KR20230027701A - 잉어 헤르페스바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 KHV CP 항원 단백질 및 이에 대한 scFv를 이용하면, 종래의 혈청학적 분석 방법 대비 빠르게 KHV에 대한 진단 항원을 확보하고, 이에 대한 scFv 항체를 신속하게 개발할 수 있을 뿐만 아니라, KHV CP에 높은 특이성, 결합력 및 친화도를 나타내는 scFv를 얻을 수 있어, 감염 시 집단폐사를 야기할 수 있는 KHV를 정확하고 신속하며 경제적으로 검출할 수 있다.

Description

잉어 헤르페스바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 {Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to Koi herpesvirus and Uses thereof}

본 발명은 잉어 헤르페스바이러스(Koi herpesvirus, KHV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 인간 scFv 라이브러리를 이용하여 분리한 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 외피 단백질 특이적 scFv, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 검출용 조성물에 관한 것이다.

바이러스 검출하는 방법 중 하나인 혈청학적 분석 방법은 항체를 이용하는 분석 방법이다. 이러한 항체를 생산하기 위해서는 동물의 희생을 필요로 하거나 동물세포 배양에서 높은 비용이 요구되며, 많은 시간이 소요된다. 또한, 이러한 항체를 생산하기 위해서는 바이러스 항원을 확보해야 하는데, 국내에서 얻기 어려운 바이러스의 경우, 항원 확보에 어려움이 있어 새로운 바이러스에 대한 대응속도가 떨어진다.

한편, 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)는 비단잉어(koi, koi carp, fancy carp) 및 잉어(common carp, Cyprinus carpio)에 높은 폐사율을 일으키는 전염성이 높은 바이러스로, 전 세계적으로 어업 생산에 높은 손실을 유발한다. 그러나, KHV를 조기에 검출하거나 이의 감염 여부를 진단하고, KHV에 의한 질병을 예방, 제어 또는 치료하는 데에 효과적인 확립된 방법이 없는 실정이다.

Michel B, Leroy B, Stalin Raj V, Lieffrig F, Mast J, Wattiez R, Vanderplasschen AF, Costes B. The genome of cyprinid herpesvirus 3 encodes 40 proteins incorporated in mature virions. J Gen Virol. 2010 Feb;91(Pt 2):452-62.

본 발명자들은 잉어류 등에 감염되었을 시 매우 심각한 양식장의 피해를 야기할 수 있는 것으로 보고되고 있는 KHV 항원 단백질의 대량 생산 및 이를 검출하는 scFv(single-chain variable fragment)를 선발하는 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, KHV에 대한 진단 항원을 확보하고 이에 대한 scFv 항체를 신속하게 개발함으로써, 바이러스에 신속한 대응이 가능하며 항체 유전자를 확보하여 항체 공학을 통한 혈청학적 분석 키트를 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV) 외피 단백질(Coat Protein, CP)을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 KHV 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 KHV 검출용 조성물을 포함하는 KHV 검출용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 KHV에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 KHV 검출용 조성물을 이용한 KHV 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV) 외피 단백질(coat protein, CP)을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 “잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpes Virus, KHV)”는 사이프리니드 헤르페스바이러스 3(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3) 또는 잉어 간질성 신염 및 아가미 괴사 바이러스(carp interstitial nephritis and gill necrosis virus, CNGV)로도 불리는 헤르페스바이러스목(order Herpesvirales), 알로헤르페스바이러스과(family Alloherpesviridiae), 사이프리니바이러스속(genus Cyprinivirus)으로 분류되는 선형의 이중 가닥 DNA를 갖는 이십면체의 바이러스를 의미한다. KHV 지놈(genome)은 295 kbp 크기이고, 적어도 156개의 단백질-코딩 ORF(open reading frame)를 포함한다.

KHV 비리온(virion)은 DNA 지놈을 포함하는 약 100 nm 내지 110 nm의 직경을 갖는 이십면체 캡시드(capsid), 바이러스 당단백질을 함유하는 지질 외피(lipid envelope), 및 지질 외피 및 캡시드 사이에 위치하는 무정형의 단백질 층(피막, tegument)으로 구성된다(Michel B, Leroy B, Stalin Raj V, Lieffrig F, Mast J, Wattiez R, Vanderplasschen AF, Costes B. The genome of cyprinid herpesvirus 3 encodes 40 proteins incorporated in mature virions. J Gen Virol. 2010 Feb;91(Pt 2):452-62. 참조).

KHV는 잉어(common carp, Cyprinus carpio carpio), 비단잉어(koi, fancy carp, Cyprinus carpio koi) 및 이의 관상용 품종(ornamental variety) 모두에 감염을 일으켜, 잉어 헤르페스바이러스병(Koi Herpes Virus Disease, KHVD)을 유발한다.

잉어 헤르페스바이러스병(KHVD)은 비특이적인 임상 징후를 나타낸다. 구체적인 임상 징후에는 감염 후(days post infection) 9일에 무기력(lethargy) 및 음식 거부를 나타낸 다음, 피부 및 아가미 조직에서 점액 생산이 크게 증가한다. 또한, 눈위 꺼짐(sunken eye, enophthalmus)이 흔하고, 아가미의 착색반점형성(gill mottling)과 병변(lesion)이 일어나며, 아가미의 출혈 및 괴사(necrosis), 창백한 피부 및 피부 발진 등이 있다. 잉어 헤르페스바이러스병은 임상 징후 발생으로부터 24시간 내지 48시간 내에 80% 내지 100%의 폐사율로 잉어의 대량 폐사를 유발할 수 있다. 현재, KHVD의 발병 기전은 완전히 알려지지 않았으며, 특히 감염은 종-특이적이지 않지만, 질병은 종-특이적인 이유는 알지 못한다(Bergmann SM, Jin Y, Franzke K, Grunow B, Wang Q, Klafack S. Koi herpesvirus (KHV) and KHV disease (KHVD) - a recently updated overview. J Appl Microbiol. 2020 Jul;129(1):98-103. 참조).

KHV의 감염은 주로 수평 감염(horizontal infection)이고, 바이러스 침입의 주요 경로는 아가미(gill) 조직, 소화관(gut) 조직 또는 피부 조직으로 간주되고 있다. KHV는 백혈구(white blood cell)를 통해 아가미로부터 소화관까지 모든 장기로 퍼진다(Bergmann SM, Jin Y, Franzke K, Grunow B, Wang Q, Klafack S. Koi herpesvirus (KHV) and KHV disease (KHVD) - a recently updated overview. J Appl Microbiol. 2020 Jul;129(1):98-103. 참조).

KHV는 2012년 세계동물보건기구(Office international des epizooties, OIE, World Organization for Animal Health)에 의해 관리대상질병(notifiable disease)으로 지정된 바 있고, 2010년 국제 해사 기구(International Maritime Organization)에 의해 선박평형수(ballast water ship)에 포함될 수 있는 유해 병원체로 등록된 바 있다.

KHV에 의한 발병은 18℃ 내지 28℃의 증식 허용 온도(permissive temperature) 범위에서 수온에 따라 달라질 수 있고, 감염 후 5일 내지 22일부터 발병하는 것으로 알려져 있으며, 높은 온도에서 바이러스가 더 빠르게 복제하는 것으로 알려져 있다.

유일하게 상업적으로 이용 가능한 약독화 생백신(live attenuated vaccine)인 KV3(KoVax Ltd.)가 있으나, 여전히 재감염을 일으킬 수 있고, 약독화의 메커니즘이 결정되지 않아, 발병력 복귀(reversion virulence)에 대한 위험성을 결정하기 어려우며, 또한 동일 환경에서 서식하는 백신의 일차적 표적 대상이 아닌 일반 잉어에게 약독화된 백신 균주가 감염될 가능성이 있는 등 생태학적 안전성 문제 또한 존재한다. 게다가, KHV에 감염된 어류가 더 따뜻한 환경을 자연스럽게 찾는 반응인 이른바 행동학적 열(behavioral fever) 반응 때문에 증상 없이 잠재적으로 감염될 수 있다. 따라서, 현재까지는 KHV에 대한 유망한 치료 방법은 없는 실정이다(Boutier M, Gao Y, Donohoe O, Vanderplasschen A. Current knowledge and future prospects of vaccines against cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3). Fish Shellfish Immunol. 2019 Oct; 93:531-541. 참조). 결국, KHV에 대한 조기 검출을 통한 예방 및 검역이 중요하다.

앞서 언급한 바와 같이, 항체를 이용한 ELISA 등의 분석 방법은 항체를 생산하는 데에 동물의 희생, 높은 비용 및 많은 시간이 요구된다. 또한, 항체를 생산하기 위한 바이러스 항원의 확보에 어려움이 있는 경우, 새로운 바이러스에 대한 대응 속도가 떨어지는 단점이 있다.

본 발명자들은 DNA 염기서열로부터 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP) 항원을 합성하고, 효모표면발현된 KHV CP 및 scFv 라이브러리 간의 바이오-패닝을 통해 수득한 KHV CP에 대해 높은 특이성과 결합력을 갖는 scFv를 수득하였으며, 수득한 scFv를 이용하여 유의한 KHV에 대한 진단능을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 scFv는 종래의 KHV의 조기 검출 및 진단 방법에 대한 유망한 대안이다.

본 명세서에서, 용어 “KHV CP(Coat Protein of Koi Herpesvirus)"는 잉어 헤르페스바이러스의 외피 단백질(Coat Protein, CP)인 캡시드 트리플렉스 서브유닛 2(capsid triplex subunit 2)를 의미한다.

KHV CP는 알로헤르페스바이러스과에서 보존된 부위(ORF72, open reading frame 72)로 간주되므로, 본 발명에서 항원 표적으로 선택되었다. ORF72는 KHV 비리온에서 풍부하게 검출되는 구성 성분으로, 알로헤르페스바이러스과에 속하는 다른 바이러스의 캡시드 트리플렉스 서브유닛 2의 오르소로그(orthologue)이다.

본 발명의 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열은, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)에 기존에 보고된 야생형 KHV CP의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호(GenBank accession number): QAU54957.1)를 바탕으로 하여, 이의 염기서열을 변형 및 합성함으로써 수득한, 합성된 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열이다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 야생형 KHV CP의 아미노산 서열과 비교하여 286번째 아미노산 잔기인 아스파라긴(N)이 N-글리코실화를 방지하기 위해 글루타민(Q)으로 치환되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)은 N-글리코실화 서열인 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴(Asn, N)이 글루타민(Gln, Q)으로 치환되어 있는 아미노산 변이 N286Q를 갖는다. 상기 X는 무작위 아미노산이다.

본 발명자들은 KHV CP의 아미노산 변이 N286Q를 통해, 당단백질의 발현을 제거함으로써, 항원 발현 효율을 높이고, 당단백질이 항원결정부위가 되는 것을 피함으로써, KHV 감염의 진단에 유용하게 사용될 수 있는, KHV CP 항원 단백질을 합성하였다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)은 양 말단에 제한효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)를 갖는다. 당업계에 공지된 제한효소에 대한 인식 부위라면 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명자들은 KHV CP의 아미노산 서열에서 상술한 아미노산 변이 N286Q뿐만 아니라, 양 말단에 제한효소 인식 부위를 첨가함으로써, 효모표면발현을 위한 후속 클로닝이 가능하도록 하였다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 KHV CP(koi herpesvirus coat protein) 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:

i) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역;

ii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역;

iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는

iv) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

i) 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;

ii) 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;

iii) 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는

iv) 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이다.

본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.

본 발명의 항체는 당업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이(phage display)방법을 사용하여 생성될 수 있고, [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186]; [Kettleborough et al. 1994, Eur. J. Immunol, 24, 952-958]; [Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18]; 및 [Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108 에 게시된 것을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(이황화) 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984) 참조).

본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, 화학적으로 연결된 F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 구체적으로 scFv(single-chain variable fragment) 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변 영역은 감마1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 가장 구체적으로는 감마 4(IgG4) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파 형이다. 따라서, 본 발명의 구체적인 항체는 카파(kappa) 경쇄와 감마 4(gamma 4) 중쇄를 가지는 scFv 형태 또는 IgG4 형태이다.

본 명세서에서, 용어 “중쇄(heavy chain)”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어 “경쇄(light chain)”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 경쇄(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 명세서에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab′, F(ab′)2, Fab3, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체(scFv), scFv-Fc, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific T-cell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역(hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:

(a) (FR-H1, Framework region 1 of Heavy chain)-(CDR-H1, complementarity determining region 1 of Heavy chain)-(FR-H2)-(CDR-H2)-(FR-H3)-(CDR-H3)-(FR-H4); 및

(b) (FR-L1, Framework region 1 of Light chain)-(CDR-L1, complementarity determining region 1 of Light chain)-(FR-L2)-(CDR-L2)-(FR-L3)-(CDR-L3)-(FR-L4).

본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역(framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10^-6 M 이하(예컨대, 9 x 10^-7 M, 8 x 10^-7 M, 7 x 10^-7 M, 6 x 10^-7 M, 5 x 10^-7 M, 4 x 10^-7 M, 3 x 10^-7 M, 2 x 10^-7 M, 또는 1 x 10^-7 M), 바람직하게는 1 x 10^-7 M 이하(예컨대, 9 x 10^-8 M, 8 x 10^-8 M, 7 x 10^-8 M, 6 x 10^-8 M, 5 x 10^-8 M, 4 x 10^-8 M, 3 x 10^-8 M, 2 x 10^-8 M, 또는 1 x 10^-8 M), 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하(예컨대, 9 x 10^-9 M, 8 x 10^-9 M, 7 x 10^-9 M, 6 x 10^-9 M, 5 x 10^-9 M, 4 x 10^-9 M, 3 x 10^-9 M, 2 x 10^-9 M, 또는 1 x 10^-9 M)의 평형 해리 상수(예를 들어, 이보다 작은 K_D는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.

또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.

본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.

상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

본 발명의 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항-KHV CP 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 잉어 헤르페스바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상술한 서열의 CDR을 포함하는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 체인 항체(scFv), Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에서 본 발명의 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-KHV CP scFv이다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 (Gly-Ser)n, (Gly₂-Ser)n, (Gly₃-Ser)n 또는 (Gly₄-Ser)n 등의 링커에 의해 연결된다. 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 구체적으로는 3 내지 4이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 scFv의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다: 경쇄가변영역-링커-중쇄가변영역 또는 중쇄가변영역-링커-경쇄가변영역. 상기 경쇄가변영역은 카파가변영역일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 본 발명의 KHV CP 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 35의 중쇄가변영역 및 서열번호 36의 경쇄가변영역을 포함하는 scFv이다.

본 발명의 구체적인 다른 일 구현예에서, 본 발명의 KHV CP 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 37의 중쇄가변영역 및 서열번호 38의 경쇄가변영역을 포함하는 scFv이다.

본 발명의 구체적인 또 다른 일 구현예에서, 본 발명의 KHV CP 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 39의 중쇄가변영역 및 서열번호 40의 경쇄가변영역을 포함하는 scFv이다.

본 발명의 구체적인 여전히 다른 일 구현예에서, 본 발명의 KHV CP 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 41의 중쇄가변영역 및 서열번호 42의 경쇄가변영역을 포함하는 scFv이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHC CP)에 높은 특이성, 결합력 및 친화도로 결합하므로, 잉어 헤르페스바이러스 검출을 위한 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 조성물을 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)에 높은 특이성, 결합력 및 친화도로 결합하므로, 잉어 헤르페스바이러스 검출을 위한 키트에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역분석용 키트는 단백질 마이크로어레이 또는 ELISA 분석 키트이다.

상술한 조성물 또는 키트는 본 발명의 항-잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차 항체로서 본 발명의 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상기 포획항체 및 검출항체로는 본 발명의 항-잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP) 항체 또는 항원 결합 단편의 클론 중 서로 다른 에피토프에 결합하는 2종의 항체 또는 항원 결합 단편을 이용할 수 있다.

본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.

상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe₃O₄, γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, P³², S³⁵, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ¹¹⁸I, ¹³⁶La, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁵Bi 및 ²⁰⁶Bi), 형광물질(플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

이는 뉴클레오타이드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.

서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄, 또는 경쇄를 이루는 폴리펩타이드와 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상술한 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 파지미드 벡터; 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 중쇄가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 상기 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리된 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 것이다.

본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 항체를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 항체를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 갈락토오스 유도성 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터 또는 락토오스 유도성 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.

본 발명의 여전히 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(KHV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계; 및

상기 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 조성물과 외피 단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 검출 대상 어류의 뇌, 아가미, 심장, 지느러미, 간, 췌장, 위, 장, 비장, 신장, 배설강, 유문수, 근육 조직, 피부 조직, 분변, 체액, 점액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 피부 스왑(skin swab)일 수 있다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 전혈(whole blood), 혈장(plasma) 또는 혈청(serum)일 수 있다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 백혈구(white blood cell)일 수 있다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 뇌의 과립층일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 검출 대상 어류는 일반 잉어(common carp, Cyprinus carpio carpio), 비단 잉어(Koi carp, Cyprinus carpio koi), 금붕어(goldfish, Carassius auratus) 및 비단 잉어의 하이브리드(hybrid), 붕어(Crucian carp, Carassius carassius) 및 비단 잉어의 하이브리드, 또는 금붕어 및 일반 잉어의 하이브리드일 수 있다. 상기 언급된 검출 대상 어류에 잉어 헤르페스바이러스가 노출되면, 수개월 동안 잠복되어 있다가 증상을 나타낸다.

본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 상기 검출 대상 어류는 금붕어, 초어(Grass carp, Ctenopharyngodon idella), 금빛황어(Ide, Leuciscus idus), 열대어 안시(Ornamental catfish, Ancistrus sp.), 러시아 철갑상어(Russian sturgeon, Acipenser gueldenstaedtii) 또는 대서양 철갑상어(Atlantic sturgeon, Acipenser oxyrinchus)일 수 있다. 상기 언급된 검출 대상 어류는 잉어 헤르페스바이러스 노출 시, 무증상 보균자(carrier)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 검출 대상 어류는 텐치(닥터 피쉬, tench, Tinca tinca), 기벨리오 붕어(Prussian carp, Carassius gibelio), 갈색 메기(brown bullhead, Ameiurus nebulosus), 무지개 송어(salmonid fish-like rainbow trout, Oncorhynchus mykiss) 또는 금붕어 변이형(goldfish variant)일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 검출 대상 수생 무척추동물의 뇌, 아가미, 심장, 지느러미, 간, 췌장, 위, 장, 비장, 신장, 배설강, 유문수, 근육 조직, 피부 조직, 분변, 체액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 검출 대상 수생 무척추동물은 백조조개류(swan mussels, Anodonta cygnea) 또는 민물 새우(freshwater shrimp, Gammarus pulex)이다. 상기 검출 대상 수생 무척추동물은 잉어 헤르페스바이러스에 대한 잠재적 매개체이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

본 발명은 합성된 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)을 제공한다.

본 발명은 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV) 검출용 조성물, 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 KHV CP 항원 단백질 및 이에 대한 scFv 항체를 이용하면, 종래의 혈청학적 분석 방법 대비 빠르게 KHV에 대한 진단 항원을 확보하고, 이에 대한 scFv 항체를 신속하게 개발할 수 있을 뿐만 아니라, KHV CP에 높은 특이성, 결합력 및 친화도를 나타내는 scFv를 얻을 수 있어, 감염 시 집단폐사를 야기할 수 있는 KHV를 정확하고 신속하며 경제적으로 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 합성된 KHV CP 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 도이다.
도 2a는 합성된 KHV CP와 야생형 KHV CP의 아미노산을 비교하여 나타낸 것이다. 합성된 KHV CP는 'KHV_mod'로, 야생형 KHV CP는 'KHV_ori'로 표기하였다.
도 2b는 합성된 KHV CP의 변형된 아미노산 부분을 나타낸 것이다. 아스파라긴(Asn, N)의 글루타민(Gln, Q)으로의 변형을 286번 아미노산 잔기의 경우에 “N286Q”로 표기하였다.
도 3a는 KHV CP의 효모표면발현에 대한 모식도이다.
도 3b는 웨스턴 블롯을 이용하여 효모표면발현법을 통한 항원 발현 정도를 24℃ 및 29℃에서 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 선발한 파지 scFv 클론을 공통적으로 증폭할 수 있도록 제작한 프라이머 세트인 pCANTAB5_S1 및 pCANTAB5_S6의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 파지미드의 scFv DNA를 증폭한 전기영동 겔을 나타낸 도이다.
도 6은 KHV CP에 특이적으로 결합하는 scFv를 대장균에서 발현하기 위한 plg20-scFv 플라스미드의 모식도이다.
도 7a는 정제한 scFv 클론인 C5, E4, F6 및 F8을 웨스턴 블롯으로 확인한 것을 나타낸 것이다. (T=total, FT=flow through, W1=Washing 1 elute, 및 W2=Washing 2 elute)
도 7b는 정제한 scFv 클론인 C5, E4, F6 및 F8을 웨스턴 블롯으로 확인하고, 단백질 순도 확인을 위해 쿠마시 블루 염색(coomassie blue staining)을 수행한 결과를 나타낸 것이다. (T=total, FT=flow through, W1=Washing 1 elute, 및 W2=Washing 2 elute)
도 8은 정제된 scFv 클론인 C5, E4, F6 및 F8의 KHV CP 진단 능력 확인을 위해 수행한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 최종 선발된 scFv(C5, E4, F6 및 F8)의 유전자 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역(카파가변영역)에 대한 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

효모표면발현(yeast surface display, YSD)의 가장 특징적인 응용 분야는 천연 라이브러리(naive library)로부터 이미 분리된 scFv(single-chain variable fragment)의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위한 scFv의 발현(display)이다. 효모표면발현(YSD) 시스템에서는, 엔지니어링 될 관심 단백질, 즉 본 발명의 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)이 Aga2p 단백질의 C-말단에 융합된다. KHV CP와 융합된 Aga2p 단백질은 효모 표면 상의 Aga1p 단백질과, 두 개의 이황화 결합을 통해, 공유 결합을 형성한다. Aga1p 단백질은 효모의 세포 벽에 β-글루칸 연결을 통해 앵커링되어 있다(Chen TF, de Picciotto S, Hackel BJ, Wittrup KD. Engineering fibronectin-based binding proteins by yeast surface display. Methods Enzymol. 2013; 523:303-26. 참조).

이러한 YSD 시스템에는 두 개의 주요 구성 요소인, 효모 EBY 100 및 플라스미드 pCTCON이 필요하다. 효모 EBY 100은 영양요구성(auxotrophic) 돌연변이로서, 트립토판 아미노산을 합성하는 시스템이 결핍되어 있고, Aga1 유전자를 효모 지놈에 포함하고 있다. 플라스미드 pCTCON은 트립토판 합성에 중요한 TRP1 유전자, 관심 단백질과 융합되는 Aga2p 단백질에 대한 유전자, 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다. Aga1p 및 Aga2p 단백질은 모두 갈락토오스-유도성 프로모터 하에서 조절되고, 효모 EBY 100이 pCTCON 플라스미드로 적절하게 형질전환된 경우, 트립토판이 결핍된 선택 배지에서 성장할 수 있는 반면, 형질전환되지 않은 EBY100은 번식(propagate)하지 못한다. 효모를 글루코오스-풍부 배지로부터 갈락토오스-풍부 배지로 옮겨주면 관심 단백질이 적절하게 표면에 발현된다(Chen TF, de Picciotto S, Hackel BJ, Wittrup KD. Engineering fibronectin-based binding proteins by yeast surface display. Methods Enzymol. 2013; 523:303-26. 참조).

본 발명에서는 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP Koi Herpesvirus Coat Protein) 유전자를 변형 및 합성하고, 효모표면발현벡터인 pCTCON 벡터에 클로닝하여, pCTCON-KHVCP를 제조하였다. 클로닝된 pCTCON-KHVCP를 효모 발현세포인 EBY100에 형질전환하였으며, cMyc에 대한 항원-항체 반응을 통해 효모 표면 상의 KHV CP의 발현을 확인하였다.

인간 scFv 라이브러리로부터 KHV CP에 특이적으로 결합하는 scFv를 분리하기 위해서, 효모 표면 상에 발현된 KHV CP와 인간 scFv 파지-디스플레이 라이브러리를 접촉시켜 특이적으로 결합한 파지를 용출하는 바이오-패닝을 수행하였다. 두 차례의 바이오-패닝을 더 반복하여, 확보한 파지 농도를 증가시키고, 파지 scFv 클론을 선발하였다.

선발된 파지 scFv 클론을 대장균에 형질전환하고 IPTG로 유도하여 scFv 발현을 확인하고, 농축 및 정제하였으며, 정제된 scFv를 이용한 ELISA 분석을 통해 이의 KHV CP 진단능을 확인하였다.

이하에서는 우선, pCTCON 플라스미드에 본 발명의 일 실시예에 따른 합성한 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP)을 클로닝하는 방법을 설명한다.

<실시예 1> KHV CP 효모표면발현벡터의 수집

1-1: 잉어 헤르페스바이러스 외피 단백질(KHV CP) 유전자 수집

본 발명에서는, 종래의 혈청학적 방법과 같이 바이러스로부터 항원을 직접 정제하는 것이 아닌, 잉어 헤르페스바이러스(Koi herpes virus, KHV)의 외피 단백질(Coat Protein, CP, capsid triplex subunit 2)에 대한 DNA 염기서열 합성 후 이의 발현을 통해 KHV CP, 즉 바이러스 항원을 확보하였다.

DNA 염기서열 합성을 위해서, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)에 기존에 보고된 KHV CP의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호(GenBank accession number): QAU54957.1)를 바탕으로 하여, 본 발명에 따른 KHV CP를 합성하였다. 본 발명의 일 실시예에 따른 합성된 KHV CP의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 및 도 1에 나타내었다. 합성된 KHV CP 유전자의 양 말단에는 제한효소 인식 부위가 추가되어 있다. 보다 상세하게, 양 말단에 제한효소 인식 부위의 추가는 클로닝을 위한 것으로, KHV CP의 5'-말단 및 3'-말단에 각각 제한효소 AflII 및 NotI에 대한 제한효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)를 추가하였다.

야생형 KHV CP와 달리, 본 발명에 따른 합성된 KHV CP는 당단백질의 발현을 방지하기 위한 N286Q 아미노산 치환을 가지고 있다.

1-2: KHV CP의 당단백질 발현 방지를 위한 아미노산 N286Q 치환

효모 표면에 발현되는 단백질 중 당단백질은 항원의 발현 효율을 떨어트릴 뿐만 아니라, 패닝(panning)을 통해 바이러스 특이 반응 scFv를 선발할 때 당단백질이 항원결정부위가 될 수 있으므로, KHV CP의 합성에 있어서, 당단백질(주로 N-글리칸)이 발현되지 않게 하기 위하여, N-글리코실화(N-glycosylation) 아미노산 서열인, Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr (X는 무작위 아미노산)에서 아스파라긴(Asn, N)을 글루타민(Gln, Q)으로 치환하였다.

도 2a에서는 합성된 KHV CP('KHV_mod'로 표기됨)와 야생형 KHV CP('KHV_ori'로 표기됨)의 아미노산 서열을 비교하고, 치환된 286번 아미노산 잔기를 파란색으로 표기하였다. 도 2b에는 변형된 아미노산 부분을 나타내었다. 도 2b에서는 아스파라긴(Asn, N)의 글루타민(Gln, Q)으로의 변형을 "N286Q"으로 표기하였다.

<실시예 2> KHV CP 효모표면발현벡터의 클로닝

2-1: pCTCON-MCS 벡터의 제조

대한민국 등록특허 제10-1806129호에 기재된 "pCTCON-PVY"벡터와 ㈜마크로젠의 "어닐링된 올리고(annealed oligo)"를 클로닝하여, 다중클로닝부위(multiple cloning site, MCS)가 삽입된 pCTCON 벡터인, pCTCON-MCS 벡터를 제조하였다.

상기 "pCTCON-PVY"벡터는 효모표면발현 플라스미드 벡터인 pCTCON 벡터에 감자바이러스 Y 외피 단백질(potato virus Y coat protein, PVY CP)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 하기 프라이머 세트를 이용하여 PVY CP 뉴클레오타이드 서열의 양 말단에 NheI 및 BamHI 제한효소 사이트를 추가하여 제조하였다(대한민국 등록특허 제10-1806129호 참조): 정방향 프라이머(pCTCON_PVY_F: GCT AGC GGA GAC ACA ATC GAT) 및 역방향 프라이머(pCTCON_PVY_R: GGA TCC CAT GTT CTT GAC TCC AAG TA).

상기 "어닐링된 올리고(annealed oligo)"는 ㈜마크로젠에 의뢰하여 합성한 올리고뉴클레오타이드로, AflII, NdeI, SmaI, SalI, SpeI 및 NotI에 대한 제한효소 인식 부위를 갖는 다중클로닝부위(MCS)를 포함하고, 양 말단에 NheI 및 BamHI 제한효소에 의해 절단된 점착성 말단(sticky end)을 포함한다.

상기 "pCTCON-PVY"벡터에 NheI 및 BamHI 제한효소(New England BioLabs^® Inc., NEB Inc.)를 처리하여 절단한 다음, 상기 "어닐링된 올리고"와 결찰(ligation)하여, MCS를 삽입하였다. MCS 삽입을 위한 정방향(forward, Fwd) 및 역방향(reverse, Rev) 프라이머의 서열을 각각 Oligo_MCS_Fwd 및 Oligo_MCS_Rev로 하기 표 1에 나타내었다.

pCTCON-MCS 벡터 제조를 위한 프라이머 서열

프라이머 명칭	5′-서열-3′
Oligo_MCS_Fwd	CTAGCCTTAAGCATATGCCCGGGGTCGACACTAGTAGCGGCCGCG
Oligo_MCS_Rev	GATCCGCGGCCGCTACTAGTGTCGACCCCGGGCATATGCTTAAGG

2-2: pCTCON 벡터에 KHV CP 유전자 삽입

KHV CP 항원을 효모 표면에 발현시키기 위해, 실시예 1에 따른 '합성된 KHV CP' 뉴클레오타이드 서열을 효모표면발현용 플라스미드인 pCTCON-MCS 플라스미드에 클로닝하였다. 상술한 실시예 1에서 합성된 KHV CP 유전자와 pCTCON 플라스미드를 AflII 및 NotI (NEB Inc.) 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였으며, 이 때 DNA 절단 과정은 제한효소 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다.

DNA 결찰(ligation) 조성물의 제작을 위하여, 1 ul의 T4 DNA 라이게이스 10X 버퍼(T4 DNA Ligase 10X buffer: 300 mM Tris-HCl(pH 7.8); 100 mM MgCl₂; 100 mM DTT(Dithiothreitol); 및 10 mM ATP), 0.5 ul의 T4 DNA 라이게이스, 1 ul의 절단된 pCTCON-MCS 벡터, 5 ul의 절단된 KHV CP 유전자 및 2.5 ul의 증류수를 반응 튜브에 첨가하고 혼합하였다. 이 혼합물을 16℃에서 12시간 동안 반응시키고, 반응물을 대장균 DH5α 균주에 형질전환하였다.

2-3: 대장균 DH5α 균주로의 형질전환 - 열 충격

-85℃에 보관된 DH5α 수용성 세포(competent cell)를 상기 반응물과 혼합하여 4℃에서 10분간 배양한 후 반응 튜브에 첨가하고 혼합시켜 42℃에서 1분 30초의 열 충격(heat shock)을 통해 형질전환하였다. 그 후 세포를 4℃에 1분 동안 배양하고, 200 ul의 LB 배지(Luria-Bertani broth)를 넣고 37℃ 진탕배양기에서 30분 동안 회복(healing)시켰다. 그 후 암피실린(Amp; 50 ul/ml) 이 포함된 LB 고형 배지(LB agar plate)에 도말하고 박테리아 배양기에서 37℃에 16시간 동안 배양하여 단일 콜로니(single colony)를 형성시켰다.

2-4: 플라스미드 정제 및 염기서열 확인

형성된 단일 콜로니는 3 ml의 Amp LB 배지(LB broth)에 혼합하고 37℃ 진탕배양기에서 15시간 동안 배양한 후, 플라스미드 추출 키트(AccuPrep® Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit, Bioneer Corporation, ㈜바이오니아)를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 형질전환된 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드는 ㈜마크로젠의 DNA 염기서열 분석 서비스를 이용하여 분석하였고, KHV CP 유전자가 pCTCON 플라스미드 내에 삽입된 것을 확인하였다. KHV CP 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터를 'pCTCON-KHVCP'라고 명명하였다.

<실시예 3> 효모 형질전환과 효모의 배양

3-1: EBY100 효모 균주를 이용한 수용성 세포(competent cell)의 제조

효모표면발현 시스템에는 트립토판 영양요구주 EBY100 효모 균주(Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, ATCC MYA-4941)를 이용하였다. 효모 형질전환을 위해 EBY100 수용성 세포를 제작하였다. -85℃에 보관된 EBY100 글리세롤 세포 스톡(glycerol cell stock)을 YPD 고형 배지(YPD agar plate, Yeast extract Peptone Dextrose agar plate)에 도말하고, 30℃ 미생물배양기에서 3일 동안 배양시켜 단일 콜로니를 형성시켰다.

형성된 단일 콜로니를 5 ml의 YPD 배지(YPD broth)에 혼합시킨 후 30℃의 진탕배양기에서 24시간 동안 배양했다. 이후, 500 ul의 배양액을 50 ml의 YPD 배지(broth)에 넣고, 30℃ 진탕배양기에서 파장 600 nm에서의 흡광도(Optical density, OD) 값이 1.0 내지 1.5가 될 때까지 배양한 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 분리하였다. 분리한 세포는 50 ml의 증류수를 이용하여 수세(washing)한 후, 다시 원심분리기를 이용해 세포를 확보하였다.

이렇게 확보한 세포를 5 ml의 리튬 아세테이트 버퍼(0.1 M Lithium acetate (LiAc), 10 mM Tris, 1 mM EDTA 및 pH 8.0)와 50 ul의 10 mM DTT와 함께 혼합하여 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 원심분리기를 이용하여 세포를 분리하고 10 ml의 1 M 소르비톨(1 M sorbitol)을 이용하여 세포를 풀어준 후 다시 원심분리기를 이용해 세포를 확보하였다. 확보한 세포는 1.5 ml의 1 M 소르비톨로 3회 수세하고 1 ml의 1 M 소르비톨로 세포를 풀어줌으로써, EBY100 수용성 세포(competent cell)를 제조하였다. 상술한 EBY100 수용성 세포 제작 과정 및 제조한 EBY100 수용성 세포의 보관을 위해 4℃ 또는 얼음 등을 이용하여 차가운 상태를 유지하였다.

3-2: pCTCON-K0HVCP의 EBY100 수용성 세포로의 형질전환 - 전기천공법

80 ul의 EBY100 수용성 세포와 5 ul의 pCTCON-KHVCP를 하나의 튜브에 첨가하여 혼합한 후, 얼음에 10분간 배양하였다. 배양한 혼합물은 미리 차게 해 둔 큐벳(cuvette)에 이동시킨 후 전기천공법(electroporation: 1.5 KV, 25Ω, 200 mF)을 통해 효모를 형질전환하였다.

형질전환한 효모는 YPDS 배지(broth)(1% 효모 추출물(Yeast Extract), 2% 펩톤(Peptone), 2% 덱스트로오스(Dextrose), 및 1 M 소르비톨(sorbitol))에 옮긴 후, 30℃ 진탕배양기에서 30분 동안 회복시켰다. 그 후, 트립토판 드롭아웃 합성 한정 고형 최소영양배지(tryptophan dropout supplement minimal synthetic defined(SD) plate: -Trp SD plate, 트립토판을 생육인자로 첨가하지 않은 고형의 최소배지)에 도말하여 30℃ 배양기에서 3일 동안 배양시켜 단일 콜로니를 형성시켰다. 트립토판이 결핍된 선택 배지에서 단일 콜로니를 형성한 효모는 pCTCON-KHVCP가 성공적으로 형질전환된 효모이다.

3-3: 효모표면상 KHV CP 발현 유도 - 갈락토오스 첨가

형성된 단일 콜로니는 5 ml의 SD-CAA 배지(broth)와 혼합하고 효모표면발현의 조건 테스트를 위해 24℃ 및 29℃에서 각각 12시간, 18시간, 24시간, 33시간 및 36시간 동안 진탕배양기에서 배양시키고 원심분리기를 이용하여 세포를 확보하였다. 상기 SD-CAA 배지는 20 g/L D-글루코오스(glucose), 6.7 g/L YNB(yeast nitrogen base), 5 g/L 카사미노산(casamino acid), 7.4 g/L 시트르산 일수화물(citric acid monohydrate), 10.4 g/L 시트르산 소듐(sodium citrate) 및 pH 4.5의 조건으로 제조하였다. 그 다음, 글루코오스 풍부 배지에서 갈락토오스 풍부 배지로 옮겨 효모를 배양하였다.

이후 세포를 2% 갈락토오스(galactose)가 첨가된 10 ml의 SG-CAA 배지에 혼합하고 30℃ 진탕배양기에서 3일 동안 배양하여 KHV CP의 효모표면발현법을 수행하였다. Aga2, HA Tag, KHV CP 및 cMyc Tag 모두 갈락토오스-유도성 프로모터인 GAL 1-10 하에서 조절되므로, 갈락토오스 풍부 배지에서 KHV CP가 효모표면상에 발현된다. KHV CP의 효모표면발현에 대한 모식도를 도 3a에 나타내었다.

3-4: 효모표면상 KHV CP 발현의 확인 - 웨스턴 블롯

형질전환 완료된 효모 세포를 OD 600 nm (OD₆₀₀) 값이 0.4가 되도록 희석한 후 항원의 발현 여부를 확인하였다. 1차 항체 처리 단계로 항-c-Myc 항체(anti-c-Myc antibody)를 항체 처리 버퍼(TBSM: 5% skim milk with TBS, tris-buffered saline)를 이용하여 1:1000으로 희석한 후 4℃에서 15시간 반응시키고, TBST(0.1% Tween 20 in TBS)를 이용하여 수세한 뒤, 2차 항체로 항-마우스 IgG::HRP(anti-mouse IgG::HRP)를 TBSM 버퍼에 1:4000으로 희석 후 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 이용하여 발색(developing)을 진행하고, 항원 발현 정도를 측정했으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b에 나타낸 바와 같이, 갈락토오스 유도 후 시간이 지남에 따라 55 kDa의 합성한 KHV CP의 단백질 발현이 24℃ 및 29℃ 모두에서 증가함을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 인간 scFv 라이브러리로부터 KHV CP에 결합하는 scFv 분리

KHV CP가 표면에 발현된 효모와 scFv 라이브러리를 이용하여 KHV CP에 결합하는 scFv 분리 실험을 진행하였다. 본 발명에 사용된 scFv 라이브러리는 아주대학교 의과대학 미생물학교실의 권명희 교수 연구실로부터 제공받은 pRGA-scFv(A) 인간 scFv 라이브러리를 이용하였다. pRGA-scFv(A) 스톡(stock)으로부터 파지(phage) 라이브러리를 준비하는 과정은 'Tomlinson I+J 라이브러리' 프로토콜을 참고하여 준비하였으며, 그 역가는 3.42×10¹³ cfu/ml이었다.

4-1: 바이오-패닝 첫 번째 라운드

KHV CP를 발현한 효모를 OD₆₀₀ 값(OD₆₀₀)이 2가 되도록 PBS를 이용하여 희석하고 96 웰 면역플레이트(well immunoplate)의 60개 웰(well)에 각 100 ul씩 넣고 4℃에서 24시간 동안 배양하여 웰에 항원을 코팅시켰다("KHV 웰"로 지칭). 이와 동시에, KHV CP를 발현하지 않은 효모를 같은 과정으로 코팅하고 "Negative 웰"로 지칭하였으며, PBS만 넣은 웰 또한 준비하여 "Blank 웰"로 지칭하였다.

각 면역플레이트의 배양 후 웰에서 상층액을 제거한 후, 각 웰에 100 ul의 3% BSA가 포함된 PBS(PBSB)를 넣고 37℃에서 2시간 동안 블로킹을 수행하였다. "Blank 웰"에 있던 PBSB를 버리고 10¹⁰ cfu/ml이 되도록 PBSB에 희석한 scFv 라이브러리를 웰 당 100 ul씩 넣고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, "Negative 웰"에 있던 PBSB를 버리고 "Blank 웰"에 있던 scFv 라이브러리 용액을 100 ul씩 "Negative 웰"에 옮기고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, "KHV 웰"에 있던 PBSB를 버리고 "Negative 웰"에 있던 scFv 라이브러리 용액을 100 ul씩 "KHV 웰"에 옮겨 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

"KHV 웰"의 상층액을 버린 후 TBST를 이용해 각 플레이트를 3회 수세한 후, 웰 당 100 ul의 100 mM 트리에틸아민(triethylamine)을 넣어 25℃에서 10분 동안 파지 용출(phage elution)을 진행하였다. 이후 각 웰 당 50 ul의 1 M 트리스(tris, pH 7.5)를 추가하고 새로운 튜브에 각 웰의 상층액을 모두 모았다. 여기까지의 과정을 바이오-패닝(bio-panning)이라고 한다.

4-2: 파지 증폭

바이오-패닝 후 확보한 파지(phage)를 증폭하는 실험을 수행하였다. 용출(elution)을 통해 얻은 파지를 5 ml의 LB 배지(broth)를 이용해 대장균 XL1-BLue 균주에 감염시키고 37℃에서 진탕시키지 않고 1시간 동안 배양했다.

배양 후 원심분리기를 이용해서 세포를 침전시킨 후 상층액을 버리고 세포만을 10 μg/ml의 테트라사이클린(Tet: tetracycline) 및 50 μl/ml의 암피실린이 포함된 2-TY (Invitrogen^TM) 고형 배지에 도말하고 37℃에서 16시간 동안 배양했다. 플레이트에 생성된 콜로니 군집을 모두 수집하여 1% 글루코오스, 암피실린(50 μl/ml) 및 테트라사이클린(10 μg/ml)이 포함된 50 ml의 2-TY 배지(broth)에 넣고 37℃에서 OD₆₀₀ 값이 0.4가 될 때까지 배양시켰다.

그 후, 2×10¹¹ cfu/ml의 M13 헬퍼 파지(M13 helper phage)를 첨가하여 진탕시키지 않고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 세포를 침전시킨 후 1% 글루코오스, 암피실린(50 μl/ml) 및 카나마이신(Kan: Kanamycin, 50 μg/ml)이 포함된 100 ml의 2-TY 배지(broth)를 넣고 30℃ 진탕배양기에서 24시간 동안 배양하였다.

원심분리기를 이용하여 세포를 침전시킨 후 80 ml의 상층액을 새 반응 튜브에 옮기고 20 ml의 PEG/NaCl (20% polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)를 첨가하여 혼합한 후, 얼음 위에 1시간 동안 두었다. 그 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 가라앉히고 상층액을 모두 제거했다. 침전물은 4 ml의 PBS를 이용하여 풀어준 후 원심분리기를 이용하여 박테리아를 침전시켰다. 상층액인 파지(Phage) 용액을 새 튜브에 옮기고 15%의 글리세롤(glycerol)을 첨가하여 -85℃에 보관하여 스톡(stock)을 제작하였다.

4-3: 바이오-패닝 두 번째 라운드 - 파지 농도 증가

바이오-패닝 두 번째 라운드에서는 scFv 라이브러리 대신 바이오-패닝 첫 번째 라운드에서 확보하여 증폭한 파지 스톡(phage stock)을 이용하여 KHV CP에 대해 결합 능력이 높은 파지의 농도를 증가시켰다.

<실시예 5> ScFv 유전자 분리 및 분석

5-1: 바이오-패닝 세 번째 라운드 - 파지 scFv 클론 선발

세 번째 라운드의 바이오-패닝 과정을 거쳐 1.5×10¹³ cfu/ml의 역가를 갖는 파지를 분리하고, 이 중 바이오-패닝 과정에서의 반응성에 따라 4개의 파지 scFv 클론(phage::scFv)을 선발하였다. 선발한 파지 scFv 클론을 공통적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 즉 pCANTAB5_S1 및 pCANTAB5_S6을 제작하여 도 4 및 서열번호 43 및 서열번호 44에 나타내었다.

5-2: scFv 유전자가 삽입된 파지미드 분리

파지 scFv를 형질전환한 XL1-Blue 세포를 ㈜바이오니아의 플라스미드 미니 추출 키트(AccuPrep® Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit)를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 scFv 유전자가 삽입된 파지미드(phagemid)를 분리하였다.

5-3: scFv DNA 증폭

분리한 파지미드를 이용한 PCR을 수행하여 scFv DNA를 증폭하였다. 상기 PCR을 위한 조성물의 제조를 위하여 10 ul의 2X PCR 프리믹스(premix), 1 ul의 10 pM 정방향 프라이머, 1 ul의 10 pM 역방향 프라이머, 1 ul의 파지미드 및 7 ul의 증류수를 반응 튜브에 첨가한 후 혼합하여, 증폭 반응을 위한 조성물을 제조하였다.

제조된 증폭 반응 조성물은 유전자증폭기(thermal cycler)를 이용하여 초기(initial) 95℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 95℃에서 30초(DNA 변성 단계), 55℃에서 30초(프라이머의 결합 단계) 및 72℃에서 1분(DNA의 합성 단계)의 조건으로 반응시키는 세 단계 과정을 35회 반복하여 DNA를 증폭하였다.

총 20 ul의 증폭 결과물을 EtBr(Ethidium bromide)이 포함된 1% 아가로오스 겔 전기영동하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

5-4: scFv DNA 정제 및 염기서열 확인

도 5에 나타낸 바와 같이, DNA가 확인된 겔 부분, 즉 C5, E4, F6 및 F8 부분을 면도칼을 이용하여 자른 후, 인트론바이오테크놀로지 사(iNtRon Biotechnology, Inc.)의 DNA 정제 키트(MEGAquick-spin^TM Total fragment DNA Purification Kit)를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭 산물을 분리하였다. 분리한 DNA 절편은 마크로젠 사의 DNA 염기서열 분석서비스 의뢰를 통해 선발 scFv 유전자 염기서열이 증폭된 것을 확인하였다.

<실시예 6> ScFv 발현을 위한 클로닝

6-1: 플라스미드에 클로닝하기 위한 scFv 증폭

아미노산 서열 분석을 완료한 scFv를 대장균에서 발현시키기 위해 이들을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 정방향 프라이머와 역방향 프라이머에는 클로닝을 위해 각각 NcoI과 NotI 제한효소 인식 부위를 추가하였다. 추가로 정방향 프라이머에는 단백질 정제를 위한 6x 히스티딘 태그(6x Histidine tag)서열을 추가하였다.

10 ul의 2X PCR 프리믹스, 1 ul의 10 pM 정방향 프라이머, 1 ul의 10 pM 역방향 프라이머, 1 ul의 파지미드 및 7 ul의 증류수를 반응 튜브에 첨가한 후 혼합하여 증폭 반응을 위한 조성물을 제조하였다.

제조된 증폭 반응 조성물은 유전자증폭기(thermal cycler)를 이용하여 초기(initial) 95℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 95℃에서 30초(DNA 변성 단계), 55℃에서 30초(프라이머의 결합 단계) 및 72℃에서 1분(DNA의 합성 단계)의 조건으로 반응시키는 세 단계 과정을 35회 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ul의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로오스 겔에 전기영동하여 유전자가 증폭되었는지 확인하고, DNA가 확인된 겔 부분을 면도칼을 이용하여 자른 후, 인트론바이오테크놀로지 사의 DNA 정제 키트(MEGAquick-spin^TM Total fragment DNA Purification Kit)를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭 산물을 분리하였다.

6-2: TA 클로닝

그 후, 증폭한 scFv 유전자를 이용해 TA 클로닝(제한효소의 사용을 피하는 서브클로닝 기술)을 수행하였으며, TA 플라스미드를 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 대장균 형질전환 과정은 상술한 실시예 2-3에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리한 후 분리한 플라스미드를 마크로젠 사의 DNA 염기서열 분석서비스 의뢰를 통해 scFv 유전자가 올바르게 클로닝된 것을 확인하였다.

6-3: pIg20 플라스미드에 scFv 유전자 삽입

확보한 TA 플라스미드의 scFv 유전자를 대장균에 발현시키기 위해 대장균 발현 플라스미드인 pIg20 플라스미드에 클로닝하였다. 상기 실험에서 제작한 scFv-TA 플라스미드와 pIg20 플라스미드를 각각 NcoI과 NotI 제한효소(NEB Inc.)를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA 절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다.

절단한 scFv 유전자와 pIg20 플라스미드를 4:1로 혼합한 후 실시예 2-3에 기술한 바와 같이 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리한 후 분리한 플라스미드를 마크로젠 사의 DNA 염기서열 분석서비스 의뢰를 통해 scFv 유전자가 단백질 발현용 pIg20 플라스미드에 삽입된 것을 확인하였다. 플라스미드 벡터 "pIg20-scFv"의 모식도는 도 6에 나타내었다.

<실시예 7> scFv 단백질의 발현 테스트 및 정제

7-1: pIg20-scFv 플라스미드의 대장균 균주 BL21(DE3)pLysE로의 형질전환

대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20은 PhoA 신호 서열(alkaline phosphatase signal sequence)이 존재하여 발현한 단백질이 페리플라즘(periplasm, 주변세포질)에 위치하게 하고, 그 결과 대장균을 이용해 발현한 단백질이 상층액에 존재할 수 있도록 한다. 플라스미드 내에 존재하는 6x 히스티딘 태그(6x Histidine tag)를 정제용 태깅(tagging) 단백질로 활용하였다. 서열이 확인된 pIg20-scFv 플라스미드를 단백질 발현을 위한 대장균 균주인 BL21(DE3)pLysE에 형질전환하였다.

-85℃에 보관된 BL21(DE3)pLysE 수용성(competent) 세포를 상기 반응물과 혼합하여 4℃에서 10분간 배양한 후 반응 튜브에 첨가하고 혼합시켜 42℃에서 1분 30초의 열 충격(heat shock)을 통해 형질전환하였다. 그 후 세포를 4℃에 1분 동안 배양하고, 200 ul의 LB 배지(broth)를 넣고 37℃ 진탕배양기에서 30분 동안 회복시켜 주었다. 그 후 암피실린(50 μl/ml) 및 클로람페니콜(chloramphenicol, Cam: 25 μg/ml)이 포함된 LB 고체 배지(agar plate)에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16시간 동안 배양시켜 단일 콜로니를 형성시켰다.

7-2: IPTG 유도에 의한 scFv 발현 테스트

형성된 단일 콜로니를 이용하여 scFv 발현 테스트를 진행하였다. 발현 유도체인 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 농도에 따른 단백질의 발현 여부 및 발현 양을 확인하였다. 각 단일 콜로니는 3 ml의 암피실린(50 μl/ml) 및 클로람페니콜(25 μg/ml)이 포함된 LB 배지(broth)와 혼합된 후 37℃ 진탕배양기에서 9시간 동안 배양시켰다.

배양 이후 새로운 3 ml의 암피실린(50 μl/ml) 및 클로람페니콜(25 μg/ml)이 포함된 LB 배지(broth))에 1%(v/v) 접종하여 OD₆₀₀ 값이 0.6이 되도록 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균에 각각 0.1 mM 또는 1 mM의 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도하였으며 25℃에서 16시간 동안 단백질을 발현시켰다.

7-3: scFv 발현 확인 - 웨스턴 블롯

단백질 발현 확인을 위해 각각의 1 ml의 세포를 취하고 원심분리기를 통해 세포를 침전시켰다. 상층액 40 ul만을 새 튜브에 옮긴 후 10 ul의 5X 샘플 버퍼(sample buffer: 60 mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올 및 0.1% 브로모페놀 블루 수용액)를 혼합해 10분 동안 끓인 후, 12% SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다. 겔(Gel)의 단백질을 웨스턴 블롯(western blotting)으로 분석하기 위해 PVDF 블롯팅 멤브레인(PVDF blotting membrane, GE healthcare)에 이동(transfer)시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인을 TBSM(TBS 내 5% 스킴 밀크)을 이용하여 블로킹하였다. 1차 항체로 항-6xHis 항체를 TBSM 버퍼에 1:2000으로 희석 후 처리하여 4℃에서 15시간 반응시키고, TBST를 이용하여 3회 수세한 뒤 2차 항체로 항-마우스 IgG::HRP를 TBSM 버퍼에 1:5000 으로 희석 후 처리하여 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. TBST를 이용하여 3회 수세한 뒤 ECL 용액을 이용하여 발색(developing)을 진행하여 단백질 발현 여부를 확인하였다.

7-4: scFv 정제 및 농축

발현 테스트를 통해 단백질 발현을 확인한 세포들은 단백질 정제를 위하여 500 ml의 암피실린 및 클로람페니콜 LB 배지(broth)에 1% 접종하여 OD₆₀₀ 값이 0.6이 되도록 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균에 각각 1 mM의 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도하였으며 25℃에서 16시간 동안 단백질을 발현시켰다.

단백질 정제를 위해 원심분리기를 이용해 세포를 침전시키고, 상층액만을 0.22 μm stericup(Millipore)을 이용하여 여과하였다. 여과액은 Capto^TML 레진을 이용하여 정제하였다. 정제한 scFv는 상기 발현 테스트와 같은 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였으며 단백질 순도 확인을 위해 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining) 또한 수행하였다. 그 결과를 각각 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. 이후 Centricon® 10,000 NMWL(공칭 분자량 한계, nominal molecular weight limit)(Merck)을 이용하여 버퍼 전환 및 단백질 농축을 수행하여 단백질 정제를 마무리하였다.

<실시예 8> 정제된 scFv을 이용한 ELISA - KHV CP 진단 능력 확인

정제한 scFv의 KHV CP 진단 능력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 진행하였다. 어류세포주(CCB cell line, common carp (Cyprinus carpio carpio) brain cell, 독일 프리드리히 뢰플러 연구소(Friedrich Loeffler Institute)로부터 계대배양 번호 67의 CCB 세포를 구매함)를 이용하여 KHV(대한민국 경상대학교로부터 잉어 헤르페스바이러스를 제공받음)를 감염시키고 원심분리를 통해 KHV 비리온(virion)을 확보하였다. KHV 비리온을 카보네이트 코팅 버퍼(carbonate coating buffer)에 1:200으로 희석하고 96 웰 플레이트에 각 웰 당 100 ul씩 분주하여 25℃에서 4시간 동안 코팅 과정을 진행하였다. TBST로 수세한 후 TBSM을 이용해 4℃에서 15시간 동안 블로킹하였다. 이후 scFv 단백질은 20 ug/ml의 농도를 가지도록 PBS를 이용해 희석한 후 다시 TBSM에 1:100으로 희석하여 96 웰 플레이트의 각 웰 당 100 ul씩 첨가하고 25℃에서 2시간 동안 코팅된 항원과 반응시켰다. TBST로 수세한 이후 마우스 유래 항-HisX6 항체와 항-마우스 항체::HRP를 TBSM에 각 1:1000으로 희석하고 각 웰에 100 ul씩 넣어 반응시켰다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 각 웰에 100 ul의 TMB 기질 용액을 넣어 발색 반응을 진행했으며 10분 뒤 50 ul의 1M H₂SO₄를 넣어 발색 반응을 멈추게 하였다. 분광광도계를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며 이 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)에 대한 450 nm에서의 Abs(absorbance) 값은 BSA(bovine serum albumin)와 통계적으로 유의한 차이가 없었으나(ns: no significant difference), 정제한 scFv 단백질은 표적 바이러스인 KHV에 특이적으로 높은 반응성을 유의하게 보이는 것을 확인하였다(**** p <0.0001). 이렇게 최종 선발된 scFv의 아미노산 서열을 도 9에 나타내었다.

<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to Koi herpesvirus and Uses thereof <130> PN210290 <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized amino acids of KHV CP <400> 1 Met Tyr Gly Leu Asn Ser Ala Ser Gly Phe Leu Asp Thr Glu Trp Val 1 5 10 15 Glu Lys Gln Gly Met Val Thr Pro Pro Glu Glu Val Ala Lys Met Leu 20 25 30 Asn Pro His Leu Ala Thr Met Gly Lys Pro Val Asp Val Thr Ser Leu 35 40 45 Met Leu Pro Asn Gly Ile Phe Val Pro Tyr Thr Pro Thr Gly Pro Glu 50 55 60 Pro Asn Ile Ala Ile Gly Gly Gly Tyr Phe Tyr Arg Pro Ser Tyr His 65 70 75 80 Gly Tyr Gly Ser Val Ala Glu Asp Ser Asp Asp Leu Gln Lys Leu His 85 90 95 Lys Asn Val Leu Cys Arg Asn Glu Gly Gln Trp Thr Arg Thr Ala Leu 100 105 110 Ile Gly Val Pro Thr Thr Gly Asn Phe Pro Val Asp Leu Phe Asp Tyr 115 120 125 Lys Asn Gln Lys Tyr Gln Ile Val Asn Thr Gly Pro Asp Ala Leu His 130 135 140 Ser Gly Asp Ala Phe Met Val Glu Pro Pro Ser Val Glu Ala Ser Lys 145 150 155 160 Ala Gln Ile Asp Ser Phe Lys Arg Ile Arg Ala Gln Gly Ser Phe Arg 165 170 175 Gln Pro Thr Leu Leu Gly Gly Leu Ser Ala Thr Asn Arg Val Pro Ser 180 185 190 Glu Leu Thr His Arg Met Lys His Ile Met Ala Arg Asp Ile Gly Leu 195 200 205 Cys Met Asp Ile Thr Thr Pro Gly Gln Gly Gly Val Gln Ala Gly Leu 210 215 220 Ala Arg Leu Tyr Gln Ala Pro Thr Glu Leu Gly Gln Ala Val Lys Asn 225 230 235 240 Ser Val Met Ala Thr Thr Leu Asp Cys Met Asn Ser Leu Asp Val Ile 245 250 255 Phe Ser Met Met Arg Arg Ile Ala Ala Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu 260 265 270 Thr Leu Ala Glu Phe His Asn Phe Lys His Gly Gly Pro Gln Ala Thr 275 280 285 Met Pro Asp Pro Ala Ile Leu Ile Glu Ile Trp Arg Thr Pro Ala Val 290 295 300 Ala Asp Leu Phe Met Glu Ser Met Asp Met Gly Phe Gln Ser Ile Asp 305 310 315 320 Arg Leu Arg His Cys Thr Tyr Gly Thr Val Ile Lys Ser Thr Glu Ala 325 330 335 Asn Pro Thr Ser Thr Arg Gly Glu Ile Ile Tyr Asn Ala Tyr Ser Gly 340 345 350 Gln Tyr Asp Thr Gly Asp Thr Phe Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe Asn 355 360 365 Gly Tyr 370 <210> 2 <211> 1110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized nucleotide of KHV CP <400> 2 atgtacggat taaacagcgc gtccggcttt ctcgacacgg aatgggtcga gaagcagggt 60 atggtcaccc cgccagaaga ggtggccaag atgctgaacc ctcacctggc caccatgggc 120 aagcccgtgg acgtgacgag tctgatgctg cccaacggca tctttgtgcc ctacacgccg 180 acgggtcccg agcccaacat cgcaatcggc ggtggttact tttacaggcc ctcttaccac 240 gggtacgggt cggtggccga ggatagcgac gacctgcaga agctgcacaa gaacgtgctg 300 tgtcgcaacg agggacagtg gactcgcacg gccctgatcg gcgtccccac cacgggcaac 360 ttccccgtgg atctatttga ctacaagaac caaaagtacc agatcgtaaa cacgggcccc 420 gacgcgctgc actctggcga cgctttcatg gtggagcctc cgtccgtcga ggcctccaag 480 gcccagatcg acagcttcaa gcgcatcagg gcgcagggca gcttcaggca gcccacgctg 540 ctgggaggcc tgtccgccac caaccgcgtg ccctcggagc tcacgcaccg catgaagcac 600 atcatggcca gggacattgg gctgtgcatg gacattacga cgcccgggca aggcggcgtg 660 caagccggtc tggcgcgact gtaccaggcc cccacggagc tgggtcaggc cgtcaagaac 720 tctgtgatgg ccacaacgct ggactgtatg aactccctgg acgtgatctt ctccatgatg 780 cgacgcatcg ccgctctacc tcgcggcgtg ctcgagactc tggccgagtt ccacaacttt 840 aagcacgggg gaccccaggc gacgatgccc gacccggcca tcctgatcga gatctggagg 900 acacccgccg tcgcggacct cttcatggaa tccatggaca tgggcttcca gtccatcgac 960 cggctcaggc actgcaccta cggcacggtg atcaagtcca cagaggccaa cccaacctcc 1020 acccggggag agatcatcta caacgcttac agcggacagt acgacacggg cgacaccttc 1080 gagggcgccg tactctcctt caacggctac 1110 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F8, F6, E4: CDR1 of Variable Heavy Region <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5: CDR2 of Variable Heavy Region <400> 4 Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ala Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8: CDR2 of Variable Heavy Region <400> 5 Ile Leu Lys Arg Gly Val Asp Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F6: CDR2 of Variable Heavy Region <400> 6 Ile Ala Ala Asn Gly Val Gln Thr 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4: CDR2 of Variable Heavy Region <400> 7 Ile Pro Lys Leu Gly Ser Lys Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5: CDR3 of Variable Heavy Region <400> 8 Ala Lys Ala Arg Val Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8: CDR3 of Variable Heavy Region <400> 9 Ala Lys Leu Ala Glu Thr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F6: CDR3 of Variable Heavy Region <400> 10 Ala Lys Leu Ala Arg Leu Phe Asp Tyr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4: CDR3 of Variable Heavy Region <400> 11 Ala Lys Thr Leu Asn Leu Phe Asp Tyr 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F8, F6, E4: CDR1 of Variable Kappa Region <400> 12 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5: CDR2 of Variable Kappa Region <400> 13 Thr Ala Ser 1 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8, F6: CDR2 of Variable Kappa Region <400> 14 Pro Ala Ser 1 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4: CDR2 of Variable Kappa Region <400> 15 Lys Ala Ser 1 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5: CDR3 of Variable Kappa Region <400> 16 Gln Gln Ser Glu Trp Leu Pro Met Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8: CDR3 of Variable Kappa Region <400> 17 Gln Gln Thr Arg Val His Pro Pro Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F6: CDR3 of Variable Kappa Region <400> 18 Gln Gln Pro Asp Leu Pro Pro Gly Thr 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4: CDR3 of Variable Kappa Region <400> 19 Gln Gln Pro Pro Arg Arg Pro Arg Thr 1 5 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F6, E4: FR1 of Variable Heavy Region <400> 20 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8: FR1 of Variable Heavy Region <400> 21 Glu Val Pro Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F8, E4: FR2 of Variable Heavy Region <400> 22 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F6: FR2 of Variable Heavy Region <400> 23 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 15 Lys <210> 24 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5: FR3 of Variable Heavy Region <400> 24 Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 25 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8: FR3 of Variable Heavy Region <400> 25 Cys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 26 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F6: FR3 of Variable Heavy Region <400> 26 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 27 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4: FR3 of Variable Heavy Region <400> 27 Cys Phe Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F8, F6, E4: FR4 of Variable Heavy Region <400> 28 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F8, F6, E4: FR1 of Variable Kappa Region <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F8, F6, E4: FR2 of Variable Kappa Regiona <400> 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 31 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F6: FR3 of Variable Kappa Region <400> 31 Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 32 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8: FR3 of Variable Kappa Region <400> 32 His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 33 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4: FR3 of Variable Kappa Region <400> 33 Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5, F8, F6, E4: FR4 of Variable Kappa Region <400> 34 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 Variable Heavy Region <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ala Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Arg Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 Variable Kappa Region <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Trp Leu Pro Met 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 Variable Heavy Region <400> 37 Glu Val Pro Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Leu Lys Arg Gly Val Asp Thr Cys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Ala Glu Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 Variable Kappa Region <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Pro Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Val His Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F6 Variable Heavy Region <400> 39 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Lys Ile Ala Ala Asn Gly Val Gln Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Ala Arg Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F6 Variable Kappa Region <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Pro Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Asp Leu Pro Pro Gly 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 Variable Heavy Region <400> 41 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Pro Lys Leu Gly Ser Lys Thr Cys Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Leu Asn Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 Variable Kappa Region <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Pro Arg Arg Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S1 <400> 43 caacgtgaaa aaattattat tcgc 24 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S6 <400> 44 gtaaatgaat tttctgtatg agg 23

Claims (14)

1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV) 외피 단백질(Coat Protein, CP).
   
2. 다음을 포함하는 잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
   i) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역;
   ii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역;
   iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는
   iv) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
   i) 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
   ii) 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
   iii) 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
   iv) 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 조성물.
   
6. 제5항의 조성물을 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 키트.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인, 검출용 키트.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 면역분석용 키트는 단백질 마이크로어레이 또는 ELISA 분석 키트인, 검출용 키트.
   
9. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
   
10. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
    
11. 제10항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
    
12. 제11항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    잉어 헤르페스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
    
13. 제5항의 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계; 및
    상기 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출용 조성물과 외피 단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는, 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출 방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 시료는 검출 대상 어류의 뇌, 아가미, 심장, 지느러미, 간, 췌장, 위, 장, 비장, 신장, 배설강, 유문수, 근육 조직, 피부 조직, 분변, 체액, 점액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 잉어 헤르페스바이러스(KHV) 검출 방법.
    

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