KR20230021653A - 면역격리를 위한 세포의 컨포멀 코팅 - Google Patents
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Abstract
불균일한 크기의 세포 및 세포 클러스터를 임플란트용 생체물질로 등각 코팅하여 세포 기능성을 보존하면서 면역 거부 또는 염증 또는 자가면역 파괴를 방지하는 유체역학적 방법이 개시된다. 적절한 기공 컷오프 크기를 갖는 생체적합성이고, 기계적으로 및 화학적으로 안정하고 다공성인 하이드로겔로 세포 및 세포 클러스터를 등각 코팅하기 위한 시약, 기구 및 방법이 추가로 개시된다.
Description
본 출원은 2020년 4월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/016,787의 우선권 및 이익을 주장하며, 그 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 2017년 4월 4일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/478,320(현재 미국 특허 10,653,816)에 관한 것으로, 이는 2011년 4월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/480,513의 이익을 주장하는, 2012년 4월 28일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2012/035696의 35 U.S.C. §371에 따른 국내 단계 출원인, 2014년 2월 12일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/114,690(현재 미국 특허 10,660,987)에 대한 우선권을 주장하는 분할 출원이고, 이들 출원의 각각의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구에 관한 진술
본 개시내용은 국립 보건원의 교부금, 번호 R01 DK109929에 의해 지원받았다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
발명의 분야
본 개시내용은 세포 이식 분야에 관한 것으로, 최소 면역 반응 또는 이식 거부를 가지고 인간 또는 동물로의 세포 이식을 용이하게 하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 본 개시내용은 보다 구체적으로 이러한 세포 또는 다른 생체물질의 생활성, 대사 또는 생체활성을 최소한으로 방해하는 코팅 혼합물로 중성 pH에서 등각 코팅된 이식용 세포를 포함하는 생체물질, 및 상기 등각 코팅된 생체물질 및 특히 세포를 생산 및 사용하기 위한 시약, 기구, 및 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 등각 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는 줄기 세포로부터 분화되거나 동물, 보다 특히 포유동물, 가장 특히 인간의 췌장으로부터 단리된 인슐린-생산 세포(예를 들어, 베타 세포-함유 랑게르한스 섬)를 포함한다. 시약 및 기구를 사용하고 본원의 방법에 의해 생성된 등각 코팅된 생체물질, 특히 세포 및/또는 세포 클러스터를 사용하는 방법이 특히 제공된다.
세포 캡슐화는 단일 세포 및 세포 클러스터를 면역단리하여 임플란트 시 세포의 기능성을 손상시킬 임의의 면역 반응을 방지하기 위해 유망한 전략이다. 생체-캡슐화는 당뇨병, 혈우병, 암 및 신부전 분야의 새로운 치료 시험에 광범위하게 사용되었다. 그러나 대부분의 시험은 다음과 같은 복합적인 이유로 완전히 성공하지 못했다:
· 캡슐화 및 세포 단리 방법의 재현성 부재;
· 생체적합성이고, 기계적으로 및 화학적으로 안정해야 하고, 캡슐화된 생체물질을 면역계 효과로부터 보호하면서 영양소 및 부산물이 캡슐 안팎으로 흐를 수 있게 하는 적절한 기공 컷오프 크기를 갖는 적합한 캡슐화 물질의 부재;
· 불균일하거나 비등각 코팅된 캡슐의 생산((i) 캡슐을 통한 산소 및 영양소 확산 및 (ii) 생체활성 분자의 세포 분비, 및 그에 따라서 캡슐화된 세포 생활성, 치료 분자 전달 비히클로서의 기능성 및 전반적인 캡슐화된 이식편 용량에 영향을 미침);
· 소동물 연구에서 전임상 비인간 영장류 연구로의 캡슐화 과정의 확장 불가능; 및
· 불리한 이식 부위의 선택.
캡슐화 기술에 대한 이러한 난제는 세포 캡슐화에 대한 가장 유망한 치료 분야 중 하나인 당뇨병에서의 작업의 맥락에서 나타날 수 있다.
당뇨병은 랑게르한스 섬을 구성하는 몇몇 세포 유형 중 하나인 췌장 베타 세포의 자가면역 파괴로 인해 발생한다. 그 일생 동안, 당뇨병 환자는 혈당 수준을 빈번하게 모니터링 및 제어하고 고혈당증을 경험할 때 인슐린을 투여해야 하며, 이는 최적이 아닌 대사 제어, 저혈당증 위험 증가 및 삶의 질 저하 등 많은 부수적인 효과를 갖는다. 섬 동종-이식은 당뇨병 환자를 치료하는 매우 유망한 치료법이지만 동종이식편 거부를 피하기 위해서는 평생 전신 면역억제가 필요하다. 문헌(Robertson, 2010, Endocrinol Metab Clin North Am 39, 655-667; Herring 등, 2016, Diabetes Care 39: 1230-1240; Shapiro 등, 2017, Nat. Rev. Endocrinol. 13: 268-277; Pepper 등, 2018, Curr. Opin Organ Transplant. 23: 428-439; LaBlanche 등, 2018, Lancet Diabetes Endocrinol. 6: 527-537; Foster 등, 2018, Diabetes Care 41: 1001-1008; Rickels & Robertson, 2019, Endocrin. Rev. 40: 631-668)을 참고한다.
전신 수준에서 면역억제 약물의 투여를 피하기 위해, 섬 동종이식편은 세포-세포 접촉 및 세포독성 분자의 확산을 방지하면서 산소, 글루코스 및 인슐린의 확산을 허용하는 반투과성 중합체 캡슐로 코팅함으로써 면역보호될 수 있고, 이는 그렇지 않으면 이식편에 대한 면역 반응 및 숙주에 의한 그 궁극적 거부를 촉발할 것이다(de Vos 등, 2010, Adv Exp Med Biol 670, 38-53; Desai & Shea, 2017, Nat Rev Drug Discov 16: 338-350; Vairhilingham 등, 2017, Rev Diabetes Stud 14: 51-78; Krosgren, 2017, Diabetes 66: 1748-1754; Smink 등, 2018, Am J. Tranplant 18: 2113-2118). 섬은 직경이 약 50 내지 300 μm로 변하는 불균일한 크기를 가지고 있다. 당분야에 알려진 대부분의 코팅 절차는 섬의 등각 코팅을 허용하지 않고; 캡슐 직경은 일반적으로 일정하고 섬 크기와 무관하므로, 일반적으로 더 큰 섬의 코팅을 보장하기 위해서 300 μm보다 크다(Teramura & Iwata, 2010, Adv Drug Deliv Rev 62, 827-840). 과량의 무세포 코팅 물질로 인해, 섬 임플란트의 총 용량이 크게 증가되어 적절한 크기의 이식 부위는 산소가 제대로 공급되지 않는 복강뿐이며, 이는 캡슐화된 세포의 저산소증에 기여한다. 또한, 캡슐의 두께는 코팅을 통해 산소에 대한 확산 장벽을 증가시키고, 또한 세포 저산소증을 악화시키고, 글루코스 감지 및 이에 따른 인슐린 분비의 반응성을 지연시킨다(de Groot 등, 2004, J Surg Res 121, 141-150; Buchwald 등, 2015, Biomed. Engineer. Online 14: 28; Tomei 등, 2015, Expert. Opin. Biol. Ther. 15: 1321-1326; Villa 등, 2017, Transplant. 101-1025-1035; Buchwald 등, 2018, Biotechnol. Bioeng 115; 232-245). 이러한 캡슐화 방법의 대부분은 에어젯 펌프 또는 정전기적 액적 발생장치를 통해 섬과 혼합된 코팅 물질의 액적 생성에 기반한다(Rabanel 등, 2009, Biotechnol Prog 25, 946-963).
액적 생성에 기반한 캡슐화 방법과 대조적으로, 다양한 직경의 세포 클러스터의 등각 코팅은 일부 최근 연구의 초점이 되어 왔다. 이러한 방법의 대부분은 (a) 세포 상으로의 직접적 층별 코팅 형성(예를 들어 화학 반응 또는 광중합에 의해) 또는 (b) 전형적으로 유중수 에멀젼 형성에 의한 또는 레일리-플래투 불안정성의 유체 역학 원리에 의한 유중수 제트의 분해에 의한 입자의 형성이 관여되는 순수 수력학적 절차에 기반한다(Teramura 등, Id.; Chabert & Viovy, 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105, 3191-3196). 이러한 방법을 사용하면, 물 및 유상의 특성, 두 상 사이의 표면 장력 및 두 상의 수력학적 매개변수의 비에 따라 고유하게 일정한 직경을 갖는 물 입자를 생성할 수 있다(Eggleton 등, 2001, Phys Rev Lett 87, 048302; Utada 등, 2008, Phys Rev Lett 100, 014502; Loscertales 등, 2020, Science 295, 1695-1698; Cohen 등, 2001, Science 292, 265-267). 식품 및 약학 산업에서, 이러한 방법은 수용성 약물 및 다른 물질을 나노 캡슐화하기 위해 광범위하게 활용되었으며(Loscertales 등, 상기 문헌), 아래에 설명된 대로, 일부 성공 보고와 함께, 최근에서야 마이크론 크기 단일 세포 및 세포 클러스터의 캡슐화까지 확장되었다.
Chabert와 동료들은 상기 기재된 원리에 기반하여 단일 세포를 캡슐화하고 자가 분류하기 위한 마이크로유체, 고처리량 시스템을 개발했다(Chabert. & Viovy, 상기 문헌). 그러나 이들의 시스템은 단일 세포(직경 40 μm 이하)의 캡슐화 및 분류를 위해 설계되었으며, 비-단일 세포는 알맞지 않은 전단 스트레스를 받게 될 장치의 마이크로-치수 때문에 세포 클러스터에 적용할 수 없다.
Garfinkel과 동료들은 세포 클러스터에 얇은 코팅을 생성하기 위해 외부 유상으로부터 섬-수상을 선택적으로 인출함으로써 섬을 캡슐화하는 또 다른 방법을 개발했다. 이 방법에서, 유상의 상부 상으로 수상 층의 흡입에 의해 유상 중 수상 제팅(jetting)이 달성된다. 이 설계에서, 물 인출 영역에서 난류가 생성되어 궁극적으로 두 번째 캡슐화를 필요로 하는 불완전한 코팅을 초래하고, 세포가 받는 스트레스의 양을 증가시키고 공정 수율을 감소시킨다(Wyman 등, 2007, Small 3, 683-690). 또한, 겔 중합은 광중합을 통해 달성되며, 이는 코팅된 세포의 장기 기능을 손상시킬 수 있다.
Hubbell과 동료들은 세포 표면 상으로 직접 화학 반응에 의해 코팅하여 감광제가 섬의 표면에 흡착되고 감광제가 처리된 섬이 광중합성 거대단량체의 수용액에 현탁되는 접근을 개발하였다(미국 특허 번호 6,911,227). 섬 현탁액의 광조명은 거대단량체의 중합 및 가교를 야기하여 섬의 표면에 결합된 등각 중합체 겔을 생성했다.
Hubbell과 동료들은 미국 특허 번호 10,653,816, 미국 특허 번호 10,660,987 및 국제 공개 WO2012/149496에서 등각 코팅 방법을 기재하고 있다. 예시에서 Hubbell 등은 수상이 (1) 다중-아암 PEG(10 kDa 8 아암 75~90% 기능화 PEG-말레이미드(PEG-MAL) 또는 PEG-비닐 설폰(PEG-VS)), 완전한 PEG 겔화를 달성하기 위한 과량의 가교제(디티오트레이톨 또는 2 kDa PEG-디티올 3~4 대 1 몰비) 및 점도 향상제(예를 들어 알기네이트, 양친매성 자가 조립 중합체 또는 펩티드 등)로 이루어져 있음을 개시한다. 그러나 가교제 및 점도 향상제를 포함하려면 수상의 pH를 3.5~6으로 유지해야 하며(특정 하이드로겔 조성에 따름), 다중-아암 PEG 및 티올화 가교제 사이에서 발생하는 마이클 유형 반응의 높은 반응성으로 인해 캡슐화 챔버에서 수상 제팅 및 분해의 하류에서 발생하는, 코팅 전 수상의 조기 겔화를 방지하기 위해 공정을 15분 이내에 실행해야 한다. 이 낮은 pH는 장기 세포 기능성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 기본 중합체 및 가교제를 사전 혼합할 때 발생하는 빠른 겔화 반응은 전체 공정 처리량을 제한하고 공정을 확장하려는 시도를 복잡하게 만든다. 마지막으로, 점도 향상제의 포함은 코팅의 면역단리 특성 및 생체적합성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 문헌(Manzoli 등, Am. J. Transplant, 18(3):590-603 (2018))을 참고한다.
상기의 관점에서, 세포 기능성 또는 생체적합성을 손상시키지 않으면서 세포 및 세포 클러스터를 등각 코팅하는 효율적인 고수율 방법이 당분야에서 여전히 요구되고 있다.
척추동물, 보다 구체적으로 포유동물, 특히 인간으로부터 단리된 생체물질, 특히 세포, 특히 줄기 세포 유래 인슐린-분비 세포 및 베타 세포-함유 랑게르한스 섬을 등각 코팅하기 위한 시약 및 방법뿐만 아니라 등각 코팅 장치가 본원에 제공된다. 생체물질, 특히 세포 및/또는 세포 클러스터, 보다 구체적으로 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 본원에 개시된 바와 같이 중성 pH(예를 들어, pH 약 6~약 7.4)에서 코팅되고 유지된다. 관련 출원에 제시된 시약, 기구 및 방법에 관하여 시약, 기구 및 방법에 대한 추가 변형이 본원에 제시된다.
따라서, 제1 측면에서, 본 개시내용은 다음 단계를 포함하는, 코팅 물질로 생체물질을 등각 코팅하는 방법을 제공한다:
(a) 유상 내 수성상의 적하에서 제팅으로의 전이 및 유동 신장을 허용하도록 구성된 코팅 장치에서 동축 유상 내에 수성상을 주입하는 단계;
(b) 생체물질 및 코팅 물질을 수성상에 첨가하는 단계로서, 상기 단계 (b)의 코팅 물질은 점도 향상제를 포함하지 않고; 수성상은 pH 약 6 내지 약 7.4인, 단계;
(c) 수성상 제트가 입자로 분해되도록 하는 단계; 및
(d) 수성상 제트의 입자로의 분해 하류에 코팅 물질의 성분을 첨가하는 단계로서, 성분은 코팅 물질의 중합을 촉진하거나 촉매하는 겔화 에멀젼이고; 이에 따라 등각 코팅된 생체물질을 생성하는, 단계.
일부 실시양태에서, 방법은 코팅 장치의 유출물(즉, 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질)을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 상기 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 생체물질이 없는 코팅 물질로부터 등각 코팅된 생체물질을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제는 (e) 생성 혼합물(즉, 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질, 유상 및 겔화 에멀젼(행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 미네랄 오일 중 10% 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)의 용액 포함))을 교반하면서 상기 방법에 제시된 단계 (d)로부터의 산물을 미네랄 오일에 붓는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제는 (f) 단계 (e)에서의 생성 산물(즉, 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질, 유상, 장치로부터 나오는 겔화 에멀젼(행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 미네랄 오일 중 10%의 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT) 용액 포함), 및 미네랄 오일)에 행크 균형 염 용액(HBSS)을 첨가하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 단계 (f)로부터의 산물은 원심분리되고 HBSS로 세척된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 원심분리 및 행크 균형 염 용액(HBSS)으로의 세척 후, 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질은 PEG디티올 용액과 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 제외되는 점도 향상제는 알기네이트와 같은 다당류, 탈세포화된 조직, PEG 기반 나노물질 어셈블리, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 키토산, 젤라 검, 잔탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 콜라겐, 및 알부민으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 유상 내 수성상의 적하에서 제팅으로의 전이 및 유동 신장을 허용하도록 구성된 코팅 장치에서 동축 유상 내에 수상을 주입하는 단계; (b) 생체물질 및 코팅 물질을 수상에 첨가하는 단계로서, 코팅 물질의 중합은 수상 제트의 입자로의 분해 하류에서 일어나, 코팅 물질로 생체물질의 등각 코팅을 생성하는, 단계; (c) 수상 제트의 입자로의 분해 하류에 코팅 물질의 성분을 첨가하는 단계로서, 상기 성분은 코팅 물질의 중합을 촉진/촉매하는, 단계; (d) 선택적으로 코팅 장치의 유출물을 수집하는 단계; e) 선택적으로 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질을 유상으로부터 정제하는 단계; 및 (f) 선택적으로 등각 코팅된 생체물질을 생체물질이 없는 코팅 물질과 분리하는 단계를 포함하는, 코팅 물질로 생체물질을 등각 코팅하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(N-비닐 피롤리디논)(PVP), 폴리에틸 옥사졸린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리틸옥사졸린(PEOX), 폴리(아미노산), 이의 유도체 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(N-비닐 피롤리디논)(PVP), 폴리에틸 옥사졸린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리틸옥사졸린(PEOX) 및/또는 폴리(아미노산) 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트, PEG-비닐 설폰, PEG-티올, 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 특정 종의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트, 또는 PEG-비닐 설폰을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성상은 PEG디티올로 최소 가교된(5~50%) 다중-아암 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG 디티올로 최소 가교된(1~30%) 다중-아암 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 5~10% PEG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성상은 약 pH 6~7.4의 무혈청 배지; 또는 약 pH 6~7.4의 행크 균형 염 용액(HBSS)을 포함하고; 구체적으로, 수성상의 pH는 약 pH 6~7.4에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 수성상은 pH 6~7.4의 무혈청 배지; 또는 pH 6~7.4의 행크 균형 염 용액(HBSS)을 포함하고; 구체적으로, 수성상의 pH는 pH 6~7.4에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 수상은 pH 약 6 내지 약 7.4이다. 일부 실시양태에서, 수상은 pH 6 내지 7.4이다.
일부 실시양태에서, 생체물질은 세포, 세포 클러스터, 생체물질 코팅 세포 또는 세포-클러스터, 세포내 소기관, 생물학적 분자, 비-생물학적 약물, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포, 세포 클러스터, 생체물질 코팅 세포 또는 세포-클러스터, 세포내 소기관, 생물학적 분자 및 비-생물학적 약물 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포 또는 세포 클러스터, 보다 구체적으로 섬 세포 또는 이의 세포 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포 또는 세포 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수상은 약 100,000,000~약 200,000,000개 세포/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수상은 약 200,000,000개 세포/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수상은 약 50,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수상은 약 100,000개 세포 클러스터/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수상은 500~750,000개 세포 및/또는 세포 클러스터/mL, 특히 섬 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 약 100,000,000~약 200,000,000개 세포/mL 및/또는 약 50,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 약 100,000,000 내지 약 200,000,000개 섬 세포/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 약 50,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성상은 약 2,500~250,000개 섬 세포 및/또는 세포 클러스터/mL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수성상은 티올화 시약, 환원 시약, 계면활성제, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법의 실시에서 사용되는 수성상은 선택적으로 티올화 시약, 환원 시약 및/또는 계면활성제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 또는 폴리(에틸렌 글리콜-bl-프로필렌 설피드), 보다 특히 2% 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체이다. 일부 실시양태에서, 티올화 또는 환원 시약은 디티오트레이톨(DTT) 또는 PEG디티올이다. 일부 실시양태에서, 수성 중 티올화 또는 환원 시약은 0.01~0.62% 디티오트레이톨(DTT)이다. 일부 실시양태에서, 수성상 중 티올화 또는 환원 시약은 0.01~3.1% PEG디티올이다.
일부 실시양태에서, 겔화 에멀젼은 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 10% v/v 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 유상은 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 10% 소르비탄 모노 올레에이트가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함하고, 상기 유상은 선택적으로 트리에탄올아민을 포함한다. 트리에탄올아민-포함 실시양태에서, 유상은 0.01~0.2% 트리에탄올아민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 수성상의 점도보다 적어도 2.5배 더 큰 점도를 갖는 미네랄 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상의 점도는 약 1,300 cP이다.
일부 실시양태에서, 수성상 제트의 입자로의 분해 하류에 첨가되는 코팅 생체물질의 성분(겔화 에멀젼)이 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 10% 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)의 용액인 방법이 본원에 제공된다.
제2 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 의해 등각 코팅된 생체물질을 제공한다.
제3 측면에서, 본 개시내용은 본 발명의 방법에 따라 생성된 등각 코팅된 생체물질을 환자에게 임플란트하는 단계를 포함하는, 환자의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 질환은 상기 등각 코팅된 생체물질은 췌장 섬 세포 및 세포 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장애는 당뇨병이다.
본원에 제공된 방법은 수성상 제트의 입자로의 분해 하류의 코팅된 생체물질을 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 중 디티오트레이톨(DTT) 및 행크 균형 염 용액(HBSS)의 에멀젼과 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 3D-인쇄 장치는 겔화 에멀젼을 코팅된 생체물질과 동축으로 분배하기 위해 캡슐화 챔버에 연결된다. 특정 실시양태에서, 3D-인쇄 장치는 DTT/HBSS/PPG 겔화 에멀젼을 코팅된 생체물질과 동축으로 분배하기 위해 캡슐화 챔버에 연결된다.
본 개시내용의 방법은 유리하게 그리고 선택적으로 코팅된 생체물질의 정제를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제는 교반하면서 코팅 산물로부터의 산물을 미네랄 오일에 붓는 것에 의해 수행된다. 제공된 방법의 이러한 정제 단계의 특정 실시양태에서, 교반하면서 미네랄 오일로 정제하는 동안, 에멀젼을 계속 교반하면서 행크 균형 염 용액(HBSS)이 첨가된다. 추가 실시양태에서, 미네랄 오일 및 행크 균형 염 용액(HBSS)으로 정제한 후, 산물은 원심분리되고 HBSS로 세척된다. 다른 실시양태에서, 정제 및 행크 균형 염 용액(HBSS)으로 세척한 후, 코팅된 생체물질은 PEG디티올 용액과 인큐베이션된다.
제4 측면에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는 등각 코팅 장치를 제공한다:
(1) 캡슐화 챔버로서, 다음:
(a) 하우징 부분의 제1 단부에서 제1 입구를 통해 카테터에 커플링되고 제1 펌프에 연결된 하우징 부분;
(b) 하우징 부분의 제2 단부의 내부 표면과 맞물리도록 구성된 제1 단부를 포함하는 부착 부분; 및
(c) 부착 부분의 제2 단부의 외부 표면과 맞물리도록 구성된 제1 단부, 코팅하도록 구성된 챔버, 제2 펌프에 커플링된 제2 입구, 및 코팅 부분의 제2 단부를 포함하는 코팅 부분;
을 포함하고, 제1 펌프에 연결된 카테터는 코팅 물질 및 코팅될 생체물질을 수성상에서 하우징 부분의 내부쪽 제1 입구에 주입하도록 구성되고, 수성상은 경계 포함 6 내지 7.4의 pH 수준을 포함하고; 주입된 코팅 물질은 점도 향상제를 포함하지 않으며;
제2 펌프는 계면활성제를 포함하는 유상을 코팅 부분의 외부쪽 제2 입구에 주입하도록 구성되고, 유상의 주입은 내부 수성상과 동축으로 그리고 외부로 흐르도록 구성되는, 챔버;
(2) 코팅 부분의 제2 단부에 커플링된 모세관으로서, 수성상 유동이 외부 유상과 접촉하고 외부 유상 내에서 신장되어 코팅 부분으로부터 모세관을 통해 동축으로 흐르도록 구성된 2상 유체를 형성하는 지점의 하류에 있는, 모세관, 및
(3) 모세관에 커플링되고 모세관과 동축으로 겔화 에멀젼을 주입하도록 구성된 제3 펌프로서, 에멀젼은 수성상의 중합을 위한 촉매를 포함하는, 펌프.
일부 실시양태에서, 코팅 부분의 제1 단부는 부착 부분의 제2 단부를 실질적으로 둘러싸서 챔버를 형성하고, 수성상 유동은 유상과 접촉하여 2상 유체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 캡슐화 챔버는 2상 유체가 모세관으로 흐르도록 구성된 출구 노즐의 테이퍼각을 포함하는 테이퍼형 개구를 포함하고, 제2 입구는 테이퍼각으로 챔버와 커플링된다.
일부 실시양태에서, 제1 펌프는 정밀 유동 주사기 펌프이다.
일부 실시양태에서, 제2 펌프는 제1 연동 펌프이다.
일부 실시양태에서, 제3 펌프는 제2 연동 펌프이다.
일부 실시양태에서, 3개의 부품의 조립에 의해 형성된 캡슐화 챔버를 포함하는 등각 코팅 장치가 본원에 제공된다. 정밀 유동 주사기 펌프에 연결된 카테터는 코팅 물질 및 코팅될 생체물질을 캡슐화 챔버(내부상)의 제1 입구에 주입하도록 구성되며, 이 수성상은 경계 포함 6 내지 7.4의 pH 수준을 포함한다. 제1 연동 펌프는 계면활성제를 함유하는 유상을 캡슐화 챔버의 제2 입구에 주입하도록 구성되며, 유상(외부상)의 주입은 내부 수성상으로 동축으로 흐르도록 구성된다. 모세관은 캡슐화 챔버의 단부에 커플링되며, 모세관은 내부 수성상 유동이 외부 유상(2상 유체) 내에서 신장되어 2상 유체가 캡슐화 챔버로부터 모세관으로 흐르도록 구성되는 지점의 하류에 있고, 내부 수성상(코팅 물질 및 코팅될 생체물질을 포함함) 및 외부 유상은 모세관을 통해 동축으로 흐르도록 구성된다. 장치는 겔화 에멀젼을 모세관과 동축으로 주입하도록 구성된 제2 연동 펌프를 추가로 포함하고, 에멀젼은 코팅 물질의 중합을 위한 촉매를 포함하고, 에멀젼은 코팅 물질 및 코팅될 생체물질과 동축으로 접촉하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 등각 코팅 장치는 장치로부터 공기를 방출하기 위한 출구를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 부분은 장치로부터 공기를 방출하기 위한 출구를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공기를 방출하기 위한 출구는 장치 내로의 수상 입구의 상류에 배치된다. 공기 방출구는 코팅 공정 동안 폐쇄된다.
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도 1. 등각 코팅(CC) 겔의 생체적합성을 개선하기 위해 점도 향상제(알기네이트, 매트리겔 또는 양친매성 자가 조립 펩티드)의 제거를 허용하고 NHP 섬의 기능성을 최대화하기 위해 생리적 pH에서의 캡슐화를 허용하는 등각 코팅 변형의 개략도. 선행 출원(이하, "저 pH 방법")에 제시된 바와 같이, 수성상은 캡슐이 형성되기 전(수성상 제트의 분해 하류) PEG 가교 및 겔 형성을 방지하기 위해 pH 6 미만에서 다중-아암 PEG, 가교제(PEG디티올 또는 디티오트레이톨, DTT) 및 점도 향상제로 이루어진다. 본원에 제시된 방법은 생리적 pH에서 수행되며, 수성상은 다중-아암 PEG만으로 이루어지고, 이는 생리적 pH(7.4)에서 최적 점도에 도달하기 위해 PEG-SH와 1~30%로 가교된다. 캡슐이 형성된 후 100% PEG 가교 및 겔 형성이 달성되며, 행크 균형 염 용액(DTT/HBSS) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 중 DTT의 에멀젼은 수성상 제트의 분해 하류로 그리고 장치의 유출과 동축으로 흐른다. 정제는 선행 출원에서와 같이 헥산과 같은 유기 용매로 추출하는 것보다 교반 및 원심분리하면서 경질 미네랄 오일 및 HBSS로 희석하여 달성된다. 따라서, 혁신은 (i) 임의의 첨가제 없이 순수한 PEG 및 섬만을 함유하는 수성상의 조성, (ii) 장치로의 겔화 에멀젼 분배에 의한 캡슐 형성 하류 PEG 가교제의 도입, (iii) 유기 용매를 포함하지 않는 캡슐 정제 방법에 의존한다.
도 1a. 등각 코팅 장치 및 겔화 에멀젼 분배 장치를 포함하는 본원에 개시된 등각 코팅 기구의 개략도. 등각 코팅 장치는 다음의 3개의 상이한 부품을 조립하여 얻어진다: 패널 (ii), (iii) 및 (iv)는 50~250 μm 세포 클러스터를 코팅하기 위해 16G 정맥내 카테터와 함께 사용되는 한 버전의 등각 코팅 장치의 3개의 주요 성분의 예시이다. 이 3개 부품은 유리 모세관과 함께 조립되고 나사 결합되어 완전한 장치를 형성한다. 패널 (v)은 등각 코팅 장치의 내부 챔버의 중요한 설계 성분 및 등각인 세포 클러스터 주위 코팅을 형성하도록 하는 유체 조건을 달성하는 데 필요한 상대적 메트릭을 표시한다. 표는 50~250 μm 세포 클러스터를 코팅하기 위해 16G 정맥내 카테터와 함께 사용되는 이러한 상대적 메트릭 및 구체적 메트릭을 표시한다.
도 1b. 본원에 제시된 등각 코팅 기구의 사진.
도 1c. 본원에 개시된 3D-인쇄 겔화 에멀젼 분배 기구의 예시적인 이미지.
도 2. 등각 코팅(CC) 비인간 영장류(NHP) 섬의 시험관내 및 생체내 평가. 게잡이 원숭이의 NHP 섬은 저 pH 방법 하에 PEG/PEG-디티올(PEG-SH)/펩티드 하이드로겔로 등각 코팅(CC)되었다. 패널 a는 CC NHP 섬의 위상차 이미지를 도시하며 큰 섬은 매우 얇고 잠재적으로 불완전한 코팅을 가지고 있음을 나타내었다. 패널 b: 2.2 mM 글루코스(1시간, L1), 16.7 mM 글루코스(1시간, H), 2.2 mM 글루코스(1시간, L2) 및 25 mM KCl(1시간)을 사용한 순차적 자극에 의한 정적 글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS)에 의한 네이키드(NK) 및 CC 작은(<200 μm) 및 큰(>200 μm) NHP 섬의 기능성은 작은 섬(화살표)의 더 높은 기능성을 그러나 네이키드 섬에 비해 CC NHP 섬의 감소된 인슐린 분비를 나타내었다. 기능성은 분비된 인슐린(왼쪽), GSIS 지수(16.7 mM 대 2.2 mM 글루코스 자극 동안 인슐린 분비의 비: H 나누기 L1) 및 GSIS 델타(16.7 mM 및 2.2 mM 글루코스 자극 동안 인슐린 분비의 차이: H 빼기 L1)로 평가되었다. 패널 c: 동적 글루코스-자극 인슐린 방출(관류)에 의한 CC NHP 섬의 기능성은 네이키드 섬과 비교하여 CC NHP 섬에 대해 감소된 인슐린 분비를, 그러나 2.6의 자극 지수를 나타내었으며; 이는 기능성을 표시한다. 패널 d~g: 혈당(패널 d, f, g) 및 섬 이식 7일 후 혈청 내 무작위 인간 c-펩티드(패널 e)로서의, 당뇨병 NSG 마우스 또는 NODscid 마우스의 부고환 지방 패드(EFP) 또는 신장 캡슐(KD)에 2,000 또는 4,000개 IEQ/마우스의 이식 후 네이키드 섬과 비교한 CC NHP 섬의 생체내 기능성. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 NHP 섬에서 가져온 것이다: 배치 #1(패널 d, e); 배치 #2(패널 f); 배치 #3(패널 g).
도 3. 인슐린-분비 췌장 섬(핵, 살아있는 세포 세포질 및 죽은 세포 핵은 살아있는/죽은 검정을 사용하여 염색됨)의 생활성에 대한 코팅 용액의 pH의 효과는 pH가 감소함에 따라 감소된 생활성을 나타냄.
도 4. 당뇨병 NHP의 망 파우치에서 CC NHP 섬(저 pH 방법, PEG/PEG-SH/펩티드 하이드로겔)의 평가. 패널 a는 생물학적 스캐폴드를 사용한 게잡이 원숭이의 망 표면 상에 CC NHP 섬의 고정화를 위한 복강경 절차의 타당성을 나타낸다. 패널 b는 CC NHP 섬의 최소 기능을 나타내는 CC NHP 섬 수신체의 외인성 인슐린 요구량(EIR, 점선), 혈당(점) 및 C-펩티드를 나타낸다. 패널 c 및 d는 T 세포(CD3, 녹색 표지)로부터의 섬 생존(인슐린) 및 캡슐 면역단리에 대해(패널 d; 인슐린에 대한 염색을 가리키는 화살표(빨간색 표지)) 및 생체적합성(패널 c, 다핵 거대 세포를 가리키는 화살표)에 대해 분석된 체외이식된 CC NHP 망 이식편의 조직학적 평가를 나타낸다. NHP의 망 부위에 있는 캡슐에 대한 염증 반응은 광범위하고 만성이며 활성이었다.
도 5. 시험관내 및 생체내 인간 섬을 사용한 본원에 개시된 등각 코팅 방법(순수한 PEG 및 생리적 pH)의 평가. 당뇨병 면역결핍 NSG(NOD scid 감마 마우스) 마우스의 지방 패드에서 4,000개 IEQ/마우스의 네이키드 또는 CC 인간 섬 이식 후 코팅 품질은 위상차 현미경(패널 a)에 의해 평가되고; 살아있는/죽은 염색 및 공초점 현미경측정에 의한 코팅된 섬의 생활성(패널 b); 3개의 상이한 공여체 및 2개의 캡슐화 배치(배치 #1: c, d; 배치 #2: e, f)로부터의 섬에 대한 정적(패널 c, e) 및 동적(관류, 패널 d, f) 글루코스-자극 인슐린 분비에 의한 시험관내 기능; 혈당(패널 g), 복강내 글루코스 시험 동안의 내당능(패널 h) 및 자극된 인간 c-펩티드(패널 i)에 의한 생체내 기능이 평가되었다.
도 6. 공동-자극 차단을 갖는 당뇨병 NHP 섬의 점액낭에서 본원에 제시된 생리적 pH 방법을 사용한 CC 인간 섬의 이식.
(패널 a) 당뇨병 게잡이 원숭이의 점액낭에서 CC NHP 섬의 임플란트를 위한 복강경 절차의 타당성. (패널 b, 도 6c) 감소된 혈당 수준으로서 이식된 CC 인간 섬의 최소 기능을 실증하는 CC NHP 섬 수신체의 외인성 인슐린 요구량(EIR, 실선), 혈당(점), c-펩티드 및 요약 표(패널 c). (패널 d, 패널 e, 패널 f) 생체적합성 평가(패널 d, e) 및 이식편 재혈관화(패널 e, CD31: 혈관; aSMA: 섬유증 및/또는 혈관 성숙도)를 위해 H&E 염색으로 분석된 체외이식된 CC NHP 부여물의 조직학적 평가. NHP 점액낭의 캡슐에 대한 염증 반응은 만성이고 활성이었지만 경도였다.
도 7. 당뇨병, 면역적격 루이스 래트 망으로의 동계 루이스 래트 섬의 이식. 패널 a: 네이키드(실선, 점 마커) 및 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) 루이스 래트 섬의 수신체의 혈당. (패널 b) 네이키드(실선, 점 마커) 및 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) 루이스 래트 섬의 수신체의 수술 후 날짜(POD) 30의 복강내 내당능 시험(IPGTT) 및 (패널 c) IPGTT 곡선 하 면적. (패널 d) 네이키드(실선, 점 마커) 및 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) 루이스 래트 섬의 수신체의 IPGTT 동안 공복 및 자극 C 펩티드. 통계 분석으로 CC 래트 섬 동계 이식편의 생체내 기능성이 래트 망에서의 네이키드 이식편과 필적함이 확인된다.
도 8. 동종 MIN6 인슐린종 세포 클러스터의 자연적 당뇨병 NOD 마우스로의 이식. (패널 a) 네이키드(상단 행) 및 등각 코팅된(중간 및 하단 행) MIN6 클러스터의 위상차 이미지. (패널 b) 3차원으로 캡슐 완전성을 나타내는 항-PEG 염색 및 인접한 수직 투영으로의 등각 코팅된 MIN6 클러스터의 공초점 현미경사진. (패널 c) 네이키드(실선, 점 마커) 및 CC 클러스터의 개선된 생존을 나타내는 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) MIN6 클러스터의 수신체의 사망률. (패널 d) 네이키드 및 등각 코팅된 MIN6 클러스터의 수신체의 무작위 비-공복 C 펩티드는 CC에서 c-펩티드의 지속성을 나타내지만 네이키드 클러스터에서는 나타내지 않음. (패널 e) CC 캡슐 내의 세포 클러스터의 생존에 대한 H&E 염색 및 생체적합성 평가에 의해 분석된 체외이식된 CC MIN6 클러스터 이식편의 조직학적 평가는 CC 캡슐이 동종 거부 및 자가면역 모두의 존재 하에 동종 세포 클러스터에 대해 면역단리를 제공함을 실증함.
도 1. 등각 코팅(CC) 겔의 생체적합성을 개선하기 위해 점도 향상제(알기네이트, 매트리겔 또는 양친매성 자가 조립 펩티드)의 제거를 허용하고 NHP 섬의 기능성을 최대화하기 위해 생리적 pH에서의 캡슐화를 허용하는 등각 코팅 변형의 개략도. 선행 출원(이하, "저 pH 방법")에 제시된 바와 같이, 수성상은 캡슐이 형성되기 전(수성상 제트의 분해 하류) PEG 가교 및 겔 형성을 방지하기 위해 pH 6 미만에서 다중-아암 PEG, 가교제(PEG디티올 또는 디티오트레이톨, DTT) 및 점도 향상제로 이루어진다. 본원에 제시된 방법은 생리적 pH에서 수행되며, 수성상은 다중-아암 PEG만으로 이루어지고, 이는 생리적 pH(7.4)에서 최적 점도에 도달하기 위해 PEG-SH와 1~30%로 가교된다. 캡슐이 형성된 후 100% PEG 가교 및 겔 형성이 달성되며, 행크 균형 염 용액(DTT/HBSS) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 중 DTT의 에멀젼은 수성상 제트의 분해 하류로 그리고 장치의 유출과 동축으로 흐른다. 정제는 선행 출원에서와 같이 헥산과 같은 유기 용매로 추출하는 것보다 교반 및 원심분리하면서 경질 미네랄 오일 및 HBSS로 희석하여 달성된다. 따라서, 혁신은 (i) 임의의 첨가제 없이 순수한 PEG 및 섬만을 함유하는 수성상의 조성, (ii) 장치로의 겔화 에멀젼 분배에 의한 캡슐 형성 하류 PEG 가교제의 도입, (iii) 유기 용매를 포함하지 않는 캡슐 정제 방법에 의존한다.
도 1a. 등각 코팅 장치 및 겔화 에멀젼 분배 장치를 포함하는 본원에 개시된 등각 코팅 기구의 개략도. 등각 코팅 장치는 다음의 3개의 상이한 부품을 조립하여 얻어진다: 패널 (ii), (iii) 및 (iv)는 50~250 μm 세포 클러스터를 코팅하기 위해 16G 정맥내 카테터와 함께 사용되는 한 버전의 등각 코팅 장치의 3개의 주요 성분의 예시이다. 이 3개 부품은 유리 모세관과 함께 조립되고 나사 결합되어 완전한 장치를 형성한다. 패널 (v)은 등각 코팅 장치의 내부 챔버의 중요한 설계 성분 및 등각인 세포 클러스터 주위 코팅을 형성하도록 하는 유체 조건을 달성하는 데 필요한 상대적 메트릭을 표시한다. 표는 50~250 μm 세포 클러스터를 코팅하기 위해 16G 정맥내 카테터와 함께 사용되는 이러한 상대적 메트릭 및 구체적 메트릭을 표시한다.
도 1b. 본원에 제시된 등각 코팅 기구의 사진.
도 1c. 본원에 개시된 3D-인쇄 겔화 에멀젼 분배 기구의 예시적인 이미지.
도 2. 등각 코팅(CC) 비인간 영장류(NHP) 섬의 시험관내 및 생체내 평가. 게잡이 원숭이의 NHP 섬은 저 pH 방법 하에 PEG/PEG-디티올(PEG-SH)/펩티드 하이드로겔로 등각 코팅(CC)되었다. 패널 a는 CC NHP 섬의 위상차 이미지를 도시하며 큰 섬은 매우 얇고 잠재적으로 불완전한 코팅을 가지고 있음을 나타내었다. 패널 b: 2.2 mM 글루코스(1시간, L1), 16.7 mM 글루코스(1시간, H), 2.2 mM 글루코스(1시간, L2) 및 25 mM KCl(1시간)을 사용한 순차적 자극에 의한 정적 글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS)에 의한 네이키드(NK) 및 CC 작은(<200 μm) 및 큰(>200 μm) NHP 섬의 기능성은 작은 섬(화살표)의 더 높은 기능성을 그러나 네이키드 섬에 비해 CC NHP 섬의 감소된 인슐린 분비를 나타내었다. 기능성은 분비된 인슐린(왼쪽), GSIS 지수(16.7 mM 대 2.2 mM 글루코스 자극 동안 인슐린 분비의 비: H 나누기 L1) 및 GSIS 델타(16.7 mM 및 2.2 mM 글루코스 자극 동안 인슐린 분비의 차이: H 빼기 L1)로 평가되었다. 패널 c: 동적 글루코스-자극 인슐린 방출(관류)에 의한 CC NHP 섬의 기능성은 네이키드 섬과 비교하여 CC NHP 섬에 대해 감소된 인슐린 분비를, 그러나 2.6의 자극 지수를 나타내었으며; 이는 기능성을 표시한다. 패널 d~g: 혈당(패널 d, f, g) 및 섬 이식 7일 후 혈청 내 무작위 인간 c-펩티드(패널 e)로서의, 당뇨병 NSG 마우스 또는 NODscid 마우스의 부고환 지방 패드(EFP) 또는 신장 캡슐(KD)에 2,000 또는 4,000개 IEQ/마우스의 이식 후 네이키드 섬과 비교한 CC NHP 섬의 생체내 기능성. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 NHP 섬에서 가져온 것이다: 배치 #1(패널 d, e); 배치 #2(패널 f); 배치 #3(패널 g).
도 3. 인슐린-분비 췌장 섬(핵, 살아있는 세포 세포질 및 죽은 세포 핵은 살아있는/죽은 검정을 사용하여 염색됨)의 생활성에 대한 코팅 용액의 pH의 효과는 pH가 감소함에 따라 감소된 생활성을 나타냄.
도 4. 당뇨병 NHP의 망 파우치에서 CC NHP 섬(저 pH 방법, PEG/PEG-SH/펩티드 하이드로겔)의 평가. 패널 a는 생물학적 스캐폴드를 사용한 게잡이 원숭이의 망 표면 상에 CC NHP 섬의 고정화를 위한 복강경 절차의 타당성을 나타낸다. 패널 b는 CC NHP 섬의 최소 기능을 나타내는 CC NHP 섬 수신체의 외인성 인슐린 요구량(EIR, 점선), 혈당(점) 및 C-펩티드를 나타낸다. 패널 c 및 d는 T 세포(CD3, 녹색 표지)로부터의 섬 생존(인슐린) 및 캡슐 면역단리에 대해(패널 d; 인슐린에 대한 염색을 가리키는 화살표(빨간색 표지)) 및 생체적합성(패널 c, 다핵 거대 세포를 가리키는 화살표)에 대해 분석된 체외이식된 CC NHP 망 이식편의 조직학적 평가를 나타낸다. NHP의 망 부위에 있는 캡슐에 대한 염증 반응은 광범위하고 만성이며 활성이었다.
도 5. 시험관내 및 생체내 인간 섬을 사용한 본원에 개시된 등각 코팅 방법(순수한 PEG 및 생리적 pH)의 평가. 당뇨병 면역결핍 NSG(NOD scid 감마 마우스) 마우스의 지방 패드에서 4,000개 IEQ/마우스의 네이키드 또는 CC 인간 섬 이식 후 코팅 품질은 위상차 현미경(패널 a)에 의해 평가되고; 살아있는/죽은 염색 및 공초점 현미경측정에 의한 코팅된 섬의 생활성(패널 b); 3개의 상이한 공여체 및 2개의 캡슐화 배치(배치 #1: c, d; 배치 #2: e, f)로부터의 섬에 대한 정적(패널 c, e) 및 동적(관류, 패널 d, f) 글루코스-자극 인슐린 분비에 의한 시험관내 기능; 혈당(패널 g), 복강내 글루코스 시험 동안의 내당능(패널 h) 및 자극된 인간 c-펩티드(패널 i)에 의한 생체내 기능이 평가되었다.
도 6. 공동-자극 차단을 갖는 당뇨병 NHP 섬의 점액낭에서 본원에 제시된 생리적 pH 방법을 사용한 CC 인간 섬의 이식.
(패널 a) 당뇨병 게잡이 원숭이의 점액낭에서 CC NHP 섬의 임플란트를 위한 복강경 절차의 타당성. (패널 b, 도 6c) 감소된 혈당 수준으로서 이식된 CC 인간 섬의 최소 기능을 실증하는 CC NHP 섬 수신체의 외인성 인슐린 요구량(EIR, 실선), 혈당(점), c-펩티드 및 요약 표(패널 c). (패널 d, 패널 e, 패널 f) 생체적합성 평가(패널 d, e) 및 이식편 재혈관화(패널 e, CD31: 혈관; aSMA: 섬유증 및/또는 혈관 성숙도)를 위해 H&E 염색으로 분석된 체외이식된 CC NHP 부여물의 조직학적 평가. NHP 점액낭의 캡슐에 대한 염증 반응은 만성이고 활성이었지만 경도였다.
도 7. 당뇨병, 면역적격 루이스 래트 망으로의 동계 루이스 래트 섬의 이식. 패널 a: 네이키드(실선, 점 마커) 및 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) 루이스 래트 섬의 수신체의 혈당. (패널 b) 네이키드(실선, 점 마커) 및 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) 루이스 래트 섬의 수신체의 수술 후 날짜(POD) 30의 복강내 내당능 시험(IPGTT) 및 (패널 c) IPGTT 곡선 하 면적. (패널 d) 네이키드(실선, 점 마커) 및 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) 루이스 래트 섬의 수신체의 IPGTT 동안 공복 및 자극 C 펩티드. 통계 분석으로 CC 래트 섬 동계 이식편의 생체내 기능성이 래트 망에서의 네이키드 이식편과 필적함이 확인된다.
도 8. 동종 MIN6 인슐린종 세포 클러스터의 자연적 당뇨병 NOD 마우스로의 이식. (패널 a) 네이키드(상단 행) 및 등각 코팅된(중간 및 하단 행) MIN6 클러스터의 위상차 이미지. (패널 b) 3차원으로 캡슐 완전성을 나타내는 항-PEG 염색 및 인접한 수직 투영으로의 등각 코팅된 MIN6 클러스터의 공초점 현미경사진. (패널 c) 네이키드(실선, 점 마커) 및 CC 클러스터의 개선된 생존을 나타내는 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) MIN6 클러스터의 수신체의 사망률. (패널 d) 네이키드 및 등각 코팅된 MIN6 클러스터의 수신체의 무작위 비-공복 C 펩티드는 CC에서 c-펩티드의 지속성을 나타내지만 네이키드 클러스터에서는 나타내지 않음. (패널 e) CC 캡슐 내의 세포 클러스터의 생존에 대한 H&E 염색 및 생체적합성 평가에 의해 분석된 체외이식된 CC MIN6 클러스터 이식편의 조직학적 평가는 CC 캡슐이 동종 거부 및 자가면역 모두의 존재 하에 동종 세포 클러스터에 대해 면역단리를 제공함을 실증함.
정의 및 일반 기법
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 생화학, 면역학, 미생물학, 유전학, 및 본원에 기재된 관련 분야에 관해 사용되는 명명법 및 기술은 당분야의 기술 범위 내에 있다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다.
본 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 기사 및 다른 간행물을 참조하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 임의의 포함된 참고문헌 및 본 명세서 사이에 상충이 있는 경우 명세서가 우선한다. 또한, 선행 기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 제외될 수 있다. 이러한 실시양태는 당업자에게 알려진 것으로 간주되므로, 이들은 본원에서 제외가 명시적으로 제시되지 않더라도 제외될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 선행 기술의 존재와 관련이 있는지 여부에 관계없이 어떤 이유로든 임의의 청구항으로부터 제외될 수 있다.
용어 "본원"은 전체 출원서를 의미한다.
명시적으로 부인하거나 부적절하지 않는 한, 본 개시내용의 상이한 측면 및 명세서의 상이한 부분(실시예에서만 기재된 실시양태 포함) 하에 기재된 것들을 포함하여, 본원에 기재된 임의의 실시양태가 본 발명의 하나 이상의 다른 실시양태와 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 실시양태의 조합은 다중 종속항을 통해 청구된 특정 조합으로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 나열된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 설명 용어가 또 다른 청구항에 도입되는 모든 변이, 조합 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속된 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속된 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로, 예를 들어 마쿠쉬 그룹 형식으로 표시되는 경우, 요소의 각 하위그룹도 개시되며 임의의 요소(들)가 그룹으로부터 제거될 수 있다.
본 명세서 및 실시양태에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 정수(또는 성분) 또는 정수들(또는 성분들)의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수(또는 성분) 또는 정수들(또는 성분들)의 그룹이 제외되지 않음을 시사하는 것으로 이해될 것이다.
명세서에 걸쳐, 조성물 또는 장치가 특정 성분을 갖는, 함유하는, 포함하는(including), 포함하는(comprising)(또는 이의 변형) 것으로 기재되는 경우, 조성물은 또한 인용된 성분으로 본질적으로 구성될 수 있거나 이로 구성될 수 있는 것으로 고려된다. 유사하게, 방법 또는 공정이 특정 공정 단계를 갖는, 함유하는, 포함하는, 또는 포함하는 것으로 기재되는 경우, 공정은 또한 인용된 공정 단계로 본질적으로 구성되거나 이로 구성될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 조성물, 장치 및 방법이 작동 가능한 상태로 유지되는 한 특정 작업의 단계 순서 또는 수행 순서는 중요하지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 두 개 이상의 단계 또는 작업이 동시에 수행될 수 있다. 단순성을 위해, 이러한 실시양태는 본원에서 문자 그대로 구체적으로 제시되지 않았다.
용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미하기 위해 사용된다. "포함하는" 및 "포함하지만 이에 제한되지 않는"은 상호 교환적으로 사용된다. 따라서, 이러한 용어는 명시된 정수(또는 성분) 또는 정수들(또는 성분들)의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수(또는 성분) 또는 정수들(또는 성분들)의 그룹이 배제되지 않음을 시사하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다.
요소를 설명하는 맥락에서(특히 하기 청구범위의 맥락에서) 용어 하나의("a" 및 "an" 및 "the") 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에 달리 표시되지 않거나 맥락상 명확히 금기되지 않는 한, 단수 및 복수를 둘 다 커버하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "또는"은 맥락상 명확히 달리 표시하지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"예로" 또는 "예를 들어"라는 용어 다음에 나오는 임의의 예(들)는 배타적이거나 제한적임을 의미하지 않는다.
본원에서 값의 범위에 대한 인용은 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 약식 방법으로서 역할을 하기 위한 것일 뿐이며, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것과 마찬가지로 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 표시되거나 맥락상 명확히 금기되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어 "~와 같은")의 사용은 단지 실시양태를 더 잘 예시하기 위한 것이며 달리 명시되지 않는 한 청구범위의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 임의의 청구되지 않은 요소를 필수적인 것으로 표시한다고 간주되어서는 안 된다.
본원에 사용된 용어 "등각 코팅" 또는 "등각 코팅된" 및 "등각 코트"와 같은 이의 변형은 생체물질의 외부 표면을 둘러싸고 그 모양 및 크기에 따르는 코팅 물질의 균일한 층(예를 들어, 일반적으로 최대 약 100 마이크론 두께)을 지칭한다. 등각 코트는 상대적으로 단분산성이며 생체물질의 크기에 의존하지 않는다. 등각 코트는 고정되고 일정한 두께를 가지고 있다. 이것은 캡슐의 크기가 고정되고 두께가 봉입된 생체물질의 크기에 의존하는 액적 생성에 의해 수행되는 전통적 마이크로캡슐화와 다르다.
용어 "수상" 및 "수성상"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 물을 포함하고 친수성 공용매 및 수용성 물질을 추가로 포함할 수 있는 액상을 지칭한다. 수성상의 예는 물 자체, 수성 완충액, 세포 배양 배지, 펩티드, 단백질 및 탄수화물 수용액, 장기 보존 용액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "유상"은 수상 또는 수성상과 비혼화성인 액상을 의미한다. 유상의 예는 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 미네랄 오일(예를 들어 점도가 수성상의 점도보다 적어도 2.5배 더 큰 미네랄 오일, 물과 비혼화성인, 임의의 고점도(예를 들어, 1,300 cP) 액체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 수성상과 관련하여 "적하"는 수성상이 오리피스, 개구 또는 구멍을 통과하여 액적이 형성되도록 하는 공정을 지칭한다. 또한 수성상의 연속 스트림이 기계적, 초음파 또는 다른 필적하는 수단을 통해 액적으로 전환되는 공정을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, 수성상과 관련하여 "제팅"은 액체(예를 들어, 수성상)의 스트림이 고속으로 오리피스, 개구 또는 구멍 밖으로 강제되는 공정을 지칭한다. 고속은 표면 장력 차이를 상쇄할 수 있게 한다. "제팅"은 수성상 유동 직경이 주입 오리피스를 나갈 때 적어도 10배 크기만큼 감소되도록 하는 유동 신장을 지칭한다.
수성상과 관련하여 본원에 사용된 용어 "신장"은 액체(예를 들어, 수성) 스트림의 단면 직경이 감소되는 동안 그 길이가 연장되거나 신장되는 공정을 지칭한다. 신장은 적하에서 제팅으로의 전이를 허용한다.
본 개시내용은 생체물질이 대상체에게 임플란트될 때 세포 기능성을 보존하면서 면역 거부, 염증 및/또는 자가면역 파괴를 방지하기 위해 생체물질, 예를 들어 세포 및 세포 클러스터를 면역단리하기 위한 시약, 기구 및 방법에 관한 것이다.
본원에 제시된 등각 코팅 기술은 다양한 크기를 갖는 세포 클러스터(인슐린 생산 세포 및 1차 섬을 포함하여, 50~350 μm 직경)가 수 마이크론 내지 수십 마이크론 두께의 하이드로겔로 코팅되도록 허용하며, 코팅 두께는 상대적으로 단분산성이고 세포 클러스터 직경에 의존하지 않는다(Tomei 등, 2014, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 111: 10514-19). 이 기술의 중요한 발전은 (i) 코팅된 세포로의 영양소/글루코스/인슐린 수송을 최대화하여 세포 생활성을 최대화하고 글루코스 자극 인슐린 분비의 지연을 최소화하는, 캡슐 두께의 최소화(Buchwald 등, 2018, Biotechnol. Bioeng. 115: 232-245), 및 (ii) 사전 혈관화된 부위 및 국소 면역조절용 장치를 포함하여 제한된 부피만을 수용할 수 있는 국한된 부위에서의 이식을 허용하는, 캡슐화된 세포 이식편의 부피 최소화를 포함한다. 문헌(Tomei 등, 2015, Expert. Opin. Biol. Ther. 15: 1321-1326)을 참고한다.
등각 코팅은 유상으로의 수성상 주입 하류에 유동-집속 기하구조를 갖는 캡슐화 장치 내에서 코팅 용액 및 세포 클러스터를 포함하는 수성상을 유동성, 비혼화성 오일 혼합물(특히, 고점도 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 및 상업적으로 이용 가능한(Sigma Aldrich), 올레산(C18:1) ≤ 60%를 포함하고; 나머지는 주로 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3) 및 팔미트산(C16:0)인 비이온성 계면활성제인 Span80으로 제조됨)을 포함하는 더 큰(단면 직경보다 약 10배 더 큰) 챔버로 주입하여 달성된다. 이러한 기하구조는 2상 유동의 신장을 허용하며, 수성상의 점도가 충분히 높으면(Tomei 등, 2014, Proc. Nat. Acad. Sci. USA.111: 10514-10519), 각각의 이들 출원의 개시내용 전체가 참조로 포함되는(이하 "선행 출원"), 미국 특허 번호 10,653,816, 미국 특허 번호 10,660,987 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2012/035696에 제시된 바와 같이 유상 내부에서 수성상의 제팅이 발생한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제팅"은 수성상 유동 직경이 주입 오리피스를 나갈 때 적어도 10배 크기만큼 감소되도록 하는 유동 신장을 지칭한다. 수성상 제팅 후, 플래투-레일리 불안정성 현상은 수성상이 나노리터 크기의 방울로 분해되도록 유발하여 수성상에 포함된 세포 클러스터가 코팅된다. 장치에서, 캡슐화 챔버는 2상 유체가 계속 흐르는 1 mm 직경의 구멍이 있는 10 cm 길이의 유리 모세관에 연결되며; 수집 튜브는 유리 튜브의 선단부 아래에 배치되어 유동 출력물을 수집한다.
선행 출원의 예시에 제시된 바와 같이, 수상은 (1) 다중-아암 PEG(10 kDa 8 아암 75~90% 기능화된 PEG-말레이미드(PEG-MAL), 또는 PEG-비닐 설폰(PEG-VS)), 완전한 PEG 겔화를 달성하기 위한 과량의 가교제(3~4 대 1의 몰비로 디티오트레이톨 및 2 kDa PEG-디티올, 8-아암 PEG-MAL 또는 PEG-VS)로 이루어지고; 수상은 또한 수상의 충분히 높은 점도를 달성하기 위한 첨가제를 포함하였다(알기네이트, 양친매성 자가-조립 중합체 또는 펩티드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음). 선행 출원에 제시된 바와 같이, 예시에서 수상의 pH는 다중-아암 PEG 및 티올화 가교제 사이에서 발생하는 마이클 유형 반응의 높은 반응성으로 인해 캡슐화 챔버에서 수상 제팅 및 분해의 하류에서 발생하는, 코팅 전 수상의 조기 겔화를 방지하기 위해 3.5~6(특정 하이드로겔 조성에 의존함)으로 유지될 필요가 있었다. 유출물을 수집하기 위해 50 mL 원뿔형 튜브가 유리 튜브 아래에 배치되고 PPG 및 염기(트리에탄올아민)로 충전되어 수성상의 pH를 증가시키고 수집 후 및 정제 전 수성상의 겔화를 가속화했다. 정제는 헥산을 사용하여 겔화된 수성상(PEG 하이드로겔-코팅 세포 클러스터 및 빈 PEG 겔)을 추출하여 달성되었다. 선행 출원에 개시된 바와 같은 이 방법을 사용하여, 등각 코팅된 1차 섬, 줄기 세포-유래 인슐린 분비 세포, 및 인간 신장 상피 세포의 시험관내 및 생체내 기능성을 본원에 제시된 바와 같이 나타내었다. 이 등각 코팅된 세포는 면역억제가 필요 없이 당뇨병을 역전시키는 마우스에서 발견되었다. 문헌(Tomei 등, 2014, Ibid.; Manzoli 등, 2018, Ibid; Stock 등, 2020, Stem Cell Reports 14: 91-104)을 참고한다.
그러나, 캡슐화 동안 수성상에서 저 pH는 특히 비인간 영장류 섬에서, 코팅된 1차 섬 기능성(예를 들어, 생활성)을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(본원의 실시예에 나타낸 바와 같음). 또한 저 pH 방법에서 사용되는 수성상은 수성상 제팅 및 분해를 허용하는 데 필요한 점도를 달성하기 위해 PEG, 가교제 및 점도 향상 첨가제(알기네이트, 양친매성 자가 조립 중합체 또는 펩티드 등)를 모두 포함해야 한다. 동물 모델에서 코팅 하이드로겔의 문헌(Manzoli 등, 2018, Am. J. Transplant. 18: 590-603)에 나타낸 바와 같이, 일부 이러한 첨가제는 생체적합성(본원에 나타낸 바와 같음) 및 면역단리를 감소시켰다.
본원에 제시된 변형된 등각 코팅 절차는 세포 클러스터를 포함하는 수성상으로부터 하이드로겔로의 PEG 겔화(3:1 몰비의 가교제 대 다중-아암 PEG)를 달성하는 데 필요한 기본 중합체(10 kDa 8 아암 75% 기능화된 PEG-말레이미드 또는 PEG-비닐 설폰) 및 가교제의 총량(디티오트레이톨 및 2 kDa PEG디티올)의 분리를 가능하게 하였고 수성상에서 점도 증가 첨가제의 임의의 필요성을 추가 제거한다(도 1, '생리적 pH 방법'에 의해 본원에 예시된 바와 같음). 본원에 개시된 바와 같이, 하이드로겔로의 PEG 겔화를 달성한 20% mol/mol의 필요한 양의 가교제를 첨가하여 최소 가교된 다중-아암 PEG로 이루어진 수성상을 사용함으로써 기능적 등각 코팅이 달성되었다. 최소 가교된 PEG(예를 들어 1~30% 가교)는 동축 유상(폴리프로필렌 글리콜(Mn 약 4000), 10% Span80을 포함하는 PPG 또는 특히 계면 장력 감소에 관해 동등한 특성을 갖는 계면활성제로 제조됨)으로부터 수성상 제팅 및 분해를 허용하기 충분한 점도를 가져서 세포 및/또는 세포 클러스터 주위에 등각 코팅의 형성을 야기한다. 전체 PEG 가교는 캡슐화 챔버에서 수성상 제팅 및 분해의 하류에서 세포 및/또는 세포 클러스터 코팅 후 달성된다. 이것은 이제 도 1, 1a 및 1b에 나타낸 바와 같은 기구를 사용하여 HBSS-/- 중 25 mg/mL DTT(디티오트레이톨): PPG/10% Span80의 1:15(v:v)의 겔화 에멀젼을 제트 분해가 일어나는 캡슐화 챔버 부분의 하류로 흐르게 함으로써 달성된다. 선행 출원의 예시에 제시된 바와 같이, 수상 pH는 캡슐화 챔버에서 수성상 제팅 및 분해의 하류에서 발생하는 코팅 전 수성상의 조기 겔화를 방지하기 위해 산성 값으로 유지되어야 한다. 그러나, 캡슐화 동안 저 pH 수성상은 코팅된 1차 섬의 기능성을 감소시켰다(본원에서 실시예 및 특히 도 2에 의해 예시된 바와 같음). 더욱이, 선행 출원에 예시된 바와 같은 수성상은 수성상 제팅 및 분해를 허용하는 데 필요한 점도를 달성하기 위해 PEG, 가교제 및 첨가제(즉, 점도 향상제; 알기네이트, 양친매성 자가 조립 중합체 또는 펩티드 등)를 함유해야 했다. 이들 첨가제는 본원의 실시예 및 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 동물 모델에서 코팅 하이드로겔의 생체적합성 및 면역단리를 감소시켰다. 수성상 pH를 생리적 값(약 6~7.4)에 가깝게 증가시키고 임의의 점도 향상제를 제거하면 본원에서 실시예 및 도 4~8에 나타낸 바와 같이 캡슐화된 섬의 기능성 및 코팅 생체적합성이 개선되었다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 유상 내 수성상의 적하에서 제팅으로의 전이 및 유동 신장을 허용하도록 구성된 코팅 장치에서 동축 유상 내에 수성상을 주입하는 단계; (b) 생체물질 및 코팅 물질을 수성상에 첨가하는 단계로서, 상기 단계 (b)의 코팅 물질은 점도 향상제를 포함하지 않고; 수성상은 pH 약 6 내지 약 7.4인, 단계; (c) 수성상 제트가 입자로 분해되도록 하는 단계; 및 (d) 수성상 제트의 입자로의 분해 하류에 코팅 물질의 성분을 첨가하는 단계로서, 성분은 코팅 물질의 중합을 촉진하거나 촉매하는 겔화 에멀젼이고; 이에 따라 등각 코팅된 생체물질을 생성하는, 단계를 포함하는, 코팅 물질로 생체물질을 등각 코팅하는 방법을 제공한다. 점도 향상제의 예는 알기네이트, 양친매성 자가-조립 중합체 또는 펩티드 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 제외되는 점도 향상제는 알기네이트와 같은 다당류, 탈세포화된 조직, PEG 기반 나노물질 어셈블리, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 키토산, 젤라 검, 잔탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 콜라겐, 및 알부민으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 코팅 장치(즉, 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질)의 유출물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 상기 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 생체물질이 없는 코팅 물질로부터 등각 코팅된 생체물질을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제는 (e) 생성 혼합물(즉, 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질, 유상 및 겔화 에멀젼(행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 미네랄 오일 중 10% 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)의 용액 포함))을 교반하면서 상기 방법에 제시된 단계 (d)로부터의 산물을 미네랄 오일에 붓는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제는 (f) 단계 (e)에서 생성 산물(즉, 등각 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질, 유상, 장치로부터 나오는 겔화 에멀젼(행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 미네랄 오일 중 10%의 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT) 용액 포함), 및 미네랄 오일)에 행크 균형 염 용액(HBSS)을 첨가하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 단계 (f)로부터의 산물은 원심분리되고 HBSS로 세척된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 원심분리 및 행크 균형 염 용액(HBSS)으로의 세척 후, 코팅된 생체물질 및 임의의 생체물질이 없는 코팅 물질은 PEG디티올 용액과 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로부터 제외되는 점도 향상제는 알기네이트와 같은 다당류, 탈세포화된 조직, PEG 기반 나노물질 어셈블리, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 키토산, 젤라 검, 잔탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 콜라겐, 및 알부민으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 생체물질의 크기는 수성상이 유상으로 주입되는 오리피스의 크기보다 더 작다.
본 개시내용의 방법은 대상체에게 임플란트될 때 면역단리로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 물질을 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 물질은 모양이 불균일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역단리로부터 이익을 얻을 수 있는 물질은 생체물질이다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포, 세포 클러스터, 생체물질-코팅 세포 또는 세포-클러스터, 세포내 소기관, 생물학적 분자, 비-생물학적 약물, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세포, 세포 클러스터, 세포내 소기관, 단백질, 핵산 및 항체와 같은 생물학적 제제, 및 약물과 같은 비생물학적 제제(예를 들어, 소분자) 중 하나 이상을 캡슐화하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포이다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포 클러스터이다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포 및 세포 클러스터이다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 세포내 소기관이다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 단백질이다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 핵산이다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 세포 및/또는 세포 클러스터를 캡슐화하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 췌장 섬 세포 및 세포 클러스터를 캡슐화하기 위해 사용된다.
특정 실시양태에서, 등각 코팅된 세포 및 세포 클러스터는 단독으로 또는 성장 인자 및/또는 등각 코팅된 세포의 확립, 유지 또는 증식을 위한 다른 유익한 제제를 제공하거나 그렇지 않으면 등각 코팅된 세포가 숙주에 임플란트될 때 치료 효과를 전달하는 것을 돕기 위한 다른 세포 유형(예를 들어, 세르톨리 세포, 중간엽 및 뼈 골수 유래 세포, 내피 전구 세포, 줄기 세포, 조절 T 세포 Treg 등, 각각 일반적으로 임플란트 "헬퍼 세포"로 지칭됨)과 함께 자가, 이질성, 동계, 동종, 또는 이종 췌장 섬 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 세포는 중간엽 줄기 세포이다.
본원에 사용된 용어 "숙주"는 임플란트된 생체물질의 수신체를 지칭하고 모든 동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주는 포유동물이다. 예시적인 실시양태에서, 숙주는 인간이다.
본 개시내용의 방법은 세포 치료 모델 시스템에서 등각 코팅에 유리하게 사용될 수 있다. 등각 코팅된 세포는, 예를 들어 임플란트 시 생체내 치료 인자를 발현함으로써 치료 이익을 전달할 수 있다. 이러한 세포의 예는 당뇨병을 치료하기 위한 인슐린; 파킨슨병을 치료하기 위한 도파민(Minquez-Castellanos 등, 2007, J Neurol Neurosurg Psychiatry 78:825-831); 왜소증을 치료하기 위한 성장 호르몬(Chang 등, 1999, Trends Biotechnol 17:78-83); 혈우병을 치료하기 위한 인자 VIII 및 인자 IX(Chang 등, 1999, Trends Biotechnol 17, 78-83); 및 빈혈을 치료하기 위한 에리트로포이에틴(Rinsch 등, 2002, Kidney Intern 62:1395-1401)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 더 많은 유익한 세포-생산 인자 또는 세포/조직 활성이 상상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 등각 코팅된 세포는 하나 이상의 치료 인자를 발현 및/또는 전달할 수 있거나, 하나 이상의 치료 인자를 전달하는 2개 이상의 세포 유형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 등각 코팅된 세포는 숙주에 임플란트될 때 치료 효과를 전달하기 위해 치료 인자의 길항제, 작용제, 유사체, 유도체, 키메라, 융합체, 또는 단편을 또한 또는 대안적으로 발현 및/또는 전달한다.
일부 실시양태에서, 등각 코팅된 세포의 적어도 일부는 또한 또는 대안적으로 확산성 인자를 분비하지 않으면서 치료 효과를 전달한다. 특정 실시양태에서, 등각 코팅된 세포는 예를 들어 기질을 유익한 효과를 갖는 산물로 전환 및/또는 유해 물질을 대사, 격리 또는 흡수하는 효소 활성을 제공한다. 특정 실시양태에서, 등각 코팅된 세포는 세포 표면-연결 인자와 같은 생물학적 물질-연결 인자를 통해 치료 효과를 전달한다.
일부 실시양태에서, 등각 코팅된 세포는 숙주 내로 임플란트 시, 유전적 변형 없이 치료 효과를 자연적으로 전달한다. 일부 실시양태에서, 등각 코팅된 세포는 치료 효과를 전달하기 위해 유전적으로 조작된다. 비제한적인 예로서, 세포는 하나 이상의 치료 및/또는 헬퍼 세포 인자를 발현할 수 있는 세포를 만드는 발현 벡터로 형질감염되거나 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 세포가 하나 이상의 치료 및/또는 헬퍼 세포 인자를 발현할 수 있도록 만드는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 이러한 발현은, 예를 들어 세포가 노출되는 혈류 또는 조직에서의 생물학적 조절제에 대한 반응으로, 구성적이거나 조절된 방식일 수 있다.
일부 실시양태에서, 등각 코팅을 위한 세포는 사체 조직 또는 살아있는 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 비-포유동물 또는 포유동물 기원, 비-인간 기원 또는 인간 기원, 자가 또는 비-자가 세포이다. 세포는 다른 세포 유형 중에서 만능, 다능, 전능 또는 분화된 배아 또는 성체 줄기 세포; 1차 분화 세포; 또는 불멸화 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포는, 예를 들어 제대혈, 양수, 월경혈, 태반, 와튼 젤리, 세포영양모세포 등으로부터 유래된 세포를 포함한다. 세포는 또한 상기 열거된 세포 유형의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
등각 코팅된 세포에 의해 전달될 수 있는 예시적인 치료 인자는 인슐린, 글루카곤, 에리트로포이에틴; 인자 VIII; 인자 IX; 헤모글로빈; 알부민; 도파민, 감마-아미노부티르산(GABA), 글루탐산, 세로토닌, 노르에피네프린, 에피네프린 및 아세틸콜린과 같은 신경전달물질; 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀 4/5(NT-4/5), 모양체 신경 영양 인자(CNTF), 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF), 콜린성 분화 인자/백혈병 억제 인자(CDF/LIF), 표피 성장 인자(EGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)와 같은 성장 인자; 물질 P, 카테콜아민, 다이노르핀, 엔돌핀 또는 엔케팔린과 같은 통증 억제제; 부갑상샘 호르몬 또는 성장 호르몬과 같은 호르몬; 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 면역조절제; 신경조절제; 림포카인; 사이토카인; 보조인자; 항체; 압타머; 및 효소 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 치료 인자의 선택 및 이들이 생산되고 세포로부터 방출되는 농도는 치료받는 환자의 필요에 의해 지정되며 숙련된 의사에 의해 경험적으로 쉽게 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 등각 코팅된 세포는 인슐린 유사 또는 인슐린 조절 활성을 갖는 치료 인자를 생산한다. 특정 실시양태에서, 치료 인자는 인슐린이다. 특정 실시양태에서, 치료 인자는 프리프로인슐린 또는 프로인슐린과 같은 인슐린의 전구체 형태이다. 특정 실시양태에서, 치료 인자는 인슐린 키메라 또는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 등각 코팅된 세포에 의해 제공되는 치료 효과는 혈중 인슐린 수준의 조절을 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 효과는 혈중 글루코스 수준의 조절을 포함한다. 다른 실시양태에서, 치료 효과는 환자의 혈중 하나 이상의 다른 생물학적 반응 조절제의 수준 조절을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료 인자(들)는 자극 또는 신호의 수신으로 인해 등각 코팅된 세포로부터 방출된다. 임플란트된 세포의 경우, 자극 또는 신호는 숙주로부터 수신될 수 있다(예를 들어, 글루코스, 호르몬, 대사 신호전달 제제, 화학적 신호전달 분자 등의 혈중 수준 변화).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 세포 및/또는 세포 클러스터는 일반적으로 크기가 균일하다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 세포 및/또는 세포 클러스터는 크기가 균일하지 않다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 10 μm 내지 약 10000 μm; 직경 약 25 μm 내지 약 500 μm; 또는 직경 약 40 μm 내지 약 400 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 10 μm 내지 10000 μm; 직경 25 μm 내지 500 μm; 또는 직경 40 μm 내지 400 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 10 μm 내지 약 10000 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 10 μm 내지 10000 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 25 μm 내지 약 500 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 25 μm 내지 500 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 40 μm 내지 약 400 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 40 μm 내지 400 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 50 내지 약 300 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 50 내지 300 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 10 μm 내지 약 10000 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 10 μm 내지 10000 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 25 μm 내지 약 500 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 25 μm 내지 500 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 40 μm 내지 약 400 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 40 μm 내지 400 μm로 변한다. 특정 실시양태에서, 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 50 내지 약 300 μm로 변한다. 일부 실시양태에서, 직경 약 50 내지 약 300 μm로 변하는 섬 세포 및/또는 세포 클러스터는 섬 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 직경 50 내지 300 μm로 변하는 세포 및/또는 세포 클러스터는 섬 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 약 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 μm 초과이다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 40 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 50 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 60 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 70 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 80 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 90 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 100 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 150 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 200 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 250 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 300 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 350 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 400 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 450 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 500 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 550 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 600 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 650 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 700 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 750 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 800 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 850 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 900 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 950 μm 초과 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 최대 약 1000 μm의 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 직경 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000 μm 초과이다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 40 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 50 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 60 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 70 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 80 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 90 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 100 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 150 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 200 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 250 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 300 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 350 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 400 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 450 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 500 μm 초과의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 550 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 600 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 650 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 700 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 750 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 800 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 850 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 900 μm 초과 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 950 μm 초과 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 최대 1000 μm의 직경을 갖는다.
특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 40 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 50 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 60 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 70 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 80 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 90 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 100 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 150 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 200 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 250 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 300 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 350 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 400 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 450 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 500 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 550 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 600 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 650 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 700 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 750 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 800 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 850 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 900 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 950 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 1000 μm의 직경을 갖는다.
본 개시내용의 등각 코팅 방법에서 사용된 코팅 물질은 생체적합성이고 기계적으로 및 화학적으로 안정하다. 또한, 등각 코팅에 유용한 물질은 캡슐화된 생체물질의 기능을 방해하지 않거나 실질적으로 방해하지 않으며, 캡슐화된 생체물질이 숙주에 임플란트될 때 면역 반응을 감소, 최소화 또는 제거한다. 특정 실시양태에서, 코팅 물질은 내부 겔화에 의해 중합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 등각 코팅 방법에서 사용된 물질은 생분해성이다.
일부 실시양태에서 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(N-비닐 피롤리디논)(PVP), 폴리에틸 옥사졸린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리틸옥사졸린(PEOX), 폴리(아미노산), 이의 유도체 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트, PEG-비닐 설폰, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트, 또는 PEG-비닐 설폰을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-말레이미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-아크릴레이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-비닐 설폰을 포함한다.
일부 실시양태에서 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(N-비닐 피롤리디논)(PVP), 폴리에틸 옥사졸린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리틸옥사졸린(PEOX), 폴리(아미노산), 이의 유도체 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트, PEG-비닐 설폰, 또는 이의 조합이다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트, 또는 PEG-비닐 설폰이다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-말레이미드이다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-아크릴레이트이다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-비닐 설폰이다.
일부 실시양태에서, 코팅 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(N-비닐 피롤리디논)(PVP), 폴리에틸 옥사졸린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리틸옥사졸린(PEOX) 및/또는 폴리(아미노산) 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 코팅 물질은 단일-아암이다. 특정 실시양태에서, 코팅 물질은 다중-아암이다. 특정 실시양태에서, 코팅 물질은 단일-아암 및 다중-아암 물질의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 수성상은 PEG디티올로 최소 가교된(5~50%) 다중-아암 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG 디티올로 최소 가교된(1~30%) 다중-아암 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 5~10% PEG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성상은 pH 6~7.4의 무혈청 배지; 또는 pH 6~7.4의 행크 균형 염 용액(HBSS)을 포함하고; 구체적으로, 수성상의 pH는 pH 6~7.4에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 수상은 pH 약 6 내지 약 7.4이다. 일부 실시양태에서, 수상은 pH 6 내지 7.4이다.
일부 실시양태에서, 코팅 물질은 최소 가교된 PEG-MAL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-SH와 혼합된 PEG-MAL(10 kDa, 8 아암, 75% 기능화)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-MAL(10 kDa, 8 아암, 75% 기능화), 및 PEG-SH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 PEG-MAL(10 kDa, 8 아암, 75% 기능화), PEG-SH 및 HBSS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 10X PEG-SH와 혼합된 12.5% w/v PEG-MAL(10 kDa, 8 아암, 75% 기능화)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 12.5% w/v PEG-MAL(10 kDa, 8 아암, 75% 기능화), 및 PEG-SH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 12.5% w/v PEG-MAL(10 kDa, 8 아암, 75% 기능화), PEG-SH 및 HBSS를 포함한다.
일부 실시양태에서, 수성상은 티올화 시약, 환원 시약, 계면활성제, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법의 실시에서 사용되는 수성상은 선택적으로 티올화 시약, 환원 시약 및/또는 계면활성제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 또는 폴리(에틸렌 글리콜-bl-프로필렌 설피드), 보다 특히 2% 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체이다. 일부 실시양태에서, 티올화 또는 환원 시약은 디티오트레이톨(DTT) 또는 PEG디티올이다. 일부 실시양태에서, 수상 중 티올화 또는 환원 시약은 0.01~0.62% 디티오트레이톨(DTT)이다.
일부 실시양태에서, 겔화 에멀젼은 1,300 cP의 점도를 갖는 오일에 유화된 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해된 가교제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 겔화 에멀젼은 DTT, 행크 균형 염 용액(HBSS) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 겔화 에멀젼은 디티오트레이톨(DTT), 행크 균형 염 용액(HBSS), 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 및 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 겔화 에멀젼은 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 겔화 에멀젼은 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 10% 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)와 함께 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 등각 코팅은 영양소 및 세포 부산물의 교환 및 치료 인자의 방출을 허용하지만, 숙주 면역 효과기 분자 및/또는 다른 바람직하지 않은 요소가 캡슐에 들어가는 것을 막을 수도 있는 투과도 특성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 등각 코팅은 컷오프 크기 100, 110, 120, 130, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 또는 500 kDa인 기공을 포함한다. 특정 실시양태에서, 등각 코팅은 컷오프 크기 150 kDa을 갖는 기공을 포함한다. 특정 실시양태에서, 등각 코팅은 컷오프 크기 최대 500 kDa을 갖는 기공을 포함한다.
등각 코팅의 두께는 코팅된 물질의 크기/직경에 의존하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 코팅의 두께는 1 μm 내지 100 μm, 5 μm 내지 50 μm, 또는 8 μm 내지 25 μm의 범위이다. 일부 실시양태에서, 코팅의 두께는 25~50 μm 범위이다. 일부 실시양태에서, 코팅의 두께는 10~20 μm 범위이다.
일부 실시양태에서, 코팅은 검출 가능한 마커로 코팅 물질을 표지함으로써 가시화된다. 마커는, 예를 들어 형광, 효소, 화학발광 또는 에피토프 표지일 수 있다. 특정 실시양태에서, 코팅은 코팅 물질 내에 고분자량 FITC 덱스트란을 포획함으로써 가시화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표지된 코팅 물질은 PEG-FITC이다.
일부 실시양태에서, 코팅 물질은 작용기를 함유하도록 화학적으로 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용기는 코팅을 안정화하는 데 도움이 된다. 추가로, 코팅 물질은 수용체 또는 친화도 제제와 같은 치료 인자 또는 이러한 치료 인자와 연합하는 다른 분자를 포함할 수 있다(예를 들어, Kim 등, 2003, Biomacromolecules 4:1214-1223 참고). 치료 인자는 공유 가교, 유화, 이온 상호작용, 특이적 친화도 상호작용, 단순 포획, 또는 이의 임의의 조합을 통해 코팅 물질에 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 코팅 물질은 등각 코팅된 세포의 임플란트 시 숙주 염증 반응을 감소시키기 위해 항염증 분자를 포함한다. 예시적인 항염증제는 코르티코스테로이드(덱사메타손, 코르티솔, 프레드니솔론, 로테프레드놀 에타보네이트, 플루오시놀론 아세토니드 등), 칼시뉴린 억제제(사이클로스포린 A) 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-10(IL-10), 알파 1-항트립신(AAT), 리소필린, 펜톡시필린, COX-2 억제제, 인터루킨-1 수용체 길항제 펩티드(IRAP), 인터루킨-10(IL-10), 알파 1-항트립신(AAT), TGF-베타; IL-1, 인터페론-감마 및 TNF-알파에 대한 항체; 항조직 인자, 및 보체 억제제; 백혈구 인테그린(LFA-1 및 ICAM-1)에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 물질은 콜라겐 유형 I 또는 IV, 라미닌, 피브로넥틴, 히알루론산, 또는 아르기닌-글리신-아스파르테이트 펩티드와 같은 세포외 기질(ECM) 분자를 포함한다(Beck 등, 2007, Tissue Eng 13(3):1-11). 일부 실시양태에서, 항염증 및/또는 ECM 분자는 코팅 물질의 표면에 속박된다. 특정 실시양태에서, 분자는 느린 방출을 위해 코팅되거나 캡슐화된다.
생체물질의 등각 코팅은 코팅 장치에서 일어난다. 본원에 사용된 용어 "코팅 장치"는 생체물질을 등각 코팅할 수 있는 임의의 장치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 코팅 장치는 비혼화성(예를 들어, 오일) 상 내 수성상의 적하에서 제팅으로의 전이 및 신장을 허용하는 장치이며, 수성상은 입자로의 제트 분해를 겪는다. 일부 실시양태에서, 코팅 장치는 하나 이상의 유상 입구, 하나 이상의 수성상 입구(유상 입구와 동일하거나 상이할 수 있음), 및 유상의 동시 유동 제트가 수성상에 집속되는 입구 하류의 하나 이상의 유동 집속 영역을 포함하는 유동 챔버이다. 유동 챔버는 유동 집속 영역(들)의 하류에 하나 이상의 채널을 추가로 포함할 수 있다. 수성상 채널(들)의 직경은, 예를 들어, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4 mm 직경일 수 있다. 유상 채널(들)의 직경은, 예를 들어 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 또는 20 mm 직경일 수 있다. 특정 실시양태에서, 유상 채널(들)의 직경은 최대 100 mm일 수 있다. 채널(들)의 길이는, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 30 mm일 수 있다. 채널은 유동 챔버로부터 하나 이상의 출구로 이어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치 또는 기구는 실시예에 제시되고 도 1, 1a 또는 1b에 예시된 바와 같이 구성된다.
일부 실시양태에서, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 제1 펌프(102), 제1 펌프(102)에 연결된 등각 코팅 장치(104), 등각 코팅 장치(104) 내에 배치된 카테터(106), 흡입측의 유상 저장소(110)(예를 들어, PPG)와 접촉하도록 구성되고 배출측의 등각 코팅 장치(104)에 연결된 제2 펌프(108), 흡입측의 에멀젼 저장소(114)와 접촉하도록 구성되고 배출측의 등각 코팅 장치(104)에 연결된 제3 펌프(112), 등각 코팅 장치(104)의 하류측의 모세관(116) 및 수집 비이커(118)를 포함하는 코팅 시스템이 제공된다.
제1 펌프(102)는 하우징 부분의 내부 부품의 제1 입구에 수성상 중 코팅 물질 및 코팅될 생체물질을 주입하도록 구성될 수 있다. 일부 측면에서, 제1 펌프(102)는 유리 주사기 펌프, 연동 펌프, 또는 물질을 주입하도록 구성된 임의의 다른 펌프로부터 선택된다. 등각 코팅 장치(104)는 상류측에서 제1 펌프(102)에 연결되고 하류측에서 모세관(116)에 연결되며 생체물질을 코팅 물질로 등각 코팅하도록 구성될 수 있다.
카테터(106)는 등각 코팅 장치(104) 내에 배치되고 정밀 유동 주사기 펌프(102)에 연결될 수 있다. 카테터(106)는 코팅 물질 및 코팅될 생체물질을 도 1a(v)에 나타낸 바와 같이, 캡슐화 챔버의 하우징 부분(152)의 제1 입구(160)(내부상)에 주입하도록 구성될 수 있다. 하우징 부분(152)은 하우징 부분(152)의 제2 단부(162)에서 부착 부분(154)에 커플링될 수 있으며, 이는 도 1a(v)에 나타낸 바와 같이, 부착 부분(154)의 제2 단부에서 코팅 부분(156)에 커플링된다. 이 실시양태의 일부 측면에서, 하우징 부분(152)의 제2 단부(162)는 도 1a(v)에 나타낸 바와 같이, 하우징 부분(152)의 제1 단부(160)와 대향한다. 코팅 부분(156)의 일부 측면에서, 도 1a(v)에 나타낸 바와 같이, 부착 부분(154)의 제2 단부(164)의 외부 표면과 맞물리도록 구성된다.
제2 펌프(108)는 흡입측에서 PPG 저장소(110)에 연결되고 배출측에서 등각 코팅 장치(104)의 코팅 부분(156)의 제2 입구(158)에 연결되며, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 계면활성제를 함유하는 유상을 제2 입구(158)로 주입하도록 구성된다. 유상(외부상)의 주입은 내부 수성상과 동축으로 흐르도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 펌프(108)는 연동 펌프, 롤러 펌프, 유리 주사기 펌프, 또는 유상 물질을 주입하도록 구성된 임의의 다른 펌프이다.
캡슐화 챔버는 도 1a, 패널 (v)에 나타낸 바와 같이, 코팅 부분(156)에 커플링된, 부착 부분(154)에 커플링된 하우징 부분(152)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 등각 코팅 장치는 장치로부터 공기를 방출하기 위한 출구를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅 부분은 장치로부터 공기를 방출하기 위한 출구를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공기를 방출하기 위한 출구는 장치 내로의 수상 입구의 상류에 배치된다. 코팅 공정 동안 공기 방출 출구는 폐쇄된다.
일부 실시양태에서, 장치는 10d의 채널로부터 d의 채널로의 유동 집속을 제공한다(적하에서 제팅으로의 전이를 허용하기 위한 직경의 1/10 제한). 특정 실시양태에서, d는 0.5~10 mm 범위이다. 특정 실시양태에서, d는 1~4 mm의 범위이다. 특정 실시양태에서, d는 약 1 mm이다. 일부 실시양태에서, 장치의 집속각은 100도 내지 5도(다소의 집속) 범위이다. 특정 실시양태에서, 집속각은 90도 내지 10도 범위이다. 특정 실시양태에서, 집속각은 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 또는 90도 초과이다. 특정 실시양태에서, 장치의 집속각은 약 60도이다. 일부 실시양태에서, 유동 집속 영역은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 mm 길이이다. 특정 실시양태에서, 유동 집속 영역은 100 mm 길이이다.
일부 실시양태에서, 외부 유상 챔버(실린더)의 직경은 1~20 mm이다. 일부 실시양태에서, 외부 유상 챔버의 직경은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 mm이다. 특정 실시양태에서, 외부 유상 챔버의 직경은 10 mm이다. 일부 실시양태에서, 외부 유상 챔버는 수성상에 대한 동축 주입 포트의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mm 상류(실린더 축방향 거리) 측면 포트에 의해 공급된다. 특정 실시양태에서, 측면 포트는 수성상 주입 포트의 5 mm 상류이다. 특정 실시양태에서, 외부 유상 챔버는 수성상에 대한 동축 주입 포트의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mm 상류(실린더 축방향 거리)의 하나를 초과하는 측면 포트에 의해 공급된다.
일부 실시양태에서, 물 주입 바늘의 선단부는 장치의 집속 영역의 기부와 공동 편재된다. 일부 실시양태에서, 물 주입 바늘의 선단부는 장치의 집속 영역 기부의 약 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mm 상류 또는 하류(실린더 축방향 거리)에 배치된다. 특정 실시양태에서, 물 주입 바늘의 선단부는 집속 영역의 약 0.5 mm 상류에 배치된다.
특정 실시양태에서, 장치는 유동 집속 영역의 0.5 mm 상류인, 수성상에 대한 동축 주입 포트의 5 mm 상류 측면 포트에 의해 공급되는, 직경 10 mm의 외부 유상 챔버를 특징으로 하며, 유동 집속은 60도의 집속각으로, 직경이 10 mm에서 1 mm로 수축되고 길이가 100 mm인 채널에서 발생한다.
특정 실시양태에서, 장치는 겔화제, 특히 코팅된 생체물질 형성 후 위치에 편재된, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20: 1:25, 1:50 또는 1:100의 부피 대 부피비로 행크 균형 염 용액(HBSS) 중 디티오트레이톨 용액(10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/mL 디티오트레이톨)을 포함하는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 용액의 동축 유동을 허용하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 장치는 직경 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 μm 초과의 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 40 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 50 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 60 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 70 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 80 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 90 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 100 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 150 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 200 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 250 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 300 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 350 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 400 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 450 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 500 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 550 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 600 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 650 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 700 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 750 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 800 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 850 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 900 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 직경 950 μm 초과 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 직경 최대 1000 μm의 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다.
특정 실시양태에서, 장치는 약 40 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 50 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 60 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 70 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 80 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 90 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 100 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 150 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 200 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 250 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 300 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 350 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 400 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 450 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 500 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 550 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 600 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 650 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 700 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 750 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 800 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 850 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 900 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 약 950 μm의 직경을 갖는 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 직경 최대 1000 μm인 세포 및/또는 세포 클러스터를 코팅할 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상 유동, 유상 유동, 또는 둘 모두는 연동 펌프에 의해 유지된다. 일부 실시양태에서, 수성상 유동, 유상 유동, 또는 둘 모두는 주사기 펌프에 의해 유지된다. 일부 실시양태에서, 수성상 유동은 주사기 펌프에 의해 유지되고 유상 유동은 연동 펌프에 의해 유지된다. 특정 실시양태에서, 디티오트레이톨 용액은 주사기 펌프 또는 연동 펌프를 사용하여 등각 코팅된 생체물질과 동축으로 도입되었다.
50~250 μm 세포 클러스터를 코팅하기 위해 16G 정맥내 카테터를 사용하는 특정 장치에 대한 메트릭이 본원에 제공되지만, 도 1a, 패널 (v)에 제시된 상대적인 메트릭이 유지되는 정도로 상이한 구성 및 크기를 갖는 다른 장치도 고려된다는 것이 이해되어야 한다.
세포 및/또는 세포 클러스터가 등각 코팅될 생체물질인 일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포의 농도는 100~500,000,000개 세포/mL, 100~200,000,000개 세포/mL, 1,000,000~200,000,000개 세포/mL, 5,000,000~200,000,000개 세포/mL, 10,000,000~200,000,000개 세포/mL, 15,000,000~200,000,000개 세포/mL, 20,000,000~200,000,000개 세포/mL, 25,000,000~200,000,000개 세포/mL, 30,000,000~200,000,000개 세포/mL, 35,000,000~200,000,000개 세포/mL, 40,000,000~200,000,000개 세포/mL, 45,000,000~200,000,000개 세포/mL, 50,000,000~200,000,000개 세포/mL, 55,000,000~200,000,000개 세포/mL, 60,000,000~200,000,000개 세포/mL, 65,000,000~200,000,000개 세포/mL, 70,000,000~200,000,000개 세포/mL, 75,000,000~200,000,000개 세포/mL, 80,000,000~200,000,000개 세포/mL, 85,000,000~200,000,000개 세포/mL, 90,000,000~200,000,000개 세포/mL, 95,000,000~200,000,000개 세포/mL, 100,000,000~200,000,000개 세포/mL, 105,000,000~200,000,000개 세포/mL, 110,000,000~200,000,000개 세포/mL, 115,000,000~200,000,000개 세포/mL, 120,000,000~200,000,000개 세포/mL, 125,000,000~200,000,000개 세포/mL, 130,000,000~200,000,000개 세포/mL, 135,000,000~200,000,000개 세포/mL, 140,000,000~200,000,000개 세포/mL, 145,000,000~200,000,000개 세포/mL, 150,000,000~200,000,000개 세포/mL, 155,000,000~200,000,000개 세포/mL, 160,000,000~200,000,000개 세포/mL, 165,000,000~200,000,000개 세포/mL, 170,000,000~200,000,000개 세포/mL, 175,000,000~200,000,000개 세포/mL, 180,000,000~200,000,000개 세포/mL, 185,000,000~200,000,000개 세포/mL, 190,000,000~200,000,000개 세포/mL, 195,000,000~200,000,000개 세포/mL, 100~1,000,000개 세포/mL, 500~750,000개 세포/mL, 1,000~500,000개 세포/mL, 또는 2,500~250,000개 세포/mL의 범위일 수 있다.
세포 및/또는 세포 클러스터가 등각 코팅될 생체물질인 일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포/세포 클러스터의 농도는 약 100~약 500,000,000개 세포/mL, 약 100~약 200,000,000개 세포/mL, 약 1,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 5,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 10,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 15,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 20,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 25,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 30,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 35,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 40,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 45,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 50,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 55,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 60,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 65,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 70,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 75,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 80,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 85,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 90,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 95,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 100,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 105,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 110,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 115,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 120,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 125,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 130,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 135,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 140,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 145,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 150,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 155,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 160,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 165,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 170,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 175,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 180,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 185,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 190,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 195,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 100~약 1,000,000개 세포/mL, 약 500~약 750,000개 세포/mL, 약 1,000~약 500,000개 세포/mL, 또는 약 2,500~약 250,000개 세포/mL의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포의 농도는 약 100개 세포/mL, 약 500개 세포/mL, 약 1000개 세포/mL, 약 2500개 세포/mL, 약 5000개 세포/mL, 약 7500개 세포/mL, 약 10000개 세포/mL, 약 25000개 세포/mL, 약 50000개 세포/mL, 약 75000개 세포/mL, 약 100000개 세포/mL, 약 250000개 세포/mL, 약 500000개 세포/mL, 약 750000개 세포/mL, 약 1,000,000개 세포/mL, 약 2,500,000개 세포/mL, 약 5,000,000개 세포/mL, 약 7,500,000개 세포/mL, 약 10,000,000개 세포/mL, 약 20,000,000개 세포/mL, 약 25,000,000개 세포/mL, 약 30,000,000개 세포/mL, 약 40,000,000개 세포/mL, 약 50,000,000개 세포/mL, 약 60,000,000개 세포/mL, 약 70,000,000개 세포/mL, 약 80,000,000개 세포/mL, 약 90,000,000개 세포/mL, 약 100,000,000개 세포/mL, 약 105,000,000개 세포/mL, 약 110,000,000개 세포/mL, 약 115,000,000개 세포/mL, 약 120,000,000개 세포/mL, 약 125,000,000개 세포/mL, 약 130,000,000개 세포/mL, 약 135,000,000개 세포/mL, 약 140,000,000개 세포/mL, 약 145,000,000개 세포/mL, 약 150,000,000개 세포/mL, 약 155,000,000개 세포/mL, 약 160,000,000개 세포/mL, 약 165,000,000개 세포/mL, 약 170,000,000개 세포/mL, 약 175,000,000개 세포/mL, 약 180,000,000개 세포/mL, 약 185,000,000개 세포/mL, 약 190,000,000개 세포/mL, 약 195,000,000개 세포/mL, 약 200,000,000개 세포/mL이다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포의 농도는 100개 세포/mL, 500개 세포/mL, 1000개 세포/mL, 2500개 세포/mL, 5000개 세포/mL, 7500개 세포/mL, 10000개 세포/mL, 25000개 세포/mL, 50000개 세포/mL, 75000개 세포/mL, 100000개 세포/mL, 250000개 세포/mL, 500000개 세포/mL, 750000개 세포/mL, 1,000,000개 세포/mL, 2,500,000개 세포/mL, 5,000,000개 세포/mL, 7,500,000개 세포/mL, 10,000,000개 세포/mL, 20,000,000개 세포/mL, 25,000,000개 세포/mL, 30,000,000개 세포/mL, 40,000,000개 세포/mL, 50,000,000개 세포/mL, 60,000,000개 세포/mL, 70,000,000개 세포/mL, 80,000,000개 세포/mL, 90,000,000개 세포/mL, 100,000,000개 세포/mL, 105,000,000개 세포/mL, 110,000,000개 세포/mL, 115,000,000개 세포/mL, 120,000,000개 세포/mL, 125,000,000개 세포/mL, 130,000,000개 세포/mL, 135,000,000개 세포/mL, 140,000,000개 세포/mL, 145,000,000개 세포/mL, 150,000,000개 세포/mL, 155,000,000개 세포/mL, 160,000,000개 세포/mL, 165,000,000개 세포/mL, 170,000,000개 세포/mL, 175,000,000개 세포/mL, 180,000,000개 세포/mL, 185,000,000개 세포/mL, 190,000,000개 세포/mL, 195,000,000개 세포/mL, 200,000,000개 세포/mL이다.
세포 클러스터가 등각 코팅될 생체물질인 일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포 클러스터의 농도는 100~200,000개 세포 클러스터/mL, 100~100,000개 세포 클러스터/mL, 500~100,000개 세포 클러스터/mL, 1,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 2,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 3,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 4,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 5,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 6,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 7,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 8,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 9,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 10,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 15,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 20,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 25,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 30,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 35,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 40,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 45,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 50,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 55,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 60,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 65,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 70,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 75,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 80,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 85,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 900,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 95,000~100,000개 세포 클러스터/mL의 범위일 수 있다.
세포 클러스터가 등각 코팅될 생체물질인 일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포 클러스터의 농도는 약 100~약 200,000개 세포 클러스터/mL, 약 100~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 500~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 1,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 2,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 3,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 4,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 5,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 6,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 7,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 8,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 9,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 10,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 15,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 20,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 25,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 30,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 35,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 40,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 45,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 50,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 55,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 60,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 65,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 70,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 75,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 80,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 85,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 약 90,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 95,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포 클러스터의 농도는 약 100개 세포 클러스터/mL, 약 500개 세포 클러스터/mL, 약 1,000개 세포 클러스터/mL, 약 2,000개 세포 클러스터/mL, 약 3,000개 세포 클러스터/mL, 약 4,000개 세포 클러스터/mL, 약 5,000개 세포 클러스터/mL, 약 6,000개 세포 클러스터/mL, 약 7,000개 세포 클러스터/mL, 약 8,000개 세포 클러스터/mL, 약 9,000개 세포 클러스터/mL, 약 10,000개 세포 클러스터/mL, 약 15,000개 세포 클러스터/mL, 약 20,000개 세포 클러스터/mL, 약 25,000개 세포 클러스터/mL, 약 30,000개 세포 클러스터/mL, 약 35,000개 세포 클러스터/mL, 약 40,000개 세포 클러스터/mL, 약 45,000개 세포 클러스터/mL, 약 50,000개 세포 클러스터/mL, 약 55,000개 세포 클러스터/mL, 약 60,000개 세포 클러스터/mL, 약 65,000개 세포 클러스터/mL, 약 70,000개 세포 클러스터/mL, 약 75,000개 세포 클러스터/mL, 약 80,000개 세포 클러스터/mL, 약 85,000개 세포 클러스터/mL, 약 90,000개 세포 클러스터/mL, 약 95,000개 세포 클러스터/mL, 약 100,000개 세포 클러스터/mL이다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포 클러스터의 농도는 100개 세포 클러스터/mL, 500개 세포 클러스터/mL, 1,000개 세포 클러스터/mL, 2,000개 세포 클러스터/mL, 3,000개 세포 클러스터/mL, 4,000개 세포 클러스터/mL, 5,000개 세포 클러스터/mL, 6,000개 세포 클러스터/mL, 7,000개 세포 클러스터/mL, 8,000개 세포 클러스터/mL, 9,000개 세포 클러스터/mL, 10,000개 세포 클러스터/mL, 15,000개 세포 클러스터/mL, 20,000개 세포 클러스터/mL, 25,000개 세포 클러스터/mL, 30,000개 세포 클러스터/mL, 35,000개 세포 클러스터/mL, 40,000개 세포 클러스터/mL, 45,000개 세포 클러스터/mL, 50,000개 세포 클러스터/mL, 55,000개 세포 클러스터/mL, 60,000개 세포 클러스터/mL, 65,000개 세포 클러스터/mL, 70,000개 세포 클러스터/mL, 75,000개 세포 클러스터/mL, 80,000개 세포 클러스터/mL, 85,000개 세포 클러스터/mL, 90,000개 세포 클러스터/mL, 95,000개 세포 클러스터/mL, 100,000개 세포 클러스터/mL이다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 섬 세포의 농도는 100~500,000,000개 세포/mL, 100~200,000,000개 세포/mL, 1,000,000~200,000,000개 세포/mL, 5,000,000~200,000,000개 세포/mL, 10,000,000~200,000,000개 세포/mL, 15,000,000~200,000,000개 세포/mL, 20,000,000~200,000,000개 세포/mL, 25,000,000~200,000,000개 세포/mL, 30,000,000~200,000,000개 세포/mL, 35,000,000~200,000,000개 세포/mL, 40,000,000~200,000,000개 세포/mL, 45,000,000~200,000,000개 세포/mL, 50,000,000~200,000,000개 세포/mL, 55,000,000~200,000,000개 세포/mL, 60,000,000~200,000,000개 세포/mL, 65,000,000~200,000,000개 세포/mL, 70,000,000~200,000,000개 세포/mL, 75,000,000~200,000,000개 세포/mL, 80,000,000~200,000,000개 세포/mL, 85,000,000~200,000,000개 세포/mL, 90,000,000~200,000,000개 세포/mL, 95,000,000~200,000,000개 세포/mL, 100,000,000~200,000,000개 세포/mL, 105,000,000~200,000,000개 세포/mL, 110,000,000~200,000,000개 세포/mL, 115,000,000~200,000,000개 세포/mL, 120,000,000~200,000,000개 세포/mL, 125,000,000~200,000,000개 세포/mL, 130,000,000~200,000,000개 세포/mL, 135,000,000~200,000,000개 세포/mL, 140,000,000~200,000,000개 세포/mL, 145,000,000~200,000,000개 세포/mL, 150,000,000~200,000,000개 세포/mL, 155,000,000~200,000,000개 세포/mL, 160,000,000~200,000,000개 세포/mL, 165,000,000~200,000,000개 세포/mL, 170,000,000~200,000,000개 세포/mL, 175,000,000~200,000,000개 세포/mL, 180,000,000~200,000,000개 세포/mL, 185,000,000~200,000,000개 세포/mL, 190,000,000~200,000,000개 세포/mL, 195,000,000~200,000,000개 세포/mL, 100~1,000,000개 세포/mL, 500~750,000개 세포/mL, 1,000~500,000개 세포/mL, 또는 2,500~250,000개 세포/mL의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 섬 세포의 농도는 약 100~약 500,000,000개 세포/mL, 약 100~약 200,000,000개 세포/mL, 약 1,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 5,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 10,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 15,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 20,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 25,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 30,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 35,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 40,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 45,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 50,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 55,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 60,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 65,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 70,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 75,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 80,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 85,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 90,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 95,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 100,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 105,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 110,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 115,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 120,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 125,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 130,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 135,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 140,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 145,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 150,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 155,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 160,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 165,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 170,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 175,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 180,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 185,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 190,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 195,000,000~약 200,000,000개 세포/mL, 약 100~약 1,000,000개 세포/mL, 약 500~약 750,000개 세포/mL, 약 1,000~약 500,000개 세포/mL, 또는 약 2,500~약 250,000개 세포/mL의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포의 농도는 약 100개 세포/mL, 약 500개 세포/mL, 약 1000개 세포/mL, 약 2500개 세포/mL, 약 5000개 세포/mL, 약 7500개 세포/mL, 약 10000개 세포/mL, 약 25000개 세포/mL, 약 50000개 세포/mL, 약 75000개 세포/mL, 약 100000개 세포/mL, 약 250000개 세포/mL, 약 500000개 세포/mL, 약 750000개 세포/mL, 약 1,000,000개 세포/mL, 약 2,500,000개 세포/mL, 약 5,000,000개 세포/mL, 약 7,500,000개 세포/mL, 약 10,000,000개 세포/mL, 약 20,000,000개 세포/mL, 약 25,000,000개 세포/mL, 약 30,000,000개 세포/mL, 약 40,000,000개 세포/mL, 약 50,000,000개 세포/mL, 약 60,000,000개 세포/mL, 약 70,000,000개 세포/mL, 약 80,000,000개 세포/mL, 약 90,000,000개 세포/mL, 약 100,000,000개 세포/mL, 약 105,000,000개 세포/mL, 약 110,000,000개 세포/mL, 약 115,000,000개 세포/mL, 약 120,000,000개 세포/mL, 약 125,000,000개 세포/mL, 약 130,000,000개 세포/mL, 약 135,000,000개 세포/mL, 약 140,000,000개 세포/mL, 약 145,000,000개 세포/mL, 약 150,000,000개 세포/mL, 약 155,000,000개 세포/mL, 약 160,000,000개 세포/mL, 약 165,000,000개 세포/mL, 약 170,000,000개 세포/mL, 약 175,000,000개 세포/mL, 약 180,000,000개 세포/mL, 약 185,000,000개 세포/mL, 약 190,000,000개 세포/mL, 약 195,000,000개 세포/mL, 약 200,000,000개 세포/mL이다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 섬 세포의 농도는 100개 세포/mL, 500개 세포/mL, 1000개 세포/mL, 2500개 세포/mL, 5000개 세포/mL, 7500개 세포/mL, 10000개 세포/mL, 25000개 세포/mL, 50000개 세포/mL, 75000개 세포/mL, 100000개 세포/mL, 250000개 세포/mL, 500000개 세포/mL, 750000개 세포/mL, 1,000,000개 세포/mL, 2,500,000개 세포/mL, 5,000,000개 세포/mL, 7,500,000개 세포/mL, 10,000,000개 세포/mL, 20,000,000개 세포/mL, 25,000,000개 세포/mL, 30,000,000개 세포/mL, 40,000,000개 세포/mL, 50,000,000개 세포/mL, 60,000,000개 세포/mL, 70,000,000개 세포/mL, 80,000,000개 세포/mL, 90,000,000개 세포/mL, 100,000,000개 세포/mL, 105,000,000개 세포/mL, 110,000,000개 세포/mL, 115,000,000개 세포/mL, 120,000,000개 세포/mL, 125,000,000개 세포/mL, 130,000,000개 세포/mL, 135,000,000개 세포/mL, 140,000,000개 세포/mL, 145,000,000개 세포/mL, 150,000,000개 세포/mL, 155,000,000개 세포/mL, 160,000,000개 세포/mL, 165,000,000개 세포/mL, 170,000,000개 세포/mL, 175,000,000개 세포/mL, 180,000,000개 세포/mL, 185,000,000개 세포/mL, 190,000,000개 세포/mL, 195,000,000개 세포/mL, 200,000,000개 세포/mL이다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 섬 세포 클러스터의 농도는 100~200,000개 세포 클러스터/mL, 100~100,000개 세포 클러스터/mL, 500~100,000개 세포 클러스터/mL, 1,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 2,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 3,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 4,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 5,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 6,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 7,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 8,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 9,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 10,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 15,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 20,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 25,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 30,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 35,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 40,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 45,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 50,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 55,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 60,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 65,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 70,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 75,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 80,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 85,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 900,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 95,000~100,000개 세포 클러스터/mL의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 섬 세포 클러스터의 농도는 약 100~약 200,000개 세포 클러스터/mL, 약 100~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 500~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 1,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 2,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 3,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 4,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 5,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 6,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 7,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 8,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 9,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 10,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 15,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 20,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 25,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 30,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 35,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 40,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 45,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 50,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 55,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 60,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 65,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 70,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 75,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 80,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 85,000~100,000개 세포 클러스터/mL, 약 90,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL, 약 95,000~약 100,000개 세포 클러스터/mL의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 섬 세포 클러스터의 농도는 약 100개 세포 클러스터/mL, 약 500개 세포 클러스터/mL, 약 1,000개 세포 클러스터/mL, 약 2,000개 세포 클러스터/mL, 약 3,000개 세포 클러스터/mL, 약 4,000개 세포 클러스터/mL, 약 5,000개 세포 클러스터/mL, 약 6,000개 세포 클러스터/mL, 약 7,000개 세포 클러스터/mL, 약 8,000개 세포 클러스터/mL, 약 9,000개 세포 클러스터/mL, 약 10,000개 세포 클러스터/mL, 약 15,000개 세포 클러스터/mL, 약 20,000개 세포 클러스터/mL, 약 25,000개 세포 클러스터/mL, 약 30,000개 세포 클러스터/mL, 약 35,000개 세포 클러스터/mL, 약 40,000개 세포 클러스터/mL, 약 45,000개 세포 클러스터/mL, 약 50,000개 세포 클러스터/mL, 약 55,000개 세포 클러스터/mL, 약 60,000개 세포 클러스터/mL, 약 65,000개 세포 클러스터/mL, 약 70,000개 세포 클러스터/mL, 약 75,000개 세포 클러스터/mL, 약 80,000개 세포 클러스터/mL, 약 85,000개 세포 클러스터/mL, 약 90,000개 세포 클러스터/mL, 약 95,000개 세포 클러스터/mL, 약 100,000개 세포 클러스터/mL이다.
일부 실시양태에서, 수성상에 첨가된 섬 세포 클러스터의 농도는 100개 세포 클러스터/mL, 500개 세포 클러스터/mL, 1,000개 세포 클러스터/mL, 2,000개 세포 클러스터/mL, 3,000개 세포 클러스터/mL, 4,000개 세포 클러스터/mL, 5,000개 세포 클러스터/mL, 6,000개 세포 클러스터/mL, 7,000개 세포 클러스터/mL, 8,000개 세포 클러스터/mL, 9,000개 세포 클러스터/mL, 10,000개 세포 클러스터/mL, 15,000개 세포 클러스터/mL, 20,000개 세포 클러스터/mL, 25,000개 세포 클러스터/mL, 30,000개 세포 클러스터/mL, 35,000개 세포 클러스터/mL, 40,000개 세포 클러스터/mL, 45,000개 세포 클러스터/mL, 50,000개 세포 클러스터/mL, 55,000개 세포 클러스터/mL, 60,000개 세포 클러스터/mL, 65,000개 세포 클러스터/mL, 70,000개 세포 클러스터/mL, 75,000개 세포 클러스터/mL, 80,000개 세포 클러스터/mL, 85,000개 세포 클러스터/mL, 90,000개 세포 클러스터/mL, 95,000개 세포 클러스터/mL, 100,000개 세포 클러스터/mL이다.
특정 실시양태에서, 수성상에 첨가된 세포/세포 클러스터의 농도는 5,000 내지 100,000개 세포/mL의 범위이다. 특정 실시양태에서, 수성상에 첨가된 5,000 내지 250,000개 세포/mL는 췌장 섬 세포이고, 이는 선택적으로 인슐린 분비 베타 세포 또는 세포 클러스터가 농축될 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3 또는 7.4이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.1이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.2이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.3이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.4이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.5이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.6이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.7이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.8이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6.9이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 7.0이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 7.1이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 7.2이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 7.3이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 7.4이다. 특정 실시양태에서, 수성상의 pH는 약 6~7.4이다.
본원에 제시된 바와 같이, 수성상의 pH는 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.4, 7.5, 또는 8이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.0이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.1이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.2이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.3이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.4이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.5이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.6이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.7이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.8이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 6.9이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 7.0이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 7.1이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 7.2이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 7.3이다. 일부 실시양태에서, 수성상의 pH는 7.4이다. 특정 실시양태에서, 수성상의 pH는 6~7.4이다.
일부 실시양태에서, 수성상은 배지, 계면활성제, 및 하나 이상의 티올화 또는 환원 시약(예를 들어, 선형 또는 다중-아암인 단일- 또는 다중-기능성 제제일 수 있음) 중 세포 및/또는 세포 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포/세포 클러스터는 섬 세포를 포함하고, 배지는 무혈청이거나 행크 균형 염 용액(HBSS)이고, 및/또는 티올화 또는 환원 시약은 DTT 또는 선형 2기능성 PEG디티올이다. 일부 실시양태에서, 수성상은 pH 7.4에서 5~10% PEG(예를 들어, 5% 또는 10% PEG) 및 50,000~250,000개 섬 세포 또는 세포 클러스터/mL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성상은 pH 6 내지 7.4에서 1~30% PEG(예를 들어, 1% 또는 30% PEG) 및 50,000~250,000개 섬 세포 또는 세포 클러스터/mL을 포함한다. 본 개시내용의 등각 코팅 방법은 이들 값의 임의의 조합을 포괄한다.
일부 실시양태에서, 유상은 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 수성상의 점도보다 적어도 2.5배 더 높은 점도를 갖는 미네랄 오일, 10% 소르비탄 모노 올레에이트가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 10% 소르비탄 모노 올레에이트가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함하고, 상기 유상은 선택적으로 트리에탄올아민을 포함한다. 트리에탄올아민-포함 실시양태에서, 유상은 0.01~0.2% 트리에탄올아민을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유상은, 예를 들어 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 또는 수성상의 점도보다 적어도 2.5배 더 큰 점도를 갖는 미네랄 오일 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유상은 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 수성상의 점도보다 적어도 2.5배 더 큰 점도를 갖는 미네랄 오일을 포함한다.
유상은 하나 이상의 제제, 예를 들어 Span80을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유상은 PPG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유상은 1~20%, 5~15%, 6~14%, 7~13%, 8~12%, 9~11%, 또는 10% Span80이 포함된 PPG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 1~20% Span80이 포함된 PPG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 5~15% Span80이 포함된 PPG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 6~14% Span80이 포함된 PPG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 7~13% Span80이 포함된 PPG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 8~12% Span80이 포함된 PPG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유상은 9~11% Span80이 포함된 PPG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유상은 10% Span80이 포함된 PPG를 포함한다.
일부 실시양태에서, 수성상(Qw) 및 유상(Qo)의 유속은 각각 10 μl/분 및 3.5 ml/분; 15 μl/분 및 3.5 ml/분; 20 μl/분 및 3.5 ml/분; 1 μl/분 및 3.5 ml/분; 10 μl/분 및 7 ml/분; 50 μl/분 및 0.5 ml/분; 50 μl/분 및 2.5 ml/분; 150 μl/분 및 0.5 ml/분; 및 150 μl/분 및 2.5 ml/분으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 오일 제트에서 물의 안정화를 허용하기 위해 수성상 전에 공기가 주입된다. 특정 실시양태에서, 공기가 수성상을 함유하는 주입 카테터로 유입되어, 수성상의 시작을 가시화하는 것을 돕기 위해 수성상을 유상에 주입하기 전에 공기 기포가 유상에 주입될 수 있다.
수성상 및 유상의 유속은 시간이 지남에 따라 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수성상은 시간이 지남에 따라 감소되는 반면 유상은 증가된다. 특정 실시양태에서, 수성상은 먼저 50 μl/분으로 유상에 들어간 다음 10 μl/분으로 감소된다. 특정 실시양태에서, 유상 속도는 0.5에서 3.5 ml/분으로 점진적으로 증가되는 반면 수성상은 감소된 다음 전체 캡슐화 공정 동안 일정하게 유지되거나, 유상 속도는 캡슐화 공정에 걸쳐 3.5 ml/분으로 일정하게 유지된다.
일부 실시양태에서, 유상 속도 대 수성상 속도의 비는 70 내지 500이다. 특정 실시양태에서, 비는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 450, 또는 500이다. 특정 실시양태에서,비는 350이다.
일부 실시양태에서, 유상 점도 대 수성상 점도의 비는 2.5 내지 100이다. 특정 실시양태에서, 비는 2.5, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100이다. 특정 실시양태에서, 비는 3.5이다.
워터 제트의 분해 시, 캡슐화를 위한 물질(예를 들어 세포 및/또는 세포 클러스터)은 제트의 크기에 비례하는 얇은 코팅 물질 함유 수층으로 코팅되어 등각 코팅을 허용한다. 이어서 본원에 개시된 바와 같이, 코팅은 중합을 촉진하는 겔화 에멀젼과 동축으로 접촉함으로써 중합체로 형성된다. 특정 실시양태에서, 에멀젼은 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 중 디티오테이톨 및 행크 균형 염 용액(HBSS)을 포함한다.
이어서 코팅된 세포/세포 클러스터는 코팅 장치의 유출물로부터 수집된다. 일부 실시양태에서, 수집 후, 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는 코팅의 중합이 완료될 때까지 융합을 피하기 위해, 예를 들어 1~30, 5~20, 또는 8~12분 동안 교반 하에 유지된다. 일부 실시양태에서, 교반은 4 내지 25℃에서 일어난다. 특정 실시양태에서, 교반은 25℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 교반 속도는 50~500 rpm 또는 100~300 rpm이다. 일부 실시양태에서, 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는 약 7분 동안 계속 교반된다. 일부 실시양태에서, 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는 용기에 수집되고 중력에 의해 침강되도록 허용된다. 일부 실시양태에서, 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는 코팅의 중합이 완료되도록 하기 위해, 예를 들어 1~30, 5~20, 또는 8~12분 동안 외부조에서 교반 없이 유지된다. 일부 실시양태에서, 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는 미네랄 오일 및 0.01~0.1% 트리에탄올아민을 포함하는 용기 내에서 수집된다.
코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터를 생체물질이 없는 코팅 물질과 분리하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 분리는, 예를 들어 구배 원심분리에 의해, 당분야에 잘 알려진 임의의 여러 크기 또는 밀도 기반 분리 기술에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는 다음 단계를 포함하는, 구배 원심분리에 의해 코팅 물질로부터 추가로 정제된다:
(a) 용액을 적층하여 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질을 분리할 수 있는 밀도 구배를 형성하는 단계; (b) 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질을 밀도 구배에 적용하는 단계; (c) 밀도 구배를 원심분리하여 등각 코팅된 생체물질을 생체물질이 없는 코팅 물질과 분리하는 단계; 및 (d) 생체물질이 없는 코팅 물질을 포함하는 구배 부분을 제거하는 단계.
일부 실시양태에서, 구배를 형성하기 위해 적층되는 용액은 (1) 1~1.1 g/ml, 예를 들어, 1.042 g/ml 및 (2) 배지의 밀도이다. 일부 실시양태에서, 코팅된 생체물질의 50, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 초과가 생체물질이 없는 코팅 물질로부터 정제된다. 특정 실시양태에서, 코팅된 생체물질의 95% 초과가 생체물질이 없는 코팅 물질로부터 정제된다.
특정 실시양태에서, 등각 코팅된 생체물질, 특히 세포는 HBSS를 포함하는 특정 실시양태에서, 반복적으로 세척된다. 정제 후 등각 코팅된 생체물질을 포함하는 세포는 적절한 배양 조건 하에 시험관내 배양될 수 있다.
코팅 물질이 형광 표지를 포함하는 경우, 등각 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터는, 예를 들어 형광 현미경측정, 형광세포계측, 유세포계측 세포 분류 기술에 의해, 또는 형광 플레이트 판독기에 의해 가시화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광 표지된 등각 코팅된 세포는, 예를 들어 유세포계측 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 검출 및/또는 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 적어도 50,000; 100,000; 150,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 또는 1,000,000개 세포 및/또는 세포 클러스터를 동시에 등각 코팅하기 위해 확장된다. 일부 실시양태에서, 이러한 확장은 일련의 챔버에서 본 개시내용의 방법을 수행함으로써 달성된다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 일련의 평행 수직 챔버를, 예를 들어, 각각의 챔버로의 방사상 유동이 필적하는 유체역학적 유동 특성을 갖는 각각의 개별 챔버에 수성상을 공급하는 방사상 구성으로 조립함으로써 확장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 챔버로부터의 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터 및 생체물질이 없는 코팅 물질은 별도의 용기에 수집된다. 일부 실시양태에서, 각 챔버로부터의 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터 및 생체물질이 없는 코팅 물질은 동일한 용기에 수집되고 동시에 정제된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 코팅 장치에 도입된 생체물질의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 초과의 등각 코팅을 제공한다. 특정 실시양태에서, 개시된 방법은 도입된 생체물질의 95% 초과의 등각 코팅을 제공한다.
일부 실시양태에서, 코팅된 세포 및/또는 세포 클러스터의 생활성 및 기능은 당분야에 잘 알려진 임의의 여러 방법, 예를 들어 MTT 검정, 살아있는/죽은 염색 및/또는 (섬의 경우) 정적 글루코스 자극 인슐린 분비 또는 관류에 의해 평가된다. 일부 실시양태에서, 상기 평가는 세포 임플란트 전에 일어난다. 코팅된 세포가 섬인 경우, 등각 코팅에 의한 이식된 섬의 면역보호는, 예를 들어 이식받은 환자의 글루코스 수준 및/또는 체중, 혈청 C 펩티드 수준, 헤모글로빈 A1c의 모니터링에 의해 및/또는 조직학적 평가에 의해 평가될 수 있다.
본 개시내용은 본원에 언급된 방법에 의해 단리된 등각 코팅된 생체물질을 환자로 임플란트하는 단계를 포함하는, 환자에서 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 장애는 당뇨병, 혈우병, 신부전, 아밀로이드증, 면역계 장애, 염증, 만성 통증, 관절염, 고혈압, 신경계 장애, 대사 장애, 내분비 장애, 림프증식성 장애, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 줄기 세포 장애, 식세포 장애, 조직구 장애, 적혈구 또는 혈소판의 이상, 형질 세포 장애, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 악성 종양(유방 암종, 유잉 육종, 신경모세포종, 신세포 암종 등), 갑상샘기능저하증, 뇌하수체기능저하증, 성선기능저하증, 이식편 실패, 이식편대숙주병(GVD), 정맥-폐쇄성 질환, 이식 전 화학치료법의 부작용(예컨대 과도한 출혈, 불임, 그리고 신장뿐만 아니라 폐 및 심장 합병증), 및 다른 장애 그리고 숙련된 의사에 의해 인식될 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 언급된 용어 "환자"는 치료적 처치의 수신체를 지칭하고 모든 동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 영장류이다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다.
본 개시내용의 방법에 의해 생성된 등각 코팅된 생체물질은 환자 내의 임의의 적절한 위치에 임플란트될 수 있다. 생체물질은 살아있는 또는 사전 혈관화된 부위; 생리적 또는 암화된 부위에; 그리고 조직 및 기관내 또는 이에 인접하여 임플란트될 수 있다. 특정 실시양태에서, 임플란트 위치는, 예를 들어, 망내(망 파우치 내), 피하, 복강내, 복막전, 근육내, 림프절내, 또는 신장 피막하일 수 있다. 일부 실시양태에서, 임플란트 위치는 피하이다. 일부 실시양태에서, 임플란트 위치는 복강이 아니다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 등각 코팅된 생체물질은 환자에게 임플란트되기 전에 장치에 배치되어 환자 면역 반응을 감소시키고/시키거나 세포의 생존을 연장한다. 장치는 환자의 생물학적 물질의 임플란트에 적합한 임의의 장치, 예를 들어 각각은 전체가 본원에 참조로 포함되는, 미국 공개 번호 2006/0024276 또는 미국 특허 번호 6,716,246에 기재된 바와 같은 장치일 수 있다. 일부 실시양태에서, 등각 코팅된 생체물질은 천연 또는 합성, 생분해성 또는 비-생분해성 스캐폴딩 기재 내에 또는 이에 인접하여 임플란트된다.
하기 실시예는 본 개시내용의 특정 실시양태, 및 이의 다양한 용도를 예시한다. 이들은 설명의 목적으로만 제시되며 어떤 식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
본원에 제시된 등각 코팅 절차는 2017년 4월 4일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 15/478320, 미국 특허 출원 번호 14/114,690, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2012/035696 및 미국 특허 가출원 번호 61/480,513에 개시된 절차에 대한 개선이며, 이들 각각의 개시내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다. 이러한 개선에는 특히 생체물질, 특히 세포 및 가장 특히 섬 세포를 저 pH(즉, 약 pH 5 미만) 조건에 노출시키는 것의 배제 및 상기 생체물질을 포함하는 수성상에서 점도 향상제의 제거가 관여되며, 이는 캡슐화된 섬 기능성 및 코팅 생체적합성의 개선을 초래한다.
개선된 등각
코팅 절차에서 사용하기 위한 물질:
개선된 등각 코팅 절차에서 사용되는 시약:
겔화 에멀젼 - 행크 균형 염 용액(HBSS) 중 디티오트레이톨 용액(25 mg/mL 디티오트레이톨)을 유화(유백색)되고 균일하게 혼합될 때까지 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 500 mL에 교반하며 천천히 첨가하였다.
최소 가교된 PEG-MAL 용액 - 400 μl의 12.5% w/v PEG-MAL(10 kDa, 8 아암, 75% 기능화)에, 2.6 μL의 1 N HCl을 첨가한 다음 볼텍싱하고(불균일 혼합으로 인한 즉각적 겔화를 방지함), 22.22 μL의 10X PEG-SH 용액을 혼합하여 첨가하였다. 이것은 최소 가교된 PEG-MAL 용액을 제공했다.
별도로, 1 μL의 1 N NaOH를 400 μl의 HBSS에 첨가한 후, 401 μL의 최소 가교된 PEG-MAL 용액에 첨가하고, 이어서 완전히 볼텍싱하였다. 이어서, 이 혼합물을 부분적으로 겔화되도록 방치하여, 30분 동안 점성 액체로 전환시켰다. 이 겔화 단계는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45분 동안 수행할 수 있다.
기구 설정
도 1 및 도 1a에 예시된 바와 같이, 코팅 장치의 성분을 세정하고 건조되도록 방치한 다음, 모세관, 모세관 나사 및 기포 트랩을 제외하고 재조립 및 멸균하였다(전형적으로, 오토클레이브에서). 구체적으로, 도 1a에 나타낸 3개 부품, 패널 (ii), (iii) 및 (iv)를 나사로 함께 고정했다. 나사를 조이기 전에 한 쌍의 고무 밸브를 도 1a(iii)에 나타낸 부품 상에 배치했다. 유리 모세관을 도 1a, 패널(iv)에 나타낸 부품의 하부 오리피스로 삽입하고 제자리에 고정했다. 각각의 준비를 위해, 사용하지 않은 새 타이곤 펌프 튜브 및 강성 튜브(주사기 펌프와 함께 사용)를 세척하고 멸균했다. 유사한 세척 및 멸균 절차를 해밀턴 주사기에 사용했다. 절차의 나머지 모든 단계는 세포 배양, 층류 후드 하에 수행하였으며, 기구는 도 1 및 1a에 나타낸 바와 같이 조립했다. 그런 다음 모세관 튜브를 장착하고 모세관 나사로 제자리에 고정하고 전형적으로 50 mL 원뿔형 튜브인 1개의 폐기물 용기를 모세관 아래에 배치하였다. 기포 트랩도 도 1 및 1a에 나타낸 바와 같이 장치 상에 배치했다.
이어서 유리 해밀턴 주사기를 가스 기포를 도입하지 않고 미네랄 오일로 충전하고, 편리하게 5 ml 루어 락 주사기에 이어 해밀턴 주사기에 연결된 프라이밍된 튜브를 사용하여 미네랄 오일로 프라이밍함으로써 강성 튜브를 준비하였다. 그런 다음 주사기는 적절한 카테터 프라이밍을 허용하도록 주사기에 적어도 2 mL 미네랄 오일을 남기도록 주의하면서, 도 1 및 1a에 나타낸 바와 같이 주사기 펌프 상에 고정했다. 강성 튜브의 원위 단부는 도 1a에 나타낸 바와 같이 강철 스탠드에 편리하게 고정한다.
타이곤 튜브를 연동 펌프에 부착하고 PPG 및 10% Span 80의 용액을 함유하는 50 mL 원뿔형 튜브(또는 다른 용기)와 접촉시켰다. 이어서 타이곤 튜브의 원위 단부를 도 1a에 나타낸 바와 같이 코팅 장치에 부착한 후 펌프를 프라이밍하였다. 그런 다음 펌프를, 예를 들어 50 mL 원뿔형 튜브에 전달되는 양을 3.5 g으로 보정하여 3.5 ml/분의 유속으로 프라이밍했다.
이어서, 멸균 카테터를 강성 튜브의 단부에 부착하고 주사기 펌프 유속을 2 mL/분으로 설정하였다. 카테터는 모든 공기 기포가 제거됨을 확인하기 위해 프라이밍하였고 주사기에 적어도 1 mL의 미네랄 오일을 남겼다.
마지막으로, 두 개의 넓은 오리피스의 200 μl 마이크로피펫 팁을 편리하게 모세관의 반대쪽 단부 상에서 집 타이 및 유리 모세관에 고정된 넓은 오리피스의 팁에 부착된 2개의 연동 튜브를 사용하여 유리 모세관에 부착하였다. 그런 다음 튜브/모세관 어셈블리를 도 1 및 1a에 나타낸 대로 연동 펌프로 장착하고, 연동 튜브의 단부를 겔화 에멀젼으로 침지하였다. 완전히 조립된 기구의 사진을 도 1b에 나타낸다. 또한 3D-인쇄 맞춤형 기구는 이 단락에서 이전에 설명된 어셈블리를 대체하도록 설계되었다(도 1c). 간단히 말해서, 이 기구는 유리 모세관 위로 미끄러져 맞물도록 설계되었으며 연동 튜브를 직접 부착할 수 있는 2개의 가시가 있는 입구를 갖는다.
등각 코팅 공정:
췌장 섬 세포를 하기 프로토콜에 따라 등각 코팅하였다. 세포 배양 배지 중 대략 10,000개 섬 세포 당량(IEQ)을 1.5 ml 저결합, 멸균 에펜도르프 튜브로 도입하고 150 RCF에서 1분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화했다. 상청액 세포 배양 배지를 따라낸 후, 섬 세포를 편리하게 P100 피펫터에 부착된 200 μl 넓은 오리피스 팁을 사용하여 100 μl의 최소 가교된 PEG-MAL 중에(중성 pH에서) 재현탁했다. 그런 다음 정밀 주사기 펌프를 사용하여 분당 100 μl의 회수율로 세포를 16G 카테터(Surflash®)로 회수했다. 이어서 겔화 에멀젼을 모세관으로 도입하고 4 mL/분의 유속으로 150 mL 수집 비이커로 흘렸다. 기포 제거를 보장하기 위해 기포 트랩을 개방하고 PPG/Span 80 혼합물을 3.5 ml/분의 보정된 속도로 장치에 도입했다(기포 트랩은 다양한 액체 성분의 도입으로 인한 기포가 장치로부터 제거되면 폐쇄됨).
이어서 섬 세포를 포함하는 16G 카테터(Surflash®)를 장치의 상부로 삽입하고, 섬을 포함하는 PEG-MAL 현탁액을 분당 15 μl의 속도로 하버드 주사기 펌프를 사용하여 모세관으로 흘렸다. 코팅 절차는 약 7분 동안 진행되도록 했으며, 안정적인 전이를 보장하기 위해 절차에 걸쳐 적하에서 제팅으로의 전이를 관찰했다. 그 후, 2개의 연동 펌프 및 하버드 주사기 펌프를 끄고 150 mL 수집 비이커에 수집된 등각 코팅된 섬을 12분 동안 겔화되도록 하였다.
정제 공정
등각 코팅 절차로부터 수집된 유출물을 전형적으로 240 rpm의 교반 속도로 1 L 비이커에 함유된 200 mL의 미네랄 오일로 천천히 부었다. 그 다음, 섬 함유 용기를 HBSS-/-로 헹구고 섬 세포 및 미네랄 오일을 함유하는 용기의 부피를 HBSS-/-로 총 500 mL로 조정하고 동일한 속도로 2분 동안 계속 교반하였다. 그 후, 혼합물을 2개의 250 mL 부분으로 원뿔형 튜브에 분리하고 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 약 5 ml의 세포 함유 펠렛을 남겼다.
세포 펠렛을 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 펠렛화 튜브를 HBSS-/-로 헹구고 각각의 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가하였다. 섬 세포를 함유하는 50 mL 원뿔형 튜브의 부피를 HBSS-/-를 사용하여 50 mL로 조정하고 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리했다. 이 원심분리로부터의 세포 펠렛을 15 ml 튜브로 옮기고, 50 mL 튜브를 HBSS-/-로 헹구고 15 ml 튜브에 첨가했다. 섬 세포를 함유하는 15 ml 원뿔형 튜브의 부피를 각각 HBSS-/-를 사용하여 15 ml로 조정하고 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 상청액을 제거하고 세포를 250 μL 1X PEG-SH로 1분 동안 인큐베이션하고, 1분 후 각각의 15 ml 원뿔형 튜브의 부피를 HBSS-/-로 15 ml로 조정하고 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리했다. 그 다음, 등각 코팅된 섬 세포를 포함하는 세포 펠렛을 1 mL 세포 배양 배지로 3회 헹구고 매번 1분 동안 1,000 rpm에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 헹구어낸 등각 코팅된 섬 세포를 10 cm 페트리 접시에 10 mL 세포 배양 배지 중에 플레이팅했다.
세포 생활성 및 기능성 비교:
세포 생활성 및 기능성에 대한 이전 방법의 효과
각각의 개시 내용이 명시적으로 본원에 참조로 포함되는, 2017년 4월 4일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 15/478320, 미국 특허 출원 번호 14/114,690, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2012/035696, 및 미국 특허 가출원 번호 61/480,513에 제시된 등각 코팅 방법을 사용하여, 더 pH에서 PEG 및 양친매성 자가 조립 펩티드로 등각 코팅된 비인간 영장류(NHP) 섬(도 2, 패널 a에 나타냄)은 시험관내 정적(GSIS) 및 동적(관류) 글루코스 자극 인슐린 분비에 불량하게 반응하였다(도 2, 패널 b 및 c). CC NHP 섬의 절대 인슐린 분비 및 자극 지수는 네이키드 섬보다 낮았다. 일치하게, CC NHP 섬은 NSG 마우스의 지방 패드 또는 신장 캡슐에 이식 후 당뇨병을 역전시킬 수 없었지만(도 2, 패널 d에 나타냄), 검출 가능한 인간 C-펩티드가 모든 수신체 마우스에서 발견되었다(도 2, 패널 e). 추가 비교 연구는 도 3에 나타낸 바와 같이, pH에 따라 섬 세포 생활성이 감소함을 표시하였다.
큰 동물에서의 생체적합성에 대한 이전 방법의 효과
당뇨병 NHP에서, 생물학적 스캐폴드(도 4, 패널 a)를 사용하는 망 파우치에서 CC NHP 섬의 복강경 임플란트를 완전 동종 CC NHP 섬 및 스테로이드가 없는 면역억제의 한계 용량(5 k IEQ/kg)을 사용하여 실증했다. 그럼에도 불구하고, CC NHP 섬의 이식 후 인슐린 요구량 및 검출 가능한 C 펩티드의 감소로 CC NHP 섬의 최소 기능만이 관찰되었다(도 4, 패널 b). 이식 21일 후에 체외이식된 이식편의 조직학적 검사는 이식편에서 인슐린 양성 CC NHP 섬의 존재 및 T 세포 침윤의 부재를 드러냈다(도 4, 패널 d). 그러나 이전의 "저 pH" 방법을 사용하여 생산된 PEG/PEG-SH/펩티드의 망 파우치에서의 생체적합성은 불량하였다. 병리학적 검사는 다수의 다핵 거대 세포 및 섬유형성증을 특징으로 하는 광범위한, 만성, 활성 중증 염증 반응을 드러냈다(도 4, 패널 c).
새로운 등각 코팅 방법의 시험: 개선된 세포 생활성 및 기능성
본원에 제시된 등각 코팅 방법은 (i) 점도 향상제 성분을 제거함으로써 코팅의 생체적합성을 개선하고 순수한 PEG 코팅을 얻고 (ii) 중성 pH에서 코팅을 허용하여 코팅된 섬(NHP 섬 포함)의 생활성 및 기능성을 최대화한다. 선행 출원에 제시된 방법으로부터의 변화는 PEG-MAL-PEG-SH 가교제의 가교 가능한 아암의 20%를 최소 가교함으로써 특히 코팅될 섬 세포를 포함할 수 있는 수성상의 점도를 증가시키는 것을 포함하고, 이는 등각 코팅 형성을 위해 유상 내에서 수성상을 제팅하는 데 필요한 점도를 달성했다. 본원에 개시된 방법에서, 폴리프로필렌 글리콜 및 Span80 계면활성제 중 디티오트레이톨(DTT) 용액의 에멀젼을 수성상과 동축으로 흐르게 하여 캡슐 형성이 일어나는 제트 분해의 하류에서, 그러나 제팅 수성상의 분해가 일어나는 장치의 부품 하류에서 섬 주변의 PEG-MAL의 완전한 겔화가 발생한다.
순수한 PEG로(생체적합성 개선을 위해) 및 생리적 pH에서(NHP 섬 기능성 개선을 위해) CC를 허용하도록 재설계된 코팅 방법을 인간 및 NHP 섬 둘 다에서 시험하였고, 이는 NHP 및 인간의 섬 모두의 시험관내 글루코스-자극 인슐린 분비 검정 성능의 증가를 나타내었다. 결과를 도 5에 나타내며, 인간 섬은 본원에 개시된 방법으로 효율적으로 코팅되었고(도 5, 패널 a), 생활성이었으며(도 5, 패널 b), 네이키드 섬과 필적하고 종종 더 높은 시험관내(도 5, 패널 c~f) 및 생체내(도 5, 패널 g~i) 기능을 나타내었다. 이 방법으로 CC 섬의 절대 인슐린 분비는 네이키드 섬에 비해 감소되지 않았고 당뇨병 동물에서 내당능이 개선되었다.
NHP 섬에서 생리적 pH에서 등각 코팅된 인간 섬 세포의 이식
본원에 제시된 방법을 사용하여 CC 인간 섬을 공동-자극 차단을 갖는 당뇨병 NHP 섬의 점액낭에 이식하였다. Orencia®(20 mg/kg IV)를 수술 후 날짜(POD) -1, 0, 3, 7, 14, 21 및 28에 및 이후 매주, 그리고 POD -1, 0, 3, 7, 14, 21, 및 28에 및 이후 10일마다 항-CD154(20 mg/kg IV)를 투여하였다. POD 0에, 복강경 절차를 사용하여 동물에 점액낭에서 20,358개 섬 당량(IEQ)/kg을 수여하였다. POD 55에 선택적 부검을 수행했다. 당뇨병 게잡이 원숭이의 점액낭에 CC NHP 섬을 임플란트하기 위한 복강경 절차의 타당성을 평가했다(도 6, 패널 a). 외인성 인슐린 요구량(EIR, 실선), 혈당(점), CC NHP 섬 수신체의 c-펩티드는 감소된 혈당 수준으로서 이식된 CC 인간 섬의 최소 기능을 실증했다(도 6, 패널 b 및 c). 체외외식된 CC NHP 부여물 및 이식편 재혈관화의 조직학적 평가를 평가했다(도 6, 패널 d 및 e).
당뇨병, 면역적격 루이스 래트 망으로의 동계 루이스 래트 섬의 이식
루이스 래트를 스트렙토조토신 주사에 의해 당뇨병(혈당 > 250 mg/dL)으로 만들었다. 2,500개의 네이키드 또는 등각 코팅된 루이스 래트 섬을 당뇨병 루이스 래트의 망 파우치에 이식했다. 당뇨병은 수술 후 날짜(POD) 36까지 혈당 측정 및 POD 30에 복강내 내당능 시험에 의해 모니터링했다. 패널 a: 네이키드 및 등각 코팅된 루이스 래트 섬의 수신체의 혈당을 평가했다(도 7, 패널 a). 수술 후 날짜(POD) 30에, 네이키드 및 등각 코팅된 루이스 래트 섬의 수신체의 복강내 내당능 시험(IPGTT) 및 IPGTT 곡선 하 면적을 평가했다(도 7, 패널 b 및 c). 네이키드(실선, 점 마커) 및 등각 코팅된(파선, 사각형 마커) 루이스 래트 섬의 수신체의 IPGTT 동안 공복 및 자극 C 펩티드도 분석했다(도 7 패널 d).
자연적 당뇨병 NOD 마우스에 이식된 동종 MIN6 인슐린종 세포 클러스터의 생체내 효과
MIN6 세포를 4일 동안 현탁 배양하여 클러스터로 응집시킨 다음 등각 코팅하였다. 혈당 > 250 mg/dL로 자연적으로 당뇨병이 발병한 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스에 4,000개 IEQ/마우스 용량으로 네이키드 또는 등각 코팅된(CC) MIN6 클러스터를 이식했다. 마우스 사망률을 평가하고, 네이키드 및 CC 수신체 마우스의 혈중 c-펩티드 수준을 측정하고, 이식편의 조직학적 평가에 의해 이식편 기능성 및 생존을 모니터링했다. 도 8, 패널 a는 네이키드(및 등각 코팅된 MIN6 클러스터)의 위상차 이미지를 나타낸다. 도 8, 패널 b는 3차원으로 캡슐 완전성을 나타내는 항-PEG 염색 및 인접한 수직 투영으로의 등각 코팅된 MIN6 클러스터의 공초점 현미경사진을 나타낸다. 개선된 CC 클러스터의 생존을 나타내는 네이키드 및 등각 코팅된 MIN6 클러스터의 수신체의 사망률을 평가했다(도 8, 패널 c). (패널 d) 네이키드 및 등각 코팅된 MIN6 클러스터의 수신체의 무작위, 비-공복 C 펩티드 수준을 평가했다(도 8, 패널 d). 체외이식된 CC MIN6 클러스터 이식편의 조직학적 평가 및 CC 캡슐 내 세포 클러스터의 생존을 평가했다(도 8, 패널 e).
당뇨병의 돼지 모델에서 등각 코팅된 섬의 자가이식편 평가
대략 8주령의 요크셔-랜드레이스(Yorkshire-Landrace) 돼지에 90% 췌장절제술 및 섬 단리 4~8주 전에 심부 피하 공간에 2~4개의 세포 파우치(8-플러그 또는 10-플러그)(Sernova Corp, London Ontario)를 임플란트한다(표준 절차에 의해 수행). 엄격한 고혈당 상태를 보장하기 위해, 돼지에게 췌장절제술 후 150 mg/kg의 스트렙토조토신을 정맥내 투약할 수 있다. 단리된 섬으로 등각 코팅 공정을 거친 후 출시 기준에 대해 시험하였다. 등각 코팅된 섬이 출시 기준을 통과했음을 확인한 후, 단리 대략 5일 후에 췌장 섬을 사전 혈관화된 세포 파우치 챔버로 이식하여 췌장 절제술로부터의 회복 및 당뇨병 상태를 확인할 수 있도록 한다. 이식편 기능을 격주 혈당 및 체중 측정뿐만 아니라 필요에 따라 매월 정맥내 내당능 시험(IVGTT)을 통해 평가한다. C-펩티드의 공복 및 IVGTT 혈액 값을 측정하고 이식 전 대조군과 비교한다. 연구 종료 시, 세포 파우치를 표준 조직학적 공정을 통해 체외이식하고 준비하여 섬의 인슐린 염색, 세포 파우치 챔버 내의 미세혈관 발달 및 섬 세포 생활성을 평가한다. 세포 파우치 체외이식 후, 혈당 제어 상실을 확인하기 위해 상기 유효성 측정을 취한다. 글루코스 소실률, 혈당 곡선 하 면적 및 C-펩티드 수준을 평가할 수 있다.
당뇨병의 동종이식편 돼지 모델에서 등각 코팅된 공여체 섬의 평가
섬 동종이식편을 수여받기 6 내지 8주 전에, 대략 1세령 암컷 소형 괴팅겐(Gottingen) 돼지에 심부 피하 공간에 2개의(8-플러그 또는 10-플러그) Cell Pouches™(Sernova Corp, London Ontario)를 임플란트한다. 공여체 섬은 2세령 초과의 은퇴한 육종 요크셔-랜드레이스 돼지로부터 표준 절차에 의해 조달 및 단리한다. 단리된 섬으로 등각 코팅 공정을 거치고 출시 기준의 통과를 확인한다. 이식 1~3주 전에, 동물에 150 mg/kg의 스트렙토조토신을 정맥내 투약하여 당뇨병을 화학적으로 유도한다. 엄격한 고혈당 상태를 보장하기 위해, 당뇨병 정맥내 내당능 시험(IVGTT)을 등각 섬 이식 전에 수행한다. 순차적 순서로 세포 파우치의 외과적 노출 및 플러그 제거 후 수신체 소형 돼지에 2,500~10,000개 IEQ/kg 범위의 동종 등각 코팅된 섬을 사전 혈관화된 피하 Cell Pouch™로 이식한다. 이식편 기능을 격주 혈당 및 체중 측정뿐만 아니라 필요에 따라 매월 정맥내 내당능 시험(IVGTT)을 통해 평가한다. C-펩티드의 공복 및 IVGTT 혈액 값을 측정하고 이식 전 대조군과 비교한다. 연구 종료 시, 세포 파우치를 표준 조직학적 공정을 통해 체외이식 및 준비하여 섬의 인슐린 염색 및 세포 파우치 챔버 내에서 혈당 제어(예를 들어 글루카곤, 소마토스타틴) 및 미세혈관 발달에 중요한 다른 호르몬을 평가한다. 세포 파우치 체외이식 후 혈당 제어 상실을 확인하기 위해 상기 측정을 취한다. 글루코스 소실률, 혈당 곡선 하 면적 및 C-펩티드 수준도 측정할 수 있다.
당뇨병의 이종이식편 돼지 모델에서 등각 코팅된 인간 글루코스 반응성 줄기 세포 유래 섬의 평가
글루코스 반응성 등각 코팅된 인간 줄기 세포 유래 기술(iPSC 또는 ESC)을 수여받기 6 내지 8주 전에 대략 1세령 암컷 소형 괴팅겐 돼지에 심부 피하 공간에 2개의(8-플러그 또는 10-플러그) Cell Pouches™(Sernova Corp, London, Ontario)를 임플란트하였다. 세포 이식 전에 줄기 세포 유래 인슐린 생산 세포 또는 세포 클러스터를 준비하고 등각 코팅 공정을 거친 후 세포가 표준 출시 기준을 충족하는지 확인한다. 등각 코팅된 줄기 세포 유래 이식 1~3주 전에, 150 mg/kg의 스트렙토조토신을 동물에 정맥내 투약함으로써 당뇨병을 화학적으로 유도한다. 엄격한 고혈당 상태를 보장하기 위해, 등각 줄기 세포 유래 세포 이식 전에 당뇨병 정맥내 내당능 시험(IVGTT)을 수행한다. 수신체 소형 돼지에 순차적 방식으로 세포 파우치 챔버의 외과적 노출 및 플러그 제거 후 2,500~10,000개 IEQ/kg(또는 동등물) 범위의 동종 등각 코팅된 섬 또는 섬 클러스터를 사전 혈관화된 피하 Cell Pouch™ 챔버로 이식한다. 이식편 기능을 격주 혈당 및 체중 측정뿐만 아니라 필요에 따라 매월 정맥내 내당능 시험(IVGTT)을 통해 평가한다. C-펩티드의 공복 및 IVGTT 혈액 값을 측정하고 이식 전 대조군과 비교한다. 연구 종료 시, 세포 파우치를 표준 조직학적 공정을 통해 체외이식 및 준비하여 섬 인슐린 염색 및 혈당 제어에 중요한 다른 호르몬(즉, 글루카곤, 소마토스타틴) 및 세포 파우치 챔버 내의 미세혈관 발달을 평가할 뿐만 아니라 인간 줄기 세포 유래 생존을 확인한다. 세포 파우치 체외이식 후 상기 측정을 취하여 혈당 제어 상실을 확인한다. 글루코스 소실률, 혈당 곡선 하 면적 및 C-펩티드 수준을 또한 면역계 공격으로부터 등각 코팅된 인간 줄기 세포 기술을 보호하기 위해 당뇨병의 등각 코팅된 인간 이종이식편 모델을 사용하여 당뇨병의 이 이종이식편 모델에서 측정할 수 있다.
당뇨병의 동계 마우스 모델에서 등각 코팅 공여체 섬의 평가
세포 이식 4 내지 5주 전에, 신생혈관 형성을 유도하기 위해 단일 챔버 미니-CP(Sernova Corp. London, ON)를 대략 25 g 수컷 BALB/c 마우스의 하복부 사분면으로 피하 임플란트하였다. 간단히 말해서, CP를 배치하기 위해, 작은 가로 절개를 수행하여 절개선 아래로 작은 파우치가 만들어지게 한다. 적절한 공간이 생성되면, 개방이 두개골 위치에 있도록 CP를 공간으로 임플란트한다. 절개는 수술용 스테이플(Autoclip; Becton Dickinson, Sparks, MD)로 닫는다. 췌장 섬을 8주 내지 12주령 수컷 BALB/c 마우스로부터 단리한다. 동물은 자유롭게 음식 및 물에 접근할 수 있는 통상적인 조건 하에 수용한다. 췌장절제술 전에, 27-G 바늘로 총담관에 캐뉼러를 삽관하고, 행크 균형 염 용액 중 0.125 mg/mL의 차가운 리버라제 TL 연구 등급 효소로 췌장을 팽창시킨다. 가볍게 진탕하며 14분 동안 37℃ 수조에 배치된 50 mL 팔콘 튜브에서 췌장을 소화하여 섬을 단리한다. 소화 단계에 이어서, 히스토파크 밀도 구배 원심분리(1.108, 1.083 및 1.069 g/mL)를 사용하여 췌장 소화물로부터 섬을 정제한다. 섬의 단리 시, 세포 파우치로의 이식을 위한 조제물로 등각 코팅 공정을 거치고 출시 기준의 통과를 확인한다.
이식 3 내지 5일 전에, CP 임플란트된 마우스를 아세트산염 인산염 완충액(pH 4.5) 중 185 mg/kg의 복강내 스트렙토조토신을 사용한 화학적 유도에 의해 당뇨병에 걸리게 한다. 동물의 혈당 수준이 2회 연속 일일 판독값에 대해 15 mmol/L를 초과하면 동물은 당뇨병으로 간주된다.
90% ± 5%의 순도를 갖는 전체 섬 덩어리(당뇨병 수신체 마우스당 500개의 등각 코팅된 섬 ± 10%) 또는 한계 질량(당뇨병 수신체당 200개의 등각 코팅된 섬 ± 10%)을 마이크로주사기를 사용하여 폴리에틸렌-50 튜브로 흡인하고 이식에 적합한 펠렛으로 원심분리한다.
CP로 이식될 때 당뇨병을 역전시키기 위한 전체 섬 용량(500개의 등각 코팅된 섬)의 유효성을 검사하기 위해 투약 연구 및 CP로 이식된 한계 섬 질량 연구(200개의 등각 코팅된 섬)를 수행할 수 있다.
섬을 CP로 이식하기 위해, 피부에 작은 절개를 수행하여 장치의 두개골 부분으로의 접근을 획득한다. 그 후, 플러그를 제거하여 섬 제조물이 주입되는 혈관화된 조직 챔버를 드러낸다. CP는 4-0 바이크릴 봉합사로 CP의 두개골 부분의 2개 층을 근사하여 닫는다. 피부 절개는 이후 수술용 스테이플(Autoclip; Becton Dickinson)로 닫는다.
섬 이식편 기능을 시험된 모든 그룹에서 휴대용 혈당계로 비-공복 혈당 측정(mmol/L)을 통해 수신체에서 주 2회 평가한다. 이식편 기능 및 당뇨병의 역전은 11.1mmol/L 미만의 2회 연속 판독으로 정의되고 연구가 완료될 때까지 유지된다. 또한, 이식 후 100일까지 정상혈당 마우스에서 내당능 시험을 수행하여 대사 능력을 추가로 평가한다. 수신체는 복강내 글루코스 볼루스(3 g/kg)를 수여받기 전에 밤새 금식시킨다. 혈당 수준을 기준선(시간 0), 주사 후 15, 30, 60, 90 및 120분에 모니터링하여 이식 그룹 간에 곡선 하 면적(AUC-혈당)을 계산하고 분석할 수 있게 한다.
이식편 의존적 정상혈당증을 확인하기 위해, 기능적 이식편을 가진 동물은 CP 제거에 의해 체외외식된 섬 이식을 갖는다. CP 체외이식편은 작은 피부 절개에 의해 수행한다. CP의 배쪽 표면을 둘러싸는 신생혈관 조직의 온전성을 유지하면서 진피로부터 절단한다. 섬 이식 장치의 등쪽편을 절단하여 그 완전한 제거를 허용한다. 조직학적 분석을 위해 체외이식 후 CP를 10% 완충 포르말린에 넣고, 동물을 고혈당증에 대해 모니터링한다.
면역조직화학은 헤마톡실린-에오신을 사용하여 전체 구조 세부사항을, 항-폰 빌레브란트 인자 항체를 사용하여 혈관화 평가를 위해 내피 세포를, CP 내 섬의 존재를 확인하기 위해 항-인슐린, 및 항-글루카곤 항체를 사용하였다. 체외이식 직후, CP 조직을 10% 완충 포르말린에 48시간 동안 고정한 다음 인산염 완충 식염수 중 세척하고 70% 에탄올로 최종 세척한다. 조직을 절단하고, 파라핀에 포매하고, 5 μm의 두께로 절편화한다. 대표적인 조직 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색한다. 또한, 조직 절편을 면역형광을 사용하여 염색한다. 절편을 탈파라핀화하고 항원 열 회수(표적 회수 용액, Dako)로 처리한 다음 트윈-20(TBS-T)이 보충된 트리스 완충 식염수(TBS)로 세척한다. 절편을 실온에서 1시간 동안 TBS-T 중 10% 염소 혈청을 사용하여 차단한다. 절편을 1:100으로 희석된(1% 염소 혈청이 포함된 TBS) 토끼 항-폰 빌레브란트 인자(Millipore AB7356), 1:1000으로 희석된(1%로 염소 혈청이 포함된 TBS) 기니피그 항-인슐린(Dako A0564) 또는 1:100으로 희석된(1% 염소 혈청이 포함된 TBS) 토끼 항글루카곤(AbD Serotec AHP534)의 1차 항체로 4℃에서 15시간 동안 처리한다. 절편을 TBS-T로 세척한 다음 1:1000으로 희석된(1% 염소 혈청이 포함된 TBS-T) 염소 항토끼(Molecular Probes A-11034; Alexa Fluor 488) 또는 1:1000으로 희석된(1% 염소 혈청이 포함된 TBS-T) 염소 항기니피그(Molecular Probes A-11075, Alexa Fluor 568)로 구성된 이차 항체로 실온에서 1시간 동안 처리한다. 샘플을 TBS-T로 세척하고 DAPI(1:1000)로 대조염색한다. 자가형광 배경을 줄이기 위해, 절편을 0.3% 수단 블랙(70% 에탄올 중)으로 2분 동안 처리하고, TBS로 세척하고, 흐림방지 장착 매질로 커버슬립 처리한다. 현미경측정 및 이미지 분석은 광학 현미경측정을 위한 Aperio-Scan Scope Console 및 형광 현미경측정을 위한 Zeiss Axio Imager Z1 또는 동등물을 사용하여 수행한다.
동계 래트 모델에서 당뇨병을 역전시키기 위해 피하 임플란트된 사전 혈관화된 장치(Cell Pouch™)로 이식된 등각 코팅된 섬의 평가
섬 공여체로서 수컷 루이스 래트(250 g) 및 이식 수신체로서 암컷 루이스 래트(최대 200 g)를 사용한다. 세포 파우치(1-플러그 또는 2-플러그) Sernova Corp, London Ontario)를 Sernova Corp 사양에 따라 배쪽편으로 루이스 래트에 피하 임플란트하고 세포 이식에 적합한 혈관화된 조직 챔버가 발달하도록 최소 4주 동안 방치한다. 임플란트 4주 후, 스트렙토조토신의 투여에 의해 수신체 래트에서 당뇨병을 유도한다. 꼬리 찌르기(OneTouch Ultra 혈당계)로 얻은 혈액 샘플에서 2회 비공복 혈당 값이 > 300 mg/dL인 래트는 당뇨병으로 간주된다. 공여체 루이스 래트로부터의 섬을 효소 소화에 의해 단리한 후, 표준 프로토콜을 사용하여 밀도 구배 상에서 정제한다. 그런 다음 루이스 래트 섬을 등각 코팅한다. 코팅 대략 4일 후, 네이키드 또는 등각 코팅된 루이스 단리 섬을 혈관화된 세포 파우치로 이식한다. 섬을 이식하기 위해, 세포 파우치를 외과적으로 노출시키고, 플러그(들)를 제거하여 혈관화된 조직 공극을 노출시키고 등각 코팅된 또는 네이키드 섬을 당뇨병 수신체당 대략 3000~5000개 IEQ의 용량으로 마이크로-피펫을 사용하여 세포 파우치 챔버로 이식한다. 상이한 그룹에서 몇몇 용량을 평가할 것이 예상된다. 섬 수신체 래트의 혈당을 휴대용 혈당계를 사용하여 꼬리 찌르기로 적어도 주 3회 모니터링한다. 이식편 기능은 표준 기술에 의해 측정된 비-공복 BG < 200 mg/dL 및 양성 래트 C-펩티드로 정의될 것이다. 이식 후 선택된 시점에서, 섬 수신체 래트에서 내당능 시험을 수행하여 이식편 유효성을 평가한다. 밤새 금식시킨 후, 경구(경구 내당능 시험[OGTT]; 2.5 g/kg) 또는 정맥내(정맥내 내당능 시험[IVGTT]; 0.5 g/kg) 글루코스 볼루스를 투여했다. 혈당 값을 모니터링하고 글루코스의 곡선 하 면적(AUC)을 계산한다. 래트 혈액 샘플은 글루코스 볼루스를 투여하기 전에(t=0분) 및 30분 후에 취하여 공복 및 자극 c-펩티드를 평가한다. 이식된 세포 파우치를 상이한 투여 그룹에서 60일 내지 300일 간격으로 회수하여 혈당 제어의 확립 유효성을 확인한다. 체외이식된 세포 파우치를 C-펩티드, 인슐린, 글루카곤 등을 염색하고 세포 생활성뿐만 아니라 다른 측정을 평가하기 위해 표준 조직학적 기술을 사용하여 이식된 섬에 대한 조직학적 분석에 의해 처리한다. 세포 파우치 내에서 네이키드 섬 및 등각 코팅된 섬의 유효성을 비교하여 면역계 공격으로부터 섬을 보호하는 데 대한 등각 코팅된 섬의 효과를 평가한다. 유효성은 세포 파우치의 등각 코팅된 섬이 생착 후 당뇨병을 역전시키고(BG < 200 mg/dL) 검출 가능한 c-펩티드와 함께 이식편 기능을 유지하는 능력뿐만 아니라 동계 당뇨병 수신체 래트의 양성 내당능(GTT 동안 AUC)으로 측정된다. 또한, 세포 파우치로 이식된 등각 코팅된 세포 대 네이키드 세포에서 섬의 생존을 확인하기 위해 조직학적 분석을 통해 생존 호르몬 생산 이식편을 확인한다.
당뇨병의 동종이식편 래트 모델에서 당뇨병을 역전시키기 위해 피하 임플란트된 사전 혈관화된 장치(Cell Pouch™)로 이식된 등각 코팅된 섬의 평가
루이스 암컷 쥐(최대 200 g)를 섬 수신체로 사용한다. 위스타 퍼스(WF)(RT1u) 수컷 쥐(250 g)를 섬 공여체로 구입한다. 세포 파우치(1-플러그 또는 2-플러그) Sernova Corp, London Ontario)를 Sernova Corp 사양에 따라 배쪽편으로 Lewis 암컷 래트에 피하 임플란트하고 세포 이식에 적합한 혈관화된 조직 챔버가 발달하도록 최소 4주 동안 방치한다. 임플란트 4주 후, 스트렙토조토신 투여에 의해 수신체 래트에서 당뇨병을 유도한다. 꼬리 찌르기(OneTouch Ultra 혈당계)에서 얻은 혈액 샘플에서 2회 비공복 혈당 값이 > 300 mg/dL인 래트는 당뇨병으로 간주된다. 공여체 위스타 퍼스(WF)(RT1u) 수컷 래트로부터의 섬을 효소 소화에 의해 단리한 다음, 표준 프로토콜을 사용하여 밀도 구배에서 정제한다. 이들 위스타 퍼스 래트 섬을 등각 코팅한다. 코팅 대략 4일 후, 네이키드 또는 등각 코팅된 위스타 단리 섬을 혈관화된 세포 파우치로 이식한다. 섬을 이식하기 위해 세포 파우치를 외과적으로 노출시키고, 플러그(들)를 제거하여 혈관화된 조직 공극을 노출시키고 등각 코팅된 또는 네이키드 섬을 당뇨병 수신체당 대략 3000~5000개 IEQ의 용량으로 마이크로-피펫을 사용하여 세포 파우치 챔버로 이식한다. 상이한 그룹에서 몇몇 용량이 평가될 것으로 예상된다. 섬 수신체 래트의 혈당을 휴대용 혈당계를 사용하여 꼬리 찌르기로 적어도 주 3회 모니터링한다. 이식편 기능은 표준 기술에 의해 측정된 비-공복 BG < 200 mg/dL 및 양성 래트 C-펩티드로 정의될 것이다. 이식 후 선택된 시점에서, 섬 수신체 래트에서 내당능 시험을 수행하여 이식 유효성을 평가한다. 밤새 금식시킨 후, 경구(경구 내당능 시험[OGTT]; 2.5 g/kg) 또는 정맥내(정맥내 내당능 시험[IVGTT]; 0.5 g/kg) 글루코스 볼루스를 투여했다. 혈당 값을 모니터링하고 글루코스의 곡선 하 면적(AUC)을 계산한다. 래트 혈액 샘플을 글루코스 볼루스를 투여하기 전에(t=0분) 및 30분 후에 취하고 공복 및 자극 c-펩티드를 투여한다. 이식된 세포 파우치를 상이한 투여 그룹에서 60일 내지 300일 사이의 간격으로 회수하여 혈당 조절을 확립하는 유효성을 확인한다. 체외이식된 세포 파우치를 C-펩티드, 인슐린, 글루카곤 등을 염색하고 세포 생활성을 평가하기 위해 표준 조직학적 기술을 사용하여 이식된 섬에 대한 조직학적 분석뿐만 아니라 다른 측정에 의해 처리한다. 세포 파우치 내에서 네이키드 섬 및 등각 코팅된 섬의 유효성을 비교하여 면역계 공격으로부터 섬을 보호하는 데 대한 등각 코팅된 섬의 효과를 평가한다. 유효성을 세포 파우치에서 등각 코팅된 섬이 생착 후 당뇨병을 역전시키고(BG < 200 mg/dL) 검출 가능한 C-펩티드와 함께 이식편 기능을 유지하는 능력뿐만 아니라 네이키드 섬에 비해 당뇨병 수신체 래트의 양성 내당능(GTT 동안 AUC)으로 측정한다. 동종 섬 이식의 경우, 이식편 거부는 등각 코팅된 섬 그룹에 비해 네이키드 섬에서 예상되는 비공복 고혈당 상태로의 복귀로 단순 정의된다. 또한 등각 코팅의 면역 보호 능력을 시험하는 이 동종이식편 실험 모델에서 조직학적 분석을 통해 생존 호르몬 생산 이식편을 확인하여 등각 코팅된 세포 대 세포 파우치로 이식된 네이키드 세포의 섬 생존을 확인한다.
당뇨병의 이종이식편 래트 모델에서 당뇨병을 역전시키기 위해 피하 임플란트된 사전 혈관화된 장치(Cell Pouch™)로 이식된 등각 코팅된 인간 줄기 세포 유래 섬의 평가
루이스 암컷 쥐(최대 200 g)를 섬 수신체로 사용한다. 인간 줄기 세포 유래 섬 클러스터(iPSC 또는 ESC)는 이 이종이식편 모델에서 세포 파우치로 이식하기 위한 인슐린 생산 세포를 생성하기 위해 분화 프로토콜을 통해 생성한다. 세포 파우치(1-플러그 또는 2-플러그) Sernova Corp, London Ontario)를 Sernova Corp 사양에 따라 배쪽편으로 Lewis 암컷 래트에 피하 임플란트하고 세포 이식에 적합한 혈관화된 조직 챔버가 발달하도록 최소 4주 동안 방치한다. 임플란트 4주 후, 스트렙토조토신의 투여에 의해 수신체 래트에서 당뇨병을 유도한다. 꼬리 찌르기(OneTouch Ultra 혈당계)로부터 얻은 혈액 샘플에서 2회 비공복 혈당 값 > 300 mg/dL인 래트는 당뇨병으로 간주된다. 인간 줄기 세포 유래 섬 클러스터를 표준 프로토콜을 사용하여 생산한다. 그런 다음 줄기 세포 유래 인간 섬 클러스터를 등각 코팅한다. 코팅 대략 4일 후, 네이키드 또는 등각 코팅된 줄기 세포 유래 클러스터를 혈관화된 세포 파우치로 이식한다. 섬을 이식하기 위해 세포 파우치를 외과적으로 노출시키고, 플러그(들)를 제거하여 혈관화된 조직 공극을 노출시키고 등각 코팅된 또는 네이키드 섬을 당뇨병 수신체당 대략 3000~5000개 IEQ(또는 동등물)의 용량으로 마이크로-피펫을 사용하여 세포 파우치 챔버로 이식한다. 상이한 그룹의 줄기 세포 유래 섬 클러스터의 몇몇 용량이 평가될 것이 예상된다. 섬 수신체 래트의 혈당을 휴대용 혈당계를 사용하여 꼬리 찌르기로 적어도 주 3회 모니터링한다. 이식편 기능은 표준 기술에 의해 측정된 비-공복 BG < 200 mg/dL 및 양성 래트 C-펩티드로 정의될 것이다. 이식 후 선택된 시점에서, 섬 수신체 래트에서 내당능 시험을 수행하여 이식편 유효성을 평가한다. 밤새 금식시킨 후, 경구(경구 내당능 시험[OGTT]; 2.5 g/kg) 또는 정맥내(정맥내 내당능 시험[IVGTT]; 0.5 g/kg) 글루코스 볼루스를 투여했다. 혈당 값을 모니터링하고 글루코스의 곡선 하 면적(AUC)을 계산한다. 래트 혈액 샘플을 글루코스 볼루스를 투여하기 전에(t=0분) 및 30분 후에 취하여 공복 및 자극 c-펩티드를 평가한다. 이식된 세포 파우치를 상이한 투여 그룹에서 60일 내지 300일 사이의 간격으로 회수하여 혈당 제어를 확립하는 유효성을 확인한다. 체외이식된 세포 파우치는 C-펩티드, 인슐린, 글루카곤 등을 염색하고 세포 생활성을 평가하기 위해 표준 조직학적 기술을 사용하여 이식된 섬에 대한 조직학적 분석뿐만 아니라 다른 측정에 의해 처리한다. 세포 파우치 내에서 네이키드 섬 및 등각 코팅된 섬의 이종이식편 유효성을 비교하여 면역계 공격으로부터 섬을 보호하는 데 대한 등각 코팅된 섬의 효과를 평가한다. 유효성은 세포 파우치에서 등각 코팅된 섬이 생착 후 당뇨병을 역전시키고(BG < 200 mg/dL) 검출 가능한 C-펩티드와 함께 이식편 기능을 유지하는 능력뿐만 아니라 네이키드 섬 대비 당뇨병 수신체 래트의 양성 내당능(GTT 동안 AUC)으로 측정한다. 이종 줄기 세포 섬 클러스터 이식의 경우, 이식편 거부는 등각 코팅된 섬 그룹에 비해 네이키드 섬에서 예상되는 비공복 고혈당 상태로의 복귀로 단순 정의된다. 또한, 인간 줄기 세포 유래 인슐린 생산 클러스터를 사용하여 등각 코팅의 면역 보호 능력을 시험하는 이 이종이식편 실험 모델에서 조직학적 분석을 통해 생존 호르몬 생산 이식편을 확인하여 등각 코팅된 세포 대 세포 파우치로 이식된 네이키드 세포의 섬 생존을 확인한다.
추가 세포 유형 및 임상 적응증에 대한 등각 코팅된 세포의 평가
상기 실시예를 사용하여, 상이한 임상 적응증에 적절한 세포(공여체 세포, 줄기 세포 유래 기술)가 이종이식편, 동종이식편 및 이종 동물 모델에서 질환을 치료하기 위해 평가될 수 있음이 주지되어야 한다. 사용된 동물 모델은 과학 문헌 및 특정 세포 유형 및 임상 적응증을 시험하기 위해 결정된 유효성 측정에서 찾을 수 있다.
번호가 매겨진 실시양태
본 개시내용의 특정 실시양태가 하기 번호가 매겨진 단락에 제시된다:
1. 다음 단계를 포함하는, 생체물질을 코팅 물질로 등각 코팅하는 방법:
(a) 유상 내 수성상의 적하에서 제팅으로의 전이 및 유동 신장을 허용하도록 구성된 코팅 장치에서 동축 유상 내에 수상을 주입하는 단계;
(b) 생체물질 및 코팅 물질을 수상에 첨가하는 단계로서, 코팅 물질의 중합은 수상 제트의 입자로의 분해 하류에서 일어나, 코팅 물질로 생체적합 물질의 등각 코팅을 생성하는, 단계;
(c) 수상 제트의 입자로의 분해 하류에 코팅 물질의 성분을 첨가하는 단계로서, 성분은 코팅 물질의 중합을 촉진하거나 촉매하는 겔화 에멀젼인, 단계;
(d) 선택적으로 코팅 장치의 유출물을 수집하는 단계;
(e) 선택적으로 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질을 유상으로부터 정제하는 단계; 및
(f) 선택적으로 등각 코팅된 생체물질을 생체물질이 없는 코팅 물질과 분리하는 단계.
2. 단락 1에 있어서, 생체물질이 세포, 세포 클러스터, 생체물질 코팅 세포 또는 세포-클러스터, 세포내 소기관, 생물학적 분자 및 비-생물학적 약물 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
3. 단락 2에 있어서, 생체물질이 세포 또는 세포 클러스터를 포함하는, 방법.
4. 단락 3에 있어서, 생체물질이 섬 세포를 포함하는, 방법.
5. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 하나에 있어서, 코팅 물질이 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(N-비닐 피롤리디논)(PVP), 폴리에틸 옥사졸린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리틸옥사졸린(PEOX) 및 폴리(아미노산) 중 하나 이상으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
6. 단락 5에 있어서, 코팅 물질이 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트, PEG-비닐 설폰, 또는 이의 변형된 유도체 중 하나 이상인, 방법.
7. 단락 6에 있어서, 코팅 물질이 5~10% PEG인, 방법.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 수상이 다음을 포함하는, 방법:
(a) pH 6~7.4의 무혈청 배지; 또는
(b) pH 6~7.4의 행크 균형 염 용액(HBSS).
9. 단락 8에 있어서, 수상이 500~750,000개 섬 세포 또는 세포 클러스터/mL을 포함하는, 방법.
10. 단락 9에 있어서, 수상이 약 2,500~250,000개 섬 세포 또는 세포 클러스터/mL을 포함하는, 방법.
11. 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 수상이 선택적으로 티올화 또는 환원 시약 및/또는 계면활성제 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
12. 단락 11에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 또는 폴리(에틸렌 글리콜-bl-프로필렌 설피드)인, 방법.
13. 단락 12에 있어서, 계면활성제가 2% 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체인, 방법.
14. 단락 11에 있어서, 티올화 또는 환원 시약이 디티오트레이톨(DTT) 또는 PEG디티올인, 방법.
15. 단락 14에 있어서, 티올화 또는 환원 시약이 0.01~0.62% 디티오트레이톨(DTT)인, 방법.
16. 단락 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 유상이 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함하는, 방법.
17. 단락 16에 있어서, 유상이 10% 소르비탄 모노 올레에이트가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함하고, 유상은 선택적으로 트리에탄올아민을 포함하는, 방법.
18. 단락 17에 있어서, 유상이 0~0.2% 트리에탄올아민을 포함하는, 방법.
19. 단락 1 내지 18 중 어느 하나의 방법에 의해 등각 코팅된 생체물질.
20. 단락 19의 등각 코팅된 생체물질을 환자에게 임플란트하는 단계를 포함하는, 환자에서 장애를 치료하는 방법.
21. 단락 20에 있어서, 장애가 당뇨병이고, 등각 코팅된 생체물질이 섬 세포 및 세포 클러스터를 포함하는, 방법.
22. 단락 11에 있어서, 수상이 PEG디티올로 최소 가교된(5~50%) 다중-아암 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 방법.
23. 단락 1 내지 18, 21 또는 22 중 어느 하나에 있어서, 수상 제트의 입자로의 분해 하류에 첨가된 겔화 에멀젼이 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 10% 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)의 용액인, 방법.
24. 단락 1 내지 18 및 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제가 교반하면서 코팅 산물로부터의 산물을 미네랄 오일로 부어서 수행되는, 방법.
25. 단락 24에 있어서, 미네랄 오일로의 정제 동안 교반하면서, 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 미네랄 오일 중 10% 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)의 용액을 포함하는 겔화 에멀젼을 계속 교반하면서 행크 균형 염 용액(HBSS)이 첨가되는, 방법.
26. 단락 25에 있어서, 미네랄 오일 및 행크 균형 염 용액(HBSS)으로의 정제 후, 산물이 원심분리되고 HBSS로 세척되는, 방법.
27. 단락 26에 있어서, 정제 및 행크 균형 염 용액(HBSS)으로의 세척 후, 산물이 PEG디티올 용액과 인큐베이션되는, 방법.
28. 다음을 포함하는 등각 코팅 장치:
도 1a, 패널 (ii), (iii) 및 (iv)에 예시된 3개 부품의 조립에 의해 형성되는 캡슐화 챔버;
캡슐화 챔버(내부상)의 제1 입구에 코팅 물질 및 코팅될 생체물질을 주입하도록 구성된 정밀 유동 주사기 펌프에 연결된 카테터로서, 수성상은 경계 포함 6 내지 7.4의 pH 수준을 포함하는, 카테터;
계면활성제를 포함하는 유상을 캡슐화 챔버의 제2 입구로 주입하도록 구성된 제1 연동 펌프로서, 유상(외부상)의 주입은 내부 수상과 동축으로 흐르도록 구성되는, 제1 연동 펌프;
캡슐화 챔버의 단부에 커플링된 모세관으로서, 모세관은 내부 수상 유동이 외부 유상(2상 유체) 내에서 신장되어 2상 유체가 캡슐화 챔버로부터 모세관으로 흐르도록 구성되는 지점의 하류에 있고, 내부 수성상(코팅 물질 및 코팅될 생체물질 함유) 및 외부 유상은 모세관을 통해 동축으로 흐르도록 구성되는, 모세관; 및
겔화 에멀젼을 모세관과 동축으로 주입하도록 구성된 제2 연동 펌프로서, 에멀젼은 코팅 물질의 중합을 위한 촉매를 포함하고, 에멀젼은 코팅 물질 및 코팅될 생체물질과 동축으로 접촉하도록 구성되는, 제2 연동 펌프.
당업자는 본원에 기재된 특정 실시예에 대한 많은 균등부를 일상적인 실험만을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 실시양태의 범위는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다. 당업자는 하기 청구범위에 정의된 바와 같이, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 이 설명에 대한 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
Claims (36)
- 다음 단계를 포함하는, 생체물질을 코팅 물질로 등각 코팅하는 방법:
(a) 유상 내 수성상의 적하(dripping)에서 제팅(jetting)으로의 전이 및 유동 신장을 허용하도록 구성된 코팅 장치에서 동축 유상 내에 수성상을 주입하는 단계;
(b) 생체물질 및 코팅 물질을 수성상에 첨가하는 단계로서, 상기 단계 (b)의 코팅 물질은 점도 향상제를 포함하지 않고; 수성상은 pH 약 6 내지 약 7.4인, 단계;
(c) 수성상 제트가 입자로 분해되도록 하는 단계; 및
(d) 수성상 제트의 입자로의 분해 하류에 코팅 물질의 성분을 첨가하는 단계로서, 성분은 코팅 물질의 중합을 촉진하거나 촉매하는 겔화 에멀젼이고; 이에 따라 등각 코팅된 생체물질을 생성하는, 단계. - 제1항에 있어서, 코팅 장치의 유출물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 등각 코팅된 생체물질을 생체물질이 없는 코팅 물질과 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체물질이 세포, 세포 클러스터, 생체물질-코팅 세포 또는 세포-클러스터, 세포내 소기관, 생물학적 분자, 비생물학적 약물, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 생체물질이 세포 또는 세포 클러스터를 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 생체물질이 섬 세포 또는 세포 클러스터를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅 물질이 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(N-비닐 피롤리디논)(PVP), 폴리에틸 옥사졸린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리틸옥사졸린(PEOX), 폴리(아미노산), 이의 유도체 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제제를 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 코팅 물질이 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-말레이미드, PEG-아크릴레이트 및 PEG-비닐 설폰으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제제를 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 코팅 물질이 5~10% PEG를 포함하는, 방법.
- 제8에 있어서, 상기 코팅 물질이 PEG디티올로 최소 가교된(1~30%) 다중-아암 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성상이 다음을 포함하는, 방법:
(a) pH 6~7.4의 무혈청 배지; 또는
(b) pH 6~7.4의 행크 균형 염 용액(HBSS). - 제12항에 있어서, 상기 수성상이 약 200,000,000개 섬 세포/mL을 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 수성상이 약 100,000개 세포 클러스터/mL을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성상이 티올화 시약, 환원 시약, 계면활성제, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 또는 폴리(에틸렌 글리콜-bl-프로필렌 설피드)인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 계면활성제가 2% 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체인, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 환원 시약이 디티오트레이톨(DTT) 또는 PEG디티올인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 환원 시약이 0.01~0.62% 디티오트레이톨(DTT)인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겔화 에멀젼이 행크 균형 염 용액(HBSS)에 용해되고 10% 소르비탄 모노 올레에이트(Span80)가 포함된 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 유화된 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유상이 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유상이 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 및 10% 소르비탄 모노 올레에이트, 및 선택적으로 트리에탄올아민을 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 유상이 0~0.2% 트리에탄올아민을 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제가 (e) 생성 혼합물을 교반하면서 단계 (d)로부터의 산물을 미네랄 오일에 붓는 단계를 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 유상으로부터 등각 코팅된 생체물질 및 생체물질이 없는 코팅 물질의 정제가 (f) 단계 (e)에서 생성 산물에 행크 균형 염 용액(HBSS)을 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 단계 (f)의 산물이 원심분리되고 HBSS로 세척되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 원심분리 및 행크 균형 염 용액(HBSS)으로의 세척 후, 코팅된 생체물질이 PEG디티올의 용액과 인큐베이션되는, 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 등각 코팅된 생체물질.
- 환자에서 장애를 치료하는 방법으로서, 제28항의 등각 코팅된 생체물질을 상기 환자에게 임플란트하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 장애가 당뇨병인, 방법.
- 다음을 포함하는, 등각 코팅 장치:
(1) 캡슐화 챔버로서,
(a) 하우징 부분의 제1 단부에서 제1 입구를 통해 카테터에 커플링되고 제1 펌프에 연결된 하우징 부분;
(b) 하우징 부분의 제2 단부의 내부 표면과 맞물리도록 구성된 제1 단부를 포함하는 부착 부분; 및
(c) 부착 부분의 제2 단부의 외부 표면과 맞물리도록 구성된 제1 단부, 코팅하도록 구성된 챔버, 제2 펌프에 커플링된 제2 입구, 및 코팅 부분의 제2 단부를 포함하는 코팅 부분;
을 포함하고, 제1 펌프에 연결된 카테터는 코팅 물질 및 코팅될 생체물질을 수성상에서 하우징 부분의 내부쪽 제1 입구에 주입하도록 구성되고, 수성상은 경계 포함 6 내지 7.4의 pH 수준을 포함하고; 주입된 코팅 물질은 점도 향상제를 포함하지 않으며;
제2 펌프는 계면활성제를 포함하는 유상을 코팅 부분의 외부쪽 제2 입구에 주입하도록 구성되고, 유상의 주입은 내부 수성상과 동축으로 그리고 외부로 흐르도록 구성되는, 챔버;
(2) 코팅 부분의 제2 단부에 커플링된 모세관으로서, 수성상 유동이 외부 유상과 접촉하고 외부 유상 내에서 신장되어 코팅 부분으로부터 모세관을 통해 동축으로 흐르도록 구성된 2상 유체를 형성하는 지점의 하류에 있는, 모세관; 및
(3) 모세관에 커플링되고 모세관과 동축으로 겔화 에멀젼을 주입하도록 구성된 제3 펌프로서, 에멀젼은 수성상에서 코팅 물질의 중합을 위한 촉매를 포함하는, 제3 펌프. - 제31항에 있어서, 코팅 부분의 제1 단부가 부착 부분의 제2 단부를 실질적으로 둘러싸서 챔버를 형성하고, 수성상 유동은 유상과 접촉하여 2상 유체를 형성하는, 장치.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 챔버가 2상 유체가 모세관으로 흐르도록 구성된 출구 노즐의 테이퍼각을 포함하는 테이퍼형 개구를 포함하고, 상기 제2 입구가 테이퍼각으로 챔버와 커플링되는, 장치.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 펌프가 정밀 유동 주사기 펌프인, 장치.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펌프가 제1 연동 펌프인, 장치.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 펌프가 제2 연동 펌프인, 장치.
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