지 않는다. 특정 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, 또는 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 경구 투여용 제품을 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 단리된 Myd 폴리펩티드와 조합하는 단게를 포함하는, 경구 투여용 제품의 맛을 조절하는 방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 조합은 Myd 폴리펩티드가 결여된 경구 투여용 제품(대조군)과 비교하여 향상된 단맛을 갖는다. 하나의 구현예에서, 경구 투여용 제품은 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플이 아니다.
하나의 양태에서, 감미 조성물의 Myd 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 (또는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17)에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, Myd 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖고; (a) 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 비해 적어도 하나의 치환 변형을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드가 아니며, 또는 (b) 상기 폴리펩티드는 히스티딘 태그를 추가로 포함하고, 상기 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는다.
경구 투여를 위한 제품은 식품, 음료, 식이 보충제 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다.
"경구 투여용 제품"은 식품, 음료 제품; 의약(의약품) 제품, 또는 약초 보조제와 같은 식이 보조제 제품과 같은 먹을 수 있는 제품을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "의약품"은 의학적 가치를 갖거나 기침 시럽, 기침 드롭스, 아스피린 및 씹을 수 있는 의약 정제와 같은 의학적 활성제를 포함하는 섭취 가능한 무독성 물질인 고체 및 액체 조성물을 모두 포함한다. 구강 위생 제품은 또한 구강 투여를 위한 제품이며 치약 또는 구강 세척제와 같은 고체 및 액체를 포함한다.
일반적으로, 본 발명은 식품 또는 음료 제품이 본 발명의 단리된 감미 단백질을 유효량으로, 예를 들어 식품 또는 음료의 총 중량에 대해 약 99중량% 이하의 양으로, 예를 들어 약 0.01중량% 내지 약 99중량%의 양으로 포함할 수 있음을 고려한다. 전체 중량에 대한 모든 중간 중량(즉, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%,...90%, 95%, 99%) 식품 또는 음료 제품이 고려되며, 이러한 양에 기초한 모든 중간 범위도 고려된다.
본 발명의 조성물은 Myd 폴리펩티드의 생물학적 유효성이 최대화되도록 분산/희석 형태로 Myd 폴리펩티드를 투여하기 위해 Myd 폴리펩티드의 원하는 투여 형태를 제조하는데 사용되는 고체 또는 액체 매질 및/또는 조성물을 포함할 수 있는 "식용으로, 생물학적으로 또는 의학적으로 허용되는 담체 또는 부형제"를 포함할 수 있다. 식용, 생물학적 또는 의학적으로 허용되는 담체에는 많은 일반적인 음식 재료, 예컨대 중성, 산성 또는 염기성 pH의 물, 과일 또는 야채 주스, 식초, 마리네이드, 맥주, 와인, 우유 또는 연유와 같은 천연 물/지방 유제, 식용유 및 쇼트닝, 지방산, 프로필렌 글리콜의 저분자량 올리고머, 지방산의 글리세릴 에스테르, 및 수성 매질에서 이러한 소수성 물질의 분산액 또는 에멀젼, 염화나트륨과 같은 염, 밀가루, 에탄올과 같은 용매, 식물성 분말 또는 밀가루와 같은 고체 식용 희석제, 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제; 증점제 또는 유화제, 방부제, 고형 결합제, 윤활제 등을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 고려될 수 있는 식품 또는 음료 제품은 구운 식품; 달콤한 베이커리 제품(롤, 케이크, 파이, 패스트리 및 쿠키를 포함하되 이에 제한되지 않음); 달콤한 베이커리 제품을 준비하기 위한 미리 만들어진 달콤한 베이커리 믹스; 파이 필링 및 기타 달콤한 필링(피칸 파이 필링과 같은 과일 파이 필링 및 너트 파이 필링뿐만 아니라 지방 기반 크림 필링과 같은 쿠키, 케이크, 페이스트리, 제과 제품 등을 위한 필링을 포함하지만 이에 제한되지 않음); 디저트, 젤라틴 및 푸딩; 냉동 디저트(- 일반 아이스크림, 소프트 아이스크림 및 기타 모든 종류의 아이스크림 포함하는 - 아이스크림과 같은 냉동 유제품 디저트, 비유제품 아이스크림, 셔벗 등과 같은 냉동 비유제품 디저트를 포함하되 이에 제한되지 않음); 탄산 음료(소프트 탄산 음료를 포함하되 이에 제한되지 않음); 비탄산 음료(풍미수 및 달콤한 차 또는 커피 기반 음료와 같은 부드러운 비탄산 음료를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 음료 농축액(액체 농축액 및 시럽뿐만 아니라 동결 건조 및/또는 분말 제제와 같은 비액체 농축액을 포함하지만 이에 제한되지 않음); 요거트(전지방, 저지방 및 무지방 유제품 요거트뿐만 아니라 비유제품 및 무유당 요거트 및 이들 모두의 냉동 등가물을 포함하되 이에 제한되지 않음); 스낵 바(시리얼, 견과류, 씨앗 및/또는 과일 바를 포함하되 이에 제한되지 않음); 빵 제품(누룩 및 누룩을 넣지 않은 빵, 소다 빵과 같은 효모 및 무효모 빵, 모든 유형의 밀가루로 구성된 빵, 모든 유형의 비밀가루로 구성된 빵(예: 감자, 쌀 및 호밀 가루), 글루텐 프리 빵); 빵 제품을 준비하기 위한 미리 만들어진 빵 믹스; 소스, 시럽 및 드레싱; 스위트 스프레드(젤리, 잼, 버터, 너트 스프레드 및 기타 퍼뜨릴 수 있는 보존 식품, 보존 식품 등을 포함하되 이에 제한되지 않음); 제과 제품(젤리 캔디, 소프트 캔디, 하드 캔디, 초콜릿 및 껌을 포함하나 이에 제한되지 않음); 감미료를 넣은 아침식사용 시리얼(압출된(kix 유형) 아침식사용 시리얼, 플레이크형 아침식사용 시리얼 및 부풀린 아침식사용 시리얼을 포함하나 이에 제한되지 않음); 및 감미료를 넣은 아침식사용 시리얼 제조에 사용하기 위한 시리얼 코팅 조성물을 포함한다. 여기에 언급되지 않았지만 통상적으로 하나 이상의 영양 감미료를 포함하는 다른 유형의 식품 및 음료 제품이 또한 본 발명의 맥락에서 고려될 수 있다.
본 발명의 식품 또는 음료 제품에서 영양 감미료의 전체 또는 부분 대체의 결과로, 본 발명의 식품 또는 음료 제품은 저칼로리 또는 다이어트 제품, 의료 식품/제품(알약 및 정제 포함), 및 스포츠 영양 제품, 주어진 가용성 고형분 수준에서 더 낮은 단맛을 요구하는 식품 또는 음료 제품에 특히 적합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 감미 조성물은 감미료 시스템을 형성하기 위해 다른 영양 또는 비영양 감미료로 보충될 수 있다. 감미료 시스템은 본 발명의 감미료 조성물, 말토덱스트로스, 아카시아 검 등과 같은 증량제, 및 적어도 하나의 고강도 감미료를 포함할 수 있다. 조성물은 액체 조성물 또는 건조 블렌드로서 제공될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 Myd 폴리펩티드를 첨가하는 단계를 포함하는, 경구 투여용 제품의 단맛을 향상시키는 방법을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 감미 조성물을 경구 투여용 제품에 첨가하는 단계를 포함하는, 경구 투여용 제품의 단맛을 개선하는 방법을 포함한다. 첨가량은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 감각 테스트를 가이드로 사용하여 결정될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 그 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1은 PHYRE2.0 단백질 폴딩 예측 툴을 사용하여 서열 데이터를 기반으로 예측된 Myd1의 3차원 구조를 보여준다.
도 2는 부분적으로 정제된 M. 테르페지오이데스 글레바의 분획으로부터 얻은 단백질의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 3은 대장균에서 발현된 SEQ ID NO:21의 정제 단계의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 레인 1: 분자량 표준; 레인 3, 조 용해물; 레인 4, HisPur™ Ni-NTA의 유동 통과 분획; 레인 5, 워시 1; 레인 6, 워시 2; 레인 7, 워시 3; 레인 8, 용출 분획.
도 4는 마이코둘세인, 아스파탐, 타우마틴, 레바우디오사이드 A에 대한 단맛에 대한 농도-반응 함수를 나타낸다. 데이터는 200mM 수크로스 관련("단맛") 표적에서 발생하는 반응의 비율(p)로 플롯팅된다. 마이코둘세인, 아스파탐, 타우마틴, 레바우디오사이드 A에 대한 곡선의 각 데이터 포인트는 32회 반복에 걸쳐 평균으로 계산되었고 수크로스 곡선에 대해 16회 반복에 걸쳐 평균을 냈다. 오차 막대는 SEM이다. 물 및 수크로스 대조군에 대한 포인트는 각각 128회 및 64회 반복에 걸쳐 평균으로 유사하게 계산되었다. 곡선은 비선형 회귀에 의해 맞춰졌다.
도 5A는 마이코둘세인 예측 3차 구조와 타우마틴(PDB: 1RQW), 모넬린(PDB: 2O9U), 브라제인(PDB: 1BRZ), 및 치킨 에그 화이트 리소자임(PDB: 1LSN)(단백질 데이터베이스)의 공지된 결정 구조의 비교한 것을 나타내며, 이는 마이코둘세인이 베타 시트와 평행한 알파 나선을 가진 역평행 베타 시트를 포함하는 다른 알려진 감미 단백질과의 3차 구조 유사성을 예측했음을 보여준다.
도 5B는 추정되는 2차 구조 모티프에 중첩된 SEQ ID NO:3의 예측된 2차 구조 및 각 모티프 내 점 돌연변이의 위치를 나타낸다.
도 6은 단맛 강도, 단맛 인식 시작 시간 및 단맛 인식 지속 시간에 대해 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 동일한 단백질 농도로 균등화된 돌연변이 his-태그된 마이코둘세인을 서로 및 his-태그된 비-돌연변이 마이코둘세인과 비교한 결과를 보여준다.
도 7A는 Capto MMC로부터 용출된 분획의 SDS-PAGE 분석, 쿠마시 염색을 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인 1: 용출된 분획, 양이온 교환 후 낮은 순도를 나타냄. 화살표는 마이코둘세인 밴드를 나타냄.
도 7B는 SDS-PAGE 분석, 쿠마시 염색, SDS-PAGE에서 분석된 HiScreen Capto Butyl 컬럼으로부터 구배 용출 동안 수집된 2개의 용출된 분획을 보여준다. 레인 1은 마이코둘세인을 포함하지 않는 용출 분획 1을 나타내고, 레인 2는 용출된 마이코둘세인을 나타낸다. 용출 분획의 순도는 GelAnalyzer에 의해 ~86%로 측정되었다. 화살표는 마이코둘세인 밴드를 나타냄.
도 7B는 SDS-PAGE 분석, 쿠마시 염색, HiPrep 26/60 Sephacryl S-200에서 크로마토그래피 후 HIC 컬럼으로부터 용출된 단백질을 보여준다. 레인 1은 정제된 his-tag 마이코둘세인을 보여주고 레인 2는 정제된 천연 마이코둘세인을 보여준다. 용출 분획의 순도는 GelAnalyzer에 의해 ~98%로 결정되었다. 화살표는 마이코둘세인 밴드를 나타냄.
실시예
실시예 1
신선한 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플은 자연 범위에서 적절한 절차와 허가를 통해 현장에서 얻었다. 신선한 샘플(총 29개)을 MycoTechnology, Inc. 시설로 배송하고 RO 수로 부드럽게 세척한 다음 액체 질소에서 냉동하고 -80 ℃에서 보관하였다. 트러플의 평균 수분 함량은 83.6% ± 4.6%이었다.
트러플의 수성 추출을 다음과 같이 수행하였다. 8개의 서로 다른 트러플 샘플을 액체 질소 내에서 막자로 빻아 가루로 만든 다음 4 ℃ 물의 5:1 v/w 트러플을 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 추출된 물질을 저속으로 간단히 원심분리하고 여과액에서 "깔끔한" 맛을 봤다. 단맛 강도는 단맛이 없는 경우 0에서 매우 달콤한 경우 10으로 평가되었다. 샘플 중 단맛은 다음과 같이 평가되었.
표 1. 다양한 트러플 샘플의 단맛.
Figure pct00001
수성 추출물은 인산나트륨 완충액에서 pH 7 및 pH 2의 4℃에서 저장되었고, 8일 동안 단맛의 변화가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 2
M. 테르페조이데스 유래 감미 단백질 Myd의 정제.
신선한 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플은 자연 범위에서 적절한 절차와 허가를 통해 현장에서 얻었고 -80 ℃에서 보관하였다. 샘플 16.3g을 냉동고에서 꺼내어 막자 사발과 막자(백색 세라믹)로 액체 질소에서 분쇄하였다. 분쇄를 15분간 진행하여 조직을 충분히 분쇄하여 미세한 동결분말을 얻었다. 분말을 50mL Falcon 튜브에 넣고 20mL RO-H2O를 넣고 소용돌이를 일으켜 얼음 결정이 보이지 않을 때까지 조직을 섞었다. 4℃에서 2 X 1분 동안 20으로 설정한 Rotor-Stator를 사용하여 조각을 분해하고 균일한 용액(H1)을 만들었다. 슬러리의 부피를 RO-H2O로 53mL로 조정하고 4 ℃에서 30분 동안 7500 x G에서 원심분리하였다. 이 단계의 상청액(S1)을 2mL Eppendorf 튜브에 수집하고 5417 R 및 Eppendorf 원심분리기에서 20,000 x G로 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 펠릿(P1)을 버렸다. (인간의 감각을 통해) 단맛을 상청액에서 감지하였다. 이 단계의 상청액을 수집하여 모았다. 이어서 상청액을 0.45 미크론 주사기 필터(셀룰로스, VWR 인터내셔널), 25 mm를 통해 여과하고 S1 + 0.22 um 여과로 명명하였다. 이어서 여액을 헥산 38mL 내지 50mL 헥산으로 2회 세척하고 수상을 수집하였다. S1FH는 S1F + 헥산 워시를 나타낸다. 헥산 상을 저장하고 건조시켰다. 이어서 수상을 아세톤으로 침전시켰다. (-20℃에서 50mL를 분획 S1FH 33ml에 첨가하고 -20℃에서 30분 동안 설정하였다.) 샘플을 3,000 x g에서 원심분리하고 침전물을 수집하였다. 침전물을 10mM 인산나트륨 pH 6에 재현탁시키고, 이 단계의 상청액을 S2라고 하고 침전물을 P2라고 한다. 상청액 S2를 먼저 분자량 컷오프가 100kD인 AMICON 원심 필터 장치에 적용하여 여과액(통과) 부분(100F라 함)과 잔류물(100R이라 함)을 얻었다; 이어서 분자량 컷오프가 30kD인 장치에 100F를 적용하여 여액(30F)과 잔류물(30R)을 생성하였다. 단맛 분획은 100kD 컬럼을 통해 흐르고 100F에서 30kD 컬럼(30R)에 유지되었다. 도 2의 SDS-PAGE에서 화살표로 나타낸 바와 같이 약 13 kDa에서 밴드가 관찰되었으며, 이 밴드를 잘라내어 표준 검출 방법, 예를 들어 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법을 사용하여 Edman 분해에 의해 N-말단 서열 분석을 수행하여 각 주기에 대한 잔류물을 확인하였다. SEQ ID NO:4의 폴리펩티드가 검출되었다.
실시예 3(RNA의 동정)
샘플 수집
신선한 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플을 자연 범위에서 적절한 절차 및 허가를 통해 현장에서 얻었다. 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플(gleba)의 야생 분리주(BDP2_18)는 자연 환경에서 공급되었다. BDP2_18은 제거된 가장 큰 야생 트러플이었으며 트러플은 "달콤함이 먼저 올라오고, 더 많은 곰팡이 및 흙내, 낮은 달콤한 여운"의 단맛 특성을 가졌다.
샘플 확인
글레바의 야생 분리주를 ITS(Internal Transcribed Spacer) 시퀀싱을 위해 냉동 상태로 GeneWiz로 배송하였다. 시퀀싱된 게놈 유전자좌는 ITS 1 & 2 영역이다. 생성된 Sanger 시퀀싱 판독값을 정렬하고 품질이 낮은 염기를 제거하였다. 그런 다음 각 시퀀스는 개별 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990) 검색을 거쳐 동일성을 확인하였다. BLASTn 검색은 공개되지 않은 샘플 서열이 제외된 뉴클레오티드 수집(nr/nt)을 사용하여 사용되었다. 야생 분리주에 대한 동일성이 가장 높은 항목은 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 균주 rib02이다.
샘플 준비
야생 단리물, BPD2_18을 멸균수로 표면적으로 세척하고 ~ 100 mg 무게의 입방체로 자르고 액체 N2에서 급속 동결시켜 -80℃에서 저장하였다. 배송은 GeneWiz용 드라이아이스로 진행되었다.
RNA 시퀀싱
다음 샘플을 Illumina HiSeq, 2x150 bp, 단일 인덱스, 레인당 ~350M 레인당raw PERs(paired-end reads) 표준 RNASeq용 GeneWiz를 통해 제출하였다. 이 RNASeq 연구에는 전사체 프로파일링을 위한 polyA+ 선택이 포함되었다.
GeneWiz는 제조업체의 지침에 따라 Qiagen RNeasy Plus Universal 미니 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA 라이브러리 준비는 Illumina용 NEBNext Ultra RNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 수행되었다. Illumina 어댑터 시퀀스는 아래에 설명되어 있다.
5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT -3'(SEQ ID NO: 18)
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7 barcode]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG -3' (SEQ ID NO: 19)
마티롤로마이세스 테르페지오이데스의 2가지 균주(각각 3회 반복)에 대한 RNA-seq 연구의 Fastq 서열 파일을 트리밍하고 HTStream으로 세척하여 다음 오염 물질을 제거하였다. PhiX(시퀀싱의 일반적인 오염 물질), rRNA 판독, 시퀀싱 어댑터, 저품질 및 "N" 염기, poly-a tracts, 프라이머 및 판독 < 50bp. 그런 다음 세척된 파일에서 M. 테르페지오이데스의 각 균주에 대한 전사체의 de novo 어셈블리에 rnaSPAdes (Bushmanova E, Antipov D, Lapidus A, Prjibelski AD. rnaSPAdes: a de novo transcriptome assembler and its application to RNA-Seq data. Gigascience. 2019;8(9):giz100. doi:10.1093/gigascience/giz100)를 사용하였다. Bandage(a Bioinformatics Application for Navigating De novo Assembly Graphs Easily) (Ryan R. Wick, Mark B. Schultz, Justin Zobel, Kathryn E. Holt, Bandage: interactive visualization of de novo genome assemblies, Bioinformatics, Volume 31, Issue 20, 15 October 2015, Pages 3350-3352)는 단백질 질의 서열(PDLSSFITIKNNNSNHVFTRT, SEQ ID NO:4)을 모든 6개의 판독 프레임에서 동적으로 번역된 조립된 트랜스크립톰 서열 데이터베이스와 비교하는 tBLASTn 검색(Gertz EM, Yu YK, Agarwala R, Schaffer AA, Altschul SF. Composition-based statistics and translated nucleotide searches: improving the TBLASTN module of BLAST. BMC Biol. 2006;4:41. Published 2006 Dec 7. doi:10.1186/1741-7007-4-41)을 사용하여 표적 펩티드에 대한 어셈블리를 시각화하고 검색하는데 사용되었다.
RNA 전사체가 확인되었고, 그 DNA 카피는 SEQ ID NO:1로 나타낸 서열을 가지며, 그 중 SEQ ID NO:2는 시작 및 정지 코돈에 기초한 예측된 코딩 서열이다. 13.3kD의 추정 크기를 갖는 121개의 아미노산을 갖는 예측 단백질, SEQ ID NO:3도 제공된다. 길이: 122aa, 분자량: 13.381kDa, 예상 등전점: 8.64, pH 7에서 예상 전하: 1.01.
블라스트 분석. 예측된 단백질 SEQ ID NO:3과 GENBANK의 다른 단백질 서열 사이의 동일성은 31% 이하였다. 피솔리더스 틴트투리우스의 가상 단백질(GenBank: KIN98154.1; SEQ ID NO:7)이 SEQ ID NO:3과 대략 31% 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 가상 단백질 M404DRAFT_1005519[피솔리더스 틴트투리우스 Marx 270]라고 한다. SEQ ID NO:7은 또한 단맛 조절 활성을 가질 수 있다는 가설을 세운다. RNA 전사체의 완전한 cDNA 카피는 SEQ ID NO:6으로 주어진 코딩 서열을 갖는 SEQ ID NO:5이다.
실시예 4 (대장균에서 마이코둘세인의 클로닝 및 이종 발현; 단맛 확인)
SEQ ID NO:3으로 확인된 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 히스티딘 태그를 포함하는 SEQ ID NO:20을 발현하기 위한 3개의 발현 벡터를 합성하고 Atum, Inc.(Newark, CA)에 의해 3개의 상이한 Atum 벡터 백본: pD454-SR (plasmid pMy_3000), pD454-MR (plasmid pMy_3001), 및 pD454-WR (plasmid pMy_3002)로 클로닝하였다. 이들은 모두 ampicillin-r, lacl, Lac01, Ori_pUC 및 중 (M), 강 (S) 및 약 (W) 플라스미드의 리보솜 결합 부위를 포함하는 E. coli IPTG-유도성 T7 프로모터 발현 벡터이다. E. coli BL21 DE3(Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113-130) (New England Biolabs)은 제조업체 프로토콜을 사용하여 pMy_3000, pMy_3001, pMy_3002로 형질전환되었다. 요컨대, 이전에 동결된 컴피턴트 세포를 해동하고 1pg -100ng의 플라스미드 DNA와 혼합하고 얼음에서 30분 동안 유지하였다. 이 혼합물에 45초 동안 42℃의 열충격을 가하였다. 그 직후, 혼합물을 10분 동안 지속되는 얼음조에 넣었다. 950μL의 예열된 LB 배지를 첨가한 다음 37 ℃에서 1시간 동안 225rpm으로 진탕하였다. 각각의 형질전환 반응에 대해 세포를 1:10 및 1:100으로 희석하고 항생제 플레이트에 100 μL 도말하였다. 37 ℃에서 밤새 성장하면 콜로니가 완전히 회복되고 눈에 띄게 된다. 성공적인 형질전환을 확인하기 위해 csPCR(colony screen PCR)을 수행하여 플라스미드의 cDNA 영역을 조사하고 lysate SDS-PAGE를 통해 발현을 확인하였다. 진탕 플라스크 스케일 유도 발현을 사용하여 대장균 숙주에서 이종 발현을 확인하였다. 이 공정은 각각 플라스미드 pMy_3000, pMy_3001 및 pMy_3002를 포함하는 균주 Z14CE, Z15CE, Z16CE를 생산하였다. 3개의 균주(Z14CE, Z15CE, Z16CE)는 LB + 암피실린 100μg/mL 한천 플레이트에서 유지되었고 음성 대조군(Eco_0001)은 LB 한천 플레이트에서 유지되었다. 배플이 없는 250mL 배양 진탕 플라스크에서 50mL의 LB 액체 배지에서 각 균주에 대해 밤새 배양하여 37 ℃에서 적절한 항생제와 함께 150rpm으로 진탕하였다. 각각의 하룻밤 배양물을 다음 날 배플 1000 mL 배양 진탕 플라스크에 200 rpm으로 진탕시키고 적절한 항생제를 사용하여 0.1 OD600으로 조정한 200 mL의 TB 액체 배지에 시딩하였다. OD600이 0.8에 도달하면 IPTG 보충제를 배지에 최종 농도 0.66mM로 첨가하였다. 추가 5시간 동안 37 ℃에서 진탕을 계속하였다. 발현 후, 세포를 4000g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 펠릿을 약 20mL의 워시 완충액(10mM 인산나트륨 완충액 pH 7.0)에 현탁하였다. 부유 세포는 최대 2,000 bar에서 작동되는 고압 균질기(C3 Emulsiflex, Avestin, Inc., Ottawa, ON, Canada)에서 파쇄되었다. 파쇄된 세포를 13,000g(30분)에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 가용화된 단백질을 함유하는 상청액을 0.22㎛ PES 멤브레인 유닛(Millipore, Burlington, MA, USA)을 통해 여과하였다. SDS PAGE를 실행하고 13.1kD 밴드(Coomassie 염색)를 관찰하여 발현을 확인하였니다.
Thermo Scientific™ HisPur™ Ni-NTA 수지는 효과적인 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 his 태그가 부착된 단백질 SEQ ID NO:20을 정제하는데 사용되었다. SEQ ID NO:20은 6% 가교된 아가로스 수지에 고정된 니켈로 하전된 니트릴로트리아세트산(NTA) 킬레이트를 사용하여 정제되었다. 용해물을 준비된 IMAC 컬럼에 로딩하고 결합 완충액: 20mM 제1인산나트륨, 0.5M 염화나트륨, 0.1M 이미다졸, pH 7.4과 평형을 이루고 용출 완충액: 20mM 제1인산나트륨, 0.5M 염화나트륨, 0.5M 이미다졸을 사용하여 용출하였다. 컬럼을 결합 완충액으로 3회 세척한 다음 his-tagged 마이코둘세인을 용리 완충액으로 4회 용리한 다음 30 kDa MWCO 필터를 사용하여 용출된 분획을 bv 한외여과한 다음 15분 동안 4000x G 동안 10 kD 필터를 통해 여액을 여과하였다. 잔류물을 희석하고 세척 단계를 위해 다시 회전시켰고, 3회 반복하였다. SDS-PAGE에 의한 정제 단계 분석은 도 3에 나와 있다.
정제된 분획(고도로 정제된 SEQ ID NO:21을 함유하는, 도 3의 레인 8에 도시됨)은 숙련된 관능 과학자(0.2mL 분취량)에 의해 0.03mg/ml로 맛을 보았고 8°브릭스(약 8% 설탕 용액)에 해당하는 단맛을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 M. 테르페지오이데스로부터 분리된 마이코둘세인이 실시예 1 및 2에서 관찰된 단맛 활성을 담당한다. 단맛은 "깨끗한" 단맛(설탕 같은 맛) 다른 향은 없고 약간 지연된 시작과 달콤한 뒷맛이 있었다.
실시예 5(마이코둘세인(HIS-TAG)의 파일럿 규모 생산)
코딩 서열 SEQ ID NO:20을 포함하는 실시예 4에서 제조된 대장균 균주 Z14CE는 실험실 규모 생물반응기에서 발효 동안 이의 성능에 대해 테스트되었다. 생물반응기 배양은 10.0 L Bioflo 320 둥근 바닥 교반 발효기(BioFlo/CelliGen 310, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA)에서 수행되었다. 발효기에는 pH 및 용존 산소 센서(Mettler Toledo, OH, USA)가 장착되었다. 온도는 물로 채워진 스테인리스 스틸 베이스를 통해 제어되었다. 샤프트의 바닥 바로 위에 위치한 가장 낮은 임펠러와 함께 47mm 간격으로 2개의 장착된 6날 Rushton 터빈에 의해 교반이 제공되었다. 천공된 파이프 스파저 링을 통해 폭기가 발생하였다. 용존 산소(DO)는 500~800rpm 사이의 연속적인 교반 캐스케이드와 높은 세포 밀도에서 살포된 공기로 5~8L/min 사이의 통기를 사용하여 공기 포화도의 20%에서 제어되었다. 5.0M 수산화암모늄을 사용하여 pH를 7.0으로 조절하였다. Antifoam 204(Sigma, St Louis, MO, USA)를 자동으로 추가하여 발포를 제어하였다. 후자는 배양 수준 보다 10cm 위에 장착된 전도도 프로브를 사용하여 감지되었다. 주요 발효 배지는 (리터당) 효모 추출물 24g, 트립톤 12g, 글리세롤 5.42mL, 인산염 완충액 스톡(0.17M KH2PO4, 0.72M K2HPO4) 100mL를 함유하였다. 배지는 2M HCl을 사용하여 pH 7.0으로 조정하였다. 원래 포도당 공급이 고갈되었을 때(pH 상승으로 신호를 받았을 때), (리터당) 200g 포도당, 21.1g (NH4)2SO4 및 19.7g MgSO4로 구성된 피드 배지를 초기 유속: 1.00mL/분으로 발효기로 펌핑하였다. 달리 명시되지 않는 한, 용기 내 배지의 초기 부피는 4.0L였다. 접종물(200ml)은 1L 배플 진탕 플라스크(37℃, 200rpm) 내 LB 스타티드 배양 배지에서 16시간 동안 성장한 배양물로 구성되었다. 발효기 온도는 37℃였다. 광학 밀도가 10-20에 도달한 후 0.66mM IPTG로 발효를 유도하고 그 후 24시간 동안 계속하였다. 이후 24시간 유도 기간 후 육즙을 4000g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 펠릿을 1L의 워시 완충액(10mM 인산나트륨 완충액 pH 7.0)에 현탁시켰다. 부유 세포는 최대 1,500bar까지 작동되는 고압 균질기(C3 Emulsiflex, Avestin, Inc., Ottawa, ON, Canada)에서 파쇄되었다. 파쇄된 세포를 13,000g(30분)에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 가용화된 단백질을 함유하는 상청액을 0.22㎛ PES 멤브레인 유닛(Millipore, Burlington, MA, USA)을 통해 여과하였다.
이 실시예에서 제조된 정제된 상청액은 숙련된 관능 과학자(0.2mL 분취량)에 의해 0.03mg/ml에서 맛을 보았고 8°브릭스(약 8% 설탕 용액)에 해당하는 단맛을 갖는 것으로 밝혀졌다. 단맛은 매우 눈에 띄게 달았고, 다른 향미가 없는 "깨끗한" 단맛(설탕 같은 맛)이었으며, 약간 지연된 발현과 달콤한 뒷맛이 있었다.
상청액은 -20℃에서 분취량으로 저장되었고 추가 실험에 사용되었다.
실시예 6(대장균 ELISA 정량화로부터의 마이코둘세인)
SEQ ID NO:21의 카르복시 말단 상의 6XHis-Tag 서열에 대한 HRP(horseradish peroxidase) 접합 항체로 his-tagged 마이코둘세인(SEQ ID NO:21)을 정량화하기 위해 직접 ELISA를 개발하였다. ELISA는 복합 용해물 및 정제된 단백질에서 마이코둘세인 농도를 측정할 수 있다. 재조합 6XHis-태그된 대장균 마이코둘세인은 분자량이 14.2kDa이고 몰 흡광 계수가 27,960M-1cm-1이며, 당업계에 공지된 방법에 의해 아미노산 서열로부터 계산된다. 순도는 SDS-PAGE에 의해 ≥ 98%로 평가되었다. 마이코둘세인 단백질 농도는 Beer-Lambert의 법칙을 사용하여 280nm에서 흡광도로 결정한 다음 ELISA를 위해 알려진 농도의 마이코둘세인(μg/ml)을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다.
ELISA 절차: 실온에서 30분 동안 50mM 탄산염 완충액 pH 9.4 코팅 완충액에서 고단백질 결합 96-웰 플레이트의 벽에 단백질을 결합시켰다. 플레이트를 0.02% Tween-20이 포함된 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4로 3회 세척하였다. 마이크로플레이트 상의 비특이적 결합 부위를 실온에서 15분 동안 PBS pH 7.4에서 5% BSA로 차단하고 PBS 0.02% Tween-20으로 3회 세척하였다. 1차 항체를 차단 완충액으로 희석(1:1000)하고 마이크로플레이트를 1시간 동안 배양하고 PBS 0.02% Tween-20에서 3회 세척하였다. 비색 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 8분 동안 HRP 반응을 전개하고 2N 황산으로 중단하였다.
실시예 7(마이코둘세인의 농도 의존성의 정량적 특성화)
Opertech Bio(Philadelphia, PA)는 실시예 5에 기술된 바와 같이 대장균으로부터 수득되고 실시예 4에 기술된 바와 같이 정제된 정제된 his-태그된 마이코둘세인(SEQ ID NO:21)의 맛 특성의 농도 의존성의 정량적 특성화를 수행하였다. 마이코둘세인의 단맛 효능 및 상대적 효능을 수크로스 및 기타 감미료인 타우마틴, 레바우디오사이드 A 및 아스파탐과 비교하였다. 대조군 표준은 200mM 수크로스, 100mM NaCl, 0.5mM 퀴닌 및 10mM 시트르산의 용액이었다. 도 4는 마이코둘세인, 아스파탐, 타우마틴, 레바우디오사이드 A에 대한 단맛에 대한 농도-반응 함수를 보여준다. 데이터는 200 mM 수크로스 관련("단맛") 표적에서 발생하는 반응의 비율(p)로 표시된다. 마이코둘세인, 아스파탐, 타우마틴, 레바우디오사이드 A에 대한 곡선의 각 데이터 포인트는 32회 반복에 걸쳐 평균으로 계산되었고 수크로스 곡선에 대해 16회 반복에 걸쳐 평균을 냈다. 오차 막대는 SEM이다. 물 및 수크로스 대조군에 대한 포인트는 각각 128회 및 64회 반복에 걸쳐 평균으로 유사하게 계산되었다. 곡선은 비선형 회귀에 의해 맞춰졌다.
최대 단맛 반응의 절반을 유도하는 농도(EC50 또는 역가)는 비선형 회귀로부터 도출되었다. 마이코둘세인(MYC), 수크로스(SUC), 아스파탐(ASP), 레바우디오사이드 A(REB) 및 타우마틴(THN)에 대한 EC50(및 95% 신뢰 구간)은 표 2에 나와 있다. 또한 몰 기준 및 중량 기준으로 수크로스에 대한 당량도 제공된다.
표 2
Figure pct00002
타우마틴, 수크로스 및 SEQ ID NO:21의 평가는 단백질 및 10% 수크로스에 대해 0.045mg/ml의 물에서 명명된 분석물의 단맛 감각의 CATA(click all that apply) 시간 강도를 사용하여 수행되었다. 방법론: 시간 강도 기술; 데이터 수집 소프트웨어: EyeQuestion, 응답은 2.57초마다 기록됨; 스케일링 방법: 15-포인트 단맛 스케일, 예, 스코어 5 = 5% 수크로스, 스코어 10 = 10% 수크로스; 평가 프로토콜: 소량 헹굼(small volume sip), 젖힘과 뱉기 테스트(tilt and spit test). 패널리스트 수: 3-6, 복제 수: 2. 모든 샘플은 블라인드였고 무작위 3자리 코드가 제시되었다.
훈련 전략: 단맛 평가를 자신 있게 수행하기 위해 15-포인트 단맛 척도에서 6주에 걸쳐 단맛 척도에 대한 집중 훈련. 특유의 단맛 거동 패턴으로 인해 3주에 걸쳐 시간 강도 원칙을 훈련하는 것이 필요하다. 시간을 기록하고 합의에 도달하는 데 도움이 되도록 스톱워치로 샘플을 맛보았다. 패널리스트 수: 3-6, 복제 수: 2. 모든 샘플은 블라인드였고 무작위 3자리 코드로 제시되었다. 통계분석 : 패널 인원이 적어 통계분석 불가
마이코둘세인 및 타우마틴의 최대 강도(Imax)는 수크로스 보다 시험된 양에서 15포인트 척도에서 대략 1점 더 높았다. 타우마틴과 마이코둘세인은 기울기가 더 완만하여 더 긴 피크 시간과 더 점진적/더 긴 감소를 나타낸다. 수크로스는 162초에 타우마틴 및 마이코둘세인 보다 빨리 임계 단맛(강도 <1)에 도달한다. 수크로스가 역치 수준에 도달하면 타우마틴과 마이코둘세인이 중저 강도로 인식된다. 마이코둘세인과 타우마틴은 이 실험에서 유사한 효능을 나타내는 것으로 나타났으며, 중량 기준으로 수크로스 보다 약 3000배 더 달거나 몰 기준으로 수크로스 보다 약 120,000배 더 달다. 이 두 실험에서 마이코둘세인은 중량 기준으로 수크로스 보다 400배 내지 3000배 더 단맛이 나는 고강도 감미 단백질인 것으로 나타났다.
실시예 8(단맛 및 열 안정성에 대한 마이코둘세인 변이체의 생산 및 시험)
마이코둘세인에서 잠재적 핵심 잔기를 확인하는 방법. 감미 단백질은 1차 서열 동일성이 없지만 전체 3차 구조는 감미 핑거 모티프를 갖는다(Tancredi, T., Pastore, A., Salvadori, S., Esposito, V. & Temussi, P. A. Interaction of sweet proteins with their receptor: A conformational study of peptides corresponding to loops of brazzein, monellin and thaumatin. European Journal of Biochemistry 271, (2004): 2231-2240.). 감미 단백질에는 베타 시트에 수직인 알파 나선이 있는 역평행 베타 시트가 있다. 감미 단백질인 타우마틴, 모넬린, 브라제인 및 리소자임 3차 구조를 PyMOL 2.0(The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrodinger, LLC)을 사용하여 분석하고 Phyre2(Kelley LA et al. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction, and analysis Nature Protocols 10, (2015): 845-858)로 생성된 마이코둘세인 모델과 비교하였다 (도 5A). 이온성 아미노산 잔기의 23개의 보존적 단일 점 돌연변이가 생성되었다. 음으로 하전된 글루타민과 아스파르트산은 지방족 사슬에 추가 탄소가 있다는 점에서 다르다. 양전하를 띤 라이신과 아르기닌을 치환하는 것이 보존적 치환으로 간주되지만, 아르기닌의 구아니디늄은 수소 결합, 방향족 및 지방족 접촉을 포함하여 아미노산과 추가 상호작용을 형성할 수 있다. 이온성 아미노산 돌연변이는 리신에서 아르기닌으로, 아르기닌에서 리신으로, 아스파르트산에서 글루탐산으로, 글루탐산에서 아스파르트산으로의 돌연변이였다. 각 돌연변이의 상대적인 위치는 PyMOL 2.0에 의해 모델링되었으며 N-말단, 3개의 루프 영역, 5개의 베타-시트, 1개의 알파-나선 및 C-말단으로 분류되었다(도 5B 참조).
구체적으로, 다음의 단일 돌연변이가 생성되었고, 이들의 예상 위치는 표 3에 있다. 추정되는 2차 구조 모티프에 중첩된 SEQ ID NO:3 예측 2차 구조의 표시 및 각 모티프 내의 표 3 점 돌연변이의 위치를 보여주는 도 5B도 참조하시오.
클로닝: Eco_0001 일명 대장균 BL21 DE3 (E. coli str. B F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)) (New England Biolabs# C2527I에서 입수)을 제조업체 프로토콜을 사용하여 23개의 플라스미드(pMy_3018에서 pMy_3040으로)로 형질전환하였다. 요컨대, 이전에 동결된 컴피턴트 세포를 해동하고 1pg - 100ng의 플라스미드 DNA와 혼합하고 빙 상에서 30분 동안 유지하였다. 이 혼합물에 45초 동안 42℃의 열충격을 가하였다. 그 직후, 혼합물을 10분 동안 지속되는 얼음조에 넣었다. 950μL의 예열된 LB 배지를 첨가한 다음 37℃에서 1시간 동안 225rpm으로 진탕하였다. 각각의 형질전환 반응에 대해 세포를 1:10 및 1:100으로 희석하고 항생제 플레이트에 100 μL 도말하였다. 37℃에서 밤새 성장하면 콜로니가 완전히 회복되고 눈에 띄게 된다. 이 공정은 플라스미드 pMy_3018 내지 pMy_3040을 순차적으로 포함하는 균주 Z18CE 내지 Z40CE를 생성하였다. 진탕 플라스크 스케일 유도 발현을 사용하여 대장균 숙주에서 이종 발현을 확인하였다. 형질전환 후 돌연변이체를 플레이팅하고 LB + 암피실린 100㎍/mL 한천 플레이트에 유지시켰다.
플레이트를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 콜로니 스크린 PCR은 플라스미드의 cDNA 영역과 함께 플랭킹 영역을 조사하도록 설계된 콜로니 스크리닝 프라이머를 사용하여 유전자형을 확인하기 위해 수행되었다. 성공적인 형질전환은 특정 크기의 DNA 조각을 생성하는 반면, 음성 대조군과 주형 대조군이 없으면 PCR 밴드가 나타나지 않는다. 모든 돌연변이에 대해 성공적인 형질전환이 관찰되었다. 진탕 플라스크 스케일 유도 발현을 사용하여 대장균 숙주에서 이종 발현을 확인하였다.
23개의 균주(Z38CE 내지 Z60CE)는 LB + 앰피실린 100㎍/mL 한천 플레이트에서 유지되었고 음성 대조군(Eco_0001)은 LB 한천 플레이트에서 유지되었다. 배플이 없는 250mL 배양 진탕 플라스크에서 50mL의 LB 액체 배지에서 각 균주에 대해 밤새 배양하여 37 ℃에서 적절한 항생제와 함께 150rpm으로 진탕하였다. 각각의 하룻밤 배양물을 다음 날 배플링된 1000 mL 배양 진탕 플라스크에 200 rpm으로 진탕시키고 적절한 항생제를 사용하여 0.1 OD600으로 조정한 200 mL의 TB 액체 배지에 시딩하였다. OD600이 0.8에 도달하면 IPTG 보충제를 배지에 최종 농도 0.66mM로 첨가하였다. 추가 5시간 동안 37℃에서 진탕을 계속하였다. 그 후, 세포를 5000g에서 4 ℃에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 대장균 세포를 차가운 dH2O로 한 번 세척하고 다시 4 ℃에서 10분 동안 5000g에서 원심분리하였다. 성공적인 발현을 확인하기 위해 액체질소와 막자사발을 이용하여 세포 용해물을 생성하였다. 세포 펠릿을 10mL의 차가운 dH2O에 재현탁하고 조 용해물을 4 ℃에서 5분 동안 20,000g에서 회전시켰다. 마지막으로, 상청액을 흡인하고 0.2μm PES 필터를 통해 여과하고 SDS-PAGE 단백질 전기영동을 수행하였다. 조 용해물은 단맛을 내는 돌연변이체를 확인하기 위해 맛을 보았다. 표 3은 테스트 결과를 보여준다.
표 3. 마이코둘세인의 단일 점 돌연변이에 대한 단맛 테스트 결과
Figure pct00003
모두 단맛이 있는 변이체 중 16개(Z38CE, Z39CE, Z41CE, Z45CE, Z47CE, Z48CE, Z49CE, Z51CE, Z52CE, Z53CE, Z55CE, Z56CE, Z57CE, Z58CE, Z59CE, Z60CE)를 추가로 200mL의 배지를 사용하여 재발현하였다. 발현 후, 세포를 24시간 유도 기간 후 20분 동안 4000g에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고 펠릿을 약 20mL의 세척 완충액(10mM 인산나트륨 완충액 pH 7.0)에 현탁시켰다. 부유 세포는 최대 2,000 bar에서 작동되는 고압 균질기(C3 Emulsiflex, Avestin, Inc., Ottawa, ON, Canada)에서 파쇄되었다. 파쇄된 세포를 13,000g(30분)에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 가용화된 단백질을 함유하는 상청액을 0.22㎛ PES 멤브레인 유닛(Millipore, Burlington, MA, USA)을 통해 여과하였다. 이어서 실시예 4에 기술된 바와 같이 물질을 IMAC 정제를 통해 분리하였다.
훈련된 관능 과학자가 정제된 샘플을 시음하였다. 마이코둘세인 스톡은 ELISA로 측정했을 때 동일한 단백질 농도로 희석되었다. 대상체는 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)에서 승인한 헹굼과 뱉기(sip and spit) 프로토콜을 따랐다. 각각의 정제된 변이주를 0.2ml씩 혀에 올려놓고 단맛 지각의 강도, 단맛 지각 발현 시간, 단맛 지각 지속 시간을 기록하였다. 결과는 도 6에 나타내었으며 아래에서 설명한다.
마이코둘세인 단맛에 대한 보존적 점 돌연변이의 효과
단맛에 대한 보존적 단일 점 돌연변이의 효과를 연관시키기 위해, 타우마틴, 브라제인, 모넬린 및 라이소자임의 공개된 돌연변이를 마이코둘세인과 비교하였다. 목표는 마이코둘세인 시간 및 강도 프로파일을 수크로스에 일치시키는 것이므로 감각 분석을 통해 수크로스 등가성, 발병 및 총 지속 시간을 측정하였다. 수크로스는 빠른 발현, 높은 강도 및 빠른 지속 시간을 가지고 있다. 따라서, 발현 및 지속 기간을 감소시키는 돌연변이는 수크로스 등가성을 일치시키거나 향상시키는 돌연변이와 마찬가지로 바람직하다. 발현 및 전체 기간을 증가시키는 돌연변이는 수크로스 등가성을 감소시키는 돌연변이와 마찬가지로 바람직하지 않다. 도 5B 및 6을 참조하십시오.
N-말단-외부- D3E
외부 N-말단에서 D3E의 단일 돌연변이의 보존적 변화는 수크로스 등가성 및 기간의 손실을 초래하였다; 그러나 발현은 약간만 감소하였다. 이러한 결과는 단맛 단백질 N-말단의 전하, 크기 및 극성이 단맛과 단백질 안정성에 중요함을 시사한다.
베타 시트 1 - 외부 - K11R
K11R에서 단일 돌연변이의 보존적 변화는 수크로스 등가성에서 약간의 증가 및 발현 시 중간정도의 감소를 초래하였다; 그러나 단맛의 지속 시간은 극적으로 증가하였다. 이러한 결과는 K11이 단맛 수용체 T1R2/T1R3에 결합하는데 중요한 잔기이며 수용체에서 마이코둘세인의 오프율에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
베타 시트 2와 3 사이의 영역 - 외부 - K26R - 링커 영역
K26에서의 보존적 돌연변이는 수크로스 등가성에 대해 약간의 감소를 가져왔고, 이는 이러한 보존적 돌연변이가 단백질 기능성에 상당한 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
루프 2 영역-외부- K51R
분자 모델링은 모든 추정 루프 영역 돌연변이가 용매에 노출되었음을 보여주었다. 발병의 완만한 감소를 제외하고 감각 연구에서 수크로스 등가성 및 총 지속 시간의 약간의 감소만이 관찰되었으며, 이는 이러한 보존적 돌연변이가 단백질 기능성에 유의미한 영향을 미치지 않음을 보여준다.
루프 2 영역-외부- R57K
돌연변이 R57K는 발현, 수크로스 등가성 및 총 지속 기간에 상당한 억제 효과를 갖는다.
베타 시트 4 - 외부 - R66K
돌연변이 R66K는 수크로스 등가성 및 총 지속 시간이 상당히 감소한 반면, 발현은 약간 증가하였다. R66K 돌연변이는 단맛 수용체에 대한 친화도 및 오프율의 핵심 잔기일 수 있다.
루프 3 영역-외부-D69E
D69E에서의 돌연변이는 수크로스 등가성, 지속 시간이 약간 감소하고 지속 시간이 약간 증가한다. 이 부위에서 이 영역은 보존적 돌연변이에 상대적으로 둔감할 것으로 예상된다.
알파-나선 영역 - 외부 - D85E 및 D86E
D85E 및 D86E 모두 마이코둘세인 관능 특성에 유사한 효과를 갖는다. D85E 및 D86E에 대한 수크로스 등가성 및 기간이 감소되었다. 발현은 대조군과 유사하였다.
C-말단 외부-D97E, K103R, R106K 및 E117D는 대조군과 비교하여 최소 효과를 가졌고, 이는 이들 영역이 보존적 돌연변이에 상대적으로 둔감하다는 것을 암시한다. 그러나 R110K와 K120R은 당도와 지속시간이 감소하였지만 발현은 유사하였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, R20K, E35D, K44R, D46E, D52E, R75K 및 D94E에서의 보존적 단일 점 돌연변이는 단백질 발현의 손실을 초래하였다. 이러한 데이터는 이러한 잔기가 대장균 숙주 내에서 단백질 폴딩 또는 발현에 관여할 수 있음을 시사한다. 이 실시예에서 위에서 논의된 예측된 3차 구조 모델은 이러한 모든 잔기가 예측된 베타-시트에 포함되어 있기 때문에 이러한 변화로 인한 단백질 폴딩 오류를 서포트한다.
참고문헌
Korz, D. J., Rinas, U., Hellmuth, K., Sanders, E. A. & Deckwer, W.-D. Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli. Journal of Biotechnology 39, 59-65 (1995).
Norsyahida, A., Rahmah, N. & Ahmad, R. M. Y. Effects of feeding and induction strategy on the production of BmR1 antigen in recombinant E. coli. Letters in Applied Microbiology 49, 544-550 (2009).
실시예 9.
제조업체에서 제공한 지침에 따라 GloMelt™ Thermal Shift Protein Stability Kit(Biotium, Inc. Fremont, CA)를 사용하여 열 안정성은 0.04 mg/mL로 정규화된 실시예 8에 기재된 바와 같이 16개의 달콤한 돌연변이체의 IMAC 정제로부터의 단백질 샘플에 대해 수행하였다. 즉, 열 변화를 측정하기 위한 개별 반응은 다음을 혼합하는데 의존한다: 제조업체의 지침에 따라 키트에 제공된 시약과 함께 25mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 중 마이코둘세인(mycodulcein), 36μg/ml. 열 이동 측정의 경우, BR 투명 플레이트를 사용하는 Bio-Rad CFX96 Touch 시스템(스캔 모드 SYBER/FAM 단독, 25℃에서 30초 동안, 용융 곡선 25℃에서 95℃까지, 10초 동안 0.5℃ 증가 플러스 플레이트 리드)이 사용되었다. Tm은 Schulz, M. N., Landstrφm, J. & Hubbard, R. E. MTSA―A Matlab program to fit thermal shift data. Analytical Biochemistry 433, 43-47 (2013)에 설명된 기술을 사용하여 5-파라미터 방정식으로 실험 데이터에 맞는 곡선에 대해 결정된 중간점을 기반으로 결정된다. 결과(표 4)는 열 안정성이 테스트된 돌연변이의 아미노산 변화에 의해 최소한의 영향을 받는다는 것을 보여준다.
표 4. 돌연변이에 대한 열 안정성 시험 결과
Figure pct00004
실시예 10 (사카로마이세스 세레비시애에서 마이코둘세인의 클로닝 및 이종 발현; 단맛의 확인)
SEQ ID NO:3으로 확인된 뉴클레오티드 서열에 기초하여, SEQ ID NO:21(pMy_4003)(his-tagged) 및 SEQ ID NO:3(pMy_4002)(천연) 마이코둘세인을 발현하는 2개의 발현 벡터를 합성하고 URA3 마커 및 강력한 구성적 프로모터 GPD를 함유하는 Atum 벡터 비-분비 백본 pD1234로 Atum, Inc.(캘리포니아주 뉴어크)에 의해 클로닝하였다. 형질전환 절차는 전기적격 세포를 만든 다음 전기천공을 통해 발현 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 요컨대, 전기활성화(electrocompetent) 세포는 성장 배지에서 염을 제거하기 위해 여러 번 세척하여 초기 및 중간 로그 단계 사이에서 먼저 세포를 성장시킴으로써 생성된다. 발현 벡터 1-5 μg을 혼합한 후, 샘플을 Gene Pulser II 전기천공기에서 다음과 같이 설정한다 (충전 전압: 1.5 kV, 정전 용량: 25 μF, 저항: 200 Ω). 예열된 30℃ YPD 1mL를 즉시 추가하고 현탁액을 30°C에서 1-2시간 동안 200-250rpm으로 진탕한다. 형질전환 후 돌연변이를 플레이팅하고 SC-ura 아가 플레이트에 유지하였다. 이 공정은 각각 플라스미드 pMy_4002 및 pMy_4003을 포함하는 균주 Z19ES, Z20ES를 생성하였다. 플라스미드의 cDNA 영역을 조사하기 위해 csPCR(colony screen PCR)을 수행하였다. 따라서, 성공적인 형질전환은 303 bp의 DNA 단편을 생성하는 반면, 음성 대조군 및 주형 대조군이 없는 경우 PCR 밴드가 없고 발현이 확인되었다.
2개의 균주(Z19ES, Z20ES)는 SC-ura 한천 플레이트에서 유지한 반면, 음성 대조군은 SC 한천 플레이트에서 유지하였다. 배플이 없는 250mL 배양 진탕 플라스크에서 50mL의 SC-ura/SC 액체 배지에서 각 균주에 대한 밤새 배양물을 37℃에서 150rpm으로 밤새도록 성장시켰다. 각 밤새 배양물을 배플링된 1000mL 배양 진탕 플라스크에서 200mL의 SC-ura/SC(O-RDL-R10_TB 배지) 액체 배지에 접종하고 30℃에서 200rpm으로 진탕하고 0.02 OD600으로 조정하였다. 추가 48시간 동안 30℃에서 진탕을 계속하였다. 그 후, 세포를 5000g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 그 후, S. 세레비시애 세포를 차가운 dH2O로 세척하고 다시 4℃에서 5분 동안 5000g에서 원심분리하였다. 성공적인 발현을 확인하기 위해 액체 질소와 막사 사발을 사용하여 세포를 용해시켰다. 세포 펠렛을 10 mL의 차가운 dH2O에 재현탁하고 용해물을 4℃에서 5분 동안 20,000g에서 회전시켰다. 상청액을 0.2μm PES 필터로 여과하였다. 여액(두 균주 모두)은 실시예 3에 기술된 방법에 의해 단맛이 나는 것으로 확인되었다.
Thermo Scientific™ HisPur™ Ni-NTA 수지는 효과적인 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 S. 세레비시애로부터 his-태그된 단백질 SEQ ID NO:20을 정제하는데 사용되었다. SEQ ID NO:20은 6% 가교된 아가로스 수지에 고정된 니켈로 하전된 니트릴로트리아세트산(NTA) 킬레이트를 사용하여 정제되었다. 용해물을 준비된 IMAC 컬럼에 로딩하고, 칼럼을 PBS 중 0.02M 이미다졸로 3회 세척한 다음, PBS 중 0.3M 이미다졸로 his-태그된 마이코둘세인을 4회 용출시키고, 50 kDa MWCO 필터를 사용하여 용출 분획을 한외여과한 다음 3 kDa MWCO 필터로 농축 및 탈염하였다.
실시예 11(균주 Z19ES(S. 세레비시애)로부터 천연 마이코둘세인의 정제)
S. 세레비시애에서 발현된 천연 마이코둘세인(SEQ ID NO:3)의 정제를 위한 유효성에 대해 3가지 크로마토그래피 기술을 평가하였다: 양이온 교환(CIEX), 소수성 상호작용(HIC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC).
양이온 교환 평가.
천연 마이코둘세인에 대한 등전점은 등전 포커싱에 의해 ~9.5인 것으로 결정되었으며, 이는 양이온 교환 컬럼이 마이코둘세인을 정제하는데 성공할 수 있음을 시사한다. 실시예 10에 기술된 바와 같이 제조된 정화된 세포 용해물을 2x 출발 완충액과 혼합하여 pH 7.0에서 50mM 인산나트륨, 1M 황산암모늄에서 세포 용해물을 얻었고, 추후 사용을 위해 4℃에서 보관하였다. 정제 절차는 AKTA Explorer 100 시스템(GE Healthcare, Sweden)에서 수행되었으며 용출된 단백질은 UV 검출기 UV-900(GE Healthcare, Sweden)에서 280 nm 및 215 nm에서 모니터링되었다. CIEX 수지로 미리 채워진 PreDictor 플레이트(GE Healthcare, Sweden)를 사용하여 천연 마이코둘세인의 결합 조건을 스크리닝하였다. 미리 채워진 플레이트에는 Capto S(강한 CIEX), Capto MMC(약한 CIEX) 및 SP Sepharose Fast Flow(강한 CIEX)의 세 가지 주요 수지가 포함되어 있다. 용해물을 20mM 이염기성 인산나트륨으로 투석하고 4~9 범위의 다양한 pH 값을 스크리닝한 다음 최적 조건을 HiScreen 컬럼을 사용하여 확장하였다. 3mL/분의 유속으로 pH 5에서 25mM 이염기성 인산나트륨을 사용하여 평형화를 수행하였다. 결합 단백질은 pH 7에서 25mM 이염기성 인산나트륨, 1M 염화나트륨을 사용하여 0에서 1M까지 증가하는 염화나트륨 구배에 의해 용출되었다. 약 양이온 교환기 Capto MMC가 pH 5에서 최상의 결합 능력을 나타내는 상이한 결합 및 용리 조건을 스크리닝하였다. 그러나 이 단계 이후의 낮은 순도(25%)로 인해 대체 정제 단계를 모색하였다. 도 7A는 Capto MMC에서 용출된 분획의 PAGE 분석을 보여준다. M: 단백질 마커; 레인 1: 용출된 분획, 양이온 교환 후 낮은 순도를 나타낸다. 화살표는 마이코둘세인 밴드를 나타낸다.
HIC 평가.
세포 용해물은 또한 HiScreen CaptoButyl 컬럼(Cytiva, Sweden)을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 적용되었다; pH 7.0에서 5 컬럼 부피의 50mM 인산나트륨, 1M 황산암모늄을 사용하여 평형화를 수행하였다. 그런 다음 세포 용해물을 3mL/분의 유속으로 컬럼에 로딩하였다. 결합된 단백질의 용출을 pH 7.0에서 50mM 인산나트륨을 사용하여 1에서 0M까지 감소하는 황산암모늄 구배에 의해 수행하였다. 얻은 모든 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다.
도 7B는 SDS-PAGE에서 분석된 HiScreen Capto Butyl 컬럼으로부터 구배 용출 동안 수집된 2개의 용출 분획을 보여준다. 레인 1은 마이코둘세인을 포함하지 않는 용출 분획 1을 나타내고, 레인 2는 용출된 마이코둘세인을 나타낸다. 용출 분획의 순도는 GelAnalyzer에 의해 ~86%로 측정되었다.
SEC 평가.
이어서 천연 마이코둘세인을 함유하는 용출된 분획을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR 컬럼(Cytiva, Sweden)을 사용하여 추가로 정제하고, pH 7.0에서 50mM 인산나트륨 및 150mM NaCl을 함유하는 완충액으로 용출하였다. 분획을 수집한 다음 농축하고 3kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심 필터(Millipore-Sigma, 독일)를 사용하여 탈염한 다음 SDS-PAGE로 분석하였다.
요약: 천연 마이코둘세인이 약 양이온 교환기 Capto MMC에 성공적으로 결합하지만, 용출 분획의 상대적으로 낮은 순도는 CIEX를 덜 바람직한 포획/중간 정제 단계로 만들었다. 한편, HIC, Capto Butyl 컬럼에서는 더 높은 순도의 분획물이 얻어졌다. SDS-PAGE 분석에 따르면, 불순물은 상대적으로 높은 분자량을 가지고 있어 SEC를 고순도 천연 마이코둘세인을 얻기 위한 후보로 적정하였다.
HIC/SEC 후 순도는 SDS-PAGE의 GelAnalyzer에 의해 약 98%이다. 도 7C는 HiPrep 26/60 Sephacryl S-200에서 크로마토그래피한 후 HIC 컬럼에서 용출된 단백질을 보여준다. 레인 1은 정제된 his-tag 마이코둘세인을 보여주고 레인 2는 정제된 천연 마이코둘세인을 보여준다.
S. 세레비시애로부터 정제된 정제된 천연 단백질은 숙련된 관능 과학자(0.2mL 분취량)에 의해 0.03mg/ml로 맛을 보았고 8°브릭스(약 8% 설탕 용액)에 해당하는 단맛을 갖는 것으로 밝혀졌다. 단맛은 매우 눈에 띄게 달았고, 다른 향미가 없는 "깨끗한" 단맛(설탕 같은 맛)이었으며, 약간 지연된 발현와 달콤한 뒷맛이 있었다.
실시예 12(응용 데이터)
실시예 5에서와 같이 제조되고 실시예 5에서 기술된 바와 같이 정제된 His-태그된 마이코둘세인을 요거트 베이스에서 시험하였다. 요거트 베이스는 다음 레시피를 가졌다(표 5):
표 5.
Figure pct00005
사탕수수 슈가는 요거트 배양을 위한 탄소원으로 첨가되며 배양에 의해 적어도 부분적으로 소비된다. 마이코둘세인은 설탕의 8°에서 10°브릭스의 단맛을 근사화하기 위해 첨가되었으며, 요거트 베이스의 최종 농도는 0.05 mg/ml이다. 맛 테스트는 숙련된 관능 과학자에 의해 수행되었으며 요거트의 단맛은 8°브릭스(약 8% 설탕 용액)에 해당하는 것으로 밝혀졌다. 단맛은 매우 눈에 띄게 달았고, 다른 향미가 없는 "깨끗한" 단맛(설탕 같은 맛)이었으며, 약간 지연된 발현과 달콤한 뒷맛이 있었다.
실시예 5에서와 같이 제조되고 실시예 5에 기재된 바와 같이 정제된 His-태그된 마이코둘세인을 전유에서 시험하였다; 비유제품 완두콩 기반 우유(물, 93.75%, 완두콩 단백질, 4.2%, 카놀라유, 1.7%, TIC Gum Blend Pro 181 AG(Acacia + Gellan) 0.3%, 해바라기 레시틴 0.05%); 차가운 커피; 및 0.04mg/ml의 최종 농도에서 물(대조군), 설탕의 8°에서 10°브릭스 사이의 단맛 수준을 제공할 것으로 예상됨. 미각 테스트를 통해 감미 단백질은 모든 샘플에서 8°내지 10°브릭스의 단맛 수준을 전달하고 모든 샘플은 물 대조군과 유사한 단맛 강도, 발현 및 지속 시간을 가짐을 확인하였다.
여기에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 개별적으로 그리고 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되고 그 전체가 여기에 제시된 것과 동일한 정도로 참조로 여기에 포함된다.
본 발명을 기술하는 맥락에서(특히 다음 청구범위의 맥락에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 "적어도 하나" 및 유사한 지시 대상의 사용은 다음과 같이 해석되어야 한다. 여기에 달리 명시되지 않았거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수형과 복수형을 모두 포함한다. "적어도 하나"라는 용어 뒤에 하나 이상의 항목 목록(예, "A 및 B 중 적어도 하나")이 사용되는 것은 나열된 항목(A 또는 B) 중에서 선택된 하나의 항목을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. ) 또는 나열된 항목(A 및 B) 중 둘 이상의 조합이다. "포함하는", "갖는", "포함하는" 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미)로 해석되어야 한다. "이루어진"이라는 용어는 폐쇄형 용어로 해석된다(즉, 나열된 것 이외의 구성 요소 또는 단계 제외). "본질적으로 구성된"이라는 용어는 제품 또는 방법의 기능 또는 활동에 필수적이지 않고 기능 또는 활동에 실질적으로 영향을 미치지 않는 구성 요소 또는 단계의 포함을 허용한다.
본원에서 값의 범위를 열거하는 것은 단지 본원에서 달리 나타내지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 사용하기 위한 것이며, 각각의 별도의 값은 마치 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 여기서. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 여기에 제공된 모든 예 또는 예시적인 언어(예, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 모드를 포함하여 본 발명의 바람직한 실시예가 여기에 설명된다. 이러한 바람직한 실시예의 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있다. 발명자들은 당업자가 이러한 변형을 적절하게 채택할 것을 기대하고, 발명자는 본 발명이 여기에 구체적으로 기술된 것과 달리 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 해당 법률이 허용하는 바에 따라 여기에 첨부된 청구 범위에 인용된 주제의 모든 수정 및 등가물을 포함합니다. 또한, 본 명세서에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 전술한 요소들의 모든 가능한 변형의 임의의 조합은 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> MycoTechnology, Inc. <120> SWEET PROTEIN FROM TRUFFLE <130> 3388820: 0640.30A WO <150> US 63/044245 <151> 2020-06-25 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1072 <212> DNA <213> Mattirolomyces terfezioides <400> 1 caagtcttta agtgttgatc gagcagtaga aatattaatc gcccaattaa ttgctcttac 60 tctaggaaat gtagtactca agttggccct ctaagtccct gattcagtgt cactttttct 120 cctttgacag taggctagat tctagctctt gtgtccgttt cttaaaatcc tgatatggca 180 ccttagcgtc agagcagaat acctgttctc atacaccttg gctatgatcc gatatttaaa 240 tagagcaatc acccttctgg atatcttccc catagctccc attgacctca aacattttct 300 aatcccctat accagccata ttacttgtct aagcacttca cattcttcct cacaatacga 360 aacctcctaa aatgcctgat ctctcctcct tcattacgat taagaacaac tctaaccacg 420 tcttcactcg gacggcaatt tattctaagt atgccgctgt gcagtggagt cccgagccgc 480 aactctcaat ctctcccggc aaatgggatt tgtttatttt aaaggacatc ttgtctatcc 540 gtgggacttc gggatatgta caatatcggg ttggggatgg tcctggatgg gttagggtca 600 ccttttcttc tctagtcggg gccgatgaag tggcagagtg gagctcaggt 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agtatcgtgt tggtgatgga cctggttggg ttagagtaac attcagctca 240 ttggttgggg ctgacgaagt ggctgagtgg tcctcaggtg acctcccaga tggcttcgtg 300 ctgcaaaagc cagtcagaac tggatctaga ccattgcaag cgacattcga agcaacaaag 360 caatga 366 <210> 23 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding Sequence for modfied protein from Mattirolomyces terfezioides including His-Tag <400> 23 atgccggaat tgagctcgtt cattactatt aagaataact ctaaccatgt ttttacgcgt 60 accgcaatct attccaaata tgccgcagtc cagtggagcc cggaaccgca gctgagcatt 120 agcccaggta aatgggacct gttcatcctg aaagacatcc tgagcatccg cggtacgtcc 180 ggctacgtgc agtaccgtgt cggcgacggt ccgggctggg tgcgtgttac ctttagcagc 240 ctggtgggtg cggacgaagt tgctgagtgg agcagcggtg atctgccgga tggctttgtt 300 ctgcaaaagc ctgtccgcac cggtagccgt ccgctgcaag cgacgttcga ggcgaccaag 360 caacatcacc accaccacca ctaa 384 <210> 24 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified protein from Mattirolomyces terfezioides with optional His-Tag <220> <221> misc_feature <222> (122)..(127) <223> Absent or Histidine <400> 24 Met Pro Glu Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Lys Asn Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Lys Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Gln Leu Ser Ile Ser Pro Gly Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Lys Asp Ile Leu Ser Ile Arg Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Gly Asp Gly Pro Gly Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Asp Glu Val Ala Glu Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Asp Gly Phe Val Leu Gln Lys Pro Val Arg Thr Gly Ser Arg Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Glu Ala Thr Lys Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 <210> 25 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding Sequence of modified protein from Mattirolomyces terfezioides with His-Tag <400> 25 atgccggatt tgagctcgtt cattactatt agaaataact ctaaccatgt ttttacgcgt 60 accgcaatct attccaaata tgccgcagtc cagtggagcc cggaaccgca gctgagcatt 120 agcccaggta aatgggacct gttcatcctg aaagacatcc tgagcatccg cggtacgtcc 180 ggctacgtgc agtaccgtgt cggcgacggt ccgggctggg tgcgtgttac ctttagcagc 240 ctggtgggtg cggacgaagt tgctgagtgg agcagcggtg atctgccgga tggctttgtt 300 ctgcaaaagc ctgtccgcac cggtagccgt ccgctgcaag cgacgttcga ggcgaccaag 360 caacatcacc accaccacca ctaa 384 <210> 26 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified protein from Mattirolomyces terfezioides with optional His-Tag <220> <221> misc_feature <222> (122)..(127) <223> Absnet or Histidine <400> 26 Met Pro Asp Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Arg Asn Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Lys Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Gln Leu Ser Ile Ser Pro Gly Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Lys Asp Ile Leu Ser Ile Arg Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Gly Asp Gly Pro Gly Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Asp Glu Val Ala Glu Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Asp Gly Phe Val Leu Gln Lys Pro Val Arg Thr Gly Ser Arg Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Glu 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Mattirolomyces terfezioides with His-Tag <400> 31 atgccggatt tgagctcgtt cattactatt aagaataact ctaaccatgt ttttacgcgt 60 accgcaatct attccaaata tgccgcagtc cagtggagcc cggatccgca gctgagcatt 120 agcccaggta aatgggacct gttcatcctg aaagacatcc tgagcatccg cggtacgtcc 180 ggctacgtgc agtaccgtgt cggcgacggt ccgggctggg tgcgtgttac ctttagcagc 240 ctggtgggtg cggacgaagt tgctgagtgg agcagcggtg atctgccgga tggctttgtt 300 ctgcaaaagc ctgtccgcac cggtagccgt ccgctgcaag cgacgttcga ggcgaccaag 360 caacatcacc accaccacca ctaa 384 <210> 32 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified protein from Mattirolomyces terfezioides with optional His-Tag <220> <221> misc_feature <222> (122)..(127) <223> Absent or Histidine <400> 32 Met Pro Asp Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Lys Asn Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Lys Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Ser Pro Asp Pro Gln Leu Ser Ile Ser Pro Gly Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Lys Asp Ile Leu Ser Ile Arg Gly Thr Ser Gly Tyr Val 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protein from Mattirolomyces terfezioides with optional His-Tag <220> <221> misc_feature <222> (122)..(127) <223> Absent or Histidine <400> 34 Met Pro Asp Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Lys Asn Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Lys Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Gln Leu Ser Ile Ser Pro Gly Arg Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Lys Asp Ile Leu Ser Ile Arg Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Gly Asp Gly Pro Gly Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Asp Glu Val Ala Glu Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Asp Gly Phe Val Leu Gln Lys Pro Val Arg Thr Gly Ser Arg Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Glu Ala Thr Lys Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 <210> 35 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding Sequence of modified protein from Mattirolomyces terfezioides with His-Tag <400> 35 atgccggatt tgagctcgtt cattactatt aagaataact ctaaccatgt ttttacgcgt 60 accgcaatct attccaaata tgccgcagtc 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Sequence of modified protein from Mattirolomyces terfezioides with His-Tag <400> 55 atgccggatt tgagctcgtt cattactatt aagaataact ctaaccatgt ttttacgcgt 60 accgcaatct attccaaata tgccgcagtc cagtggagcc cggaaccgca gctgagcatt 120 agcccaggta aatgggacct gttcatcctg aaagacatcc tgagcatccg cggtacgtcc 180 ggctacgtgc agtaccgtgt cggcgacggt ccgggctggg tgcgtgttac ctttagcagc 240 ctggtgggtg cggacgaagt tgctgagtgg agcagcggtg agctgccgga tggctttgtt 300 ctgcaaaagc ctgtccgcac cggtagccgt ccgctgcaag cgacgttcga ggcgaccaag 360 caacatcacc accaccacca ctaa 384 <210> 56 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified protein from Mattirolomyces terfezioides with optional His-Tag <220> <221> misc_feature <222> (122)..(127) <223> Absent or Histidine <400> 56 Met Pro Asp Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Lys Asn Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Lys Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Gln Leu Ser Ile Ser Pro Gly Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Lys Asp Ile Leu Ser 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Sequence <220> <223> Modified protein from Mattirolomyces terfezioides with optional His-Tag <220> <221> misc_feature <222> (122)..(127) <223> Absent or Histidine <400> 58 Met Pro Asp Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Lys Asn Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Lys Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Gln Leu Ser Ile Ser Pro Gly Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Lys Asp Ile Leu Ser Ile Arg Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Gly Asp Gly Pro Gly Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Asp Glu Val Ala Glu Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Glu Gly Phe Val Leu Gln Lys Pro Val Arg Thr Gly Ser Arg Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Glu Ala Thr Lys Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 <210> 59 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding Sequence of modified protein from Mattirolomyces terfezioides with His-Tag <400> 59 atgccggatt tgagctcgtt cattactatt aagaataact ctaaccatgt ttttacgcgt 60 accgcaatct 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misc_feature <222> (68)..(72) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (85)..(86) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (101)..(110) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa is any amino acid <400> 71 Met Pro Xaa Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Xaa Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ser Ile Xaa Xaa Xaa Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Ile Xaa Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Xaa Xaa Val Ala Xaa Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Xaa Gly Phe Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Xaa Ala Thr Xaa Gln 115 120 <210> 72 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence 2 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(16) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (37)..(38) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (68)..(70) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (85)..(86) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (101)..(103) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (105)..(110) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa is any amino acid <400> 72 Met Pro Xaa Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Xaa Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Xaa Pro Glu Pro Xaa Xaa Ser Ile Xaa Pro Xaa Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Ile Xaa Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Xaa Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Xaa Xaa Val Ala Xaa Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Xaa Gly Phe Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Xaa Ala Thr Xaa Gln 115 120 <210> 73 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence 3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is Ser, Cys, Thr. or Met <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa is Ser, Cys, Thr. or Met <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ser, Cys, Thr. or Met <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (85)..(86) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> Xaa is Ser, Cys, Thr. or Met <220> <221> misc_feature <222> (108)..(108) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu.or Ile <220> <221> misc_feature <222> (108)..(108) <223> Xaa is Val, Gly, Ala, Leu, or Ile <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> Xaa is Ser, Cys, Thr. or Met <220> <221> misc_feature <222> (110)..(110) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa is Lys, Arg, or His <400> 73 Met Pro Xaa Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Xaa Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Xaa Pro Glu Pro Xaa Xaa Ser Ile Xaa Pro Xaa Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Ile Xaa Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Xaa Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Xaa Xaa Val Ala Xaa Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Xaa Gly Phe Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Xaa Ala Thr Xaa Gln 115 120 <210> 74 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence 4 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa is Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is Leu, Val, or Ile <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> Xaa is Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa is Leu, Val, or Ile <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (85)..(86) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> Xaa is Leu, Val, or Ile <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> Xaa is Asn or Gln <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> Xaa is Leu, Val, or Ile <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (108)..(108) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (110)..(110) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa is Lys or Arg <400> 74 Met Pro Xaa Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Xaa Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Xaa Pro Glu Pro Xaa Xaa Ser Ile Xaa Pro Xaa Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Ile Xaa Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Xaa Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Xaa Xaa Val Ala Xaa Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Xaa Gly Phe Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Xaa Ala Thr Xaa Gln 115 120 <210> 75 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence 5 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (110)..(110) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> Xaa is Lys or Arg <400> 75 Met Pro Xaa Leu Ser Ser Phe Ile Thr Ile Xaa Asn Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Val Phe Thr Arg Thr Ala Ile Tyr Ser Xaa Tyr Ala Ala Val Gln Trp 20 25 30 Ser Pro Glu Pro Gln Leu Ser Ile Ser Pro Gly Lys Trp Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Ile Xaa Gly Thr Ser Gly Tyr Val Gln 50 55 60 Tyr Xaa Val Gly Xaa Gly Pro Gly Trp Val Arg Val Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Leu Val Gly Ala Xaa Xaa Val Ala Xaa Trp Ser Ser Gly Asp Leu Pro 85 90 95 Xaa Gly Phe Val Leu Gln Xaa Pro Val Xaa Thr Gly Ser Xaa Pro Leu 100 105 110 Gln Ala Thr Phe Xaa Ala Thr Xaa Gln 115 120

Claims (32)

  1. 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은
    (a) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 및 SEQ ID NO:75로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열;
    (b) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (c) 24개 이하의 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 부가에 의해 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열로부터 변형된 폴리펩티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 폴리펩티드 서열, 또는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1-11, 17-32, 39, 40, 45-67, 73-100 및 110-121을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 또는 SEQ ID NO:75를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, 또는 SEQ ID NO: 68를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO; 65, 또는 SEQ ID NO: 67를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은 히스티딘 태그를 추가로 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 제 10 항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  12. 제 11 항의 숙주 세포를 단맛 조절 활성을 갖는 단백질을 생산하는 조건 하의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 단맛 조절 활성을 갖는 단백질의 제조방법.
  13. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서,
    상기 폴리펩티드는 임의로 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 하나의 치환 변형을 포함하며, 또는
    상기 폴리펩티드는 임의로 히스티딘 태그를 추가로 포함하고,
    상기 폴리펩티드는 단맛 조절 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1-11, 17-32, 39, 40, 45-67, 73-100 및 110-121을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  16. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 또는 SEQ ID NO:75를 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, 또는 SEQ ID NO: 68을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  18. 단리된 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은
    (a) SEQ ID NO:2에 기재된 핵산 서열; 및
    (b) SEQ ID NO:2에 기재된 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
    상기 폴리뉴클레오티드는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코팅하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 및 SEQ ID NO:75로 이루어진 군에서 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO; 63, SEQ ID NO: 65, 또는 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드는 히스티딘 태그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 제 18 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  24. 제 23 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  25. 제 24 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  26. 제 25 항의 숙주 세포를 단맛 조절 활성을 갖는 단백질을 생산하는 조건 하의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 단맛 조절 활성을 갖는 단백질의 제조방법.
  27. (a) 경구 투여용 제품 및 (b) 단리된 폴리펩티드를 포함하는 감미 조성물의 조합을 포함하는 조성물로서,
    상기 경구 투여용 제품은 마티롤로마이세스 테르페지오이데스(Mattirolomyces terfezioides) 트러플이 아니며,
    여기서:
    (i) 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 또는
    (ii) 상기 폴리펩티드는 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드이고;
    상기 조합은 경구 투여용 제품에 비해 단맛이 강화된 조성물.
  28. 단리된 폴리펩티드를 포함하는 유효량의 감미 조성물과 경구 투여용 제품을 조합하는 단계를 포함하는 경구 투여용 제품의 맛을 조절하는 방법으로서,
    여기서:
    (i) 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 또는
    (ii) 상기 폴리펩티드는 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드이고,
    상기 경구 투여용 제품은 마티롤로마이세스 테르페지오이데스 트러플이 아니며,
    상기 조합은 경구 투여용 제품에 비해 단맛이 강화된 방법.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    상기 경구 투여용 제품은 식품, 음료, 식이 보충제 조성물 또는 약학적 조성물인 조성물 또는 방법.
  30. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    상기 경구 투여용 제품은 제과; 감미 베이커리 제품, 감미 베이커리 제품을 준비하기 위한 미리 만들어진 감미 베이커리 믹스; 파이 필링 및 기타 감미 필링, 젤라틴 및 푸딩; 냉동 디저트; 요거트; 스낵 바; 빵 제품; 빵 제품을 준비하기 위한 미리 만들어진 빵 믹스; 소스, 시럽 및 드레싱; 감미 스프레드; 제과 제품; 및 가당 아침식사용 시리얼로 이루어진 군에서 선택된 식품인 조성물 또는 방법.
  31. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    상기 경구 투여용 제품은 탄산 음료; 무탄산 음료; 및 음료 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 음료 제품인 조성물 또는 방법.
  32. (a) 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 얻는 단계,
    (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 조성물을 정제하는 단계를 포함하는 단맛 조절 활성을 갖는 폴리펩티드의 정제 방법으로서,
    여기서:
    (i) 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 또는
    (ii) 상기 폴리펩티드는 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드인 방법.
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