KR20230026396A - 코로나바이러스감염증-19(covid-19) 치료용 조성물 - Google Patents

코로나바이러스감염증-19(covid-19) 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SARS-Cov-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)를 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 화합물을 포함하는 치료용 조성물에 대한 것이다.

Description

코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물
본 발명은 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)를 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 화합물을 포함하는 코로나바이러스감염증-19 치료용 조성물에 대한 것이다.
코로나바이러스(coronavirus)는 RNA 바이러스의 한 종류로 유전정보가 리보핵산(RNA)으로 이루어진 바이러스로서, 사람과 동물의 호흡기와 소화기계 감염을 유발한다. 주로, 점막전염, 비말전파 등으로 쉽게 감염되며, 건강한 사람은 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키지만 드물게 치명적인 감염을 일으키기도 한다.
코로나바이러스 감염증 중 중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스(SARS-CoV)는 2003년 4월 중국으로부터 유행하여, 사망률 9.6%를 기록하며 많은 사람이 사망했고, 2015년에는 중동 호흡기 증후군-코로나바이러스(MERS-CoV)는 중동으로부터 유행하여 전세계로 퍼지면서, 사망률 약 36%의 높은 사망률을 나타내었으며, 2019년 12월 중국으로부터 유행한 중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)는 현재 진행 중이다.
중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)는 중국 우한에서 처음 출현한 이후 전세계로 빠르게 확산되었으며 WHO는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다. 최근 보고에 따르면, 일반적인 증상으로 발열(98.6%), 피로감(69.6%), 마른 기침(59.4%), 림프구 감소증(70.3%), 프로트롬빈 시간의 연장(58%), 및 젖산 탈수소효소의 증진(39.9%)이 있다(Wang, D. et al., JAMA, 2020). 상기 SARS-CoV-2는 기침과 재채기로 생성된 호흡기 비말을 통한 사람과 사람의 접촉 또는 기침 또는 재채기를 하는 사람들에 의해 오염된 물체 표면을 통해 주로 전염되는 것으로 보고되었고(CDC, How COVID-19 Spreads. Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), 2020), 무증상 감염이 가능한 것으로 보고된 바 있다(Yu, P. et al., J Infect Dis, 2020; Hoehl, S. et al., N Engl J Med, 2020; Bendix, A., Science Alert, 2020).
SARS-CoV-2의 사례가 전세계적으로 급증하면서, WHO는 2020년 1월 30일 '국제적 공중보건 비상사태'(PHEIC)를 선포했으며, 코로나바이러스 감염 확진자가 전 세계에서 속출하자 WHO는 3월 11일 홍콩독감(1968), 신종 플루(2009)에 이어 사상 세 번째로 코로나19에 대해 펜데믹(세계적 대유행)을 선포했다. 2021년 6월 기준으로 전세계적으로 약 1억7천만명의 환자가 발생하고, 약 3,547,000명이 사망했으며, 매일 수만명의 확진환자가 추가되어, 여전히 계속적으로 감염환자가 증가하는 추세에 있다. 한국에서도, 약 140,000명의 환자가 확진되었으며, 1,963명의 사망자가 보고되었다(COVID-19 Dashboard by the Center for Systems Science and Engineering(CSSE) at Johns Hopkins University(JHU), 한국 질병관리본부 홈페이지 자료).
이러한 세계적 대유행 및 심각성에도 불구하고, 현재 다른 바이러스(독감, 에볼라 바이러스 등)를 대상으로 하는 항바이러스제 치료, 항생제 치료(antibiotics therapy), 대증 요법(symptomatic treatment), 및 지지 치료(supportive therapy) 등을 병용하여 치료하는 포괄 치료(comprehensive treatment)로 대처할 수밖에 없는 상황이다(National Library of Medicine. Clinical Features of Suspected and Confirmed Patients of 2019 Novel Coronavirus Infection). 상기와 같은 포괄치료는 코로나바이러스에 특이성이 입증되지 않은 제제를 사용한 잠재적 치료방법에 불과하기 때문에, 환자의 특징, 면역력 및 상태에 크게 의존하여 각 환자마다 그 임상적 효과가 매우 상이하고, 특히 기저질환을 앓고 있는 환자 또는 어린아이와 노인을 포함하는 면역력이 약한 노약자들에 대한 치료효과가 적어, COVID-19에 특이적인 치료효과가 임상적으로 입증된 치료제의 개발이 필요하다.
현재 다른 바이러스 감염증 치료제로 승인된 항바이러스제에 기반한 COVID-19 치료제 연구가 진행 중이며, 구체적으로 인디나비르(indinavir), 사퀴나비르(saquinavir), 로피나비르/리토나비르(lopinavir/ritonavir)와 같은 항레트로바이러스(Antiretroviral) 인간면역결핍 I 단백질분해효소(HIV-1 protease) 억제제, 렘데시비르와 같은 RNA 중합효소 억제제(polymerase inhibitor), 라싸열과 에볼라 출혈열 대항 조사 중인 신약 트리아자비린(triazavirin), 항바이러스 단백질인 베타인터페론(en:interferon beta), 이전에 식별된 단일클론항체(Monoclonal antibody) 등이 COVID-19에 대한 치료제 후보 물질로 연구 또는 임상시험 중에 있으나, 현재 COVID-19의 치료제로 승인이 완료된 치료제는 미 FDA 승인을 받은 렘데시비르(Remdesivir, 길리어드사이언스), 소트로비맙(GSK)이 있으며, 현재, 한국 내 허가가 완료된 치료제는 길리어드사이언스의 렘데시비르와 셀트리온의 렉키로나주이다(Paules, Catharine I., Marston, Hilary D., Fauci, Anthony S. (2020.01.23)., Coronavirus Infections-More Than Just the Common Cold; "Ural scientists have proposed testing the drug against coronavirus. Ural Federal University, 23/1/2020" 등).
현재에도 전세계 다수의 제약회사에서 백신 개발을 위한 노력을 기울이고 있으나, 아직 만족할만한 치료효과나 예방효과를 나타내는 백신이나 치료제는 보고되고 있지 않으며, 여전히 치료 및 예방효과가 우수한 치료제에 대한 수요는 절실한 상황이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 기존에 항암 효과를 갖던 화합물이 SARS-Cov-2를 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있고, 이에 따라 상기 화합물들이 코로나바이러스감염증-19 치료용도로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제1,692,921호
한국보건사회연구원 발행 '보건복지 Issue & Focus' 제373호(2020. 4.) 문성실, BRIC View 2020-TX2(2020)
발명의 요약
본 발명의 목적은 코로나바이러스감염증-19 치료용 약학 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 제형을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 코로나바이러스감염증-19 치료용 약학 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 제형을 코로나바이러스감염증-19 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 치료방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 I의 구조를 가지는 화합물, 이의 프로드럭, 이의 염, 또는 이의 이성체를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서, Ra는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이고, Rb는 아릴기, 치환된 아릴기, 또는 -C(=O)Re이고, Re는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이다.
본 발명에 따른 코로나바이러스감염증-19 치료용 약학 조성물에 포함되는 상기 화학식 I의 화합물에 있어, Ra는 C1-C6의 알킬기 또는 C2-C6의 알케닐기이고, Rb는 -C(=O)Re이고, Re는 C1-C6의 알킬기인 것이 바람직하며, Ra는 메틸(methyl)이고, Rb는 -C(=O)CH3인 것이 보다 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 화학식 I의 화합물에 있어 Ra는 메틸(methyl)이고, Rb는 -C(=O)CH3인 경우, 화학식 II의 구조를 가진다.
[화학식 II]
Figure pct00002
또한 본 발명에 따른 상기 화학식 I의 화합물의 프로드럭은 화학식 III의 구조를 가진다.
[화학식 III]
Figure pct00003
상기 화학식 III에서, Ra는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이고, Rb는 아릴기, 치환된 아릴기, 또는 -C(=O)Re이고, Re는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이고, Rp는 -PO3H2, -HPO3 -Na+, -PO3 2-Na2 +, -PO3 2-K2 +, -PO3 2-Mg2+, -PO3 2-Ca2+, 구조식 1, 구조식 2, 또는 구조식 3이다.
Figure pct00004
특히 본 발명에 따른 화학식 III의 화합물에 있어, Ra는 C1-C6의 알킬기 또는 C2-C6의 알케닐기이고, Rb는 -C(=O)Re이고, Re는 C1-C6의 알킬기, Rp는 -PO3H2, -HPO3 -Na+ 또는 -PO3 2-Na2인 것이 바람직하며, Ra는 메틸(methyl)이고, Rb는 -C(=O)CH3, Rp는 -PO3H2, -HPO3 -Na+ 또는 -PO3 2-Na2인 것이 보다 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
가장 바람직하게는 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 프로드럭인 화학식 III는 화학식 IV 내지 화학식 VI의 구조를 가질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 화학식 I 내지 화학식 VI의 구조를 갖는 화합물은 대한민국 등록특허공보 제1,692,921호에 기재된 방법 등에 의해 제조될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00005
또한 본 발명은 화학식 I 내지 화학식 VI의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 화학식 I 내지 화학식 VI의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염의 비제한적인 예로는 염산, p-톨루엔설폰산, 푸마르산, 시트르산, 숙신산, 살리실산, 옥살산, 브롬산, 인산, 메탄설폰산, 타르타르산, 말레이트, 디-p-톨루오일 타르타르산, 오르틴산, 에디실산, 헤미 에디실산 및 만델산의 염이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 화학식 I 내지 화학식 VI의 화합물을 포함하는 치료용 조성물에는 약제학적으로 허용 가능한 담체가 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 비내, 비강내, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 투여 형태에 적합한 제형으로 제조되어 상기 경로로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이에 따라 본 발명은 본 발명에 따른 치료용 조성물을 포함하는 경구 또는 비경구 투여용 약제학적 제형을 제공한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 치료용 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 제형은 경구 투여되거나, 비내 또는 비강내 투여될 수 있으며, 특히 비내 또는 비강내 투여시에는 스프레이(spray) 또는 에어로솔(aerosol) 형태로의 투여, 또는 흡입(inhalation) 투여용 제형으로 제형화되어 투여되는 것이 더욱 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 비내 또는 비강내 투여용 약제학적 제형은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조될 수 있으며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체 이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조될 수 있다.
또 다른 형태로서, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제형으로 제형화될 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 비히클 및 용매의 비제한적인 예시로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.
또한 본 발명에 따른 치료용 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 펠렛, 정제, 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 약제학적 제형의 형태로 제형화되어 경구 투여될 수 있다.
경구 투여용으로 제형화되는 경우, 본 발명에 따른 치료용 조성물에 약학적으로 허용되는 하나 이상의 부형제를 포함하여 제형화될 수 있으며, 그러한 부형제로는 충전제(희석제), 붕해제, 결합제, 활택제(윤활제), 방부제, 산화방지제, 완충제, 킬레이트제, 가용화제 및 감미제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 사용될 수 있다.
비제한적인 예시로, 충전제(희석제)는 만니톨(mannitol), 탄산 칼슘(calcium carbonate), 제2인산 칼슘(calcium phosphate dibasic), 제3인산 칼슘(calcium phosphate tribasic), 황산 칼슘(calcium sulfate), 미세결정성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 미세결정성 규화 셀룰로오스(microcrystalline silicified cellulose), 분말 셀룰로오스, 덱스트레이트(dextrates), 덱스트로오스(dextrose), 프럭토오스(fructose), 락티톨(lactitol), 무수 락토오스(lactose anhydrous), 락토오스 모노하이드레이트(lactose monohydrate), 락토오스 디하이드레이트(lactose dihydrate), 락토오스 트리하이드레이트(lactose trihydrate), 소르비톨(mannitol sorbitol), 전분(starch), 전호화 전분(pregelatinized starch), 수크로오스(sucrose), 탈크(talc), 자일리톨(xylitol), 말토오스 말토덱스트린(maltose maltodextrin) 및 말티톨(maltitol)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상;
붕해제는 크로스포비돈, 알긴산, 이산화탄소, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시메틸 셀룰로오스 소듐, 미세결정성 셀룰로오스, 분말 셀룰로오스, 크로스카멜로오스 소듐, 크로스포비돈, 소윰 도큐세이트, 구아검, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴라크릴린 포타슘(polacrilin potassium), 폴록사머, 포비돈, 소듐 알지네이트, 소듐 글리신 카보네이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 스타치 글리콜레이트, 전분 및 전호화 전분으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상;
결합제는 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 아카시아 뮤실라지(acacia mucilage), 알긴산(alginic acid), 카보머(carbomer), 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시메틸셀룰로오스 소듐, 미세결정성 셀룰로오스, 분말 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 젤라틴, 액상 글루코오스, 구아 검, 말토덱스트린, 메틸셀룰로오스, 폴리덱스트로오스, 폴레에틸렌 옥사이드, 포비돈, 소듐 알지네이트, 전분 패이스트, 전호화 전분 및 수크로오스로 구성된 군에서 선택된 하나 이상;
활택제(윤활제)는 탈크, 소듐 스테아릴 푸마레이트, 마그네슘 스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 소듐 라우릴 설페이트, 전분, 글리세릴 베헤네이트(glyceryl behenate), 수소화된 피마자 기름, 스테아린산, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 칼슘 실리케이트, 분말화 셀룰로오스 및 전분으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 경구 투여용 약제학적 제형은 캡슐, 펠렛 또는 정제인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 정제는 필름 코팅층을 포함하는 필름 코팅 정제인 것이 보다 바람직하다.
상기 필름 코팅층은 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 알코올과 폴리에틸렌과의 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타아크릴산 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드 및 잔탄 검으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 코팅 기제를 이용하여 형성될 수 있으며, 이에 따라 상기 필름 코팅층은 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 알코올과 폴리에틸렌과의 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타아크릴산 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드 및 잔탄 검으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 필름 코팅 기제를 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 치료용 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 제형은 코로나바이러스 감염증, 특히 코로나바이러스감염증-19의 치료에 이용될 수 있다.
이에 따라 본 발명은 본 발명에 따른 치료용 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 제형을 코로나바이러스 감염증, 특히 코로나바이러스감염증-19의 치료에 사용하는 용도, 및 상기 치료가 필요한 환자에게 본 발명에 따른 약제학적 제형을 투여하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염증, 특히 코로나바이러스감염증-19의 치료 방법에 대한 것이다.
본 발명은 또한 코로나바이러스 감염증의 치료를 위한 약제 제조를 위한 본 발명의 조성물의 사용에 대한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 화학식 II의 화합물과 기존의 약물을 처리한 경우의 SARS-CoV-2의 저해율과 세포 독성을 나타내는 도면이다.
(A) 화학식 II의 화합물
(B) 클로로퀸(Chloroquine)
(C) 렘데시비르(Remdesivir)
(D) 로피나비르(Lopinavir)
도 2는 햄스터 폐조직의 육안적 평가방법을 나타낸 것이다.
도 3은 동물실험 결과, 각 그룹의 육안적 폐렴 병변 개선율(%)을 나타낸 것이다.
도 4는 각 그룹별 폐조직의 육안적 분석 및 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 각 그룹별 폐조직의 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 각 그룹별 폐조직의 육안적 분석 및 조직병리학적 분석 결과를 스코어링한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 각 그룹별 폐조직에서 SARS-CoV 바이러스의 N 유전자의 발현변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1. 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 COVID-19 억제 효과
1.1 면역 형광법에 의한 용량반응곡선 분석 방법
384-조직배양 플레이트에 웰당 1.2x104 개의 Vero 세포(ATCC CCL-81)를 접종하였다. 24 시간 후, DMSO에 2배 연속희석한 후, 10 포인트로 준비된 화학식 II의 화합물, 클로로퀸(Chloroquine)(Sigma-Aldrich C6628), 렘데시비르(Remdesivir) (MedChemExpress HY-104077) 및 로피나비르(Lopinavir) (SelleckChem S1380)의 화합물 4종을 50μM을 최고농도로 하여 세포에 처리하였다.
각 화합물 처리 약 1 시간 후, BSL3 시설에서 세포에 0.0125의 감염비(multiplicity of infection, MOI)로 SARS-CoV-2(대한민국 질병관리청 국가병원체자원은행)를 감염시키고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde(PFA))로 세포를 고정한 뒤, permeabilization하였다. 그 후 anti-SARS-CoV-2 Nucleocapsid (N) 1차 항체(Sino Biological Inc.)를 처리하고, 488-conjugated goat anti-rabbit IgG 2차 항체(Molecular Probes)와 Hoechst 33342(Molecular Probes)를 처리하여 세포를 염색하였다. 형광 발현은 대용량 이미지 분석 기기인 Operetta (Perkin Elmer)를 이용하여 이미징하였다.
획득된 이미지는 내부 분석 프로그램인 Image Mining (IM) 소프트웨어를 이용하여 분석되었다. 웰당 총 세포수는 Hoechst로 염색된 핵 수로 산출하였고, 감염된 세포수는 nucleocapsid 단백질을 발현하는 세포수로 산출하였다. 감염도(infection ratio)는 nucleocapsid 단백질을 발현하는 세포수/총 세포수로 계산하였다. 각 웰당 감염도는 동일한 플레이트에서 감염되지 않은 세포(mock)를 포함한 웰들의 평균 감염도를 0%로 하고 화합물이 처리되지 않은 감염세포 (0.5% DMSO group)를 포함한 웰들의 평균 감염도를 100%로 하여 노말라이제이션 되었다.
약물 농도에 따른 반응 곡선과 IC50 값은 XLFit 4 (IDBS) 소프트웨어를 이용하여 Y = Bottom + (Top Bottom)/(1 + (IC50/X) Hillslope) 수식을 활용해 도출하였다.
모든 IC50 값은 두 번의 반복실험으로 측정되었고, 어세이의 신뢰도는 Z'-factor 와 변동계수 백분율 (%CV)의 값으로 검증되었다.
1.2 용량반응곡선(DRC) 분석 결과
화학식 II의 화합물, 클로로퀸(Chloroquine), 렘데시비르(Remdesivir) 및 로피나비르(Lopinavir)의 화합물 4종 각각의 SARS-CoV-2 저해율(Inhibition)을 분석한 결과, 화학식 II의 화합물의 IC50 값은 3.13 μM인 반면, 기존에 SARS-CoV-2에 치료효과를 가질 것이라고 예측되던 화합물들인 클로로퀸(Chloroquine), 렘데시비르(Remdesivir) 및 로피나비르(Lopinavir)의 IC50 값은 각각 11.59, 11.50 및 13.99 μM으로, 본 발명에 따른 화학식 II의 화합물이 낮은 농도에서도 월등히 우수한 치료효과를 나타냄을 확인하였다(표 1 및 도 1 참조).
따라서 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 프로드럭인 화학식 III의 화합물은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19의 치료에 매우 높은 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있다.
Figure pct00006
실시예 2: 햄스터를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대한 화학식 II의 화합물에 의한 치료효과 확인
2-1: 동물실험 방법
8주령의 암컷 햄스터(Golden Syrian hamster, (주) 오리엔트 바이오)를 사용하였으며, 표준작업지침서 및 시험계획서에 따라 동물에 대한 일반적인 복지를 실시하고, 실험동물복지법, Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (by ILAR publication)에 따라 동물 시험을 실시하였으며, 본 실시예의 동물시험은 한국생명공학연구원 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) 심의(승인번호: KRIBB-AEC-20193) 와 IBC (Institutional Biosafety Committee) 심의(승인번호: KRIBB-IBC-20200216)를 통과하였다.
햄스터는 각 군별로 8마리를 사용하여 총 56마리를 사용하였으며, SARS-CoV-2 바이러스(대한민국 질병관리청 국가병원체자원은행) 감염은 비강을 통하여 2.0×105 PFU/mL의 바이러스를 100 μL 투여하였다.
양성대조군으로는 렘데시비르(Remdesivir)(VulcanChem, Cat No. VC1031201, CAS No. 1809249-37-3)를 콘오일(Sigma-Aldrich, Cat No. C8267)로 희석하여 사용하였다.
화학식 II의 화합물(CWP291) 및 렘데시비르의 투여는 3 mL 주사기를 이용하여 복부 우측 하단에 복강투여를 실시하였다. 투여액량은 실험동물의 체중에 따라 10 mL/kg로 계산하였다.
실험에 사용한 화합물의 용량은 50 mg/kg 용량을 고용량군으로 설정하였으며, 공비 2를 두어 중용량 및 저용량을 각각 25mg/kg 및 12.5mg/kg으로 설정하였다. 또한, 시험물질 및 부형제를 투여하지 않는 대조군(NC, normal control)과 생리식염수를 투여하는 부형제대조군(VeC, vehicle control), remdesivir 5 mg/kg를 투여하는 양성대조군(PC, positive control) 및 SARS-CoV-2를 비강접종(2.0×105 PFU/mL) 하여 감염시킨 바이러스감염군(VC, virus control)을 설정하였다. 화합물의 SARS-CoV-2에 대한 항바이러스 효능을 평가하기 위해, SARS-CoV-2를 비강접종한 후 시험물질 화학식 II를 12.5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg으로 접종한 화학식 II-12.5 mpk, 25 mpk, 50 mpk 군을 각각 설정하였다.
햄스터 실험 그룹의 그룹 및 투여용량을 표 2에 나타내었다.
Figure pct00007
실험동물에 대한 SARS-CoV-2의 감염은 비강점적법을 통해 수행하였으며, 비강점적법은 isoflurane 호흡마취 하에서 2.0×105 PFU/mL titer를 갖는 바이러스 희석액 100 μL를 양쪽 비강에 균등하게 점적하여 흡입하도록하는 방법으로 실시하였다. 2.0×105 PFU/mL titer는 시험연구기관에서 실시한 예비시험결과 및 참고문헌고찰을 통해 설정하였다.
SARS-CoV-2가 인체에 감염되는 비말을 통한 호흡기감염과 가장 유사한 감염경로로 알려져있어 비강점적법을 감염방법으로 설정하였다.
양성대조물질인 렘데시비르의 용량은 인체에 적용되는 용량을 기준으로 5mg/kg으로 설정하였다.
1일 2회(작업개시 전 및 작업종료 후) 동물의 사망 및 빈사 상태를 관찰하였다. 단, 동물입수일 및 부검일의 경우 1일 1회(작업개시 전 또는 작업종료 후) 관찰하였다. 사망률, 빈사, 외관 및 행동 변화 등을 포함하는 일반증상을 관찰하고, 날짜와 시간, 지속 정도 등을 기록하였다. 실험은 감염일(PID0)부터 감염 후 4일째(PID4)까지 진행하였으며, isoflurane 흡입을 이용하여 마치 후 부검을 실시하였다. 부검(PID4)되는 모든 동물은 isoflurane 흡입을 통해 마취 후 후대정맥에서 채혈하였으며, 육안적으로 외관상 비정상 유무 및 흉강의 비정상 유무를 관찰하였다.
2-2: 실험동물의 사망률, 일반증상 체중변화
실험결과, 시험과정 중 사망동물은 발생하지 않았으며, 시험기간 동안 모든 시험군에서 시험물질 투여와 관련된 일반증상은 관찰되지 않았다. 시험기간 동안 대조군(NC)과 부형제대조군(VeC)에서는 체중감소가 관찰되지 않았다.
바이러스감염군(VC)에서는 감염 2일차 및 4일차(PID4)에 체중감소가 관찰되었으며, 양성대조군(PC)과 시험물질투여군에서도 바이러스감염군과 유사한 체중감소가 관찰되었다.
2-3: 육안적 폐렴병변 개선율 확인
부검(PID4)되는 모든 동물의 폐는 육안적 평가를 실시하였으며, 육안적 폐병변 개선율로 나타내었다. 육안적 평가 방법은 도 2에 나타내었다.
부검결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군(NC)과 부형제대조군(VeC)에서는 육안적 이상소견은 관찰되지 않았다. 대조군의 육안적 폐렴병변 개선율(%)을 100% 기준으로하여 평가한 결과, 폐렴병 바이러스감염군(VC)에서는 폐 면적의 60-70%에서 충/충혈 및 폐 변연부(margin) 부종소견이 관찰되었으며, 5개의 폐엽에 대한 육안적 폐렴병변 개선율은 1%로 관찰되었다. 양성대조군(PC)의 육안적 폐렴병변 개선율은 24.8%로 관찰되었다. 시험물질투여군의 육안적 폐렴병변 개선율은 12.5mpk투여군, 25mpk투여군, 50 mpk 투여군에서 각각 41.3%, 43.9% 및 48.9%로 관찰되었다
2-4: 조직병리학적 확인
적출한 폐조직은 10% 중성 포르말린에 7일간 고정하였다. 고정한 폐조직은 헤마톡실린과 에오신 염색을 실시하고, 조직병리학적 소견을 관찰하였다.
폐조직 손상에 대한 스코어링 기준을 표 3에 나타내었다.
Figure pct00008
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군(NC)과 부형제대조군(VeC)에서는 폐조직에서의 이상소견은 관찰되지 않았다. 바이러스감염군(VC)에서는 폐조직에서 폐상피세포의 비후화(thickening of epithelial cells)와 염증세포 침윤소견(inflammatory cell infiltration)등 바이러스성 폐렴 소견이 관찰되었다. 양성대조군(PC)에서도 바이러스감염군에서 관찰된 조직병리학적 이상 소견이 관찰되었다. 시험물질투여군의 조직병리학적 소견을 관찰한 결과, 바이러스감염군에서 관찰된 이상 소견의 정도가 낮게 관찰되었다.
각 그룹의 폐조직 손상정도를 평가한 스코어를 도 6에 나타내었다.
2-5: SARS-CoV-2 N(nucleocapsid) 유전자 발현 확인
각 그룹의 햄스터의 적출한 폐조직 중 일부를 용해용액을 넣고 분쇄하여 상충액에서 RNA 추출키트(RNeasy Mini Kit, Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 정량하여 iScript cDNA Synthesis Kit를 이용하여 1 μg cDNA합성하였다. SARS-CoV-2 N 유전자 특이적인 프라이머 (Forward: 5'-TAA TCA GAC AAG GAA CTG ATT A-3'(서열번호 1) // Reverse: 5'-CGA AGG TGT GAC TTC CAT G-3'(서열번호 2))를 사용하여 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)에서 분석하였다.
감염 후 4일째 부검을 통한 폐조직에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time quantitative PCR)법을 이용하여 바이러스감염군(VC)과 시험군간의 N gene에 대한 발현량를 상대적 정량법을 이용하여 비교한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 바이러스감염군(VC)를 1로 나타냈을 때 양성대조군(PC, Remdesivir 5 mpk)은 0.47을 나타낸 반면 시험물질 투여그룹 CWP291-12.5 mpk, CWP291-25 mpk 및 CWP291-50 mpk 그룹에서 각각 0.27, 0.12 및 0.15의 발현량을 나타내어, 시험물질 투여군에서 SARS-CoV 바이러스의 N 유전자의 발현이 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 화학식 I 내지 화학식 VI의 화합물은 SARS-Cov-2를 효율적으로 억제함으로써, 코로나바이러스감염증-19 치료에 탁월한 효과를 거둘 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> JW Pharmaceutical Co. <120> Composition for Treating COVID-19 <130> PP-B2618 <150> KR 10-2020-0070835 <151> 2020-06-11 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 taatcagaca aggaactgat ta 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgaaggtgtg acttccatg 19

Claims (12)

  1. 화학식 I의 구조를 가지는 화합물, 이의 프로드럭, 이의 염, 또는 이의 이성체를 포함하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물:
    [화학식 I]
    Figure pct00009

    상기 화학식 I에서, Ra는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이고, Rb는 아릴기, 치환된 아릴기, 또는 -C(=O)Re이고, Re는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 I에서 Ra는 C1-C6의 알킬기 또는 C2-C6의 알케닐기이고, Rb는 -C(=O)Re이고, Re는 C1-C6의 알킬기인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물.
    [화학식 II]
    Figure pct00010
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 I의 구조를 가지는 화합물의 프로드럭은 화학식 III의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물.
    [화학식 III]
    Figure pct00011

    상기 화학식 III에서, Ra는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이고, Rb는 아릴기, 치환된 아릴기, 또는 -C(=O)Re이고, 이때, Re는 C1-C6의 알킬기, C2-C6의 알케닐기, 또는 C2-C6의 알키닐기이고, Rp는 -PO3H2, -HPO3 -Na+, -PO3 2-Na2 +, -PO3 2-K2 -, -PO3 2-Mg2+, -PO3 2-Ca2+, 구조식 1, 구조식 2, 또는 구조식 3이다.
    Figure pct00012
  5. 제4항에 있어서, 상기 화학식 III의 화합물에 있어, Ra는 C1-C6의 알킬기 또는 C2-C6의 알케닐기이고, Rb는 -C(=O)Re이고, Re는 C1-C6의 알킬기, Rp는 -PO3H2, -HPO3 -Na+ 또는 -PO3 2-Na2인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 화학식 III의 화합물에 있어, Ra는 메틸(methyl)이고, Rb는 -C(=O)CH3, Rp는 -PO3H2, -HPO3 -Na+ 또는 -PO3 2-Na2인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 화학식 III의 화합물은 화학식 IV 내지 화학식 VI에서 선택된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물.
    Figure pct00013
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물.
  9. 제8항에 따른 치료용 조성물을 포함하는 경구 또는 비경구 투여용 약제학적 제형.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비경구 투여는 비내, 비강내, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 투여인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비내 또는 비강내 투여는 스프레이, 에어로솔 또는 흡입(inhalation) 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
  12. 제11항에 있어서, 상기 경구 투여는 캡슐, 펠렛, 정제, 수성 현탁액 또는 용액의 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
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