KR20230015880A - 이중특이적 gd2 및 b7h2 결합 분자 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20230015880A
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폴 손델
다니엘 저스틴 게르하르트
Original Assignee
윈 테라퓨틱스, 인크.
인벤라 인코포레이티드
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
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Abstract

2개의 종양 세포 표면 항원, 즉 GD2 및 B7H3에 동시에 결합하는 다중 특이적 항체 구축물이 본원에서 개시된다. GD2 및 B7H3을 표적으로 하는 1가 아암은 각각의 항원에 대해 각각 낮거나 중등도의 친화도를 보인다. 본 명세서에 개시되는 다중 특이적 항체는 항체의 양쪽 아암이 그들의 항원에 결합할 때 표적 종양 세포에 결합하여, GD2 및 B7H3을 발현하는 종양 세포에 대한 항체의 높은 특이성을 나타낸다.

Description

이중특이적 GD2 및 B7H2 결합 분자 및 사용 방법
1. 관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 2월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/979,245호에 기초한 우선권 및 이익을 주장하고, 상기 출원은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
2. 서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함하고, 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다. 2021년 XX월에 생성된 ASCII 사본의 명칭은 XXXXXUS_sequencelisting.txt이고, 크기는 X,XXX,XXX 바이트이다.
3.배경
디시알로강글리오사이드(GD2)는 많은 고형 종양 및 말초 신경계에서 발현된다. 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙을 사용한 치료는 현재 신경모세포종 환자에 대한 표준 치료이다. 그러나, 디누툭시맙은 치료되는 환자에게 극심한 통증을 유발하여 그 효능을 심각하게 제한한다.
분화 클러스터 276(CD276)으로도 알려진 B7 동족체 3(B7H3)은 많은 고형 종양에서 고도로 발현되지만, 신경 세포에서는 발현되지 않는다. B7H3 발현은 인간 환자의 불량한 예후 및 시험관내 모델에서 종양의 침습 및 전이 가능성과 관련이 있다.
GD2 및 B7H3을 발현하는 종양 세포에 대해 높은 특이성을 갖는 암 치료제에 대한 요구가 존재한다.
4. 요약
본 개시내용은 다양한 항체 구축물, 약제학적 조성물, 및 치료 방법을 제공한다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 제1 종양 세포 표면 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위(ABS)를 포함하고 제2 종양 세포 표면 항원에 특이적인 제2 ABS를 추가로 포함하는 다중 특이적 항체 구축물을 제공하며, 여기서 제1 종양 세포 항원은 B7 동족체 3(B7H3)이고, 제2 종양 세포 항원은 디시알로강글리오사이드(GD2)이다.
일부 실시양태에서, 제1 ABS는 10 nM보다 큰 평형 해리 상수(KD)로 인간 B7H3에 결합하고, 제2 ABS는 10 nM보다 큰 KD로 인간 GD2에 결합하고, 항체 구축물은 B7H3 및 GD2를 발현하는 종양 세포에 100 nM 미만의 KD로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 GD2 및 B7H3 모두를 발현하는 세포와 비교하여 GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 세포에 대해 더 낮은 결합을 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 항체 구축물은 대등한 농도에서 디누툭시맙과 비교하여 신경 세포에 덜 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물의 제1 ABS는 제1 중쇄 가변 영역(VH) CDR1, 제1 VH CDR2, 제1 VH CDR3, 제1 경쇄 가변 영역(VL) CDR1, 제1 VL CDR2, 및 제1 VL CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 ABS는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 VH CDR1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 제1 VH CDR2, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 제1 VH CDR3, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 제1 VL CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 제1 VL CDR2, 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 제1 VL CDR3을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제1 ABS는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물의 제2 ABS는 제2 중쇄 가변 영역(VH) CDR1, 제2 VH CDR2, 제2 VH CDR3, 제2 경쇄 가변 영역(VL) CDR1, 제2 VL CDR2, 및 제2 VL CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 ABS는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 제2 VH CDR1, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 제2 VH CDR2, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 갖는 제2 VH CDR3, 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 제2 VL CDR1, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 제2 VL CDR2, 및 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖는 제2 VL CDR3을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제2 ABS는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 포함하고, 도메인 B, 도메인 D 및 도메인 E는 각각 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 포함하고; 제2 폴리펩타이드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 불변 영역 도메인 아미노산 서열 서열을 포함하고; 제3 폴리펩타이드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K는 각각 불변 영역 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩타이드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 불변 영역 아미노산 서열, 또는 이의 일부를 포함하고; 제1 및 제2 폴리펩타이드는 A와 F 도메인 사이의 상호작용 및 B와 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; 제3 및 제4 폴리펩타이드는 H와 L 도메인 사이의 상호작용 및 I와 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; 제1 및 제3 폴리펩타이드는 D와 J 도메인 사이의 상호작용 및 E와 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합된다. 일부 실시양태에서, 도메인 A는 VL 도메인이고; 도메인 B는 CH3 도메인을 포함하고; 도메인 D는 CH2 도메인이고; 도메인 E는 CH3 도메인이고; 도메인 F는 VH 도메인이고; 도메인 G는 CH3 도메인을 포함하고; 도메인 H는 VL 도메인이고; 도메인 I는 CL 도메인이고; 도메인 J는 CH2 도메인이고; 도메인 K는 CH3 도메인이고; 도메인 L은 VH 도메인이고; 도메인 M은 CH1 도메인이다. 일부 실시양태에서, 도메인 D 및 J는 인간 IgG1 CH2 도메인의 아미노산 서열을 갖고; 도메인 I는 인간 C 카파 경쇄의 아미노산 서열을 갖고; 도메인 M은 인간 IgG1 CH1 영역의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 B는 T366K 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 KSC 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고; 도메인 G는 L351D 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 B는 CH3 아미노산 서열 및 KSC 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고; 도메인 G는 CH3 아미노산 서열 및 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 B는 Y349C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고; 도메인 G는 S354C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 B는 P343V 돌연변이, Y349C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고; 도메인 G는 S354C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; 도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1 ABS는 도메인 A 및 F에 의해 형성되고, 제2 ABS는 도메인 H 및 L에 의해 형성된다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 치료제에 접합된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 본원에서 설명되는 다중 특이적 항체 구축물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 개시된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 본원에서 설명되는 항체 구축물을 포함하는 약제학적 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 증식성 질환을 치료하는 방법이 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 신경모세포종, 교모세포종, 소세포 폐암 또는 육종이다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물을 투여하면, 항-GD2 모노클로날 항체를 사용한 치료와 비교하여 통증이 감소된다. 일부 실시양태에서, 항-GD2 모노클로날 항체는 디누툭시맙 또는 hu14.18이다.
또 다른 측면에서, 유효량의 본원에서 설명되는 항체 구축물을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 세포를 선택적으로 표적화하는 방법이 본원에서 개시된다.
5. 도면의 간단한 설명
본 발명의 이들 및 다른 특징, 측면 및 이점은 다음의 설명 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 본원에서 개시되는 항체 구축물의 필요성 및 본원에서 개시되는 항체 구축물에 의해 충족되는 이러한 필요성을 해결하기 위한 접근법을 개략적으로 나타낸 슬라이드이다.
도 2는 본원에서 개시되는 항체 구축물을 생성하는 목적을 제시한다.
도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d는 신경모세포종 및 말초 신경 세포(도 3b) 상의 GD2 항원(도 3a)에 결합하는 항-GD2 항체를 신경모세포종 세포 상의 B7H3 항원(도 3c)에는 결합하지만 신경 세포 상의 상기 항원에는 결합하지 않는(도 3d) 항-GD2 x B7H3 SNIPER™ 항체(INV721)와 비교하는 개략도이다.
도 4는 본 명세서에 개시되는 항체 구축물을 생성하기 위한 프로젝트 워크플로우를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 본원에서 개시되는 항체 구축물에 대한 원하는 항체 의존성 세포독성(ADCC) 기준을 확인한 것이다.
도 6은 2개의 GD2 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 제공한다.
도 7은 GD2 발현 종양 세포에 대한 잠재적인 GD2 결합 분자의 결합을 평가하기 위한 GD2 결합 검정에 대한 프로토콜을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 8은 GD2 및 B7H3을 발현하는 M21 흑색종 세포에 대한 4개의 항-GD2 항체의 결합을 평가하는 검정의 결과를 제공한다.
도 9는 GD2 및 B7H3을 발현하는 M21 및 B78 흑색종 세포에 대한 4개의 항-GD2 항체의 결합을 평가하는 검정의 결과를 제공한다.
도 10은 평가된 B7H3 결합 분자의 수 및 본원에서 개시되는 항체 구축물에 대한 후보로 남은 B7H3 결합 분자의 수를 확인한 것이다.
도 11은 B7H3 발현 종양 세포에 대한 잠재적인 B7H3 결합 분자의 결합을 평가하기 위한 B7H3 결합 검정에 대한 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 12는 GD2 및 B7H3을 발현하는 M21 흑색종 세포 및 B16 세포에 대한 4개의 항-B7H3 항체의 결합을 평가하는 검정의 결과를 제공한다.
도 13은 B16 및 B78 세포에 대한 4개의 항-B7H3 항체 및 3개의 항-GD2 항체의 결합을 평가하는 검정의 결과를 제공한다.
도 14는 평가된 GD2 및 B7H3 결합 분자를 요약한 것이다.
도 15는 M21 흑색종 세포에 대한 6개의 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 및 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙의 결합을 평가하는 검정의 결과를 제공한다.
도 16은 B16 세포에 대한 4개의 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 결합을 평가하는 검정의 결과를 제공한다.
도 17은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보의 결합 연구의 초기 결과를 요약한 것이다.
도 18은 2개의 GD2 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 제공한다.
도 19는 다양한 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 에피토프 비닝(binning)의 결과를 제공한다.
도 20은 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 특징 및 특성을 요약한 것이다.
도 21은 다양한 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 결합을 평가하기 위한 연구를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 22는 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체를 평가하는데 사용하기 위한 크로마토그래피 검정을 제시한다.
도 23은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-01 x GD2-5의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 24는 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-01 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 25는 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-09 x GD2-5의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 26은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-09 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 27은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-10 x GD2-5의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 28은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-10 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 29는 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-19 x GD2-5의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 30은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-19 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 31은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-20 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 32는 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-33 x GD2-5의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 33은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-33 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 34는 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-34 x GD2-5의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 35는 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-34 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 36은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-36 x GD2-5의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 37은 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 I7-36 x GD2-6의 결합 및 크로마토그래피 검정 결과를 도시한 것이다.
도 38은 항체 유도 세포독성(ADCC) 검정에 의한 시험을 위한 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체를 확인한 것이다.
도 39는 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 평가를 요약한 것이다.
도 40은 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 효능을 평가하기 위한 항체 유도 세포독성(ADCC) 검정을 위한 프로토콜을 개략적으로 도시한 것이다.
도 41은 다양한 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 ADCC 검정 결과를 도시한 것이다.
도 42는 다양한 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체의 반복된 ADCC 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 43은 통증을 평가하기 위한 모델 시스템에 대한 프로토콜의 개략도이다.
도 44는 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙으로 치료한 후 통증을 평가하는 파일럿 연구의 결과를 도시한 것이다.
도 45는 디누툭시맙 치료 후 통증을 평가하는 파일럿 연구의 결과를 요약하고, 추가의 연구를 위한 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체를 확인한 것이다.
도 46은 GD2 x B7H3 SNIPER™ 항체에 대한 잠재적 치료 적응증을 확인한 것이다.
도 47은 변형된 GD2 x B7H3 SNIPER™ 항체의 잠재적 용도를 확인한 것이다.
도 48은 후보 GD2 x B7H3 이중특이적 항체를 평가하기 위해 수행된 연구를 요약한 것이다.
도 49는 GD2 및 B7H3을(A), GD2만을(B), 또는 B7H3만을(C) 발현하는 B78 세포에서 다양한 GD2 x B7H3 이중특이적 항체 후보 및 디누툭시맙을 비교하는 결합 검정의 결과를 도시한 것이다. GD2 및 B7H3을 발현하는 B78 종양을 보유하는 마우스의 양전자 방출 단층 촬영(PET) 이미지는 방사성 표지된 GD2 x B7H3 항체 후보(I7-33 x GD2-2)(상단 패널) 또는 방사성 표지된 비특이적 대조군 항체(Bbody)로 처리한 후에 (D)에 제시된다. 방사성 표지된 I7-33 x GD2-2의 생체 분포를 평가하고, 방사성 표지된 디누툭시맙의 생체 분포와 비교하고; 그 결과를 (E)에 제시하였다.
도 50은 항-GD2, 항-B7H3(GD2 x B7H3) 이중특이적 SNIPER™ 항체 INV721을 평가하기 위해 수행된 실험의 개요를 설명한 것이다.
도 51은 본 명세서에서 설명되는 다양한 2가 항체 구축물에 대한 도식적 구조를 각각의 명명 규칙과 함께 제시한다.
도 52a 및 도 52b는 종양 항원 GD2 및 B7H3을 발현하는 B78 세포(도 52a) 및 GD2는 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 B78 세포(도 52b)에서 INV721의 결합 검정 결과를 도시한 것이다.
도 53은 다양한 소아암 세포주에서 종양 세포 표면 항원 GD2 및 B7H3의 상대적인 발현을 나타내는 표이다.
도 54는 다양한 흑색종 세포주에서 종양 세포 표면 항원 GD2 및 B7H3의 상대적인 발현을 나타내는 표이다.
도 55a, 도 55b 및 도 55c는 다양한 소아 신경모세포종 세포주인 CHLA20(도 55a), LAN-1(도 55b) 및 NGP(도 55c)에서 INV721 및 항-GD2 및 항-B7H3 모노클로날 항체의 내재화를 평가하는 연구의 결과를 도시한 것이다. 항체 내재화는 총 적색 물체 통합 강도(total red object integrated intensity)를 증가시킨다.
도 56a 및 56b는 INV721(도 56a)로 처리되거나 또는 INV721 또는 항-GD2 항체 Hu14.18(도 56b)로 별개로 처리된 B78 종양 스페로이드의 항체 유도 세포독성(ADCC) 검정의 결과를 도시한 것이다. INV721 처리 후 밝은 조밀한 신호의 분산은 INV721이 ADCC를 통해 종양 성장을 억제한다는 것을 입증한다.
도 57a, 도 57b, 및 도 57c는 INV721 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)로, INV721 단독으로 또는 PBMC 단독으로 처리된 B78 종양 세포를 평가하는 직접적인 항체 매개 아폽토시스 검정의 결과를 도시한 것이다. 실험은 GD2 및 B7H3을 발현하는 B78 종양 세포(도 57a), GD2는 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 B78 종양 세포(도 57b), B7H3은 발현하지만 GD2는 발현하지 않는 B78 종양 세포(도 57c)에서 수행하였다.
도 58a, 도 58b 및 도 58c는 GD2 및 B7H3을 발현하는 다양한 흑색종 세포주, 즉 M21(도 58a), Mel7(도 58b) 및 Mel13(도 58c)에서 INV721 및 항-GD2 항체 디누툭시맙 및 Hu14.18을 비교하는 ADCC 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 59는 GD2 및 B7H3을 발현하는 M21 세포에서 INV-721, 항-GD2 항체 디누툭시맙 및 GD2-7, 및 항-B7H3 항체 I7-01의 세포독성 효과를 비교하는 ADCC 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 60은 방사성 표지된 INV721 및 디누툭시맙의 결합에 대해 평가된 마우스에서 종양의 국소화 및 GD2/B7H3 발현 상태를 예시하는 카툰 다이어그램이다.
도 61은 GD2 및 B7H3 발현이 다른 4개의 종양을 보유하고 방사성 표지된 항체, 즉 INV721(상단 패널), 비특이적 대조군(중간 패널) 및 디누툭시맙(하단 패널)으로 처리된 마우스의 양전자 방출 단층 촬영(PET) 이미지를 도시한 것이다.
도 62a, 도 62b, 도 62c 및 도 62d는 상이한 GD2 및 B7H3 발현, 즉 GD2-/B7H3+(도 62a), GD2-/B7H3-(도 62b), GD2+/B7H3-(도 62c) 및 GD2+/B7H3+(도 62d)을 보이는 종양에서 종양 1 그램당 투여당 주사되는 방사성 표지된 항체의 활성의 비를 나타내는 그래프이다.
도 63a는 척추를 따라 방사성 표지된 항체의 결합에 대해 평가된 마우스의 예시적인 이미지를 도시한 것이다. 도 63b는 INV721 및 디누툭시맙의 방사성 표지된 항체 결합의 결과를 보여주고, 이것은 INV721이 처리된 마우스의 척추에 디누툭시맙보다 유의하게 더 적게 결합함을 입증한다.
도 64는 마우스의 B78 흑색종 종양에서 INV721의 효능을 평가하기 위해 사용된 처리 프로토콜의 개략도이다.
도 65는 무처리(패널 1, 왼쪽부터), 방사선 요법 단독 처리(패널 2), 방사선 요법 및 IL-2를 사용한 처리(패널 3), 방사선 요법 및 INV721을 사용한 처리(패널 4), 및 방사선 요법, INV721 및 IL-2를 사용한 처리(패널 5) 후에 B78 흑색종 종양을 보유하는 마우스에서 종양 성장 및 억제의 결과를 도시한 것이다.
도 66은 B78 흑색종 종양을 보유하는 마우스에서 무처리, 방사선 요법 단독 처리, 방사선 요법 및 IL-2를 사용한 처리, 방사선 요법 및 INV721을 사용한 처리("I7-01/GD2-7"), 방사선 요법 및 α-푸코실화된 INV721을 사용한 처리("A-Fuco I7-01/GD2-7"), 방사선 요법 및 디누툭시맙을 사용한 처리("Din"), 방사선 요법, INV721, 및 IL-2를 사용한 처리, 방사선 요법, α-푸코실화된 INV721 및 IL-2를 사용한 처리, 및 방사선 요법, 디누툭시맙 및 IL-2를 사용한 처리 후에 B78 흑색종 종양을 보유하는 마우스에서 종양 성장 및 억제의 결과를 도시한 것이다.
도 67은 무처리, 방사선 요법 단독 처리, 방사선 요법 및 IL-2를 사용한 처리, 방사선 요법 및 INV721을 사용한 처리, 및 방사선 요법, INV721 및 IL-2를 사용한 처리 후에 B78 흑색종 종양을 보유하는 마우스의 총 생존을 도시한 것이다.
6. 발명의 상세한 설명
6.1. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 하기에 부여된 의미를 갖는다.
"항원 결합 부위"("ABS")는 주어진 항원 또는 에피토프를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는 항체 구축물의 영역을 의미한다. ABS 및 이러한 ABS를 포함하는 항체 구축물은 ABS가 특이적으로 결합하는 에피토프(또는 보다 일반적으로 항원)를 "인식"한다고 언급되며, 에피토프(또는 보다 일반적으로 항원)는 ABS의 "인식 특이성" 또는 "결합 특이성"을 제공하는 것으로 언급된다.
ABS는 특정 친화도로 그의 특정 항원 또는 에피토프에 결합한다고 언급된다. 본원에서 설명되는 바와 같이, "친화도"는 한 분자와 또 다른 분자 사이의 비공유 분자간 힘의 상호작용의 강도를 지칭한다. 친화도, 즉 상호작용의 강도는 해리 평형 상수(KD)로 표현될 수 있으며, 여기서 KD 값이 낮을수록 분자 사이의 상호작용이 더 강함을 의미한다. 항체 구축물의 KD 값은 생물층 간섭계(예를 들어, Octet/FORTEBIO®), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(예를 들어, Biacore®) 및 세포 결합 검정을 포함하지만 이로 제한되지 않는 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 측정된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 목적을 위해 친화도는 Octet/FORTEBIO®를 사용하여 생물층 간섭계에 의해 측정된 해리 평형 상수이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 KD 값이 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만인 ABS와 그의 동족 항원 또는 에피토프 사이의 친화도를 지칭한다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서 ABS의 수는 항체 구축물의 "결합가(valency)"를 정의한다. 단일 ABS를 갖는 항체 구축물은 "1가"이다. 복수의 ABS를 갖는 항체 구축물은 "다가"라고 언급된다. 2개의 ABS를 갖는 다가 항체 구축물은 "2가"이다. 3개의 ABS를 갖는 다가 항체 구축물은 "3가"이다. 4개의 ABS를 갖는 다가 항체 구축물은 "4가"이다.
항체 구축물의 다양한 다가 실시양태에서, 모든 복수의 ABS는 동일한 인식 특이성을 갖는다. 이러한 구축물은 "단일특이적" "다가" 항체 구축물이다. 다른 다가 실시양태에서, 복수의 ABS 중 적어도 2개는 상이한 인식 특이성을 갖는다. 이러한 항체 구축물은 다가 및 "다중특이적"이다. ABS가 집합적으로 2개의 인식 특이성을 갖는 다가 실시양태에서, 결합 분자는 "이중특이적"이다. ABS가 집합적으로 3개의 인식 특이성을 갖는 다가 실시양태에서, 결합 분자는 "삼중특이적"이다.
ABS가 집합적으로 동일한 항원에 존재하는 상이한 에피토프에 대한 복수의 인식 특이성을 갖는 다가 실시양태에서, 항체 구축물은 "다중 파라토프"이다. ABS가 동일한 항원 상의 2개의 에피토프를 집합적으로 인식하는 다가 실시양태는 "이중 파라토프"이다.
다양한 다가 실시양태에서, 항체 구축물의 다가 특성은 특정 표적에 대한 결합 분자의 결합력을 개선시킨다. 본원에서 설명되는 바와 같이, "결합력"은 2개 이상의 분자, 예를 들어 특정 표적에 대한 다가 결합 분자 사이의 상호작용의 전체 강도를 나타내며, 여기서 결합력은 다중 ABS의 친화도에 의해 제공되는 상호작용의 누적 강도이다. 결합력은 위에서 설명한 바와 같이 친화도를 결정하는 데 사용되는 것과 동일한 방법으로 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 특이적 표적에 대한 결합 분자의 결합력은 상호작용이 특이적 결합 상호작용이 되도록 하는 것이며, 여기서 2개의 분자 사이의 결합력은 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10--9 M, 또는 10-10 M 미만의 KD 값을 갖는다. 특정 실시양태에서, 특이적 표적에 대한 결합 분자의 결합력은 상호작용이 특이적 결합 상호작용이 되도록 하는 KD 값을 갖고, 여기서 개별 ABS의 하나 이상의 친화도는 각각의 항원 또는 에피토프에 그 홀로 특이적으로 결합하는 것으로 간주되는 KD 값을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 결합력은 개별 세포에서 발견되는 개별 항원과 같은 공유된 특정 표적 또는 복합체 상의 개별 항원에 대한 다중 ABS의 친화도에 의해 제공되는 상호작용의 누적 강도이다. 특정 실시양태에서, 결합력은 공유된 개별 항원 상의 개별 에피토프에 대한 다중 ABS의 친화도에 의해 제공되는 상호작용의 누적 강도이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "B-바디(B-Body)"는 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 도 51에 도시된 바와 같은 항체 구축물을 지칭하며, 여기서 (a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 CH3 아미노산 서열을 갖고, 도메인 D는 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고; (b) 제2 폴리펩타이드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 CH3 아미노산 서열 서열을 갖고; (c) 제1 및 제2 폴리펩타이드는 A와 F 도메인 사이의 상호작용 및 B와 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 항체 구축물을 형성한다. B-바디는 US 2018/0118811 및 WO 2019/204522에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 설명되는 바와 같이, "직교(orthogonal) 변형" 또는 동일어로서 "직교 돌연변이"는 직교 변형의 부재 하에서의 제1 및 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 변경하는 항체 도메인의 아미노산 서열의 하나 이상의 조작된 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 직교 변형은 직교 변형의 부재 하에서의 제1 및 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 직교 변형은 직교 변형의 부재 하에서의 제1 및 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 변경하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 직교 변형은 직교 변형의 부재 하에서의 제1 및 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 증가시킨다. 특정 바람직한 실시양태에서, 직교 변형은 상보적 직교 변형이 결여된 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 도메인의 친화도를 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 직교 변형은 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같은, 조작된 디설파이드 다리, 노브-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이, 및 전하쌍 돌연변이를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 직교 변형은 조작된 디설파이드 다리, 노브-인-홀 돌연변이 및 전하쌍 돌연변이로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 직교 변형의 조합을 포함한다.
6.2. 기타 해석 규칙
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 "서열"에 대한 모든 언급은 아미노산 서열에 대한 것이다. "내인성 서열" 또는 "천연 서열"은 유기체, 조직 또는 세포에서 유래하고 인위적으로 변형되거나 돌연변이되지 않은, 상황에 따라 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 임의의 서열을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 항체 불변 영역 잔기 넘버링은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html에 기재된 Eu 인덱스에 따르고, 이것은 본원에서 설명되는 항체 구축물의 사슬 내의 잔기의 물리적 위치에 관계없이 내인성 불변 영역 서열에서의 그의 위치에 따라 잔기를 식별한다.
달리 명시되지 않는 한, 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 모든 언급은 카바트(Kabat) 정의 CDR이다.
용어 "제1", "제2", "제3", "제4" 등은 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, "제1" 폴리펩타이드 사슬, "제2" 폴리펩타이드 사슬 등 또는 폴리펩타이드 "사슬 1", "사슬 2" 등)과 관련하여 사용될 때, 본원에서 다량체 분자를 형성하는 특정 폴리펩타이드 사슬에 대한 고유 식별자로서 사용되며, 항체 구축물 내의 상이한 폴리펩타이드 사슬의 순서 또는 양을 의미하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "제1", "제2", "제3", "제4" 등은 CH3 도메인과 관련하여 사용될 때, 특정 도메인을 지정하는 데 사용되며, 도메인의 순서 또는 양을 의미하는 것으로 의도되지 않는다.
본 개시내용에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는", "갖는", "포괄하다", "포괄하는" 및 이들의 언어적 변형은 미국 특허법에서 부여된 의미를 갖고, 명시적으로 언급된 것 이외의 추가의 구성요소의 존재를 허용한다.
본원에서 제공되는 범위는 인용된 종점을 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 구성된 그룹의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 용어 "a", "an" 및 "the"는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 관련 기술 분야의 정상 허용 오차 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. 약은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 달리 특정되지 않는 한, "약"은 명시된 값의 10% 이내를 의미한다.
6.3. 항체 구축물
분화 클러스터 276(CD276)으로도 알려져 있는 종양 세포 표면 항원 B7 동족체 3(B7H3), 및 디시알로강글리오사이드(GD2)에 선택적으로 결합하는 다중 특이적 항체 구축물이 본원에 개시되어 있다. 바람직하게는, 다중 특이적 항체 구축물은 B7H3 및 GD2를 모두 발현하는 종양 세포에 선택적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 다중 특이적 항체 구축물은 제1 종양 세포 표면 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위(ABS) 및 제2 종양 세포 표면 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위(ABS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ABS는 제1 종양 세포 표면 항원에 대해 낮은 결합 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제2 ABS는 제2 종양 세포 표면 항원에 대해 낮은 결합 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 ABS는 모두 각각 제1 및 제2 종양 세포 표면 항원에 대해 낮은 결합 친화도를 나타낸다. 낮은 결합 친화도는 10 nM 초과, 20 nM 초과, 바람직하게는 50 nM 초과, 더욱 바람직하게는 100 nM 초과, 더욱 더 바람직하게는 200 nM 초과인 평형 해리 상수(KD)를 갖는 결합을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 제1 ABS는 10 nM 초과, 20 nM 초과, 바람직하게는 50 nM 초과, 더욱 바람직하게는 100 nM 초과, 더욱 더 바람직하게는 200 nM 초과인 KD로 제1 종양 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 ABS는 약 10 내지 1000 nM, 바람직하게는 약 50 내지 900 nM, 보다 바람직하게는 약 100 내지 800 nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 200 내지 500 nM인 KD로 제1 종양 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 제2 ABS는 10 nM 초과, 20 nM 초과, 바람직하게는 50 nM 초과, 더욱 바람직하게는 100 nM 초과, 더욱 더 바람직하게는 200 nM 초과인 KD로 제2 종양 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 ABS는 약 10 내지 1000 nM, 바람직하게는 약 50 내지 900 nM, 보다 바람직하게는 약 100 내지 800 nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 200 내지 500 nM인 KD로 제2 종양 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 ABS는 임의의 다른 항원에 대해 평가 가능한 결합 친화도를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 ABS는 비표적 항원에 대해 각각 제1 또는 제2 종양 세포 표면 항원에 대한 KD의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500X, 또는 500X 초과인 KD를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 제1 ABS는 5 내지 200 nM, 바람직하게는 약 10 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 약 20 내지 60 nM, 또는 훨씬 더 바람직하게는 약 20 내지 40 nM인 KD로 B7H3에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 제2 ABS는 약 50 내지 500 nM, 바람직하게는 약 100 내지 400 nM, 더 바람직하게는 약 100 내지 300 nM, 또는 훨씬 더 바람직하게는 약 150 내지 250 nM인 KD로 GD2에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 다중 특이적 항체 구축물은 B7H3 및 GD2를 발현하는 표적 종양 세포에 높은 결합력으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 다중 특이적 항체 구축물은 약 500 nM 미만, 약 400 nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 90 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 60 nM 미만, 바람직하게는 약 50 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 25 nM 미만, 또는 훨씬 더 바람직하게는 약 10 nM 미만인 KD로 표적 종양 세포에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 다중 특이적 항체 구축물은 약 9 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 7 nM 미만, 약 6 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만인 KD로 표적 종양 세포에 결합한다.
다중 특이적 항체 구축물은 제1 및 제2 종양 세포 표면 항원에 대한 그의 ABS의 개별 결합 친화도보다 더 높은 결합력으로 표적 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 다중 특이적 항체 구축물은 표적 종양 세포에 대한 항체 구축물의 KD보다 더 높은, 제1 또는 제2 종양 세포 표면 항원에 대한 KD를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중 특이적 항체 구축물은 표적 종양 세포에 대한 항체 구축물의 KD보다 적어도 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 11X, 12X, 13X, 14X, 15X, 16X, 17X, 18X, 19X, 20X, 21X, 22X, 23X, 24X, 25X, 26X, 27X, 28X, 29X, 30X, 31X, 32X, 33X, 34X, 35X, 36X, 37X, 38X, 39X, 40X, 41X, 42X, 43X, 44X, 45X, 46X, 47X, 48X, 49X, 50X, 51X, 52X, 53X, 54X, 55X, 56X, 57X, 58X, 59X, 60X, 61X, 62X, 63X, 64X, 65X, 66X, 67X, 68X, 69X, 70X, 71X, 72X, 73X, 74X, 75X, 76X, 77X, 78X, 79X, 80X, 81X, 82X, 83X, 84X, 85X, 86X, 87X, 88X, 89X, 90X, 91X, 92X, 93X, 94X, 95X, 96X, 97X, 98X, 99X, 100X 더 높은, 또는 100X 초과로 더 높은, 제1 및 제2 종양 세포 표면 항원에 대한 KD를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 ABS는 100 nM 초과의 KD로 제1 종양 세포 표면 항원에 결합하고, 제2 ABS는 100 nM 초과의 KD로 제 2 종양 세포 표면 항원에 결합하고, 다중 특이적 항체 구축물은 10 nM 미만인 KD로 표적 종양 세포에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제1 ABS는 100 nM 초과의 KD로 제1 종양 세포 표면 항원 에 결합하고, 제2 ABS는 100 nM 초과의 KD로 제2 종양 세포 표면 항원에 결합하고, 다중 특이적 항체 구축물은 8 nM 미만인 KD로 표적 종양 세포에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제1 ABS는 100 nM 초과의 KD로 제1 종양 세포 표면 항원 에 결합하고, 제2 ABS는 100 nM 초과의 KD로 제2 종양 세포 표면 항원에 결합하고, 다중 특이적 항체 구축물은 5 nM 미만인 KD로 표적 종양 세포에 결합한다.
일부 실시양태에서, 다중 특이적 항체 구축물은 임의의 비표적 세포보다 더 큰 결합력으로 표적 종양 세포에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 다중 특이적 항체 구축물은 비표적 세포에 대한 그의 결합력보다 적어도 0.1X, 0.2X, 0.3X, 0.4X, 0.5X, 0.6X, 0.7X, 0.8X, 0.9X, 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 11X, 12X, 13X, 14X, 15X, 16X, 17X, 18X, 19X, 20X, 21X, 22X, 23X, 24X, 25X, 26X, 27X, 28X, 29X, 30X, 31X, 32X, 33X, 34X, 35X, 36X, 37X, 38X, 39X, 40X, 41X, 42X, 43X, 44X, 45X, 46X, 47X, 48X, 49X, 50X, 51X, 52X, 53X, 54X, 55X, 56X, 57X, 58X, 59X, 60X, 61X, 62X, 63X, 64X, 65X, 66X, 67X, 68X, 69X, 70X, 71X, 72X, 73X, 74X, 75X, 76X, 77X, 78X, 79X, 80X, 81X, 82X, 83X, 84X, 85X, 86X, 87X, 88X, 89X, 90X, 91X, 92X, 93X, 94X, 95X, 96X, 97X, 98X, 99X, 100X, 110X, 120X, 130X, 140X, 150X, 160X, 170X, 180X, 190X, 200X, 210X, 220X, 230X, 240X, 250X, 260X, 270X, 280X, 290X, 300X, 310X, 320X, 330X, 340X, 350X, 360X, 370X, 380X, 390X, 400X, 410X, 420X, 430X, 440X, 450X, 460X, 470X, 480X, 490X, 500X, 750X, 또는 1000X 더 큰 결합력으로 표적 종양 세포에 결합할 수 있다.
다중 특이적 항체 구축물은 비표적 세포에 비해 표적 종양 세포에 선택적으로 결합할 수 있다. 통상의 기술자는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 비표적 세포에 비해 표적 종양 세포에 대한 선택적 결합을 평가할 수 있다. 선택적 결합을 평가하기 위한 예시적인 방법은 비포화 검정 조건 하에서 다중 특이적 항체 구축물로 검출 가능하게 표지된 표적 종양 세포의 백분율을 동일한 검정 조건 하에서 다중 특이적 항체 구축물로 검출 가능하게 표지된 비표적 세포의 백분율과 비교하는 것을 포함한다. 예를 들어, 다중 특이적 항체 구축물에 의해 결합된 표적 종양 세포 퍼센트/결합된 비표적 세포 퍼센트의 비는 표적 종양 세포에 대한 선택적 결합의 지표로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비포화 분석 조건 하에서 70% 초과의 표적 종양 세포에 검출 가능하게 결합하는 다중 특이적 항체 구축물은 동일한 검정 조건 하에서 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만 또는 15% 미만의 비표적 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 비포화 검정 조건 하에서 80% 초과의 표적 종양 세포에 검출 가능하게 결합하는 다중 특이적 항체 구축물은 동일한 검정 조건 하에서 20% 미만의 비표적 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 비포화 검정 조건 하에서 90% 초과의 표적 종양 세포에 검출 가능하게 결합하는 다중 특이적 항체 구축물은 동일한 검정 조건 하에서 10% 미만의 비표적 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 비포화 검정 조건 하에서 결합된 표적 종양 세포/결합된 비표적 세포의 비는 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 6 초과, 7 초과, 8 초과, 9 초과, 10 초과, 11 초과, 12 초과, 13 초과, 14 초과, 15 초과, 16 초과, 17 초과, 18 초과, 19 초과, 20 초과, 21 초과, 22 초과, 23 초과, 24 초과, 25 초과, 26 초과, 27 초과, 28 초과, 29 초과, 30 초과, 31 초과, 32 초과, 33 초과, 34 초과, 35 초과, 36 초과, 37 초과, 38 초과, 39 초과, 40 초과, 41 초과, 42 초과, 43 초과, 44 초과, 45 초과, 46 초과, 47 초과, 48 초과, 49 초과, 50 초과, 51 초과, 52 초과, 53 초과, 54 초과, 55 초과, 56 초과, 57 초과, 58 초과, 59 초과, 60 초과, 61 초과, 62 초과, 63 초과, 64 초과, 65 초과, 66 초과, 67 초과, 68 초과, 69 초과, 70 초과, 71 초과, 72 초과, 73 초과, 74 초과, 75 초과, 76 초과, 77 초과, 78 초과, 79 초과, 80 초과, 81 초과, 82 초과, 83 초과, 84 초과, 85 초과, 86 초과, 87 초과, 88 초과, 89 초과, 90 초과, 91 초과, 92 초과, 93 초과, 94 초과, 95 초과, 96 초과, 97 초과, 98 초과, 99 초과, 100 초과, 110 초과, 120 초과, 130 초과, 140 초과, 150 초과, 160 초과, 170 초과, 180 초과, 190 초과, 200 초과, 210 초과, 220 초과, 230 초과, 240 초과, 250 초과, 260 초과, 270 초과, 280 초과, 290 초과, 300 초과, 310 초과, 320 초과, 330 초과, 340 초과, 350 초과, 360 초과, 370 초과, 380 초과, 390 초과, 400 초과, 410 초과, 420 초과, 430 초과, 440 초과, 450 초과, 460 초과, 470 초과, 480 초과, 490, 또는 500 초과이다.
표적 종양 세포는 B7H3 및 GD2의 공동 발현에 기초하여 비표적 세포와 구별된다. 따라서, 표적 종양 세포는 B7H3 및 GD2에 대해 이중 양성이다. 비표적 세포는 B7H3을 발현하지만 GD2는 발현하지 않는 세포 및 GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
6.3.1. 가변 도메인
전형적인 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 각각의 ABS는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드의 VL 도메인 및 제2 폴리펩타이드의 VH 도메인은 회합하여 제1 ABS를 형성한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 제3 폴리펩타이드의 VL 도메인 및 제4 폴리펩타이드의 VH 도메인은 회합하여 제2 ABS를 형성한다.
일부 실시양태에서, 도 51을 참조하면, 항체 구축물의 제1 폴리펩타이드 및 제3 폴리펩타이드는 모두 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물의 제2 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드는 모두 VL 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 도 51을 참조하면, VL 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬의 도메인 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬의 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 각각 다음과 같이 정렬된다:
a) 제1 폴리펩타이드 사슬
도메인 A - 도메인 B - 도메인 D - 도메인 E
VL - 제1 CH3 - CH2 - 제3 CH3
제2 폴리펩타이드 사슬
도메인 F - 도메인 G
VH - 제2 CH3
또는
b) 제1 폴리펩타이드 사슬
도메인 A - 도메인 B - 도메인 D - 도메인 E
VL - 제2 CH3 - CH2 - 제3 CH3
제2 폴리펩타이드 사슬
도메인 F - 도메인 G
VH - 제1 CH3.
다양한 실시양태에서, 도 51을 참조하면, 항체 구축물은 제3 폴리펩타이드 사슬 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 추가로 포함하며, 여기서,
(a) 제3 폴리펩타이드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J 및 도메인 K를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고,
(b) 제4 폴리펩타이드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고;
(c) 제3 및 제4 폴리펩타이드는 제2 항원 결합 부위(ABS)를 형성하는 H와 L 도메인 사이의 상호작용 및 I와 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고;
(d) 제1 및 제3 폴리펩타이드는 D와 J 도메인 사이의 상호작용 및 E와 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합된다.
특정 실시양태에서, 도메인 H는 VL 도메인이고; 도메인 I는 CL 도메인이고; 도메인 J는 CH2 도메인이고; 도메인 K는 제4 CH3 도메인이다. 특정 실시양태에서, 도메인 L은 VH 도메인이고; 도메인 M은 CH1 도메인이다.
특정 실시양태에서, 도메인 A는 VL 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 도메인 A는 VH 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 천연 항체 구조를 포함하며, 여기서 도메인 A 및 H는 VH 아미노산 서열을 포함하고, 도메인 F 및 L은 VL 아미노산 서열을 포함하고, 도메인 B 및 I는 CH1을 포함하고, 도메인 G 및 M은 CL을 포함하고, 도메인 D 및 J는 CH2를 포함하고, 도메인 E 및 K는 CH3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 B-바디™이다. B-바디™ 항체 구축물은 US 2018/0118811 및 WO 2019/204522에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함되며, 특정 실시양태는 아래에서 추가로 설명된다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 크로스맵(CrossMab)™이다. 크로스맵™ 항체는 미국 특허 제8,242,247호; 제9,266,967호; 및 제8,227,577호, 미국 특허 출원 공개 20120237506, 미국 특허 출원 공개 US20090162359, WO2016016299, WO2015052230에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 2가의 이중 특이적 항체이고, 여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체된다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 미국 특허 제8,871,912호 및 WO 2016/087650에 기재된 일반적인 구조를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 VL-CH3으로 구성된 경쇄(LC) 및 VH-CH3-CH2-CH3을 포함하는 중쇄(HC)를 포함하는 도메인 교환된 항체이고, 여기서 LC의 VL-CH3은 HC의 VH-CH3과 이량체화하여, CH3LC/CH3HC 도메인 쌍을 포함하는 도메인 교환된 LC/HC 이량체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 WO 2017/011342에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 WO 2006/093794에 기재된 바와 같다.
6.3.1.1.1 VH 도메인
다양한 실시양태에서, VH 도메인은 인간 서열을 포함하는 포유동물 서열, 인간화 서열, 합성 서열, 또는 인간, 비인간 포유동물 및/또는 합성 서열의 조합인 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 실시양태에서, VH 아미노산 서열은 자연 발생 서열의 돌연변이된 서열이다.
6.3.1.1.2 VL 도메인
다양한 실시양태에서, VL 도메인은 인간 서열을 포함하는 포유동물 서열, 인간화 서열, 합성 서열, 또는 인간, 비인간 포유동물 및/또는 합성 서열의 조합인 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 실시양태에서, VL 아미노산 서열은 자연 발생 서열의 돌연변이된 서열이다.
특정 실시양태에서, VL 아미노산 서열은 람다(λ) 경쇄 가변 도메인 서열이다. 특정 실시양태에서, VL 아미노산 서열은 카파(κ) 경쇄 가변 도메인 서열이다.
6.3.1.1.3 상보성 결정 영역
본 명세서에서 설명되는 항체 구축물의 VH 및 VL 도메인은 "상보성 결정 영역"(CDR), 일반적으로 3개의 CDR(CDR1, CD2, 및 CDR3)이라고 명명되는 고도로 가변적인 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서, CDR은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시양태에서, CDR은 인간 서열이다. 다양한 실시양태에서, CDR은 자연 발생 서열이다. 다양한 실시양태에서, CDR은 특정 항원 또는 에피토프에 대한 항원 결합 부위의 결합 친화도를 변경하도록 돌연변이된 자연 발생 서열이다. 특정 실시양태에서, 자연 발생 CDR은 친화도 성숙 및 체세포 과돌연변이를 통해 생체 내의 숙주에서 돌연변이된 것이다. 특정 실시양태에서, CDR은 PCR 돌연변이 유발 및 화학적 돌연변이 유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법을 통해 시험관 내에서 돌연변이된 것이다. 다양한 실시양태에서, CDR은 무작위 서열 CDR 라이브러리 및 합리적으로 설계된 CDR 라이브러리로부터 수득된 CDR을 포함하지만 이에 제한되지 않는 합성 서열이다.
6.3.1.1.4 프레임워크 영역 및 CDR 이식
본원에서 설명되는 항체 구축물의 VH 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역"(FR) 서열을 포함한다. FR은 일반적으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 배열(N-말단으로부터 C-말단으로)에서, 산재된 CDR에 대한 스캐폴드 역할을 하는 일반적으로 보존된 서열 영역이다. 다양한 실시양태에서, FR은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시양태에서, FR은 인간 서열이다. 다양한 실시양태에서, FR은 자연 발생 서열이다. 다양한 실시양태에서, FR은 합리적으로 설계된 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 합성 서열이다.
다양한 실시양태에서, FR 및 CDR은 모두 동일한 자연 발생 가변 도메인 서열로부터 유래한다. 다양한 실시양태에서, FR 및 CDR은 상이한 가변 도메인 서열로부터 유래되고, 여기서 CDR은 특정 항원에 대한 특이성을 제공하는 CDR과 함께 FR 스캐폴드 상에 이식된다. 특정 실시양태에서, 이식된 CDR은 모두 동일한 자연 발생 가변 도메인 서열로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 이식된 CDR은 상이한 가변 도메인 서열로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 이식된 CDR은 무작위 서열 CDR 라이브러리 및 합리적으로 설계된 CDR 라이브러리로부터 수득된 CDR을 포함하지만 이에 제한되지 않는 합성 서열이다. 특정 실시양태에서, 이식된 CDR 및 FR은 동일한 종으로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 이식된 CDR 및 FR은 상이한 종으로부터 유래한다. 바람직한 이식된 CDR 실시양태에서, 항체는 "인간화"되고, 여기서 이식된 CDR은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀 및 염소 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비인간 포유동물 서열이고, FR은 인간 서열이다. 인간화 항체는 미국 특허 제6,407,213호에 기재되어 있으며, 상기 특허는 그것이 교시하는 모든 내용에 대해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 다양한 실시양태에서, 한 종에서 유래한 FR의 일부 또는 특정 서열을 사용하여 또 다른 종의 FR의 일부 또는 특정 서열을 대체한다.
6.3.2. CH1 및 CL 도메인
다양한 실시양태에서, 항체 구축물의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬 중 적어도 하나는 면역글로불린 CH1 도메인을 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 항체 구축물의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬 중 적어도 하나는 면역글로불린 CL 도메인을 추가로 포함한다.
다양한 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 추가로 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 CL 도메인을 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 제2 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 추가로 포함하고, 제1 폴리펩타이드는 CL 도메인을 추가로 포함한다.
다양한 실시양태에서, CH1 서열은 내인성 서열이다. 다양한 실시양태에서, CH1 서열은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시양태에서, CH1 서열은 인간 서열이다. 특정 실시양태에서, CH1 서열은 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgM 이소형으로부터 유래한다. 바람직한 실시양태에서, CH1 서열은 IgG1 이소형으로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, CH1 서열은 UniProt 수탁 번호 P01857 아미노산 1-98이다.
본원에서 설명되는 항체 구축물의 CL 도메인은 항체 경쇄 불변 도메인이다. 특정 실시양태에서, CL 도메인은 내인성 서열인 서열을 갖는다. 다양한 실시양태에서, CL 서열은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시양태에서, CL 서열은 인간 서열이다.
특정 실시양태에서, CL 아미노산 서열은 람다(λ) 경쇄 불변 도메인 서열이다. 특정 실시양태에서, CL 아미노산 서열은 인간 람다 경쇄 불변 도메인 서열이다. 바람직한 실시양태에서, 람다(λ) 경쇄 서열은 UniProt 수탁 번호 P0CG04이다.
특정 실시양태에서, CL 아미노산 서열은 카파(κ) 경쇄 불변 도메인 서열이다. 바람직한 실시양태에서, CL 아미노산 서열은 인간 카파(κ) 경쇄 불변 도메인 서열이다. 바람직한 실시양태에서, 카파 경쇄 서열은 UniProt 수탁 번호 P01834이다.
특정 실시양태에서, CH1 서열 및 CL 서열은 모두 내인성 서열이다.
CH1 도메인 폴딩은 전형적으로 IgG 분비의 속도 제한 단계이다(Feige et al. Mol Cell. 2009 Jun 12; 34(5):569-79; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, CH1 포함 폴리펩타이드 사슬의 속도 제한 성분에 기초하여 본원에서 설명되는 항체 구축물을 정제하는 것은 불완전한 사슬로부터 완전한 복합체를 정제하는, 예를 들어, 하나 이상의 비-CH1 포함 사슬만을 갖는 복합체로부터 제한 CH1 도메인을 갖는 복합체를 정제하는 수단을 제공할 수 있다.
논의되는 바와 같이, CH1 제한 발현이 일부 측면에서 이점이 될 수 있지만, CH1이 완전한 항체 구축물의 전체 발현을 제한할 가능성이 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬의 발현은 완전한 복합체를 형성하는 항체 구축물의 효율을 개선하도록 조정된다. 예시적인 예에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 발현하도록 구축된 플라스미드 벡터의 비는 다른 폴리펩타이드 사슬을 발현하도록 구축된 플라스미드 벡터에 비해 증가될 수 있다. 또 다른 예시적인 예에서, CL 서열(들)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬과 비교할 때 CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 2개의 폴리펩타이드 사슬 중에서 더 작을 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬의 발현은 어떤 폴리펩타이드 사슬이 CH1 서열(들)을 갖는지를 제어함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, CH1 도메인이 4-도메인 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 본 명세서에서 설명되는 제3 폴리펩타이드 사슬) 내의 CH1 서열의 천연 위치 대신에 2-도메인 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 본 명세서에서 설명되는 제4 폴리펩타이드 사슬)에 존재하도록 항체 구축물을 조작하는 것은 CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬의 발현을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 다른 측면에서, 다른 사슬에 비해 너무 높은 CH1 함유 사슬의 상대적인 발현 수준은 CH1 사슬은 갖지만 각각의 다른 사슬은 갖지 않는 불완전한 복합체를 생성할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬의 발현은 CH1 함유 사슬이 없는 불완전한 복합체의 형성을 감소시키고 CH1 함유 사슬이 존재하지만 완전한 복합체에 존재하는 다른 사슬이 없는 불완전한 복합체의 형성을 감소시키기 위해 조정된다.
특정 실시양태에서, CH1 서열 및 CL 서열은 아래에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 내인성 CH1 및 CL 서열에 각각 직교 변형을 개별적으로 포함한다. 바람직하게는, CH1 서열의 직교 돌연변이는 CH1 도메인과 정제에 사용되는 CH1 특이적 결합 시약 사이의 특이적 결합 상호작용을 제거하지 않는다.
6.3.2.1 CH1 및 CL 직교 변형
특정 실시양태에서, CH1 서열 및 CL 서열은 각각 내인성 CH1 및 CL 서열의 직교 변형을 추가로 포함한다. CH1/CL 직교 변형은 CH1 도메인의 변형된 잔기와 CL 도메인의 상응하는 변형된 또는 비변형된 잔기 사이의 상호작용을 통한 CH1/CL 도메인 페어링에 영향을 미칠 수 있다.
특정 실시양태에서, 직교 변형은 동종동질이형체(isoallotype) 돌연변이와 같은 면역원성을 감소시키는 아미노산 치환과 조합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CH1/CL 쌍의 하나의 서열은 적어도 하나의 변형을 포함하는 반면, CH1/CL 쌍의 다른 서열은 각각의 직교 아미노산 위치에 변형을 포함하지 않는다.
CH1 및 CL 서열은 또한 내인성 또는 변형된 서열의 일부일 수 있으므로, CH1 서열을 갖는 도메인 또는 그의 일부는 CH1 서열을 갖는 도메인 또는 그의 일부와 회합할 수 있다. 또한, 본원에서 설명되는 CH1 서열의 일부를 갖는 항체 구축물은 CH1 결합 시약에 의해 결합될 수 있다.
6.3.2.1.1 예시적인 CH1/CL 직교 변형: 조작된 디설파이드 다리
CH1/CL 직교 변형의 일부 실시양태는 CH1 및 CL 내의 조작된 시스테인 사이의 조작된 디설파이드 다리를 포함한다. 이러한 조작된 디설파이드 다리는 변형된 CH1을 포함하는 폴리펩타이드와 상응하는 변형된 CL을 포함하는 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 안정화할 수 있다.
조작된 디설파이드 다리를 포함하는 직교 CH1/CL 변형은 예를 들어 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 위치 128, 129, 138, 141, 168, 또는 171에 조작된 시스테인을 갖는 CH1 도메인을 포함한다. 조작된 디설파이드 다리를 포함하는 이러한 직교 CH1/CL 변형은 예를 들어 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 위치 116, 118, 119, 164, 162, 또는 210에 조작된 시스테인을 갖는 CL 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, CH1/CL 직교 변형은 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,053,562호 및 미국 특허 제9,527,927호에서 넘버링되고 보다 상세하게 설명된 바와 같이 CH1 서열의 위치 138 및 CL 서열의 위치 116, CH1 서열의 위치 128 및 CL 서열의 위치 119, 또는 CH1 서열의 위치 129 및 CL 서열의 위치 210에서의 조작된 시스테인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 141 및 CL 서열의 위치 118에 조작된 시스테인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 168 및 CL 서열의 위치 164에 조작된 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 128 및 CL 서열의 위치 118에 조작된 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 171 및 CL 서열의 위치 162에 조작된 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CL 서열은 CL-람다 서열이다. 바람직한 실시양태에서, CL 서열은 CL-카파 서열이다. 일부 실시양태에서, 조작된 시스테인은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 128 및 CL 카파 서열의 위치 118에 존재한다.
하기 표 1은 EU 인덱스에 따라 넘버링된, CH1과 CL 사이에 조작된 디설파이드 다리를 포함하는 예시적인 CH1/CL 직교 변형을 제공한다.
Figure pct00001
일련의 바람직한 실시양태에서, 비내인성(조작된) 시스테인 아미노산을 제공하는 돌연변이는 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열에서의 상응하는 A141C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 F118C 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 L128C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 F118C 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 H168C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 T164C 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 P171C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 S162C 돌연변이이다.
6.3.2.1.2 CH1/CL 직교 변형: 조작된 전하쌍 돌연변이
다양한 실시양태에서, CL 서열 및 CH1 서열의 직교 변형은 전하쌍 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 전하쌍 돌연변이는 EU 인덱스에 의해 넘버링되고 그 교시하는 모든 내용에 대해 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Bonischet al. (Protein Engineering, Design & Selection, 2017, pp. 1-12)]에 보다 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, CH1 서열에서의 상응하는 A141L 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 F118S, F118A 또는 F118V 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 K147D 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 T129R 돌연변이이다.
일부 경우에, CH1/CL 전하쌍 돌연변이는 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열에서의 상응하는 G166D 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 N138K 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 G166K 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 N138D 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 전하쌍 돌연변이는 상응하는 CL 서열에서의 상응하는 E123K 돌연변이와 함께 CH1 서열에서의 P127E 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 전하쌍 돌연변이는 상응하는 CL 서열에서의 상응하는 E123(돌연변이되지 않음)과 함께 CH1 서열에서의 P127K 돌연변이이다.
하기 표 2는 예시적인 CH1/CL 직교 전하쌍 변형을 제공한다.
Figure pct00002
6.3.2.1.3 CH1/CL 직교 변형의 조합
특정 실시양태에서, 단일 CH1/CL 쌍의 CH1 및 CL 도메인은 내인성 CH1 및 CL 서열에 2개 이상의 각각의 직교 변형을 개별적으로 함유한다. 예를 들어, CH1 및 CL 서열은 내인성 CH1 및 CL 서열에서의 제1 직교 변형 및 제2 직교 변형을 포함할 수 있다. 내인성 CH1 및 CL 서열에서의 2개 이상의 각각의 직교 변형은 본원에서 설명되는 CH1/CL 직교 변형 중 임의의 변형으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 직교 변형은 직교 전하쌍 돌연변이이고, 제2 직교 변형은 직교 조작된 디설파이드 다리이다. 일부 실시양태에서, 제1 직교 변형은 표 2에 기재된 바와 같은 직교 전하쌍 돌연변이이고, 추가의 직교 변형은 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,053,562호 및 미국 특허 제9,527,927호에서 넘버링되고 보다 상세하게 설명된 바와 같이 CH1 서열의 위치 138 및 CL 서열의 위치 116, CH1 서열의 위치 128 및 CL 서열의 위치 119, 또는 CH1 서열의 위치 129 및 CL 서열의 위치 210에서의 조작된 시스테인으로부터 선택되는 조작된 디설파이드 다리를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 직교 변형은 표 2에 기재된 바와 같은 직교 전하쌍 돌연변이이고, 추가의 직교 변형은 표 1에 기재된 바와 같은 조작된 디설파이드 다리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 직교 변형은 CH1 서열에서의 L128C 돌연변이 및 CL 서열에서의 F118C 돌연변이를 포함하고, 제2 직교 변형은 동일한 CH1 서열에서의 잔기 166의 변형 및 동일한 CL 서열에서의 잔기 138의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 직교 변형은 CH1 서열에서의 L128C 돌연변이 및 CL 서열에서의 F118C 돌연변이를 포함하고, 제2 직교 변형은 CH1 서열에서의 G166D 돌연변이 및 CL 서열에서의 N138K 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 직교 변형은 CH1 서열에서의 L128C 돌연변이 및 CL 서열에서의 F118C 돌연변이를 포함하고, 제2 직교 변형은 CH1 서열에서의 G166K 돌연변이 및 CL 서열에서의 N138D 돌연변이를 포함한다.
6.3.3. CH2 도메인
다양한 실시양태에서, 항체 구축물의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬 중 적어도 하나는 CH2 도메인을 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 모두 CH2 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 CH2 도메인의 한 쌍을 초과하는 세트를 갖는다. 다양한 이들 실시양태에서, 페어링된 CH2 도메인의 제1 세트는 제1 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열 및 또 다른 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열의 하나 이상의 이종상동성(orthologous) 세트를 갖는다. 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 이종상동성 CH2 아미노산 서열은 공유 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열과 상호작용할 수 있지만, 항체 구축물에 존재하는 또 다른 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열과는 유의하게 상호작용하지 않는다.
특정 실시양태에서, CH2 아미노산 서열의 제1 세트는 항체 구축물의 다른 비-CH2 도메인과 동일한 이소형으로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 제1 세트는 IgG 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열을 갖고, 하나 이상의 이종상동성 세트는 IgM 또는 IgE 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, CH2 아미노산 서열의 세트 중 하나 이상은 내인성 CH2 서열이다. 다른 실시양태에서, CH2 아미노산 서열의 세트 중 하나 이상은 하나 이상의 돌연변이를 갖는 내인성 CH2 서열이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 직교 노브-홀 돌연변이, 직교 전하쌍 돌연변이 또는 직교 소수성 돌연변이이다. 본원에서 설명되는 항체 구축물에 유용한 이종상동성 CH2 아미노산 서열은 국제 PCT 출원 공개 WO2017/011342 및 WO2017/106462에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, CH2 아미노산 서열의 모든 세트는 동일한 종으로부터 유래한 것이다. 바람직한 실시양태에서, CH2 아미노산 서열의 모든 세트는 인간 CH2 아미노산 서열이다. 다른 실시양태에서, CH2 아미노산 서열의 세트는 상이한 종으로부터 유래한 것이다.
6.3.4. CH3 도메인
본원에서 설명되는 항체 구축물의 CH3 도메인은 상기 돌연변이가 그 내부로 조작되는, 항체 중쇄의 C-말단에 자연적으로 위치하는 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 실시양태에서, CH3 서열은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시양태에서, CH3 서열은 인간 서열이다. 특정 실시양태에서, CH3 서열은 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소형으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, CH3 서열은 IgG 이소형으로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, CH3 서열은 IgG1 이소형으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, CH3 서열은 IgA 이송형으로부터 유래된다.
특정 실시양태에서, CH3 서열은 IgE 또는 IgM 이소형으로부터의 CH4 서열이다.
특정 실시양태에서, CH3 서열은 내인성 서열이다. 특정 실시양태에서, CH3 서열은 UniProt 수탁 번호 P01857 아미노산 224-330이다. 다양한 실시양태에서, CH3 서열은 내인성 CH3 서열의 세그먼트이다. 특정 실시양태에서, CH3 서열은 N-말단 아미노산 G224 및 Q225가 결여된 내인성 CH3 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, CH3 서열은 C-말단 아미노산 P328, G329, 및 K330이 결여된 내인성 CH3 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, CH3 서열은 N-말단 아미노산 G224 및 Q225 및 C-말단 아미노산 P328, G329 및 K330 모두가 결여된 내인성 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, CH3 서열은 문헌이 교시하는 모든 내용에 대해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Stickler et al. (Genes Immun. 2011 Apr; 12(3): 213-221)]에 보다 상세하게 설명된 바와 같이 하나의 동종이인자형(allotype)의 특정 아미노산을 또 다른 동종이인자형의 아미노산으로 대체함(본 명세서에서 동종동질이형체 돌연변이로 언급됨)으로써 면역원성을 감소시키도록 조작된다. 특정 실시양태에서, G1m1 동종이인자형의 특정 아미노산이 대체된다. 바람직한 실시양태에서, 동종동질이형체 돌연변이 D356E 및 L358M은 CH3 서열에서 만들어진다.
일부 실시양태에서는, 제1 또는 제2 CH3 도메인에 추가의 조작된 돌연변이가 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, CH3 서열은 아래에서 설명되는 바와 같이 상기 기재된 것에 추가로 하나 이상의 조작된 돌연변이를 갖는 내인성 서열이다.
6.3.5. CH3 도메인에서 추가의 조작된 직교 돌연변이
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH3 도메인 내에 조작된 적어도 하나의 추가의 직교 돌연변이가 존재한다.
6.3.5.1 노브-인-홀
다양한 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 직교 노브-인-홀("K-I-H") 돌연변이를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 도메인이 상보적 입체 돌연변이가 없는 도메인과의 회합에 비해 상보적 입체 돌연변이를 갖는 제2 도메인과 우선적으로 회합하도록 제1 도메인의 표면의 입체적 특징을 변경하는 돌연변이이다. 노브-인-홀 돌연변이는 미국 특허 제5,821,333호 및 미국 특허 제5,821,333호 8,216,805에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 조작된 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 노브 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 홀 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인에 홀 돌연변이가 존재하고, 제2 CH3 도메인에 노브 돌연변이가 존재한다.
특정 실시양태에서, 노브 돌연변이는 T366W 또는 T366Y이다.
특정 실시양태에서, 홀 돌연변이는 T366S, L368A, F405T, Y407V, 또는 Y407T로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 홀 돌연변이는 F405T이다.
특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366W 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 Y407A 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366W 돌연변이 및 제1 CH3 도메인에서의 Y407A 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 제2 도메인에서의 Y407T 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 제1 도메인에서의 Y407T 돌연변이이다.
특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T394W 및 제2 CH3 도메인에서의 F405A이다. 특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의의 T394W 및 제1 CH3 도메인에서의 F405A이다.
특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 F405A 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 T394W 돌연변이 및 Y407T 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 F405A 돌연변이 및 제1 CH3 도메인에서의 T394W 돌연변이 및 Y407T 돌연변이이다.
6.3.5.2 조작된 전하쌍
다양한 실시양태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 직교 전하쌍 돌연변이를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 전하쌍 돌연변이는 도메인이 상보적 전하쌍 돌연변이가 없는 도메인과의 회합에 비해 상보적 전하쌍 돌연변이를 갖는 제2 도메인과 우선적으로 회합하도록 도메인 표면의 아미노산의 전하에 영향을 미치는 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 전하쌍 돌연변이는 특정 도메인 간의 직교 회합을 개선한다. 전하쌍 돌연변이는 미국 특허 제8,592,562호; 제9,248,182호; 및 제9,358,286호에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이들은 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, 전하쌍 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366K 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 L351D 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 전하쌍 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366K 돌연변이 및 제1 CH3 도메인에서의 L351D 돌연변이이다.
6.3.6. 특정 2가 항체 구축물
다양한 실시양태에서, 항체 구축물은 도 51에 나타낸 구조를 갖는다.
6.3.6.1 도메인 A
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 A는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 도메인 A는 VL 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 도메인 A는 VH 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 A의 C-말단은 도메인 B의 N-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 도메인 A는 도메인 A와 도메인 B 사이의 접합부에서 그의 C-말단에서 돌연변이된 VL 아미노산 서열을 갖는다.
6.3.6.2 도메인 B
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 B는 불변 영역 도메인 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 B는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 CH3 서열 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 다리를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 제1 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 제2 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다. 특정 실시양태에서, 제2 CH3 도메인은 E357W 돌연변이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖는다: P343V; Y349C; 및 트리펩타이드 삽입, 즉 445P, 446G, 447K. 다른 바람직한 실시양태에서, 도메인 B는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: T366K; 및 트리펩타이드 삽입, 즉 445K, 446S, 447C. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 도메인 B는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: Y349C 및 트리펩타이드 삽입, 즉 445P, 446G, 447K.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 내인성 CH3 서열에 통합된 K447C 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 불변 영역 서열은 이종상동성 CH2 서열이다. 일부 실시양태에서, 도메인 B는 IgE로부터의 CH2 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 도메인 B는 IgM으로부터의 CH2 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 결합 분자의 결합가가 3 또는 3 초과인 경우, 불변 영역 서열은 CH1 또는 CL 서열이다. 일부 실시양태에서, 도메인 B는 CH1 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 서열은 CL 서열이다. 일부 실시양태에서, CH1 또는 CL 서열은 본원에서 설명되는 하나 이상의 CH1 또는 CL 직교 변형을 포함한다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 B의 N-말단은 도메인 A의 C-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 도메인 B는 도메인 A와 도메인 B 사이의 접합부에서 그의 N-말단에서 돌연변이된 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 B의 C-말단은 도메인 D의 N-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 도메인 B는 도메인 B와 도메인 D 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 B는 인간 IgA CH3 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA CH3 서열은 CH3 링커 서열을 포함한다.
6.3.6.3 도메인 D
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 D는 불변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
일련의 바람직한 실시양태에서, 도메인 D는 CH2 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, CH2 서열은 내인성 서열이다. 특정 실시양태에서, 서열은 UniProt 수탁 번호 P01857 아미노산 111-223이다. 바람직한 실시양태에서, CH2 서열은 N-말단 가변 도메인-불변 도메인 세그먼트를 CH2 도메인에 연결하는 N-말단 힌지 영역 펩타이드를 갖는다. 일부 실시양태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 D의 N-말단은 도메인 B의 C-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 도메인 B는 도메인 D와 도메인 B 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
6.3.6.4 도메인 E
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 E는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 불변 영역 서열은 CH3 서열이다.
특정 실시양태에서, 도메인 E는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 E는 CH3 서열 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 다리를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 E는 제1 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환된다(Y349C).
특정 실시양태에서, 도메인 E는 제2 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다. 특정 실시양태에서, 제2 CH3 도메인은 E357W 돌연변이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 불변 영역 도메인 서열은 CH1 서열이다. 특정 실시양태에서, 도메인 E의 CH1 아미노산 서열은 결합 분자에서 유일한 CH1 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, CH1 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다.
특정 실시양태에서, 불변 영역 서열은 CL 서열이다. 특정 실시양태에서, CL 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다.
6.3.6.5 도메인 F
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 F는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 도메인 F는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 도메인 F는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
6.3.6.6 도메인 G
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 G는 불변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 G는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 G는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: S354C; 및 트리펩타이드 삽입, 즉 445P, 446G, 447K. 일부 실시양태에서, 도메인 G는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: S354C; 및 445P, 446G, 447K 트리펩타이드 삽입. 일부 바람직한 실시양태에서, 도메인 G는 다음과 같은 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: L351D, 및 445G, 446E, 447C의 트리펩타이드 삽입.
특정 실시양태에서, 도메인 G는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 G는 CH3 서열 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 다리를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 G는 인간 IgA CH3 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 G는 CL 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 G는 IgE로부터의 CH2 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 도메인 G는 IgM으로부터의 CH2 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 결합 분자의 결합가가 3 또는 3 초과인 경우, 불변 영역 서열은 CH1 또는 CL 서열이다. 도메인 B가 CL 서열인 일부 실시양태에서, 도메인 G는 CH1 서열이다. 일부 실시양태에서, CH1 또는 CL 서열은 본원에서 설명되는 하나 이상의 CH1 또는 C1 직교 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 도메인 G의 C-말단은 도메인 D의 N-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 도메인 G는 도메인 G와 도메인 D 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
6.3.6.7 도메인 H
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 H는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 도메인 H는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 도메인 H는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다.
6.3.6.8 도메인 I
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 I는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다.
결합 분자의 일련의 바람직한 실시양태에서, 도메인 I는 CL 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 일련의 실시양태에서, 도메인 I는 CH1 아미노산 서열을 갖는다.
6.3.6.9 도메인 J
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 J는 CH2 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, CH2 아미노산 서열은 도메인 J를 도메인 I에 연결하는 N-말단 힌지 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
도메인 J의 C-말단은 도메인 K의 N-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 도메인 J는 CH1 아미노산 서열 또는 CL 아미노산 서열을 갖는 도메인 K의 N-말단에 연결된다.
6.3.6.10 도메인 K
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 K는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 도메인 K는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 K는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 K는 CH3 서열 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 다리를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 K는 제1 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환된다(Y349C).
특정 실시양태에서, 도메인 K는 제2 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다. 특정 실시양태에서, 제2 CH3 도메인은 E357W 돌연변이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 노브-인-홀 직교 돌연변이는 동종동질이형체 돌연변이와 조합된다. 특정 실시양태에서, 노브 돌연변이는 T366W 또는 T366Y이다. 특정 실시양태에서, 홀 돌연변이는 T366S, L368A, F405T, Y407V, 또는 Y407T로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 홀 돌연변이는 F405T이다.
특정 실시양태에서, 불변 영역 도메인 서열은 CH1 서열이다. 특정 실시양태에서, 도메인 K의 CH1 아미노산 서열은 결합 분자에서 유일한 CH1 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, CH1 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 불변 영역 서열은 CL 서열이다. 특정 실시양태에서, CL 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다.
6.3.6.11 도메인 L
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 L은 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 도메인 L은 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 도메인 L은 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
6.3.6.12 도메인 M
도 51을 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시양태에서, 도메인 M은 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 일련의 바람직한 실시양태에서, 도메인 I는 CH1 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 CL 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 일련의 바람직한 실시양태에서, 도메인 I는 CL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 CH1 아미노산 서열을 갖는다.
6.3.6.13 도메인 A와 F의 페어링
도 51에 예시된 항체 구축물에서, 도메인 "A" VL 또는 VH 아미노산 서열 및 동족 도메인 "F" VH 또는 VL 아미노산 서열은 회합되어 항원 결합 부위(ABS)를 형성한다. A:F 항원 결합 부위(ABS)는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
다양한 다가 실시양태에서, 도메인 A 및 F(A:F)에 의해 형성된 ABS는 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 ABS와 서열이 동일하고, 따라서 결합 분자 내의 하나 이상의 다른, 서열이 동일한 ABS와 동일한 인식 특이성을 갖는다.
다양한 다가 실시양태에서, A:F ABS는 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 ABS와 서열이 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, A:F ABS는 결합 분자 내의 하나 이상의 다른, 서열이 동일하지 않은 ABS의 인식 특이성과 상이한 인식 특이성을 갖는다. 특정 실시양태에서, A:F ABS는 결합 분자에서 적어도 하나의 다른, 서열이 동일하지 않은 ABS에 의해 인식되는 것과 상이한 항원을 인식한다. 특정 실시양태에서, A:F ABS는 결합 분자 내의 적어도 하나의 다른, 서열이 동일하지 않은 ABS에 의해 또한 인식되는 항원의 상이한 에피토프를 인식한다. 이들 실시양태에서, 도메인 A 및 F에 의해 형성된 ABS는 항원의 에피토프를 인식하며, 여기서 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 ABS는 동일한 항원을 인식하지만 동일한 에피토프는 인식하지 않는다.
6.3.6.14 도메인 B와 G의 페어링
도 51에 예시된 항체 구축물에서, 도메인 "B" 불변 영역 아미노산 서열 및 도메인 "G" 불변 영역 아미노산 서열은 회합된다.
일부 실시양태에서, 도메인 B 및 도메인 G는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 제1 CH3 도메인이고, 도메인 G는 제2 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시양태에서, 도메인 B는 제2 CH3 도메인이고, 도메인 G는 제1 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
다양한 실시양태에서, B 및 G 도메인의 아미노산 서열은 동일하다. 이들 중 특정 실시양태에서, 서열은 내인성 CH3 서열이다. 서열은 인간 IgG1의 CH3 서열일 수 있다. 서열은 인간 IgA로부터의 서열일 수 있다.
다양한 실시양태에서, B 및 G 도메인의 아미노산 서열은 상이하고, 내인성 CH3 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 B 도메인은 G 도메인과 상호작용하고, 여기서 B 도메인과 G 도메인은 모두 직교 변형이 결여된 CH3 도메인과 유의하게 상호작용하지 않는다.
특정 실시양태에서, CH3 서열을 함유하는 도메인 B 또는 G와, CH3 서열을 또한 함유하는 도메인 E 및 K의 원하지 않는 회합을 감소시키는 것이 바람직하다. 그러한 경우, 도메인 B 및/또는 G에서 인간 IgA로부터의 CH3 서열(IgA-CH3)을 사용하면, 이러한 바람직하지 않은 회합합을 감소시켜 항체 조립 및 안정성을 향상시킬 수 있다. 도메인 E 및 K가 IgG-CH3 서열을 포함하는 결합 분자의 일부 실시양태에서, 도메인 B 및 G는 IgA-CH3 서열을 포함한다.
6.3.6.15 도메인 E와 K의 페어링
특정 실시양태에서, 도메인 E는 제1 CH3 도메인이고, 도메인 K는 제2 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시양태에서, 도메인 E는 제2 CH3 도메인이고, 도메인 K는 제1 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시양태에서, 상이한 서열은 내인성 CH3 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 E 도메인은 K 도메인과 상호작용하고, E 도메인과 K 도메인은 모두 직교 변형이 결여된 CH3 도메인과는 유의하게 상호작용하지 않는다. 특정 실시양태에서, 직교 변형은 조작된 디설파이드 다리, 노브-인-홀 돌연변이, 및 전하쌍 돌연변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 직교 변형은 조작된 디설파이드 다리, 노브-인-홀 돌연변이 및 전하쌍 돌연변이로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 직교 변형의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 직교 변형은 동종동질이형체 돌연변이와 같은 면역원성을 감소시키는 아미노산 치환과 조합될 수 있다.
다양한 실시양태에서, E 및 K 도메인의 아미노산 서열은 동일하다.
6.3.6.16 도메인 H와 L의 페어링
다양한 실시양태에서, 도메인 H는 VL 서열을 갖고, 도메인 L은 VH 서열을 갖고, 도메인 "H" VL은 도메인 및 "L" VH 아미노산 서열은 회합되어 항원 결합 부위(ABS)를 형성한다. H:L 항원 결합 부위(ABS)는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 도메인 H는 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 CL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 L은 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 CH1 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 실시양태에서, H 도메인 및 L 도메인의 아미노산 서열은 내인성 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 H 도메인은 L 도메인과 상호작용하고, H 도메인과 L 도메인은 모두 직교 변형이 없는 도메인과 유의하게 상호 작용하지 않는다. 일련의 실시양태에서, H 도메인의 직교 돌연변이는 VL 서열에 있고, L 도메인의 직교 돌연변이는 VH 서열에 있다. 특정 실시양태에서, 직교 돌연변이는 VH/VL 계면에서의 전하쌍 돌연변이이다. 바람직한 실시양태에서, VH/VL 계면에서의 전하쌍 돌연변이는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Igawa et al. (Protein Eng. Des. Sel., 2010, vol. 23, 667-677)]에 보다 상세하게 기재된 바와 같이 VL의 상응하는 Q38K와 함께 VH의 Q39E, 또는 VL의 상응하는 Q38E와 함께 VH의 Q39K이다.
특정 실시양태에서, A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용은 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고, H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 특정 실시양태에서, A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용은 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고, H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용은 제1 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
6.3.6.17 도메인 I와 M의 페어링
다양한 실시양태에서, 도메인 I는 CL 서열을 갖고, 도메인 M은 CH1 서열을 갖는다.
다양한 실시양태에서, I 도메인 및 M 도메인의 아미노산 서열은 내인성 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 I 도메인은 M 도메인과 상호작용하고, I 도메인과 M 도메인은 모두 직교 변형이 결여된 도메인과 유의하게 상호작용하지 않는다. 일련의 실시양태에서, I 도메인의 직교 돌연변이는 CL 서열에 있고, M 도메인의 직교 돌연변이는 CH1 서열에 있다.
6.3.6.18 도메인 접합부
6.3.6.18.1 VL 및 CH3 도메인을 연결하는 접합부
다양한 실시양태에서, VL 도메인의 C-말단과 CH3 도메인의 N-말단 사이의 접합부를 형성하는 아미노산 서열은 조작된 서열이다.
특정 실시양태에서, VL 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시양태에서, A111은 VL 도메인의 C-말단에서 결실된다. 특정 실시양태에서, CH3 도메인의 N-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시양태에서, P343은 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시양태에서, P343 및 R344는 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시양태에서, VL 도메인의 C-말단 및 CH3 도메인의 N-말단 모두에 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시양태에서, A111은 VL 도메인의 C-말단에서 결실되고 P343은 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 바람직한 실시양태에서, A111 및 V110은 VL 도메인의 C-말단에서 결실된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, A111 및 V110은 VL 도메인의 C-말단에서 결실되고, CH3 도메인의 N-말단은 P343V 돌연변이를 갖는다.
6.3.6.18.2 VH 및 CH3 도메인을 연결하는 접합부
다양한 실시양태에서, VH 도메인의 C-말단과 CH3 도메인의 N-말단 사이의 접합부를 형성하는 아미노산 서열은 조작된 서열이다.
특정 실시양태에서, VH 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시양태에서, K117 및 G118은 VH 도메인의 C-말단에서 결실된다. 특정 실시양태에서, CH3 도메인의 N-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시양태에서, P343은 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시양태에서, P343 및 R344는 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시양태에서, P343, R344, 및 E345는 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산이 VH 도메인의 C-말단 및 CH3 도메인의 N-말단 모두에서 결실되거나 부가된다. 바람직한 실시양태에서, T116, K117, 및 G118은 VH 도메인의 C-말단에서 결실된다.
6.3.6.18.3 CH3 C 말단을 CH2 N 말단에 연결하는 접합부(힌지)
본원에서 설명되는 항체 구축물의 일부 실시양태에서, CH2 도메인의 N-말단은 "힌지" 영역 아미노산 서열을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 힌지 영역은 항체의 N-말단 가변 도메인-불변 도메인 세그먼트 및 항체의 CH2 도메인을 연결하는 항체 중쇄의 서열이다. 또한, 힌지 영역은 전형적으로 N-말단 가변 도메인-불변 도메인 세그먼트와 CH2 도메인 사이의 유연성뿐만 아니라, 중쇄(예를 들어, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬) 사이에 디설파이드 다리를 형성하는 아미노산 서열 모티프를 제공한다.
다양한 실시양태에서, CH3 아미노산 서열은 CH3 도메인의 C-말단과 CH2 도메인의 N-말단 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장된다. 특정 실시양태에서, CH3 아미노산 서열은 CH3 도메인의 C-말단과 힌지 영역 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되며, 상기 힌지 영역은 다시 CH2 도메인의 N-말단에 연결된다. 바람직한 실시양태에서, CH3 아미노산 서열은 CH3 아미노산 연장 서열("CH3 링커 서열" 또는 "CH3 링커")을 삽입함으로써 연장된다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열 다음에 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프가 존재한다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열의 길이는 3-10개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열의 길이는 3-8의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열의 길이는 3-6개의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 PGK 트리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGC 트리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 GEC 트리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGKC이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 PGKC이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGKGC이다. 일부 실시양태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGKGSC이다.
특정 실시양태에서, CH3 도메인의 C-말단에서의 연장은 또 다른 CH3 도메인의 직교 C-말단 연장과 함께 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CH3 도메인의 C-말단에서의 연장은 KSC 트리펩타이드 서열을 포함하고, 그 다음에는 카파 경쇄의 GEC 모티프를 포함하는 또 다른 CH3 도메인의 직교 C-말단 연장과 디설파이드 결합을 형성하는 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프가 포함된다.
도메인 B 및 G가 CH3 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자의 일부 실시양태에서, 도메인 B는 제1 CH3 링커 서열을 포함하고, 도메인 G는 제2 CH3 링커 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커 서열은 제1 및 제2 CH3 링커 서열의 시스테인 잔기 사이에 디설파이드 다리의 형성에 의해 제2 CH3 링커 서열과 회합된다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 길이가 1-6개의 아미노산만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 길이가 1-3개의 아미노산만큼 상이하다.
바람직한 실시양태에서, 제1 CH3 링커는 AGC이고, 제2 CH3 링커는 AGKGSC이다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커는 AGKGC이고, 제2 CH3 링커는 AGC이다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커는 AGKGSC이고, 제2 CH3 링커는 AGC이다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 링커는 AGKC이고, 제2 CH3 링커는 AGC이다.
6.3.6.18.4 CL C-말단과 CH2 N-말단을 연결하는 접합부(힌지)
다양한 실시양태에서, CL 아미노산 서열은 그의 C-말단을 통해 힌지 영역에 연결되고, 상기 힌지 영역은 다시 CH2 도메인의 N-말단에 연결된다.
6.3.6.18.5 CH2 C-말단을 불변 영역 도메인에 연결하는 접합부
다양한 실시양태에서, CH2 아미노산 서열은 그의 C-말단을 통해 불변 영역 도메인의 N-말단에 연결된다. 바람직한 실시양태에서, CH2 서열은 그의 내인성 서열을 통해 CH3 서열에 연결된다. 다른 실시양태에서, CH2 서열은 CH1 또는 CL 서열에 연결된다. CH2 서열을 CH1 또는 CL 서열에 연결하는 것을 논의하는 예는 미국 특허 제8,242,247호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
6.3.6.19 2가 이중특이적 B-바디 "BC1"
도 51을 참조하면, 일련의 실시양태에서, 항체 구축물은 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 T366K 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 KSC 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산을 갖고; (b) 제2 폴리펩타이드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 L351D 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; (c) 제3 폴리펩타이드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩타이드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 CH1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 및 제2 폴리펩타이드는 A와 F 도메인 사이의 상호작용 및 B와 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 및 제4 폴리펩타이드는 H와 L 도메인 사이의 상호작용 및 I와 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 및 제3 폴리펩타이드는 D와 J 도메인 사이의 상호작용 및 E와 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A 및 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H 및 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 상기 구축물의 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.3.6.20 2가 이중특이적 B-바디 "BC6"
도 51을 참조하면, 일련의 실시양태에서, 결합 분자는 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 KSC 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산을 갖고; (b) 제2 폴리펩타이드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; (c) 제3 폴리펩타이드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩타이드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 및 제2 폴리펩타이드는 A와 F 도메인 사이의 상호작용 및 B와 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 및 제4 폴리펩타이드는 H와 L 도메인 사이의 상호작용 및 I와 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 및 제3 폴리펩타이드는 D와 J 도메인 사이의 상호작용 및 E와 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A 및 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H 및 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.3.6.21 2가 이중특이적 B-바디 "BC28"
도 51을 참조하면, 일련의 실시양태에서, 결합 분자는 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 Y349C 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산을 갖고; (b) 제2 폴리펩타이드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 S354C 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; (c) 제3 폴리펩타이드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩타이드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 CH1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 및 제2 폴리펩타이드는 A와 F 도메인 사이의 상호작용 및 B와 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 및 제4 폴리펩타이드는 H와 L 도메인 사이의 상호작용 및 I와 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 및 제3 폴리펩타이드는 D와 J 도메인 사이의 상호작용 및 E와 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A 및 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H 및 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 B:G 페어링된 도메인 또는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.3.6.22 2가 이중특이적 B-바디 "BC44"
도 51을 참조하면, 일련의 실시양태에서, 결합 분자는 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 Y349C 돌연변이, P343V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 돌연변이 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (b) 제2 폴리펩타이드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 S354C 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 갖고; (c) 제3 폴리펩타이드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 Y349C, T366S, L368A 및 aY407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩타이드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 및 제2 폴리펩타이드는 A와 F 도메인 사이의 상호작용 및 B와 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 및 제4 폴리펩타이드는 H와 L 도메인 사이의 상호작용 및 I와 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 및 제3 폴리펩타이드는 D와 J 도메인 사이의 상호작용 및 E와 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A 및 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H 및 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 B:G 페어링된 도메인 또는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.4. 항원 특이성
6.4.1. B7H3
본원에서 개시되는 항체 구축물은 분화 클러스터 276(CD276)으로도 공지된 B7 동족체 3(B7H3)에 특이적인 항원 결합 부위(ABS)를 갖는다.
일부 실시양태에서, B7H3은 표적 종양 세포 상의 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에서, 표적 종양 세포는 신경모세포종, 흑색종, 육종 또는 소세포 폐암이다.
바람직한 실시양태에서, 본원에서 개시되는 항체 구축물은 B7H3에 특이적으로 결합하는 제1 ABS를 포함한다.
6.4.2. GD2
본원에서 개시되는 항체 구축물은 디시알로강글리오사이드(GD2)에 특이적인 항원 결합 부위(ABS)를 갖는다.
일부 실시양태에서, GD2는 표적 종양 세포 상의 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에서, 표적 종양 세포는 신경모세포종, 흑색종, 육종 또는 소세포 폐암이다.
바람직한 실시양태에서, 본원에서 개시되는 항체 구축물은 GD2에 특이적으로 결합하는 제2 ABS를 포함한다.
6.5. 실시예
아래에서 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 실시양태의 예를 제시한다. 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 약간의 실험적 오류와 편차는 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술 분야의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세하게 설명되어 있다.
6.5.1. 실시예 1 - INV721 항체
본 발명자들은 제1 종양 세포 표면 항원인 B7 동족체 3(B7H3) 및 제2 종양 세포 표면 항원인 디시알로강글리오사이드(GD2)에 특이적인, "INV721"로 명명된 신규한 2가 이중특이적 항체를 구축하였다. B7H3에 특이적인 항원 결합 부위(ABS)는 서열 번호 2의 중쇄 가변 영역(VH) 서열 및 서열 번호 1의 경쇄 가변 영역 서열(VL)을 포함한다. GD2에 특이적인 항원 결합 부위(ABS)는 서열 번호 4의 VH 서열 및 서열 번호 3의 VL 서열을 포함한다.
보다 상세하게는, 도 51에 따른 도메인 및 폴리펩타이드 사슬에서, INV721의 구조는 다음과 같다:
제1 폴리펩타이드 사슬:
도메인 A=VL(B7H3 결합제)(서열 번호 1)
도메인 B=CH3
도메인 D=CH2
도메인 E=CH3
제2 폴리펩타이드 사슬:
도메인 F=VH(B7H3 결합제)(서열 번호 2)
도메인 G=CH3
제3 폴리펩타이드 사슬:
도메인 H=VL(GD2 결합제)(서열 번호 3)
도메인 I=CL(카파)
도메인 J=CH2
도메인 K=CH3
제4 폴리펩타이드 사슬:
도메인 L=VH(GD2 결합제)(서열 번호 4)
도메인 M=CH1.
A 도메인 및 F 도메인은 회합하여 B7H3에 특이적인 항원 결합 부위(A:F)를 형성한다. H 도메인 및 L 도메인은 회합하여 GD2에 특이적인 항원 결합 부위(H:L)를 형성한다.
도 51을 참조하면, INV721의 B7H3 결합 아암은 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. B7H3 결합 아암은 I7-01이다.
도 51을 참조하면, INV721의 GD2 결합 아암은 제3 폴리펩타이드 사슬 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, GD2 결합 아암은 GD2-5이다. 일부 바람직한 실시양태에서, GD2 결합 아암은 GD2-7이다.
INV721은 100 ㎍/mL보다 높은 농도에서 포유동물 발현을 사용하여 높은 수준으로 쉽게 발현될 수 있었다. 본 발명자들은 2가 이중특이적 INV721 단백질이 표준 항체 정제 방법을 사용하여 정제될 수 있음을 발견하였다.
6.5.2. 실시예 2 - 암세포에서 INV721의 시험관내 결합
B7H3 및 GD2를 발현하는 B78 흑색종 종양 세포를 (1) INV721, (2) B7H3에 특이적인 ABS 및 비특이적 ABS를 포함하는 항체 구축물, 또는 (3) GD2에 특이적인 ABS 및 비특이적 ABS를 포함하는 항체 구축물과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 2차 항-인간 IgG 항체와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다.
도 52a에 나타낸 결과는 B78 종양 세포에 대한 INV721의 강한 결합이 관찰되었음을 입증한다. B78 종양 세포에 대한 더 낮은 친화도 결합은 B7H3 또는 GD2에 특이적인 ABS만을 포함하는 항체에 대해 관찰되었다. 이에 비해, 1가 항-B7H3 항체는 1가 항-GD2 항체보다 높은 친화도로 B78 종양 세포에 결합하지만, INV721보다는 낮은 친화도로 결합한다.
GD2를 발현하지만 B7H3을 발현하지 않는 B78 흑색종 종양 세포를 상기 기재된 바와 같이 (1), (2) 및 (3)과 함께 인큐베이션하였다. 도 52b에 나타낸 결과는 GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 종양 세포에 매우 적은 INV72가 결합한다는 것을 입증한다.
신경모세포종 및 육종 종양으로부터 기원하는 세포주를 포함하는 다른 인간 흑색종 및 소아암 세포주를 GD2 및 B7H3 발현에 대해 평가하고, INV721 결합에 대해 시험하였다. 도 53 및 도 54에 보고된 결과는 1백만 개의 세포당 1 ㎍의 INV721과 함께 인큐베이션될 때, GD2 발현에 관계없이 높은 B7H3 발현을 갖는 평가된 모든 암 세포주에 INV721이 결합함을 나타낸다.
6.5.3. 실시예 3 - 항-B7H3 및 항-GD2 모노클로날 항체와 비교한 INV721의 내재화
항체 의존성 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)에 의해 종양 세포 사멸을 매개하는 치료 항체의 효능은 항체의 세포 내로의 내재화에 의해 감소될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 INV721 및 치료 항-GD2 항체 디누툭시맙 및 hu14.18의 세포 내재화를 평가하였다.
INV721의 내재화를 GD2를 고도로 발현하는 다양한 신경모세포종 세포주에서 평가하고, 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙, hu14.18, 및 GD2-5(INV721의 GD2 결합 아암 포함)의 내재화와 비교하였다. INV721의 내재화를 또한 LAN-1 세포에서 항-B7H3 모노클로날 항체 I7-01(INV721의 B7H3 결합 아암 포함)과 비교하였다.
도 55a-c의 결과는 INV721("I7-01/GD2-5/7")의 내재화가 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙 및 hu14.18과 비교하여 최소임을 도시한 것이다. 또한, 항-GD2 항체 GD2-5의 내재화는 CHLA20, LAN-1 및 NGP 신경모세포종 세포주에서 거의 관찰되지 않았다. 항-B7H3 항체 I7-01의 내재화는 GD2 및 B7H3 모두를 발현하는 LAN-1 세포에서 관찰되지 않았다.
6.5.4. 실시예 4 - INV721 처리 후 종양 성장의 시험관내 평가
INV721 처리 후의 종양 성장을 평가하기 위해, INV721의 존재 또는 부재 하에 B78 흑색종 종양 세포에 대해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정을 수행하였다. 간단히 설명하면, mKate2 태그 부착되고 GD2 및/또는 B7H3으로 형질도입된 핵 국소화 서열을 발현하는 B78 흑색종 종양 세포를 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하고, 종양 스페로이드(spheroid)를 형성하도록 하였다. 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 항체(hu14.18, INV721, 음성 대조군으로서의 리툭시맙, 또는 배지 단독)와 함께 종양 스페로이드에 첨가하였다. 처리된 종양 스페로이드는 IncuCyte 세포 이미징 시스템을 사용하여 이미지화되었다. 스타우로스포린은 양성 대조군으로서 포함되었다. 직접적인 항체 매개 아폽토시스를 시험하기 위해 종양 스페로이드를 PBMC 없이 인큐베이션하였다.
ADCC 검정의 결과는 도 56a 및 도 56b에 제시되어 있다. 도 56a에서, PBMC 단독(왼쪽 컬럼, "배지")과 비교하여 INV721 및 PBMC(오른쪽 컬럼)로 처리한 후에 밝은 조밀한 신호의 분산은 INV721이 ADCC를 통해 종양 성장을 억제한다는 것을 입증한다. INV721 또는 항-GD2 모노클로날 항체 Hu14.18로 처리된 종양 스페로이드에서 ADCC 검정의 결과는 hu14.18과 비교하여 INV721의 효능이 더 큼을 입증한다(도 56b).
직접적인 항체 매개 아폽토시스의 결과는 도 57a-57c에 제시되어 있다. B7H3을 발현하는 세포는 INV721 및 PBMC와 함께 인큐베이션한 후에 시간이 지남에 따라 사멸된다(도 57a 및 도 57c). GD2를 고도로 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 세포는 INV721 및 PBMC와의 인큐베이션 후에 사멸되지 않는다(도 57b).
6.5.5. 실시예 5 - 항-B7H3 및 항-GD2 모노클로날 항체와 비교한 INV721의 시험관내 평가
B7H3 및 GD2를 모두 발현하는 다양한 흑색종 암 세포주에서 INV721 및 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙 및 hu14.18의 효능을 평가하기 위해 ADCC 검정을 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 58a에 나타낸 결과는 INV721이 M21 세포에서 디누툭시맙 또는 Hu14.18보다 더 큰 효능을 갖는다는 것을 입증한다. 도 58b-c에 나타낸 결과는 INV721이 Mel7(도 58b) 및 Mel13(도 58c) 세포에서 적어도 디누툭시맙 및 Hu14.18만큼 효과적임을 입증한다.
B7H3 및 GD2를 모두 발현하는 M21 세포에서 INV721, 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙 및 GD2-7, 및 항-B7H3 항체 I7-01의 효능을 평가하기 위해 추가의 ADCC 검정을 수행하였다. 도 59에 나타낸 결과는 INV721 및 GD2-7이 디누툭시맙보다 사멸에 보다 효과적임을 입증한다. I7-01은 거의 INV721만큼 효과적이다.
6.5.6. 실시예 6 - INV721 결합의 생체내 평가
생체 내에서 INV721의 결합을 평가하기 위해, 차등 B7H3 및 GD2 발현을 갖는 4개의 B78 종양을 보유하는 마우스를 지르코늄 방사성 표지된(89Zr) 디누툭시맙, INV721, 또는 비특이적 대조군 항체(BB-WT)로 처리하고, 양전자 방출 단층 촬영(PET) 이미지에 의해 평가하였다. 도 60에 도시된 바와 같이, 위에서 보았을 때 코가 위쪽에 있고 꼬리가 아래쪽에 있는 엎드린 자세의 마우스에 대해: GD2 및 B7H3을 모두 발현하는 종양은 오른쪽 하단에 있고, GD2는 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 종양은 왼쪽 하단에 있고, B7H3을 발현하지만 GD2는 발현하지 않는 종양은 왼쪽 상단에 있고, GD2 및 B7H3 발현에 대해 대부분 음성이었지만 두 항원 모두의 일부 발현이 있는 종양은 오른쪽 상단에 있었다.
도 61의 결과는 INV721의 흡수가 GD2/B7H3 이중 양성 종양(상부 패널, 각각의 마우스의 오른쪽 하단) 및 B7H3을 고도로 발현하지만 GD2 음성인 종양(상부 패널, 각각의 마우스의 왼쪽 상단)에서 가장 높았음을 보여준다. INV721의 최소 흡수는 높은 수준의 GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 종양에서 관찰된다(상부 패널, 각각의 마우스의 왼쪽 하단). 이와 대조적으로, 디누툭시맙의 높은 흡수는 GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 종양에서 볼 수 있다(하부 패널, 각각의 마우스의 왼쪽 하단).
도 62a-62d의 그래프는 종양 그램당 투여당 주사된 89Zr-표지된 항체의 활성의 비를 보여준다. INV721은 GD2 및 B7H3 모두를 발현하는 종양에서 디누툭시맙에 비해 증가된 흡수를 보여준다(도 62d). INV721의 흡수는 B7H3을 발현하지만 GD2는 발현하지 않는 종양에서도 관찰된다(도 62a). GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 종양에서는 디누툭시맙의 흡수가 관찰되지만, INV721의 흡수는 관찰되지 않는다(도 62c).
척추에 결합하여 통증 독성에 기여할 수 있는 항체의 양을 평가하기 위해, 종양 그램당 투여당 주사된 89Zr 표지된 항체의 활성의 비를 처리된 동물에서 시간 경과에 따라 척추 영역 단독에 대해 측정하였다(도 63a). 도 63b의 결과는 항-GD2 모노클로날 항체 디누툭시맙과 비교하여 상당히 적은 INV721이 처리된 동물의 척추에 결합함을 보여준다.
6.5.7. 실시예 7 - INV721 효능의 생체내 평가
생체 내에서 INV721의 효능을 평가하기 위해, GD2 및 B7H3을 발현하는 B78 흑색종 종양을 보유하는 마우스를 방사선 요법으로 처리한 후, INV721 및/또는 IL-2로 처리하고, 종양 성장 및 생존에 대해 모니터링하였다. 간단히 설명하면, B7H3 및 GD2를 발현하는 75 mm3의 B78 종양을 보유하는 마우스를 무작위로 선발하여 제0일에 방사선 요법(12 Gγ)을 실시한 후, 제5-9일에 INV721(40 ㎍/투여) 및/또는 IL-2(75,000 U/투여)를 투여하였다(도 64). 그 결과는 방사선 요법, INV721 및 IL-2로 처리된 마우스가 다른 처리 그룹과 비교하여 개선된 반응을 보였고, 종양 성장이 느려지고, 종양이 없는 생존이 개선되었으며(도 65 및 도 66), 또한 생존이 전반적으로 개선되었음을 보여주었다(도 67). 도 66의 결과는 푸코실화된 INV721(모든 이전 연구에서 사용됨)과 비교하여 α-푸코실화된 INV721의 개선된 효능을 입증한다.
7. 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
8. 균등물 및 참조에 의한 포함
본원에서 언급되는 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예를 들어, Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원 또는 특허가 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 참조에 의한 통합이라는 상기 설명은 신청자에 의해 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라, 이러한 언급이 참조에 의한 통합이라는 전용 설명에 바로 인접하지 않는 경우에도 그 각각이 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명확하게 확인되는 각각의 모든 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예를 들어, Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원 또는 특허에 관련되는 것으로 의도된다. 명세서 내에 참조에 의한 통합이라는 전용 설명의 포함(있는 경우)은 참조에 의한 통합에 대한 상기 일반적인 설명을 어떤 식으로도 약화하지 않는다. 본 명세서에서 참고문헌의 언급은 참고문헌이 관련 선행 기술임을 인정하는 것이 아니며, 또한 이러한 간행물 또는 문헌의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 승인도 구성하지 않는다.
본 발명이 바람직한 실시양태 및 다양한 대안적인 실시양태를 참조하여 구체적으로 제시되고 설명되었지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> WIN THERAPEUTICS, INC. INVENRA INC. WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION <120> BISPECIFIC GD2 AND B7H3 BINDING MOLECULES AND METHODS OF USE <130> 38327-42809/WO (011WO) <140> PCT/US2021/018939 <141> 2021-02-20 <150> 62/979,245 <151> 2020-02-20 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Arg Ser Leu Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 10 <210> 49 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Lys Val 1 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Leu 1 5 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn 1 5 10 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Gly Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Thr Gly Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr Asn 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr 1 5 10 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Trp Val Ala Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 8 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Synthetic polypeptide <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 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Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Ile Gln Met Thr 435 440 445 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 450 455 460 Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr 465 470 475 480 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 485 490 495 His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 500 505 510 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 515 520 525 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro 530 535 540 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 545 550 555 560 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser 565 570 575 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 580 585 590 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 595 600 605 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 610 615 620 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 625 630 635 640 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 645 650 655 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 660 <210> 72 <211> 583 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Ser Leu Gln Pro 435 440 445 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro 450 455 460 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 465 470 475 480 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser 485 490 495 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 500 505 510 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 515 520 525 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 530 535 540 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 545 550 555 560 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 565 570 575 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 580 <210> 73 <211> 583 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Ser Leu Gln Pro 435 440 445 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro 450 455 460 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 465 470 475 480 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser 485 490 495 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 500 505 510 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 515 520 525 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 530 535 540 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 545 550 555 560 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 565 570 575 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 580 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Asp Lys Thr His Thr 1 5 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Ala Gly Lys Cys 1 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Pro Gly Lys Cys 1 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Ala Gly Lys Gly Cys 1 5 <210> 78 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Ala Gly Lys Gly Ser Cys 1 5

Claims (27)

  1. 제1 종양 세포 표면 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위(ABS) 및
    제2 종양 세포 표면 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위(ABS)
    를 포함하는 다중 특이적 항체 구축물로서,
    제1 종양 세포 항원은 B7 동족체 3(B7H3)이고, 제2 종양 세포 항원은 디시알로강글리오사이드(GD2)인 다중 특이적 항체 구축물.
  2. 제1항에 있어서, 제1 ABS는 10 nM보다 큰 KD로 인간 B7H3에 결합하고, 제2 ABS는 10 nM보다 큰 KD로 인간 GD2에 결합하고, 항체 구축물은 B7H3 및 GD2를 발현하는 종양 세포에 100 nM 미만의 KD로 결합하는 다중 특이적 항체 구축물.
  3. 제2항에 있어서, GD2 및 B7H3 모두를 발현하는 세포와 비교하여 GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 세포에 대해 더 낮은 결합을 나타내는 다중 특이적 항체 구축물.
  4. 제3항에 있어서, GD2를 발현하지만 B7H3은 발현하지 않는 세포에 대한 항체 의존성 세포독성(ADCC) 활성과 비교하여 B7H3 및 GD2를 발현하는 세포에 대한 더 큰 ADCC 활성을 갖는 다중 특이적 항체 구축물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대등한 농도에서 디누툭시맙과 비교하여 신경 세포에 덜 결합하는 다중 특이적 항체 구축물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ABS가
    a) 제1 중쇄 가변 영역(VH) CDR1,
    b) 제1 VH CDR2,
    c) 제1 VH CDR3,
    d) 제1 경쇄 가변 영역(VL) CDR1,
    e) 제1 VL CDR2, 및
    f) 제1 VL CDR3
    을 포함하는 것인 다중 특이적 항체 구축물.
  7. 제6항에 있어서, 제1 ABS가
    a) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 VH CDR1,
    b) 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 제1 VH CDR2,
    c) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 제1 VH CDR3,
    d) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 제1 VL CDR1,
    e) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 제1 VL CDR2, 및
    f) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 제1 VL CDR3
    을 포함하는 것인 다중 특이적 항체 구축물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ABS가
    서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및
    서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 제1 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는 것인 다중 특이적 항체 구축물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 ABS가
    a) 제2 중쇄 가변 영역(VH) CDR1,
    b) 제2 VH CDR2,
    c) 제2 VH CDR3,
    d) 제2 경쇄 가변 영역(VL) CDR1,
    e) 제2 VL CDR2, 및
    f) 제2 VL CDR3
    을 포함하는 것인 다중 특이적 항체 구축물.
  10. 제9항에 있어서, 제2 ABS가
    a) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 제2 VH CDR1,
    b) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 제2 VH CDR2,
    c) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 갖는 제2 VH CDR3,
    d) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 제2 VL CDR1,
    e) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 제2 VL CDR2, 및
    f) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖는 제2 VL CDR3
    을 포함하는 것인 다중 특이적 항체 구축물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 ABS가
    서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및
    서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 제2 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는 것인 다중 특이적 항체 구축물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 구축물이 제1 폴리펩타이드 사슬, 제2 폴리펩타이드 사슬, 제3 폴리펩타이드 사슬 및 제4 폴리펩타이드 사슬을 갖고,
    (a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 포함하고, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E는 각각 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) 제2 폴리펩타이드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) 제3 폴리펩타이드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K는 각각 불변 영역 아미노산 서열을 갖고;
    (d) 제4 폴리펩타이드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 불변 영역 아미노산 서열 또는 그의 일부를 포함하고;
    (e) 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용 및 B 도메인과 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고;
    (f) 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드는 H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용 및 I 도메인과 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고;
    (g) 제1 폴리펩타이드 및 제3 폴리펩타이드는 D 도메인과 J 도메인 사이의 상호작용 및 E 도메인과 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되는 것인 항체 구축물.
  13. 제12항에 있어서,
    도메인 A는 VL 도메인이고;
    도메인 B는 CH3 도메인을 포함하고;
    도메인 D는 CH2 도메인이고;
    도메인 E는 CH3 도메인이고;
    도메인 F는 VH 도메인이고;
    도메인 G는 CH3 도메인을 포함하고;
    도메인 H는 VL 도메인이고;
    도메인 I는 CL 도메인이고;
    도메인 J는 CH2 도메인이고;
    도메인 K는 CH3 도메인이고;
    도메인 L은 VH 도메인이고;
    도메인 M은 CH1 도메인인 항체 구축물.
  14. 제13항에 있어서,
    도메인 D 및 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 도메인의 아미노산 서열을 갖고;
    도메인 I는 인간 C 카파 경쇄의 아미노산 서열을 갖고;
    도메인 M은 인간 IgG1 CH1 영역의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 구축물.
  15. 제14항에 있어서,
    도메인 B는 T366K 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 KSC 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고;
    도메인 G는 L351D 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 구축물.
  16. 제14항에 있어서,
    도메인 B는 CH3 아미노산 서열, 및 KSC 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고;
    도메인 G는 CH3 아미노산 서열, 및 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 구축물.
  17. 제14항에 있어서,
    도메인 B는 Y349C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고;
    도메인 G는 S354C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 구축물.
  18. 제14항에 있어서,
    도메인 B는 P343V 돌연변이, Y349C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖고;
    도메인 G는 S354C 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열, 및 PGK 트리펩타이드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 갖고;
    도메인 K는 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 선택적으로 D356E 및 L358M 돌연변이를 갖는 CH3 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 구축물.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ABS가 도메인 A 및 도메인 F에 의해 형성되고, 제2 ABS가 도메인 H 및 도메인 L에 의해 형성되는 것인 항체 구축물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제에 접합되는 항체 구축물.
  21. 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 다중 특이적 항체 구축물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 인간 대상체에게 제21항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 증식성 질환을 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 증식성 질환이 암인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 암이 신경모세포종, 교모세포종, 소세포 폐암 또는 육종인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 항-GD2 모노클로날 항체를 사용한 치료와 비교하여 통증 감소를 유도하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항-GD2 모노클로날 항체가 디누툭시맙 또는 hu14.18인 방법.
  27. 제21항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 세포를 선택적으로 표적화하는 방법.
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