KR20230021747A - 말초 신경 재생을 촉진하기 위한 cxcl13 결합 분자의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에서는 노화에 따른 신경 재생 저하를 경험하는 대상체에서 말초 신경 손상 후에 감각 뉴런의 축삭 재생 및 뉴런의 기능 회복을 촉진하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 CXCL13에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

말초 신경 재생을 촉진하기 위한 CXCL13 결합 분자의 용도

배경

신경계에 대한 축삭 손상은 고령화 인구가 증가함에 따라 점점 더 많이 발생한다[DeVivo, M.J., and Chen, Y. (2011). Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 92, 332-338; Singh et al., (2014). Clinical Epidemiology 6, 309]. 불행하게도, 축삭 재생 능력 및 복구 과정은 노화에 따라 감소하고, 기능 회복을 저해하고, 장기간의 장애를 증가시킨다[Nagano, A. (1998). Journal of Orthopaedic Science 3, 71-80; Pestronk et al., (1980). Experimental Neurology 70, 65-82; Tanaka and deF. Webster, (1991). Journal of Comparative Neurology 308, 180-187; Vaughan, 1992. Journal of Comparative Neurology, 323, 219-237; Verdu et al., (2000). Journal of the Peripheral Nervous System 5, 191-208].

이러한 노화에 따른 재생 저하의 세포 및 분자 메커니즘에 대한 이해는 매우 부족한 상태이다. 연구에 따르면, 쉬반 세포(SC: Schwann cell)의 탈분화 및 활성화의 연령 관련 장애는 손상된 말초 신경계(PNS)에서 축삭 재성장을 제한하여 감각 및 운동 회복을 손상시키는 것으로 나타났다(Kang and Lichtman, (2013). Journal of Neuroscience 33, 19480-19491; Painter et al., (2014). Neuron 83, 331-343). 중추 신경계에서, 척수 손상 후에, mTOR 신호전달 증가와 함께 포스파타제 및 텐신 상동체(PTEN)의 고갈은 피질척수로의 노화에 따른 축삭 재생 약화를 단지 부분적으로 제한한다(Geoffroy et al., (2016). Cell Reports 15, 238-246). 이러한 연구는 손상 후에 노화에 따른 분자적 변화를 뒷받침하는 일부 분자 메커니즘을 다루었지만, 노화 자체는 항상성에 영향을 미치고 질병에 걸리기 쉬운 모든 조직에서 세포 신호전달, 대사, 면역, 유전자 조절 및 단백질 번역에 대한 중대한 변형을 초래한다[Barzilai et al., (2012). Diabetes 61, 1315-1322; Lardenoije et al., (2015). Progress in Neurobiology 131, 21-64; Pomatto and Davies, (2017). The Journal of Physiology 595, 7275-7309; Taylor and Dillin, (2011). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 3, a004440; Weiskopf et al., (2009). Transplant International 22, 1041-1050].

따라서, 뉴런에서 노화에 따른 조절을 유도하는 인자 및 축삭 재생의 제어에 있어서의 상기 인자의 역할을 결정하여, 말초 신경계 손상의 치료를 위해 상기 인자를 표적으로 하는 치료법이 개발될 수 있도록 할 필요가 존재한다.

분야

본 발명은 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에서 말초 신경 재생을 촉진하기 위한 CXCL13 중화 결합 분자, 예를 들어 항체 및 그의 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이다.

노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에서 말초 신경 재생을 촉진하기 위해 CXCL13 결합 분자를 사용하는 방법이 본원에서 개시된다. 본원에서 예시되는 개시내용의 측면에 따르면, 말초 신경 손상 및 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에게, CXCL13에 특이적으로 결합하고 CXCL13의 효과를 저해, 억제, 방지, 역전 또는 둔화시키는 단리된 결합 분자의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 말초 신경 재생을 개선하는 방법이 제공된다.

CXCL13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 손상된 말초 신경의 신경 재생을 촉진하는 방법이 제공된다. 방법의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13 활성을 억제한다. 방법의 특정 실시양태에서, 억제된 CXCL13 활성은 손상된 말초 신경의 후근 신경절(DRG: dorsal root ganglion)에 대한 CXCR5+ CD8+ T 세포의 동원(recruitment)이다. 방법의 특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 억제한다. 방법의 특정 실시예에서, CXCL13 수용체는 CXCR5이다. 방법의 특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9, MAb 5091, MAb 1758 및 MAb 0745로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 CXCL13에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 상기 언급된 방법 중 어느 하나의 특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9, MAb 5091, MAb 1758 및 MAb 0745로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합한다. 방법의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (A) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 26, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; (B) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 27, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; (C) 각각 서열 번호 19, 22 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 28, 31, 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (D) 각각 서열 번호 20, 23 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 29, 31 및 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL은 (i) 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 7; (ii) 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 9; (iii) 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 11; (iv) 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 13; (v) 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 15; 및 (vi) 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 MAb 5261, MAb 5091, 또는 MAb 1476, MAb 1758이다. 상기 언급된 방법 중 어느 하나의 특정 실시양태에서, 손상된 말초 신경은 좌골 신경, 비골 신경, 척추 부신경 및 상완 신경총으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 손상된 신경을 전체적으로 또는 부분적으로 재생하거나, 표피 조직의 신경재분포(reinnervation)를 유도하거나, 손상된 신경의 신경학적 기능의 완전 또는 부분 회복을 유도하거나, 또는 이들의 조합을 유도한다.

CXCL13에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 노화에 따른 재생 저하 및 말초 신경 손상을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 말초 신경 손상을 치료하는 방법이 제공된다. 방법의 특정 실시양태에서, 말초 신경 손상은 말초 신경의 압박, 신장 또는 절단의 결과이다. 방법의 특정 실시양태에서, 말초 신경 손상은 좌골 신경, 상완 신경총, 비골 신경 또는 척추 부신경의 손상이다. 방법의 특정 실시양태에서, 말초 신경 손상은 좌골 신경 손상이다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 억제한다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 수용체는 CXCR5이다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (A) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 26, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; (B) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 27, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; (C) 각각 서열 번호 19, 22 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 28, 31, 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (D) 각각 서열 번호 20, 23 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 29, 31 및 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL은 (i) 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 7; (ii) 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 9; (iii) 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 11; (iv) 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 13; (v) 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 15; 및 (vi) 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, MAb 5091, MAb 1758, 3D2 및 3C9로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 CXCL13에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 인간 또는 인간화 항체이다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 MAb 5261, MAb 5091, MAb 1476 또는 MAb 1758이다.

CXCL13에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 노화에 따른 재생 저하를 역전시키는 방법이 제공된다. 방법의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 억제한다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 수용체는 CXCR5이다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, MAb 5091, MAb 1748, 3D2 및 3C9로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 CXCL13에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (A) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 26, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; (B) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 27, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; (C) 각각 서열 번호 19, 22 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 28, 31, 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (D) 각각 서열 번호 20, 23 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 29, 31 및 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL은 (i) 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 7; (ii) 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 9; (iii) 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 11; (iv) 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 13; (v) 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 15; 및 (vi) 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 MAb 5261, MAb 5091, MAb 1476 또는 MAb 1758이다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 말초 신경 손상을 갖는다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 말초 손상은 좌골 신경 손상, 상완 신경총 손상, 척추 부신경 손상 또는 비골 신경 손상이다. 상기 언급된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 말초 신경 손상은 좌골 신경 손상이다.

도 1a-e는 노화가 좌골 신경 손상 전후의 후근 신경절(DRG)에서 케모카인/사이토카인의 농축 및 적응 면역을 유도함을 보여준다. 도 1a는 젊은 좌골 신경 손상(SNI: sciatic nerve injury) 마우스, 늙은 SNI 마우스 대 젊은 모의(sham) 마우스로부터의 단백질-단백질 네트워크에서 차등적으로 발현된(DE: differentially expressed) 사이토카인의 변화 배수를 보여주는 히트맵이다. 도 1b는 좌골 신경 압좌 손상(sciatic crush injury) 3일 후 젊은 마우스 및 늙은 마우스의 좌골 신경 종단면의 SCG10 면역염색이다. 도 1c는 젊은 마우스 및 늙은 마우스로부터의 근위 압좌 부위에 대해 정규화된 SCG10 강도를 나타낸다(N=5, 사후 시닥 검정(post-hoc Sidak's test)을 통한 이원 ANOVA. ^**P<0.01; ^****P<0.0001). 도 1d는 젊은 모의 마우스와 비교하여 정규화된 형광 강도의 변화 배수로 표시된 CXCL13 발현의 정량을 보여준다(N=4, 사후 튜키(Tukey) 검정을 사용한 일원 ANOVA. ^****P<0.0001). 도 1e는 좌골 DRG로부터의 CXCL13 ELISA를 보여준다(N=3, 사후 튜키 검정을 사용한 일원 ANOVA. ^****p<0.0001).
도 2a-d는 CXCL13이, 노화된 후근 신경절(DRG)에서 강화되는 CXCR5+ 및 CD8 T 세포에 대한 화학유인물질임을 보여준다. 도 2a: 좌골 DRG에서 카운트 비드로 정규화된 CXCR5+ CD8+ T 세포 수의 정량(N=3, 스튜던트 독립 표본(Student's unpaired) t-검정. ^*P<0.05). 도 2b: 좌골 DRG에서 전체 T 세포 중의 CXCR5+ CD8+ T의 백분율(N=3, 스튜던트 독립 표본 t-검정. ^*P<0.05). 도 2c: 좌골 신경 손상 3일 후 젊은 및 노화된 DRG에서 CXCR5+ CD8+ T 세포 수의 정량(N=4, 스튜던트 독립 표본 t-검정. ^****p<0.0001). 도 2d: 신경 손상 3일 후 CXCR5 및 CD8에 대해 면역염색된 젊은 및 노화된 DRG 절편으로부터의 총 CD8 T 세포 중의 CXCR5+ CD8+ T 세포의 백분율(N=3, 스튜던트 독립 표본 t-검정. ^***P<0.001).
도 3a-c는 CD8 T 세포가 노화된 좌골 신경의 축삭 재생을 방해한다는 것을 보여준다. 도 3a: 대조군 IgG 또는 항-CD8 모노클로날 항체 투여 후에 압좌 손상 3일 후 노화된 마우스의 좌골 신경의 종단면의 SCG10 면역염색. 파선은 근위 압좌 부위를 나타낸다. 축척 막대: 500 μm. 도 3b: 대조군 IgG(N=6) 또는 항-CD8(N=6) 모노클로날 항체로 처리된 노화된 마우스에서 근위 압좌 부위에 대해 정규화된 SCG10 강도(사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^*P<0.05, ^***P<0.001). 도 3c: 대조군 IgG 또는 항-CD8 모노클로날 항체 투여 후에 좌골 신경 손상 3일 후 좌골 DRG 절편에서 CD8 T 세포 수의 정량(N=3, 스튜던트 독립 표본 t-검정이 사용됨. ^****P<0.0001).
도 4a-g는 MHC-1 발현이 노화된 DRG에서 유도되고 좌골 신경 손상 후 마우스의 퇴행성 감소에 필요함을 입증한다. 도 4a: 젊은 또는 노화된 마우스로부터의 좌골 신경 손상 전 또는 손상 3일 후 좌골 DRG에서의 MHC-I 및 Tuj1 공동-면역염색 및 DAPI. MHC-I 정규화된 형광 강도의 변화 배수(N=3, 사후 튜키 검정을 사용한 일원 ANOVA. ^*P<0.05). 도 4b: 젊은 또는 노화된 마우스의 좌골 DRG에서 세포 표면 MHC-I 발현을 나타내는 항원 제시(AP) DRG 뉴런의 백분율(N=3, 사후 튜키 검정을 사용한 일원 ANOVA. ^****P<0.0001). 도 4c: AAV 바이러스 입자에 의해 전달된 루시페라제 리포터를 사용하는 이중 벡터 독시사이클린 유도성 면역 회피 GAr 시스템의 선형 다이어그램. 도 4d: 실험 계획. 도 4e: 노화된 마우스에서 AAV-rtTA 또는 AAV-Gar-rtT 감염 후 및 좌골 신경 손상 3일 후 DRG 절편에서 MHC-1 및 절단된 카스파제3 정규화된 형광 강도의 변화(N=6, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^****P<0.0001). 도 4f: AAV-rtTA 또는 AAV-GAr-rtTA로 감염된 노화된 마우스에서 근위 압좌 부위에 대해 정규화된 SCG10 강도(N=6, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^***P<0.001, ^****P<0.0001). 도 4g: SCG10 강도가 근위 손상 부위에 비해 50% 감소할 때 압좌 부위로부터의 거리로 표시되는 재생 지수(N=5, 스튜던트 독립 표본 t-검정. ^****p<0.01).
도 5a-l은 CXCL13의 중화 효과를 입증한다. 도 5a: 좌골 신경 압좌 후 항-CXCL13 항체의 만성 투여에 의한 감각 기능 평가의 개략적 절차. 도 5b: 젊은 마우스 및 노화된 마우스에서 좌골 신경 손상(SNI) 3일 후 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 모노클로날 항체 투여에 따른 좌골 신경 종단면의 SCG10 면역염색. 파선은 근위 손상 부위를 나타낸다. 축척 막대: 100 μm. 도 5c: IgG 또는 항-CXCL13 모노클로날 항체로 처리된 젊은 또는 노화된 마우스의 근위 압좌 부위에 대해 정규화된 SCG10 강도(N=6, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA). ^*P(BOLD)<0.05, ^**P(BOLDe)<0.01, IgG-Y 대 IgG-O; ^*P(BLACK)<0.05, ^**P(BLACK)<0.01, 항-CXCL13-Y 대 IgG-O, ^*P(GREY)<0.05, 항-CXCL13-0 대 IgG-O). 도 5d: 노화된 마우스에서 좌골 신경 손상 3일 후 DRG로부터의 CXCR5+ B, CD8+ 및 CD4+ T 세포 수의 FACS 정량(N=3, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^**P<0.01, ^***P<0.001, ^****p<0.0001). 도 5e: 일측성 좌골 신경 압좌 후에 폰 프레이 필라멘트(von Frey filament)로 자극한 후, 뒷발의 발 움츠림 반응 역치에 의해 측정된 기계적 민감도(N(IgG-Y)=10, N(항-CXCL13-Y)=10, N(IgG-O)=11, N(항-CXCL13-0)=10; 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^**P<0.01, ^****P<0.0001, IgG-Y 대 IgG-O; $P<0.05, $$$$$P<0.0001, 항-CXCL13-Y 대 IgG-O; ##P<0.01, ####P<0.0001, 항-CXCL13-0 대 IgG-O). 도 5f: 하그리브스(Hargreaves) 검정에 의한 열 민감성 분석은 일측성 좌골 신경 압좌 후 뒷발의 발 움츠림 반응 잠복기를 측정한다(N=10, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^***P<0.001, ^****p<0.0001, IgG-Y 대 IgG-O; $P<0.05, $$$$$P<0.0001, 항-CXCL13-Y 대 IgG-O; ####P<0.0001, 항-CXCL13-0 대 IgG-O). 도 5g: 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체로 처리된 노화된 마우스에서 일측성 좌골 신경 압좌 후 뒷발에 부착된 접착 테이프 터치까지의 잠복기에 의해 측정된 감각 반응(N=10, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^**P<0.01). 도 5h: 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체로 처리된 노화된 마우스에서 일측성 좌골 신경 압좌 후 뒷발에 부착된 접착 테이프 제거까지의 잠복기에 의해 측정된 감각 반응(N=10, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^**P<0.01). 도 5i: 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체로 처리된 노화된 마우스에서 일측성 좌골 신경 압좌 후 뒷발에 부착된 접착 테이프 터치까지의 잠복기에 의해 측정된 감각 반응(N=10, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^**P<0.01). 도 5j: 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체로 처리된 노화된 마우스에서 일측성 좌골 신경 압좌 후 뒷발에 부착된 접착 테이프 제거까지의 잠복기에 의해 측정된 감각 반응(N=10, 사후 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA. ^**P<0.01). 도 5k: DAPI로 역염색된 PGP9.5 면역염색은 좌골 신경 압좌 18일 후 뒷발 지간부(interdigital) 피부의 표피 신경분포(innervation)를 보여준다. 파선은 표피와 진피의 경계를 나타낸다. 축척 막대: 500 μm. 도 5l: IgG 또는 항-CXCL13 항체 투여 후에 지간부 피부의 1 mm당 표피내 신경 섬유(IENF)의 수의 정량(N=6, 사후 튜키 검정을 사용한 일원 ANOVA. ^*P<0.5, ^**P<0.01, ^****P<0.0001).

상세한 설명

I.정의

용어 "a" 또는 "an" 엔티티는 하나 이상의 해당 엔티티를 의미하고, 예를 들어, "항-CXCL13 항체"는 하나 이상의 항-CXCL13 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 교환 가능하게 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 서로의 유무에 관계없이 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각을 특정하여 개시한 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용되는 용어 및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로 "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 다음과 같은 각각의 실시양태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

용어 "신경재생"은 신경 조직, 세포 또는 세포 생성물의 재성장 또는 복구를 의미한다. 이러한 메커니즘에는 새로운 뉴런, 아교세포, 축삭, 미엘린 또는 시냅스의 생성이 포함될 수 있다. 신경 재생은 관련되는 기능적 메커니즘에 따라 말초 신경계(PNS)와 중추 신경계(CNS) 사이에서, 특히 복구 범위 및 속도에서 상이하다. 말초 재생에서 발생하는 과정은 다음과 같은 주요 사건으로 나눌 수 있다: 월러(Wallerian) 변성, 축삭 재생/성장 및 신경재분포. 축삭이 손상되면, 원위 분절이 월러 변성을 겪어 그의 미엘린 수초(myelin sheath)를 잃는다. 근위 분절은 아폽토시스에 의해 사멸하거나 염색질 용해 반응, 즉 신경 세포의 색소친화성(chromophil) 물질(염색질과 같은)의 용해 및 파괴를 겪을 수 있고, 이것은 복구를 시도하는 것이다. 말초 재생에서 발생하는 이벤트는 신경 손상의 축과 관련하여 발생한다. 근위단(proximal stump)은 뉴런 세포체에 여전히 부착되어 있는 손상된 뉴런의 끝을 의미하고, 이것은 재생되는 부분이다. 원위단(distal stump)은 축삭의 끝에 여전히 부착되어 있는 손상된 뉴런의 끝을 의미하고, 이것은 변성될 것이지만 재생하는 축삭이 성장하는 영역에 남아 있는 뉴런의 일부이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말초 신경"은 척수로부터 분기되어 신체의 모든 부분으로 연장되는 여러 신경 중 하나를 지칭한다. 중추신경계와 달리, 말초신경계의 신경재생이 더 흔하다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말초 신경 손상"은 뇌 및 척수(중추 신경계)를 전체 인체에 연결하는 말초 신경계의 43쌍의 운동 및 감각 신경 중 하나 이상의 손상을 의미한다. 말초 신경 손상은 일반적으로 열상(신경 조직의 절단 또는 찢김); 심한 멍(타박상); 주변 조직에 대한 수술 중 손상; 신장(견인); 약물 주사 손상; 및 전기적 손상으로 인해 발생한다. 말초 신경 손상의 증상은 손상된 신경의 유형(운동 신경, 감각 신경 또는 자율 신경)에 따라 다르다. 운동 신경은 걷기, 물건 잡기 또는 말하기에 사용되는 근육과 같이 의식적으로 제어되는 모든 근육의 움직임을 제어한다. 감각 신경은 가벼운 촉감, 온도, 또는 절단에 따른 통증과 같은 정보를 전달한다. 자율 신경은 호흡, 음식 소화, 심장 및 샘 기능과 같이 동물이 의식적으로 제어하지 않는 활동을 조절하기 위해 장기를 조절한다. 말초 신경은 감각, 움직임 및 운동 조정 기능을 제어한다. 말초 신경은 약하고, 쉽게 손상될 수 있다. 일반적인 말초 신경 손상의 비제한적인 예에는 상완 신경총, 좌골 신경, 비골 신경 및 척추 부신경의 손상이 포함된다.

"좌골 신경"이라는 용어는 천골 신경총의 하부에서 시작하여 고관절을 통해 하지 아래로 이어지는 인간 및 다른 척추동물의 주요 말초 신경을 지칭한다. 또한,좌골 신경은 좌골(ischiadic) 신경이라고도 한다. 이것은 인체에서 가장 길고 가장 넓은 단일 신경으로서, 다리의 상단으로부터 후방부의 발까지 이어진다.

용어 "좌골 신경 손상"은 신경에 대한 외상(예를 들어, 압력, 신장 또는 절단)으로 인한 손상을 포함하는 좌골 신경의 손상을 지칭한다. 이러한 유형의 손상은 어느 정도의 근력 손실및 감각 변화를 유발할 수 있다. 또한, 좌골 신경 손상의 원인은 척추 협착증(퇴행성 뼈 장애, 외상, 염증성 질환으로 인한); 척추전방전위증; 척추관의 성장(예를 들어, 농양); 예를 들어 이상근 증후군, 임신, 요추 신경근병증, 다리 외상, 골반 또는 좌골 신경 종양으로 인해 신경을 압박하거나 손상시키는 비척추성 원인; 또는 의학적 검사, 조작 또는 치료로 인해 발생할 수 있는 원인을 포함하지만 이로 제한되지 않는 척수성 또는 비척수성 또는 의원성(iatrogenic)일 수 있다.

"척추 부신경 손상"이란 용어는 뇌에서 기원하는 12개의 뇌신경 중 11번째 신경인 척추부신경에 대한 손상을 지칭한다. 척추 부신경은 다음과 같이 목에 있는 두 세트의 근육이 기능할 수 있도록 한다: 머리를 기울이고 돌릴 수 있도록 하는 흉쇄유돌근, 및 어깨를 으쓱하거나 견갑골을 움직이는 것과 같은 여러 동작을 허용하는 승모근이다. 척추 부신경은 외과의사가 목의 림프절 또는 경정맥을 수술할 때 외상이나 수술 중에 손상될 수 있다. 증상은 어깨 통증, 상방 익상(outward winging) 견갑골, 승모근의 약화 또는 위축이다.

"상완 신경총 손상"이라는 용어는 척수로부터 어깨, 팔 및 손으로 신호를 보내는 신경망인 상완 신경총의 손상을 의미한다. 상완 신경총 손상은 이들 신경이 신장되거나 압축되거나 가장 심각한 경우 척수에서 뜯어지거나 찢어질 때 발생한다. 보다 심각한 손상의 증상에는 손, 팔 또는 어깨의 특정 근육을 사용하지 못하는 쇠약 또는 불능, 어깨 및 손을 포함하는 팔의 움직임 및 감각의 완전한 결여, 심한 통증이 포함될 수 있다. 상완 신경총 손상의 일반적인 원인에는 접촉성 스포츠 부상, 난산, 외상, 종양 및/또는 화학요법이 포함된다.

"비골 신경"이란 용어는 좌골 신경으로부터 분지되어 다리의 앞면 및 옆면, 발등에 감각을 전달하는 총 비골 신경을 지칭한다. 또한, 이 신경은 발목 및 발가락을 위로 들어올리는 다리의 근육을 제어한다. 비골 신경에 대한 손상은 무감각, 저림, 통증, 쇠약 및 족하수(foot drop)라는 보행 문제를 유발할 수 있다. 비골 신경은 슬관절 탈구, 슬관절 또는 다리 골절, 슬관절 또는 고관절 치환술, 다리의 비골 신경 압박, 및 신경초 종양 또는 신경 낭종에 의한 비골 신경 압박을 포함하는 외상 및 신경 압박에 의해 손상될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "후근 신경절"(DRG)은 일차 체감각 뉴런의 세포체를 나타내는 척수 신경의 후근의 팽대를 지칭한다. DRG는 감각 기능을 담당하고, 말초 신경계로부터 중추 신경계(척수, 뇌)로 신경 신호를 전달한다. DRG 자체는 척수 신경 세포를 포함하는 결절이다. 1차 뉴런으로 알려진 감각 뉴런의 세포체는 후근 신경절에 위치한다.

용어 "치료 유효량"은 대상체 또는 포유동물의 병태 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 항체, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 작은 유기 분자, 또는 기타 약물의 양을 의미한다. 좌골 신경 손상과 같은 말초 신경 상해 또는 손상의 경우, 약물의 치료 유효량은 예를 들어, 신경 줄기/전구 세포의 증식, 분화, 이동 및/또는 생존을 증가시킴으로써 신경 재생 저하를 갖는 대상체에서 신경 손상 후 감각 뉴런의 축삭 재생, 표피 신경재분포 및 뉴런의 기능 회복을 촉진하거나; 뉴런 세포의 감소, 지연 또는 중지시키거나; 뉴런 세포 감소를 저해, 예를 들어, 억제, 지연, 방지, 중지 또는 역전시키거나; 뉴런 세포의 수, 밀도 및/또는 농도를 증가시키거나; 뉴런 세포의 형태 또는 기능을 변경하거나; 또는 뉴런 세포 간의 상호작용을 변경하거나; 신경 손상과 관련된 하나 이상의 증상, 예를 들어 통증을 어느 정도 완화하거나; 삶의 질을 향상시킬 수 있거나; 또는 그러한 효과의 조합일 수 있다.

"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하다 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키기 위한"과 같은 용어는 1) 손상된 신경의 진단된 병리학적 상태를 치유, 완화, 증상을 완화, 진행을 역전 및/또는 중지시키는 치료적 조치 및 2) 말초 신경의 재생을 방지 및/또는 늦추는 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 대상체에는 이미 말초 신경 손상이 있는 대상체 및 말초 신경 손상(예를 들어, 좌골 신경 손상)을 경험하기 쉬운 대상체가 포함된다. 유익하거나 요구되는 임상 결과에는 증상 완화, 손상된 신경 조직 범위의 감소, 신경 손상의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 손상 진행의 지연 또는 둔화, 신경 손상의 개선 또는 완화, 및 검출 가능하거나 검출할 수 없는 손상된 신경의 재생(부분적이든 전체적이든)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 치료가 필요한 대상체는 이미 말초 신경 손상이 있거나 말초 신경 손상이 있는 것으로 의심되는 대상체, 및 말초 신경 손상, 예를 들어 좌골 신경통이 생기기 쉬운 대상체, 또는 병태 또는 손상 또는 추가의 손상이 억제되어야 하는 대상체를 포함한다. 특히, 치료가 필요한 대상체에는 노화에 따라 신경 재생 기능의 저하를 경험하는 동물이 포함된다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 치료가 필요한 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소, 곰 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "항-CXCL13 항체의 투여로부터 이익을 얻을 대상체" 및 "치료를 필요로 하는 동물"과 같은 문구는 항-CXCL13 항체 또는 예를 들어 CXCL13 폴리펩타이드 수준의 검출(예를 들어, 진단 절차를 위해)을 위해 사용되는 다른 CXCL13 결합 분자 항체의 투여로부터 및/또는 항-CXCL13 항체 또는 다른 CXCL13 결합 분자를 사용한, 말초 신경에 영향을 미치는 병리학적 상태의 치료, 즉 완화 또는 예방으로부터 이익을 얻을 포유동물 대상체와 같은 대상체를 포함한다. 이러한 대상체는 신경 손상 후 신경학적 회복을 촉진하는 자연 발생적 신경 재생 과정에서 노화에 따른 감소를 경험하는 동물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "노화에 따른 재생 저하" 또는 "노화에 따른 축삭 재생 저하"는 축삭 재생 능력 및 축삭 복구 과정이 노화에 따라 감소하는 노화 과정과 관련된 동물에서 자연적으로 발생하는 상태를 지칭한다. 대상체가 노화에 따른 재생 저하의 영향을 받는지의 여부는 대상체의 연령, 전반적인 건강 상태, 정도의 관찰 및 신경 손상 복구에 필요한 시간 등을 결정함으로써 의료 전문가에 의해 평가될 수 있다. 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체는 대상체의 다른 생리적 또는 유전적 특성에 따른 임의의 연대기적 연령일 수 있다. 임의의 상기 대상체는 말초 신경 손상에 대해 본원에서 설명되는 바와 같은 치료로부터 이익을 얻을 것이다.

본 발명의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서 항원 결정자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 CXCL13(BCA-1이라고도 함)에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 항-CXCL13 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 6개의 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, CDR 중 하나 이상은 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9, MAb 1758, MAb 5091, 또는 MAb 0745로부터 유래된 것이다. 예시적인 항-CXCL13 항체는 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 통합된 미국 특허 제9,963,504호를 참조한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "억제하다"는 예를 들어 결합, 활성, 기능, 상호작용 또는 다른 측정 가능한 특징의 부분적인 또는 완전한 차단을 포함할 수 있다.

본 개시내용은 노화에 따른 신경 재생 저하를 경험하는 대상체, 예를 들어 노인 대상체 또는 의료 제공자에 의해 신경 재생 저하로 진단된 대상체에서 말초 신경의 손상 후에 감각 뉴런의 축삭 재생, 표피 신경분포 및 뉴런의 기능 회복을 촉진하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 대상체에게 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 그의 변이체 또는 유도체를 투여하는 것을 포함한다. 전체 크기의 항체, 예를 들어 자연 발생 항체를 구체적으로 언급하지 않는 한, 용어 "항-CXCL13 항체"는 전체 크기의 항체뿐만 아니라, 상기 항체, 예를 들어 자연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자의 항원 결합 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작된 항체 분자 또는 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 아래에서 및 예를 들어 쿠처라파티(Kucherlapati) 등의 미국 특허 제5,939,598호에 기재된 바와 같이 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 형질전환되고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 적어도 중쇄의 가변 도메인, 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 가변 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 갖는다.

"인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 본원에서 설명되는 항체 분자(예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 상기 설명된 "인간" 또는 "완전한 인간" 항체를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편은 CXCL13 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 인간 항-CXCL13 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입할 수 있으며, 상기 기술에는 아미노산 치환을 초래하는 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 변이체(유도체 포함)는 참조 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3에 비해 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 250개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 코딩한다.

특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 아래에서 추가로 논의되는 보존적 아미노산 치환이다. 대안적으로, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발과 같이 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체는 활성(예를 들어, CXCL13 폴리펩타이드, 예를 들어 인간, 뮤린, 또는 인간과 뮤린 둘 모두의 CXCL13에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. "인간" 또는 "완전한 인간" 항체의 이러한 변이체(또는 그의 유도체)는 또한 "최적화된" 또는 "항원 결합에 대해 최적화된" 인간 또는 완전한 인간 항체로 지칭될 수 있고, 항원에 대한 친화도가 개선된 항체를 포함한다.

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 교환 가능하게 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하고, 일반적으로 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 척추동물 시스템의 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]을 참조한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "면역글로불린"이라는 용어는 생화학적으로 구별될 수 있는 매우 다양한 클래스의 폴리펩타이드를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며, 이들 중 일부 서브클래스(예를 들어, γ1-γ4)가 존재한다. 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로 결정하는 것은 바로 이 사슬의 특성이다. 면역글로불린 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 특성이 잘 밝혀졌고, 특수 기능을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 각각의 클래스 및 이소형의 변형된 버전은 본 개시내용의 관점에서 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 쉽게 식별할 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 포함된다. 모든 면역글로불린 클래스는 분명히 본 개시내용의 범위 내에 있으며, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 관한 것일 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 약 23,000 달톤의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000 달톤의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 사슬은 일반적으로 경쇄가 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 묶는 "Y" 배열의 디설파이드 결합에 의해 연결된다.

경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분이 공유 디설파이드 연결 또는 비공유 연결에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 분기된 말단부에 있는 N-말단으로부터 각각의 사슬의 하단에 있는 C-말단까지 이어진다.

경쇄와 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 나뉜다. "불변" 및 "가변"이라는 용어는 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL 또는 VK) 및 중쇄(VH) 부분 둘 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 이해될 것이다. 이와 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 통상적으로, 불변 영역 도메인의 번호는 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노 말단으로부터 더 멀어짐에 따라 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고, C-말단 부분은 불변 영역이고; CH3 및 CL 도메인은 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단을 실질적으로 포함한다.

위에 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이러한 가변 도메인 내의 상보성 결정 영역(CDR)의 하위세트가 조합되어 3차원 항원 결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 상기 4차 항체 구조는 Y의 각각의 아암의 끝에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 VH 및 VL 사슬 각각에 있는 3개의 CDR에 의해 정의된다. 일부 경우에, 예를 들어 낙타류 종으로부터 유래하거나 낙타류 면역글로불린에 기초하여 조작된 특정 면역글로불린 분자, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄 없이 중쇄만으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]을 참조한다.

천연 발생 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 그의 3차원 배열을 취하면서 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 특이적으로 위치하는 짧은 비연속적인 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 지칭되는 항원 결합 도메인의 나머지 아미노산은 분자간 변동성이 적다. 프레임워크 영역은 주로 β-시트 입체형태를 채택하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬간 비공유 상호작용에 의해 올바른 방향으로 CDR을 위치시키는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 위치하는 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 이 상보적인 표면은 그의 동족 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산은 정확하게 정의되었기 때문에(하기 참조) 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 쉽게 확인될 수 있다.

관련 기술 분야에서 사용 및/또는 허용되는 용어의 정의가 2개 이상 있는 경우, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 명백히 반대되는 언급이 없는 한, 이러한 모든 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비연속적인 항원 조합 부위를 설명하기 위해 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")을 사용하는 것이다. 상기 특정 영역은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"] 및 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재되어 있고, 여기서 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 지칭하는 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 각각의 상기 인용된 참고문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 제시되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어느 잔기가 특정 CDR을 구성하는지 통상적인 방식으로 결정할 수 있다.

표 1의 모든 CDR 정의의 번호 지정은 카바트(Kabat) 등에 의해 제시된 번호 지정 규약에 따른다(아래 참조).

¹표 1의 모든 CDR 정의의 번호 지정은 카바트 등에 의해 제시된 번호 지정 규약에 따른다(아래 참조).

항체 가변 도메인은 또한 예를 들어 CDR을 포함하는 가변 영역 세그먼트를 확인하기 위해 IMGT 정보 시스템(www://imgt.cines.fr/)(IMGT®/V-Quest)을 사용하여 분석될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36:W503-508, 2008] 참조).

카바트 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호 지정 시스템을 정의하였다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 임의의 가변 도메인 서열에 상기 "카바트 번호 지정" 시스템을 명확하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "카바트 번호 지정"은 문헌 [Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"]에 제시된 번호 지정 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용의 항-CXCL13 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호 지정에 대한 언급은 카바트 번호 지정 시스템을 따른다.

본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이성, 인간, 인간화, 영장류화 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프 결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 디설파이드 연결 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본원에서 개시되는 항-CXCL13 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. ScFv 분자는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다. 본 개시내용의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 등), 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용에서 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 추가로, 본 개시내용에서 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH2 도메인의 적어도 일부(예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 결여될 수 있다. 상기 제시된 바와 같이, 이들 도메인(예를 들어, 중쇄 부분)은 자연 발생 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열이 달라지도록 변형될 수 있음을 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다.

본원에서 개시되는 특정 항-CXCL13 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 하나의 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 부분과 동일하다. 대안적으로, 본 개시내용의 중쇄 부분 함유 단량체는 동일하지 않는다. 예를 들어, 각각의 단량체는 예를 들어 이중특이성 항체를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.

본원에서 개시되는 방법에 사용하기 위한 결합 분자의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로는 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 카파 또는 람다 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.

CXCL13은 CXC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 케모카인이다. 이것은 B-1 및 B-2 하위세트 둘 모두에 속하는 B 세포에 대해 선택적으로 주화성이며, 케모카인 수용체 CXCR5와 상호작용함으로써 그 효과를 이끌어낸다(Legler DF, Loetscher M, Roos RS, Clark-Lewis I, Baggiolini M, Moser B (February 1998). J. Exp. Med. 187 (4): 655-60; Ansel KM, Harris RB, Cyster JG (January 2002). Immunity. 16 (1): 67-76). CXCL13 및 그의 수용체 CXCR5는 림프 조직의 소포 내에서 B 세포의 조직화를 제어한다(Ansel KM, Ngo VN, Hyman PL, Luther SA, Foerster R, Sedgwick JD, Browning JL, Lipp M, Cyster JG (July 2000. Nature. 406 (6793): 309-14). CXCL13은 인간의 간, 비장, 림프절 및 내장에서 높게 발현된다(Legler DF, Loetscher M, Roos RS, Clark-Lewis I, Baggiolini M, Moser B (February 1998). J. Exp. Med. 187 (4): 655-60). 본원에서 설명되는 바와 같이, CXCL13은 특정 경우에 CXCR5 발현 T 림프구, 특히 CD8+ T 림프구에 대해 주화성일 수도 있다.

본원에서 개시되는 항-CXCL13 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이들이 특이적으로 인식하거나 결합하는 항원, 예를 들어 본원에서 개시되는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, CXCL13)의 에피토프(들) 또는 일부(들)의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩타이드의 부분은 "에피토프" 또는 "항원 결정자"이다. 표적 폴리펩타이드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 2개의 에피토프를 포함하고, 항원의 크기, 입체형태 및 유형에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 표적 폴리펩타이드 상의 "에피토프"는 비-폴리펩타이드 요소일 수 있거나 이를 포함할 수 있다는 점, 예를 들어 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있음을 주목해야 한다.

항체에 대한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개의 아미노산으로 생각된다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 적어도 7개, 적어도 9개, 또는 적어도 약 15 내지 약 30개의 아미노산을 함유할 수 있다. CDR은 3차 형태의 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 인접할 필요가 없으며, 일부 경우에는 심지어 동일한 펩타이드 사슬에 존재하지도 않는다. 본 개시내용의 항-CXCL13 항체에 의해 인식되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 CXCL13의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 연속적인 또는 비연속적인 아미노산을 함유할 수 있다.

"특이적으로 결합한다"는 것은 일반적으로 항체가 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 임의의 관련되지 않은 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때 해당 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하게 되는 상대적 친화도를 한정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 주어진 에피토프에 대해 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 가질 수 있거나, 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합할 수 있다.

"우선적으로 결합한다"는 용어는 관련되거나, 유사하거나, 동종이거나, 유사한 에피토프에 항체가 결합하는 것보다 더 쉽게 항체가 에피토프에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 그 항체가 관련 에피토프와 교차 반응할 수 있더라도 관련된 에피토프보다 해당 에피토프에 더 많이 결합할 것이다.

비제한적인 예로서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 K_D보다 더 작은 해리 상수(K_D)로 제1 에피토프에 결합하는 경우 항체는 상기 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다. 또 다른 비제한적인 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 K_D보다 적어도 한 자릿수 더 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 항원에 우선적으로 결합한다. 또 다른 비제한적인 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 K_D보다 적어도 두 자릿수 더 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 항원에 우선적으로 결합한다.

또 다른 비제한적인 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 오프율(k(off))보다 작은 k(off)로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다. 또 다른 비제한적인 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 한 자릿수 더 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다. 또 다른 비제한적인 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 두 자릿수 더 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다. 본원에서 개시되는 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 5X10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5X10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1 이하의 오프율(k(off))로 본원에서 개시되는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, CXCL13, 예를 들어, 인간, 뮤린, 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 5X10^-4 sec^-1, 10^-4 sec^-1, 5X 10^-5sec^-1, 또는 10^-5 sec^-1, 5X10^-6 sec-1, 10^-6 sec^-1, 5X10^-7 sec^-1 또는 10^-7 sec^-1 이하의 오프율(k(off))로 본원에서 개시되는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, CXCL13, 예를 들어, 인간, 뮤린, 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합한다고 언급될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 개시되는 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 10³ M^-1 sec^-1, 5 X 10³ M^-1 sec^-1, 10⁴ M^-1 sec^-1 또는 5 X 10⁴ M^-1 sec^-1 이상의 온율(k(on))로 본원에서 개시되는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, CXCL13, 예를 들어, 인간, 뮤린, 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 10⁵ M^-1 sec^-1, 5 X 10⁵ M^-1 sec^-1, 10⁶ M^-1 sec^-1, 또는 5 X 10⁶ M^-1 sec^-1 또는 10⁷ M^-1 sec^-1 이상의 온율(k(on))로 본원에서 개시되는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, CXCL13, 예를 들어, 인간, 뮤린, 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합한다.

에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 항체가 차단하는 정도로 항체가 해당 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 언급된다. 경쟁적 억제는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경쟁 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 억제한다고 언급될 수 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 척도를 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28]을 참조한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합력"이라는 용어는 면역글로불린 집단과 항원 사이의 복합체의 전체적인 안정성, 즉 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적 결합 강도를 의미한다. 예를 들어, 상기 할로우(Harlow) 문헌의 29-34페이지를 참조한다. 결합력은 특정 에피토프를 가진 집단에서 개별 면역글로불린 분자의 친화도와, 및 면역글로불린과 항원의 결합가 둘 모두와 관련이 있다. 예를 들어, 2가 모노클로날 항체와 고도로 반복되는 에피토프 구조체, 예를 들어 중합체 사이의 상호작용은 높은 결합력의 하나일 것이다.

본 개시내용의 항-CXCL13 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 그의 교차 반응성의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "교차 반응성"은 하나의 항원에 특이적인 항체가 두 번째 항원과 반응하는 능력을 의미하며; 두 가지의 상이한 항원 물질 사이의 관련성 척도이다. 따라서, 항체가 그의 형성을 유도한 에피토프 이외의 다른 에피토프에 결합하는 경우에, 항체는 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 상보적인 구조적 특징을 많이 포함하며, 경우에 따라 실제로 본래의 에피토프보다 더 잘 적합할 수 있다.

예를 들어, 특정 항체는 관련되지만 동일하지 않은 에피토프, 예를 들어 참조 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50%의 동일성(관련 기술 분야에 공지되고 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하기 때문에, 상기 항체는 어느 정도의 교차 반응성을 갖는다. 항체가 참조 에피토프에 대해 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성(관련 기술 분야에 공지되고 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하지 않는 경우에, 상기 항체는 교차 반응성을 거의 또는 전혀 갖지 않는다고 언급될 수 있다. 항체는 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르토로그(ortholog) 또는 동족체에 결합하지 않는 경우, 특정 에피토프에 대해 "매우 특이적인" 것으로 간주될 수 있다.

본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 본 개시내용의 폴리펩타이드, 예를 들어, CXCL13, 예를 들어, 인간, 뮤린, 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두의 결합 친화도의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 예시적인 결합 친화도는 5 X 10^-2 M, 10^-2 M, 5 X 10^-3 M, 10^-3 M, 5 X 10^-4 M, 10^-4M, 5 X 10^-5M, 10^-5 M, 5 X 10 ^-6 M, 10^-6M, 5 X 10^-7 M, 10^-7 M, 5 X 10^-8M, 10^-8M, 5 X 10^-9 M, 10^-9 M, 5 X 10^-10 M, 10^-10 M, 5 X 10^-11 M, 10^-11 M, 5 X 10^-12 M, 10^-12 M, 5 X 10^-13 M, 10^-13 M, 5 X 10^-14 M, 10^-14 M, 5 X 10^-15 M, 또는 10^-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 약 5 X 10^-9 M 미만 내지 약 5 X 10^-10 M 미만의 Kd로 인간 CXCL13에 결합하고, 여기서 항체는 MAb 5261이고, Kd는 약 5 X 10^-9 M 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 약 5 X 10^-7 M 미만 내지 약 9 X 10^-9 M 미만의 Kd로 뮤린 CXCL13에 결합하고, 여기서 항체는 MAb 5261이고, Kd는 약 8 X 10^-9 M 이하이다. 예를 들어, 미국 특허 제9,963,504를 참조한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득되거나 유래되고 불변 영역(온전한, 부분적인 또는 본 개시내용에 따라 변형될 수 있는)이 제2 종으로부터 수득되는 것인 임의의 항체를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원(예를 들어, 마우스 또는 영장류)에서 유래할 것이고, 불변 영역은 인간이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 가변 도메인이 특이성이 공지된 항체로부터의 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해, 및 필요한 경우 부분 프레임워크 영역 교체 및 서열 변경에 의해 변경된 항체를 지칭한다. 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 하위클래스의 항체로부터 CDR이 유래될 수 있지만, CDR이 상이한 클래스의 항체, 예를 들어 상이한 종의 항체로부터 유래되는 것이 고려된다. 공지된 특이성의 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 "공여자" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역에 이식된 조작된 항체는 본원에서 "인간화 항체"로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 도메인으로 전달하기 위해 모든 CDR을 공여자 가변 도메인으로부터의 완전한 CDR로 교체할 필요는 없다. 오히려, 단지 표적 결합 부위의 활성을 유지하기 위해 필요한 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있다.

인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두의 가변 도메인 내의 프레임워크 영역은 인간 기원의 잔기만을 포함할 수 있으며, 이 경우 인간화 항체의 상기 프레임워크 영역은 "완전한 인간 프레임워크 영역"으로 지칭되는 것이 추가로 인식된다. 대안적으로, 공여자 가변 도메인의 프레임워크 영역(들)의 하나 이상의 잔기는 필요한 경우 CXCL13 항원에 대한 적절한 결합을 유지하거나 결합을 향상시키기 위해 인간화 동물의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두에서 가변 도메인의 인간 프레임워크 영역(들)의 상응하는 위치 내에서 조작될 수 있다. 이러한 방식으로 조작된 인간 프레임워크 영역은 따라서 인간 및 공여자 프레임워크 잔기의 혼합물을 포함할 것이며, 본원에서 "부분적 인간 프레임워크 영역"으로 지칭된다.

예를 들어, 항-CXCL13 항체의 인간화는 인간 항-CXCL13 항체의 상응하는 서열을 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법에 따라 수행될 수 있다(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). 또한, 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조한다. 생성된 인간화 항-CXCL13 항체는 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 완전한 인간 프레임워크 영역 내에 적어도 하나의 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR을 포함할 것이다. 일부 예에서, 인간화 항-CXCL13 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역 내의 잔기는 상응하는 비인간(예를 들어, 설치류) 잔기로 대체되고(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 제5,693,761호, 제5,693,762호; 및 제6,180,370호 참조), 이 경우 생성된 인간화 항-CXCL13 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인 내에 부분적으로 인간 프레임워크 영역을 포함할 것이다.

또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정밀하게 만들기 위해(예를 들어, 원하는 친화도를 얻기 위해) 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-인간 면역글로불린의 CDR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 자세한 내용은 본 명세서에 참조로 포함된 문헌 [Jones et al., Nature 331:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 항체를 포함할 수 있다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조한다. 또한, 인간화 항체 및 미리 결정된 항원에 대해 개선된 친화도를 갖는 인간화 항체를 생산하는 기술이 개시되어 있는 미국 특허 제6,180,370호 및 국제 공개 제WO 01/27160호를 참조한다.

II. 표적 폴리펩타이드 설명

CXCL13은 버킷(Burkitt) 림프종 수용체 1(BLR-1)을 발현하는 세포로의 칼슘 유입 및 상기 세포의 화학주성을 자극함으로써 B 림프구(및 T 세포의 하위세트)의 이동을 촉진하는 것으로 본원에서 제시된 작은 케모카인이다(도 2a, 2b 및 5d). 따라서, 이것은 B 림프구를 여포로 유도(homing)하는 기능을 할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CXCL13" 및 "CXCL13 폴리펩타이드"는 교환 가능하게 사용된다. 특정 실시양태에서, CXCL13은 전장 CXCL13 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 또는 CXCL13 변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기서 CXCL13 또는 CXCL13 변이체 폴리펩타이드의 단편은 전장 CXCL13의 일부의 또는 모든 기능적 특성을 보유한다. 인간 CXCL13 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열(각각 서열 번호 1 및 2)이 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Legler, et al., J. Exp. Med. 187(4):655-660 (1998)]을 참조한다. 마우스 CXCL13 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열(각각 서열 번호 3 및 4)이 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gunn, et al., Nature 391(6669):799-803 (1998)]을 참조한다. 또한, 사이노몰거스 원숭이 CXCL13 폴리펩타이드 서열은 서열 번호 5에 제시된 바와 같이 기재되어 있다.

III. 축삭 재생

젊은 포유동물에서, 축삭은 말초 신경 손상 후에 쉽게 재생된다. 세포체에서 분리된 축삭의 원위 부분은 월러 변성을 겪는다. 이 활성 과정은 축삭의 단편화 및 붕괴를 초래한다. 파편은 아교 세포, 예를 들어 쉬반 세포 및 대식세포에 의해 제거된다. 이후에, 근위 축삭이 재생하고, 그의 표적을 신경재분포화하여 기능을 회복시킬 수 있다. 그러나, 축삭 복구 과정 및 축삭 재생 능력은 노화 과정에 따라 감소한다. 노화는 말초 신경계(PNS)의 여러 형태학적 및 기능적 특징에 깊은 영향을 미친다. 손상 후, 월러 변성은 노화된 동물에서 지연되며, 대식세포에 축적된 미엘린 잔해가 젊은 동물보다 더 많다. 쉬반 세포와 재생 축삭 사이의 상호작용은 더 오래 걸리고, 반응성 쉬반 세포와 표적 기관에 의해 분비되는 영양성 및 자극성 인자의 양은 젊은 젊은 대상체보다 노화된 대상체에서 더 적다. 노화된 동물에서는 축삭 재생 속도가 느려지고, 재생 축삭의 밀도가 감소한다. 노화는 또한 재생된 섬유의 말단 및 측부 발아(sprouting)의 감소를 결정하여, 표적 신경재분포 및 기능적 회복 능력을 더욱 제한한다. 이러한 연령 관련 변화는 연령에 따라 선형적으로 진행되지 않고, 축삭 재생 및 신경재분포 능력은 평생 동안 유지되지만, 노화에 따라 지연되고 덜 효과적인 경향이 있다(E Verdu,　et al., J Peripher. Nerv Syst. 2000 Dec; 5(4):191-208; Fenrich K. et al, Can J Neurol Sci. 2004 May; 31(2):142-56). 이러한 관찰은 노화가 손상 특이적 세포 신호와 결합될 때 뉴런을 재생 실패로 유도하는 독특한 분자 및 세포 메커니즘의 발달로 이어진다는 것을 시사한다.

이 가설을 검증하기 위해, 본 발명자들은 좌골 후근 신경절(DRG)에서 RNAseq 실험을 수행하였고, 이것은 좌골 신경 손상 전후 모두에서 면역 및 사이토카인/케모카인 신호전달 경로의 노화에 따른 강화를 보여주었다. 주요 연령 관련 분자 특징은 T 세포 활성화 및 신호전달의 증가로 나타난다. 메커니즘에 의해, 림프독소를 포함하는 염증성 사이토카인의 노화에 따른 증가는 DRG에서 NFκB(활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서)를 활성화하여 케모카인 CXCL13을 상향조절하고, 이것은 다시 MHC-I를 발현함으로써 항원 제시 세포(APC)로서 작용하는 뉴런 근처에서 CXCR5+ CD8+ T 세포를 동원하는 것으로 밝혀졌다. 활성화된 CD8+ T 세포는 다시 pAKT 및 pS6에서 카스파제 3 의존적 감소를 통해 재생 신호를 억제함으로써 감각 DRG 뉴런의 축삭 재생을 억제한다. 놀랍게도, 생체 내에서 항체 매개된 특정 CD8+ T 세포 고갈 또는 CXCL13 중화는 감각 뉴런의 축삭 재생을 젊은 대상체의 수준 이상으로 회복시켜 기능 회복을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 노인 대상체에서 축삭 재생 능력을 제한하는 독특한 메커니즘이 있음을 나타내며, 신경-면역 세포 통신의 항체 매개 조작이 노인 대상체에서 관찰되는 재생 저하에 대응하고 말초 신경의 손상, 예를 들어 좌골 신경 손상 후의 복구를 촉진하기 위해 임상적으로 사용될 수 있음을 보여준다.

IV. 항-CXCL13 항체

CXCL13에 결합하는 항체는 관련 기술 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제9,963,504호를 참조한다. 또한, CXCL13에 결합하는 상업적 항체, 예를 들어 래트 항-마우스 MAb 470(R&D Systems) 및 마우스 항-인간 MAb 801(R&D Systems)도 관련 기술 분야에 개시되어 있다. 다른 항-CXCL13 결합 분자는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제US2008/0227704호 및 제US2008/0199481호, 및 PCT 공개 제WO2020057540A1호에 개시되어 있다.

본 개시내용의 항체는 CXCL13에 결합하는 항-CXCL13 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체, 예를 들어 MAb 5261(인간), MAb 5378(뮤린 불변 영역을 갖는 Mab 5261의 VH 및 VL), MAb 5080(Mab 5261의 인간화 모 항체), MAb 1476(인간 불변 영역을 갖는 3D2의 VH 및 VL을 갖는 키메라 항체), 3D2(5261 및 5080의 모 뮤린 모노클로날 항체), MAb 5091(인간), 3C9(뮤린 모노클로날 항체), MAb 1758(인간화 3C9) 또는 MAb 0745(3C9 하이브리도마)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-CXCL13 항체는 인간, 영장류, 뮤린, 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 항체는 인간화된다. 다른 실시양태에서, 항-CXCL13 항체는 그의 수용체, 예를 들어 CXCR5에 대한 CXCL13 결합을 차단한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 항체는 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9, MAb 1758, MAb 0745, MAb 5091 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.

본 개시내용은 일반적으로 연령에 따른 신경 재생 저하를 경험하는 대상체에서 말초 신경 손상 후 감각 뉴런의 축삭 재생, 표피 신경재분포 및 상기 뉴런의 기능 회복을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체에게 CXCL13에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 CXCL13과 그의 수용체 CXCR5와의 상호작용을 차단한다. 이러한 특성을 갖는 항체는 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 항체는 US 9,963,504에 자세히 기재되어 있고 본원에 참고로 포함된 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, MAb 3D2, MAb 3C9, MAb 0745, MAb 5091, 또는 MAb 1758을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 항-CXCL13 항체는 인간, 또는 뮤린, 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두에 결합한다. 또한, 상기 언급된 임의의 항체 및/또는상기 언급된 임의의 항체를 경쟁적으로 억제하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체도 유용하다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 분자는 MAb 5261 및 MAb 5378과 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합한다. MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, MAb 3D2, MAb 3C9, MAb 745, MAb 5091, 및 MAb 1758 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 아미노산 서열은 하기 표 2에 제시되어 있다. 상보성 결정 영역(CDR)에는 밑줄이 그어져 있다. 또한, CDR 서열은 하기 표 3에 제시되어 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 참조 항체, 예를 들어 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, MAb 5091, MAb 1758, 3D2, 또는 3C9와 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 CXCL13에 특이적으로 결합하고 참조 항체, 예를 들어 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, MAb 5091, MAb 1758, 3D2, 또는 3C9가 CXCL13, 예를 들어 인간, 영장류, 뮤린 또는 인간과 뮤린 CXCL13 둘 모두에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 단리된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 참조 항-CXCL13 항체 분자에 대한 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 결합 분자는 참조 항체에 대해 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100%의 서열 동일성을 공유한다. 특정 실시양태에서, 참조 항체는 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, MAb 5091, MAb 1758, 3D2 또는 3C9이다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인은 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 서열 번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25와 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 코딩되는 VH 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체는 CXCL13에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 7, 9, 11, 13, 15, 또는 17의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인은 서열 번호 7, 9, 11, 13, 15, 또는 17에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일한 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 서열 번호 7, 9, 11, 13, 15, 또는 17의 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 서열 번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34와 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 7, 9, 11, 13, 15, 또는 17에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 코딩되는 VL 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체는 CXCL13에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.

본 개시내용의 항-CXCL13 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체가 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 변이체는 모 항-CXCL13 항체의 원하는 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체를 만드는 방법은 일반적으로 관련 기술 분야에서 이용 가능하다.

V. 치료적 항-CXCL13 항체를 사용한 치료 방법

림프계 케모카인 CXCL13은 여포 수지상 세포(FDC) 및 대식세포에 의해 발현된다. CXCL13은 다양한 면역 세포(예를 들어, B 세포, 여포 헬퍼 T 세포 및 최근 활성화된 T 세포)에서 발견되는 그의 수용체인 CXCR5를 통해, 면역계 항상성 유지, 림프 기관 형성, 림프구 수송 및 화학주성 이동뿐만 아니라, 2차 림프 조직(예를 들어, 배 중심)의 발달에 필요한 세포 내 변화를 유도한다. CXCL13 및 그의 수용체 CXCR5의 과다발현은 다양한 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증(예를 들어, 문헌 [Corcione et al., PNAS 101(30):11064-11069 (2004); Serafini et al., Brain Pathol. 14:164-174 (2004); Magliozzi et al., Brain 130: 1089-1104 (2007)] 참조), 관절염(예를 들어, 류마티스 관절염(예를 들어, 문헌 [Rioja et al., Arthritis & Rheumatism 58(8):2257-2267 (2008); Shi et al., J. Immuno. 166:650-655 (2001); Schmutz et al., Arthritis Restearch and Therapy 7:R217-R229 (2005); Hjelmstrom et al., J. Leukocyte Bio. 69:331-339 (2001)] 참조), 만성 위염(예를 들어, 문헌 [Hjelmstrom et al.; Mazzucchelli et al., Brain 130:1089-1104 (2007)] 참조), 위 림프종(예를 들어, 하기 문헌; 문헌 [Nobutani et al., FEMS Immunol Med Microbiol 60:156-164 (2010)] 참조), 이식 거부(예를 들어, 문헌 [Steinmetz et al., Kidney International 67:1616-1621 (2005)] 참조), 쇼그렌(Sjogren) 증후군(SS)(예를 들어, 문헌 [Barone et al., J. Immuno. 180:5130-5140 (2008); Hjelmstrom et al.] 참조), 전신 홍반성 루푸스(SLE)(예를 들어, 문헌 [Steinmetz et al., Lee et al., J. Rheum. 37(1):45-52 (2010); Schiffer et al., J. Immun. 171:489-497 (2003)] 참조), C형 간염 바이러스 감염에서의 활성 한랭글로불린혈증(MC) 혈관염(예를 들어, 문헌 [Sansonno et al., Blood 112(5):1620-1627 (2008)] 참조), 연소성 피부근육염(예를 들어, 문헌 [de Padilla et al., Arthritis & Rheumatism 60(4):1160-1172 (2009)] 참조), 및 중증 근무력증(예를 들어, 문헌 [Matsumoto et al., J. Immuno. 176:5100-5107 (2006); Meraouna et al., Blood 108(2):432-440 (2006); Saito et al., J. Neuroimmunol 170:172-178 (2005)] 참조) 및 특정 암(예를 들어, 버킷 림프종(예를 들어, 문헌 [Forster et al., Blood 84:830-840 (1994); Forster et al., Cell 87:1037-1047 (1996)] 참조), 비-호지킨(Hodgkin) 림프종(예를 들어, 문헌 [Trentin et al., Ann. Rev. Immunol. 6:251-81 (1988); Gong et al., J. Immunol. 174: 817-826 (2005); Hamaguchi et al., J. Immunol. 174:4389-4399 (2005)] 참조), 암종(예를 들어, 결장 및 췌장 암종)(예를 들어, 문헌 [Gunther et al., Int. J. Cancer 116:726-733 (2005); Meijer et al., Cancer Res. 66: 9576-9582 (2006)] 참조), 유방암(예를 들어, 문헌 [Panse et al., British Journal of Cancer 99:930-938 (2008)] 참조), 만성 림프성 백혈병(CLL)(예를 들어, 문헌 [Burkle et al., Blood 110:3316-3325 (2007)] 참조), 및 전립선암(예를 들어, 문헌 [Singh et al., Cancer Letters 283 (1):29-35 (2009)] 참조)에 관련된다.

지금까지, CXCL13의 뉴런 발현은 T 세포 신호전달 경로의 노화에 따른 강화와 관련이 있는 것으로 알려져 있지 않았다. 본 개시내용은 염증성 사이토카인 림포톡신이 NFκB를 활성화하여 CXCL13의 신경 발현을 유도하고, 이는 다시 MHC-1을 발현하는 DRG 뉴런 부근에서 CXCR5⁺ CD8⁺ T 세포를 동원함을 입증한다. CD8+ T 세포는 본원에서 카스파제 3 활성화를 통해 재생 신호 pAKT 및 pS6을 억제함으로써 감각 DRG 뉴런의 축삭 재생을 억제하는 것으로 나타났다. 항-CXCL13 결합 분자를 사용한 중화는 DRG로의 CXCR5⁺ CD8⁺ T 세포 동원을 억제하여, 노화에 따른 재생 저하를 역전시키고, 좌골 신경 손상과 같은 말초 신경 손상 후 신경생물학적 회복을 촉진하는 것으로 본원에서 밝혀졌다.

본 개시내용의 특정 방법은 좌골 신경 손상과 같은 말초 신경 손상 후 노화에 따른 축삭 재생 저하를 갖는 대상체에서 말초 신경 재생을 촉진하기 위한, 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 그의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체를 포함하는 항체의 용도에 관한 것이다.

하기 논의는 본 개시내용의 항-CXCL13 항체를 사용하여 축삭 재생을 촉진하기 위한 말초 신경의 치료 및 진단 방법을 언급하지만, 본원에서 설명되는 방법은 또한 본 개시내용의 항-CXCL13 항체의 원하는 특성을 보유하는 항체, 예를 들어 CXCL13, 예를 들어 인간, 영장류 또는 마우스, 또는 인간 및 마우스 CXCL13에 특이적으로 결합할 수 있고 CXCL13 중화 활성을 갖는, 예를 들어 CXCL13의 CXCR5에 대한 결합을 차단하는, 상기 항-CXCL13 항체의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체에도 적용가능하다.

한 실시양태에서, 치료는 환자에게 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 적용 또는 투여하거나, 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에게 항-CXCL13 결합 분자를 적용 또는 투여하는 것을 포함하고, 여기서 환자는 노화에 따른 축삭 재생 저하가 있거나 있는 것으로 의심되고, 말초 신경 손상, 상해, 또는 좌골 신경 손상과 같은 말초 신경 손상에 대한 소인이 있거나 있는 것으로 의심되는 환자이다. 또 다른 실시양태에서, 치료는 또한 환자에게 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 적용 또는 투여하거나, 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에게 항-CXCL13 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 환자는 노화에 따른 축삭 재생 저하가 있거나 있는 것으로 의심되고, 말초 신경 손상, 또는 좌골 신경 손상과 같은 말초 신경 손상에 대한 소인이 있거나 있는 것으로 의심되는 환자이다.

본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 결합 단편은 축삭 재생을 필요로 하는 말초 신경 손상 또는 병태의 치료에 유용하다. 예를 들어, 적어도 하나의 항-CXCL13 항체를 사용한 요법은 노화에 따른 축삭 재생 저하를 갖는 환자의 축삭 재생과 관련하여 유익한 생리학적 반응을 유발한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 의약으로서 또는 의약의 제조를 위해 사용하기 위한, 특히 좌골 신경 손상과 같은 말초 신경 손상의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 결합 단편에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9는 말초 신경 손상 및 노화에 따른 축삭 재생 저하를 갖는 환자에서 축삭 재생을 촉진하기 위해 사용된다.

말초 신경 손상 후 축삭 재생의 촉진을 위한 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 결합 단편의 유효성은 동물 모델을 사용하여 나타낼 수 있다. 예를 들어, 말초 신경 손상의 치료를 위한 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유효성은 좌골 신경 손상에 대한 동물 모델, 예를 들어 아래에서 설명되는 바와 같이 좌골 신경 "압좌"에 적용되고 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자로 치료된 마우스를 사용하여 나타낼 수 있다. 상완 신경총 손상, 척추 부신경 손상 및 비골 신경 손상과 같은 다른 말초 신경 손상에 대한 동물 모델도 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.

본 개시내용의 방법에 따르면, 적어도 하나의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 말초 신경 손상 또는 상해에 대한 긍정적인 치료 반응을 촉진하기 위해 사용된다. 말초 신경 손상에 대한 "긍정적인 치료 반응"은 신경 재생과 관련된 손상된 조직의 개선 및/또는 손상과 관련된 증상의 개선을 의도한다. 즉, 재생 효과, 노화에 따른 재생 저하의 역전, 표피 신경재분포, 손상된 신경의 신경 기능 회복, 및/또는 신경 손상과 관련된 하나 이상의 증상, 예를 들어 관련 통증, 근육 약화, 따끔거림, 감각 상실 등의 감소를 관찰할 수 있다. 따라서, 예를 들어 손상된 조직의 개선은 완전한 반응으로 특징지어질 수 있다. "완전한 반응"은 신경학적 기능의 회복 및 임의의 관련 통증, 따끔거림 또는 손상의 다른 부작용의 부재를 의도한다. 또는, 손상의 개선은 부분 반응으로 분류할 수 있다. "부분 반응"은 관련된 통증의 감소, 일부 표피 신경분포 및 신경 재생, 근력 개선 및 신경 기능의 적어도 부분적 회복을 의미한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 좌골 신경 손상 또는 상해를 치료하기 위해 사용된다. 좌골 신경은 다리 뒤쪽에 위치하며, 허벅지, 종아리 및 발바닥에 감각을 제공한다. 좌골 신경은 무릎 및 종아리의 근육에 연결되어 감각을 제공하기 때문에, 신경에 대한 극심한 손상은 무릎 약화, 무릎 굽힘 어려움, 발 굽힘 어려움 및/또는 발 움직임 약화를 유발할 수 있다. 또한, 상기 손상은 반사에 문제를 일으킬 수 있으며, 무릎 또는 다리를 만졌을 때 제대로 반응하지 않을 수 있다. 환자는 좌골 신경 손상의 결과로 극심한 통증 또는 따끔거림을 경험할 수 있다.

좌골 신경 손상은 손상(예를 들어, 골반 골절 또는 기타 골반 손상); 추간판 탈출증; 퇴행성 추간판 질환; 척추관 협착증; 또는 종양을 포함하는 많은 인자에 의해 유발될 수 있다. 좌골 신경이 손상되면, 환자는 한쪽 또는 양쪽 다리에 통증, 따끔거림 또는 화끈거림을 경험할 수 있다. 통증은 한쪽 다리 또는 한쪽 다리, 엉덩이, 종아리의 한 측면 또는 발바닥에 국한되거나, 양쪽 다리에 통증이 존재할 수 있다. 좌골 신경의 손상이 심할 경우, 환자는 다리를 움직이지 못할 수 있다. 신경이 손상되면, 통증이 천천히 시작되어 점차 악화될 수 있다.

"좌골 신경통"은 좌골 신경이 손상되었을 때 발생하는 증상을 지칭하기 위해 사용되는 용어이다. 이것은 별도의 의학적 상태는 아니지만, 좌골 신경에 손상을 입은 환자가 한쪽 또는 양쪽 다리에서 경험하는 무감각, 통증, 따끔거림 또는 약화에 대한 일반적인 용어이다.

본 개시내용의 항-CXCL13 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 MAb 5261 또는 Mab 5378을 사용한 CXCL13의 중화는 몇 가지 상이한 메카니즘, 예를 들어 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 차단하거나 좌골 신경의 DRG 내로의 CXCR5+ CD8+ T 세포의 유도를 차단함으로써 좌골 신경통의 중증도를 감소시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에서 척추 부신경에 대한 물리적 손상을 치료하기 위해 사용된다. 척추 부신경에 대한 손상은 어깨에 둔하고 쑤시는 통증, 움직일 때 통증의 증가, 삼각근 부위의 무감각, 영향을 받은 팔을 움직이기 어려움, 장기간 손상시 삼각근의 쇠약, 및 영향을 받은 어깨의 쇠약을 유발할 수 있다.

본 개시내용의 항-CXCL13 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 MAb 5378 또는 MAb 5261을 사용한 CXCL13의 중화는 본원에서 설명되는 하나 이상의 메카니즘을 통해, 예를 들어 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 차단하거나 또는 척추 부신경의 DRG 내로의 CXCR5+ CD8+ T 세포의 유도를 차단함으로써 척추 부신경 손상의 중증도를 감소시키거나 손상된 신경 조직을 재생시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 본원에서 설명되는 하나 이상의 메카니즘을 통해, 예를 들어 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 차단하거나 또는 상완 신경총 신경망의 DRG 내로의 CXCR5+ CD8+ T 세포의 유도를 차단함으로써 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에서 상완 신경총 손상을 치료하기 위해, 예를 들어 상완 신경총의 손상된 신경 조직을 재생하기 위해 사용된다. 상완 신경총 신경은 5번째, 6번째, 7번째 및 8번째 경추부(C5-C8) 및 1번째 흉추부(T1) 척수 신경에서 기원하고, 가슴, 어깨, 팔 및 손의 근육 및 피부에 신경을 분포시킨다. 상완 신경총 손상은 사지의 가장 심각한 신경 손상이다. 신경 손상 부위에 따라, 상완 신경총 손상은 팔의 일부 또는 전체에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 근피부 신경 손상은 팔꿈치 굴근을 약화시키고, 정중 신경 손상은 근위 팔뚝 통증을 유발하며, 척골 신경 마비는 약한 악력 및 손가락 저림을 유발한다(Lorei, Matthew P.; Hershman, Elliott B. (1993). "Peripheral Nerve Injuries in Athletes". Sports Medicine. 16 (2): 130-47). 경우에 따라, 이러한 손상은 사지의 사용을 제한하고, 통증을 유발한다. 손상은 종종 팔의 쇠약, 반사 감소 및 이에 상응하는 감각 결손을 유발한다.

본 개시내용의 항-CXCL13 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 MAb 5378 또는 MAb 5261을 사용한 CXCL13의 중화는 여러 개의 상이한 메카니즘을 통해, 예를 들어 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 차단하거나 또는 상완 신경총 신경의 DRG 내로의 CXCR5+ CD8+ T 세포의 유도를 차단함으로써 상완 신경총 신경 손상을 가진 대상체에서 재생 저하를 역전시킬 수 있고, 이에 의해 손상된 신경 조직을 재생하거나, 관련 통증 및 근육 약화의 중증도를 감소시키거나 제거할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 본원에서 설명되는 하나 이상의 메카니즘을 통해, 예를 들어 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 차단하거나 또는 비골 신경의 DRG 내로의 CXCR5+ CD8+ T 세포의 유도를 차단함으로써 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에서 비골 신경 손상을 치료하기 위해, 예를 들어 비골 신경의 손상된 신경 손상을 재생하기 위해 사용된다. 비골 신경병증으로도 알려진 비골 신경 손상은 다리 앞쪽 또는 옆쪽의 무감각 또는 따끔거림, 손상 부위 및 주변 부위에 대한 민감도 감소, 발을 위쪽으로 들어 올리고 바깥쪽으로 돌리는 동작시의 쇠약, 걸을 때 바닥에 닿지 않을 만큼 발을 들어 올리지 못함(족하수)을 유발하거나, 계상 보행(slapping gait)을 유발할 수 있다.

본원에서 설명되는 치료에 대한 임상 반응은 스크리닝 기술, 예를 들어 자기 공명 영상(MRI) 스캔, MRI 신경조영술, 전기진단 검사, x-방사선 영상화, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 유세포 분석 또는 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 분석, 조직학, 육안 병리학 및 혈액 화학(ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 검출가능한 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 긍정적인 치료 반응에 더하여, 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용한 요법을 받고 있는 대상체는 손상과 관련된 증상의 개선이라는 유익한 효과를 경험할 수 있다.

본 개시내용의 추가의 실시양태는 예를 들어 대상체가 본원에서 설명되는 치료로부터 이익을 얻는지 결정하거나 주어진 치료 요법의 효능을 결정하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 조직 내 단백질 수준의 진단 모니터링을 위한 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도이다. 예를 들어, 대상체, 예를 들어 특정 DRG에서 또는 그 부근의 조직에서 CXCL13 수준의 검출은 항-CXCL13 항체를 검출 가능한 물질에 커플링함으로써 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예로는 각종 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질 등이 있다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 금 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

VI. 약학적 조성물 및 투여 방법

본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제조하고 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 잘 알려져 있거나 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 경로는 예를 들어 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 이러한 모든 투여 형태는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 명확하게 고려되지만, 투여 형태의 예는 주사액, 특히 정맥내, 복강내 또는 동맥내 주사 또는 점적용 주사액일 것이다. 일반적으로, 주사용으로 적합한 약학적 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시내용에 적합한 다른 방법에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 말초 신경 손상 부위에 직접 전달될 수 있어, 치료제에 대한 손상된 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.

본원에서 논의되는 바와 같이, 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 말초 신경계(PNS) 손상, 예를 들어 손상된 말초 신경, 예를 들어 손상된 좌골 신경의 생체내 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 개시된 결합 분자는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 제제화될 것임을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 생리 식염수, 무독성 완충제, 방부제 등과 같은 약학적으로 허용되는 무독성 멸균 담체를 포함한다. 즉시 적용을 위해, 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체(접합 또는 비접합된)의 약학적 유효량은 표적에 대한효과적인 결합을 달성하고 이익, 예를 들어 손상된 신경의 재생, 주변 표피의 신경분포, 뉴런 기능의 회복 및/또는 말초 신경 손상의 증상, 예를 들어 통증 또는 따끔거림을 완화하거나 조직 내의 CXCL13 수준을 검출하기에 충분한 양을 의미하는 것이다.

본 개시내용에서 사용되는 약학적 조성물은 예를 들어 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예를 들어 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함하는 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사 가능 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체는 예를 들어 물, 알코올성/수성 용액, 염수 및 완충 매질을 포함하는 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 본 개시내용에서, 약학적으로 허용되는 담체는 0.01-0.1 M, 예를 들어 0.05 M 포스페이트 완충제 또는 0.8% 식염수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 일반적인 비경구 비히클에는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양 보충제, 링거 덱스트로스에 기반한 것과 같은 전해질 보충제 등이 포함된다. 또한, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 존재할 수 있다.

보다 구체적으로, 주사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우, 조성물은 무균 상태여야 하고, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항해서 보존될 수 있어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 사용하여, 분산액의 경우 필요한 입자 크기에 의해 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 본원에서 개시되는 치료 방법에 사용하기 적합한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기재되어 있다.

미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 제제는 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함할 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 유도될 수 있다.

임의의 경우에, 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 여기에서 열거된 성분 중 하나 또는 성분의 조합물과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물(예를 들어, 항-CXCL13 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체)을 단독으로 또는 다른 활성제와 조합하여 혼입한 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비히클에 혼입하여 제조되며, 여기에는 기본 분산 매질 및 위에서 나열된 성분 중 필요한 기타 성분이 포함되어 있다. 멸균 주사 가능 용액의 제제를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조일 수 있으며, 이것은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 목적 성분의 분말을 생성한다. 주사 제제를 처리하고, 관련 기술 분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 앰퓰, 백, 병, 주사기 또는 바이알과 같은 용기에 채우고, 밀봉한다. 또한, 상기 제제는 미국 특허 출원 제09/259,337호에에 기술된 것과 같은 키트 형태로 포장 및 판매될 수 있다. 이러한 제조 물품은 관련 조성물이 특정 유형의 말초 신경 손상 또는 상해로 고통받고 있거나 그러한 경향이 있는 대상체를 치료하는 데 유용하다는 것을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 가질 수 있다.

비경구 제제는 단일 볼루스 용량, 주입 또는 로딩 볼루스 용량, 이어서 하나 이상의 유지 용량일 수 있다. 이들 조성물은 특정한 고정된 간격 또는 가변적인 간격으로, 예를 들어 하루에 한 번 또는 "필요에 따라" 투여될 수 있다.

본 개시내용에서 사용되는 특정 약학적 조성물은 예를 들어 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 특정 약학적 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제 및/또는 다른 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수 용액으로 제조될 수 있다.

단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 변할 수 있다. 조성물은 단일 투여, 다중 투여로서 또는 확립된 기간 동안의 주입으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 또한 원하는 최적의 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.

본 개시내용의 범위에 따라, 본 개시내용의 항-CXCL13 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 상기 언급된 치료 방법에 따라 치료 효과를 내기에 충분한 양으로 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 항-CXCL13 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본 개시내용의 항체, 예를 들어 MAb 5261 또는 MAb 5378을 공지 기술에 따른 통상적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합함으로써 제조되는 통상적인 투여 형태로 상기 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성은 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 잘 알려진 변수에 의해 결정됨을 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 인식할 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 추가로 본 개시내용의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 하나 이상의 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있음을 이해할 것이다.

"치료 유효 용량 또는 치료 유효량" 또는 "유효량"은 투여될 때 치료되는 말초 신경 손상을 갖는 환자의 치료에 대해 긍정적인 치료 반응을 유발하는 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 의미한다.

말초 신경 손상의 치료를 위한 본 개시내용의 조성물의 치료학적 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 사람인지 동물인지의 여부, 치료가 예방적이든 치료적이든 관계없이 투여되는 다른 약물, 대상체의 연령, 치료 전에 대상체에서 검출된 CXCL13의 수준을 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 다양하다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 형질도입된 포유동물을 포함한 비인간 포유동물도 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 적정될 수 있다.

투여되는 적어도 하나의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양은 본 발명의 개시내용을 고려하여 과도한 실험 없이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 적어도 하나의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어, 항체, 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 방식 및 각각의 양에 영향을 미치는 요인에는 손상의 중증도, 손상 부위, 손상된 말초 신경, 손상 병력, 및 연령, 신장, 체중, 건강, 및 예를 들어 대상체에서 검출된 CXCL13 수준을 포함하는 요법을 받고 있는 개인의 신체 상태를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이와 유사하게, 투여되는 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체 예를 들어 항체의 양은 투여 방식 및 대상체에게 상기 작용제를 단일 투여하는지 다중 투여하는지의 여부에 따라 결정될 것이다.

본 개시내용은 또한 예를 들어 좌골 신경 손상을 포함하는 말초 신경 손상을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 항-CXCL13 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공한다.

IX. 진단

본 개시내용은 대상체가 항-CXCL13 결합 분자를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 것인지의 여부, 예를 들어 대상체가 노화에 따른 신경 재생 저하를 경험하고 있는지의 여부를 결정하기 위해 대상체에서 말초 신경 손상을 진단하는 데 유용한 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 예를 들어 손상된 말초 신경의 DRG 또는 말초 신경 손상, 예를 들어 좌골 신경 손상이 있거나 상기 손상이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 다른 세포 또는 체액 내의 또는 이에 근접한 조직에서 CXCL13 단백질 또는 전사체의 발현 수준을 측정하고, 측정된 발현 수준을 젊은 대상체의 정상 조직 또는 체액에서의 표준 CXCL13 발현 수준과 비교하는 것을 수반하고, 여기서 표준 수준과 비교하여 샘플의 발현 수준의 증가는 대상체가 본원에서 개시되는 항-CXCL13 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻는다는 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CXCL13 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체, 예를 들어 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9는 노화에 따른 신경 재생 저하의 존재 진단에 사용된다.

본 개시내용의 항-CXCL13 항체 및 그의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내의 CXCL13 단백질 수준을 검정하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참조). CXCL13 단백질 발현을 검출하는 데 유용한 다른 항체 기반 방법은 면역 검정, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 면역침전법, 웨스턴 블롯팅, 유세포 분석, PCR 기술 등을 포함한다. 적합한 검정법은 본원의 다른 곳에서 보다 자세히 설명되어 있다.

"CXCL13 폴리펩타이드의 발현 수준을 검정하는 것"은 제1 생물학적 샘플에서 CXCL13 폴리펩타이드의 수준을 직접적으로(예를 들어, 절대 단백질 수준을 결정하거나 추정함으로써) 또는 상대적으로(예를 들어, 제2 생물학적 샘플 내의 관련된 폴리펩타이드 수준과 비교함으로써) 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 추정하는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 제1 생물학적 샘플 내의 CXCL13 폴리펩타이드 발현 수준을 측정하나 추정하고, 표준 CXCL13 폴리펩타이드 수준과 비교하고, 상기 표준 수준은 노화에 따른 재생 저하가 없는 젊은 개체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 결정되거나 또는 노화에 따른 신경 재생 저하가 없는 젊은 개체 집단의 평균 수준에 의해 결정된다. 관련 기술 분야에서 알 수 있는 바와 같이, 일단 "표준" CXCL13 폴리펩타이드 수준이 알려지면, 이 수준은 비교를 위한 표준 수준으로서 반복적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "젊은 개체(들)"라는 용어는 생활 연령 및 일반 건강 또는 유전과 같은 기타 기준에 따라 의료 서비스 제공자가 결정한 임의의 지정 용어이다. 특정 실시양태에서, "젊은 개체"는 예를 들어 40세 미만 또는 35세 미만, 예를 들어 20세 내지 35세의 대상체일 수 있다.

"생물학적 샘플"은 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 잠재적으로 CXCL13을 발현하는 세포의 다른 공급원으로부터 얻은 임의의 생물학적 샘플을 의도한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다.

상기 인용된 모든 참고문헌뿐만 아니라 본원에서 인용되는 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

하기 실시예는 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.

실시예

실시예 1. 실험 재료 및 방법

하기 물질, 방법 및 프로토콜을 하기 실시예에 적용하였다.

마우스

8 내지 10주령의 야생형 C57/BL6J 마우스는 찰스 리버(Charles River)로부터 얻었고, 노화된 마우스(20 내지 22개월령)는 찰스 리버 또는 독일 튀빙겐 소재의 HIH 저커 연구소(Jucker's laboratory)로부터 공급받았다. 임페리얼 칼리지(Imperial College) 보토 연구소(Botto's laboratory)에서 B57/BL6 유전적 배경을 가진 OTI 마우스를 제공받았다. 모든 동물 절차는 영국 동물 과학 절차법(UK Animals Scientific Procedures Act)(1986)에 따라 수행되었으며, 임페리얼 칼리지 런던(Imperial College London) 윤리 위원회의 승인을 받았다.

DRG 세포 배양

24웰 플레이트의 멸균 15 mm 유리 커버슬립을 H₂O에 희석된 0.003% 폴리-L-오미틴(Sigma)으로 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 물로 3번 세척한 후, 커버슬립을 PBS(Invitrogen) 내에 준비된 1 μg/ml 라미닌(Millipore)으로 실온에서 3시간 동안 코팅하였다. PBS로 2회 세척한 후, 웰을 DMEM으로 채우고, 세포 플레이팅까지 37℃에 두었다. DRG를 절개하고, 얼음 위의 행크 균형 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution; HBSS)(Invitrogen)에 수거하였다. 그런 다음, HBSS를 제거하고, 튜브를 5분마다 부드럽게 치면서 40분 동안 37℃ 수조에서 500 μl의 분해 용액(DMEM(Invitrogen) 중 5 mg/ml 디스파제 II(Sigma), 2.5 mg/ml 콜라게나제 타입 II(Worthington))으로 교체하였다. 소화 후 2분 동안 800 rpm에서 원심분리하여 DRG를 수집하고, 따뜻한 DRG 배지(DMEM/F12(Invitrogen), 1X B27(Invitrogen), 10% 태아 소 혈청(FBS)(Sigma))로 1회 세척하였다. 그런 다음, DRG를 따뜻한 DRG 배지 1 ml로 재현탁하고, 화염 연마된 시그마코트(Sigmacote)(Sigma) 코팅 유리 피펫으로 15회 피펫팅하여 분해하였다. 해리되지 않은 조직을 100 μm 세포 스트레이너(BD Falcon)로 여과하고, 세포를 혈구계를 사용하여 명시야 현미경으로 계수하였다. 세포 계수 후, 세포를 회전시키고, 따뜻한 DRG 배양 배지(DMEM/F12(Invitrogen), 1X B27(Invitrogen), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen))로 재현탁하고, 플레이팅하였다(웰당 4000개 세포). DRG 세포는 37℃, 5% CO₂에서 배양되었다.

DRG 신경돌기 성장 분석

배양된 DRG 세포의 평균 신경돌기 길이는 뉴롤루시다(Neurolucida) 소프트웨어(MBF Bioscience)를 사용하여 조건당 적어도 100개의 세포(무작위로 선택된 커버슬립당 5개의 필드)에 대해 기술적 및 생물학적 3중 실험으로 측정하였다.

면역세포화학

배양된 DRG 세포를 빙상에서 30분 동안 1X PBS 내의 빙냉 4% 파라포름알데히드(PFA)(Sigma)로 고정하고, 1X PBS로 3회 세척하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안 1X PBS, 0.1% 트리톤(Triton) X, 5% 정상 염소 혈청(Abcam)에서 차단한 다음, 1X PBS, 0.1% 트리톤 X, 2% 정상 염소 혈청 내의 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 1X PBS로 3회 세척하고, 암실에서 1X PBS, 0.1% 트리톤 내의 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1X PBS로 3회 세척하고, 10분 동안 1X PBS, 0.1% 트리톤 X 내의 4-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Molecular Probes, 1:5000)과 함께 인큐베이션한 후, PBS 내에서 2X 세척하였다. 세포가 아래를 향한 커버슬립을 안티페이드 봉입제(Antifade mounting medium)(Vectashield, H-1000)와 함께 슬라이드 상에 옮겨 봉입하였다.

좌골 신경 압좌

이전에 기술된 프로토콜에 따라 좌골 신경을 압좌하였다(Bauder and Ferguson, (2012). JoVE (Journal of Visualized Experiments), e3606). 마우스를 1 L/min 산소 중 2% 이소플루란으로 깊이 마취시키고, 진통을 위해 0.1 mg/kg 부프레노르핀 및 5 mg/kg 리마딜을 피하(s.c.) 주사하였다. 정중선을 가로질러 피부를 절개하고, 근막면을 열어 좌골 신경을 노출시키고, 대둔근과 대퇴이두근의 전면 삼각근 사이를 조금 더 깊게 절개하였다.

3개의 다발(fascicle)이 순차적으로 정렬된 노출된 신경의 근위측을 초미세 지혈용 겸자(Fine Science Tools, 13020-12)의 끝에서 1.5 mm 지점에 상기 겸자의 기부 조(bottom jaw)에 위치시켰다. 신경 신장 없이 겸자를 3번 클릭하여 30초 동안 신경을 압좌하였다. 그런 다음, 봉합 클립으로 피부를 봉합하였다.

수술 후 3일 동안 마우스에게 0.1 mg/kg의 부프레노르핀을 하루에 두 번, 5 mg/kg의 리마딜을 매일 s.c. 주사로 투여하였다. 손상 없이 신경을 노출시키기 위해 모의 수술을 시행하였다.

RNA 준비 및 시퀀싱

모의 또는 좌골 신경 손상 후 24시간이 경과한 젊은 또는 노화된 마우스의 전체 좌골 DRG 조직으로부터의 RNA를 사용하여 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 구체적으로, 좌골 DRG를 샘플당 1마리의 마우스로부터 절개하고, RNAlater 안정화 용액(ThermoFisher)에 보관하였다. 조직을 RNase가 없는 마이크로페슬(micropestle)로 균질화하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하였다. DNA를 제거하기 위해 15분 동안 RNase 미함유 DNase 세트(Qiagen)로 온-컬럼(On-column) DNase 분해를 수행하였다. RNA 농도 및 순도는 애질런트(Agilent) 2100 생물분석기(Bioanalyzer)(애질런트)를 사용하여 측정하였다. RNA 무결성 번호(RIN)가 7.5 이상인 RNA를 라이브러리 준비에 사용하였다. TruSeq mRNA 샘플 준비 키트(Illumina)를 사용하여 Ospedale San Raffaele(Milan)에서 라이브러리를 준비하고, 일루미나(Illumina) HiSeq 2500 100-사이클, 쌍 말단 시퀀싱(pair end sequencing)을 사용하여 시퀀싱하였다.

생물정보학적 분석

FDR(위발견율) 보정된 P-값은 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg; BH) 보정으로 구현되었다. 세 가지 비교(각각 SNI Young, 모의 Old 및 SNI Old 대 모의 Young)의 차별적으로 발현된(DE) 유전자(FDR<0.05)를 데이터세트의 모든 발현된 유전자를 배경으로 하고 DAVID v6.7을 사용하여 유전자 온톨로지(Gene Ontology; GO) 및 KEGG 경로에 대해 분석하였다(Huang et al., Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 2009;4(1):44-57; Huang et al., Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 2009 ). GO 및 KEGG 경로의 범주는 상향 및 하향 조절 둘 모두에 대해 FDR<0.01로 선택되었다. 벤(Venn) 다이어그램은 바이오벤(Biovenn)을 사용하여 생성되었다(BioVenn - a web application for the comparison and visualization of biological lists using area-proportional Venn diagrams, T. Hulsen, J. de Vlieg and W. Alkema , BMC Genomics 2008, 9 (1): 488). GO 및 KEGG 경로에서 수집된 면역 반응에 관여하는 SNI Old 대 모의 Young의 차별적으로 상향조절된 유전자를 STRING에 의해 확립된 단백질-단백질 네트워크에 대해 분석하였다(Szklarczyk et al., STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets, Nucleic Acids Res. 2019). 실험 및 데이터베이스의 활성 상호작용 소스를 사용하여 엄격한 기준을 선택하였으며, 최소 필수 상호작용 점수의 가장 높은 신뢰도를 사용하였다. 네트워크는 사이토스케이프(Cytoscape)로 시각화하였다(Shannon et al., Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks, Genome Research 2003 Nov; 13(11):2498-504).

CXCL13 ELISA 검정

모의 또는 좌골 신경 손상 3일 후에 샘플당 2마리의 젊은 또는 노화된 마우스로부터 절개된 좌골 DRG를 수집하고, 프로테아제 억제제(Roche)와 함께 마우스 CXCL13 ELISA 키트(ThermoFisher)로부터 공급된 150 μL 검정 희석제 A에서 균질화하였다. 균질화 후에, 트리톤 X-100을 최종 1% 농도로 첨가하였다. 샘플을 액체 질소에서 동결하고, 해동한 다음, 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 파편을 제거하였다. BCA 단백질 검정 키트(ThermoFisher)를 사용하여 단백질 농도를 정량하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 CXCL13 ELISA 키트를 사용하여 CXCL13 ELISA 검정에 100 μL의 세포 용해물을 사용하였다. CXCL13 ELISA 측정은 450 nm로 설정된 ELISA 플레이트 판독기에서 흡광도를 측정하고, 마이크로플레이트의 광학적 결함을 보정하기 위해 550 nm 측정값을 차감하여 얻었다. 세포 용해물 내의 CXCL13 농도는 표준 곡선에 따라 계산하였다.

면역조직화학

마우스를 복강내(i.p.) 주사를 통해 케타민/자일라진 혼합물(최대 80 mg/kg(체중) 케타민 및 10 mg/kg(체중) 자일라진)에 의해 심부 마취하고, 5 ml/분의 유속으로 20 ml의 빙냉 PBS로, 이어서 4% PFA로 경심 관류하였다. 뒷발의 DRG, 좌골 신경 또는 털이 없는 피부를 절제하고, 빙상서 2시간 동안 4% PFA에 후고정하고, OCT 화합물(Tissue-Tek)에 포매하기 전에 3일 동안 30% 수크로스(Sigma)로 옮겼다. DRG는 저온 유지 장치(Leica)로 피부 표면에 수직으로 10 μm, 좌골 신경은 12 μm, 지간부 발바닥은 30 μm에서 절편화되었다. 절편을 실온에서 1시간 동안 PBS에 10% 정상 염소 혈청 또는 정상 당나귀 혈청(Abcam) 및 0.3% 트리톤 X-100을 포함하는 차단 용액으로 처리하고, 4℃에서 밤새 1차 항체로 염색하였다. 1차 항체는 다음과 같다: 항-Tuj1(1:500, Novus, NB100-1612), 항-CXCL13(10 μg/ml, R&D SYSTEMS, AF470), 항-미세신경섬유 200(1:100, Sigma, N4142), 항-CGRP(1:200, Abcam, ab36001), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 접합-GS-IB4(1:100, ThermoFisher, 121411), 항-SCG10(1:500, NOVUS, NBP1-49461), 항-CD8(1:100, ThermoFisher, 14-0081-82), 항-CD3(1:100, Abcam, ab16669), 항-CXCR5(1:100, Abcam, ab133706), 항-CD68(1:200, Abcam, ab125212), 항-B220(1:100, Biolegend, 103228), 항-MHC-I(1:100, Abcam, ab15681), 항-활성 카스파제 3(1:200, Cell Signaling, #9664), 항-포스포-AKT(1:200, Cell Signaling, #4060), 항-포스포-S6(1:200, Cell Signaling, #5364), 항-페르포린(1:100, NOVUS, NBP1-97512), 항-그랜자임 B(1:100, Abcam, ab4059), 항-PGP9.5(1:200, Proteintech, 14730-1-AP), 항-포스포-NFκB2(1:100, Abcam, ab194919), 항-루시페라제(1:200, Fitzgerald, 70R-12141), 항-GFP(1:500, Abcam, ab13970). 절편을 1X PBS로 3회 세척한 후, 알렉사 플루오르 488 염소 항-닭, 알렉사 플루오르 488 당나귀 항-닭, 알렉사 플루오르 488 염소 항-래트, 알렉사 플루오르 488 염소 항-토끼, 알렉사 플루오르 568 당나귀 항염소, 알렉사 플루오르 568 염소 항-토끼(1:1000, ThermoFisher)과 함께 실온에서 2시간 동안 2차 항체 인큐베이션을 실시하였다. 이어서, 절편을 실온에서 15분 동안 DAPI(Molecular Probes, 1:5000)로 염색하고, 안티페이드 봉입제(Vectashield, H-1000)로 봉입하였다. DRG는 20x 배율을 사용하여 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TE2000 현미경으로 이미지화되었다. 좌골 신경(20배 확대) 및 표피(오일 렌즈로 40배 확대)를 레이카(Leica) TCS SP8 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화하였다.

면역염색의 정량

임의의 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어(National Institute of Health, USA)를 사용하여 측정하였고, 상대적 변화 배수는 배경 강도를 제외한 후, 대조군 그룹에 대해 정규화된 형광 강도로 계산하였다. 절단된 카스파제 3, 페르포린 및 그랜자임 B의 발현에 대해 양성으로 지정된 세포는 배경보다 적어도 2배 높은 형광 강도를 나타냈다. SCG10으로 염색된 좌골 신경의 종단면을 축삭 재생에 대해 분석하였다. SCG10 임의 강도는 신경을 따라 측정되었고, 매 0.5 mm의 강도 백분율은 근위 압좌 부위에서 떨어져 정량되었다. 또한, 재생 지수는 강도가 50% 수준으로 감소한 근위 손상 부위로부터의 거리를 계산하여 평가하였다. 표피 신경재분포에 대해, 피부의 시상 단면(sagittal section)의 PGP9.5 염색으로 표시되는 표피내 신경 섬유(IENF)의 수는 부피 단위당 측정되었다.

유세포 분석

생체 내에서 세포의 특성을 결정하기 위해, 젊거나 노화된 나이브 또는 좌골 신경 손상 동물에게 3 μg의 항-CD45-APC(I3/2.3, Biolegend)를 3분 동안 정맥 내로(i.v.) 주사하였다. 말초 혈액 또는 DRG는 깊은 마취 후에 각각 2 mM EDTA 및 RPMI-1640 배지(ThermoFisher)가 포함된 10 ml PBS에 수집되었다. 실온에서 5분 동안 300 g에서의 원심분리에 의해 혈액 세포를 수집하고, 적혈구를 1X RBC 용해 완충제(Biolegend)을 사용하여 용해시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 70 μm 세포 스트레이너(Corning)에 의해 여과하여 덩어리를 제거하고, 염색을 위해 신선한 FACS 완충제(PBS 중의 0.5% BSA, 2 mM EDTA)로 재현탁하였다. DRG를 1X PBS로 1회 세척하고, 분해 완충제(RPMI-1640 중의 0.5 mg/ml CLSPA(Worthington, #LS005273), 7.5 μg/ml DNase I(Roche, #10104159001))로 37℃에서 30분 동안 해리하였다. 분해 후, DRG 조직을 분산시키고, 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 단일 세포 현탁액을 수집하고, 세정 완충제(RPMI-1640 중의 5% FBS)로 세척하였다. 원심분리 후, 펠렛을 실온에서 30분 동안 DNase 용액(250 μg/ml DNase I, IX DNase 완충제(RPMI-1640 중의 1.21 g/L Tris 염기, 0.5 g/L MgCl₂ 및 0.073 g/L CaCl₂))으로 재현탁하였다. 염색을 위해 세포를 FACS 완충제로 세척하였다.

혈액 및 DRG 샘플로부터 단리된 세포를 빙상에서 10분 동안 10⁶개 세포당 1.0 μg의 TruStain FcX 항-마우스 CD16/32 항체(Biolegend)로 100 μl 부피로 처리하여 Fc 수용체를 차단하고, 브릴리언트(Brilliant) 염색 완충제(BD Horizon)가 포함된 FACS 완충제에서 염색하였다. 다음 항-마우스 항체가 항원에 대해 사용되었다: 퍼시픽 블루(Pacific Blue)-접합 항-CD45(30-F11, Biolegend, 2 μg/ml), FITC-접합 항-CD62L(MEL-14, Biolegend, 5 μg/ml), 브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) 605-접합 항-CD19(6D5, Biolegend, 1 μg/ml), 브릴리언트 바이올렛 711-접합 항-CD8(53-6.7, Biolegend, 2 μg/ml), 브릴리언트 바이올렛 785-접합 항-TCRβ(H57-597, Biolegend, 2 μg/ml), APC-접합 항-CD4(RM4.5, BD, 2 μg/ml), APC/CY7-접합 항CD44(IM7, Biolegend, 2 μg/ml), PE/CY7-접합 항-CD69(H1.2F3, ThermoFisher, 2 μg/ml), 비오틴-접합 항-CXCR5(SPRCL5, ThermoFisher, 5 μg/ml), FITC-접합 항-CD11b(M1/70, ThermoFisher, 2.5 μg/ml), APC-접합 항-F4/80(T45-2342, BD, 2㎍/ml). LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell 염색 키트(ThermoFisher)를 사용하여 죽은 세포를 염색에서 제외하였다. 세포를 칵테일 항체로 4℃에서 20분 동안 암실에서 염색하고, 세척 후 4℃에서 20분 동안 2 μg/ml PE-스트렙타비딘(Biolegend)으로 염색하였다. FMO(Fluorescence Minus One) 및 PE-스트렙타비딘 염색 대조군을 게이팅 경계에 사용하였다. 세포 획득 전에 항-CXCR5 쉐딩을 최소화하기 위해, 염색된 세포를 실온에서 20분 동안 IC 고정 완충제(ThermoFisher)로 즉시 고정하였다. 세포를 PBS로 세척하고, FACS 완충제로 재현탁하였다. 20 μl의 정밀 계수 비드(Precision Count Bead)(Biolegend, 424902)를 각각의 샘플에 첨가한 후, 유세포 분석기 LSR II(BD Biosciences)에 의해 세포를 획득하였다.

세포 고갈 실험

생체 내에서 CD8 T 세포를 고갈시키기 위해, 22 내지 24개월령의 마우스에게 200 ㎍의 InVivoMAb 래트 IgG2b 이소형 대조군(LTF-2, BioXcell, BE0090) 또는 InVivoMAb 항-마우스 CD8α(YTS 169.4, BioXcell, BE0117)를 좌골 신경 압좌 손상 전에 일주일 동안 격일로 3회 i.p.주사하였다. 동물이 마취에서 완전히 회복되었을 때, 좌골 신경 압좌 후 한 번의 추가의 주사를 수행하였다. DRG 및 신경은 신경 손상 3일 후에 절개한 후, FACS, 면역염색 또는 재생 검정을 수행하였다. CD4 T 세포의 고갈은 InvivoMAb 항-마우스 CD4(YTS 191, BioXcell, BE0119) 및 래트 IgG2b의 이소형 대조군을 사용하여 CD8 T 세포 고갈에 사용된 것과 동일한 요법으로 수행하였다. 이전에 설명한 전략에 따라 B 세포 고갈을 수행하였다(Keren et al., 2011). 노화된 마우스에게 다음 항체 칵테일을 i.p. 주입하였다: 150 μg InvivoMAb 항-마우스 CD19(1D3, BioXcell, BE0150), 150 μg InvivoMAb 항-마우스 B220(RA3.3A1/6.1, BioXcell, BE0067), 150 μg InvivoMAb 항-마우스 CD22(Cy34.1, BioXcell, BE0011). 48시간 후에, 마우스에게 2차 항체 InvivoMAb 항-래트 카파(MAR18.5, BioXcell, BE0122)를 마우스당 150 ㎍의 용량으로 주사하였다. 모든 주사는 좌골 신경 손상 1주일 전에 2회 수행하고, 손상 다음날에 1회 더 시행하였다. 사용된 항체의 동일한 이소형의 대조군 IgG는 래트 IgG2a(2A3, BioXcell, BE0089), 폴리클로날 래트 IgG(BioXcell, BE0094), 마우스 IgG1(MOPC-21, BioXcell, BE0083) 및 마우스 IgG2a(C1.18.4, BioXcell, BE0085)를 사용하여 주사되었다.

CXCL13 중화

DRG의 생체외 배양을 위해, DRG 절개 및 1차 세포 배양 1주일전에 30 mg/kg의 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체로 처리하였다(항-CXCL13 모노클로날 항체(mAb 5378-41) 및 대조군 IgG2a(mAb 2510)). 단리된 DRG 세포를 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 신경돌기 성장물을 측정하였다. 생체 내에서 CXCL13의 중화를 위해, 30 mg/kg 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체를 좌골 신경 압좌 4시간 후 및 제3일에 희생될 때까지 매일 젊은 마우스 또는 노화된 마우스에게 i.p. 주사하였다. 만성 신경 재생 연구의 경우, 30 mg/kg의 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체를 손상 후 4시간부터 시작하여 동물을 희생시킬 때까지 주당 3회 i.p. 주사하였다.

행동 평가

좌골 신경 압좌가 있는 마우스 및 대조군 IgG 또는 항-CXCL13 항체의 만성 투여를 행동 평가에 사용하였다. 왼쪽 좌골 신경 및 뒷발을 손상시켜 평가하였다. 행동 평가에 참여하는 연구자들에게는 그룹 및 치료에 대한 정보를 제공하지 않았다.

기계적 감도 시험

행동 평가를 시작하기 전에 적응을 위해 마우스를 30분 동안 시험 챔버에 두었다. 0.4 g †T지 4 g 범위의 보정된 폰 프레이 필라멘트로 왼쪽 뒷발의 발바닥 표면을 조사하여 기계적 감도를 결정하였다. 감각 수용체가 기준선으로 돌아갈 수 있는 충분한 시간을 주기 위해, 간격 시간은 각각의 시험 사이에 적어도 30초이었다. 빠른 뒷발 움츠림은 긍정적인 반응으로 간주되었다. 각각의 마우스에 대해 5회의 시험을 수행하고, 3개의 긍정적인 움츠림 반응으로부터의 잠복기 값을 평균하였다. 역치는 모노필라멘트 힘의 최저 수준으로 설정되었다.

열 감도 시험

열 감도에 대해, 하그리브스 검정은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다(Chen et al., (2014). Nature Communications 5, 5331; Hargreaves et al., (1988). Pain 32, 77-88). 간단히 설명하면, 마우스를 유리 바닥에 놓고, 플라스틱 챔버로 분리하였다. 마우스는 적응을 위해 30분 동안 그대로 두었다. 열 자극(적외선 방사원, 강도=50)을 10초 이하의 시간 동안 뒷발의 발바닥 표면 아래에 조심스럽게 공급하였다. 뒷발 움츠림 시간이 자동으로 기록되었다. 각각의 발에 5회 시험하고, 가장 긴 움츠림 시간과 가장 짧은 움츠림 시간을 포함하여 평균을 계산하였다.

접착제 제거

작은 접착제 자극(¼" 원형 접착 라벨)을 마우스의 왼쪽 뒷발에 주고, 두 앞발 또는 입과 처음 접촉하는 시간 및 접착제를 완전히 제거하는 시간을 기록하였다. 신경 손상 전 1주일 동안 마우스당 매일 10분 훈련을 수행하였다. 각각의 마우스는 3번의 시험되었다. 모든 시험은 사전 정보를 받지 않은 조사자에 의해 동물의 케이지에서 수행되었다.

통계 분석

데이터는 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 8.0(Graphpad Software Inc., 미국 캘리포니아주 라 홀라 소재)으로 통계적으로 분석되었고, 달리 명시되지 않는 한 평균 ± SEM으로 표현되었다. 통계적 비교는 두 그룹에 대한 스튜던트 독립 표본 t-검정을 사용하여 분석되었다. 여러 그룹을 사후 튜키 보정을 사용한 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 튜키 또는 시닥 검정을 사용한 이원 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 통계적 유의성은 p<0.05로 간주되었다.

실시예 2. 신경 손상 후 유전자 발현에 대한 노화의 영향: 뉴런 CXCL13은 노화된 DRG에서 상승한다.

후근 신경절(DRG)에서 유전자 발현에 대한 노화의 영향을 진행 신경 손상 전(모의) 및 손상 후에 다음 8-10주령(젊은) 마우스 및 20-22주령(노화된) 마우스로부터 얻은 좌골 DRG로부터의 RNA 시퀀싱(RNA seq)에 의해 평가하였다. 겸자로 신경을 압박하여 X마리의 젊은 마우스 및 노화된 마우스의 좌골 신경을 압좌하였다. 각각의 마우스는 좌골 신경의 대략 동일한 지점에서 위에서 설명한 것과 같이 손상을 입거나 모의 치료를 받았다. 24시간 후에, 좌골 신경 손상(SNI) 또는 모의 손상 부위 근처의 DRG를 제거하고, 이로부터 RNA를 추출하여 시퀀싱하였다. DRG로부터의 유전자 발현의 변화는 젊은 모의 동물의 기준선 발현과 비교하여 SNI 후 노화된 모의, 젊은 및 노화된 동물에서 평가되었다. 유의하게 차별적으로 발현된(DE) 유전자(FDR<0.05)를 기능적 분류를 위해 유전자 온톨로지(GO)와 KEGG에 의해 분석하였다. 일반적으로, 신경 발생, 신경 전달 물질, 이온 수송, G 결합 신호전달 및 신호 전달과 관련된 젊은 동물에서 SNI 후 상향조절된 GO 클래스는 SNI 이후를 포함하여 노화된 DRG에서 차별적으로 강화되지 못하였다(데이터는 표시되지 않음). 그러나, GO 분석에서 가장 눈에 띄는 발견은 노화된 DRG가 SNI 이전과 이후 둘 모두에서 T 및 부분적으로 B 세포 신호전달을 포함하는 적응 면역 반응에서 매우 현저한 강화를 보였다는 것이다. KEGG 분석은 사이토카인/케모카인 신호전달뿐만 아니라 면역 반응 및 신호전달에서 연령 및 부상과 관련된 현저한 변화의 존재를 더욱 강조하였다. 노화된 DRG에서 대부분의 DE 유전자(66.6% 상향조절 및 65% 하향조절됨)는 손상 후에 노화 의존적이었다.

면역 반응의 공지된 현저한 노화에 따른 조절을 고려하여, 면역 반응에 관련된 전사체를 분석하였다. 분석에 따르면, CXCL13은 좌골 손상 전후 모두에서 노화와 관련하여 단연코 가장 두드러지게 상향조절되는 유전자인 것으로 나타났다. CXCL13 케모카인 수용체 CXCR5의 발현은 또한 노화된 DRG에서 상당히 향상되었으며(도 1a), 이것은 CXCL13/CXCR5 신호전달 축의 존재를 시사한다. 좌골 신경 압좌 3일 후에 DRG에서 신경 특이 성장 관련 단백질인 SCG10의 발현 및 국소화, 및 압좌 부위 부근의 염색 강도를 측정한 결과, 젊은 동물에 비해 노화된 동물에서 재생 저하를 나타났음이 밝혀졌다(도 1b 및 1c). 항-CXCL13 면역염색은 좌골 신경 손상 전 및 3일 후 둘 모두에 있어서 노화된 좌골 DRG 뉴런에서 CXCL13 발현의 현저한 증가를 보여주었다(도 1d 및 1e).

실시예 3. CXCL13 수용체 CXCR5를 발현하는 CD8 ⁺ T 세포는 노화된 DRG에서 상승한다.

CXCL13의 생체내 뉴런 발현이 CXCR5+ T 세포를 유인하는지의 여부를 결정하기 위해, 젊은 마우스의 좌골 신경을 AAV-GFP 또는 AAV-CXCL13-GFP로 감염시킴으로써 CXCL13을 DRG 뉴런에서 과다발현시켰다. 감염 6주 후에, 인터페론-γ(IFN-γ) 및 만니톨을 전신적으로 전달하여 각각 MHC-I 제시를 유도하고 혈액 장벽 투과성을 촉진하였고; 그 직후에 좌골 신경 압좌를 수행하였고, 손상 후 제3일에 좌골 DRG에서 FACS에 의해 CXCR5+ T 세포를 측정하였다(데이터는 표시되지 않음). 흥미롭게도, CXCR5+ CD8+ T 세포는 GFP 대조군과 비교하여 CXCL13을 과다발현하는 DRG에서 유의하게 증가한 것으로 밝혀졌다(도 2a 및 b).

CXCL13은 CXCR5 양성 B 및 T 세포에 대한 화학유인물질이기 때문에, DRG 내의 CD8+ T 세포의 국소화 및 면역표현형을 평가하였다. 면역염색은 CXCR5+ CD8+ T 세포의 수가 젊은 좌골 DRG에 비해 노화된 좌골 DRG에서 유의하게 더 높고(도 2c), 총 CD8+ T 세포의 백분율로서 CXCR5+ CD8+ T 세포의 빈도는 좌골 손상 후 제3일에 젊은 DRG에 비해 노화된 DRG에서 증가함을 보여주었다(도 2d). 이러한 데이터는 노화가 좌골 신경 손상 후를 포함하여 DRG 내에 위치하는 CXCL13의 강화된 뉴런 발현 및 증가된 수의 CXCR5+ CD8+ T 세포 둘 모두와 연관되어 있음을 보여준다. 이러한 데이터는 노화된 DRG의 조직 미세환경이 신경 손상 후 젊은 DRG와 유의하게 상이하다는 것을 보여준다.

실시예 4. CD8+ T 세포는 좌골 신경 손상 후에 노화에 따른 재생 저하와 선택적으로 연관되고; 뉴런 MHC-1은 노화된 DRG에서 유도되며 좌골 신경 손상 후에 노화에 따른 재생 저하에서 중요한 역할을 한다.

CD8 T 세포가 노화된 좌골 DRG 뉴런의 축삭 재생을 손상시키는지 분석하였다. CD8 T 세포 고갈은 좌골 신경 압좌 1주 전에 노화된 마우스에게 i.p. 전신 주사된 항-CD8 모노클로날 항체를 사용하여 수행된 반면, 대조군 동물에게는 정상적인 이소형 일치된 IgG를 투여하였다. SCG10 양성 좌골 신경 축삭의 분석은 항-CD8 모노클로날 항체가 신경 재생을 유의하게 촉진하고(도 3a-b), 면역형광 분석에 의해 표시된 바와 같이 DRG에서 CD8 T 세포의 유의한 감소를 초래한다는 것을 보여주었다(도 3c). 이와 대조적으로, 항-CD4 모노클로날 항체에 의한 CD4 T 세포의 고갈 또는 동일한 실험 손상 모델에서 모노클로날 항-CD19/항-B220/항-CD22 항체에 의한 B 세포의 고갈은 좌골 신경 손상 후에 노화에 따른 재생 저하를 변경하지 않았다(데이터는 제시되지 않음).

이들 데이터는 노화된 동물에서 SNI 후의 재생 저하에 CD8+ T 세포가 직접적이고 선택적으로 관련되어 있음을 시사한다.

RNAseq 데이터는 주요 조직적합 복합체 클래스 I(MHC-I)의 노화에 따른 농축을 밝혀냈다. MHC-I는 항원 제시 세포(APC)에 의해 발현되어 T 세포 수용체(TCR)와 결합한 후 CD8 T 세포를 활성화하기 위해 세포막에 항원 펩타이드를 제시한다(Zinkemagel, (2002). European Journal of Immunology 32, 2385- 2392). DRG에서 MHC-I에 대한 면역염색은 좌골 손상 전후의 노화된 DRG 뉴런에서 MHC-I의 발현 증가를 보여주었다(도 4a). 그러나, SNI는 뉴런 세포 표면의 MHC-I 국소화에 의해 제안된 바와 같이 항원 제시가 가능한 DRG 뉴런의 백분율의 유의한 증가와 관련이 있었다(도 4b).

다음 단계는 MHC-1 의존성 펩타이드 제시가 좌골 신경 손상 후에 노화된 동물에서 축삭 재생 저하에 중요한 역할을 하는지의 여부를 입증하는 것이었다. 이를 위해, AAV 기반 접근법을 사용하여 CD8 T 세포 면역 반응을 회피하는 MHC-1 항원 제시를 억제하는 바이러스 코딩 펩타이드 서열 GAr을 노화된 마우스의 좌골 DRG에서 발현시켰다(Zaldumbide and Hoeben, (2008). Biotechnology Letters 32, 749-754). GAR은 루시페라제 리포터를 사용하여 테트라사이클린/독시사이클린 유도 발현에 반응하는 역 테트라사이클린 트랜스활성화제(rtTA: reverse tetracycline transactivator)에 연결되었다(도 4c, d)(Burnside et al., (2018). Brain 141, 2362-2381; Hoyng et al., (2014). Gene therapy 21, 549-557; Zaldumbide et al., (2010). Biotechnology Letters 32, 749-754). 구체적으로, 독시사이클린이 1주일 동안 i.p. 투여되었을 때, 5주 동안 AAV-루시페라제와 AAV-GAr-rtTA 또는 대조군 AAV-rtTA의 혼합물을 좌골 신경에 양측으로 주사하였다. 다음으로, 좌골 신경 압좌 손상을 수행하고, 3일 후에 동물을 희생시켰다. MHC-1 및 절단된 카스파제 3 발현은 대조군 AAV-rtTA와 비교하여 AAV-GAr-rtTA 투여 후에 루시페라제 양성 DRG 뉴런에서 유의하게 감소되었다(도 4e). SCG10 면역염색에 의해 측정된 좌골 축삭 재생은 AAV-GAr-rtTA 감염시에 유의하게 향상되었다(도 4f, g).

종합적으로, 상기 데이터는 CD8+ T 세포 및 신경 MHC-I가 SNI 후에 노화에 따른 재생 저하에 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사한다.

실시예 5. CXCL13 중화는 좌골 신경 손상 후에 노화에 따른 재생 저하를 역전시키고 신경 기능 회복을 촉진한다.

CXCL13의 중화가 노화된 동물에서 축삭 재생, 표피 신경분포 및 기능 회복을 촉진하는지의 여부를 도 5a의 도식에 요약된 전략을 사용하여 조사하였다. 초기 실험에서, CXCL13에 대한 모노클로날 항체 또는 대조군 IgG는 좌골 신경 압좌 손상 후 3일 동안 매일 젊은 또는 노화된 마우스에게 위에서 설명한 바와 같이 복강 내로 주사되었다. 축삭 재생은 상기 기재된 바와 같이 항-SCG10 면역염색에 의해 측정되었다. 항-CXCL13 항체는 노화에 따른 재생 실패를 차단하고, 젊은 동물의 축삭 재생에 영향을 미치지 않았다(도 5b-c). CXCL13 중화는 노화된 DRG에서 CXCR5+ T 및 B 세포의 수를 유의하게 감소시켰다(도 5d). 별도의 실험에서, 기능 회복에 대한 항-CXCL13 항체의 장기 전달을 시험하였다. 위에서 기술한 바와 같이, CXCL13에 대한 모노클로날 항체 또는 대조군 IgG는 손상 4시간 후부터 시작하여 5주 이상 동안 주당 3회로 젊은 동물 또는 노화된 동물에게 전달되었다. 폰 프레이 필라멘트에 의한 기계적 자극에 대한 반응, 테이프 제거 시험에 의한 터치 및 하그리브스 검정에 의한 열 통각에 대한 반응을 측정하기 위해 다중 모드 감각 평가를 수행하였다(도 5a). 데이터 분석에 따르면, 노화된 마우스는 젊은 마우스에 비해 훨씬 더 느리게 회복되었으며, 중요한 사실은 CXCL13 중화가 노화된 마우스에서 선택적으로 조사된 모든 감각 양상에서 노화된 마우스에서 유의하게 가속된 회복을 유도하는 것으로 나타났다는 것이다(도 5e-j). CXCL13 중화가 개선된 표피 신경분포를 유도하는지의 여부는 항-CXCL13 항체 또는 대조군 IgG의 전달 후에 젊은 마우스와 노화된 마우스 둘 모두에서 좌골 신경 손상 18일 후에 뒷발의 털이 없는 지간부 영역의 PGP 9.5 면역염색에 의해 측정되었다. CXCL13 중화는 노화된 마우스에서 유의한 표피 신경분포를 촉진하는 것으로 밝혀졌다(도 5k, l).

이들 데이터는 CXCL13 길항작용이 열 감도와 기계적 감도 둘 모두에서 기능적 회복을 유도함을 보여준다.

종합적으로, 이들 데이터는 CXCL13 중화가 노화된 동물에서 축삭 재생, 표피 신경재분포 및 기능 회복을 촉진한다는 것을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> VACCINEX, INC. <120> USE OF CXCL13 BINDING MOLECULES TO PROMOTE PERIPHERAL NERVE REGENERATION <130> 8555.038WO <140> <141> <150> 63/037,755 <151> 2020-06-11 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg 20 25 30 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 50 55 60 Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln 65 70 75 80 Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 100 105 <210> 2 <211> 1219 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gagaagatgt ttgaaaaaac tgactctgct aatgagcctg gactcagagc tcaagtctga 60 actctacctc cagacagaat gaagttcatc tcgacatctc tgcttctcat gctgctggtc 120 agcagcctct ctccagtcca aggtgttctg 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Leu Ser Thr Phe 20 25 30 Asn Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Arg Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Leu Gly Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Phe Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe 20 25 30 Gly Ala Thr Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Leu Gly Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Arg Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln 85 90 95 Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 16 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe 20 25 30 Asn Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Leu Gly Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Phe Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Thr Phe Gly Met Gly Val Gly 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Ser Thr Phe Asn Met Gly Val Gly 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ser Thr Phe Gly Ala Thr Val Gly 1 5 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Ile Ala Gly Tyr Tyr Gly Ser Arg Asp Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Ala Arg Arg Leu Gly Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Gly Phe Asp 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser Gly Ile Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Met Gly Ile Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Asp Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Leu Leu Ile Phe Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Tyr Arg Ala 1 5 10 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Gln Gln Ser Asn Lys Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr 1 5

Claims (32)

1. 노화에 따른 재생 저하를 갖는 대상체에서 말초 신경 손상의 치료에 사용하기 위한, CXCL13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13 활성을 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 제2항에 있어서, 억제된 CXCL13 활성은 손상된 말초 신경의 후근 신경절(DRG)에 대한 CXCR5+ CD8+ T 세포의 동원(recruitment)인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
4. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 제4항에 있어서, CXCL13 수용체는 CXCR5인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9, MAb 5091, MAb 1758 및 MAb 0745로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 CXCL13에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9, MAb 5091, MAb 1758 및 MAb 0745로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
   (A) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 26, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
   (B) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 27, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
   (C) 각각 서열 번호 19, 22 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 28, 31, 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
   (D) 각각 서열 번호 20, 23 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 29, 31 및 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL
   을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL은 (i) 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 7; (ii) 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 9; (iii) 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 11; (iv) 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 13; (v) 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 15; 및 (vi) 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MAb 5261, MAb 5091, MAb 1476, 또는 MAb 1758인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 말초 신경 손상은 좌골 신경 손상, 비골 신경 손상, 척추 부신경 손상 및 상완 신경총 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
12. 제11항에 있어서, 상기 사용은 손상된 신경의 전체적 또는 부분적 재생을 유도하거나, 표피 조직의 신경재분포를 유도하거나, 손상된 신경의 신경학적 기능의 완전 또는 부분 회복을 유도하거나, 또는 이들의 조합을 유도하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
13. 노화에 따른 재생 저하 및 말초 신경 손상을 갖는 대상체에서 말초 신경 손상의 치료에 사용하기 위한, CXCL13에 특이적으로 결합하는 유효량의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
14. 제13항에 있어서, 말초 신경 손상은 말초 신경의 압박, 신장 또는 절단의 결과인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 말초 신경 손상은 좌골 신경, 상완 신경총, 비골 신경 또는 척추 부신경의 손상인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
16. 제15항에 있어서, 말초 신경 손상은 좌골 신경 손상인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
18. 제17항에 있어서, 수용체는 CXCR5인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
    (A) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 26, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (B) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 27, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (C) 각각 서열 번호 19, 22 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 28, 31, 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (D) 각각 서열 번호 20, 23 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 29, 31 및 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
20. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL은 (i) 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 7; (ii) 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 9; (iii) 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 11; (iv) 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 13; (v) 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 15; 및 (vi) 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
21. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, MAb 5091, MAb 1758, 3D2 및 3C9로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 CXCL13에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 인간 또는 인간화 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
22. 제21항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MAb 5261, MAb 5091, MAb 1476 또는 MAb 1758인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
23. 노화에 따른 재생 저하의 치료를 필요로 하는 대상체에서 노화에 따른 재생 저하의 치료에 사용하기 위한, CXCL13에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
24. 제23항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CXCL13과 그의 수용체와의 상호작용을 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
25. 제24항에 있어서, 수용체는 CXR5인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, Mab 5378, MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, MAb 5091, MAb 1748, 3D2 및 3C9로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 CXCL13에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
    (A) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 26, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (B) 각각 서열 번호 18, 21 및 24로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 27, 30 및 33으로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (C) 각각 서열 번호 19, 22 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 28, 31, 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (D) 각각 서열 번호 20, 23 및 25로 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(VH-CDR1), VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 각각 서열 번호 29, 31 및 34로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1(VL-CDR1), VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL은 (i) 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 7; (ii) 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 9; (iii) 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 11; (iv) 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 13; (v) 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 15; 및 (vi) 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MAb 5261 또는 MAb 5091, MAb 1476 또는 MAb 1758인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 말초 신경 손상을 갖는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
31. 제30항에 있어서, 말초 신경 손상은 좌골 신경 손상, 상완 신경총 손상, 척추 부신경 손상 또는 비골 신경 손상인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
32. 제31항에 있어서, 말초 신경 손상은 좌골 신경 손상인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.

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