CN115916112A - 用于免疫分离的细胞保形包衣 - Google Patents

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Abstract

公开了用于用生物材料保形地包衣非均匀大小的细胞和细胞簇以用于植入，从而在保存细胞功能的同时防止免疫排斥或炎症或自身免疫破坏的流体动力学方法。进一步公开了用于用生物相容的、机械和化学稳定的和多孔的，具有合适的孔隙截止尺寸的水凝胶保形地包衣细胞和细胞簇的试剂、设备和方法。

Description

用于免疫分离的细胞保形包衣
本申请要求于2020年4月28日提交的美国临时专利申请第63/016,787号的优先权和权益，所述美国临时专利申请的公开内容特此通过全文引用的方式并入本文。
本申请与于2017年4月4日提交的美国专利申请第15/478,320号(现为美国专利10,653,816)有关，所述美国专利申请是分案申请，要求于2014年2月12日提交的美国专利申请第14/114,690号(现为美国专利10,660,987)的优先权，所述美国专利申请是根据国际专利申请第PCT/US2012/035696号的35U.S.C.§371的国家阶段申请，于2012年4月28日提交，要求于2011年4月29日提交的美国临时专利申请第61/480,513号的利益，这些申请中每项申请的公开内容特此通过全文引用的方式并入。
关于联邦资助研究的声明
此公开得到了美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的资助，编号为R01 DK109929。政府在本发明中具有某些权利。
技术领域
本公开涉及细胞移植领域，并且提供了用于促进细胞移植到人或动物的最小免疫反应或移植排斥的试剂和方法。本公开更具体地提供了生物材料，所述生物材料包含已在中性pH下用包衣混合物保形地包衣的用于移植的细胞，所述包衣混合物对此类细胞或其它生物材料的活力、代谢或生物活性干扰最小，以及用于生产和使用所述保形地包衣的生物材料，具体地细胞的试剂、设备和方法。在特定实施例中，保形地包衣的细胞和/或细胞簇包括产生胰岛素的细胞(例如，含有β细胞的朗格尔汉斯(Langerhans)胰岛)，所述细胞从干细胞分化或从动物、更具体地哺乳动物以及最具体地人的胰腺分离。具体地提供了使用试剂和设备以及通过本文的方法产生的保形地包衣的生物材料，具体地细胞和/或细胞簇的使用方法。
背景技术
细胞封装是一种很有前景的策略，用于免疫分离单个细胞和细胞簇，从而防止在植入时将损害细胞功能的任何免疫应答。生物封装已广泛用于糖尿病、血友病、癌症和肾衰竭等领域的新型治疗试验。然而，大多数试验没有完全成功，原因如下：
·封装和细胞分离方法缺乏再现性；
·缺乏合适的封装材料，所述封装材料应具有生物相容性、机械和化学稳定性，并且具有适当的孔隙截止尺寸，以允许营养素和副产物流入和流出胶囊，同时保护封装的生物材料免受免疫系统作用的影响；
·非均匀或非保形地包衣的胶囊的生产(影响(i)氧气和营养素通过胶囊的扩散，以及(ii)生物活性分子的细胞分泌，从而影响封装的细胞的活力、作为治疗分子递送媒剂的功能和总封装的移植物体积)；
·无法将封装过程从小型动物研究扩大到临床前非人灵长类动物研究；以及
·不利的移植部位的选择。
在细胞封装最有前景的治疗领域之一：糖尿病的工作背景下，可以看到封装技术面临此类挑战。
糖尿病是由胰岛β细胞的自身免疫破坏引起的，所述胰岛β细胞是构成朗格尔汉斯胰岛的若干种细胞类型之一。在其寿命过程中，糖尿病患者必须频繁监测和控制血糖水平，并且在出现高血糖时施用胰岛素，这有许多副作用，包含代谢控制不理想、低血糖风险较高和生活质量下降。胰岛同种异体移植是治疗糖尿病患者的一种非常有前景的疗法，但需要终身的全身免疫抑制才能避免同种异体移植物排斥。参见Robertson,2010,《北美内分泌代谢临床学(Endocrinol Metab Clin North Am)》39,655-667；Herring等人,2016,《糖尿病护理(Diabetes Care)》39:1230-1240；Shapiro等人,2017,《内分泌学自然评论(Nat.Rev.Endocrinol.)》13:268-277；Pepper等人,2018,《器官移植当前观点(Curr.OpinOrgan Transplant.)》23:428-439；LaBlanche等人,2018,《柳叶刀糖尿病与内分泌学(Lancet Diabetes Endocrinol.)》6:527-537；Foster等人,2018,《糖尿病护理》41:1001-1008；Rickels和Robertson,2019,《内分泌评论(Endocrin.Rev.)》40:631-668。
为了避免在全身水平上施用免疫抑制药物，可以通过用半透性聚合物胶囊包衣用于移植的细胞来免疫保护胰岛同种异体移植物，所述胶囊允许氧气、葡萄糖和胰岛素的扩散，同时防止细胞间接触和细胞毒性分子的扩散，这将触发针对移植物的免疫应答并最终被宿主排斥。de Vos等人,2010,《实验医学与生物学进展(Adv Exp Med Biol)》670,38-53；Desai和Shea,2017,《自然综述：药物发现(Nat Rev Drug Discov)》16:338-350；Vairhilingham等人,2017,《糖尿病研究综述(Rev Diabetes Stud)》14:51-78；Krosgren,2017,《糖尿病(Diabetes)》66:1748-1754；Smink等人,2018,《美国移植杂志(AmJ.Tranplant)》18:2113-2118。胰岛的大小不均匀，直径为约50μm至300μm。本领域已知的大多数包衣程序不允许对胰岛进行保形包衣；胶囊直径通常是恒定的，并且与胰岛大小无关，因此通常大于300μm，以保证较大胰岛的包衣。Teramura和Iwata,2010,《先进药物递送评论(Adv Drug Deliv Rev)》62,827-840。由于过量的游离包衣材料，胰岛植入物的总体积大为增加，使得唯一合适尺寸的移植部位是低氧合的腹腔，这会促进被封装的细胞的缺氧。此外，胶囊的厚度增加了通过包衣对氧气的扩散屏障，也加剧了细胞缺氧，并且延迟了葡萄糖感测，从而延迟了胰岛素分泌的应答。de Groot等人,2004,《外科研究杂志(J Surg Res)》121,141-150；Buchwald等人,2015,《生物医学工程(Biomed.Engineer.)》在线14:28；Tomei等人,2015,《生物疗法专家意见(Expert.Opin.Biol.Ther.)》15:1321-1326；Villa等人,2017,《移植(Transplant.)》101-1025-1035；Buchwald等人,2018,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng)》115；232-245。这些封装方法中的大多数基于通过空气喷射泵或静电液滴发生器生成与胰岛混合的包衣材料液滴。Rabanel等人,2009,《生物技术进展(Biotechnol Prog)》25,946-963。
与基于液滴生成的封装方法相比，各种直径的细胞簇的保形包衣是最近一些研究的重点。这些方法大多基于(a)直接在细胞上逐层包衣形成(例如，通过化学反应或光聚合)或(b)纯流体动力学过程，通常涉及通过油包水乳液形成或通过瑞利高原不稳定性(Rayleigh-Plateau instability)的流体动力学原理使油中的水射流破碎而形成颗粒。Teramura等人,同上；Chabert和Viovy,2008,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad SciUSA)》105,3191-3196。使用这些方法，有可能生成具有恒定直径的水颗粒，其唯一取决于水相和油相的特性、两相之间的表面张力以及两相的流体动力学参数之比。Eggleton等人,2001,《物理评论快报(Phys Rev Lett)》87,048302；Utada等人,2008,《物理评论快报》100,014502；Lossertales等人,2020,《科学(Science)》295,1695-1698；Cohen等人,2001,《科学》292,265-267。在食品和制药行业中，这些方法已被广泛用于纳米封装水溶性药物和其它物质(Lossertales等人,同上)，并且最近才扩展到微米级单细胞和细胞簇的封装，并取得了一些成功，如下所述。
Chabert以及其同事基于上述原理开发了一种用于封装和自分选单个细胞的微流体高通量系统。Chabert.和Viovy,同上。然而，其系统设计用于封装和分选单个细胞(直径为40μm或更小)，并且由于其装置的微观尺寸，无法应用于细胞簇，这将使非单个细胞承受难以承受的剪切应力。
Garfinkel及其同事开发了另一种封装胰岛的方法，方法所述方法通过选择性地从外部油相中提取胰岛水相，在细胞簇上形成一层薄包衣。在此方法中，油相中的水相喷射是通过抽吸油相顶部的水相层来实现的。在此设计中，在取水区域产生湍流，最终导致包衣不完整，需要进行第二轮封装，增加了细胞所承受的应力，并且降低了过程的产率。Wyman等人,2007,《Small》3，683-690。此外，凝胶聚合是通过光聚合实现的，这可能会损害包衣的细胞的长期功能。
Hubbell以及其同事开发了一种直接在细胞表面通过化学反应进行包衣的方法，通过这种方法，光敏剂被吸附到胰岛表面，并且光敏剂处理的胰岛悬浮在光聚合大分子单体的水溶液中(美国专利第6,911,227号)。胰岛悬浮液的光照导致大分子单体的聚合和交联，以产生结合到胰岛表面的保形聚合物凝胶。
Hubbell以及其同事在美国专利第10,653,816号、美国专利第10,660,987号和国际公开WO2012/149496中描述了保形包衣方法。在所述例示中，Hubbell等人公开了由以下构成的水相：(1)多臂PEG(10kDa 8臂75％至90％官能化PEG-马来酰亚胺(PEG-MAL)或PEG-乙烯基砜(PEG-VS))，过量的交联剂(摩尔比为3至4比1的二硫苏糖醇或2kDa PEG二硫醇)以实现完全PEG凝胶化，以及粘度增强剂(例如，藻酸盐、两亲性自组装聚合物或肽等)。然而，交联剂和粘度增强剂的加入要求水相的pH保持在3.5至6(取决于具体的水凝胶组合物)，并且所述过程在15分钟内运行，以防止包衣前水相过早凝胶化，由于在多臂PEG和硫醇化交联剂之间发生的迈克尔型反应(Michael-type reaction)的高反应性，其发生在水相喷射和在封装室中破碎的下游。这种低pH会影响细胞的长期功能。此外，当预混合基础聚合物和交联剂时发生的快速凝胶化反应限制了整个过程产量，并且使扩大过程的努力复杂化。最后，粘度增强剂的加入可以影响包衣的免疫分离特性和生物相容性。参见例如Manzoli等人,《美国移植杂志》,18(3):590-603(2018)。
鉴于以上，本领域仍然需要在不损害细胞功能或生物相容性的情况下对细胞和细胞簇进行保形地包衣的高效、高产率方法。
发明内容
本文提供了用于保形包衣生物材料(具体地细胞，特别是从脊椎动物、更具体地哺乳动物、并且特别是人分离的干细胞源性胰岛素分泌细胞和含有β细胞的朗格尔汉斯胰岛)的试剂和方法以及保形包衣装置。生物材料，具体地细胞和/或细胞簇，并且更具体地胰岛细胞和/或细胞簇被包衣并维持在中性pH(例如，pH约6至约7.4)，如本文所公开的。本文阐述了关于相关申请中所述的试剂、设备和方法的试剂、设备和方法的进一步修改。
因此，在第一方面，本公开提供了用包衣材料保形地包衣生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将水相注入包衣装置中的同轴油相内，所述包衣装置被配置成允许所述水相在所述油相中从滴落到喷射的转变和流动伸长；
(b)将所述生物材料和所述包衣材料添加到所述水相中，其中所述步骤(b)的所述包衣材料不包括粘度增强剂；并且其中所述水相的pH为约6至约7.4；
(c)允许所述水相射流破碎成颗粒；以及
(d)在所述水相射流破碎成颗粒的下游添加所述包衣材料的组分，其中所述组分是促进或催化所述包衣材料聚合的胶凝乳液；从而得到保形地包衣的生物材料。
在一些实施例中，所述方法进一步包括收集所述包衣装置(即，保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料)的流出物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包括从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和所述无生物材料的包衣材料的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将所述保形地包衣的生物材料与所述无生物材料的包衣材料分离的步骤。
在一些实施例中，从所述油相纯化所述保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料包括步骤(e)：将来自上述方法中所阐述的步骤(d)的产物倒入矿物油中，同时搅拌所得混合物(即保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料、油相和胶凝乳液(包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt Solution，HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并且用矿物油中的10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化)。
在一些实施例中，从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料包括步骤(f)：将汉克氏平衡盐溶液溶液(HBSS)添加到步骤(e)中所得的产物中(即保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料、油相、从所述装置中流出的胶凝乳液(包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并且用矿物油中用10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化)以及矿物油。
在本文公开的方法的一些实施例中，将来自步骤(f)的产物离心并用HBSS洗涤。
在本文公开的方法的一些实施例中，在离心和用汉克氏平衡盐溶液(HBSS)洗涤之后，与PEG二硫醇溶液一起温育包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料。
在一些实施例中，本文所描述的方法中排除的粘度增强剂选自多糖，如藻酸盐、脱细胞组织、基于PEG的纳米材料组合件、透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖、葡聚糖硫酸盐、肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、瓜尔胶、水溶性纤维素衍生物、明胶、胶原蛋白和白蛋白。
在一些实施例中，本公开提供了用包衣材料保形地包衣生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将水相注入包衣装置中的同轴油相内，所述包衣装置被配置成允许所述水相在所述油相中从滴落到喷射的转变和流动伸长；(b)将所述生物材料和所述包衣材料添加到所述水相中，其中所述包衣材料的聚合发生在所述水相射流破碎成颗粒的下游，导致所述生物材料与所述包衣材料的保形包衣；(c)在所述水相射流破碎成颗粒的下游添加所述包衣材料的组分，其中所述组分促进/催化所述包衣材料的聚合；(d)任选地收集所述包衣装置的流出物；e)任选地从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料；以及(f)任选地将所述保形地包衣的生物材料与所述无生物材料的包衣材料分离。
在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙基噁唑啉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙基噁唑啉(PEOX)、聚(氨基酸)、其衍生物或其组合。在一些实施例中，所述包衣材料是聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙基噁唑啉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙基噁唑啉(PEOX)和/或聚(氨基酸)中的一种或多种。在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯、PEG-乙烯基砜、PEG硫醇或其经修饰的衍生物或其特定种类的组合。在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯或PEG-乙烯基砜。在一些实施例中，所述水相包括与PEG二硫醇最小交联(5％至50％)的多臂聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，所述包衣材料包括与PEG二硫醇最小交联(1％至30％)的多臂聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，所述包衣材料包括5％至10％的PEG。在一些实施例中，所述水相包括约pH 6至7.4的无血清培养基；或约pH 6至7.4的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)；具体地，所述水相的pH为约pH 6至7.4。在一些实施例中，所述水相包括pH 6至7.4的无血清培养基；或pH 6至7.4的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)；具体地，所述水相的pH为pH 6至7.4。在一些实施例中，所述水相的pH为约6至约7.4。在一些实施例中，所述水相的pH为6至7.4。
在一些实施例中，所述生物材料包括细胞、细胞簇、生物材料包衣的细胞或细胞簇、亚细胞器、生物分子、非生物药物或其组合。在一些实施例中，所述生物材料包括细胞、细胞簇、生物材料包衣的细胞或细胞簇、亚细胞器、生物分子和非生物药物中的一种或多种。在一些实施例中，所述生物材料包括细胞或细胞簇，更具体地，胰岛细胞或其细胞簇。在一些实施例中，所述生物材料包括细胞或细胞簇。在一些实施例中，所述水相包括约100,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL。在一些实施例中，所述水相包括约200,000,000个细胞/mL。在一些实施例中，所述水相包括约50,000个细胞簇/ml至约100,000个细胞簇/ml。在一些实施例中，所述水相包括约100,000个细胞簇/ml。在一些实施例中，所述水相包括500个细胞和/或细胞簇/mL至750,000个细胞和/或细胞簇/mL，具体地胰岛细胞。在一些实施例中，所述生物材料包括约100,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL和/或约50,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL。在一些实施例中，所述生物材料包括约100,000,000个胰岛细胞/mL至约200,000,000个胰岛细胞/mL。在一些实施例中，所述生物材料包括约50,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL。在一些实施例中，所述水相包括约2,500个胰岛细胞和/或细胞簇/mL至250,000个胰岛细胞和/或细胞簇/mL。
在一些实施例中，所述水相包括硫醇化试剂、还原试剂、表面活性剂或其组合。在一些实施例中，用于实施本公开方法的水相可以任选地包括一种或多种硫醇化试剂、还原试剂和/或表面活性剂。在某些实施例中，所述表面活性剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或聚(乙二醇-嵌-硫化丙烯)，更具体地2％聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在一些实施例中，所述硫醇化或还原试剂是二硫苏糖醇(DTT)或PEG二硫醇。在一些实施例中，所述水相中的所述硫醇化或还原试剂是0.01％至0.62％二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施例中，所述水相中的所述硫醇化或还原试剂是0.01％至3.1％的PEG二硫醇。
在一些实施例中，所述胶凝乳液包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)，并且用10％v/v脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化。
在本文提供的方法的一些实施例中，所述油相包括聚丙二醇(PPG)。在一些实施例中，所述油相包括具有10％脱水山梨糖醇单油酸酯的聚丙二醇(PPG)，其中所述油相任选地包括三乙醇胺。在包括三乙醇胺的实施例中，所述油相包括0.01％至0.2％的三乙醇胺。在一些实施例中，所述油相包括粘度为所述水相粘度的至少2.5倍的矿物油。在一些实施例中，所述油相的粘度为约1,300cP。
在一些实施例中，本文提供了方法，其中在所述水相射流破碎成颗粒(胶凝乳液)的下游添加的所述包衣生物材料的组分是溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并且用10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化。
在第二方面，本公开提供了一种通过本文公开的方法保形地包衣的生物材料。
在第三方面，本公开提供了用于治疗患者疾病或病症的方法，包括将根据本发明的方法生产的保形地包衣的生物材料植入患者体内的步骤。在特定实施例中，所述疾病是，并且所述保形地包衣的生物材料包括胰岛细胞和细胞簇。在一些实施例中，所述病症是糖尿病。
本文提供的方法包括在所述水相射流破碎成颗粒的下游使包衣的生物材料与二硫苏糖醇(DTT)和汉克氏平衡盐溶液(HBSS)在聚丙二醇(PPG)中的乳液接触。在某些实施例中，3D打印装置与所述封装室连接，用于将所述胶凝乳液同轴地分配到所述包衣的生物材料。在某些实施例中，3D打印装置与所述封装室连接，用于将所述DTT/HBSS/PPG胶凝乳液同轴地分配到所述包衣的生物材料。
本公开的方法有利地并且任选地提供包衣的生物材料的纯化。在此类实施例中，通过在搅拌的同时将来自所述包衣产物的所述产物倒入矿物油中，从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料。在所提供方法的这些纯化步骤的某些实施例中，在搅拌下用所述矿物油纯化期间，在继续搅拌所述乳液的同时添加汉克氏平衡盐溶液(HBSS)。在另外的实施例中，在用所述矿物油和汉克氏平衡盐溶液(HBSS)纯化后，将所述产物离心并用HBSS洗涤。在其它实施例中，在用汉克氏平衡盐溶液(HBSS)纯化和洗涤之后，将所述包衣的生物材料与PEG二硫醇溶液一起温育。
在第四方面，本公开提供了一种保形包衣装置，所述保形包衣装置包括：
(1)封装室，所述封装室包括：
(a)外壳部分，所述外壳部分通过所述外壳部分的第一端处的第一入口联接到导管并与第一泵连接；
(b)连接部分，所述连接部分包括被配置成与所述外壳部分的第二端的内表面接合的第一端；以及
(c)包衣部分，所述包衣部分包括被配置成与所述连接部分的第二端的外表面接合的第一端、被配置成包衣的室、联接到第二泵的第二入口以及所述包衣部分的第二端；
其中与所述第一泵连接的所述导管被配置成将水相中的包衣材料和待包衣的生物材料注射到所述外壳部分的内侧上的所述第一入口，其中所述水相包括处于或介于6至7.4之间的pH水平；并且其中所述注入的包衣材料不包括粘度增强剂；
其中所述第二泵被配置成将包括表面活性剂的油相注入到所述包衣部分的所述外侧上的第二入口，其中所述油相的注入被配置成与所述内部水相同轴地并且在外部流动；
(2)毛细管，所述毛细管联接到所述包衣部分的所述第二端，其中所述毛细管位于所述水相流与所述外部油相接触并在所述外部油相内伸长以形成双相流体的点的下游，所述双相流体被配置成从所述包衣部分同轴地流过所述毛细管，以及
(3)第三泵，所述第三泵联接到所述毛细管并被配置成同轴地将胶凝乳液注入所述毛细管，其中所述乳液包括用于所述水相的聚合的催化剂。
在一些实施例中，所述包衣部分的第一端基本上围绕所述连接部分的所述第二端以形成所述室，其中所述水相流与所述油相接触以形成所述双相流体。
在一些实施例中，所述封装室包括锥形开口，所述锥形开口包含出口喷嘴的锥形角，所述出口喷嘴被配置成用于双相流体流动到所述毛细管，并且所述第二入口以所述锥形角与所述室联接。
在一些实施例中，所述第一泵是精密流动注射泵。
在一些实施例中，所述第二泵是第一蠕动泵。
在一些实施例中，所述第三泵是第二蠕动泵。
在一些实施例中，本文提供了一种保形包衣装置，所述保形包衣装置包括由三个部件的组装形成的封装室。与精密流动注射泵连接的导管被配置成将包衣材料和待包衣的所述生物材料注入所述封装室(内部相)上的第一入口，其中此水相的包括处于或介于6至7.4之间的pH水平。第一蠕动泵被配置成将含有表面活性剂的油相注入所述封装室上的第二入口，其中所述油相(外部相)的注入被配置成与所述内部水相同轴地流动。毛细管，所述毛细管联接到所述封装室的一端，其中所述毛细管位于所述内部水相流在所述外部油相(双相流体)内伸长的点的下游，使得所述双相流体被配置成从所述封装室流入所述毛细管，并且其中所述内部水相(含有所述包衣材料和待包衣的所述生物材料)和所述外部油相被配置成同轴地流过所述毛细管。所述装置进一步包括第二蠕动泵，所述第二蠕动泵被配置成将胶凝乳液同轴地注入所述毛细管，其中所述乳液包括用于所述包衣材料的聚合的催化剂，其中所述乳液被配置成与所述包衣材料和待包衣的所述生物材料同轴地接触。在一些实施例中，所述保形包衣装置进一步包括出口用以从所述装置释放空气。在一些实施例中，所述包衣部分可以进一步包括出口以从所述装置释放空气。在一些实施例中，用于释放空气的所述出口定位在进入所述装置的所述水相入口的上游。在包衣过程中，空气释放出口关闭。
从下面结合所附权利要求书的详细描述中，将更全面地理解本公开的这些和其它特征和优点。注意，权利要求的范围由其中的叙述来限定，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论来限定。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，将由专利局提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
图1。保形包衣修改示意图，以允许消除粘度增强剂(藻酸盐、基质胶(Matrigel)或两亲性自组装肽)，以改善保形包衣(CC)凝胶的生物相容性，并且允许在生理pH下封装以最大化NHP胰岛的功能。如在先申请中所阐述的(以下简称“低pH方法”)，水相由多臂PEG、交联剂(PEG二硫醇或二硫苏糖醇，DTT)和pH小于6的粘度促进剂组成，以防止胶囊形成前的PEG交联和凝胶形成(水相射流的下游破碎)。本文所阐述的方法在生理pH下进行，其中水相仅由多臂PEG组成，其在1％至30％与PEG-SH交联以在生理pH(7.4)下达到最佳粘度。在形成胶囊后实现100％的PEG交联和凝胶形成，其中DTT在汉克氏平衡盐溶液(DTT/HBSS)和聚丙二醇(PPG)中的乳液在水相射流破碎的下游流动并且与装置的流出物同轴。通过在搅拌和离心的同时用轻质矿物油和HBSS稀释，而不是如现有申请中那样用有机溶剂(如己烷)萃取来实现纯化。因此，所述创新依赖于(i)仅含有胰岛和不含任何添加剂的纯PEG的水相组合物，(ii)通过用装置分配胶凝乳液在胶囊形成下游引入PEG交联剂，(iii)不包含有机溶剂的胶囊纯化方法。
图1A。本文公开的保形包衣设备的示意图，包含保形包衣装置和胶凝乳液分配装置。保形包衣装置通过组装三个不同的部件获得：图(ii)、(iii)和(iv)是与16G静脉导管一起用于包衣50μm至250μm细胞簇的保形包衣装置的一个版本的三个主要组件的图示。这三个部件与玻璃毛细管一起组装并旋钮在一起以形成完整的装置。小图(v)显示了保形包衣装置的内腔的关键设计组件以及实现允许在保形的细胞簇周围形成包衣的流体条件所需的相对度量。表显示了这些相对度量和16G静脉导管用于包衣50μm至250μm细胞簇的具体度量。
图1B。本文公开的保形包衣设备的照片。
图1C。本文公开的3D打印胶凝乳液分配工具的示例性图像。
图2。保形包衣的(CC)非人灵长类(NHP)胰岛的体外和体内评估。在低pH方法下，用PEG/PEG二硫醇(PEG-SH)/肽水凝胶对食蟹猴的NHP胰岛进行保形包衣(CC)。小图A描绘了CCNHP胰岛的相位对比图像，示出大胰岛具有非常薄且可能不完整的包衣。小图B：通过静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)，通过2.2mM葡萄糖(1小时，L1)、16.7mM葡萄糖(1小时，H)、2.2mM葡萄糖(1小时，L2)和25mM KCl(1小时)的顺序刺激，裸(NK)和CC小(<200μm)和大(>200μm)NHP胰岛的功能显示出较小胰岛的更高功能(箭头)，但与裸胰岛相比，CC NHP胰岛的胰岛素分泌减少。功能评估为分泌胰岛素(左)、GSIS指数(16.7mM至2.2mM葡萄糖刺激期间的胰岛素分泌比率：H除以L1)和GSISδ(16.7mM和2.2mM葡萄糖刺激期间胰岛素分泌的差：H减去L1)。小图C：通过动态葡萄糖刺激的胰岛素释放(灌流)对CC NHP胰岛的功能显示，与裸胰岛相比，CC NHP胰岛的胰岛素分泌减少，但刺激指数为2.6；其表示功能。小图D-G：将2,000或4,000IEQ/小鼠移植到糖尿病NSG小鼠或NODscid小鼠的附睾脂肪垫(EFP)或肾囊(KD)中后，CC NHP胰岛与裸鼠胰岛相比的体内功能表现为胰岛移植后7天的血糖(小图D、F、G)和血清中的随机人c肽(图E)。所示数据来自三个独立的NHP胰岛：批次#1(小图D、E)；批次#2(小图F)；批次#3(小图G)。
图3。包衣溶液的pH对胰岛素分泌胰岛的活力的影响(使用活/死测定对细胞核、活细胞质和死细胞细胞核进行染色)，表明随着pH的降低，活力降低。
图4。糖尿病NHP网膜袋中CC NHP胰岛的评估(低pH方法，PEG/PEG-SH/肽水凝胶)。小图A示出了使用生物支架将CC NHP胰岛固定在食蟹猴网膜表面的腹腔镜程序的可行性。小图B示出了CC NHP胰岛受体的外源性胰岛素需求(EIR，虚线)、血糖(点)和C肽，显示CCNHP胰岛的最小功能。小图C和D示出了移植的CC NHP网膜移植物的组织学评估，分析了胰岛存活(胰岛素)和T细胞(CD3，绿色标记)的胶囊免疫分离(小图D；箭头指向胰岛素染色(红色标记))以及生物相容性(小图C，箭头指向多核巨细胞)。NHP网膜部位胶囊的炎症反应广泛、慢性且活跃。
图5。本文公开的体外和体内人胰岛保形包衣方法(纯PEG和生理pH)的评估。包衣质量通过相差显微镜(小图A)；通过活/死染色和共聚焦显微镜观察包衣的胰岛的活力(小图B)；通过静态(小图C、E)和动态(灌流，小图D、F)葡萄糖刺激的胰岛素分泌(来自三个不同供体和两个批次的封装的胰岛)(批次#1：C、D；批次#2：E、F)的体外功能；通过监测血糖(小图G)、腹膜内葡萄糖测试期间的葡萄糖耐量(小图H)和在糖尿病免疫缺陷NSG(NOD scidγ小鼠)小鼠的脂肪垫中移植4,000IEQ/小鼠的裸或CC人胰岛后的刺激的人c肽(小图I)进行评估。
图6。使用本文所阐述的生理pH方法在伴有共刺激阻断的糖尿病NHP胰岛的网膜囊中移植CC人胰岛。
(小图A)剖腹程序在糖尿病食蟹猴网膜囊中植入CC NHP胰岛的可行性。(小图B，图6C)CC NHP胰岛受体的外源性胰岛素需求(EIR，实线)、血糖(点)、c肽和汇总表(小图C)，表明移植的CC人胰岛的最低功能是血糖水平降低。(小图D、小图E、小图F)通过H&E染色分析移植CC NHP移植物的组织学评估，用于生物相容性评估(小图D，小图E)和移植物血运重建(小图E，CD31：血管；aSMA：纤维化和/或血管成熟度)。NHP网膜囊的炎症反应是慢性的、活跃的，但很轻微。
图7。将同基因Lewis大鼠胰岛移植到糖尿病、免疫活性Lewis大鼠网膜中。小图A：裸(实线，点标记)和保形包衣的(虚线，正方形标记)Lewis大鼠胰岛受体的血糖。(小图B)手术后天数(POD)30天，裸(实线，点标记)和保形包衣的(虚线，正方形标记)Lewis大鼠胰岛受体的腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)，以及(小图C)IPGTT曲线下面积。(小图D)裸(实线，点标记)和保形包衣的(虚线，正方形标记)Lewis大鼠胰岛受体在IPGTT期间空腹和刺激C肽。统计分析证实大鼠网膜中CC大鼠胰岛同系移植物与裸移植物的体内功能相当。
图8。将同种异体MIN6胰岛瘤细胞簇移植到自发性糖尿病NOD小鼠体内。(小图A)裸(顶行)和保形包衣的(中行和底行)MIN6簇的相位对比图像。(小图B)具有抗PEG染色和相邻正交投影的保形包衣的MIN6簇的共聚焦显微照片，示出了三维胶囊完整性。(小图C)裸(实线，点标记)和保形包衣的(虚线，正方形标记)MIN6簇受体的死亡率显示CC簇存活率提高。(小图D)裸和保形包衣的MIN6簇的受体的随机、非空腹C肽，显示c肽在CC而非裸簇中的持久性。(小图E)通过H&E染色分析移植的CC MIN6簇移植物的组织学评估，以确定CC胶囊内细胞簇的存活，并且进行生物相容性评估，证明CC胶囊在存在同种异体排斥和自身免疫的情况下，对同种异体细胞簇提供免疫分离。
具体实施方式
定义和一般技术
除非本文另外定义，否则本申请使用的科学和技术术语应该具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、生物化学、免疫学、微生物学、遗传学和相关领域相关的术语和技术都在本领域技术范围内。在发生冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。
本申请涉及不同授权的专利、出版的专利申请、期刊文章以及其它出版物，所有这些通过引用并入本文中。如果并入的参考文献中的任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。另外，落入现有技术内的本发明的任何特定实施例都可以明确地从权利要求中的任何一个或多个中排除。因为此类实施例被视为对于本领域的普通技术人员是已知的，所以即使没有在此明确地提出这种排除，其也可以被排除。本发明的任何特定实施例可以出于任何原因从任何权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。
术语“本文”意指整个申请。
应当理解，本文描述的任何实施例，包含在本公开的不同方面和说明书的不同部分(包含仅在实例中描述的实施例)下描述的那些实施例，都可以与本发明的一个或多个其它实施例相结合，除非明确否认或不适当。实施例的组合不限于通过多个从属权利要求所要求保护的那些特定组合。
此外，本发明涵盖其中将来自所列示的权利要求中的一个或多个的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语引入到另一权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，可以对附属于另一权利要求的任何权利要求加以修改，以使其包含在附属于同一基础权利要求的任何其它权利要求中所见的一个或多个限制。在要素是以例如马库什组(Markush group)格式等列表形式呈现的情况下，也公开了所述要素的每个子组，并且可以从所述组中去除任何一种或多种要素。
贯穿本说明书和实施例，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述整数(或分量)或整数组(或分量)，但不排除任何其它整数(或分量)或整数组(或分量)。
在整个说明书中，当组合物或装置被描述为具有、含有、包含或包括(或其变体)特定组分时，预期组合物也可以基本上由所述组分组成或由所述组分组成。类似地，在将方法或过程描述为具有、含有、包含或包括特定方法步骤的情况下，所述方法也基本上可以由所述处理步骤组成或由所述处理步骤组成。此外，应当理解只要本文所描述的组合物、装置和方法保持可操作性，那么步骤的顺序或用于执行某些动作的顺序是无关紧要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。为了简单起见，那些实施例没有在本文中具体阐述。
术语“包含(including)”用于意指“包含但不限于”。“包含”和“包含但不限于”可互换地使用。因此，这些术语将被理解为暗示包含所陈述的整数(或分量)或整数(或分量)组，但不排除任何其它整数(或分量)或整数(或分量)组。
如本文所使用的，“约(about)”或“大约(approximately)”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于所述值是如何测量或确定的，即，测量系统的局限性。
除非在此另有说明或者与上下文明确地相矛盾，否则在描述要素的上下文中(尤其是在以下权利要求书的上下文中)使用术语“一个(a)”、“一种”(an)和“所述”以及类似指代物应被解释为覆盖单数和复数两者。
除非上下文另外明确指出，否则如本文所使用的术语“或”应理解为意指“和/或”。
术语“例如(e.g.或for example)”之后的任何一或多个实例并不意味着穷举或限制。
除非本文另外说明，否则本文对数值范围的引用仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值如同在本文被单独引用一样被并入本说明书中。除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以以任何合适的顺序执行。除非另有说明，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明实施例，而不构成对权利要求的范围的限制。本说明书中的任何语言均不应被解释为将任何非要求保护的要素指示为是必要的。
如本文所使用的，术语“保形包衣(conformal coating)”或其变体，如“保形地包衣的(conformally coated)”和“保形包衣(conformal coat)”是指围绕生物材料外表面并符合生物材料形状和大小的均匀包衣材料层(例如，厚度通常至多约100微米)。保形包衣是相对单分散的，并且不依赖于生物材料的大小。保形包衣具有固定且恒定的厚度。这不同于通过液滴生成进行的传统微胶囊化，其中胶囊的大小是固定的，并且厚度取决于封闭的生物材料的大小。
术语“水相(water phase)”和“水相(aqueous phase)”在本文中可互换使用，并且是指包括水并且可以另外包括亲水性助溶剂和水溶性物质的液相。水相的实例包含但不限于水本身、水性缓冲剂、细胞培养基、肽、蛋白质和碳水化合物在水中的溶液、器官保存溶液。
本文中使用的术语“油相”意指与水相(water phase)或水相(aqueous phase)不混溶的液相。油相的实例包含但不限于聚丙二醇(PPG)、矿物油(例如，粘度是水相粘度的至少2.5倍的矿物油)、与水不混溶的任何高粘度(例如，1,300cP)液体。
如本文所使用的，与水相相关的“滴落”是指允许水相通过孔口、开口或孔，从而形成液滴的过程。其还涵盖通过机械、超声波或其它类似手段将连续的水相流转化为液滴的过程。
如本文所使用的，与水相相关的“喷射”是指一种液体流(例如，水相)以高速从孔口、开口或孔中挤出的过程。高速可以抵消表面张力差。“喷射”是指流动伸长，使得水相流动直径在离开注入孔时至少减小一个数量级。
如本文所使用的，与水相相关的术语“伸长”是指液体流(例如，水)的长度在其横截面直径减小的同时延长或拉长的过程。伸长允许从滴落转变到喷射。
本公开涉及用于免疫分离生物材料(例如，细胞和细胞簇)的试剂、设备和方法，以防止免疫排斥、炎症和/或自身免疫破坏，同时在生物材料植入受试者体内时保持细胞功能。
本文所阐述的保形包衣技术允许用几微米至几十微米厚的水凝胶包衣具有可变尺寸(直径为50μm至350μm，包含胰岛素产生细胞和原代胰岛)的细胞簇，其中包衣厚度相对单分散且不依赖于细胞簇直径。Tomei等人,2014,《美国国家科学院院刊》111:10514-19。此技术的重大进展包含(i)最小化胶囊厚度，这最大化了营养素/葡萄糖/胰岛素向包衣的细胞的运输，最大化了细胞活力，并且最小化了葡萄糖刺激的胰岛素分泌的延迟，Buchwald等人,2018,《生物技术与生物工程》115:232-245，并且(ii)最小化封装的细胞移植物的体积，这允许在只能容纳有限体积的受限部位进行移植，包含预血管化部位和用于局部免疫调节的装置。参见，Tomei等人,2015,《生物疗法专家意见》15:1321-1326。
保形包衣是通过将含有包衣溶液和细胞簇的水相同轴地注入较大(横截面直径为约10倍)的室来实现的，所述室含有在封装装置内流动的、不混溶的油混合物(尤其是由高粘度聚丙二醇(PPG)和Span80制成，所述Span80是一种可商购获得的(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))非离子表面活性剂，包括油酸(C18:1)≤60％；主要平衡亚麻酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)和棕榈(C16:0)酸，所述封装装置在水相注入油相的下游具有流动聚焦几何形状。如果水相的粘度足够高，此类几何形状允许双相流的伸长，Tomei等人,2014,《美国国家科学院院刊》111:10514-10519，水相在油相中发生喷射，如美国专利第10,653,816号、美国专利第10,660,987号和国际专利申请第PCT/US2012/035696号中所阐述的，这些申请中的每项申请的公开内容特此通过全文引用的方式并入(以下简称“先前申请”)。
如本文所使用的，“喷射”是指流动伸长，使得水相流动直径在离开注入孔时至少减小一个数量级。在水相喷射之后，瑞利高原不稳定性现象导致水相破碎成纳升大小的液滴，从而包衣水相中包含的细胞簇。在所述装置中，封装室与10-cm长的玻璃毛细管连接，所述毛细管具有一个直径为1-mm的孔，其中双相流体继续流动；收集管定位在玻璃管的尖端下方以收集流输出。
如在先申请的例示中所阐述的，水相由以下构成：(1)多臂PEG(10kDa 8臂75％至90％官能化PEG-马来酰亚胺(PEG-MAL)或PEG-乙烯基砜(PEG-VS))、过量的交联剂(二硫苏糖醇和2kDa PEG二硫醇，摩尔比为3:1至4:1，8臂PEG-MAL或PEG-VS)，以实现完全PEG凝胶化；水相还包含实现水相足够高粘度的添加剂(包含但不限于藻酸盐、两亲性自组装聚合物或肽等)。如在先申请中所阐述的，例示中水相的pH需要维持在3.5至6(取决于特定的水凝胶组合物)以防止在包衣前水相过早凝胶化，由于在多臂PEG与硫醇化交联剂之间发生的迈克尔型反应的高反应性，其发生在水相喷射和在封装室中破碎的下游。为了收集流出，将50mL锥形管定位在玻璃管下方，并且用PPG和碱(三乙醇胺)填充以增加水相的pH，并且在收集后和纯化前加速水相的凝胶化。通过使用己烷萃取胶凝水相(PEG水凝胶包衣的细胞簇和空PEG凝胶)来实现纯化。使用先前申请中公开的方法，如本文所阐述的，显示了保形包衣的原代胰岛、干细胞源性胰岛素分泌细胞和人肾上皮细胞的体外和体内功能。发现这些保形地包衣的细胞在小鼠体内可以在不需要免疫抑制的情况下逆转糖尿病。参见Tomei等人,2014,同上；Manzoli等人,2018,同上；Stock等人,2020,《干细胞报告(Stem CellReports)》14:91-104。
然而，已发现在封装期间水相中的低pH会降低包衣的原代胰岛功能(例如，活力)，特别是在非人灵长类胰岛中(如本文实例所示)。此外，低pH方法中使用的水相需要含有PEG、交联剂和粘度增强添加剂(藻酸盐、两亲性自组装聚合物或肽等)以达到允许水相喷射和破碎所需的粘度。这些添加剂中的一些降低了生物相容性(如本文所示)和免疫分离，如Manzoli等人,2018,《美国移植杂志》18:590-603的动物模型中的包衣水凝胶所示。
本文所阐述的修改的保形包衣程序使得基础聚合物(10kDa 8臂75％官能化的PEG-马来酰亚胺或PEG-乙烯基砜)和实现PEG凝胶化所需的交联剂(二硫苏糖醇和2kDa PEG二硫醇)的总量(交联剂与多臂PEG的摩尔比为3:1)从含有细胞簇的水相中解耦为水凝胶进一步消除了对水相中粘度增加添加剂的任何需求(如图1“生理pH方法”所展示的)。如本文所公开的，使用由多臂PEG构成的水相，通过向水凝胶中添加20％mol/mol的必要量的交联剂实现PEG凝胶化，从而实现PEG的功能性保形包衣。最小交联的PEG(例如，1％至30％交联)具有足够的粘度以允许水相从同轴油相中喷射(由聚丙二醇(Mn约4000)、具有10％ Span80的PPG或具有同等特性的表面活性剂制成，特别是在降低界面张力方面)并使其破碎，从而在细胞和/或细胞簇周围形成保形包衣。在封装室中水相喷射和破碎下游的细胞和/或细胞簇包衣之后，实现完全PEG交联。现在，这是通过使用图1、1A和1B所示的装置，在发生射流破碎的封装室部分下游，使25mg/mL DTT(二硫苏糖醇)的1:15(v:v)的胶凝乳液在HBSS-/-:PPG/10％ Span80中流动来实现的。如在先申请的例示中所阐述的，水相pH需要维持在酸性值以防止在包衣之前水相过早凝胶化，这发生在水相喷射和封装室中破碎的下游。然而，封装期间的低pH水相降低了包衣的原代胰岛的功能(如本文实例所展示的，特别是图2)。此外，如先前申请中所例示的水相需要含有PEG、交联剂和添加剂(即粘度增强剂；藻酸盐、两亲性自组装聚合物或肽等)以达到允许水相喷射和破碎所需的粘度。这些添加剂降低了动物模型中包衣水凝胶的生物相容性和免疫分离，如本文实例和图2和图3所示。将水相pH增加到接近生理值(约6至7.4)并消除任何粘度增强剂提高了封装的胰岛的功能和包衣生物相容性，如本文实例和图4至8所示。
因此，在一些实施例中，本公开提供了一种用包衣材料保形地包衣生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将水相注入包衣装置中的同轴油相中，所述包衣装置被配置成允许所述水相在所述油相中从滴落到喷射的转变和流动伸长；(b)将所述生物材料和所述包衣材料添加到所述水相中，其中所述步骤(b)的所述包衣材料不包括粘度增强剂；并且其中所述水相的pH为约6至约7.4；(c)允许所述水相射流破碎成颗粒；以及(d)在所述水相射流破碎成颗粒的下游添加所述包衣材料的组分，其中所述组分是促进或催化所述包衣材料聚合的胶凝乳液；从而得到保形地包衣的生物材料。粘度增强剂的实例包含但不限于藻酸盐、两亲性自组装聚合物或肽等。在一些实施例中，本文所描述的方法中排除的粘度增强剂选自多糖，如藻酸盐、脱细胞组织、基于PEG的纳米材料组合件、透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖、葡聚糖硫酸盐、肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、瓜尔胶、水溶性纤维素衍生物、明胶、胶原蛋白和白蛋白。
在一些实施例中，所述方法进一步包括收集所述包衣装置(即，保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料)的流出物的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包括从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和所述无生物材料的包衣材料的步骤。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将所述保形地包衣的生物材料与所述无生物材料的包衣材料分离的步骤。
在一些实施例中，从所述油相纯化所述保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料包括步骤(e)：将来自上述方法中所阐述的步骤(d)的产物倒入矿物油中，同时搅拌所得混合物(即保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料、油相和胶凝乳液(包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并且用矿物油中的10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化)。
在一些实施例中，从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料包括步骤(f)：将汉克氏平衡盐溶液溶液(HBSS)添加到步骤(e)中所得的产物中(即保形地包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料、油相、从所述装置中流出的胶凝乳液(包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并且用矿物油中用10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化)以及矿物油。
在本文公开的方法的一些实施例中，将来自步骤(f)的产物离心并用HBSS洗涤。
在本文公开的方法的一些实施例中，在离心和用汉克氏平衡盐溶液(HBSS)洗涤之后，与PEG二硫醇溶液一起温育包衣的生物材料和任何无生物材料的包衣材料。
在一些实施例中，本文所描述的方法中排除的粘度增强剂选自多糖，如藻酸盐、脱细胞组织、基于PEG的纳米材料组合件、透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖、葡聚糖硫酸盐、肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、瓜尔胶、水溶性纤维素衍生物、明胶、胶原蛋白和白蛋白。
在一些实施例中，生物材料的大小小于将水相注入油相的孔的大小。
本公开的方法可以用于封装植入受试者时可以受益于免疫分离的任何材料。材料的形状可以不均匀。在一些实施例中，可以受益于免疫分离的材料是生物材料。在一些实施例中，所述生物材料包括细胞、细胞簇、生物材料包衣的细胞或细胞簇、亚细胞器、生物分子、非生物药物或其组合。在一些实施例中，本发明的方法用于封装一种或多种细胞、细胞簇、亚细胞器、生物制品(如蛋白质、核酸和抗体)和如药物等非生物制品(例如，小分子)。在一些实施例中，生物材料是细胞。在一些实施例中，生物材料是细胞簇。在一些实施例中，生物材料是细胞和细胞簇。在一些实施例中，生物材料是亚细胞器。在一些实施例中，生物材料是蛋白质。在一些实施例中，生物材料是核酸。在一些实施例中，生物材料是抗体。在一些实施例中，本公开的方法用于封装细胞和/或细胞簇。在一些实施例中，本公开的方法用于封装胰岛细胞和细胞簇。
在某些实施例中，保形地包衣的细胞和细胞簇可以包括一种或多种自体、异源、同基因、同种异体或异种胰岛，单独或与其它细胞类型(例如，支持细胞(Sertoli cell)、间充质细胞和骨髓源性细胞、内皮祖细胞、干细胞、调节性T细胞Treg等，每种统称为植入物“辅助细胞”)组合，所述细胞类型为保形地包衣的细胞的建立、维持或扩张提供生长因子和/或其它有益剂，或以其它方式帮助保形地包衣的细胞在植入宿主时递送治疗效果。在一些实施例中，辅助细胞是间充质干细胞。
如本文所使用的，术语“宿主”是指植入的生物材料的受体，并且包含所有动物。在一些实施例中，宿主是哺乳动物。在示例性实施例中，宿主是人。
本公开的方法可以有利地用于细胞疗法模型系统中的保形包衣。保形地包衣的细胞可以提供治疗益处，例如通过在植入后体内表达治疗因子。此类细胞的实例包含但不限于产生以下的细胞：治疗糖尿病的胰岛素；治疗帕金森氏病(Parkinson's disease)的多巴胺(Minquez-Castellanos等人,2007,《神经外科精神病学杂志(J Neurol NeurosurgPsychiatry)》78:825-831)；治疗侏儒症的生长激素(Chang等人,1999,《生物技术趋势(Trends Biotechnol)》17:78-83)；治疗血友病的因子VIII和因子IX(Chang等人,1999,《生物技术趋势》17，78-83)；以及治疗贫血的促红细胞生成素(Rinsch等人,2002,《国际肾脏杂志(Kidney Intern)》62:1395-1401)。可以想象许多更有益的细胞产生因子或细胞/组织活动。在一些实施例中，保形地包衣的细胞可以表达和/或递送多于一种治疗因子，或可以包括递送一种或多种治疗因子的两种或多种细胞类型。在一些实施例中，保形地包衣的细胞还或可替代地表达和/或递送治疗因子的拮抗剂、激动剂、类似物、衍生物、嵌合体、融合物或片段，以在植入宿主体内时递送治疗效果。
在一些实施例中，至少一些保形地包衣的细胞还或可替代地在不分泌扩散因子的情况下递送治疗效果。在某些实施例中，保形地包衣的细胞提供酶活性，例如将底物转化为具有有益效果的产物，和/或代谢、隔离或吸收有害物质。在某些实施例中，保形地包衣的细胞通过生物材料连接因子(如细胞表面连接因子)递送治疗效果。
在一些实施例中，保形地包衣的细胞在植入宿主后自然地递送治疗效果，无需基因修饰。在一些实施例中，保形地包衣的细胞被基因工程化以递送治疗效果。作为非限制性实例，可以用表达载体转染细胞，或用慢病毒载体转导细胞，使细胞能够表达一种或多种治疗和/或辅助细胞因子。在另一个实施例中，细胞可以包括、由或基本上由用表达载体转染的细胞组成，所述表达载体使细胞能够表达一种或多种治疗和/或辅助细胞因子。此类表达可以是组成的或以调节的方式，例如，响应于细胞所暴露的血流或组织中的生物调节剂。
在一些实施例中，用于保形包衣的细胞源自尸体组织或源自活组织。在一些实施例中，细胞是非哺乳动物或哺乳动物来源、非人来源或人来源、自身或非自身的。这些细胞可以是多能、专能、全能或分化的胚胎或成人干细胞；原代分化细胞；或永生化细胞以及其它细胞类型。在某些实施例中，干细胞包括例如源自脐带血、羊水、经血、胎盘、沃顿氏胶(Wharton's jelly)、细胞滋养层等的细胞。细胞还可以包括上述细胞类型的任何组合。
可以由保形地包衣的细胞递送的示例性治疗因子包含但不限于以下中的一种或多种：胰岛素、胰高血糖素、促红细胞生成素；因子VIII；因子IX；血红蛋白；白蛋白；神经递质，如多巴胺、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、血清素、去甲肾上腺素、肾上腺素和乙酰胆碱；生长因子，如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经生长因子4/5(NT-4/5)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系源性神经生长因子(GDNF)、胆碱能分化因子/白血病抑制因子(CDF/LIF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板源性生长因子(PDGF)；疼痛抑制剂，如物质P(Substance P)、儿茶酚胺、强啡肽、内啡肽或脑啡肽；激素，如甲状旁腺激素或生长激素；免疫调节剂，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；神经调节剂；淋巴因子；细胞因子；辅因子；抗体；适体；以及酶。一种或多种治疗因子的选择以及其从细胞中产生和释放的浓度取决于被治疗患者的需要，并且可以由熟练从业者根据经验容易地确定。
在一些实施例中，保形地包衣的细胞产生具有胰岛素样或胰岛素调节活性的治疗因子。在某些实施例中，治疗因子是胰岛素。在某些实施例中，治疗因子是胰岛素的前体形式，如前胰岛素原或胰岛素原。在某些实施例中，治疗因子是胰岛素嵌合或融合蛋白。
在一些实施例中，保形地包衣的细胞提供的治疗效果包括调节血液中的胰岛素水平。在某些实施例中，治疗效果包括调节血液中的葡萄糖水平。在其它实施例中，治疗效果包括调节患者血液中一种或多种其它生物应答调节剂的水平。
在一些实施例中，由于刺激或信号的接收，治疗因子从保形地包衣的细胞释放。对于植入的细胞，可以从宿主接收刺激或信号(例如，葡萄糖、激素、代谢信号剂、化学信号分子等的血液水平的变化)。
在一些实施例中，本公开的细胞和/或细胞簇的大小通常是均匀的。在其它实施例中，本公开的细胞和/或细胞簇的大小不均匀。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在约10μm至约10000μm之间变化；直径为约25μm至约500μm；或直径为约40μm至约400μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在10μm至10000μm之间变化；直径为25μm至500μm；或直径为40μm至400μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在约10μm至约10000μm之间变化。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在10μm至10000μm之间变化。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在约25μm至约500μm之间变化。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在25μm至500μm之间变化。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在约40μm至约400μm之间变化。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在40μm至400μm之间变化。在特定实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在约50μm至约300μm之间变化。在特定实施例中，细胞和/或细胞簇的直径在50μm至300μm之间变化。在某些实施例中，胰岛细胞和/或细胞簇的直径在约10μm至约10000μm之间变化。在某些实施例中，胰岛细胞和/或细胞簇的直径在10μm至10000μm之间变化。在某些实施例中，胰岛细胞和/或细胞簇的直径在约25μm至约500μm之间变化。在某些实施例中，胰岛细胞和/或细胞簇的直径在25μm至500μm之间变化。在某些实施例中，胰岛细胞和/或细胞簇的直径在约40μm至约400μm之间变化。在某些实施例中，胰岛细胞和/或细胞簇的直径在40μm至400μm之间变化。在特定实施例中，胰岛细胞和/或细胞簇的直径在约50μm至约300μm之间变化。在一些实施例中，直径在约50μm至约300μm之间变化的胰岛细胞和/或细胞簇包括胰岛细胞。在一些实施例中，直径在50μm至300μm之间变化的细胞和/或细胞簇包括胰岛细胞。
在一些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1000μm。在一些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约40μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约50μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约60μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约70μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约80μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约90μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约100μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约150μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约200μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约250μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约300μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约350μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约400μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约450μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约500μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约550μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约600μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约650μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约700μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约750μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约800μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约850μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于约900μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于950μm。在一些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径至多为约1000μm。
在一些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1000μm。在一些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于40μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于50μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于60μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于70μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于80μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于90μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于100μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于150μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于200μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于250μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于300μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于350μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于400μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于450μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于500μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于550μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于600μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于650μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于700μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于750μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于800μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于850μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于900μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径大于950μm。在一些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径至多为1000μm。
在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约40μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约50μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约60μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约70μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约80μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约90μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约100μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约150μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约200μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约250μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约300μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约350μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约400μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约450μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约500μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约550μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约600μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约650μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约700μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约750μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约800μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约850μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约900μm。在某些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约950μm。在一些实施例中，细胞和/或细胞簇的直径为约1000μm。
本公开的保形包衣方法中使用的包衣材料是生物相容的，并且是机械和化学稳定的。此外，用于保形包衣的材料不会干扰或实质上不会干扰封装的生物材料的功能，并且当封装的生物材料植入宿主体内时，会减少、最小化或消除免疫应答。在某些实施例中，包衣材料可以通过内部凝胶化聚合。在某些实施例中，本公开的保形包衣方法中使用的材料是生物可降解的。
在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙基噁唑啉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙基噁唑啉(PEOX)、聚(氨基酸)、其衍生物或其组合。在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯、PEG-乙烯基砜或其组合。在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯或PEG-乙烯基砜。在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，所述包衣材料包括PEG-马来酰亚胺。在一些实施例中，所述包衣材料包括PEG-丙烯酸酯。在一些实施例中，所述包衣材料包括PEG-乙烯基砜。
在一些实施例中，所述包衣材料选自聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙基噁唑啉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙基噁唑啉(PEOX)、聚(氨基酸)、其衍生物以及其组合。在一些实施例中，所述包衣材料是聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯、PEG-乙烯基砜或其组合。在一些实施例中，所述包衣材料是聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯或PEG-乙烯基砜。在一些实施例中，所述包衣材料是聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，所述包衣材料是PEG-马来酰亚胺。在一些实施例中，所述包衣材料是PEG-丙烯酸酯。在一些实施例中，所述包衣材料是PEG-乙烯基砜。
在一些实施例中，所述包衣材料包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙基噁唑啉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙基噁唑啉(PEOX)和/或聚(氨基酸)中的一种或多种。
在某些实施例中，所述包衣材料是单臂的。在某些实施例中，所述包衣材料是多臂的。在某些实施例中，所述包衣材料是单臂和多臂材料的混合物。在一些实施例中，所述水相包括与PEG二硫醇最小交联(5％至50％)的多臂聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，所述包衣材料包括与PEG二硫醇最小交联(1％至30％)的多臂聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，所述包衣材料包括5％至10％的PEG。在一些实施例中，所述水相包括pH 6至7.4的无血清培养基；或pH 6至7.4的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)；具体地，所述水相的pH为pH 6至7.4。在一些实施例中，所述水相的pH为约6至约7.4。在一些实施例中，所述水相的pH为6至7.4。
在一些实施例中，所述包衣材料包括最小交联的PEG-MAL。在一些实施例中，所述包衣材料包括与PEG-SH混合的PEG-MAL(10kDa，8臂，75％官能化)。在一些实施例中，所述包衣材料包括PEG-MAL(10kDa，8臂，75％官能化)和PEG-SH。在一些实施例中，所述包衣材料包括PEG-MAL(10kDa，8臂，75％官能化)、PEG-SH和HBSS。在一些实施例中，所述包衣材料包括与10X PEG-SH混合的12.5％w/v PEG-MAL(10kDa，8臂，75％官能化)。在一些实施例中，所述包衣材料包括12.5％w/v PEG-MAL(10kDa，8臂，75％官能化)和PEG-SH。在一些实施例中，所述包衣材料包括12.5％w/v PEG-MAL(10kDa，8臂，75％官能化)、PEG-SH和HBSS。
在一些实施例中，所述水相包括硫醇化试剂、还原试剂、表面活性剂或其组合。在一些实施例中，用于实施本公开方法的水相可以任选地包括一种或多种硫醇化试剂、还原试剂和/或表面活性剂。在某些实施例中，所述表面活性剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或聚(乙二醇-嵌-硫化丙烯)，更具体地2％聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在一些实施例中，所述硫醇化或还原试剂是二硫苏糖醇(DTT)或PEG二硫醇。在一些实施例中，所述水相中的所述硫醇化或还原试剂是0.01％至0.62％二硫苏糖醇(DTT)。
在一些实施例中，胶凝乳液包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中，并且在粘度为1,300cP的油中乳化的交联剂。在一些实施例中，胶凝乳液包括DTT、汉克氏平衡盐溶液(HBSS)和聚丙二醇(PPG)。在一些实施例中，胶凝乳液包括二硫苏糖醇(DTT)、汉克氏平衡盐溶液(HBSS)、聚丙二醇(PPG)和脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)。在一些实施例中，胶凝乳液包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)，并用脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化。在一些实施例中，胶凝乳液包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)，并且用10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化。
在一些实施例中，保形包衣具有渗透性特征，所述渗透性特征允许营养素和细胞副产物的交换和治疗因子的释放，但也可以阻止宿主免疫效应子分子和/或其它不期望的元件进入胶囊。在某些实施例中，保形包衣包括截止尺寸为100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa、145kDa、150kDa、155kDa、160kDa、170kDa、180kDa、190kDa、200kDa、210kDa、220kDa、230kDa、240kDa、250kDa或500kDa的孔隙。在某些实施例中，保形包衣包括截止尺寸为150kDa的孔隙。在某些实施例中，保形包衣包括截止尺寸至多为500kDa的孔隙。
保形包衣的厚度不取决于包衣的材料的尺寸/直径。在一些实施例中，包衣的厚度范围为1μm至100μm、5μm至50μm或8μm至25μm。在一些实施例中，包衣的厚度范围为25μm至50μm。在一些实施例中，包衣的厚度范围为10μm至20μm。
在一些实施例中，通过用可检测标志物标记包衣材料来可视化包衣。标志物可以是例如荧光标记、酶标记、化学发光标记或表位标记。在某些实施例中，可以通过将高分子量FITC葡聚糖包埋在包衣材料内来可视化包衣。在特定实施例中，标记的包衣材料是PEG-FITC。
在一些实施例中，包衣材料可以被化学改变以含有官能团。在一些实施例中，官能团有助于稳定包衣。此外，包衣材料可以包括治疗因子或与此类治疗因子相关的其它分子，如受体或亲和剂(参见例如，Kim等人,2003,《生物大分子(Biomacromolecules)》4:1214-1223)。治疗因子可以通过共价交联、乳化、离子相互作用、特异亲和相互作用、简单包埋或其任何组合并入包衣材料中。
在某些实施例中，包衣材料包括抗炎分子，以在植入保形地包衣的细胞时减少宿主炎性应答。示例性抗炎剂包含皮质类固醇(地塞米松(dexamethasone)、皮质醇、泼尼松龙(prednisolone)、氯替泼诺(loteprednol etabonate)、氟轻松缩丙酮(fluocinoloneacetonide)等)、钙调神经磷酸酶抑制剂(环孢菌素A(Cyclosporin A))白介素-1(IL-1)、白介素-10(IL-10)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、利索茶碱、己酮可可碱、COX-2抑制剂、白介素-1受体拮抗肽(IRAP)、白介素-10(IL-10)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、TGF-β；针对IL-1、干扰素-γ和TNF-α的抗体；抗组织因子和补体抑制剂；针对白细胞整合素(LFA-1和ICAM-1)的抗体。在一些实施例中，包衣材料包括细胞外基质(ECM)分子，如I型或IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、透明质酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(Beck等人,2007,《组织工程化(TissueEng)》13(3):1-11)。在一些实施例中，抗炎和/或ECM分子拴系到包衣材料的表面。在某些实施例中，分子被包衣或封装以缓慢释放。
生物材料的保形包衣在包衣装置中进行。如本文所使用的，术语“包衣装置”是指能够保形地包衣生物材料的任何装置。在一些实施例中，包衣装置是允许水相在非混溶(例如，油)相中从滴落转变到喷射和伸长的装置，其中水相经历射流破碎成颗粒。在一些实施例中，包衣装置是流动室，所述流动室包括一个或多个油相入口、一个或多个水相入口(其可以与油相入口相同或不同)以及入口下游的一个或多个流动聚焦区域，其中油相的同流射流聚焦水相。流动室可以进一步包括在流动聚焦区域下游的一个或多个通道。水相通道的直径可以是例如0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm或4mm。油相通道的直径可以是例如5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、10.5mm、11mm、11.5mm、12mm、12.5mm、13mm、13.5mm、14mm、14.5mm、15mm、15.5mm、16mm、16.5mm、17mm、17.5mm、18mm、18.5mm、19mm、19.5mm或20mm。在某些实施例中，油相通道的直径可以是至多100mm。通道的长度可以是例如5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm或30mm。通道可通向流动室的一个或多个出口。在特定实施例中，装置或设备按照实例中所阐述的和图1、1A或1B所展示的进行配置。
在一些实施例中，提供了一种包衣系统，所述包衣系统包含第一泵102、与第一泵102连接的保形包衣装置104、定位在保形包衣装置104内的导管106、被配置成在吸入侧与油相储器110(例如，PPG)接触并在排出侧与保形包衣装置104连接的第二泵108、被配置成在吸入侧与乳液储器114接触并在排出侧与保形包衣装置104连接的第三泵112、保形包衣装置104下游侧的毛细管116和收集烧杯118，如图1A所示。
第一泵102可以被配置成将待包衣的水相中的包衣材料和生物材料注入外壳部分的内部上的第一入口。在一些方面，第一泵102选自玻璃注射泵、蠕动泵或被配置成注入材料的任何其它泵。保形包衣装置104在上游侧与第一泵102连接，在下游侧与毛细管116连接，并且可以被配置成用包衣材料保形地包衣生物材料。
导管106可以定位在保形包衣装置104内并且与精密流动注射泵102连接。导管106可以被配置成将包衣材料和待包衣的生物材料注入封装室(内部相)的外壳部分152上的第一入口160，如图1A(v)所示。外壳部分152可以联接到外壳部分152上的第二端162处的连接部分154，也就是其联接到连接部分154的第二端处的包衣部分156，如图1A(v)所示。在此实施例的一些方面，外壳部分152的第二端162与外壳部分152的第一端160相对，如图1A(v)所示。在某些方面，包衣部分156被配置成与连接部分154的第二端164的外表面接合，如图1A(v)所示。
第二泵108在吸入侧与PPG储器110连接，在排出侧与保形包衣装置104的包衣部分156的第二入口158连接，并且被配置成将含有表面活性剂的油相注入第二入口158，如图1A所示。油相(外部相)的注入可以被配置成与内部水相同轴流动。在一些实施例中，第二泵108是蠕动泵、滚柱泵、玻璃注射泵或被配置成注入油相材料的任何其它泵。
封装室包含联接到连接部分154的外壳部分152，所述连接部分联接到包衣部分156，如图1A、小图(v)所示。
在一些实施例中，所述保形包衣装置进一步包括出口用以从所述装置释放空气。在一些实施例中，所述包衣部分可以进一步包括出口以从所述装置释放空气。在一些实施例中，用于释放空气的所述出口定位在进入所述装置的所述水相入口的上游。在包衣过程中，空气释放出口关闭。
在一些实施例中，所述装置提供从10d的通道到d的通道的流聚焦(直径的1/10限制以允许从滴落转变到喷射)。在某些实施例中，d的范围为0.5mm至10mm。在某些实施例中，d的范围为1mm至4mm。在特定实施例中，d约为1mm。在一些实施例中，装置的聚焦角度范围为100度至5度(更多至更少聚焦)。在某些实施例中，聚焦角度范围为90度至10度。在某些实施例中，聚焦角度大于10度、20度、30度、40度、50度、55度、60度、65度、70度、80度或90度。在某些实施例中，装置的聚焦角为约60度。在一些实施例中，流动聚焦区域为50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm长。在某些实施例中，流动聚焦区域为100mm长。
在一些实施例中，外部油相室(圆筒)的直径为1mm至20mm。在一些实施例中，外部油相室的直径为5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm或15mm。在特定实施例中，外部油相室的直径为10mm。在一些实施例中，外部油相室由水相同轴注入端口上游(圆筒轴向距离)1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm处的侧向端口进料。在某些实施例中，侧向端口位于水相注入端口上游5mm处。在某些实施例中，外部油相室由水相同轴注入端口上游(圆筒轴向距离)1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm处的一个以上的侧向端口进料。
在一些实施例中，注水针的尖端与装置的聚焦区域的底部共定位。在一些实施例中，注水针的尖端位于装置的聚焦区域的底部的上游或下游(圆筒轴向距离)约0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm或5mm处。在特定实施例中，注水针的尖端位于聚焦区域上游约0.5mm处。
在特定实施例中，所述装置的特征在于直径为10mm的外部油相室，由位于水相同轴注入端口上游5mm处的侧向端口进料，所述外部油相室位于流动聚焦区域上游0.5mm处，并且流动聚焦发生在直径从10mm收缩到1mm且长度为100mm的通道中，聚焦角为60度。
在特定实施例中，所述装置被配置成允许包括胶凝剂的溶液同轴流动，具体地汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇溶液(10mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL二硫苏糖醇)，所述溶液在聚丙二醇(PPG)中乳化，体积比为1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50或1:100，定位在包衣的生物材料形成后的位置。
在一些实施例中，所述装置能够包衣直径大于40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1000μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于40μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于50μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于60μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于70μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于80μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于90μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于100μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于150μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于200μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于250μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于300μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于350μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于400μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于450μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于500μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于550μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于600μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于650μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于700μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于750μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于800μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于850μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于900μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径大于950μm的细胞和/或细胞簇。在一些实施例中，所述装置能够包衣直径至多为1000μm的细胞和/或细胞簇。
在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约40μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约50μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约60μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约70μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约80μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约90μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约100μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约150μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约200μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约250μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约300μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约350μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约400μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约450μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约500μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约550μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约600μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约650μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约700μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约750μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约800μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约850μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约900μm的细胞和/或细胞簇。在某些实施例中，所述装置能够包衣直径为约950μm的细胞和/或细胞簇。在一些实施例中，所述装置能够包衣直径至多为1000μm的细胞和/或细胞簇。
在一些实施例中，水相流、油相流或两者由蠕动泵维持。在一些实施例中，水相流、油相流或两者由注射泵维持。在一些实施例中，水相流由注射泵维持，并且油相流由蠕动泵维持。在某些实施例中，使用注射泵或蠕动泵将二硫苏糖醇溶液同轴地引入保形地包衣的生物材料。
虽然本文提供了使用16G静脉导管包衣50μm至250μm细胞簇的特定装置的度量，应当理解，也可以设想具有不同配置和大小的其它装置，以维持图1A、小图(v)中所阐述的相对度量。
在其中细胞和/或细胞簇是待保形地包衣的生物材料的一些实施例中，添加到水相中的细胞浓度范围可以是100个细胞/mL至500,000,000个细胞/mL、100个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、1,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、5,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、10,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、15,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、20,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、25,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、30,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、35,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、40,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、45,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、50,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、55,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、60,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、65,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、70,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、75,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、80,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、85,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、90,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、95,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、100,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、105,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、110,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、115,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、120,000,000-200,000,000个细胞/mL、125,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、130,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、135,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、140,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、145,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、150,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、155,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、160,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、165,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、170,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、175,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、180,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、185,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、190,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、195,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、100个细胞/mL至1,000,000个细胞/mL、500个细胞/mL至750,000个细胞/mL、1,000个细胞/mL至500,000个细胞/mL或2,500个细胞/mL至250,000个细胞/mL。
在其中细胞和/或细胞簇是待保形地包衣的生物材料的一些实施例中，添加到水相中的细胞/细胞簇的浓度范围可以是约100个细胞/mL至约500,000,000个细胞/mL、约100个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约1,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约5,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约10,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约15,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约20,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约25,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约30,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约35,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约40,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约45,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约50,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约55,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约60,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约65,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约70,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约75,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约80,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约85,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约90,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约95,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约100,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约105,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约110,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约115,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约120,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约125,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约130,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约135,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约140,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约145,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约150,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约155,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约160,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约165,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约170,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约175,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约180,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约185,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约190,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约195,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约100个细胞/mL至约1,000,000个细胞/mL、约500个细胞/mL至约750,000个细胞/mL、约1,000个细胞/mL至约500,000个细胞/mL或约2,500个细胞/mL至约250,000个细胞/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的细胞的浓度为约100个细胞/mL、约500个细胞/mL、约1000个细胞/mL、约2500个细胞/mL、约5000个细胞/mL、约7500个细胞/mL、约10000个细胞/mL、约25000个细胞/mL、约50000个细胞/mL、约75000个细胞/mL、约100000个细胞/mL、约250000个细胞/mL、约500000个细胞/mL、约750000个细胞/mL、约1,000,000个细胞/mL、约2,500,000个细胞/mL、约5,000,000个细胞/mL、约7,500,000个细胞/mL、约10,000,000个细胞/mL、约20,000,000个细胞/mL、约25,000,000个细胞/mL、约30,000,000个细胞/mL、约40,000,000个细胞/mL、约50,000,000个细胞/mL、约60,000,000个细胞/mL、约70,000,000个细胞/mL、约80,000,000个细胞/mL、约90,000,000个细胞/mL、约100,000,000个细胞/mL、约105,000,000个细胞/mL、约110,000,000个细胞/mL、约115,000,000个细胞/mL、约120,000,000个细胞/mL、约125,000,000个细胞/mL、约130,000,000个细胞/mL、约135,000,000个细胞/mL、约140,000,000个细胞/mL、约145,000,000个细胞/mL、约150,000,000个细胞/mL、约155,000,000个细胞/mL、约160,000,000个细胞/mL、约165,000,000个细胞/mL、约170,000,000个细胞/mL、约175,000,000个细胞/mL、约180,000,000个细胞/mL、约185,000,000个细胞/mL、约190,000,000个细胞/mL、约195,000,000个细胞/mL、约200,000,000个细胞/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的细胞的浓度为100个细胞/mL、500个细胞/mL、1000个细胞/mL、2500个细胞/mL、5000个细胞/mL、7500个细胞/mL、10000个细胞/mL、25000个细胞/mL、50000个细胞/mL、75000个细胞/mL、100000个细胞/mL、250000个细胞/mL、500000个细胞/mL、750000个细胞/mL、1,000,000个细胞/mL、2,500,000个细胞/mL、5,000,000个细胞/mL、7,500,000个细胞/mL、10,000,000个细胞/mL、20,000,000个细胞/mL、25,000,000个细胞/mL、30,000,000个细胞/mL、40,000,000个细胞/mL、50,000,000个细胞/mL、60,000,000个细胞/mL、70,000,000个细胞/mL、80,000,000个细胞/mL、90,000,000个细胞/mL、100,000,000个细胞/mL、105,000,000个细胞/mL、110,000,000个细胞/mL、115,000,000个细胞/mL、120,000,000个细胞/mL、125,000,000个细胞/mL、130,000,000个细胞/mL、135,000,000个细胞/mL、140,000,000个细胞/mL、145,000,000个细胞/mL、150,000,000个细胞/mL、155,000,000个细胞/mL、160,000,000个细胞/mL、165,000,000个细胞/mL、170,000,000个细胞/mL、175,000,000个细胞/mL、180,000,000个细胞/mL、185,000,000个细胞/mL、190,000,000个细胞/mL、195,000,000个细胞/mL、200,000,000个细胞/mL。
在其中细胞簇是待保形地包衣的生物材料的一些实施例中，添加到水相中的细胞簇的浓度范围可以是100个细胞簇/mL至200,000个细胞簇/mL、100个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、500个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、1,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、2,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、3,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、4,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、5,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、6,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、7,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、8,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、9,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、10,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、15,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、20,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、25,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、30,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、35,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、40,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、45,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、50,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、55,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、60,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、65,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、70,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、75,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、80,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、85,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、900,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、95,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL。
在其中细胞簇是待保形地包衣的生物材料的一些实施例中，添加到水相中的细胞簇的浓度范围可以是约100个细胞簇/mL至约200,000细胞簇/mL、约100个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约500个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约1,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约2,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约3,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约4,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约5,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约6,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约7,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约8,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约9,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约10,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约15,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约20,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约25,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约30,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约35,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约40,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约45,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约50,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约55,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约60,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约65,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约70,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约75,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约80,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约85,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、约90,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约95,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的细胞簇的浓度为约100个细胞簇/mL、约500个细胞簇/mL、约1,000个细胞簇/mL、约2,000个细胞簇/mL、约3,000个细胞簇/mL、约4,000个细胞簇/mL、约5,000个细胞簇/mL、约6,000个细胞簇/mL、约7,000个细胞簇/mL、约8,000个细胞簇/mL、约9,000个细胞簇/mL、约10,000个细胞簇/mL、约15,000个细胞簇/mL、约20,000个细胞簇/mL、约25,000个细胞簇/mL、约30,000个细胞簇/mL、约35,000个细胞簇/mL、约40,000个细胞簇/mL、约45,000个细胞簇/mL、约50,000个细胞簇/mL、约55,000个细胞簇/mL、约60,000个细胞簇/mL、约65,000个细胞簇/mL、约70,000个细胞簇/mL、约75,000个细胞簇/mL、约80,000个细胞簇/mL、约85,000个细胞簇/mL、约90,000个细胞簇/mL、约95,000个细胞簇/mL、约100,000个细胞簇/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的细胞簇的浓度为100个细胞簇/mL、500个细胞簇/mL、1,000个细胞簇/mL、2,000个细胞簇/mL、3,000个细胞簇/mL、4,000个细胞簇/mL、5,000个细胞簇/mL、6,000个细胞簇/mL、7,000个细胞簇/mL、8,000个细胞簇/mL、9,000个细胞簇/mL、10,000个细胞簇/mL、15,000个细胞簇/mL、20,000个细胞簇/mL、25,000个细胞簇/mL、30,000个细胞簇/mL、35,000个细胞簇/mL、40,000个细胞簇/mL、45,000个细胞簇/mL、50,000个细胞簇/mL、55,000个细胞簇/mL、60,000个细胞簇/mL、65,000个细胞簇/mL、70,000个细胞簇/mL、75,000个细胞簇/mL、80,000个细胞簇/mL、85,000个细胞簇/mL、90,000个细胞簇/mL、95,000个细胞簇/mL、100,000个细胞簇/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的胰岛细胞的浓度范围可以是100个细胞/mL至500,000,000个细胞/mL、100个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、1,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、5,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、10,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、15,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、20,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、25,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、30,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、35,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、40,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、45,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、50,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、55,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、60,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、65,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、70,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、75,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、80,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、85,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、90,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、95,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、100,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、105,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、110,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、115,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、120,000,000-200,000,000个细胞/mL、125,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、130,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、135,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、140,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、145,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、150,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、155,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、160,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、165,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、170,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、175,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、180,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、185,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、190,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、195,000,000个细胞/mL至200,000,000个细胞/mL、100个细胞/mL至1,000,000个细胞/mL、500个细胞/mL至750,000个细胞/mL、1,000个细胞/mL至500,000个细胞/mL或2,500个细胞/mL至250,000个细胞/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的胰岛细胞的浓度范围可以是约100个细胞/mL至约500,000,000个细胞/mL、约100个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约1,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约5,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约10,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约15,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约20,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约25,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约30,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约35,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约40,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约45,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约50,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约55,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约60,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约65,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约70,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约75,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约80,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约85,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约90,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约95,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约100,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约105,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约110,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约115,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约120,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约125,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约130,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约135,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约140,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约145,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约150,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约155,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约160,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约165,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约170,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约175,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约180,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约185,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约190,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约195,000,000个细胞/mL至约200,000,000个细胞/mL、约100个细胞/mL至约1,000,000个细胞/mL、约500个细胞/mL至约750,000个细胞/mL、约1,000个细胞/mL至约500,000个细胞/mL或约2,500个细胞/mL至约250,000个细胞/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的细胞的浓度为约100个细胞/mL、约500个细胞/mL、约1000个细胞/mL、约2500个细胞/mL、约5000个细胞/mL、约7500个细胞/mL、约10000个细胞/mL、约25000个细胞/mL、约50000个细胞/mL、约75000个细胞/mL、约100000个细胞/mL、约250000个细胞/mL、约500000个细胞/mL、约750000个细胞/mL、约1,000,000个细胞/mL、约2,500,000个细胞/mL、约5,000,000个细胞/mL、约7,500,000个细胞/mL、约10,000,000个细胞/mL、约20,000,000个细胞/mL、约25,000,000个细胞/mL、约30,000,000个细胞/mL、约40,000,000个细胞/mL、约50,000,000个细胞/mL、约60,000,000个细胞/mL、约70,000,000个细胞/mL、约80,000,000个细胞/mL、约90,000,000个细胞/mL、约100,000,000个细胞/mL、约105,000,000个细胞/mL、约110,000,000个细胞/mL、约115,000,000个细胞/mL、约120,000,000个细胞/mL、约125,000,000个细胞/mL、约130,000,000个细胞/mL、约135,000,000个细胞/mL、约140,000,000个细胞/mL、约145,000,000个细胞/mL、约150,000,000个细胞/mL、约155,000,000个细胞/mL、约160,000,000个细胞/mL、约165,000,000个细胞/mL、约170,000,000个细胞/mL、约175,000,000个细胞/mL、约180,000,000个细胞/mL、约185,000,000个细胞/mL、约190,000,000个细胞/mL、约195,000,000个细胞/mL、约200,000,000个细胞/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的胰岛细胞的浓度为100个细胞/mL、500个细胞/mL、1000个细胞/mL、2500个细胞/mL、5000个细胞/mL、7500个细胞/mL、10000个细胞/mL、25000个细胞/mL、50000个细胞/mL、75000个细胞/mL、100000个细胞/mL、250000个细胞/mL、500000个细胞/mL、750000个细胞/mL、1,000,000个细胞/mL、2,500,000个细胞/mL、5,000,000个细胞/mL、7,500,000个细胞/mL、10,000,000个细胞/mL、20,000,000个细胞/mL、25,000,000个细胞/mL、30,000,000个细胞/mL、40,000,000个细胞/mL、50,000,000个细胞/mL、60,000,000个细胞/mL、70,000,000个细胞/mL、80,000,000个细胞/mL、90,000,000个细胞/mL、100,000,000个细胞/mL、105,000,000个细胞/mL、110,000,000个细胞/mL、115,000,000个细胞/mL、120,000,000个细胞/mL、125,000,000个细胞/mL、130,000,000个细胞/mL、135,000,000个细胞/mL、140,000,000个细胞/mL、145,000,000个细胞/mL、150,000,000个细胞/mL、155,000,000个细胞/mL、160,000,000个细胞/mL、165,000,000个细胞/mL、170,000,000个细胞/mL、175,000,000个细胞/mL、180,000,000个细胞/mL、185,000,000个细胞/mL、190,000,000个细胞/mL、195,000,000个细胞/mL、200,000,000个细胞/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的胰岛细胞簇的浓度范围可以是100个细胞簇/mL至200,000个细胞簇/mL、100个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、500个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、1,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、2,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、3,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、4,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、5,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、6,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、7,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、8,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、9,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、10,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、15,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、20,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、25,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、30,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、35,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、40,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、45,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、50,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、55,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、60,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、65,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、70,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、75,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、80,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、85,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、900,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、95,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的胰岛细胞簇的浓度范围可以是约100个细胞簇/mL至约200,000细胞簇/mL、约100个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约500个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约1,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约2,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约3,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约4,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约5,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约6,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约7,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约8,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约9,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约10,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约15,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约20,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约25,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约30,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约35,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约40,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约45,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约50,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约55,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约60,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约65,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约70,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约75,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约80,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约85,000个细胞簇/mL至100,000个细胞簇/mL、约90,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL、约95,000个细胞簇/mL至约100,000个细胞簇/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的胰岛细胞簇的浓度为约100个细胞簇/mL、约500个细胞簇/mL、约1,000个细胞簇/mL、约2,000个细胞簇/mL、约3,000个细胞簇/mL、约4,000个细胞簇/mL、约5,000个细胞簇/mL、约6,000个细胞簇/mL、约7,000个细胞簇/mL、约8,000个细胞簇/mL、约9,000个细胞簇/mL、约10,000个细胞簇/mL、约15,000个细胞簇/mL、约20,000个细胞簇/mL、约25,000个细胞簇/mL、约30,000个细胞簇/mL、约35,000个细胞簇/mL、约40,000个细胞簇/mL、约45,000个细胞簇/mL、约50,000个细胞簇/mL、约55,000个细胞簇/mL、约60,000个细胞簇/mL、约65,000个细胞簇/mL、约70,000个细胞簇/mL、约75,000个细胞簇/mL、约80,000个细胞簇/mL、约85,000个细胞簇/mL、约90,000个细胞簇/mL、约95,000个细胞簇/mL、约100,000个细胞簇/mL。
在一些实施例中，添加到水相中的胰岛细胞簇的浓度为100个细胞簇/mL、500个细胞簇/mL、1,000个细胞簇/mL、2,000个细胞簇/mL、3,000个细胞簇/mL、4,000个细胞簇/mL、5,000个细胞簇/mL、6,000个细胞簇/mL、7,000个细胞簇/mL、8,000个细胞簇/mL、9,000个细胞簇/mL、10,000个细胞簇/mL、15,000个细胞簇/mL、20,000个细胞簇/mL、25,000个细胞簇/mL、30,000个细胞簇/mL、35,000个细胞簇/mL、40,000个细胞簇/mL、45,000个细胞簇/mL、50,000个细胞簇/mL、55,000个细胞簇/mL、60,000个细胞簇/mL、65,000个细胞簇/mL、70,000个细胞簇/mL、75,000个细胞簇/mL、80,000个细胞簇/mL、85,000个细胞簇/mL、90,000个细胞簇/mL、95,000个细胞簇/mL、100,000个细胞簇/mL。
在某些实施例中，添加到水相中的细胞/细胞簇的浓度范围为5,000个细胞/mL至100,000个细胞/mL。在特定实施例中，添加到水相中的5,000个细胞/mL至250,000个细胞/mL是胰岛细胞，所述胰岛细胞可以任选地富集用于分泌胰岛素的β细胞或细胞簇。
在一些实施例中，水相的pH为约6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3或7.4。在一些实施例中，水相的pH为约6。在一些实施例中，水相的pH为约6.1。在一些实施例中，水相的pH为约6.2。在一些实施例中，水相的pH为约6.3。在一些实施例中，水相的pH为约6.4。在一些实施例中，水相的pH为约6.5。在一些实施例中，水相的pH为约6.6。在一些实施例中，水相的pH为约6.7。在一些实施例中，水相的pH为约6.8。在一些实施例中，水相的pH为约6.9。在一些实施例中，水相的pH为约7.0。在一些实施例中，水相的pH为约7.1。在一些实施例中，水相的pH为约7.2。在一些实施例中，水相的pH为约7.3。在一些实施例中，水相的pH为约7.4。在特定实施例中，水相的pH为约6至7.4。
如本文所阐述的，水相的pH为6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.4、7.5或8。在一些实施例中，水相的pH为6.0。在一些实施例中，水相的pH为6.1。在一些实施例中，水相的pH为6.2。在一些实施例中，水相的pH为6.3。在一些实施例中，水相的pH为6.4。在一些实施例中，水相的pH为6.5。在一些实施例中，水相的pH为6.6。在一些实施例中，水相的pH为6.7。在一些实施例中，水相的pH为6.8。在一些实施例中，水相的pH为6.9。在一些实施例中，水相的pH为7.0。在一些实施例中，水相的pH为7.1。在一些实施例中，水相的pH为7.2。在一些实施例中，水相的pH为7.3。在一些实施例中，水相的pH为7.4。在特定实施例中，水相的pH为6至7.4。
在一些实施例中，水相包括培养基中的细胞和/或细胞簇、表面活性剂和一种或多种硫醇化或还原试剂(所述试剂可以是例如线性或多臂的单官能或多官能试剂)。在一些实施例中，细胞/细胞簇包括胰岛细胞，培养基是无血清的或是汉克氏平衡盐溶液(HBSS)，和/或硫醇化或还原试剂是DTT或线性双官能PEG二硫醇。在一些实施例中，水相包括5％至10％的PEG(例如，5％或10％的PEG)和50,000个至250,000个胰岛细胞或细胞簇/ml，pH为7.4。在一些实施例中，水相包括1％至30％的PEG(例如，1％或30％的PEG)和50,000个至250,000个胰岛细胞或细胞簇/ml，pH为6至7.4。本公开的保形包衣方法涵盖这些值的任何组合。
在一些实施例中，所述油相包括聚丙二醇(PPG)、粘度为水相粘度的至少2.5倍的矿物油、含10％脱水山梨糖醇单油酸酯的聚丙二醇(PPG)。在一些实施例中，所述油相包括具有10％脱水山梨糖醇单油酸酯的聚丙二醇(PPG)，其中所述油相任选地包括三乙醇胺。在包括三乙醇胺的实施例中，所述油相包括0.01％至0.2％的三乙醇胺。在一些实施例中，所述油相包括一种或多种粘度为水相粘度的至少2.5倍的例如聚丙二醇(PPG)或矿物油。在某些实施例中，所述油相包括聚丙二醇(PPG)。在一些实施例中，所述油相包括粘度为所述水相粘度的至少2.5倍的矿物油。
油相可以进一步包括一种或多种试剂，例如Span80。
在一些实施例中，所述油相包括PPG。在某些实施例中，所述油相包括具有1％至20％、5％至15％、6％至14％、7％至13％、8％至12％、9％至11％或10％ Span80的PPG。在一些实施例中，所述油相包括具有1％至20％ Span80的PPG。在一些实施例中，所述油相包括具有5％至15％ Span80的PPG。在一些实施例中，所述油相包括具有6％至14％Span80的PPG。在一些实施例中，所述油相包括具有7％至13％ Span80的PPG。在一些实施例中，所述油相包括具有8％至12％ Span80的PPG。在一些实施例中，所述油相包括具有9％至11％Span80的PPG。在特定实施例中，所述油相包括具有10％ Span80的PPG。
在一些实施例中，水相(Qw)和油相(Qo)的流速分别选自：10微升/分钟和3.5毫升/分钟；15微升/分钟和3.5毫升/分钟；20微升/分钟和3.5毫升/分钟；1微升/分钟和3.5毫升/分钟；10微升/分钟和7毫升/分钟；50微升/分钟和0.5毫升/分钟；50微升/分钟和2.5毫升/分钟；150微升/分钟和0.5毫升/分钟；以及150微升/分钟和2.5毫升/分钟。在一些实施例中，在水相之前注入空气以使油射流中的水稳定。在某些实施例中，将空气吸入含有水相的注入导管中，使得可以在将水相注入到油相中之前将空气的气泡注入油相中，以帮助可视化水相的开始。
水相和油相的流速可以随时间推移调节。在一些实施例中，水相随时间推移减少而油相增加。在特定实施例中，水相首先以50微升/分钟进入油相，然后降低到10微升/分钟。在某些实施例中，油相速率从0.5毫升/分钟逐渐增加到3.5毫升/分钟，同时水相降低，然后在整个封装过程中保持恒定，或者在整个封装过程中油相速率保持恒定，为3.5毫升/分钟。
在一些实施例中，油相速度与水相速度的比率在70与500之间。在某些实施例中，比率为50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、450或500。在特定实施例中，比率为350。
在一些实施例中，油相粘度与水相粘度的比率在2.5与100之间。在某些实施例中，比率为2.5、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100。在特定实施例中，比率为3.5。
在水射流破碎时，用与射流大小成比例的薄的、含有包衣材料的水层包衣用于封装的材料(例如，细胞和/或细胞簇)，从而允许保形包衣。如本文所公开的，然后通过与促进聚合的胶凝乳液同轴地接触将包衣形成聚合物。在某些实施例中，乳液包括聚丙二醇(PPG)中的二硫苏糖醇和汉克氏平衡盐溶液(HBSS)。
然后从包衣装置的流出物收集包衣的细胞/细胞簇。在一些实施例中，在收集后，将包衣的细胞和/或细胞簇保持在搅拌下，例如1分钟至30分钟、5分钟至20分钟或8分钟至12分钟，以避免聚结，直到包衣的聚合完成。在一些实施例中，搅拌在4℃与25℃之间进行。在特定实施例中，搅拌在25℃下进行。在一些实施例中，搅拌速度为50rpm至500rpm或100rpm至300rpm。在一些实施例中，将包衣的细胞和/或细胞簇保持搅拌约7分钟。在一些实施例中，将包衣的细胞和/或细胞簇收集在容器中，并且允许其通过重力沉降。在一些实施例中，将包衣的细胞和/或细胞簇在外浴中不搅拌地保持例如1分钟至30分钟、5分钟至20分钟或8分钟至12分钟，以完成包衣的聚合。在一些实施例中，将包衣的细胞和/或细胞簇收集在包括矿物油和0.01％至0.1％三乙醇胺的容器内。
可能期望将包衣的细胞和/或细胞簇与无生物材料的包衣材料分离。这种分离可以通过本领域众所周知的许多基于尺寸或基于密度的分离技术中的任何一种来实现，例如通过梯度离心。在某些实施例中，通过梯度离心从包衣材料中进一步纯化包衣的细胞和/或细胞簇，包括以下步骤：
(a)分层溶液以形成能够分离保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料的密度梯度；(b)将保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料应用于密度梯度；(c)对所述密度梯度进行离心以将所述保形地包衣的生物材料与所述无生物材料的包衣材料分离；和(d)去除含有无生物材料的包衣材料的梯度部分。
在一些实施例中，被分层以形成梯度的溶液的密度为(1)1g/ml至1.1g/ml，例如1.042g/ml，以及(2)培养基的密度。在一些实施例中，超过50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的包衣的生物材料从无生物材料的包衣材料中纯化。在某个实施例中，95％以上的包衣的生物材料从无生物材料的包衣材料中纯化。
在某些实施例中，重复洗涤保形地包衣的生物材料，具体地细胞，在某些实施例中包括HBSS。纯化后，可以在适当的培养条件下体外培养包括保形地包衣的生物材料的细胞。
如果包衣材料带有荧光标记，则可通过例如荧光显微镜、荧光细胞术(fluorocytometry)、流式细胞术细胞分选技术或通过荧光酶标仪来可视化保形地包衣的细胞和/或细胞簇。在一些实施例中，可以使用例如流式细胞术或荧光激活的细胞分选术(FACS)检测和/或分离荧光标记的保形地包衣的细胞。
在一些实施例中，本公开的方法被放大以同时保形地包衣至少50,000个细胞和/或细胞簇；100,000个细胞和/或细胞簇；150,000个细胞和/或细胞簇；200,000个细胞和/或细胞簇；300,000个细胞和/或细胞簇；400,000个细胞和/或细胞簇；500,000个细胞和/或细胞簇；600,000个细胞和/或细胞簇；700,000个细胞和/或细胞簇；800,000个细胞和/或细胞簇；900,000个细胞和/或细胞簇；或1,000,000个细胞和/或细胞簇。在一些实施例中，通过在一系列室中进行本公开的方法来实现这种放大。在一些实施例中，所公开的方法可以通过将一系列平行的竖直室组装成例如径向配置来放大，其中到每个室的径向流以相当的流体动力学流动特性将水相进料到每个单独的室。在一些实施例中，将来自每个室的包衣的细胞和/或细胞簇和无生物材料的包衣材料收集在单独的容器中。在一些实施例中，将来自每个室的包衣的细胞和/或细胞簇和无生物材料的包衣材料收集在同一容器中并同时纯化。
在一些实施例中，本公开的方法提供了大于引入到包衣装置中的生物材料的15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的保形包衣。在某些实施例中，所公开的方法提供大于95％的引入的生物材料的保形包衣。
在一些实施例中，通过本领域众所周知的多种方法中的任一种(例如，MTT测定、活/死染色和/或(在胰岛的情况下)静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌或灌流)来评估包衣的细胞和/或细胞簇的活力和功能。在一些实施例中，所述评估在细胞植入之前进行。在包衣的细胞是胰岛的情况下，可以通过例如监测移植的患者的葡萄糖水平和/或体重、血清C肽水平、血红蛋白A1c和/或通过组织学评估来评估通过保形包衣对移植的胰岛的免疫保护。
本公开进一步提供了治疗患者的病症的方法，所述方法包括将通过本文所述方法分离的保形地包衣的生物材料植入患者体内的步骤。这些病症包含但不限于：糖尿病、血友病、肾衰竭、淀粉样变性、免疫系统病症、炎症、慢性疼痛、关节炎、高血压、神经系统病症、代谢紊乱、内分泌紊乱、淋巴增生紊乱、骨髓增生紊乱、骨髓增生异常综合征、干细胞病症、吞噬细胞病症、组织细胞疾病、红细胞或血小板异常、浆细胞病症、急性白血病、慢性白血病、恶性肿瘤(乳腺癌、尤文氏肉瘤(Ewing Sarcoma)、成神经细胞瘤、肾细胞癌等)、甲状腺功能减退、垂体机能减退、性腺功能减退、移植物衰竭、移植物抗宿主病(GVD)、静脉闭塞性疾病、移植前化疗的副作用(如出血过多、不孕症、肾并发症以及肺和心脏并发症)以及熟练从业者会认识到的其它病症和疾病。
如本文所述，术语“患者”是指治疗处理的接受者，并且包含所有动物。在一些实施例中，所述患者是哺乳动物。在一些实施例中，所述患者是灵长类动物。在一些实施例中，所述患者是人。
通过本公开的方法生产的保形地包衣的生物材料可以植入患者体内的任何适当位置。生物材料可以植入活的或预血管化的部位；在生理或转化部位；以及在组织和器官内或与其相邻。在某些实施例中，植入位置可以是例如颏内(网膜袋中)、皮下、腹膜内、腹膜前、肌肉内、淋巴结内或肾包膜下。在一些实施例中，植入位置是皮下。在一些实施例中，植入位置不是腹腔。
在一些实施例中，在植入患者体内之前，将通过本公开的方法生产的保形地包衣的生物材料放置在装置中，以降低患者免疫应答和/或延长细胞存活。所述装置可以是适合在患者体内植入生物材料的任何装置，例如美国公开第2006/0024276号或美国专利第6,716,246号中描述的装置，所述文献中的每个文献通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，保形地包衣的生物材料植入天然或合成、生物可降解或非生物可降解支架基材内或附近。
以下实例说明了本公开的具体实施例以及其各种用途。其仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实例
本文所阐述的保形包衣程序是对于2017年4月4日提交的美国专利申请第15/478320号、美国专利申请第14/114,690号、国际专利申请第PCT/US2012/035696号和美国临时专利申请第61/480,513号中公开的程序的改进，所述文献中的每个文献明确通过引用的方式并入本文。这些改进尤其涉及避免使生物材料，具体地细胞并且最具体地胰岛细胞经受低pH(即小于约pH 5)条件，并且消除包括所述生物材料的水相中的粘度增强剂，这导致封装的胰岛功能和包衣生物相容性的改善。
用于改进保形包衣程序的材料：
Figure BDA0003958240340000441
用于改进的保形包衣程序的试剂：
胶凝乳液：通过搅拌将汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏醇溶液(25mg/mL二硫苏糖醇)缓慢添加到500mL聚丙二醇(PPG)中，直到乳化(乳白色)并均匀混合。
最小交联的PEG-MAL溶液：向400μL的12.5％w/v PEG-MAL(10kDa，8臂，75％官能化)中添加2.6μL的1N HCl，然后涡旋(这防止了由于不均匀混合导致的即时凝胶化)，然后通过混合添加22.22μL的10X PEG-SH溶液。这提供了最小交联的PEG-MAL溶液。
单独将1μL的1N NaOH添加到400μL的HBSS中，然后将其添加到401μL的最小交联的PEG-MAL溶液中，然后完全涡旋。然后将此混合物放置30分钟以部分凝胶化，转化为粘性液体。此胶凝步骤可以进行5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟或45分钟。
设备设置
如图1和图1A所展示的，除毛细管、毛细管螺钉和气泡捕捉器外，清洁包衣装置的组件，使其干燥，然后重新组装并灭菌(通常在高压釜中)。具体而言，将图1A，小图(ii)、(iii)和(iv)所示的三个部件旋钮在一起。旋钮前，将一对橡胶阀放置在图1A(iii)所示部件的顶部。将玻璃毛细管插入图1A，小图(iv)所示的部件的底部孔口并固定到位。对于每次制备，对新的、未使用的Tygon泵管和刚性管(用于与注射泵一起使用)进行洗涤和灭菌。Hamilton注射器也采用了类似的洗涤和灭菌程序。程序中的所有剩余步骤在细胞培养、层流罩下进行，其中设备如图1和1A所示组装。然后将毛细管安装并用毛细管螺钉固定到位，并且在毛细管下方放置1个废物接受器，通常为50mL锥形管。气泡捕捉器也定位在装置上，如图1和1A所示。
然后在不引入气泡的情况下，用矿物油填充玻璃Hamilton注射器，并且通过用矿物油起动制备刚性管，方便地使用5mL鲁尔锁注射器(luer lock syringe)，然后将起动的管与Hamilton注射器连接。然后将注射器固定在注射泵上，如图1和1A所示，注意在注射器中留有至少2mL的矿物油，以允许适当的导管起动。刚性管的远端方便地固定在钢支架上，如图1A所示。
然后将Tygon管与蠕动泵连接，并且与含有PPG和10％ Span 80溶液的50mL锥形管(或其它接受器)接触。然后将Tygon管的远端与包衣装置连接，如图1和1A所示，然后对泵进行起动。然后通过校准递送的量(例如，递送到50mL锥形管中的量为3.5g)将泵起动为3.5毫升/分钟的流速。
然后将无菌导管与刚性管的末端连接，并且将注射泵流速设置为2毫升/分钟。对导管进行起动，以确保去除所有气泡，并且注射器中至少留有1mL矿物油。
最后，将两个宽孔口200μL微量移液管尖端固定到玻璃毛细管上，方便地在毛细管的相对端上使用束线带，并且将两个蠕动管固定在固定到玻璃毛细血管上所固定的宽孔口尖端上。然后将管/毛细管组合件安装到蠕动泵上，如图1和1A所示，蠕动管的端部浸入胶凝乳液中。图1B示出了完全组装的设备的照片。另外，设计了3D打印定制工具，以取代本段先前描述的组合件(图1C)。简而言之，此工具设计为滑到玻璃毛细管上并咬下，并且具有两个带倒钩的入口，蠕动管可以直接在此固定。
保形包衣工艺：
根据以下方案对胰岛细胞进行保形地包衣。将细胞培养基中的约10,000个胰岛细胞当量(IEQ)引入1.5mL低结合无菌Eppendorf管中，并且在150RCF下离心1分钟，以沉淀细胞。倾析上清液细胞培养基后，将胰岛细胞重新悬浮在100μL最小交联的PEG-MAL(中性pH)中，方便地使用固定到P100移液管的200μL宽孔口尖端。然后使用精密注射泵以每分钟100μL的提取速率将细胞提取到16G导管
Figure BDA0003958240340000451
中。然后将胶凝乳液引入毛细管中，并且以4毫升/分钟的流速流入150mL收集烧杯中。打开气泡捕捉器以确保气泡去除，并且以3.5毫升/分钟的校准速率将PPG/Span 80混合物引入装置中。(一旦从装置中清除了引入各种液体组分产生的气泡，则关闭气泡捕捉器。)
然后将包括胰岛细胞的16G导管
Figure BDA0003958240340000461
插入装置的顶部，使用Harvard注射泵将包括PEG-MAL悬浮液的胰岛以每分钟15μL的速度流入毛细管。允许包衣程序进行约7分钟，在整个程序中观察滴落到喷射的转变，以确保稳定的转变。此后，关闭2个蠕动泵和Harvard注射泵，并且使收集在150mL收集烧杯中的保形地包衣的胰岛凝胶化12分钟。
纯化工艺
将从保形包衣程序中收集的流出物缓慢倒入200mL矿物油中，通常以240rpm的搅拌速率装在1L烧杯中。然后用HBSS-/-冲洗含有胰岛的接受器，用HBSS-/-将含有胰岛细胞和矿物油的接受器的体积调节到总共500mL，并且以相同的速率继续搅拌两分钟。此后，将混合物分成两个250mL的部分，放入锥形管中，并且在1500rpm下离心5分钟，留下约5mL的含有细胞的沉淀物。
将细胞沉淀物转移到50mL锥形管中，用HBSS-/-冲洗沉淀管并添加到每个50mL锥形管中。用HBSS-/-将含有胰岛细胞的50mL锥形管的体积调节到50mL，并且在1000rpm下离心5分钟。将此离心得到的细胞沉淀物转移到15mL管中，用HBSS-/-冲洗50mL管并添加到15mL管中。用HBSS-/-将含有胰岛细胞的15mL锥形管中的每个的体积调节到15mL，并且在1000rpm下离心5分钟。然后去除上清液，并且将细胞与250μL 1X PEG-SH一起温育1分钟，1分钟后，用HBSS-/-将每个15mL锥形管的体积调节到15mL，并且在1000rpm下离心1分钟。然后用1mL细胞培养基冲洗包括保形包衣的胰岛细胞的细胞沉淀物三次，并且通过每次在1,000rpm下离心1分钟来沉淀。然后将冲洗过的保形地包衣的胰岛细胞置于10cm培养皿中的10mL细胞培养基中。
细胞活力和功能的比较：
先前方法对细胞活力和功能的影响
使用于2017年4月4日提交的美国专利申请第15/478320号、美国专利申请第14/114,690号、国际专利申请第PCT/US2012/035696号和美国临时专利申请第61/480,513号中阐述的保形包衣方法，所述文献中的每个文献的公开内容明确通过引用的方式并入本文，在低pH下，用PEG和两亲性自组装肽保形包衣的非人灵长类动物(NHP)胰岛(如图2，小图A所示)对静态(GSIS)和动态(灌流)葡萄糖刺激的体外胰岛素分泌应答较差(图2，小图B和C)。CC NHP胰岛的绝对胰岛素分泌和刺激指数低于裸胰岛。一致地，在NSG小鼠的脂肪垫或肾囊中移植后，CC NHP胰岛不能逆转糖尿病(如图2，小图D所示)，尽管在所有受体小鼠中都发现了可检测的人C肽(图2，小图E)。进一步的比较研究表明，胰岛细胞活力随着pH的降低而降低，如图3所示。
先前方法对大型动物生物相容性的影响
在糖尿病NHP中，证明了使用生物支架在网膜袋中腹腔镜植入CC NHP胰岛(图4，小图A)，使用边缘剂量(5k IEQ/kg)的完全同种异体CC NHP胰岛和无类固醇免疫抑制。尽管如此，在移植CC NHP胰岛后，仅观察到CC NHP岛的最小功能，即胰岛素需求和可检测的C肽的减少(图4，小图B)。移植后21天移植的移植物的组织学检查显示，移植物中存在胰岛素阳性的CC NHP胰岛，并且没有T细胞浸润(图4，小图D)。然而，使用先前的“低pH”方法生产的PEG/PEG-SH/肽在网膜袋中的生物相容性较差。病理检查显示广泛、慢性、活跃的严重炎症反应，其特征在于大量多核巨细胞和纤维增生(图4，小图C)。
新保形包衣方法的测试：提高细胞活力和功能
本文所阐述的保形包衣方法(i)通过消除粘度增强剂组分提高包衣的生物相容性，并且获得纯PEG包衣，以及(ii)允许在中性pH下进行包衣，以最大化包衣的胰岛(包含NHP胰岛)的活力和功能。与现有申请中所阐述的方法的不同之处在于，包含增加水相的粘度，尤其可以包含待包衣的胰岛细胞，通过最小交联20％的PEG-MAL-PEG-SH交联剂的可交联臂，实现了在油相中喷射水相以形成保形包衣所需的粘度。在本文公开的方法中，PEG-MAL在胰岛周围的完全凝胶化发生在射流破碎的下游，其中通过使二硫苏糖醇(DTT)溶液在聚丙二醇和Span80表面活性剂中的乳液与水相同轴流动而形成胶囊，但在发生喷射水相破碎的装置部分的下游。
在人和NHP胰岛两者上测试了重新设计以允许CC具有纯PEG(以提高生物相容性)和生理pH(以提高NHP胰岛功能)的包衣方法，这表明NHP和人胰岛的两者的体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定性能均有所提高。结果如图5所示，其中人胰岛用本文公开的方法有效地包衣(图5，小图A)是可行的(图5，小图B)，并且显示出体外(图5，小图C-F)和体内(图5，小图G-I)功能相当且通常高于裸胰岛。使用此方法，与裸胰岛相比，CC胰岛的绝对胰岛素分泌没有减少，糖尿病动物的葡萄糖耐量得到改善。
保形地包衣的人胰岛细胞在生理pH下在NHP胰岛中的移植
使用本文所阐述的方法将CC人胰岛移植到伴有共刺激阻断的糖尿病NHP胰岛的网膜囊中。在手术后天数(POD)-1天、0天、3天、7天、14天、21天和28天以及之后每周施用
Figure BDA0003958240340000471
(20mg/kg IV)，并且在POD-1天、0天、3天、7天、14天、21天和28天以及此后每10天施用抗CD154(20mg/kg IV)。在POD 0天时，使用剖腹程序，动物在网膜囊中接受20,358胰岛当量(IEQ)/kg。在POD 55天进行选择性尸检。评估了剖腹程序在糖尿病食蟹猴网膜囊中植入CC NHP胰岛的可行性(图6，小图A)。CC NHP胰岛受体的外源性胰岛素需求(EIR，实线)、血糖(点)、c肽表明，移植的CC人胰岛的最小功能随着血糖水平的降低而降低(图6，小图B和C)。评估了移植的CC NHP移植物和移植物血运重建的组织学评估(图6，小图D和E)。
将同基因Lewis大鼠胰岛移植到糖尿病免疫活性Lewis大鼠网膜中
通过链脲佐菌素(streptozotocin)注射使Lewis大鼠出现糖尿病(血糖>250mg/dL)。将2,500个裸或保形包衣的Lewis大鼠胰岛移植到糖尿病Lewis大鼠的网膜袋中。通过直到手术后天数(POD)36天的血糖测量和在POD 30天时的腹膜内葡萄糖耐量测试监测糖尿病。小图A：评估裸和保形包衣的Lewis大鼠胰岛受体的血糖(图7，小图A)。手术后天数(POD)30天，对裸和保形包衣的Lewis大鼠胰岛受体的腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)和IPGTT曲线下面积进行了评估(图7，小图B和C)。还分析了裸(实线，点标记)和保形包衣的(虚线，正方形标记)Lewis大鼠胰岛受体在IPGTT期间空腹和刺激C肽(图7，小图D)。
同种异体MIN6胰岛素瘤细胞簇移植到自发性糖尿病NOD小鼠体内的体内影响通过悬浮培养4天将MIN6细胞聚集成簇，然后保形包衣。将血糖>250mg/dL时自发地发展为糖尿病的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠以4,000IEQ/小鼠剂量移植裸鼠或保形包衣的(CC)MIN6簇。通过评估小鼠死亡率，通过测量裸和CC受体小鼠血液中的c肽水平以及通过移植物组织学评估来监测移植物功能和存活率。图8，小图A示出了裸和保形包衣的MIN6簇的相位对比图像。图8，小图B示出了具有抗PEG染色和相邻正交投影的保形包衣的MIN6簇的共聚焦显微照片，示出了三维胶囊完整性。评估了裸和保形包衣的MIN6簇受体的死亡率，显示CC簇存活率提高(图8，小图C)。(小图D)评估了裸和保形包衣的MIN6簇受体的随机、非空腹C肽水平(图8，小图D)。评估了移植的CC MIN6簇移植物的组织学评估和CC胶囊内细胞簇的存活情况(图8，小图E)。
猪糖尿病模型中保形包衣的胰岛的自体移植物评估
在90％胰切除术和胰岛分离(通过标准程序进行)前4周至8周，在约八周大的约克郡长白猪(Yorkshire-Landrace pig)的深皮下空间中植入2个至4个Cell Pouch(8塞或10塞)(安大略省伦敦的Sernova公司(Sernova Corp,London Ontario))。为了确保严格的高血糖状态，猪可以在胰切除术后静脉内注射150mg/kg链脲佐菌素。对分离的胰岛进行保形包衣处理，然后测试释放标准。在确认保形包衣的胰岛已通过释放标准后，胰岛在分离后约五天被移植到预血管化的Cell Pouch室中，从而从胰切除术中恢复并确认糖尿病状态。通过每两周的血糖和体重测量以及每月的静脉葡萄糖耐量测试(IVGTT)来评估移植物功能。测量C肽的空腹和IVGTT血液值，并且与移植前对照进行比较。在研究结束时，通过标准组织学过程移植和制备Cell Pouch，以评估胰岛的胰岛素染色、Cell Pouch室中的微血管发展和胰岛细胞活力。Cell Pouch移植后，采取上述有效措施以确认血糖控制丧失。可以评估葡萄糖消失率、血糖曲线下面积和C肽水平。
同种异体移植物猪糖尿病模型中保形包衣的供体胰岛的评估
在接受胰岛同种异体移植物前六周至八周，在约一岁的雌性小型哥廷根猪(Gottingen pig)的深皮下空间中植入两个(8塞或10塞)Cell PouchTM(安大略省伦敦的Sernova公司)。供体胰岛是通过标准程序从2岁以上的约克郡长白猪中获得和分离的。对分离的胰岛进行保形包衣处理，并且确认通过释放标准。移植前一周到三周，通过对动物静脉内给药150mg/kg链脲佐菌素化学诱导糖尿病。为了确保严格的高血糖状态，在保形胰岛移植前进行糖尿病静脉葡萄糖耐量测试(IVGTT)。在外科手术暴露Cell Pouch和按顺序去除塞后，将范围为2,500IEQ/kg至10,000IEQ/kg的同种异体保形包衣的胰岛移植到受体小型猪的预血管化的皮下Cell PouchTM中。通过每两周的血糖和体重测量以及每月的静脉葡萄糖耐量测试(IVGTT)来评估移植物功能。测量C肽的空腹和IVGTT血液值，并且与移植前对照进行比较。在研究结束时，通过标准组织学过程移植和制备Cell Pouch，以评估胰岛和其它在血糖控制中重要的激素(即胰高血糖素、生长抑素)的胰岛素染色，以及Cell Pouch室内的微血管发展。Cell Pouch移植后，采取上述措施以确认血糖控制丧失。还可以测量葡萄糖消失率、血糖曲线下面积和C肽水平。
异种移植物猪糖尿病模型中保形包衣的人葡萄糖响应性干细胞源性胰岛的评估
在接受葡萄糖响应性保形包衣的人干细胞源性技术(iPSC或ESC)前六周至八周，在约一岁的雌性小型哥廷根猪的深皮下空间中植入两个(8塞或10塞)Cell PouchTM(安大略省伦敦的Sernova公司)。在细胞移植之前，制备干细胞源性胰岛素产生细胞或细胞簇，并且进行保形包衣过程，然后确认细胞符合标准释放标准。在保形包衣的干细胞源性移植前一周到三周，通过静脉内给药150mg/kg链脲佐菌素化学诱导糖尿病。为了确保严格的高血糖状态，在保形干细胞源性细胞移植前进行糖尿病静脉葡萄糖耐量测试(IVGTT)。在外科手术暴露Cell Pouch室和按顺序去除塞后，将范围为2,500IEQ/kg至10,000IEQ/kg(或当量)的同种异体保形包衣的胰岛或胰岛簇移植到受体小型猪的预血管化的皮下Cell PouchTM室中。通过每两周的血糖和体重测量以及每月的静脉葡萄糖耐量测试(IVGTT)来评估移植物功能。测量C肽的空腹和IVGTT血液值，并且与移植前对照进行比较。在研究结束时，通过标准组织学过程移植和制备Cell Pouch，以评估胰岛和其它在血糖控制中重要的激素(即胰高血糖素、生长抑素)的胰岛素染色和Cell Pouch室内的微血管发展，以及确认人干细胞源性存活。Cell Pouch移植后，采取上述措施以确认血糖控制丧失。在此异种移植物糖尿病模型中也可以使用保形包衣的人糖尿病异种移植物模型来测量葡萄糖消失率、血糖曲线下面积和C肽水平，以保护保形包衣的人干细胞技术免受免疫系统攻击。
同基因小鼠糖尿病模型中保形包衣的供体胰岛的评估
在细胞移植前四周至五周，为了诱导新血管形成，将单室小型CP(安大略省伦敦的Sernova公司)皮下植入约25g雄性BALB/c小鼠的腹部下象限。简而言之，为了放置CP，制造一个小的横向切口，以便在切口线下方形成一个小袋。一旦产生了足够的空间，就将CP植入所述空间，使开口位于顶部位置。用外科用缝合钉闭合切口(Autoclip；马里兰州斯帕克斯的碧迪公司(Becton Dickinson,Sparks,MD))。从8周至12周龄的雄性BALB/c小鼠中分离胰岛。动物被安置在传统条件下，可以随意获得食物和水。在胰切除术前，用27-G的针对总胆管进行插管，用0.125mg/mL汉克氏平衡盐溶液中的冷Liberase TL研究级酶扩张胰腺。通过将胰腺放入50-mL Falcon管中消化(置于37℃水浴中轻轻摇晃14分钟)来分离胰岛。在消化阶段之后，使用不透组织密度梯度离心(1.108g/mL、1.083g/mL和1.069g/mL)从胰腺消化物中纯化胰岛。分离胰岛后，对其进行保形包衣处理以准备移植到Cell Pouch中，并且确认通过释放标准。
移植前三天至5天，植入CP的小鼠通过用腹膜内链脲佐菌素(185mg/kg，在醋酸磷酸盐缓冲剂中，pH 4.5)化学诱导而成为糖尿病小鼠。当动物的血糖水平连续2次超过15mmol/L时，其被认为患有糖尿病。
使用微量注射器将纯度为90％±5％的完整胰岛质量(每只糖尿病受体小鼠500个保形包衣的胰岛±10％)或边缘质量(每只糖尿病受体小鼠200个保形包衣的胰岛±10％)吸入聚乙烯-50管中，并且离心成适合移植的沉淀物。
可以进行剂量研究以检查移植到CP中时完整胰岛剂量(500个保形包衣的胰岛)逆转糖尿病的功效，以及移植到CP的边缘胰岛质量研究(200个保形包衣的胰岛)。
为了将胰岛移植到CP中，需要在皮肤上制造一个小切口，以便使装置的顶部获得入口。随后去除塞，露出血管化的组织腔，胰岛制剂注入其中。通过用4-0vicryl缝合线将CP顶部的2层缝合来闭合CP。随后用外科缝合钉(Autoclip；碧迪公司)闭合皮肤切口。
每周两次通过非空腹血糖测量(mmol/L)评估受体的胰岛移植物功能，在所有组中进行便携式血糖仪测试。移植物功能和糖尿病逆转被定义为连续2次读数小于11.1mmol/L，并且维持到研究完成。另外，在移植后100天内对正常血糖小鼠进行糖耐量测试以进一步评估代谢能力。受体在接受腹膜内葡萄糖团注(3g/kg)之前空腹过夜。在注射后的基线(时间0)、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟监测血糖水平，以便计算和分析移植组之间的曲线下面积(AUC血糖)。
为了证实移植物依赖性正常血糖，具有功能性移植物的动物通过去除CP进行胰岛移植。CP移植通过小皮肤切口进行。CP的腹侧表面与真皮分离，同时维持周围新生血管组织的完整性。解剖胰岛移植装置的背侧，以便将其完全取出。将移植后的CP置于10％缓冲福尔马林中进行组织学分析，并且监测动物的高血糖。
免疫组织化学用于使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin)鉴定总体结构细节，内皮细胞用于使用抗血管性血友病因子(anti-von Willebrand Factor)抗体、抗胰岛素和抗胰高血糖素抗体评估血管形成，以鉴定CP内胰岛的存在。移植后，CP组织立即在10％缓冲福尔马林中固定48小时，然后在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，最后在70％乙醇中洗涤。解剖组织，包埋在石蜡中，切片厚度为5μm。代表性组织切片用苏木精-伊红染色。另外，使用免疫荧光对组织切片进行染色。将切片脱蜡并用抗原热回收(Target Retrival Solution，丹科公司(Dako))处理，然后用补充有吐温-20(TBS-T)的三缓冲盐水(TBS)洗涤。使用TBS-T中的10％山羊血清在室温下封闭切片1小时。切片用稀释的1:100(TBS与1％山羊血清)兔抗血管性血友病因子(Millipore AB7356)、稀释的1:1000(TBS与1％山羊血清)豚鼠抗胰岛素(DakoA0564)或稀释的1:100(TBS与1％山羊血清)兔抗胰高血糖素(AbD Serotec AHP534)的初级抗体在4℃下处理15小时。用TBS-T洗涤切片，然后在室温下用稀释的1:1000(TBS-T与1％山羊血清)山羊抗兔(Molecular Probes A-11034；Alexa Fluor 488)或稀释的1:1000(TBS-T与1％山羊血清)的山羊抗豚鼠(Molecular Probes A-11075；Alexa Fluor 568)组成的二级抗体处理1小时。样品用TBS-T洗涤，用DAPI(1:1000)复染。为了降低自身荧光背景，用0.3％苏丹黑(sudan black)(于70％乙醇中)处理切片2分钟，用TBS洗涤并用防褪色封固剂盖片。显微镜和图像分析使用Aperio-Scan Scope Console(用于光学显微镜)和ZeissAxio Imager Z1(用于荧光显微镜)或等效装置完成。
在同基因大鼠模型中，将保形包衣的胰岛移植到皮下植入的预血管化的装置(Cell PouchTM)中以逆转糖尿病的评估
雄性Lewis大鼠(250g)作为胰岛供体，并且雌性Lewis大鼠(至多200g)用作移植受体。根据Sernova公司的规范，将Cell Pouch((1塞或2塞)安大略省伦敦的Sernova公司)植入Lewis大鼠腹侧皮下，并且放置至少4周，以形成适合细胞移植的血管化组织腔。植入后4周，通过施用链脲佐菌素在受体大鼠中诱导糖尿病。从尾部穿刺(OneTouch Ultra血糖仪)获得的血样中两个非空腹血糖值>300mg/dL的大鼠被视为患有糖尿病。通过酶消化分离供体Lewis大鼠的胰岛，然后使用标准方案在密度梯度上纯化。Lewis大鼠胰岛然后被保形地包衣。包衣后约四天，将裸或保形包衣的Lewis大鼠分离的胰岛移植到血管化的Cell Pouch中。为了移植胰岛，通过外科手术暴露Cell Pouch，并且去除塞以暴露血管化的组织空隙空间，使用微型移液管将保形包衣的或裸胰岛移植到Cell Pouch室中，每个糖尿病受体的剂量约为3000IEQ至5000IEQ。预计将评估不同组中的若干种剂量。胰岛受体大鼠的血糖每周至少监测三次，方法是用便携式血糖仪进行尾部穿刺。移植物功能将定义为非空腹BG<200mg/dL以及通过标准技术测量的阳性大鼠C肽。在移植后的选定时间点，对胰岛受体大鼠进行糖耐量测试，以评估移植物功效。过夜空腹后，口服(口服葡萄糖耐量测试[OGTT]；2.5g/kg)或静脉内(静脉葡萄糖耐量测试[IVGTT]；0.5g/kg)施用葡萄糖团注。监测血糖值并计算葡萄糖曲线下面积(AUC)。在施用葡萄糖团注之前(t＝0分钟)和施用后30分钟采集大鼠血样，并且评估空腹和刺激的c肽。在60天与300天之间的不同剂量组中以一定的间隔取回移植的Cell Pouch，以证实建立葡萄糖控制的功效。使用标准组织学技术对移植的胰岛进行组织学分析，以对C-肽、胰岛素、胰高血糖素等进行染色，并且评估细胞活力以及其它量度，从而处理移植的Cell Pouch。比较Cell Pouch内裸胰岛和保形包衣的胰岛的功效以评估保形包衣的胰岛保护胰岛免受免疫系统攻击的效果。通过Cell Pouch中的保形包衣的胰岛在移植后逆转糖尿病(BG<200mg/dL)的能力以及用可检测的c肽维持移植物功能的能力，以及同基因糖尿病受体大鼠的阳性葡萄糖耐量(GTT期间的AUC)来衡量功效。另外，通过组织学分析鉴定存活的激素产生移植物，以证实保形包衣的细胞与移植到Cell Pouch中的裸细胞的胰岛存活。
在同种异体移植物大鼠糖尿病模型中，将保形包衣的胰岛移植到皮下植入的预血管化的装置(Cell PouchTM)中以逆转糖尿病的评估糖尿病
Lewis雌性大鼠(至多200g)被用作胰岛受体。购买Wistar Furth(WF)(RT1u)雄性大鼠(250g)作为胰岛供体。根据Sernova公司的规范，将Cell Pouch((1塞或2塞)安大略省伦敦的Sernova公司)植入Lewis雌性大鼠腹侧皮下，并且放置至少4周，以形成适合细胞移植的血管化组织腔。植入后4周，通过施用链脲佐菌素在受体大鼠中诱导糖尿病。从尾部穿刺(OneTouch Ultra血糖仪)获得的血样中两个非空腹血糖值>300mg/dL的大鼠被视为患有糖尿病。通过酶消化分离供体Wistar Furth(WF)(RT1u)雄性大鼠的胰岛，然后使用标准方案在密度梯度上纯化。然后将这些Wistar Furth大鼠胰岛保形地包衣。包衣后约四天，将裸或保形包衣的Wistar大鼠分离的胰岛移植到血管化的Cell Pouch中。为了移植胰岛，通过外科手术暴露Cell Pouch，并且去除塞以暴露血管化的组织空隙空间，使用微型移液管将保形包衣的或裸胰岛移植到Cell Pouch室中，每个糖尿病受体的剂量约为3000IEQ至5000IEQ。预计将评估不同组中的若干种剂量。胰岛受体大鼠的血糖每周至少监测三次，方法是用便携式血糖仪进行尾部穿刺。移植物功能将定义为非空腹BG<200mg/dL以及通过标准技术测量的阳性大鼠C肽。在移植后的选定时间点，对胰岛受体大鼠进行糖耐量测试，以评估移植物功效。过夜空腹后，口服(口服葡萄糖耐量测试[OGTT]；2.5g/kg)或静脉内(静脉葡萄糖耐量测试[IVGTT]；0.5g/kg)施用葡萄糖团注。监测血糖值并计算葡萄糖曲线下面积(AUC)。在施用葡萄糖团注之前(t＝0分钟)和施用后30分钟采集大鼠血样，并且评估空腹和刺激的c肽。在60天与300天之间的不同剂量组中以一定的间隔取回移植的Cell Pouch，以证实建立葡萄糖控制的功效。使用标准组织学技术对移植的胰岛进行组织学分析，以对C-肽、胰岛素、胰高血糖素等进行染色，并且评估细胞活力以及其它量度，从而处理移植的Cell Pouch。比较Cell Pouch内裸胰岛和保形包衣的胰岛的功效以评估保形包衣的胰岛保护胰岛免受免疫系统攻击的效果。通过Cell Pouch中的保形包衣的胰岛在移植后逆转糖尿病(BG<200mg/dL)的能力以及用可检测的C肽维持移植物功能的能力，以及相对于裸胰岛的糖尿病受体大鼠的阳性葡萄糖耐量(GTT期间的AUC)来衡量功效。在同种异体胰岛移植的情况下，移植物排斥被简单地定义为恢复到非空腹高血糖状态，这在裸胰岛中相对于保形包衣的胰岛组是预期的。另外，通过组织学分析鉴定存活的激素产生移植物，以证实在此测试保形包衣的免疫保护能力的同种异体移植物实验模型中，保形包衣的细胞与移植到CellPouch中的裸细胞的胰岛存活。
在异种移植物大鼠糖尿病模型中，将保形包衣的人干细胞源性胰岛移植到皮下植入的预血管化的装置(Cell PouchTM)中以逆转糖尿病的评估糖尿病
Lewis雌性大鼠(至多200g)被用作胰岛受体。通过分化方案生成人干细胞源性胰岛簇(iPSC或ESC)，以产生胰岛素产生细胞，用于移植到此异种移植物模型中的Cell Pouch中。根据Sernova公司的规范，将Cell Pouch((1塞或2塞)安大略省伦敦的Sernova公司)植入Lewis雌性大鼠腹侧皮下，并且放置至少4周，以形成适合细胞移植的血管化组织腔。植入后4周，通过施用链脲佐菌素在受体大鼠中诱导糖尿病。从尾部穿刺(OneTouch Ultra血糖仪)获得的血样中两个非空腹血糖值>300mg/dL的大鼠被视为患有糖尿病。人干细胞源性胰岛簇是使用标准方案生产的。然后将干细胞源性人胰岛簇保形地包衣。包衣后约四天，将裸或保形包衣的干细胞源性簇移植到血管化的Cell Pouch中。为了移植胰岛，通过外科手术暴露Cell Pouch，并且去除塞以暴露血管化的组织空隙空间，使用微型移液管将保形包衣的或裸胰岛移植到Cell Pouch室中，每个糖尿病受体的剂量约为3000IEQ至5000IEQ(或当量)。预计将评估不同组中干细胞源性胰岛簇的若干种剂量。胰岛受体大鼠的血糖每周至少监测三次，方法是用便携式血糖仪进行尾部穿刺。移植物功能将定义为非空腹BG<200mg/dL以及通过标准技术测量的阳性大鼠C肽。在移植后的选定时间点，对胰岛受体大鼠进行糖耐量测试，以评估移植物功效。过夜空腹后，口服(口服葡萄糖耐量测试[OGTT]；2.5g/kg)或静脉内(静脉葡萄糖耐量测试[IVGTT]；0.5g/kg)施用葡萄糖团注。监测血糖值并计算葡萄糖曲线下面积(AUC)。在施用葡萄糖团注之前(t＝0分钟)和施用后30分钟采集大鼠血样，并且评估空腹和刺激的c肽。在60天与300天之间的不同剂量组中以一定的间隔取回移植的CellPouch，以证实建立葡萄糖控制的功效。使用标准组织学技术对移植的胰岛进行组织学分析，以对C-肽、胰岛素、胰高血糖素等进行染色，并且评估细胞活力以及其它量度，从而处理移植的Cell Pouch。比较Cell Pouch内裸胰岛和保形包衣的胰岛的异种移植物功效以评估保形包衣的胰岛保护胰岛免受免疫系统攻击的效果。通过Cell Pouch中的保形包衣的胰岛在移植后逆转糖尿病(BG<200mg/dL)的能力以及用可检测的C肽维持移植物功能的能力，以及相对于裸胰岛的糖尿病受体大鼠的阳性葡萄糖耐量(GTT期间的AUC)来衡量功效。在异种干细胞胰岛簇移植的情况下，移植物排斥被简单地定义为恢复到非空腹高血糖状态，这在裸胰岛中相对于保形包衣的胰岛组是预期的。另外，通过组织学分析鉴定存活的激素产生移植物，以证实在此使用人干细胞源性胰岛素产生簇测试保形包衣的免疫保护能力的异种移植物实验模型中，保形包衣的细胞与移植到Cell Pouch中的裸细胞的胰岛存活。
保形包衣的细胞用于另外的细胞类型和临床适应症的评估
使用上述实例，应注意可以评估适合不同临床适应症的细胞(供体细胞、干细胞源性技术)以治疗异种移植物、同种异体移植物和异种动物模型的疾病。所使用的动物模型可以在科学文献中找到，并且可以在确定用于测试特定细胞类型和临床适应症的功效度量中找到。
带编号的实施例
以下带编号的段落中阐述了本公开的特定实施例：
1.一种用包衣材料保形地包衣生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将水相注入包衣装置中的同轴油相内，所述包衣装置被配置成允许所述水相在所述油相中从滴落到喷射的转变和流动伸长；
(b)将所述生物材料和所述包衣材料添加到所述水相中，其中所述包衣材料的聚合发生在所述水相射流破碎成颗粒的下游，导致所述生物材料与所述包衣材料的保形包衣；
(c)在所述水相射流破碎成颗粒的下游添加所述包衣材料的组分，其中所述组分是促进/催化所述包衣材料聚合的胶凝乳液；
(d)任选地收集所述包衣装置的流出物；
(e)任选地从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料；以及
(f)任选地将所述保形地包衣的生物材料与所述无生物材料的包衣材料分离。
2.根据段落1所述的方法，其中所述生物材料包括细胞、细胞簇、生物材料包衣的细胞或细胞簇、亚细胞器、生物分子和非生物药物中的一种或多种。
3.根据段落2所述的方法，其中所述生物材料包括细胞或细胞簇。
4.根据段落3所述的方法，其中所述生物材料包括胰岛细胞。
5.根据段落1至3中任一项所述的方法，其中所述包衣材料选自由以下中的一种或多种组成的组：聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙基噁唑啉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙基噁唑啉(PEOX)和聚(氨基酸)。
6.根据段落5所述的方法，其中所述包衣材料是聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯、PEG-乙烯基砜或其经修饰的衍生物中的一种或多种。
7.根据段落6所述的方法，其中所述包衣材料是5％至10％的PEG。
8.根据段落1至7中任一项所述的方法，其中所述水相包括：
(a)pH 6至7.4的无血清培养基；或
(b)pH 6至7.4的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)。
9.根据段落8所述的方法，其中所述水相包括500个胰岛细胞或细胞簇/mL至750,000个胰岛细胞或细胞簇/mL。
10.根据段落9所述的方法，其中所述水相包括约2,500个胰岛细胞或细胞簇/mL至250,000个胰岛细胞或细胞簇/mL。
11.根据段落1至10中任一项所述的方法，其中所述水相任选地包括一种或多种硫醇化或还原试剂和/或表面活性剂。
12.根据段落11所述的方法，其中所述表面活性剂是聚氧乙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物或聚(乙二醇-嵌-硫化丙烯)。
13.根据段落12所述的方法，其中所述表面活性剂是2％的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
14.根据段落11所述的方法，其中所述硫醇化或还原试剂是二硫苏糖醇(DTT)或PEG二硫醇。
15.根据段落14所述的方法，其中所述硫醇化或还原试剂是0.01％至0.62％的二硫苏糖醇(DTT)。
16.根据段落1至15中任一项所述的方法，其中所述油相包括聚丙二醇(PPG)。
17.根据段落16所述的方法，其中所述油相包括具有10％脱水山梨糖醇单油酸酯的聚丙二醇(PPG)，其中所述油相任选地包括三乙醇胺。
18.根据段落17所述的方法，其中所述油相包括0％至0.2％的三乙醇胺。
19.一种通过根据段落1至18中任一项所述的方法保形地包衣的生物材料。
20.一种治疗患者的病症的方法，其包括将根据段落19所述的保形地包衣的生物材料植入所述患者体内的步骤。
21.根据段落20所述的方法，其中所述病症是糖尿病，并且所述保形地包衣的生物材料包括胰岛细胞和细胞簇。
22.根据段落11所述的方法，其中所述水相是与PEG二硫醇最小交联(5％至50％)的多臂聚乙二醇(PEG)。
23.根据段落1至18、21或22中任一项所述的方法，其中在所述水相射流破碎成颗粒的下游添加的所述胶凝乳液是溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并且用10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化。
24.根据段落1至18和21至23中任一项所述的方法，其中通过在搅拌的同时将来自所述包衣产物的所述产物倒入矿物油中，从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料。
25.根据段落24所述的方法，其中在搅拌的同时用所述矿物油纯化期间，在继续搅拌所述胶凝乳液的同时添加汉克氏平衡盐溶液(HBSS)，所述胶凝乳液包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中的二硫苏糖醇(DTT)溶液，并且用矿物油中的10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化。
26.根据段落25所述的方法，其中在用所述矿物油和汉克氏平衡盐溶液(HBSS)纯化后，将所述产物离心并用HBSS洗涤。
27.根据段落26所述的方法，其中用汉克氏平衡盐溶液(HBSS)纯化和洗涤后，将所述产物与PEG二硫醇溶液一起温育。
28.一种保形包衣装置，其包括：
封装室，所述封装室由图1A，小图(ii)、(iii)和(iv)中所展示的三个部件组装形成；
导管，所述导管与精密流动注射泵连接，被配置成将包衣材料和待包衣的所述生物材料注入所述封装室(内部相)上的第一入口，其中此水相的包括处于或介于6至7.4之间的pH水平；
第一蠕动泵，所述第一蠕动泵被配置成将含有表面活性剂的油相注入所述封装室上的第二入口，其中所述油相(外部相)的注入被配置成与所述内部水相同轴地流动；
毛细管，所述毛细管联接到所述封装室的一端，其中所述毛细管位于所述内部水相流在所述外部油相(双相流体)内伸长的点的下游，使得所述双相流体被配置成从所述封装室流入所述毛细管，并且其中所述内部水相(含有所述包衣材料和待包衣的所述生物材料)和所述外部油相被配置成同轴地流过所述毛细管；以及
第二蠕动泵，所述第二蠕动泵被配置成将胶凝乳液同轴地注入所述毛细管，其中所述乳液包括用于所述包衣材料的聚合的催化剂，其中所述乳液被配置成与所述包衣材料和待包衣的所述生物材料同轴地接触。
仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或者能够确定本文所描述的本发明的具体实施例的许多等效物。本文所描述的本发明实施例的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求中所阐述的。本领域普通技术人员将了解，在不背离如所附权利要求所限定的本发明的精神或范围的情况下，可以对该描述作出各种修改和改变。

Claims (36)

1.一种用包衣材料保形地包衣生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将水相注入包衣装置中的同轴油相内，所述包衣装置被配置成允许所述水相在所述油相中从滴落到喷射的转变和流动伸长；
(b)将所述生物材料和所述包衣材料添加到所述水相中，其中所述步骤(b)的所述包衣材料不包括粘度增强剂；并且其中所述水相的pH为约6至约7.4。
(c)允许所述水相射流破碎成颗粒；以及
(d)在所述水相射流破碎成颗粒的下游添加所述包衣材料的组分，其中所述组分是促进或催化所述包衣材料的聚合的胶凝乳液；从而得到保形地包衣的生物材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括收集所述包衣装置的流出物的步骤。
3.根据权利要求1至2所述的方法，其进一步包括从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和无生物材料的包衣材料的步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其进一步包括将所述保形地包衣的生物材料与所述无生物材料的包衣材料分离的步骤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物材料包括细胞、细胞簇、生物材料包衣的细胞或细胞簇、亚细胞器、生物分子、非生物药物或其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物材料包括细胞或细胞簇。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述生物材料包括胰岛细胞或细胞簇。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述包衣材料包括药剂，所述药剂选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙基噁唑啉、聚乙烯醇(PVA)、聚乙基噁唑啉(PEOX)、聚(氨基酸)、其衍生物以及其组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述包衣材料包括药剂，所述药剂选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、PEG-马来酰亚胺、PEG-丙烯酸酯和PEG-乙烯基砜。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述包衣材料包括5％至10％的PEG。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述包衣材料包括与PEG二硫醇最小交联(1％至30％)的多臂聚乙二醇(PEG)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述水相包括：
(a)pH 6至7.4的无血清培养基；或
(b)pH 6至7.4的汉克氏平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt Solution，HBSS)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述水相包括约200,000,000个胰岛细胞/mL。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述水相包括约100,000个细胞簇/mL。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述水相包括硫醇化试剂、还原试剂、表面活性剂或其组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述表面活性剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或聚(乙二醇-嵌-硫化丙烯)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述表面活性剂是2％的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述还原试剂是二硫苏糖醇(DTT)或PEG二硫醇。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述还原试剂是0.01％至0.62％的二硫苏糖醇(DTT)。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述胶凝乳液包括溶解在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中并且用10％脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)在聚丙二醇(PPG)中乳化的二硫苏糖醇(DTT)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述油相包括聚丙二醇(PPG)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述油相包括聚丙二醇(PPG)和10％脱水山梨糖醇单油酸酯以及任选的三乙醇胺。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述油相包括0％至0.2％的三乙醇胺。
24.根据权利要求3至23中任一项所述的方法，其中从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和所述无生物材料的包衣材料包括步骤(e)：将来自步骤(d)的产物倒入矿物油中，同时搅拌所得混合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中从所述油相中纯化所述保形地包衣的生物材料和所述无生物材料的包衣材料包括步骤(f)：将汉克氏平衡盐溶液(HBSS)添加到步骤(e)中得到的产物中。
26.根据权利要求25所述的方法，其中将步骤(f)的产物离心并用HBSS洗涤。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在离心和用汉克氏平衡盐溶液(HBSS)洗涤后，将所述包衣的生物材料与PEG二硫醇溶液一起温育。
28.一种通过根据权利要求1至27中任一项所述的方法保形地包衣的生物材料。
29.一种治疗患者的病症的方法，所述方法包括将根据权利要求28所述的保形地包衣的生物材料植入所述患者体内的步骤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述病症是糖尿病。
31.一种保形包衣装置，其包括：
(1)封装室，所述封装室包括：
(a)外壳部分，所述外壳部分通过所述外壳部分的第一端处的第一入口联接到导管并与第一泵连接；
(b)连接部分，所述连接部分包括被配置成与所述外壳部分的第二端的内表面接合的第一端；以及
(c)包衣部分，所述包衣部分包括被配置成与所述连接部分的第二端的外表面接合的第一端、被配置成包衣的室、联接到第二泵的第二入口以及所述包衣部分的第二端；
其中与所述第一泵连接的所述导管被配置成将含包衣材料和待包衣的生物材料的水相注入到所述外壳部分的内侧上的所述第一入口，其中所述水相包括处于或介于6至7.4之间的pH水平；并且其中所注入的包衣材料不包括粘度增强剂；
其中所述第二泵被配置成将包括表面活性剂的油相注入到包衣部分的外侧上的第二入口，其中所述油相的注入被配置成与所述内部水相同轴地并且在所述内部水相外部流动；
(2)毛细管，所述毛细管联接到所述包衣部分的所述第二端，其中所述毛细管位于所述水相流与所述外部油相接触并在所述外部油相内伸长以形成双相流体的点的下游，所述双相流体被配置成从所述包衣部分同轴地流过所述毛细管，以及
(3)第三泵，所述第三泵联接到所述毛细管并被配置成将胶凝乳液同轴地注入所述毛细管，其中所述乳液包括用于所述水相中所述包衣材料的聚合的催化剂。
32.根据权利要求31所述的装置，其中所述包衣部分的所述第一端基本上围绕所述连接部分的所述第二端以形成所述室，其中所述水相流与所述油相接触以形成所述双相流体。
33.根据权利要求31或32所述的装置，其中所述室包括锥形开口，所述锥形开口包含出口喷嘴的锥形角，所述出口喷嘴被配置成用于双相流体流动到所述毛细管，并且其中所述第二入口以所述锥形角与所述室联接。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的装置，其中所述第一泵是精密流动注射泵。
35.根据权利要求31至33中任一项所述的装置，其中所述第二泵是第一蠕动泵。
36.根据权利要求31至33中任一项所述的装置，其中所述第三泵是第二蠕动泵。
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