KR20230013234A - 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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이윤미
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Abstract

본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분은 호흡기 세포인 기관지 상피세포에서 염증성 케모카인인 RANTES의 생성량을 감소시키며, LPS 유도에 의해 손상된 세포를 보호하는 효과가 있으며, 염증성 사이토카인 IL-6 발현량을 감소시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 폐손상 동물모델에서 호중구 수를 감소시키고, 염증성 사이토카인 또는 케모카인의 발현량을 조절할 수 있으므로, 호흡기질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품; 호흡기질환의 예방 또는 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating respiratory disease comprising fermented Centella asiatica extract as effective component}
본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분을 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기비염, 진해 거담, 급만성기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염, 후두염 등은 호흡기질환의 대표적인 질환이다. 천식(asthma)은 기도, 특별히, 기관지에 생기는 만성 염증을 일컫는다. 천식으로 인해 유발되는 염증은 매연, 알레르기성 항원, 찬바람, 운동, 호흡기 감염 등 매우 다양한 소인에 의하여 악화될 수 있으며, 지속적인 염증은 기도의 변형 및 기도의 과민성(hyper-responsiveness)을 야기한다. 이러한 원인들에 의하여 천명(wheezing, 기도가 좁아져 쌕쌕거리거나 가랑가랑하는 호흡음이 나타나는 증상)이나, 숨이 차고 기침이 나며, 과도한 객담이 배출되는 등의 일반적인 증상이 나타난다.
호흡기도는 크게 점막과 기관지평활근이라는 근육으로 이루어져 있고 점막에는 많은 분비샘들이 있어 필요한 분비물을 계속 분비하고 있으며 기관지 평활근이 수축하면 호흡기도가 좁아지게 된다. 매연, 알레르기성 항원, 찬바람, 운동, 호흡기 감염 등 매우 다양한 소인에 의하여 염증반응이 일어나면 분비샘에서 나오는 분비물이 더욱 증가하게 되고 이 분비물이 기도를 막아 점막이 기도 안쪽으로 부어오르게 되어 기도를 더욱 좁게 만든다. 이로 인해, 천명을 동반한 발작적인 기침과 호흡곤란이 심하게 나타나며, 발작 시에는 마른기침이 발생되고 흉부압박감을 느끼게 된다. 천명이 없이 만성적 기침과 흉부압박감이 있는 원인을 알 수 없는 호흡곤란 증상만 있는 천식도 많은데 이 증상들은 일상생활 중에서 갑자기 발작적으로 나타나는 경향이 있다.
한편, 병풀(Centella asiatica)은 한반도 남부 섬의 산이나 들에 흔히 나는 여러해살이풀이다. 원줄기는 옆으로 뻗고, 뿌리가 내리는 마디 근처에 2개의 퇴화된 비늘 모양의 잎이 있다. 잎은 마디에서 밀생하고, 신장형, 지름 2~5cm, 표면은 광택이 나고, 가장자리에 둔한 톱니가 있으며, 잎자루의 길이는 4~20cm이다. 꽃은 홍자색, 잎겨드랑이에 3~4송이씩 산형꽃차례로 달리며, 머리 모양이다. 암술대는 2갈래이며, 열매는 분과의 편원형이다. 인도에서는 상처를 입은 호랑이가 병풀이 많이 난 곳에서 뒹굴어 치료하는 것을 보고 호랑이풀이라고 부르며, 오래전부터 약으로 사용하였다. 병풀의 잎과 줄기에 있는 마데카식산이란 성분이 염증을 낫게 하고, 종양과 궤양 등의 상처를 치유하는 힘이 있다는 게 밝혀지면서 연고, 치약 또는 화장품 등의 원료로 쓰인다.
병풀 관련 기술로, 한국공개특허 제2003-0024932호에 병풀 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관해 개시되어 있고, 한국등록특허 제1591872호에 항염, 항알러지 및 항산화 효능이 우수한 Ge-8 혼합물을 함유하는 화장료 조성물이 개시되어 있으나, 아직까지는 본 발명의 병풀 발효 추출물을 유효성분을 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분을 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 본 발명의 유효성분은 호흡기 세포인 기관지 상피세포에서 염증성 케모카인인 RANTES의 생성량을 감소시키며, LPS 유도에 의해 손상된 세포를 보호하는 효과가 있으며, 염증성 사이토카인 IL-6 발현량을 감소시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 폐손상 동물모델에서 호중구 수를 감소시키고, 염증성 사이토카인 또는 케모카인의 발현량을 조절한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분은 호흡기 세포인 기관지 상피세포에서 염증성 케모카인인 RANTES의 생성량을 감소시키며, LPS 유도에 의해 손상된 세포를 보호하는 효과가 있으며, 염증성 사이토카인 IL-6 발현량을 감소시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 폐손상 동물모델에서 호중구 수를 감소시키고, 염증성 사이토카인 또는 케모카인의 발현량을 조절할 수 있다.
도 1은 기관지 상피세포에서 본 발명의 병풀 발효 추출물의 처리에 따른 RANTES 생성 억제에 의한 항염효과를 확인한 것이다. *, **, ***은 TNF-α 처리군 대비 본 발명의 병풀 발효 추출물 처리군의 RANTES 생성량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이며, **는 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
도 2는 기관지 상피세포에서 본 발명의 병풀 발효 추출물의 처리에 따른 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 LPS 처리에 의해 손상된 기관지 상피세포에서 본 발명의 병풀 발효 추출물의 처리에 따른 세포보호 효과를 확인한 결과이다. #은 아무것도 처리하지 않은 대조군(CON) 대비 LPS 처리군의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이며, *은 LPS 처리군 대비 본 발명의 병풀 발효 추출물 처리군의 세포생존율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 4는 기관지상피세포 BEAS-2B 세포에서 LPS로 염증을 유도한 후, 본 발명의 병풀 발효 추출물의 처리에 따른 염증성 사이토카인 IL-6 발현량 변화를 확인한 결과이다. ###은 아무것도 처리하지 않은 대조군(CON) 대비 LPS 처리군의 IL-6의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이며, **은 LPS 처리군 대비 병풀 에탄올 추출물(CA2) 및 본 발명의 병풀 발효 추출물(CA3~5) 처리군의 IL-6의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.01이며, $, $$는 병풀 에탄올 추출물(CA2) 처리군 대비 본 발명의 병풀 발효 추출물(CA4, CA5) 처리군의 IL-6의 발현량이 통계적으로 유의미하게 더 감소하였다는 것으로, $는 p<0.05이고, $$는 p<0.01이다.
도 5는 폐 손상 동물모델에서, 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물을 투여한 군에서 분리된 기관지폐포 세척액(BALF) 내 총 호중구 세포수를 확인한 Diff-Quick 염색 결과로, (A)는 정상군, (B) 폐 손상 대조군, (C) 100mg/kg의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군, (D)는 200mg/kg의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군 및 (E)는 양성대조군인 덱사메타손 투여군이다.
도 6은 폐 손상 동물모델에서, 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물을 투여한 군에서 분리된 기관지폐포 세척액(BALF) 내 총 호중구 세포수를 확인한 그래프이다. ###은 정상군(Balb/c Normal) 대비 대조군(COPD_CTL)의 호중구 세포수가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, ***은 대조군 대비 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물을 투여한 군(COPD_CA4)에서 통계적으로 유의미하게 호중구 세포수가 감소하였다는 것으로, p<0.001이다.
도 7은 폐 손상 동물모델에서, 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물을 투여한 군에서 분리한 폐포 세척액(BALF)에서 케모카인 및 사이토카인 MIP2, IL-1α, CXCL-1, IL-17 및 TNF-α의 생성량 변화를 확인한 ELISA 결과이다. ##, ###은 정상군(Balb/c Normal) 대비 폐 손상 대조군(COPD_CTL)의 MIP2, IL-1α, CXCL-1, IL-17 및 TNF-α 생성량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이며, *, **은 폐 손상 대조군 대비 양성대조군 또는 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군의 MIP2, IL-1α, CXCL-1, IL-17 및 TNF-α 생성량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
도 8은 폐 손상 동물모델에서, 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물을 투여한 군에서 분리한 폐 조직 내 케모카인 및 사이토카인(MUC5AC, TNF-α, CXCL-1 및 MIP2) 유전자 발현량 변화를 확인한 ELISA 결과이다. ##, ###은 정상군(Balb/c Normal) 대비 폐 손상 대조군(COPD_CTL)의 MUC5AC, TNF-α, CXCL-1 및 MIP2 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이며, *, **은 폐 손상 대조군 대비 양성대조군 또는 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군의 MUC5AC, TNF-α, CXCL-1 및 MIP2 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 병풀 발효 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
1) 병풀 분말에 물을 가하여 멸균하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 상온으로 식혀 발효균을 첨가하고 25~50℃에서 발효하여 병풀 발효물을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 병풀 발효물에 추출용매를 첨가하여 추출하는 단계.
상기 단계 2)에서, 상온은 바람직하게 15~25℃일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 발효물을 제조하는 시간은 2~4일 동안이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 단계 2)에서 첨가한 발효균은 유산균, 효모 또는 누룩이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 유산균은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophillus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 메센테로이드스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 중에서 선택된 하나 이상의 유산균인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 메센테로이드스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 이루어진 복합 유산균이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 단계 3)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 발효 병풀 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 10~18배 첨가하는 것이고, 더욱더 바람직하게는 15배 첨가하는 것이다. 추출온도는 20~120℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 1~48시간인 것이 바람직하며, 1~24시간이 더욱 바람직하고, 2시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 농축은 진공 회전 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 병풀 발효 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 병풀 발효 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 카라멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01~0.04g인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02~0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 주사 또는 피부에 도포하는 방법으로 투여할 수 있는 것이다. 상기 피부에 도포하는 경우는 연고제, 첩부제 또는 분무제의 제형으로 제조된 것을 이용하는 것이 람직하다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제에 관한 것이다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 수의학적 조성물의 유효한 양은 동물의 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강상태 또는 성별에 따른 본 발명의 유효성분에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 수의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 병풀 발효 추출물, 병풀 추출물 및 병풀 추출 발효물의 제조
(1) 병풀(유산균, 누룩 및 효모) 발효 후, 에탄올 추출물의 제조
발효에 사용된 유산균은 복합 유산균을 이용하였으며, 상기 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 메센테로이드스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 이루어진 것이다. 400㎖의 증류수를 첨가하여 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 상온으로 식힌 상기 병풀에, MRS broth에서 배양한 1×104 cfu/㎖의 복합 유산균 20㎖을 첨가한 후, 32℃에서 3일 동안 발효시키고, 60℃에서 건조하여 병풀 유산균 발효물을 제조하였다.
또한, 상기 복합 유산균 대신에 10g의 누룩 또는 2g의 효모를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로, 병풀 누룩 발효물 및 병풀 효모 발효물을 제조하였다.
상기 병풀 누룩 발효물, 병풀 유산균 발효물 및 병풀 효모 발효물을 70%(v/v) 에탄올로 추출하여 병풀 누룩 발효 추출물(CA3), 병풀 유산균 발효 추출물(CA4) 및 병풀 효모 발효 추출물(CA5)을 제조하였다.
(2) 병풀 물 또는 에탄올 추출물
병풀 물 추출물은 200g의 병풀을 분쇄한 후, 물 2ℓ를 첨가하여 열수 추출하였고(CA1), 병풀 에탄올 추출물은 200g의 병풀을 분쇄한 후, 70%(v/v) 에탄올 2ℓ를 첨가하여 병풀 에탄올 추출물을 획득하였다(CA2). 이를 호흡기 질환에 대한 효능평가에서 비교예로 사용하였다.
(3) 병풀 에탄올 추출물의 제조 및 이의 병풀 유산균, 누룩 및 효모 발효물의 제조
상기 획득한 병풀 에탄올 추출물을 감압농축한 후 500㎖의 멸균수를 첨가하고, 여기에 MRS broth에서 배양한 1×104cfu/㎖의 복합 유산균 20㎖을 첨가한 후, 32℃에서 2일 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 60℃에서 감압건조하여 병풀 추출물의 유산균 발효물(CA7)을 제조하였다. 상기 발효에 사용한 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 메센테로이드스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 이루어진 복합균이다.
또한, 상기 발효 시, 복합 유산균 대신에 10g의 누룩 또는 2g의 효모를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 병풀 추출물의 누룩 발효물(CA6) 및 병풀 추출물의 효모 발효물(CA8)을 제조하였다.
실시예 2. 기관지 상피세포에서 TNF-α로 유도한 염증의 개선 효과 확인
인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B(human bronchial epithelial cell, ATCC, USA) 세포를 소태아혈청(FBS; fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신(PS; penicillin-streptomycin)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)에서 배양하였으며, 96웰 플레이트에서 웰당 5×104 세포를 분주하여 DMEM 배지조건으로 18시간 배양한 후, 배지를 제거하고 혈청-프리 DMEM으로 교체하고, 시료(6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200㎍/㎖의 병풀 발효 추출물) 및 10ng/㎖의 TNF-α를 동시 처리하여 24시간 동안 배양하였다. RANTES 분비량은 ELISA 키트(R&D systems, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액에 존재하는 RANTE의 분비량을 측정하였다. 스튜던트 t-테스트를 이용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이, TNF-α의 처리에 의해 RANTES 분비량이 증가하였으며, 이에 대비하여 본 발명의 병풀 발효 추출물(CA3, CA4, CA5) 뿐만 아니라 병풀 추출물의 발효물(CA6, CA7, CA8)을 처리한 경우, RANTES 분비량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
실시예 3. 기관지 상피 세포에서 세포 생존율 및 LPS로 유도한 세포손상에 대한 보호 효과 확인
(1) 인체 기관지 상피세포주를 이용한 세포생존율 평가
인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B(human bronchial epithelial cell, ATCC, USA) 세포를 소태아혈청(FBS; fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신(PS; penicillin-streptomycin)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)에서 배양하였으며, 96웰 플레이트에서 웰당 3×104 세포를 분주하여 DMEM 배지조건으로 18시간 배양한 후, 배지를 제거하고 혈청-프리 DMEM으로 교체하고, 100㎍/㎖의 병풀 발효 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포생존률은 CCK-8 kit를 이용하여 측정하였다. 스튜던트 t-테스트를 이용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
그 결과 도 2에 개시한 바와 같이, 병풀 발효 추출물은 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.
(2) 인체 기관지 상피세포주를 이용한 LPS 유도 세포 손상에 대한 보호 효과
인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B(human bronchial epithelial cell, ATCC, USA) 세포를 소태아혈청(FBS; fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신(PS; penicillin-streptomycin)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)에서 배양하였으며, 96웰 플레이트에서 웰당 3×104 세포를 분주하여 DMEM 배지조건으로 18시간 배양한 후, 배지를 제거하고 혈청-프리 DMEM으로 교체하고, 100㎍/㎖의 병풀 발효 추출물 및 20㎍/㎖의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포생존률은 CCK-8 키트를 이용하여 측정하였다. 스튜던트 t-테스트를 이용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
LPS 처리하여 세포 독성을 유발한 결과 세포 생존율이 감소하였으며, 이에 대비하여 본 발명의 병풀 발효 추출물(CA3, CA4, CA5)은 생포 생존율이 증가하는 것을 확인하였고, 이로부터 세포를 보호하는 효과가 있는 것으로 판단하였다(도 3).
실시예 4. 기관지상피세포 BEAS-2B 세포에서 LPS로 염증을 유도한 후, 염증성 사이토카인 IL-6 발현량 변화 확인
LPS로 염증을 유도한 인체 기관지 상피세포주에서 염증성 사이토카인 IL-6 발현량 변화를 평가하였다.
인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B (human bronchial epithelial cell, ATCC, USA) 세포는 FBS(fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)으로 배양하였으며, BEAS-2B (3×104 세포/웰) 세포를 96웰 플레이트에 10%가 포함된 DMEM 배지에 18시간 배양한 후, 배지를 제거하여 혈청-프리 DMEM으로 배지를 교체하고, 시료(50, 25㎍/㎖)와 LPS(100ng/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포 상층액을 회수하여 IL-6 ELISA 키트를 이용하여 IL-6 발현량을 측정하였다.
그 결과 도 4에 개시한 바와 같이, 대조군(CON) 대비 LPS 유도군의 IL-6 발현량이 현저하게 증가하였고, 이에 대비하여 병풀 추출물(CA2) 및 병풀 발효 추출물(CA3, CA4, CA5)의 IL-6 발현량이 현저하게 감소하였다. 특히, 병풀 추출물에 대비하여 병풀 유산균 발효 추출물(CA4) 및 병풀 효모 발효 추출물(CA5)가 더 현저한 IL-6 발현량의 감소를 보였다.
실시예 5. 폐 손상 동물모델에서 호흡기 염증 개선 효과 확인
7주령 BALB/c 수컷 생쥐의 코 및 입을 통해, 각 50㎕씩 총 100㎕의 LPS+CS(표준 담배 추출물)를 2주 동안 3회 흡인시켜 만성폐쇄성폐질환(COPD)를 유발시켰다. 아무런 처리를 하지 않은 정상군(Normal), COPD 유발물질을 처리한 대조군(Control), COPD 유발물질과 양성대조군인 3mg/kg의 덱사메타손 투여군, COPD 유발물질과 200mg/kg의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군(CA4-200), COPD 유발물질과 100mg/kg의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군(CA4-100)으로 동물모델을 무작위 분류하였다. 약물(덱사메타손 또는 병풀유산균 발효 추출물) 투여군은 14일 동안 매일 경구투여하고, 실험이 끝난 후 각 군 생쥐의 폐포 세척액(BALF) 및 폐 조직을 분리하였다.
(1) 기관지폐포 세척액(BALF) 분리 및 총 호중구 세포수 측정
혈액을 채혈한 후, 해부하여 호중구의 BALF 내 세포계수를 위해 세포원심분리 후 침전된 혈구를 분리하여 0.04% 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 후, 총세포수를 측정하였다. Diff-Quick 염색을 3회 실시하였고, 이후 PBS로 2회 세척한 후 군당 9개의 슬라이드를 제작하여 400 배율의 광학현미경을 통해 계수하였다.
그 결과 양성대조군인 3mg/kg의 덱사메타손 투여군 및 본 발명의 100mg/kg 또는 200mg/kg의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군(CA4)에서 상대적인 호중구의 수가 감소하였고, 특히, 200mg/kg의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군에서 호중구의 수가 가장 많이 감소한 것을 확인하였다(도 5 및 6).
(2) 효소면역분석(ELISA)
상기 동물모델(C57BL/6 생쥐)에서 분리한 폐포 세척액(BALF)에서 케모카인 및 사이토카인(MIP2, IL-1α, CXCL-1, IL-17 및 TNF-α)의 생성량을 측정하기 위해 ELISA를 실시하였다. 포획 항체를 코팅 버퍼에 혼합하여 각각의 웰당 100㎕씩 넣고, 4℃에서 밤새 방치한 후, 세척 버퍼로 4회 세척하였다. 이후, 웰당 200㎕의 Assay diluent를 넣고, 실온에서 1시간 동안 블로킹한 후, 세척버퍼로 4회 세척하였다. 각 실험군의 혈청 및 표준 물질을 assay diluent 용액에 10배의 농도로 희석한 후, 각각의 포획 항체로 코팅된 96웰 플레이트에 100㎕씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척하고, 비오틴-컨쥬게이트 항체 시약을 각각의 웰에 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 2회 세척한 다음, 스트렙타아비딘-HRP 용액을 각각의 웰에 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후에 다시 세척 버퍼로 2회 세척하였다. 여기에 100㎕의 기질용액을 처리하여 20분 동안 반응시킨 후에, 50㎕의 정지용액을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, LPS+표준 담배 추출물을 흡인시킨 대조군의 BALF에서 염증 관련 케모카인 및 사이토카인 생성량이 모두 증가하였고, 이에 대비하여 양성대조군인 덱사메타손 투여군 및 병풀 유산균 발효 추출물 투여군(CA4)에서 통계적으로 유의미하게 MIP2, IL-1α, CXCL-1, IL-17 및 TNF-α의 생성량이 감소하였다(도 7).
(3) 실시간 중합연쇄반응(Real-Time PCR)
폐 조직으로부터 구축한 호흡기 염증 관련인자 MUC5AC(Mucin-5AC), TNF-α, CXCL-1 및 MIP2의 cDNA를 이용한 실시간 중합연쇄반응은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시하였다. G3PDH(mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로브는 CATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG(VIC)을 사용하였으며(probe는 Applied Biosystems사에서 제공되는 제품임), Sper-Taqman PCR 마스터 믹스(4369016, ABI)를 사용하였고, MUC5AC(Mucin-5AC), TNF-α, CXCL-1 및 MIP2 프라이머의 최종농도가 200nM이 되도록 처리하여 반응시켰다.
실시간 중합연쇄반응의 조건은 pre-denaturation은 50℃에서 2분, 94℃에서 10분, 40 싸이클을 95℃에서 0.15분, 60℃에서 1분 동안 수행하였다. 병풀 유산균 발효 추출물의 투여군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 RQ(relative quantitative)을 측정하였다.
실시간 중합연쇄반응에 사용된 프라이머 및 프로브 서열
명칭 방향 서열(5'->3') 서열번호
TNF-α 정방향 TTG ACC TCA GCG CTG AGT TG 1
역방향 CCT GTA GCC CAC GTC GTAGC 2
CXCL1 정방향 CCG AAG TCA TAG CCA CAC 3
역방향 GTG CCA TCA GAG CAG TCT 4
MUC5AC 정방향 AGA ATA TCT TTC AGG ACC CCT GCT 5
역방향 ACA CCA GTG CTG AGC ATA CTT TT 6
MIP-2 정방향 ATG CCT GAA GAC CCT GCC AAG 7
역방향 GGT CAG TTA GCC TTG CCT TTG 8
G3PDH
(probe)		 CAT GTT CCA GTA TGA CTC CAC TCA CG 9
그 결과, C57BL/6 생쥐에 LPS+표준 담배 추출물을 흡인시킨 대조군의 폐에서 염증관련 케모카인 및 사이토카인(MUC5AC, TNF-α, CXCL-1 및 MIP2)의 유전자 발현량이 모두 증가하였으며, 이에 대비하여, 양성대조군인 덱사메타손 투여군 및 본 발명의 병풀 유산균 발효 추출물 투여군(CA4)에서는 MUC5AC, TNF-α, CXCL-1 및 MIP2의 유전자 발현량이 감소한 것을 확인하였다(도 8).

Claims (11)

  1. 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 병풀 발효 추출물은
    1) 병풀 분말에 물을 가하여 멸균하는 단계;
    2) 상기 단계 1) 이후에, 상온으로 식혀 발효균을 첨가하고 25~40℃에서 발효하여 병풀 발효물을 제조하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 병풀 발효물에 추출용매를 첨가하여 추출하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단계 2)에서의 발효균은 유산균 또는 효모인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유산균은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophillus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 메센테로이드스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 중에서 선택된 하나 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 단계 3)에서 병풀 발효 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 병풀 발효 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
  11. 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
KR1020220085537A 2021-07-14 2022-07-12 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 KR20230013234A (ko)

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