KR20230027374A - 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지의 지방산의 함량을 판별할 수 있는 SNP 마커에 관한 것으로, 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커 조성물 및 이를 이용한 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별 방법에 관한 것이다.
약 9000년 전에 인도의 동부 지방에서 사육된 이래로, 돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔다. 일반적으로 유럽품종과 아시아 품종들은 각 대륙의 야생 멧돼지(Susscrofa)에서 유래되었으며, 현재까지 존재하고 있는 품종은 200여종 이며, 최근 FAO (Finance and Accounts Office)에서 발표한 결과에 따르면 아시아품종이 30%, 유럽품종이 33% 정도임이 보고되었다. 이 품종들 사이에 표현형의 차이는 모색, 크기, 체형 등이 있다.
최근에는, 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵기 때문에, 이러한 점을 악용하여 브랜드화되지 않은 돼지육을 브랜드화된 돼지육으로 속여서 판매하는 방식으로 돼지육의 유통질서를 교란시키는 사건이 빈번하게 발생하고 있다. 실제로, 브랜드화된 돼지와 브랜드화되지 않은 돼지육을 구별하는 것은 전문가의 수준에서도 매우 어려운 일이기 때문에, 정품 브랜드의 돼지육을 판별하는 객관적인 기준을 마련하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 지방산 (fatty acid, FA) 성분은 감각적, 영양적 및 기능적 요인에 기여할 수 있기 때문에 돼지 고기 품질 평가에 중요한 역할을 하며, 예를 들어, FA 성분은 돼지 고기의 산화 안정성을 조절하여 고기의 색과 풍미에 영향을 미친다.
따라서, 이러한 돼지의 지방산의 함량을 판별하여 돼지의 품질을 판별할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 돈육의 품질을 판별하기 위하여, 돼지의 지방산의 함량을 판별할 수 있는 SNP 마커 조성물, 돼지의 지방산 함량 판별용 조성물, 판별용 키트 및 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예는 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물이다.
본 발명의 다른 실시예는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 조성물로서, 상기 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다.
상기 제제는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 상기 조성물을 포함하는, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 키트이다.
본 발명의 다른 실시예는 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;를 포함하며, 상기 (a) 단계의 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별 방법이다.
상기 개체는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스 교잡종일 수 있다.
본 발명에 따른 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량을 판별할 수 있는 SNP 마커는 돈육 내 지방산을 객관적으로 평가할 수 있고, 이에 따라 돈육의 품질을 쉽게 판별할 수 있다.
도 1은 GAS7 유전자의 염기서열을 나타내는 것이며, 1001번째 염기에서 T/C 염기 변이가 나타난다.
도 2는 GWAS(genome wide association study)분석을 통해 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량과 관련된 유전자가 포함된 염색체를 확인한 것이다.
도 3은 연결분석을 통해 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)에 대한 12번 염색체의 주요 QTL 영역을 분석한 것이다.
도 4는 12번 염색체의 서열번호1의 GAS7 유전자의 염기서열의 1001번째 염기 변이에 따른 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 GWAS(genome wide association study)분석을 통해 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량과 관련된 유전자가 포함된 염색체를 확인한 것이다.
도 3은 연결분석을 통해 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)에 대한 12번 염색체의 주요 QTL 영역을 분석한 것이다.
도 4는 12번 염색체의 서열번호1의 GAS7 유전자의 염기서열의 1001번째 염기 변이에 따른 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 GAS7 유전자의 변이염기를 SNP 마커로 활용하여 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량을 판별하는 것이다.
| < GAS7 염기서열, 서열번호 1> CCTACATTGCCGTGAGTTGTGGTGTAGGTCGCAGACGCAGCTCGGATCCCGCGTTGCTCTGGCTCTGGCATAGGCTGGCAGCTGTAGCTCCAATTCGACCCCTAGCCTGGGAACCTCCATATGCCGTAGGTGCGGCCCTAGAAAAGAAAAAAAGAAGAGAAGCAGGACAGGGAGAGGACCAGTTCACATGACACCTGCTCTCTGGGGTGTCCTGTCCTGTAGCCCAAAGAGCCTGGCTCTCCAGGACCCAGGGGCCTCACTTTGAGGTTCAGCACTGACCTGTCCACCTGGGCCTTCCACAACCCCAACCCATACTCCGTGACAAGGCCATTCACGCCTTCTCGAAGAAAAACTGCTTAAGCCAGGGGCCCACATCCCAGCAAGGTGGGCCTGATTCCCCAGGGCAAGCTCTCATCTCTTTATCCTCTTCAGTTCAGCCAGCCGTCCAACCAGCCATCCAAGAGTTACCCAGCCAGGCCTCATGGAAGCCGAGGGCCGGGCAGGGCCATCCCAGAGATTTCCTGCCCTGGAGGGGCTCAGGGTGCAGGGGGAGAGGGTCACACGAGTCACCACCGGCCAGGGCTATCGCGGGGGGCAGCCCTGTGCAAGCCAGGGGAGAAGGAGCAACCGGCCTGGGGAGCGACCGAAGGGCACAGGTGGGCTGGGTCTGGGGGAGGCAAGAGGGGGAGGGACCCCAGAGAGAGGGGCGGGTGTGCAGAGGCACGGGGTGCGGAGGTGTGTGTACCCGGAGAGGGCAACTGAGGAGGCTGGGGCGGGTGGGGAAGGTGGTCTGTGAAGGCCCCTGTCCCCCAGCAAGGAGCAGCCCGACTCTCGGGACAGTGGGGAGCCAGTGGAGATGGCTCCATAGGACTCAGGTTGTAGGAGGACACCGTGGAGGGCCACGCGAGGCTAGGAAGTGTGGGACTCCAGCCCCAAGCCTGGGGTCCCTGGCTCAGCTGGAACACAGGGATATTGACTAGGAAGCCAGTTAACAGGAAACTTGCCACTCCCTGGGAGACGTCAGCCACTTTCCAACCACCTCCCTCCAGCCTTCCCCCTTGGGGTCCAGCCCTCCAGAAACAACAGACCGTCCTCCTCCCCCCTCCCCCACAAGCCAGGAGAAGGCCAAGGGCACGGGACTCTGCGAGGATGGATCACGCCAGCGGCAGGTCTGCGCCGGATCCCTCTCCACCCTGCCCGCCTCTCACGCCGGCCCTCATTTGCAGGAGACGTGCCGCTGTAGCTGAGTGTATATATCGTCTGGATGATTTGCCGTGGAGCATCATTTACACCTTCTGCTGCTCCTCCGAGAAAATCATTTCTCCAAGACTAATAATAAAACAGACCAGCCACCTAGAGTAACAAAGCACTGCAACCAGCCCCTGGCACGCAATTCAGAAACACACCAGAACAGCTGCACGTGGCATGCCCCAGAGCAGAGAGGAGCGGCAGCGTGTAGCGGACTGGGATTCTGGACTTTGCAAACAGTGTCACCTAGAGCACCACGGCTTCCTGGAGGAGTCCCCAGAGCGGGTATGCAGCCAGAAGAGCAGTGCCTGGGTCAGACCCCAAGGAGCACCCGTGAAGCCAGGTCTGGGAGCCCTGGAGACTTGAGGCTGGATCTGGTTCCCCTGTCTGCATTTGCACATCAGCACAGCTGCCTTCATGGACTGGGGACACAGGGGCAAAGGGCAAAGGGCTCAGGCCTGCCTGGCTCCACAAACCCCCTGGAGTGCCCAGTCAAGCTCTGGCCAAGCCATTCCCCACATCTCCCTCACTGGCAGGGCCTCCAACCCGCTCAGAATGACTCCACAGTGGACTCTGCACAGCTGAGGAAGAGGCCTGGCTACCTTCTCCCAGGTGAGACAGAGGACACCCGTCTGAAATTCTCAACATCAACAGCATCACTGCAGCCACACACCCCCACGGGGCTCCTTAAGGGCACCTAGAGATCAGGTCTTATACCCACAGACGGCTCACTGTCGCTCTGACCCCAAATTC |
따라서, 본 발명의 일 실시예는 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물이다.
본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량을 판별하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량을 판별할 수 있고, 상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스 교잡종일 수 있다.
본 발명의 돼지의 지방산은 아라키돈산(Arachidonic acid, C20:4)으로 20:4 ω-6 또는 20:4(5,8,11,14)로 표기되는 다불포화 지방산 및 오메가-6 지방산으로, 아라키돈산은 신체를 구성하는 세포의 세포막에 있는 인지질(특히, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨)에 존재하는 다불포화 지방산이며, 뇌, 근육 및 간에 풍부하다.
본 발명에 있어서, 상기 아라키돈산(Arachidonic acid, C20:4)은 12번 염색체에 위치한 SNP(M1GA0017062)의 유전형을 이용하여 함량을 예측할 수 있는 대상으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T인 경우의 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량이 1001번째 염기가 C인 경우보다 높은 수준을 나타내는 것으로 판별할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 유전자형이 TT인 경우 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량이 상대적으로 가장 높은 수준을 나타내었고, 유전자형이 CC인 경우 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량이 상대적으로 가장 낮은 수준을 나타내었으며, 유전자형이 CT인 경우 중간 값을 나타내었다. 따라서, 유전자형이 TT 및 CT를 모두 포함하는 경우는 유전자형이 CC인 경우보다 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량이 높게 판별되었다(실시예 3).
본 발명의 다른 실시예는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 조성물로서, 상기 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량을 판별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 의미한다.
상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 용어, "프로브"는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 조성물을 포함하는, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 DNA 칩 키트는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량을 판별할 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;를 포함하며, 상기 (a) 단계의 SNP 마커는 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 C인 경우의 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량이 1001번째 염기가 T인 경우보다 높은 수준을 나타내는 것으로 판별할 수 있다.
상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다.
상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.
<재료 및 실험방법>
1. 동물
순종 제주 토종 돼지(KNP)와 순종 랜드레이스 돼지(Landrace)를 를 교배(LK cross)하여 F2 자원 개체군(수컷 568 마리, 암컷 537 마리)의 총 1,105 마리의 동물을 확립하였다.
구체적으로, 19 마리의 KNP돼지와 17 마리의 Landrace 돼지를 교배하여 91마리의 F1 세대 동물을 확보하였고, F1 자손을 교배하여 F2 자손을 생성하였다. 사육, 사료, 표현형에 대한 모든 실험 절차는 제주도에 위치한 국립 동물 과학원 아열대 축산 연구소의 동일한 연구 농장에서 이루어졌다.
2. 표현형
장근 배근(Longissimus dorsi muscle)은 지방산(FA) 조성 데이터를 위해 F2 자손에서 샘플링하였다.
Folch et al(A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J. Biol. Chem. 1957, 226, 497-509.)의 방법에 따라 클로로포름-메탄올(2:1,v/v)을 사용하여 각 장근 배근 샘플의 근육 내 지질을 분리하고, 지질 추출물을 Morrison과 Smith의 방법(Preparation of Fatty Acid Methyl Esters and Dimethylacetals from Lipids with Boron Fluoride-methanol. J. Lipid Res. 1964, 5, 600-608.)을 사용하여 지방산(FA) 메틸 에스테르로 변환하였다.
FA 메틸 에스테르의 분리 및 정량화는 가스 크로마토 그래프(6890N, Agilent Technologies, Germany)를 사용하여 수행하였다.
3. 유전자형
F2 개체에 대하여 돼지 SNP 60K BeadChip (Illumina)을 사용하여 62,163 개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 마커에 대해 유전자형을 분석하였고, 게놈 DNA는 표준 sucrose-proteinase K 방법을 사용하여 혈액에서 추출하였다. 유전자형 SNP 마커의 품질 관리 및 여과는 PLINK 프로그램 (ver. 1.90)을 사용하여 수행하였으며, 유전형은 경미한 대립 유전자 빈도 (<5 %), 유전형 호출 비율 (<90 %) 및 Hardy-Weinberg 평형 오류에 대한 c2-테스트의 P- 값(≤0.000001)에 따라 필터링되었다. 18 개의 상 염색체에 대한 총 39,485 개의 SNP 마커가 여과 및 품질 관리 후에도 남아있었다.
4. QTL 매핑을위한 GWAS
단일 마커 연관 분석은 게놈 차원의 효율적인 혼합 모델 연관(genome-wide efficient mixed model association, GEMMA) 프로그램(ver. 0.94.1)을 사용하여 FA 프로파일 형질에 대한 양적 형질 위치(QTL)를 식별하기 위해 수행되었다. 이 접근법은 전체유전체 상관분석 연구(genome-wide association study, GWAS) 동안 F2 개체 내에서 가족연관(familial relatedness)를 조정한다.
GWAS의 다중 비교 문제를 해결하기 위해 LK 코호트에 대해 Bonferroni 조정 유의 임계 값 (i.e., 0.01/39,485 SNP markers, p = 2.53 x 10-7)을 계산하였고, 유의성 역치를 기준으로 GWAS는 염색체별로 염색체를 수행하였다. 이러한 QTL 영역의 신뢰 구간은 상위 SNP 부근에서 유의성 임계 값 (p = 2.53 x 10-7)보다 낮은 명목 p-value를 갖는 두 개의 SNP (상한 경계 및 하한 경계)를 사용하여 결정되었다.
5. 고해상도 QTL 매핑을 위한 LALD(Joint Linkage and Linkage Disequilibrium) 분석
GWAS에 의해 검출 된 가장 중요한 QTL의 고해상도 매핑은 일배체형 기반 접근법(haplotype-based approach)을 사용하여 연결 (LA)과 연결 불균형 (LD)을 공동통합하여 수행되었다.
먼저, CRIMAP 프로그램 (ver. 2.503)을 사용하여 GWAS에 의해 검출된 가장 중요한 QTL을 포함하는 염색체의 유전적 연결지도를 설정하였다.
다음으로, 부모 돼지(즉, Landrace 및 KNP)에서 발견된 설립자 일배체형은 가족 수준에서 얻은 LA정보와 인구 수준에서 얻은 LD 정보를 Hidden MarkovModel 프레임 워크에 통합하는 DualPHASE 프로그램(ver. 1.1)을 사용하여 재구성되었고, 총 20 개의 설립자 일배체형 클러스터 (K = 20)가 사용되었다.
마지막으로, 추정된 일배체형을 고정(예 : 성별, 배치 및 도체 무게) 및 랜덤 효과(즉, 창립자 일 배체 유형 및 동물 효과의 20 가지 효과)와 랜덤 잔여 오차 항을 포함하는 혼합 모델에 통합하여 QxPAK 프로그램(ver. 5.05)을 사용하여 QTL 분석의 고해상도 매핑을 수행하였고, 미세 매핑된 QTL의 신뢰 구간은 1-LOD 드롭 방법으로 설정되었다.
6. 위치 후보 유전자 분석
각 QTL의 유전자 목록은 Sus scrofa 11.1 어셈블리 (NCBI 액세스 ID : NC_010454.4)를 기반으로 NCBI 데이터베이스 릴리스 85에서 추출되었고, 각 QTL 영역의 유전자 목록은 NCBI 데이터베이스에서 얻었다. QTL 위치의 비교 분석은 Animal QTLdb를 사용하여 수행되었다.
실시예 1 : 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 관련 GWAS 분석 결과
도 2는 GWAS(genome wide association study)분석을 통해 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량과 관련된 유전자가 포함된 염색체를 확인한 것이다.
도 2를 통해, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량과 연관된 양적형질위치(Quantitative trait locus, QTL)는 돼지의 12번 염색체(SSC 12)에 있음을 확인하였다.
실시예 2 : 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)관련 QTL 지역 분석
돼지의 12번 염색체 중 구체적인 QTL 영역을 확인하기 위하여, 연결 분석(linkage analysis)을 수행하였다.
도 3은 연결분석을 통해 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)에 대한 12번 염색체의 주요 QTL 영역을 분석한 것이다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, QTL은 M1GA0017062를 포함하는 지역에 존재하고 있음을 확인하였다.
실시예 3: 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 연관 SNP를 포함하는 염기서열 추출 및 분석
상기 실시예 2를 통해 12번 염색체에 위치한 M1GA0017062 SNP가 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량과 관련하여 유의성이 가장 높음을 확인하였다. 이에 상기 M1GA0017062를 포함하는 GAS7 유전자의 서열(서열번호 1)을 확보한 다음, 이들의 염기서열을 분석하였고, 1001번 염기서열에 따른 유전자형 (TT, TC, CC)을 확인하였다(도 3).
도 4는 12번 염색체의 서열번호 1의 염기서열로 구성된 M1GA0017062 폴리뉴클레오티드에 포함된 1001번째 염기 변이에 따른 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 유전자형은 CC, CT 또는 TT로 구분됨을 확인하였다.
또한, 유전자형이 TT인 경우 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량이 상대적으로 가장 높은 수준을 나타내었고, 유전자형이 CC인 경우 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4)의 함량이 상대적으로 가장 낮은 수준을 나타내었으며, 유전자형이 CT인 경우 중간 값을 나타내었다.
이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> SNP marker for determining the content of fatty acid(Arachidonic
acid, C20:4) in pigs and its uses thereof
<130> DP20210117
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2001
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS7
<400> 1
cctacattgc cgtgagttgt ggtgtaggtc gcagacgcag ctcggatccc gcgttgctct 60
ggctctggca taggctggca gctgtagctc caattcgacc cctagcctgg gaacctccat 120
atgccgtagg tgcggcccta gaaaagaaaa aaagaagaga agcaggacag ggagaggacc 180
agttcacatg acacctgctc tctggggtgt cctgtcctgt agcccaaaga gcctggctct 240
ccaggaccca ggggcctcac tttgaggttc agcactgacc tgtccacctg ggccttccac 300
aaccccaacc catactccgt gacaaggcca ttcacgcctt ctcgaagaaa aactgcttaa 360
gccaggggcc cacatcccag caaggtgggc ctgattcccc agggcaagct ctcatctctt 420
tatcctcttc agttcagcca gccgtccaac cagccatcca agagttaccc agccaggcct 480
catggaagcc gagggccggg cagggccatc ccagagattt cctgccctgg aggggctcag 540
ggtgcagggg gagagggtca cacgagtcac caccggccag ggctatcgcg gggggcagcc 600
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gctgggtctg ggggaggcaa gagggggagg gaccccagag agaggggcgg gtgtgcagag 720
gcacggggtg cggaggtgtg tgtacccgga gagggcaact gaggaggctg gggcgggtgg 780
ggaaggtggt ctgtgaaggc ccctgtcccc cagcaaggag cagcccgact ctcgggacag 840
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cacgcgaggc taggaagtgt gggactccag ccccaagcct ggggtccctg gctcagctgg 960
aacacaggga tattgactag gaagccagtt aacaggaaac ttgccactcc ctgggagacg 1020
tcagccactt tccaaccacc tccctccagc cttccccctt ggggtccagc cctccagaaa 1080
caacagaccg tcctcctccc ccctccccca caagccagga gaaggccaag ggcacgggac 1140
tctgcgagga tggatcacgc cagcggcagg tctgcgccgg atccctctcc accctgcccg 1200
cctctcacgc cggccctcat ttgcaggaga cgtgccgctg tagctgagtg tatatatcgt 1260
ctggatgatt tgccgtggag catcatttac accttctgct gctcctccga gaaaatcatt 1320
tctccaagac taataataaa acagaccagc cacctagagt aacaaagcac tgcaaccagc 1380
ccctggcacg caattcagaa acacaccaga acagctgcac gtggcatgcc ccagagcaga 1440
gaggagcggc agcgtgtagc ggactgggat tctggacttt gcaaacagtg tcacctagag 1500
caccacggct tcctggagga gtccccagag cgggtatgca gccagaagag cagtgcctgg 1560
gtcagacccc aaggagcacc cgtgaagcca ggtctgggag ccctggagac ttgaggctgg 1620
atctggttcc cctgtctgca tttgcacatc agcacagctg ccttcatgga ctggggacac 1680
aggggcaaag ggcaaagggc tcaggcctgc ctggctccac aaaccccctg gagtgcccag 1740
tcaagctctg gccaagccat tccccacatc tccctcactg gcagggcctc caacccgctc 1800
agaatgactc cacagtggac tctgcacagc tgaggaagag gcctggctac cttctcccag 1860
gtgagacaga ggacacccgt ctgaaattct caacatcaac agcatcactg cagccacaca 1920
cccccacggg gctccttaag ggcacctaga gatcaggtct tatacccaca gacggctcac 1980
tgtcgctctg accccaaatt c 2001
Claims (6)
- 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물.
- 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 조성물로서,
상기 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 제제는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 조성물.
- 제2항의 조성물을 포함하는, 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 키트.
- (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별용 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;를 포함하며,
상기 (a) 단계의 SNP 마커는 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 1001번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 1001번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 개체는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스 교잡종인 것을 특징으로 하는 돼지의 지방산(Arachidonic acid, C20:4) 함량 판별 방법.
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Cho, IC. et al., PLOS Genetics (2019) 15(10):e1008279 * |
| Crespo-Piazuelo, D. et al., Scientific Reports volume 10, Article number: 13962 (2020) * |
| Kim, S. et al., Czech Journal of Animal Science (2019) 64(4) * |
| Wang, Z. et al. Journal of Animal Science and Biotechnology (2019) 10:27 * |
Also Published As
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