KR20230024728A - Markers for discriminating Brassica napus varieties and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유채(Brassica napus) 품종, 구체적으로 중모7003(Jungmo7003) 품종을 특이적으로 판별하는 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a marker for specifically discriminating a Brassica napus variety, specifically a Jungmo 7003 (Jungmo7003) variety, and uses thereof.
유채(Brassica napus, 2n=4x=38, AACC)는 B. rapa (2n=2x=20, AA)와 B. oleracea (2n=2x=18, CC)의 교잡에 의해 유래된 이질사배체(alloteotraploid)로, 전세계적으로 중요한 기름 농작물이다. 농업경제학 및 산업에서 이의 중요성 때문에, Multinational Brassica Genome Project (MBGP)에 의해 유채의 게놈이 시퀀싱 되었으며, 게놈의 정보는 웹(http://www.brassica.info/)에서 이용이 가능하다. 이를 시작으로 다수의 유채 유전체 정보가 발표되었으며, 최근 2세대 NGS 기술과 3세대 Nanopore 기술을 활용하여 유채 게놈을 시퀀싱한 정보를 바탕으로 하는 유전체 정보가 공개되었다(https://zenodo.org/record/3524259#.X6pf2YgzaUk). Rapeseed ( Brassica napus , 2n=4x=38, AACC) is an alloteotraploid derived from crossing B. rapa (2n=2x=20, AA) and B. oleracea (2n=2x=18, CC) As such, it is an important oil crop worldwide. Because of its importance in agronomy and industry, the rapeseed genome was sequenced by the Multinational Brassica Genome Project (MBGP), and genome information is available on the web (http://www.brassica.info/). Starting with this, a number of rapeseed genome information was announced, and recently, genome information based on information obtained by sequencing the rapeseed genome using 2nd-generation NGS technology and 3rd-generation Nanopore technology was released (https://zenodo.org/record /3524259#.X6pf2YgzaUk).
그러나, 유채는 부분 타가수분식물(cross-pollinating plant)로써 꽃가루 오염이 있어 왔으며, 이는 새로운 품종 개발 및 이미 개발된 품종의 유전적 순도를 유지하는데 문제가 되어 왔다. However, rapeseed has been contaminated with pollen as a partially cross-pollinating plant, which has been a problem in developing new varieties and maintaining the genetic purity of already developed varieties.
결과적으로, 상업적 규모에서 중모7001, 중모7002, 내한, 탐라, 유려, 영산, 한라, 탐미, 목포134호 등과, 중모7003이 혼용될 수 있는 문제가 있으며, 따라서 각 품종을 명확히 확인하여, 품종 간 혼용되는 문제를 방지할 수 있는 기술 개발이 필요한 실정이다. As a result, on a commercial scale, there is a problem that Jungmo 7001, Jungmo 7002, Naehan, Tamra, Yuryeo, Youngsan, Halla, Tammi, Mokpo No. 134, etc., and Jungmo 7003 can be mixed. It is necessary to develop a technology that can prevent the mixed use problem.
한편, 최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 다양한 DNA 다형성 검출용 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류, 동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 다형성 검출용 마커에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 마커, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 마커, 초위성체(microsatellite) 마커, SSR(simple sequence repeat) 마커 등이 있다. On the other hand, with the recent rapid development of molecular biology, various DNA polymorphism detection markers have been developed that enable the study of bio-diversity of genetic resources at the nucleic acid (DNA) level. Through this, useful trait search, species discrimination, breed classification, identification, and relatedness analysis of group populations can be performed simply and quickly without being affected by the external environment. Polymorphism detection markers developed so far include randomly amplified polymorphic DNAs (RAPD) markers, amplified fragment length polymorphic DNA (AFLP) markers, microsatellite markers, and simple sequence repeat (SSR) markers.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 다양한 유채 품종 중 중모7003 품종을 특이적으로 판별하는 마커를 개발하고, 이를 이용하여 해당 품종을 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors developed a marker that specifically discriminates the Jungmo 7003 variety among various rapeseed varieties, and completed the present invention by confirming that the variety can be accurately distinguished using this.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 3의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 유채(Brassica napus) 중모7003(Jungmo7003) 품종 판별용 마커를 제공하는 것이다.One object of the present invention is composed of any one or more polynucleotides selected from the group consisting of any one or more continuous polynucleotides selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and their complementary polynucleotides, rapeseed ( Brassica napus ) medium hair 7003 (Jungmo7003) to provide a marker for discriminating varieties.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a primer set for identifying rapeseed medium 7003 varieties, including the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for identifying rapeseed medium 7003 varieties, including the primer set of the present invention.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for identifying rapeseed medium 7003 varieties, including the primer set of the present invention.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is (a) performing PCR using the composition of the present invention or the kit of the present invention using DNA isolated from a sample as a template; and (b) analyzing the amplified PCR product obtained in step (a), to provide a method for identifying rapeseed medium 7003 varieties.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.A detailed description of this is as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed herein fall within the scope of the present invention. In addition, it cannot be seen that the scope of the present invention is limited by the specific descriptions described below.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 3의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 유채(Brassica napus) 중모7003(Jungmo7003) 품종 판별용 마커를 제공한다.One aspect of the present invention consists of any one or more consecutive polynucleotides selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and any one or more polynucleotides selected from the group consisting of their complementary polynucleotides, rapeseed ( Brassica napus ) medium hair 7003 (Jungmo7003) Provides a marker for discriminating varieties.
본 발명에서 용어, "유채(Brassica napus, 2n=4x=38, AACC)는 B. rapa (2n=2x=20, AA)와 B. oleracea (2n=2x=18, CC)의 교잡에 의해 유래된 이질사배체(alloteotraploid)"로, 전세계적으로 중요한 기름 농작물을 의미한다.In the present invention, the term, "rapeseed ( Brassica napus , 2n = 4x = 38, AACC) is derived from the hybridization of B. rapa (2n = 2x = 20, AA) and B. oleracea (2n = 2x = 18, CC) “alloteotraploid”, meaning an important oil crop worldwide.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.As used herein, the term "polynucleotide" refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain shape by covalent bonds.
본 발명에서 용어, "마커"란, 유채의 품종을 구별할 수 있는 각 유채의 DNA 상의 특이적 표지를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 마커는 유채 게놈 DNA의 chrA05 내 Indel 서열을 검출 또는 증폭시킬 수 있다.In the present invention, the term "marker" means a specific label on the DNA of each rapeseed that can distinguish the variety of rapeseed. For purposes of the present invention, the marker can detect or amplify an Indel sequence in chrA05 of rapeseed genomic DNA.
본 발명에 있어서, 상기 연속적인 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 연속되는 10 내지 50bp의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 구체적으로 연속되는 10 내지 30bp의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 더욱 구체적으로 서열번호 1의 염기서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.In the present invention, the contiguous polynucleotide is not particularly limited as long as it is any one or more contiguous polynucleotides selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but may specifically be a contiguous polynucleotide of 10 to 50 bp, more specifically It may be a contiguous polynucleotide of 10 to 30 bp, and more specifically, may have, include, consist of, or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or may essentially consist of the above amino acid sequence.
본 발명에 있어서, 상기 상보적인 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 서열번호 3의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드에 상보적인 10 내지 50bp의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 구체적으로 서열번호 3의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드에 상보적인 10 내지 30bp의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 더욱 구체적으로 서열번호 2의 염기서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다.In the present invention, the complementary polynucleotide is not particularly limited as long as it is a polynucleotide complementary to any one or more consecutive polynucleotides selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but specifically any one selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 It may be a polynucleotide of 10 to 50 bp complementary to one or more contiguous polynucleotides, and more specifically, a polynucleotide of 10 to 30 bp complementary to any one or more contiguous polynucleotides selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, , More specifically, it may have, include, consist of, or consist essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 유채 중모7003 품종은 "새얀"으로 상표등록되었다(상표등록번호 제40-1473279호).The rape medium 7003 variety of the present invention has been trademarked as "Sayan" (trademark registration number 40-1473279).
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a primer set for identifying rapeseed medium hair 7003 varieties, including the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3'말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 DNA 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 30bp의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 DNA 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.The term "primer" of the present invention refers to a base sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template, and starting for copying the template strand. A short sequence that functions as a point. In the present invention, the primers used for amplification of the DNA marker are prepared in suitable conditions (eg, four different nucleoside triphosphates and a polymerizing agent such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and a template under an appropriate temperature. -It can be a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for directing DNA synthesis. The appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use, but it may be used in a size of 10 to 30 bp in general. The primer sequence does not have to be completely complementary to the polynucleotide containing the DNA marker or its complementary polynucleotide, and can be used as long as it is sufficiently complementary to hybridize.
또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.In addition, primers can be modified, for example methylation, capping, substitution of nucleotides or modifications between nucleotides, for example uncharged linkages (eg methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc.) or charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머는 상기 DNA 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 구성할 수 있는데, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍이 될 수 있다. 이와 같은 프라이머 쌍은 1회의 PCR을 통해 유채 중모7003 품종을 신속하고 정확하게 구별할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의하여 증폭된, 예컨대, 186bp의 크기의 산물이 검출되는 경우, 상기 시료에 유채 중모7003 품종이 포함된 것으로 판정할 수 있다.In the present invention, the primer set includes primers composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The primers may constitute a primer pair capable of amplifying the DNA marker, and the primer pair may be a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Such a primer pair can quickly and accurately distinguish rapeseed medium 7003 varieties through one-time PCR. Specifically, when a product amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, for example, having a size of 186 bp is detected, it can be determined that the sample contains the rapeseed medium 7003 variety.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 프라이머, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머, 또는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머와 혼용되어 사용될 수 있다.The primers composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. It may be used in combination with a primer containing the nucleotide sequence of No. 2.
상기 프라이머 세트는 유채 게놈 DNA의 chrA05 내 Indel 서열을 검출 또는 증폭시킬 수 있다. 중모7003 품종의 chrA05 내 Indel 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, DNA re-quencing을 통해 해당 염기서열에는 기발표된 유채 표준 유전체 서열과 달리 60bp의 염기서열이 추가로 삽입되어 있음을 확인하였다. The primer set can detect or amplify the Indel sequence in chrA05 of rapeseed genomic DNA. The Indel sequence in chrA05 of the Joongmo 7003 variety may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and unlike the previously published rapeseed standard genome sequence, a 60 bp nucleotide sequence was additionally inserted into the corresponding nucleotide sequence through DNA re-quencing. confirmed that there is
상기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시킨 PCR 산물을 보다 효과적으로 인식하기 위하여, 상기 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 형광물질 등으로 표지할 수 있다. 이때, 사용되는 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NEDTM 등을 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 특이적 프라이머 세트는 증폭된 PCR 산물의 명확한 크기 차이로 인하여, 별다른 형광물질의 표지 없이도 겔 상에서 밴드 사이즈로 이를 명확히 구분할 수 있다.In order to more effectively recognize the PCR product amplified using the primer set, the 5' or 3' end of the primer may be labeled with a fluorescent substance or the like. At this time, the fluorescent material used is not particularly limited thereto, but FAM (6-carboxyfluorescein), HEX (2', 4', 5', 7', -tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NED TM etc. can be used. However, the specific primer set of the present invention can be clearly distinguished by the band size on the gel without any fluorescent labeling due to the clear size difference of the amplified PCR products.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for identifying rapeseed medium 7003 varieties, including the primer set of the present invention.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for identifying rapeseed medium 7003 varieties, including the primer set of the present invention.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.Terms used herein are as described above.
본 발명의 키트는, 이에 제한되는 것은 아니나, PCR 키트, DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있다.The kit of the present invention may be, but is not limited to, a PCR kit or a DNA analysis kit (eg, a DNA chip).
본 발명의 키트는 본 발명의 조성물을 이용하여 유채 게놈 DNA의 chrA05 내 Indel 서열을 포함하는 염기서열을 증폭하여 확인함으로써, 유채 중모7003 품종을 판별 또는 구별하는데 사용될 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.The kit of the present invention can be used to discriminate or distinguish rapeseed middle hair 7003 varieties by amplifying and confirming a nucleotide sequence including an Indel sequence in chrA05 of rapeseed genomic DNA using the composition of the present invention. As a specific example, the kit provided by the present invention may be a kit including essential elements required to perform PCR.
예를 들어, PCR 키트는, 전술한 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 유채 중모7003 품종 판별용 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브, 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 다양한 효소(Taq-폴리머라아제 등), DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 유채 중모7003 품종 판별용 DNA 칩 키트일 수 있다. For example, the PCR kit includes, in addition to the set of primers for identifying the rapeseed medium 7003 variety including the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, a test tube, another suitable container, a reaction buffer (with varying pH and magnesium concentration), Deoxynucleotides (dNTPs), various enzymes (such as Taq-polymerase), DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. As another example, the kit of the present invention may be a DNA chip kit for identifying rapeseed medium 7003 varieties including essential elements necessary for performing DNA chip.
본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.The term "DNA chip" of the present invention refers to one of DNA microarrays capable of identifying hundreds of thousands of DNA bases at once.
상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.In the DNA chip kit, nucleic acid species are attached in a gridded array to a generally flat solid support plate, typically a glass surface no larger than a slide for a microscope, and nucleic acids are regularly arranged on the chip surface to form DNA. It is a tool that enables mass parallel analysis by multiple hybridization reactions between the nucleic acids on the chip and the complementary nucleic acids included in the solution treated on the chip surface.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 제6항의 조성물 또는 제7항의 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is (a) performing PCR using the composition of claim 6 or the kit of claim 7 using DNA isolated from a sample as a template; and (b) analyzing the amplified PCR product obtained in step (a).
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.Terms used herein are as described above.
상기 (a) 단계는 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 제6항의 조성물 또는 제7항의 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 것일 수 있다.Step (a) may be to perform PCR using the composition of claim 6 or the kit of claim 7 using the DNA isolated from the sample as a template.
상기 (a) 단계는 유채 식물 개체로부터 분리된 시료를 이용하여 게놈 DNA를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로, 분리된 조직 또는 분리된 세포일 수 있다.The step (a) may further include obtaining genomic DNA using a sample isolated from a rapeseed plant individual, and the sample is not particularly limited thereto, but, for example, an isolated tissue or an isolated cell can
상기 (a) 단계는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 수행될 수 있다.Step (a) may be performed by polymerase chain reaction (PCR) using a primer set containing the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
상기 (a) 단계의 PCR 수행 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, 주형으로 사용되는 DNA는 각각의 개별 유채 식물로부터 분리된 DNA일 수 있고, 2 이상의 유채 식물을 포함하는 혼합 물질로부터 분리된 DNA일 수도 있다.Any method known to those skilled in the art may be used for the PCR performance step of step (a). Specifically, DNA used as a template may be DNA isolated from each individual rapeseed plant, or may be DNA isolated from a mixture containing two or more rapeseed plants.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 것일 수 있다.Step (b) may be to analyze the amplified PCR product obtained in step (a).
상기 증폭된 PCR 산물의 분석은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, (a) 단계에 의하여 증폭된 DNA 마커의 서열을 결정하여, 목적하는 DNA 마커가 검출되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 구체적인 방법으로서 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있다.Any method known to those skilled in the art may be used to analyze the amplified PCR product. Specifically, by determining the sequence of the DNA marker amplified in step (a), it is possible to confirm whether the target DNA marker is detected. As a specific method, it may be performed through a DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement, or phosphorescence measurement.
예를 들어, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의하여 증폭된 186bp의 크기의 산물이 검출되는 경우, 상기 시료에 유채 중모7003 품종이 포함된 것으로 판정할 수 있다.For example, when a product having a size of 186 bp amplified by PCR using a pair of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is detected, it can be determined that the sample contains the rapeseed medium 7003 variety.
본 발명의 중모7003(Jungmo7003) 품종 판별 마커는 주요 고정종에서뿐만 아니라, 일대잡종 품종을 생산하는 화분친과 웅성불임계통이 포함된 표본에서도 중모7003 품종을 특이적으로 판별할 수 있는 바, 중모7003의 분자적 인증을 위한 검출에 활용될 수 있다.The Jungmo 7003 (Jungmo7003) variety discrimination marker of the present invention can specifically discriminate the Jungmo 7003 variety not only in the main fixed species, but also in specimens containing pollen parents and male infertile lines that produce one-to-one hybrid varieties, Jungmo 7003 It can be used for detection for molecular authentication of
도 1은 본 발명의 마커를 이용하여 유채 주요 고정종 10개 품종 및 계통을 대상으로 검정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 마커를 이용하여 유채 주요 일대잡종(부본, 모본) 품종을 대상으로 검정한 결과이다.1 is a result of testing 10 major fixed species of rapeseed and 10 varieties and strains using the markers of the present invention.
Figure 2 is the result of testing for major hybrid (parent, parent) varieties of rapeseed using the markers of the present invention.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention by way of example, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 유채 품종별 DNA 추출Example 1. DNA extraction by rapeseed variety
유채 주요 고정종 10개 품종(중모7001, 중모7002, 내한, 탐라, 유려, 영산, 한라, 탐미, 중모7003, 목포134호)의 어린 식물체을 분말화하고, 이로부터 제조사의 지침에 따라 MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction kit (Takara, Japan)을 이용하여 각 게놈 DNA를 추출하였다. Young plants of 10 major fixed species of rapeseed (Jungmo 7001, Jungmo 7002, cold resistance, Tamra, Yuryeo, Youngsan, Halla, Tammi, Jungmo 7003, Mokpo No. 134) were powdered, and MiniBEST Plant Genomic Each genomic DNA was extracted using a DNA Extraction kit (Takara, Japan).
상기 중모7003은 보편적으로 노란색 꽃을 갖는 기존 유채 품종과 달리 흰색 꽃을 가지는 유채 품종으로, "새얀"으로 상표등록되었다(상표등록번호 제40-1473279호).The middle hair 7003 is a rapeseed variety having white flowers, unlike conventional rapeseed varieties having yellow flowers, and has been trademarked as "Sayan" (trademark registration number 40-1473279).
실시예 2. Indel 판별을 위한 마커 제작 Example 2. Production of markers for indel discrimination
DNA re-quencing을 통해 중모7003 품종에 특이적인 Indel 염기서열을 확인하였고, 이를 품종 판별 마커로 개발하였다. Indel sequences specific to the Joongmo 7003 cultivar were identified through DNA re-quencing, and this was developed as a cultivar discrimination marker.
구체적으로, 논문(Chromosome-Scale Assembly of Winter oilseed Rape Brassica napus, 2020)에 발표된 유채 유전체(https://zenodo.org/record/3524259#.X6pf2YgzaUk)를 참조 게놈(reference genome)으로 하여 분석한 결과 중모7003 품종은 chrA05에서 참조 게놈(서열번호 4)과 달리 60bp의 염기서열이 추가로 삽입(Indel)되어 있음을 확인하였다(하기 서열번호 3). Specifically, the rapeseed genome (https://zenodo.org/record/3524259#.X6pf2YgzaUk) published in the paper (Chromosome-Scale Assembly of Winter oilseed Rape Brassica napus, 2020) was analyzed as a reference genome. Results Joongmo 7003 variety was confirmed that, unlike the reference genome (SEQ ID NO: 4) in chrA05, a base sequence of 60 bp was additionally inserted (Indel) (SEQ ID NO: 3 below).
- Jungmo7003 : -Jungmo7003 :
ACACCTGCGGATAACAACATCGGGAGATCCATAGATCTCCATGTCACCTGAGATGAAAATAAGAGATTCAGATCTCTCATTTAGATTTCAAAATGATAAAATTAGAAACAAGAGTTACCTTCTGAGTCGATGCAAAGGGACATTTTAACT[TTATAGGACTTTGAAATTTTATCTTTCCAAAAATCTGTTCACTACTTGTACAGTAAAACTTC]TATAGGACTTTGAAATTTTATTAATTTGTAGCGACCATATATTTACATATTCTTATGCACACATTTGATTTAGTTTCTTCATGCCAGCAATCAATGAATCGAAGAACTATTGAAACCCAACACTAGGTGATCAATATCAAACACAAACTT (서열번호 3)ACACCTGCGGATAACAACATCGGGAGATCCATAGATCTCCATGTCACCTGAGATGAAAATAAGAGATTCAGATCTCTCATTTAGATTTCAAAATGATAAAATTAGAAACAAGAGTTACCTTCT GAGTCGATGCAAAGGGACAT TTTAACT [TTATAGGACTTTGAAATTTTATCTTTCCAAAAATCTGTTCACTACTTGTACAGTAAAACTTC] TATAGGACTTTGAAATTTTATTAATTTGTAGCGACCATATATTTACATATTCTTATGCACACATTTGATTTAGTTT CTTCATGCCAGCAATCAATG AATCGAAGAACTATTGAAACCCAACACTAGGTGATCAATATCAAACACAAACTT (서열번호 3)
- Brassica napus(Reference genome): - Brassica napus (Reference genome):
ACACCTGCGGATAACAACATCGGGAGATCCATAGATCTCCATGTCACCTGAGATGAAAATAAGAGATTCAGATCTCTCATTTAGATTTCAAAATGATAAAATTAGAAACAAGAGTTACCTTCTGAGTCGATGCAAAGGGACATTTTAACT[T]TATAGGACTTTGAAATTTTATTAATTTGTAGCGACCATATATTTACATATTCTTATGCACACATTTGATTTAGTTTCTTCATGCCAGCAATCAATGAATCGAAGAACTATTGAAACCCAACACTAGGTGATCAATATCAAACACAAACTT (서열번호 4)ACACCTGCGGATAACAACATCGGGAGATCCATAGATCTCCATGTCACCTGAGATGAAAATAAGAGATTCAGATCTCTCATTTAGATTTCAAAATGATAAAATTAGAAACAAGAGTTACCTTCT GAGTCGATGCAAAGGGACAT TTTAACT [T] TATAGGACTTTGAAATTTTATTAATTTGTAGCGACCATATATTTACATATTCTTATGCACACATTTGATTTAGTTT CTTCATGCCAGCAATCAATG AATCGAAGAACTATTGAAACCCAACACTAGGTGATCAATATCAAACACAAACTT (서열번호 4)
* 밑줄: primer 서열 부분, [진하게 글씨]: Indel 서열 부분* Underline: primer sequence part, [bold text]: Indel sequence part
이에, 해당 서열 앞뒤의 300bp 이내 서열에서 Indel 서열을 포함하도록, primer3(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)를 이용하여 중모7003 특이적 품종 판별 마커로써 하기의 프라이머 쌍을 제작하였다. 유채 참조유전체 서열과 비교하여 중모7003 품종의 서열은 60bp가 삽입되고 있어, PCR 산물이 각각 126bp, 186bp 크기일 것으로 예상되었다.Accordingly, the following primer pairs were used as medium 7003-specific breed discrimination markers using primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) to include the Indel sequence in the sequence within 300 bp before and after the sequence. was produced. Compared to the rapeseed reference genome sequence, the sequence of cultivar Joongmo 7003 had 60 bp inserted, so the PCR products were expected to be 126 bp and 186 bp, respectively.
- Left primer : GAGTCGATGCAAAGGGACAT (서열번호 1)- Left primer: GAGTCGATGCAAAGGGACAT (SEQ ID NO: 1)
- Right primer : CATTGATTGCTGGCATGAAG (서열번호 2)- Right primer: CATTGATTGCTGGCATGAAG (SEQ ID NO: 2)
실시예 3. 마커를 이용한 중모7003 품종 판별Example 3. Jungmo 7003 variety discrimination using markers
3-1. 유채 주요 고정종 품종에서 검정3-1. Test in rapeseed main stationary cultivars
상기 실시예 1에서 추출한 유채 주요 고정종 10개 품종 및 계통의 주형 게놈 DNA 100ng을 실시예 2에서 제작한 프라이머 쌍(각 10 picomol)을 이용하여 하기 표 1의 PCR 조건에서 증폭하였다. 증폭된 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 100V에서 40분 동안 전기영동으로 분리하여 Gel Dec(Bio-Rad, USA)으로 관찰하였다.100 ng of template genomic DNA of 10 major fixed species of rapeseed and strains extracted in Example 1 was amplified under the PCR conditions shown in Table 1 below using the primer pair (each 10 picomol) prepared in Example 2. The amplified products were separated by electrophoresis on a 1.5% agarose gel at 100 V for 40 minutes and observed using Gel Dec (Bio-Rad, USA).
그 결과, 예상한 바와 같이 국내에서 육성한 주요 품종으로, 노란색 꽃을 갖는 중모7001, 중모7002, 내한, 탐라, 유려, 영산, 한라, 탐미 품종뿐만 아니라, 목포134호 계통 모두 PCR 산물은 126bp이었으나, 중모7003의 PCR 산물은 186bp 크기를 나타내었다(도 1). 이에 실시예 2에서 제작한 프라이머 쌍, 즉, 중모7003 특이적 품종 판별 마커를 통해 고정종인 기존 노란색꽃 유채 품종뿐만 아니라 미색 꽃을 가진 목포134호 계통과도 중모7003 품종을 특이적으로 판별할 수 있음을 확인하였다.As a result, as expected, the main varieties cultivated in Korea were Jungmo 7001, Jungmo 7002, cold-resistant, Tamra, Yuryeo, Youngsan, Halla, and Tammi varieties with yellow flowers, as well as Mokpo 134 line. All PCR products were 126 bp. , The PCR product of medium hair 7003 showed a size of 186 bp (Fig. 1). Therefore, through the primer pair prepared in Example 2, that is, the Jungmo 7003 specific variety discrimination marker, not only the existing yellow flower rapeseed variety, which is a fixed species, but also the Mokpo 134 line with off-white flowers, Jungmo 7003 variety can be specifically identified. confirmed that there is
3-2. 유채 주요 일대잡종(부본, 모본) 품종에서 검정3-2. Inspection of rapeseed major monohybrid (parent, parent) varieties
상기 실시예 1의 방법으로 주요 일대잡종 품종을 생산하는 유채 화분친(해안_화분친, 유풍_화분친, 성광_화분친, 아름_화분친, 조망_화분친, 보춘_화분친, 조안_화분친) 및 종자친인 웅성불임계통으로부터 각 게놈 DNA를 추출하고, 중모7003 유래 게놈 DNA와 함께 실시예 2에서 제작한 프라이머 쌍(각 10 picomol)을 이용하여 실시예 3-1의 방법으로 PCR 후 전기영동하였다.Rapeseed pollen parent (Coast_Pollen parent, Yupung_Pollen parent, Seonggwang_Pollen parent, Beautiful_Pollen parent, View_Pollen parent, Bochun_Pollen parent, Joan_ Each genomic DNA was extracted from the pollen parent) and the male infertile line, the seed parent, and PCR was performed by the method of Example 3-1 using the primer pair (each 10 picomol) prepared in Example 2 together with the genomic DNA derived from Jungmo 7003 After electrophoresis was performed.
그 결과, 일대잡종 품종을 생산하는 화분친과 웅성불임계통의 PCR 산물은 126bp, 중모7003의 PCR 산물은 186bp 크기를 나타내어(도 2), 실시예 2에서 제작한 프라이머 쌍, 즉, 중모7003 특이적 품종 판별 마커를 통해 일대잡종 품종을 생산하는 화분친과 웅성불임계통이 포함된 표본에서도 중모7003 품종을 특이적으로 판별할 수 있음을 확인하였다.As a result, the PCR product of the pollen parent and the male infertile line producing the hybrid variety was 126 bp, and the PCR product of the middle hair 7003 was 186 bp (Fig. 2), and the primer pair prepared in Example 2, that is, the middle hair 7003 specific It was confirmed that the Joongmo 7003 variety could be specifically discriminated even in the specimens containing pollen parents and male infertile lines producing monohybrid varieties through red variety discrimination markers.
상기 결과를 통해, 본 발명의 유채 중모7003 품종 판별 마커는 주요 고정종에서뿐만 아니라, 일대잡종 품종을 생산하는 화분친과 웅성불임계통이 포함된 표본에서도 중모7003 품종을 특이적으로 판별할 수 있는 바, 중모7003의 분자적 인증을 위한 검출에 활용될 수 있다.Through the above results, the rapeseed middle hair 7003 variety discrimination marker of the present invention can specifically discriminate the middle hair 7003 variety not only in the main fixed species, but also in samples containing pollen parents and male infertile lines that produce one-to-one hybrid varieties. , can be utilized for detection for molecular authentication of Joongmo 7003.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later and equivalent concepts rather than the detailed description above are included in the scope of the present invention.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Markers for discriminating Brassica napus varieties and uses thereof <130> KPA210473-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Left primer <400> 1 gagtcgatgc aaagggacat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right primer <400> 2 cattgattgc tggcatgaag 20 <210> 3 <211> 362 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Jungmo7003 <400> 3 acacctgcgg ataacaacat cgggagatcc atagatctcc atgtcacctg agatgaaaat 60 aagagattca gatctctcat ttagatttca aaatgataaa attagaaaca agagttacct 120 tctgagtcga tgcaaaggga cattttaact ttataggact ttgaaatttt atctttccaa 180 aaatctgttc actacttgta cagtaaaact tctataggac tttgaaattt tattaatttg 240 tagcgaccat atatttacat attcttatgc acacatttga tttagtttct tcatgccagc 300 aatcaatgaa tcgaagaact attgaaaccc aacactaggt gatcaatatc aaacacaaac 360 tt 362 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Brassica napus (Reference genome) <400> 4 acacctgcgg ataacaacat cgggagatcc atagatctcc atgtcacctg agatgaaaat 60 aagagattca gatctctcat ttagatttca aaatgataaa attagaaaca agagttacct 120 tctgagtcga tgcaaaggga cattttaact tataggactt tgaaatttta ttaatttgta 180 gcgaccatat atttacatat tcttatgcac acatttgatt tagtttcttc atgccagcaa 240 tcaatgaatc gaagaactat tgaaacccaa cactaggtga tcaatatcaa acacaaactt 300 300 <110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Markers for discriminating Brassica napus varieties and uses its <130> KPA210473-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Left primer <400> 1 gagtcgatgc aaagggacat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> right primer <400> 2 cattgattgc tggcatgaag 20 <210> 3 <211> 362 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Jungmo7003 <400> 3 acacctgcgg ataacaacat cgggagatcc atagatctcc atgtcacctg agatgaaaat 60 aagagattca gatctctcat ttagatttca aaatgataaa attagaaaca agagttacct 120 tctgagtcga tgcaaaggga cattttaact ttataggact ttgaaatttt atctttccaa 180 aaatctgttc actacttgta cagtaaaact tctataggac tttgaaattt tattaatttg 240 tagcgaccat atatttacat attcttatgc acacatttga tttagtttct tcatgccagc 300 aatcaatgaa tcgaagaact attgaaaccc aacactaggt gatcaatatc aaacacaaac 360 tt 362 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Brassica napus (Reference genome) <400> 4 acacctgcgg ataacaacat cgggagatcc atagatctcc atgtcacctg agatgaaaat 60 aagagattca gatctctcat ttagatttca aaatgataaa attagaaaca agagttacct 120 tctgagtcga tgcaaaggga cattttaact tataggactt tgaaatttta ttaatttgta 180 gcgaccatat atttacatat tcttatgcac acatttgatt tagtttcttc atgccagcaa 240 tcaatgaatc gaagaactat tgaaacccaa cactaggtga tcaatatcaa acacaaactt 300 300
Claims (9)
Any one or more continuous polynucleotides selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and any one or more polynucleotides selected from the group consisting of complementary polynucleotides thereof.
The marker according to claim 1, wherein the continuous polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
The marker according to claim 1, wherein the complementary polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
Containing the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, a set of primers for determining rapeseed medium 7003 varieties.
The primer set according to claim 4, wherein the primer set is capable of detecting or amplifying an Indel sequence in chrA05 of rapeseed genomic DNA.
A composition for identifying rapeseed medium 7003 varieties, including the primer set of claim 4.
A kit for identifying rapeseed medium 7003 varieties, including the primer set of claim 4.
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 유채 중모7003 품종 판별 방법.
(a) performing PCR using the composition of claim 6 or the kit of claim 7 using DNA isolated from the sample as a template; and
(b) a method for identifying rapeseed medium 7003 varieties, comprising the step of analyzing the amplified PCR product obtained in step (a).
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR101448964B1 (en) | 2012-10-23 | 2014-10-13 | 강원대학교산학협력단 | Novel marker and primer to identify and discriminate cultivars in Brassica napus L. and use thereof |
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2021
- 2021-08-12 KR KR1020210106829A patent/KR20230024728A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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