KR20230008773A - SARS-COV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 의 치료를 위한 방법들 및 조성물들 - Google Patents

SARS-COV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 의 치료를 위한 방법들 및 조성물들 Download PDF

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네이선 뷰틀러
데니스 레이몬드 버튼
아르납 케이. 체터지
케이스 더블유. 맥나마라
토마스 에프. 로저스
피터 쥐. 슐츠
카렌 울프
로라 리바
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Abstract

SARS-CoV-2와 같은, 병원성 감염된 피험자를 치료하고; 피험자가 병원체에 의해 감염될 가능성을 감소시키고; 그리고 피험자로부터 다른 사람으로의 병원체의 전파를 감소시키는데 유용한 방법들이 본 명세서에 개시된다. 방법들은 선택 가능하게 항감염제와 같은 부가적인 제제와 조합하여, 본 명세서의 표 1 또는 표 4에 개시된 화합물을 활용한다.

Description

SARS-COV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 의 치료를 위한 방법들 및 조성물들
코로나 바이러스 감염은 상당한 이환율 (morbidity) 및 사망을 초래할 수 있다. 일반적으로 백신 접종이 일부 바이러스 감염에 대해 효과적일 수 있지만, 백신들이 항상 특정 바이러스들에 대해 완전히 효과적인 것은 아니다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 에 대한 현재 공지된 백신들의 장기 유효성은, 특히 백신들의 전체 영향을 약화시킬 수 있는 SARS-CoV-2 균주들 (strains) 의 출현으로 인해 아직 결정되지 않았다. 따라서 이 바이러스의 치료, 그리고 다른 사람들로의 전염을 방지하는 것은 일부 젊은이들, 노인들, 또는 면역 저하 집단들 사이에서 특히 중요하다.
본 출원은 2020년 5월 5일에 출원된 미국 가 특허 출원 제 62/704,340 호, 2020년 6월 19일에 출원된 제 62/705,288 호 및 2020년 10월 30일에 출원된 제 63/107,893 호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 이 출원들의 개시는 본 명세서에 완전히 기술된 바와 같이 본 개시에 인용된다.
따라서, 일 구현 예에서, 본 개시 (disclosure) 는 병원체 (pathogen) 에 의해 감염된 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 아필리모드 (apilimod), 렘데시비르 (remdesivir), 및 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine) 을 제외하고, 본 명세서에 기술된 (describe) 바와 같이 표 1 또는 표 4로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량 (therapeutically effective amount) 을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
다양한 실시 예들에서, 병원체는 코로나 바이러스이다. 예를 들어, 일 실시 예에서, 코로나 바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 이다.
일부 실시 예들에서, 방법은 항감염제 (anti-infective agent) 를 피험자에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 항감염제는, 다양한 실시 예들에서, 항바이러스제, 예컨대 진입-억제 약물들 (entry-inhibiting drugs), 코팅되지 않은 억제 약물들 (uncoating inhibiting drugs), 역전사 억제 약물들 (reverse transcriptase inhibiting drugs), 안티센스 약물들 (antisense drugs), 리보자임 약물들 (ribozyme drugs), 프로테아제 억제제들 (protease inhibitors), 어셈블리 억제 약물들 (assembly inhibiting drugs), 및 방출 억제 약물들 (release inhibiting drugs) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 것이다. 일부 실시 예들에서, 항바이러스제는 렘데시비르를 포함한다.
본 개시의 또 다른 실시 예는 화학식 RFM-011-200-5에 따른 화합물 또는 이의 제약 상 허용 가능한 (pharmaceutically acceptable) 염이다:
Figure pct00001
본 개시의 또 다른 실시 예는 화학식 RFM-007-454-4에 따른 화합물 또는 이의 제약 상 허용 가능한 염이다:
Figure pct00002
부가적인 실시 예들에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표 1 또는 표 4로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항감염제의 치료적 유효량, 및 제약 상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 상 조성물을 제공한다.
도 1. 1 차 세포 (primary cell) 기반 HCI 분석은 SARS-CoV-2 감염에 대해 활성인 화합물들을 식별한다. A) 단순화된 분석 워크플로우. B) DMSO (dimethyl sulfoxide)-처치된 웰 (treated well), 렘데시비르-처치된 웰 또는 아필리모드-처치된 웰로부터의 대표적인 이미지들. 웰 당 전체 이미징된 영역 (10x 대물 렌즈로 촬영되고 함께 스티칭된 (stitch) 4 개의 필드), 뿐만 아니라 흰색 박스로 구분된 8-배 확대된 세그먼트가 처치 각각에 대해 도시된다. DNA 신호 [4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)] 는 녹색이고, 면역 형광으로 가시화된 바이러스는 마젠타 색이다. 감염된 (화살표) 세포 및 감염되지 않은 (화살촉) 세포가 표시된다; 500 ㎛ 및 50 ㎛ 축척 바들이 합성 이미지 및 확대된 이미지에 각각 도시된다. 이미지들로부터 계산된 미가공 값 및 정규화된 (Norm.) 값이 도시된다. C) SARS-CoV-2 분석 제어 EC50들의 박스 및 위스커 (whiskers) 플롯은 바로 나타낸 평균 및 도시된 모든 데이터 지점들을 사용하여 독립적인 생물학적 실험들로부터 획득되었다. 위스커들은 최소값과 최대 값을 나타낸다. D) 1.9 μM ReFRAME 스크리닝 플레이트들로부터 정규화된 데이터의 열지도 이미지들이다. 백분율 ( ％) 감염된 세포들 및 총 세포 수들에 대한 정규화된 활성 값들은 축척 바에 따라 표시되고 화합물 및 대조 웰들에 대한 밀도 플롯이 도시된다. DMSO-처치된 웰들은 24 개 열로 있고 양성 대조군-처치된 웰들 (2.5 μM 렘데시비르, 2.5 μM 아필리모드, 또는 9.6 μM 퓨로마이신을 갖는 웰들의 블록들) 은 23 개열로 있다. 웰 타입 각각과 연관된 값들의 빈도를 나타내는 밀도 플롯들이 우측에 도시된다. E) 화합물 웰 및 대조군 웰에 대한 1.9 μM ReFRAME 스크리닝 데이터의 분포. F) 스크리닝 적중 (hit) 선택 문턱 값들.
도 2. 항-SARS-CoV-2 활성을 갖는 강력하고 선택적인 화합물들이 ReFRAME 라이브러리에서 식별된다. A) 개발 및 질병 징후의 임상 단계에 대한 ReFRAME 용도 변경 (repurposing) 라이브러리의 구성. B) 감염되지 않은 HeLa-ACE2 세포들에서 평가된 바와 같이, SARS-CoV-2 EC50이 이의 숙주 세포 독성 CC50에 대해 플롯팅된 화합물 각각의 용량 반응 (dose-response) 재확인 결과들. 점선들은 분석 화합물들 (40 μM) 및 아필리모드 및 렘데시비르 (10 μM) 대조군들에 대한 용량-반응 연구들에서 테스트된 최대 농도들을 나타낸다. 대조군들 (검정색 다이아몬드들) 및 분석 화합물들 (분홍색 다이아몬드들) 의 활성도들이 도시된다. 이 적중 재확인의 일부로서 스크리닝된 퓨로마이신의 ReFRAME 라이브러리 카피의 활성도 또한 나타낸다 (적색 다이아몬드). C) 렘데시비르, 아필리모드 및 퓨로마이신 대조군 화합물들에 대한 SARS-CoV-2 EC50 (청색), 감염된 HeLa-ACE2 EC50 (주황색) 및 감염되지 않은 HeLa-ACE2 CC50 용량 반응 곡선들이 ReFRAME 적중 재확인의 일부로서 실행되었다. D) 기능적 주석에 따른 75 개의 강력하고 선택적인 화합물 및 135 개의 약 활성 또는 비선택적인 화합물들의 분류. E) 전체 상가 효과 (additive effect) (-10 < δ < 10) 를 나타내는, 아필리모드 + 렘데시비르 약물 상호 작용 환경 (단일 복제) 에 대한 시너지 분석의 대표적인 출력. F) 렘데시비르와 2 개의 고정된 농도들의 아필리모드 사이의 상가 반응 (additive response) (시너지 실험 동안 대략 EC30과 EC65). 기술적 삼중 수 (technical triplicate) 의 중앙값 +/-sem이 도시된다.
도 3. 대조군 화합물 EC50들에 대한 MOI의 효과들. SARS-CoV-2/HeLa-ACE2 분석에서 렘데시비르, 아필리모드 및 퓨로마이신 대조군들의 활성은 1 내지 26 범위의 MOI를 사용하여 평가되었다. 표시된 MOI에서 화합물 각각의 EC50이 도시된다.
본 개시는 부분적으로 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 와 같은 병원성 감염된 피험자를 치료하는 방법들에 관한 것이다. 2019년 12월 초, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 가 COVID-19로 불리는 중증 폐렴 유사 증상들의 수를 급증시키는 원인으로 확인되었다 (Huang, C. et al. 중국 우한에서 2019년 신종 코로나 바이러스에 감염된 환자들의 임상적 특징. Lancet 395, 497-506, doi:10.1016/S0140-6736 (20) 30183-5 (2020)). 그 이후로, SARS-CoV-2는 WHO (World Health Organization) 에 의해 대유행 상태가 인정되었다. 2021년 2월 10일 현재, SARS-CoV-2는 전 세계로 확산되어 223 개국에서 106,555,200 명이 넘는 확인된 감염 및 2,333,440 명이 넘는 보고된 사망을 유발하였다 (Organization, W.H. Vol. 2020 (ed World Health Organization) (World Health Organization, 2020)). 몇몇 효과적인 항-SARS-CoV-2 백신들의 개발 대유행의 통제에 기여할 것은 의심할 여지가 없을 것이지만, 일부 백신들을 보다 덜 효과적이게 하는 회피 돌연변이들 (escape mutations) 을 갖는 SARS-CoV-2 균주들의 출현과 전반적으로 제한된 COVID-19 백신들의 전세계적 공급은 치료적 개입들을 식별하기 위한 지속적인 노력의 사례를 만든다. 그러나 연구 커뮤니티의 광범위한 노력에도 불구하고 COVID-19에 대한 항바이러스 치료 옵션들은 여전히 매우 제한된다. 이들은 중증 (severe) 또는 위독한 (critical) COVID-19 환자들의 치료를 위해 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드류를 포함한다 (Group, R.C. et al. Covid-N Engl J Med, doi:10.1056/NEJMoa2021436 (2020) 및 정맥으로 전달된 항바이러스 렘데시비르 (de Wit, E. et al. MERS-CoV 감염의 히말라야 원숭이 모델에서 예방적 및 치료적 렘데시비르 (GS-5734) 치료. (Proc Natl Acad Sci USA 117, 6771-6776, doi:10.1073/pnas.1922083117 (2020)); Sheahan, T.P. et al. 광범위한 스펙트럼의 항바이러스 GS-5734는 전염성 및 동물성 코로나 바이러스 모두를 억제하고 (Sci Transl Med 9, doi:10.1126/scitranslmed.aal3653 (2017); Lo, M.K. et al. GS-5734) 및 모체 뉴클레오사이드 유사체는 필로 바이러스 (Filo-virus), 뉴모 바이러스 (Pneumo-virus) 및 파라믹소 바이러스 (Paramyxovirus) 를 억제한다 (Sci Rep 7, 43395, doi:10.1038/srep43395 (2017)). 광범위한 항바이러스 활성을 갖는 뉴클레오티드 유사체 전구 약물 및 RdRp 억제제인 렘데시비르는 3 상 적응형 COVID-19 치료 실험에서 양성 임상 종점들을 입증했다 (회복까지의 중간 시간이 15일에서 11일로 단축됨; Health, N. I. o. (2020) 는 입원한 COVID-19 환자들의 치료를 위해 미국 식품 의약국 (FDA) 의 응급 사용 허가를 정당화했다 (Administration, U. S. F. D. (ed U.S. Food & Drug Administration) (U.S. Food & Drug Administration, 2020). 그러나, 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine) 섭생 (regimen), 로피나비르 (lopinavir) 섭생 및 인터페론 (interferon) 섭생과 함께 최근 대규모 다기관 WHO SOLIDARITY 실험에서 입원한 COVID-19 환자들의 사망률을 감소시키지 못했다 (Pan, H. et al. Repurposed antiviral drugs for COVID-19 -interim WHO SOLIDARITY trial results. medRxiv, 2020.2010.2015.20209817, doi:10.1101/2020.10.15.20209817 (2020)). 본 개시는 또한 부분적으로 2 개의 상이한 세포-기반 SARS-CoV-2 감염 분석들 및 렘데시비르 강화 포맷 (potentiation format) 의 대규모 약물 라이브러리 (ReFRAME) 의 스크리닝들, 및 2 차 직교 분석들에서 식별된 적중들 (hits) 의 프로파일링에 관한 것이다. 이 스크리닝 캐스케이드 및 후속 적중 우선순위 지정 (hit prioritization) 은 SARS-CoV-2의 강력한 억제제로서 유망한 적중으로 MK-4482를 식별하고 검증했으며, 이는 SARS-CoV-2 감염의 생체 내 (in vivo ) 햄스터 모델로 변환된 시험관 내 (in vitro) 결과이다. 이들 연구들에서 식별된 다른 적중들은 코로나 바이러스 복제 경로들을 밝히기 위한 요법들 및 툴들로 용도 변경하는데 (repurposing) 유용하다.
정의들
본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 반대로 명시되지 않는 한, 용어 "화합물 (compound)"은 화합물 또는 이의 제약 상 허용되는 염 (pharmaceutically acceptable salt), 입체 이성질체, 및/또는 호변 이성질체 (tautomer) 를 포괄한다는 점에서 포괄적이다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물은 화합물의 호변 이성질체의 제약 상 허용되는 염을 포함한다.
본 개시에서, "제약 상 허용되는 염 (pharmaceutically acceptable salt)"은 본 명세서에 기술된 화합물의 제약 상 허용되는, 유기 또는 무기 산 또는 염기 염이다. 대표적인 제약 상 허용되는 염은 예를 들어, 알칼리 금속 염, 알칼리 토류 염, 암모늄 염, 수용성 염 및 수 불용성 염, 예컨대 아세테이트, 앰소네이트 (4,4-디아미노스틸벤-2,2-디설포네이트), 벤젠설포네이트, 벤조네이트, 바이카보네이트, 바이설페이트, 바이타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 부티레이트, 칼슘, 칼슘 에데테이트, 캠실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 클라불라리에이트, 디하이드로클로라이드, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 피우나레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴라사닐레이트, 헥실레조시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드록시나프토에이트, 아이오다이드, 이소티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸브로마이드, 메틸나이트레이트, 메틸설페이트, 뮤케이트, 냅실레이트, 나이트레이트, N-메틸글루카민 암모늄 염, 3-하이드록시-2-나프토에이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트 (1,1-메텐-bis-2-하이드록시-3-나프토에이트, 아인보네이트), 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 피크레이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, p-톨루엔설포네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 서브아세테이트, 숙시네이트, 설페이트, 설포살리컬에이트, 수라메이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 및 발레레이트 염들을 포함한다. 제약 상 허용되는 염은 구조 내에 2 개 이상의 대전된 원자를 가질 수 있다. 이 예에서, 제약 상 허용되는 염은 복수의 반대 이온들을 가질 수 있다. 따라서, 제약 상 허용되는 염은 하나 이상의 대전된 원자들 및/또는 하나 이상의 반대 이온들을 가질 수 있다.
용어 "치료하다 (treat)", "치료하는" 및 "치료 (treatment)"는 질환 또는 질환과 연관된 증상의 개선 또는 근절을 지칭한다. 다양한 실시 예들에서, 용어들은 이러한 질병을 가진 환자에게 본 명세서에 기술된 하나 이상의 예방적 또는 치료적 화합물들의 투여로부터 발생하는 질병의 확산 또는 악화를 최소화하는 것을 지칭한다.
용어 "예방하다 (prevent)", "예방하는", 및 "예방"은 본 명세서에 기술된 화합물의 투여로부터 발생하는 환자의 질병의 발병, 재발, 또는 확산의 예방을 지칭한다.
용어 "유효량 (effective amount)"은 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 질병의 치료 또는 예방에서 치료적 또는 예방적 이점을 제공하거나 질병과 연관된 증상들을 지연시키거나 최소화하기 충분한 다른 활성 성분의 양을 지칭한다. 또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물에 대해 치료적 유효량은 질병의 치료 또는 예방에서 치료적 이점을 제공하는, 치료제 단독으로, 또는 다른 요법들과 조합된 양을 의미한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물과 관련하여 사용된 용어는 전체 요법을 개선하고, 증상 또는 질병의 원인을 감소 또는 방지하고, 또는 또 다른 치료제의 치료 효능 (efficacy) 을 향상시키거나 상승 작용하는 양을 포괄할 수 있다.
"환자" 또는 "피험자 (subject)"는 인간, 소, 말, 양, 어린 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니피그와 같은 동물을 포함한다. 일부 실시 예들에 따라, 동물은 비-영장류 및 영장류 (예를 들어, 원숭이 및 인간) 와 같은 포유 동물이다. 일 실시 예에서, 환자는 인간, 예컨대 인간 유아, 아동, 청소년 또는 성인이다. 본 개시에서, 용어 "환자" 및 "피험자"는 상호 교환 가능하게 사용된다.
스크리닝 분석 및 방법들
ReFRAME (Repurposing, Focused Rescue, and Accelerated Medchem) 약물 컬렉션 (drug collection) 은 인간들에게 직접적으로 사용하기에 적합한 것으로 보이는 거의 12,000 개의 소분자 약물들을 포함하는 광범위한 약물 용도 변경 라이브러리이며 (5) 효능을 더 향상시키고 잠재적인 약물 내성을 감소시키기 위한 추가적인 단일 요법들 또는 렘데시비르와 조합으로서 유용할 수 있는 새로운 치료법을 발견하기 위한 풍부한 리소스를 제공한다. 인간 세포에 SARS-CoV-2의 진입 또는 복제를 억제할 수 있는 이 라이브러리의 화합물들을 식별하기 위해, 인간 SARS-CoV-2 수용체, 안지오텐신-전환 효소 2, 또는 ACE2 (HeLa-ACE2) 를 발현하는 HeLa 세포들을 사용하여 HCI (high-content Imaging) 384-웰 (well) 포맷 분석을 개발하였다. 이 분석에서, HeLa-ACE2 세포들은 관심 있는 화합물들의 존재시 SARS-CoV-2 바이러스로 감염되고, 바이러스 감염은 24 시간 후에 정량화된다 (도 1, 패널 A). 이 분석은 바이러스에 노출된 환자들로부터 정제된 혈청을 사용한 SARS-CoV-2 단백질들의 면역 형광 검출에 의존하고, 이는 숙주 세포 핵 염색과 함께 웰 각각에서 감염된 세포 백분율의 정량화를 허용한다 (도 1, 패널 B).
에볼라에 대해 보고된 활성 및 SARS-CoV-2에 대한 활성이 의심되거나 이전에 검증된 화합물: 렘데시비르 (GS-5734) (6) (EC50 = 194 ± 20 nM; 5 개의 독립적인 실험의 평균 ± sem) 및 PIKfyve 억제제 아필리모드 (EC50 = 50 ± 11 nM, 4 개의 독립적인 실험들의 평균 ± sem) 를 사용하여 분석을 검증하였다 (도 1, 패널 B). 상승된 농도들의 렘데시비르는 감염된 세포들을 거의 완전히 제거할 수 있었고 (도 1, 패널 C) 2.5 μM의 농도에서 양성 대조군과 이에 대해 정규화된 데이터 및 중성 DMSO 대조군 웰들과 함께 사용했다. 아필리모드가 렘데시비르보다 보다 강력하지만, 렘데시비르와 비교하여 부분적으로 보다 낮은 최대 효능 (가장 높은 유효 농도들에서 감염되지 않은 세포들의 85 내지 90 ％) 을 가졌다. 또한, 양성 대조군 (평균 EC50 = 547 ± 27 nM, 5 번의 독립적인 실험의 평균 ± sem; HeLa-ACE2 CC50 = 2.45 ± 0.23 μM, 5 번의 독립적인 실험의 평균 ± sem) 으로서 세포독성 단백질 합성 억제제 퓨로마이신을 사용하여 웰 당 총 세포 수를 정량화함으로써 감염의 맥락에서 화합물 독성을 평가했다. 특히, 수반되는 세포 수의 증가는 아마도 감염된 세포들의 증식 (proliferation) 의 감소로 인한 렘데시비르 및 아필리모드의 항바이러스 활성과 일치한다 (도 1, 패널 B 내지 패널 E). 감염의 다양성을 변경하는 것은 동일한 실험에서 퓨로마이신이 아니라 렘데시비르의 EC50이 MOI = 1에서 MOI = 26으로 2.7 배 증가하고, 아필리모드의 EC50이 3.7 배 증가하는 것과 함께 대조군 화합물들의 유효성 (potency) 에 보통의 효과를 가졌다 (도 3).
개발된 분석을 사용하여, 본 발명자들은 코로나 바이러스 감염 (7) (RZ'= 0.84) 에 대해 의심되는 치료 가능성을 갖는 148 개의 소분자들의 활성을 평가하기 위해 파일럿 스크리닝을 실행하였다. 본 발명자들은 감염되지 않은 HeLa-ACE2 24 시간 생존/사멸 분석 (live/dead assay) 으로부터 획득된 데이터에 기초하여, EC50 < 9.6 μM을 갖는 19 개의 화합물들을 식별하였고, 이들 중 10 개는 선택적이다 (감염되지 않은 HeLa-ACE2 CC50/SARS-CoV-2 EC50 > 10 또는 감염되지 않은 HeLa-ACE2 CC50 > 40 μM) (표 1). 이는 분석에서 "재발견된" 아필리모드 (EC50 = 184 nM, CC50 > 40 μM) 및 렘데시비르 (EC50 = 300 nM CC50 > 40 μM) 의 라이브러리/스크리닝 로트들 (screening lot) 을 포함한다. 보다 높은 EC50의 아필리모드 및 렘데시비르는 새로 조제된 (prepare) 대조군 분말 스톡과 비교하여 스크리닝 데크에서 시간이 흐름에 따라 약간의 열화로 인한 것 같다.
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본 발명자들은 1.9 μM 및 9.6 μM의 최종 농도들에서 12,000-화합물 ReFRAME 용도 변경 라이브러리를 스크리닝했다. 이하 표 2에 나타낸 바와 같이 (각각 0.87 및 0.72의 RZ') 분석 품질은 두 스크리닝 전반에 걸쳐 유지되었다.
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이에 더하여, DMSO 비히클-처치된 웰 (vehicle-treated well) (중성 대조), 렘데시비르-처치된 웰 (양성 대조), 아필리모드-처치된 웰, 및 퓨로마이신-처치된 웰 (독성 대조) 의 활성 프로파일들에서 분명한 구별이 명백하다 (도 1, 패널 D 및 패널 E). 적중 선택은 총 311 개의 적중들 중에서 1.9 μM 스크리닝 농도에서 61 개의 1 차 적중 및 9.6 μM 스크리닝 농도에서 266 개의 1 차 적중 (각각 0.51 및 2.24 ％의 적중률) 을 식별하는, 웰 당 감염된 세포 수의 50 ％ 미만의 감소 (중성 대조군 - 억제제로 정규화된 50 ％ 이하 활성도) 및 웰 당 총 세포 수에 기초하여 40 ％ 미만 독성 (10 μM 퓨로마이신을 포함한, 화합물 활성도에 대해 정규화된 40 ％ 이하 활성도) 의 입증에 기초한다 (도 1, 패널 E 및 패널 F).
ReFRAME 라이브러리의 1 차 스크리닝에 대한 적중률은 높지만 (2.51 ％), 이들 중 다수가 승인된 약물들이거나 개발의 임상 단계에 있고 다양한 적응증에 사용되는 이 생체 활성 소분자들의 수집에 대해 예상치 못한 것은 아니다 (도 2, 패널 A). 1 차 적중의 유효성 및 선택도를 재확인하고 평가하기 위해, 9.6 μM의 최고 농도를 갖는 10 포인트 1:3 희석 용량 응답 포맷으로 가용 화합물들의 325 개를 테스트하였다. 이들 중 233 개 (71.7 ％) 는 SARS-CoV-2에 대해 9.6 μM 미만의 EC50으로 활성을 나타내고, 추가적으로 42 개 (12.9 ％) 는 약한 활성도를 나타냈다 (EC50 > 9.6 μM). 그러나, 많은 1 차 스크리닝 적중들은 또한 세포 독성이었고, 감염되지 않은 HeLa-ACE2 세포들에서 결정된 바와 같이 용인할 수 없을 정도로 낮은 선택도 (감염되지 않은 CC50/EC50 < 10) 를 갖는다 (표 3, 도 2, 패널 B).
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바이러스들은 복제를 위해 숙주 조직 (host machinery) 에 의존하기 때문에, 항바이러스 활성을 갖는 많은 화합물들이 또한 중요한 숙주 프로세스에 영향을 미친다는 것은 예상치 못한 일은 아니다. 흥미롭게도, 단백질 합성 억제제인 퓨로마이신 및 심지어 하이드록시클로로퀸과 같은 화합물들에 의한 바이러스 감염의 감소가 감염의 맥락에서 세포 건강에 이점을 제공하기 때문에, 이 독성은 때때로 가려지지만 (mask) 감염되지 않은 세포에서는 그렇지 않다 (도 2, 패널 C).
작은 파일럿 스크리닝과 ReFRAME 스크리닝 사이에서, 76 개 (GW-803430의 2 개의 상이한 로트가 식별됨에 따라 75 개 고유) 의 강한 (EC50 < 9.6 μM) 화합물 및 선택적인 (CC50/EC50 > 10 또는 CC50 > 39.8 μM) 화합물을 식별하고, 그리고 단지 약한 활성 (EC50 > 9.6 μM) 또는 강하지만 적절하게 선택적이지 않은 (EC50 < 9.6 μM, CC50/EC50 < 10) 135 개의 화합물들을 식별하였다 (도 2, 패널 B 및 패널 D, 표 1). 강력하고 선택적인 화합물들의 상위 4 부류들은 종양 용해성 (oncolytic) 화합물들, 이온 채널 조절제들, 항정신병제들 (anti-psychotics) 및 수용체 결합 화합물들이었다 (도 2, 패널 D). 약한 활성 또는 비선택적 적중들에 대해, 상위 4 개의 카테고리들은 유사하게 종양 용해성 화합물들, 이온 채널 조절제들, 항정신병제들뿐만 아니라 신호 변환 조절제들을 포함한다. 강력하고 선택적인 적중의 5 분의 1은 종양 용해성 약물로서 분류될 수 있고, 신속하게 증식하는 세포들에 존재하는 숙주 세포 프로세스들에 대한 바이러스의 의존도를 더 반영한다. 항정신병제, 심혈관, 심지어 항기생충 (소외 열대성 질병들 (neglected tropical diseases)) 부류들에 속하는 화합물들의 식별은 이들 분자들 중 일부의 양이온성 양친매성 (amphiphilic) 특성 및 산성 세포 내 구획들 (예를 들어, 후기 엔도좀/ 리소좀) 에 축적되고 영향을 주는 능력을 반영할 수 있다. 엔도-리소좀 경로 및 지질 항상성의 결과적인 조절 이상은 바이러스 진입 및/또는 복제를 손상시키도록 제안되었고 (8), 이 작용 모드는 아미오다론 및 하이드록시클로로퀸에 대해 고려되고, 모두 스크리닝에서 SARS-CoV-2에 대한 강력하고 선택적인 적중으로 확인되었다 (표 1 및 표 3). 본 발명자들은 또한 이전에 에볼라 바이러스 감염을 억제하는 것으로 밝혀진 화합물의 부류인 2 개의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제들 (바제독시펜 (bazedoxifene), EC50 = 3.47 μM 및 라록시펜 (raloxifene) EC50 = 4.13 μM) 을 확인했다 (9).
임의의 본 명세서에 기술된 방법들 또는 구성들에 사용하기 위한 부가적인 실시 예들은 ReFRAME 스크리닝으로부터의 재확인된 적중들을 더 포함한다. 이들은 본 명세서에 기술된 SARS-CoV-2/HeLa-ACE2 고-함량 스크리닝 분석 및 SARS-CoV-2/Calu-3 고-함량 스크리닝 분석으로부터의 대응하는 데이터와 함께 표 4에 제시된다 (실시 예들 참조).
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다양한 실시 예들에 따라, 식별된 적중들 중, 상대적으로 고 노출 또는 치료제로서의 긴 사용 이력 및 따라서 동물 모델들에서 추가 유효성 검사 후 COVID-19 치료제들로 신속하게 용도 변경될 가능성으로 인해, 새롭게 식별되고 승인된 경구 약물들인 할로판트린 (halofantrine) HCl, 아미오다론 (amiodarone), 넬피나비르 메실레이트 (nelfinavir mesylate), 시메프레비르 (simeprevir), 마니디핀 (manidipine) 및 오자니모드 (ozanimod) 가 있다. 예를 들어, 바이러스성 프로테아제 억제제 넬피나비르 및 시메프레비르는 우수한 노출을 나타낸다.
또 다른 실시 예에서, 화합물은 선택적인 스핑고신-1-포스페이트 (S1P1) 수용체 조절제 오자니모드이다. 선택적인 S1P1 작용제들은 감염 부위에서 염증을 감소시킴으로써 (폐 내피 세포들에 의한 사이토카인들의 방출 및 폐들로의 림프구의 침윤을 감소시킴으로써) 뮤린 모델들에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 상당한 보호를 제공하는 것으로 나타났고 (10), 따라서 오자니모드는 직접 작용하는 항바이러스 약물에 대한 우수한 조합 파트너로서 역할할 (serve) 수 있다.
또 다른 실시 예에 따라, 본 명세서에 기술된 방법들에서 투여된 화합물은 우수한 노출 (Cmax ~ 684 μM) 을 갖는 승인된 약물 아미오다론 또는 낮은 노출을 갖지만 고혈압 환자의 COVID-19 질병 결과들을 개선할 수 있는 승인된 칼슘-채널 차단제 마니디핀이다. 아미오다론은 시험관 내 스크리닝에서 광범위한 스펙트럼의 항바이러스 활성을 갖는 것으로 추가로 확인된다 (11).
아필리모드 (필로 바이러스들 (filoviruses) 에 대해 발견된 바와 같이, 엔도-리소좀 트래피킹의 파괴를 통한 바이러스 진입을 억제할 수도 있는 분석 제어 (12)), 프로테아제 억제제들 NCO 700 (카텝신 B) 및 두타카팁 (카텝신 K) 와 같은 다양한 개발 단계들의 19 개의 다른 화합물들이 있고, 이는 또한 바이러스 진입에 영향을 줄 수 있고, 모두 유효성 또는 약동학적 프로파일들로 인한 유효성을 나타낼 수 있다 (표 3). 이들 대부분은 매우 강력한 아필리모드를 제외하고, 렘데시비르의 유효성을 능가하지 않는 1 μM보다 작은 보통의 EC50들을 갖는다.
본 개시는 또한 일부 실시 예들에서, 피험자에서 발생하는 병원성 감염의 가능성을 감소시키거나 감염된 피험자로부터 다른 피험자들로의 병원체의 전파를 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 방법은 표 1 또는 표 4에 열거된 적어도 하나의 화합물을 선택 가능하게 (optionally) 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 항감염제와 조합하여 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
병용 요법 (COMBINATION THERAPY)
다양한 실시 예들에서, 본 개시의 방법들은 항감염제를 투여하는 것을 더 포함한다. 항감염제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 화합물 (표 1 및 표 4) 과 동시에, 예컨대 동일한 제제 또는 제형 (dosage form) 으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 항감염제는 화합물 전 또는 후에 투여될 수 있다.
일부 실시 예들에서, 항감염제는 진입-억제 약물들 (엔푸비르타이드 (enfuvirtide) 포함), 코팅되지 않은 억제 약물들 (아만타딘 (amantadine), 리만타딘 (rimantadine), 및 플레코나릴 (pleconaril) 포함), 역전사 (reverse transcriptase) 억제 약물들 (아시클로비르 (acyclovir), 지도부딘 (zidovudine), 및 라미부딘 (lamivudine) 포함), 안티센스 (antisense) 약물 (포미비르센 (fomivirsen) 포함), 리보자임 약물, 프로테아제 억제제, 어셈블리 억제 약물 (리팜피신 (rifampicin) 포함), 및 방출 억제 약물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시 예들에서, 부가적인 제제는 덱사메타손, 아모디아퀸,
Figure pct00067
및
Figure pct00068
이다.
일부 실시 예들에서, 부가적인 항감염제는 항바이러스제이다. 일부 실시 예들에서, 항바이러스제는 아바카비르 (Abacavir), 아시클로비르 (Acyclovir (Aciclovir)), 아데포비르 (Adefovir), 아만타딘 (Amantadine), 암플리겐 (Ampligen), 암프레나비르 (Amprenavir (아게네라제 (Agenerase))), 아르비돌 (Arbidol), 아타자나비르 (Atazanavir), 아트리플라 (Atripla), 바라비르 (Balavir), 발록사비르 마르복실 (Baloxavir marboxil (Xofluza)), 빅타비 (Biktarvy), 보세프레비르 (Boceprevir (Victrelis)), 시도포비르 (Cidofovir), 코비시스탯 (Cobicistat (Tybost)), 콤비비르 (Combivir), 다클라타스비르 (Daclatasvir (Daklinza)), 다루나비르 (Darunavir), 델라비르딘 (Delavirdine), 데스코비 (Descovy), 디다노신 (Didanosine), 도코사놀 (Docosanol), 도루테그라비르 (Dolutegravir), 도라비린 (Doravirine (Pifeltro)), 에코리버 (Ecoliever), 에독서딘 (Edoxudine), 에파비렌츠 (Efavirenz), 엘비테그라비르 (Elvitegravir), 엠트리시타빈 (Emtricitabine), 엔푸비르타이드 (Enfuvirtide), 엔테카비르 (Entecavir), 에트라비린 (Etravirine (Intelence)), 팜시클로비르 (Famciclovir), 파비피라비르 (Favipiravir (T-705; 6-플루오로-3-하이드록시-2-피라진카복사미드 (6-fluoro-3-hydroxy-2-pyrazinecarboxamide)), 포미비르센 (Fomivirsen), 포삼프레나비르 (Fosamprenavir), 포스카르넷 (Foscarnet), 포스포넷 (Fosfonet), 융합 억제제 (Fusion inhibitor), 간시클로비르 (Ganciclovir (Cytovene)), 이바시타빈 (Ibacitabine), 이발리주맙 (Ibalizumab (Trogarzo)), 아이독서리딘 (Idoxuridine), 이미퀴모드 (Imiquimod), 이무노비르 (Imunovir), 인디나비르 (Indinavir), 이노신 (Inosine), 인테그라제 억제제 (Integrase inhibitor), 인터페론 타입 I (Interferon type I), 인터페론 타입 II, 인터페론 타입 III, 인터페론, 라미부딘 (Lamivudine), 레테르모비르 (Letermovir (Prevymis)), 로피나비르 (Lopinavir), 로비라이드 (Loviride), 마라비록 (Maraviroc), 메티사존 (Methisazone), 모록시딘 (Moroxydine), 넬피나비르 (Nelfinavir), 네비라핀 (Nevirapine), 넥사비르 (Nexavir), 니타족사나이드 (Nitazoxanide), 노르비르 (Norvir), 뉴클레오사이드 (Nucleoside) 유사체들, 오셀타미비르 (Oseltamivir (Tamiflu)), 페긴테르페론 알파-2에이 (Peginterferon alfa-2a), 페긴테르페론 알파-2비 (Peginterferon alfa-2b), 펜시클로비르 (Penciclovir), 페라미비르 (Peramivir (Rapivab)), 플레코나릴 (Pleconaril), 포도필로톡신 (Podophyllotoxin), 프로테아제 억제제 (Protease inhibitor (약리학)), 피라미딘 (Pyramidine), 랄테그라비르 (Raltegravir), 렘데시비르, 역 전사효소 (Reverse transcriptase) 억제제, 리바비린 (Ribavirin), 릴피비린 (Rilpivirine (Edurant)), 리만타딘 (Rimantadine), 리토나비르 (Ritonavir), 사퀴나비르 (Saquinavir), 시메프레비르 (Simeprevir (Olysio)), 소포스부비르 (Sofosbuvir), 스타부딘 (Stavudine), 시너지 인핸서 (Synergistic enhancer (항레트로바이러스 (antiretroviral))), 텔라프레비르 (Telaprevir), 텔비부딘 (Telbivudine (Tyzeka)), 테노포비르 아라페나마이드 (Tenofovir alafenamide), 테노포비르 디소프록실 (Tenofovir disoproxil), 테노포비르, 티프라나비르 (Tipranavir), 트리플루리딘 (Trifluridine), 트리지비르 (Trizivir), 트로만타딘 (Tromantadine), 트루바다 (Truvada), 발라시클로비르 (Valaciclovir (Valtrex)), 발간시클로비르 (Valganciclovir), 빅리비록 (Vicriviroc), 비다라빈 (Vidarabine), 비라미딘 (Viramidine), 잘시타빈 (Zalcitabine), 자나미비르 (Zanamivir (Relenza)), 및 지도부딘 (Zidovudine) 으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
렘데시비르의 정맥 내 투여 요건 및 잠재적으로 제한된 효능은 대안적 요법 또는 보충적 요법에 대한 추가 조사를 촉발시켰다. 따라서, 다양한 실시 예들에 따라, 본 개시는 병용 요법에서 렘데시비르와의 파트너로서 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물들을 제공한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 병용 요법은 조합 파트너들 중 하나 또는 모두의 약물 용량을 감소시키면서 치료의 효능을 증가시킬 수 있고, 따라서 보다 높은 용량들의 투여와 연관될 수도 있는 부작용을 방지할 수 있다. 약물 조합들은 또한 약물 내성 획득을 늦출 수 있다. 상가 작용 (additive interaction) 이 예상되는 것 이상으로 병용 요법의 활성의 증가로 규정되는, 약물 시너지가 드물지만, 상가 효과들 자체가 요법 섭생 (therapy regimens) 을 개선할 수 있다. 반대로, 화합물들이 독립적으로 작용한다면 예상되는 것을 넘어서는 전체 조합의 활성의 억제인 길항 작용은 바람직하지 않은 특성이다.
따라서, FDA-승인된 렘데시비르와 ReFRAME 적중 사이의 시너지적 상호 작용, 상가 작용 및 길항적 상호 작용을 식별하기 위해, 10 × 10 매트릭스에서 매력적인 안전성 및 약동학적 프로파일들을 갖는 11 번의 적중의 용량 반응과 렘데시비르의 전체 용량 반응을 비교하는, 체커 보드 실험에서 시너지적 상호 작용 연구를 수행하였다 (그림 2, 패널 E). ZIP (Zero Interaction Potency Model) (14) 를 사용하여 테스트된 화합물들 간의 상호 작용을 평가하기 위해 R의 synergyfinder 패키지 (13) 를 사용했으며, 여기서 10 초과의 δ 점수는 시너지일 것이고, -10 미만의 δ는 길항 작용을 나타내고, -10 내지 10의 δ는 상가 작용을 암시한다. 결과들은 몇몇 예시적인 조합들이 상가적 (additive) 이라는 것을 나타낸다 (도 2, 패널 E 및 패널 F, 표 1).
이 스크리닝은 또한 뉴클레오사이드 유사체 리보프린 (riboprine) (이전에 항종양제로서 조사된, 메스꺼움 및 수술 부위 감염의 치료를 위한 N6-이소펜테닐아데노신, 및 산전/산후 처방 종합 비타민/미네랄 정제인 CitraNatal 90 DHA의 구성 요소) 및 엽산 길항제 10-데아자아미노프테린 (현재 개발의 II 상 단계에 있는 항종양 화합물) 이 렘데시비르의 활성과 시너지 작용을 하는 활성을 갖는 것으로 확인하였다. 두 화합물들에 대한 시너지 효과들은 3 차원 시너지 점수 환경에서 피크들로 나타내는 특정한 농도들에 걸쳐 관찰되었다.
리보프린은 테스트된 농도 범위에 걸쳐 최대 (100 ％) 효능을 달성했지만, 렘데시비르의 EC2의 첨가는 EC50을 12 μM에서 3.6 μM로 시프팅하고, 렘데시비르의 EC24의 첨가는 EC50 = 1.6 μM로 그 유효성을 더욱 상승시켰다. 10-데아자아미노프테린은 테스트된 농도들의 범위에 걸쳐 40 ％의 최대 효능만을 나타내지만, 렘데시비르의 EC2의 첨가는 40 ％에서 거의 65 ％로 (2 ％의 시프팅이 예상되는) 최대 효능의 상승을 유발하고 렘데시비르의 EC24의 첨가는 조합의 최대 효능을 40 ％에서 80 ％초과로 상승시켰다.
제약 조성물
본 개시는 다양한 실시 예들에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표 1 또는 표 4로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항감염제의 치료적 유효량, 및 제약 상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 상 조성물을 제공한다. 일부 실시 예들에서, 조성물은 제약적 화합물의 용인된 관행들에 따라, 하나 이상의 부가적인 제약 상 허용되는 부형제, 희석제, 보조제, 안정화제, 유화제, 보존제, 착색제, 완충제, 및 향미 부여제를 더 함유한다.
본 개시의 제약 조성물은 우수한 의학적 관행과 일치하는 방식으로 제제화되고, 투약되고, 투여된다. 이 맥락에서 고려할 인자들은 치료될 특정한 장애, 치료될 특정한 피험자, 피험자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 의료 종사자들에게 공지된 다른 요인들을 포함한다.
병용 요법의 모든 활성 성분들을 포함하여, 투여되는 화합물의 "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 이러한 고려 사항들에 의해 좌우되고, 항감염, 예를 들어, 항-바이러스 효과를 유발하는데 필요한 최소량이다. 이러한 양은 정상 세포들 또는 피험자 전체에 독성이 있는 양보다 적을 수도 있다. 일반적으로, 투여되는 본 개시의 화합물의 최초의 치료적 유효량은 하루에 약 0.01 내지 약 200 ㎎/㎏ 또는 약 0.1 내지 약 20 ㎎/㎏의 환자 체중의 범위 내이고, 통상적인 초기 범위는 약 0.3 내지 약 15 ㎎/㎏/일이다. 경구 단위 제형들, 예컨대 정제들 및 캡슐들은 약 1 ㎎ 내지 약 1000 ㎎의 본 개시의 화합물을 함유할 수도 있다. 또 다른 실시 예에서, 이러한 제형들은 약 50 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 본 개시의 화합물을 함유한다. 또 다른 실시 예에서, 이러한 제형들은 약 25 ㎎ 내지 약 200 ㎎의 본 개시의 화합물을 함유한다. 여전히 또 다른 실시 예에서, 이러한 제형들은 약 10 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 본 개시의 화합물을 함유한다. 추가 실시 예에서, 이러한 제형들은 약 5 ㎎ 내지 약 50 ㎎의 본 개시의 화합물을 함유한다.
조성물들은 투약 단위 제제로 경구로, 국소적으로, 비경구적으로 (parenterally), 흡입 또는 스프레이에 의해 또는 직장으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 피하 주사 (subcutaneous injections), 정맥 내 (intravenous), 근육 내 (intramuscular), 흉골 내 주사 (intrasternal injection) 또는 주입 기법들 (infusion techniques) 을 포함한다.
본 개시에 따른 적합한 경구 조성물은 제한 없이 정제, 트로키 (troches), 로젠지 (lozenges), 수성 현탁액 또는 유성 현탁액, 분산성 분말들 또는 과립들, 에멀젼, 경질 캡슐 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르 (elixirs) 를 포함한다.
본 개시의 범위 내에는 본 개시의 화합물 또는 이의 제약 상 허용되는 입체 이성질체, 염, 또는 호변 이성질체 및 제약 상 허용되는 담체를 포함하는 단일 단위 투약량들에 적합한 제약 조성물들이 포괄된다.
경구 사용에 적합한 조성물들은 제약 조성물들의 제조를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 조제될 (prepare) 수도 있다. 예를 들어, 화합물들의 액체 제제들은 아르기나제 억제제의 제약 상 우수하고 맛좋은 조제들을 제공하기 위해 감미제들, 향미제들, 착색제들 및 보존제들로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제들을 함유한다.
정제 조성물들의 경우, 비독성 제약 상 허용되는 부형제들 (excipients) 과 혼합된 본 개시의 화합물이 정제의 제조를 위해 사용된다. 이러한 부형제들의 예들은 비제한적으로 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제들, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제들, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 스테아르 산 또는 탈크를 포함한다. 정제들은 코팅되지 않을 수도 있고 또는 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시키고 이에 따라 목표된 시간 기간에 걸쳐 지속적인 치료 작용을 제공하도록 공지의 코팅 기법들에 의해 코팅될 수도 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 재료가 채용될 수도 있다.
경구 사용을 위한 제제들은 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐들로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐들로서 제시될 수도 있다.
수성 현탁액들의 경우, 본 개시의 화합물은 안정한 현탁액을 유지하는데 적합한 부형제들과 혼합된다. 이러한 부형제들의 예들은 제한 없이 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸스 (tragacanth) 및 검 아카시아를 포함한다.
경구 현탁액들은 또한 분산제 또는 습윤제, 예컨대 천연 발생 포스파티드, 예를 들어, 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산들의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올들의 축합 생성물 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 지방산들과 헥시톨, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트로부터 유도된 부분 에스테르들과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물들, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물들로부터 유도된 부분 에스테르들과의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트를 함유할 수 있다. 수성 현탁액들은 또한 하나 이상의 방부제들, 예를 들어 에틸, 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제들, 하나 이상의 향미제들, 및 하나 이상의 감미제들, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수도 있다.
유성 현탁액들은 본 개시의 화합물을 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일, 또는 광유, 예컨대 액체 파라핀에 현탁시킴으로써 제제화될 수도 있다. 유성 현탁액은 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 증점제 (thickening agent) 를 함유할 수도 있다.
상기 기술된 것과 같은 감미제들, 및 향미제들은 맛좋은 경구 조제들을 제공하도록 첨가될 수도 있다. 이들 조성물들은 아스코르브 산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수도 있다.
물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 조제에 적합한 분산성 분말들 및 과립들은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제들과 혼합된 본 개시의 화합물을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 이미 상기 언급된 것들에 의해 예시된다. 부가적인 부형제들, 예를 들어 감미제, 향미제 및 착색제가 또한 존재할 수도 있다.
본 개시의 제약 조성물들은 또한 수중유 (oil-in-water) 에멀젼의 형태일 수도 있다. 유상은 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 또는 광유, 예를 들어 액체 파라핀 또는 이들의 혼합물들일 수 있다. 적합한 유화제들은 천연 (naturally-occurring) 검들, 예를 들어 아카시아 검 또는 트라가칸스 검, 천연 포스파티드들, 예를 들어 대두, 레시틴, 및 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 에스테르들 또는 부분 에스테르들, 무수물들, 예를 들어 소르비탄 모노리에이트, 및 상기 부분적 에스테르들과 에틸렌 옥사이드, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노리에이트의 축합 포화 (condensaturatedion) 생성물들일 수도 있다. 에멀젼들은 또한 감미제 및 향미제를 함유할 수도 있다.
시럽들 및 엘릭시르들은 감미제들, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로스와 함께 제제화될 수도 있다. 이러한 제제는 또한 완화제, 방부제, 및 향미제 및 착색제를 함유할 수도 있다. 제약 조성물들은 살균된 주사용, 수성 현탁액 또는 유성 현탁액의 형태일 수도 있다. 이 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수도 있다. 멸균 주사 가능한 조제는 또한 예를 들어 1,3-부탄디올 내 용액으로서, 비독성 제약 상 허용 가능한 희석제 또는 용매 내 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액일 수도 있다. 채용될 수도 있는 허용 가능한 비히클들 및 용매들 중에는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 이에 더하여, 멸균, 불휘발성 오일들 (fixed oils) 이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 채용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 무자극 불휘발성 오일 (bland fixed oil) 이 채용될 수도 있다. 이에 더하여, 올레산과 같은 지방산이 주사용 조제에 사용된다.
본 개시의 화합물들은 또한 화합물들의 직장 투여를 위해 좌약의 형태로 투여될 수도 있다. 이들 조성물들은 상온에서 고체이지만 직장 온도에서 액체이고 따라서 약물을 방출하기 위해 직장에서 용융될 적합한 비자극성 (non-irritating) 부형제와 약물을 혼합함으로써 조제될 수 있다. 이러한 재료들은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜들이다.
비경구 투여를 위한 조성물은 무균 배지로 투여된다. 사용된 비히클 및 제제 내 약물의 농도에 따라, 비경구 제제는 용해된 약물을 함유하는 용액 또는 현탁액일 수 있다. 국소 마취제들, 방부제들 및 완충제들과 같은 보조제들 또한 비경구 조성물들에 첨가될 수 있다.
예들
다음의 예들은 본 명세서에 기술된 조성물들, 방법들, 및 제제들의 범위에 대해 예시적이고 비제한적이다.
바이러스 생성. Vero E6 세포들 (ATCC CRL-1586) 을 10 ％ FBS, 1xPenStrep (Corning 20-002-CL), 2 mM L-글루타민 (Corning 25-005-CL) 을 함유하는 완전 DMEM (Corning 15-013-CV) 을 T225 플라스크에서 37 ℃, 5 ％ O2에서 하룻밤 평판 배양하였다 (plate). 플라스크 내의 배지를 제거하고 완전 DMEM 내의 2 mL의 SARS-CoV-2 균주 USA-WA1/2020 (BEI Resources NR-52281) 을 0.5의 MOI로 플라스크에 첨가하고 30 분 동안 34 ℃, 5 ％ O2에서 인큐베이션하도록 (incubate) 하였다. 인큐베이션 후, 30 mL의 완전 DMEM을 플라스크에 첨가하였다. 이어서 플라스크를 5 ％ CO2의 34 ℃ 인큐베이터에 5 일 동안 두었다. 감염 후 5 일에 상청액을 수확하고 5 분 동안 1,000xg로 원심 분리하였다. 상청액을 0.22 μM 필터를 통해 여과하고 -80 ℃에 저장하였다.
ReFRAME 라이브러리: 화합물 관리, 약물 주석 및 스크리닝 데이터 액세스. ReFRAME 라이브러리 컬렉션은 고품질 DMSO (dimethyl sulfoxide) 에 용해된 거의 12,000 개의 고순도 화합물 (> 95 ％) 로 구성된다. 화합물 품질 제어는 필요시 액체 크로마토그래피-질량 분광법 및/또는 1H-NMR에 의해 수행되었다. 라이브러리는 저농도 (2 내지 10 μM) 스크리닝 포맷 및 고농도 (10 내지 50 μM) 스크리닝 포맷을 지원하기 위해 2 개의 농도, 2 mM 및 10 mM로 조제되었다. Echo-qualified 384-well low dead volume plus microplates (LP-0200-BC; Labcyte Inc.) 는 Echo 555 Liquid Handler (Labcyte Inc.) 를 사용한 음향 전달을 지원하기 위해 라이브러리 소스 플레이트들로서 사용되었다. DMSO에 용해되지 않은 화합물들은 물에 도금되었다 (plate) (129 개의 화합물); DMSO에서 장기 용해도가 결여된 화합물들은 침전을 방지하기 위해 디스펜싱 직전에 현탁되었다 (71 개 화합물).
연관된 화합물 주석 (표 1) 은 널리 사용되는 3 개의 상용 약물 경쟁 정보 데이터베이스에 의해 지원된다: Clarivate Integrity, GVK Excelra GoStar 및 Citeline Pharmaprojects. 이용 가능한 바와 같이, 주석 데이터는 임상 개발 상태 및 달성된 가장 높은 개발 단계, 작용 메커니즘, 약물 징후(들), 및 투여 경로를 포함할 수도 있다.
HeLa - ACE2 안정한 세포주. HeLa-ACE2 세포들은 인간 ACE2 렌티바이러스의 형질 도입 (transduction) 을 통해 생성되었다. 렌티바이러스는 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, 11668019) 을 사용하여 pBOB-hACE2 구조체 및 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pMDL, pREV 및 pVSV-G (Addgene) 를 사용한 HEK293T 세포들의 공-형질 감염 (co-transfection) 에 의해 생성되었다. 형질 감염 (transfection) 후 48 시간 후에 상청액이 수집되고 이어서 사전 시딩된 HeLa 세포들을 형질 도입하는데 (transduce) 사용하였다. 형질 도입 12 시간 후 안정한 세포주들을 수집하고, 스케일 업하고 (scale up), 저장하였다. 세포들은 37 ℃, 5 ％ O2에서 10 ％ FBS (Gibco, 10438026) 및 1x 나트륨 피루베이트 (Gibco, 11360070) 와 함께 DMEM (Gibco, 11965-092) 에서 유지되었다.
SARS- CoV -2/ HeLa - ACE2 고-함량 스크리닝 분석. 화합물들은 384-웰 μ클리어-보텀 플레이트들 (μ로 음향적으로 전달되었다 (Greiner, Part. No. 781090-2B). HeLa-ACE2 세포들은 웰 당 1.0 x 103 세포들의 밀도로 2 ％ FBS를 갖는 13 ㎕ DMEM에 시딩하였다. 평판 배양된 세포들은 BSL3 설비로 이송되었고, 여기서 분석 배지에 희석된 13 ㎕의 SARS-CoV-2가 1 차 스크리닝을 위해 분석 MOI (multiplicity of infection) = 2.2로 웰 당 첨가되었고, 분말 재확인을 위해 0.65로 조정된다. 플레이트들은 34 ℃, 5 ％ O2에서 24 시간 동안 인큐베이션되고, 이어서 최종 농도 4 ％ 포름알데하이드로 34 ℃, 5 ％ O2에서 1 시간 동안 고정된다. 플레이트들은 고정과 후속하는 1 차 및 2 차 항체 염색 사이에 1xPBS 0.05 ％ Tween 20으로 세척되었다. Perm/Wash 버퍼 (BD Biosciences 554723) 에서 1:500으로 희석된 인간 폴리클론 혈장 (polyclonal plasma) 을 플레이트에 첨가하고 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 8 ㎍/mL (1:250 희석) 의 염소 항-인간 H+L 컨쥬게이트된 (conjugate) Alexa 488 (Thermo Fisher Scientific A11013) 과 SuperBlock T20 (PBS) 버퍼 (Thermo Fisher Scientific 37515) 의 8 μM의 안티페이드-46-디아미디노-2-페닐인돌 (antifade-46-diamidino-2-phenylindole) (DAPI; Thermo Fisher Scientific D1306) 의 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 플레이트들은 웰 당 4 개의 필드들을 이미징하는, 10x 대물 렌즈를 갖는 ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System (Molecular Devices) 을 사용하여 이미징되었다. 이미지들은 감염된 세포들의 식별을 유도하는, 숙주-세포 핵 (이미지들 내 총 세포 수) 및 SARS-CoV-2 면역 형광 신호를 식별하는 DAPI 염색과 함께, Multi-Wavelength Cell Scoring Application Module (MetaXpress) 을 사용하여 분석되었다.
첨가 시간 (Time of addition; TOA ) 분석. HeLa-ACE2 세포들은 34 ℃, 5 ％ O2에서 1 시간 동안 1.5의 MOI에서 분석 배지 (2 ％ FBS를 갖는 DMEM) 내 현탁액에서 SARS-CoV-2로 감염되었고, 이어서 PBS로 광범위하게 세척되고 표준 HeLa-ACE2 감염 분석을 위한 화합물들로 사전 스팟팅된 (pre-spot) 분석-준비된 384-웰 플레이트들에 평판 배양되었다 (plate). 시간 경과 실험을 위해, 세포들은 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 및 24 hpi에서 4 ％ 포름알데히드의 최종 농도로 고정되고 TOA 분석을 위한 최적의 시점을 결정하기 위해 표준 감염 분석에 대해 염색되고 이미징된다. TOA 분석은 10 hpi로 고정된 세포들을 사용하여 동일한 방식으로 수행되었다.
Calu -3 고-함량 스크리닝 분석. 이 분석은 다음의 예외들을 제외하고 HeLa-ACE2 분석에 대해 개괄된 (outline) 바와 같이 수행된다. NCATS/NIH의 Dr. Catherine Chen과 Scripps Research의 Dr. Juan Carlos de la Torre로부터 일종의 선물인 Calu-3 세포들 (ATCC HTB-55) 이 분석 배지 (2 ％ FBS를 갖는 MEM) 에서 웰 당 20 ㎕ 당 5,000 개의 세포들의 밀도로 시딩되었고, 30 내지 60 ％까지의 감염된 세포들을 달성하기 위해 분석 배지에 희석된 SARS-CoV-2는 0.75 내지 1의 MOI로 첨가되었다. 플레이트들은 34 ℃, 5 ％ O2에서 48 시간 동안 인큐베이션되었고, 이어서 4 ％ 포름알데하이드의 최종 농도로 고정되었다. 고정된 세포들은 HeLa-ACE2 분석에서와 같이 염색되고 이미지화되었다.
감염되지 않은 숙주 세포 세포 독성 ( cytotoxicity ) 카운터 스크리닝. HeLa-ACE2 세포들의 경우, 화합물들은 1,536-웰 μ클리어 플레이트들 (Greiner Part. No. 789091) 로 음향적으로 전달되었다. HeLa-ACE2 세포들은 감염 분석에 대해 기술된 바와 같이 유지되고, 2 ％ FBS와 함께 DMEM에서 400 세포/웰로 분석-준비된 플레이트들에 시딩되고 플레이트들은 37 ℃, 5 ％ CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션되었다. 세포 생존력을 평가하기 위해, Image-iT DEAD 그린 시약 (Thermo Fisher) 은 제조사 지침들에 따라 사용되었다. 세포들은 4 ％ 파라포름알데하이드로 고정되고, DAPI로 대조 염색되었다. 고정된 세포들은 10x 대물 렌즈를 가진 ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System (Molecular Devices) 을 사용하여 이미징되었고, Live Dead Application Module (MetaXpress) 을 사용하여 획득된 이미지들에서 웰 당 총 생존 세포들이 정량화되었다.
Calu-3 세포들에 대해, 화합물들은 웰 당 5 ㎕ 당 600 개의 세포들의 밀도로 분석 배지 (2 ％ FBS를 갖는 MEM) 에 Calu-3 세포들을 시딩하기 전에 1,536-웰 플레이트들 (Corning No. 9006BC) 내로 음향적으로 전달되었다. 플레이트들은 37 ℃, 5 ％ CO2에서 48 시간 동안 인큐베이션되었다. 세포 생존력을 평가하기 위해, 물에 희석된 2 ㎕의 50 ％ Cell-Titer Glo (Promega No G7573) 를 세포들에 첨가하고 발광을 EnVision Plate Reader (Perkin Elmer) 상에서 측정하였다.
HepG2 (ATCC HB-8065) 및 HEK293T (ATCC CRL-3216) 포유류 세포주들은 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 5 ％ CO2와 함께, 37 ℃에서 10 ％ 열-불 활성화된 HyClone FBS (GE Healthcare Life Sciences), 100 IU 페니실린, 및 100 ㎎/mL 스트렙토마이신 (Gibco) 과 함께 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco) 에 유지되었다. 적중 화합물들의 포유류 독성을 분석하기 위해, 750 HepG2 및 375 HEK293T 세포/웰을 40 μM에서 시작하는 3 배 연속 희석으로 음향적으로 전달된 화합물들을 담는, 1536-웰, 백색, 조직 배양 처리된, 솔리드 하단 플레이트들 (solid bottom plates) (Corning, 9006BC) 의 분석 배지 (DMEM, 2 ％ FBS, 100 IU 페니실린 및 100 ㎎/mL 스트렙토 마이신) 에 각각 시딩하였다. 72-시간 인큐베이션 후, Calu-3 세포들에 대해 세포 생존력을 정량화하기 위해 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega No G7573) 을 사용하였다.
SARS- CoV -2 1 차 ALI HBEC 모델. 정상 1 차 인간 기관지 상피 세포 (HBEC) (Lonza) 는 PneumaCult™-ALI 배지 (Stemcell Technologies) 를 사용하여 적어도 4 주 동안 공기 액체 계면에서 1 ㎛ PET 필터 (Sigma) 가 있는 Millicell-96 세포 배양 삽입 플레이트들에서 배양되었다. 간략하게, HBEC들은 PneumaCult™-Ex Plus 배지에 침지된 웰 당 10,000 개의 세포들을 시딩하기 전에 먼저 세포 배양 플라스크에서 팽창되었다. 1 주 후, 세포들을 PneumaCult™-ALI 배지로 전환하고 배지를 선단 표면 (apical surface) 으로부터 제거하였다. 공기 액체 계면이 유지되고, 배지는 세포들의 분화를 허용하도록 적어도 4 주 동안 2 내지 3 일마다 교환된다. 감염 전에, 선단 표면은 DPBS로 한번 린스되었고 화합물들은 기저 측 챔버에 첨가되었다. 20,000 PFU SARS-CoV-2 균주 USA-WA1/2020을 50 ㎕ PBS의 선단 표면에 첨가하고 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 접종물이 제거되고, 세포들은 DPBS로 1 회 린스된다. 배지를 교환하고, 감염 후 24 시간 및 48 시간에 새로운 화합물을 첨가하였다. 선단 세척은 15 분 동안 선단 표면에 100 ㎕ DPBS를 첨가함으로써 감염 후 72 시간에 수집되었다. RNA는 PureLink™ Pro 96 Viral RNA/DNA Purification Kit (Thermo Fisher) 를 사용하여 선단 세척으로부터 분리되고, SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR 키트 (Thermo Fisher) 및 2019-nCoV N1 CDC 프라이머 및 프로브 세트 (Integrated DNA Technologies) 를 사용하여 RT-qPCR에 의해 바이러스 RNA 레벨에 대해 분석되었다. 표준 곡선은 스톡 바이러스의 연속적인 희석물들로부터 RNA를 분리함으로써 생성되고 샘플 각각에 대한 PFU 등가물/mL를 결정하는데 사용된다. 이어서 중성 DMSO 대조군과 비교하여 실험 화합물 치료제 각각에 대해 바이러스 부하 감소를 결정하고 로그 스케일로 플롯팅하였다. 세포 독성은 제조사의 지시들에 따라 LDH (Cytotoxicity Detection kit) (Sigma) 를 사용하여 기저 측 배지에서 LDH 활성을 측정함으로써 평가되었다. 실험 샘플들에 대해 평균을 취하고 양성 대조 퓨로마이신의 백분율로 제시하였다. 항바이러스성 판독 및 세포 독성 판독 모두에 대해 기술적인 삼중으로 (technical triplicate) 실행하였다.
골든 시리아 햄스터 (Golden Syrian Hamster) SARS- CoV -2 효능 모델. 8 주령의 골든 시리아 햄스터들 (Charles River) (그룹 당 5 마리) 은 지시된 바와 같이 경구 (per os; PO) 투약되었다. 제 1 투약 (dose) 후 4 시간 동안, 햄스터들은 100 ㎕의 DMEM에서 동물 당 106 개의 총 PFU의 비강 내 설치를 통해 감염되었다. 햄스터들에 화합물을 하루 2 번 (BID) 투약하고 연구 기간 동안 체중을 쟀다. 감염 후 5일에, 햄스터들을 희생시키고, 분석을 위해 폐 조직을 분리하였다. 연구 프로토콜은 Scripps Research IACUC 프로토콜 #20-0003에 따라 승인되고 수행되었다.
폐 바이러스 역가 결정. SARS-CoV2 역가는 100 ㎛ 세포 스트레이너 (Myriad 2825-8367) 를 사용하여 DMEM 2 ％ FCS에서 기관을 균질화함으로써 측정되었다. 균질화된 장기를 6 단계에 걸쳐 1:10으로 적정하고 Vero 세포 위에 적층하였다. 37 ℃에서 1 시간의 인큐베이션 후, DMEM 오버레이 내 1 ％ 메틸셀룰로스가 첨가되고, 세포들은 37 ℃에서 3 일 동안 인큐베이션되었다. 세포들은 4 ％ PFA로 고정되고 플라크들은 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 계수되었다.
약동학 연구. 약동학 연구들은 IACUC 가이드 라인 (IACUC Protocol #09-0004-5) 에 따라 Scripps Research Institute의 Animal Models Core에서 수행되었다. 8 주령 수컷 시리아 햄스터들 (Charles River) (그룹 당 3 마리) 은 화합물 및 제제 각각에 대해 지시된 바와 같이 PO 투약되었다. 테스트 항목 각각의 혈장 농도는 48 시간까지 모니터링되었다. 넬피나비르는 약동학 연구 및 효능 연구 모두를 위해 10 ％ DMSO/90 ％ 옥수수 오일로 제제화되고 MK-4482는 10 ％ PEG400/2.5 ％ Cremaphor RH40에서 제제화되었다.
햄스터 폐 RNA 분석. 감염되지 않은 (U, n = 2), 비히클 처리된 (V, n = 4) 및 MK-4482 처리된 (T, n = 4) 샘플로부터의 햄스터 폐를 RNASeq 플랫폼을 사용하여 분석하였다. 평균 절대 편차 (MAD) 는 python 패키지 scipy.stats.median_absolute_deviation을 사용하여 모든 유전자들에 대해 계산되었다. 22,284 개의 유전자들을 14,939 개로 필터링하는 고 MAD 값들을 선택하도록 StepMiner 알고리즘 (Sahoo, D., Dill, D.L., Tibshirani, R. & Plevritis, S.K. Extracting binary signals from microarray time-course data. Nucleic Acids Res 35, 3705-3712, doi:10.1093/nar/gkm284 (2007)) 를 적용하였다. StepMiner 알고리즘은 다시 14,939 개 유전자들을 8,617 개 유전자들로 필터링하도록 적용되었다. 계층적 응집 클러스터링 분석이 python seaborn clustermap 라이브러리 함수를 사용하여 이들 8,617 개 유전자에 대해 수행되었다. 차동 발현 분석이 DESeq227 (MK-4482 처리 샘플 vs 비히클 처리 샘플) 을 사용하여 수행되고 상향/하향 조절된 유전자를 식별하기 위해 조정된 pvalue < 0.1 및 |배수 변화의 log2| > 1이 적용된다. 차동 발현된 유전자의 Reactome 경로 분석 (Fabregat, A. et al. The Reactome Pathway Knowledgebase. Nucleic Acids Res 46, D649-D655, doi:10.1093/nar/gkx1132 (2018)) 이 유전자 세트가 풍부한 고 레벨 생물학적 프로세스들을 확인하기 위해 수행되었다. x-축으로서 -log10 (fdr) 을 사용한 바 플롯은 풍부한 생물학적 프로세스들의 중요성을 입증하기 위해 사용된다.
RNA 시퀀싱 ( RNASeq.) RNA 시퀀싱 라이브러리들은 25 이전에 기술된 바와 같이 Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold with TruSeq Unique Dual Indexes (Illumina, San Diego, CA) 를 정확히 사용하여 생성되었다. 간략하게, 샘플들은 RNA 전단 시간을 5 분으로 수정하는 것을 제외하고 제조사의 지시들에 따라 프로세싱되었다. 발생된 라이브러리들은 캘리포니아 샌디에이고 대학의 IGM (Institute of Genomic Medicine) 에 의해 샘플 당 약 2,500만 내지 4,000만 판독의 깊이로 100 bp (basepair) PE100 (Paired End) 로 다중화되고 시퀀싱되었다. 샘플들은 bcl2fastq v2.20 변환 소프트웨어 (Illumina, San Diego, CA) 를 사용하여 역다중화되었다. RNASeq 데이터는 kallisto (버전 0.45.0), Mesocricetus auratus genome (MesAur1.0) 을 사용하여 프로세싱되었다. 유전자-레벨 TPM 값들 및 유전자 주석들은 tximport 및 biomaRt R 패키지를 사용하여 계산되었다. TPM > 1이면 log2 (TPM) 및 TPM <= 1이면 TPM - 1을 사용하여 축소된 데이터 및 로그를 구성하도록 사용자 지정 (custom) python 스크립트가 사용되었다. 햄스터 연구를 위해 kallisto 지수는 Mesocricetus_auratus.MesAur1.0.ncrna.fa.gz + Mesocricetus_auratus MesAur1.0 cdna.all.fa.gz에 대해 준비되었다. 미가공 데이터 및 프로세싱된 데이터는 Gene Expression Omnibus에 보관된다 (deposit) (NCBI GEO로부터 GSEID 계류 중).
햄스터 폐 조직 병리학/ 침윤물 (Infiltrate) 정량화. ImageJ 소프트웨어는 H & E 염색된 슬라이드 이미지를 (20x 배율로) 정량화하는데 사용되었다. 이미지들은 먼저 8-Bit로 변환되고 (Image > Type > 8-Bit), 문턱 값이 조정되고 (Image > Adjust > 문턱 값), 70 내지 80 ％ 사이의 문턱 값이 어둡게 염색된 핵만이 검출되도록 선택된다. 문턱 값 설정 후 이미지는 마스크로 변환되고 (Process > Binary > Convert to Mask) 기본 설정으로 분석되고 (Analyze > Analyze Particles), 디스플레이 결과들을 추가하고 아웃라인을 보여주고 출력은 GraphPad Prism (V9.0.0) 로 익스포트되고, 여기서 비모수적, 양면 Mann-Whitney 통계 테스트가 유의성을 계산하기 위해 사용되었다.
데이터 분석. 고-콘텐트 이미지 분석이 MetaXpress (버전 6.5.4.532) 를 사용하여 수행되었다. 1 차 시험관 내 스크리닝 및 숙주 세포 세포 독성 카운터 스크리닝 데이터는 Genedata Screener, 버전 16.0.3-Standard에 업로드되었다. HeLa-ACE2 데이터는 중성 (DMSO) - 억제제 대조군으로 정규화되었다 (HeLa-ACE2 세포들에서 항바이러스 효과를 위해 2.4 μM 렘데시비르 그리고 감염된 숙주 세포 독성에 대해 10 μM 퓨로마이신). Calu-3 감염 분석 데이터는 중성 (DMSO) - 억제제 대조군 (10 μM 렘데시비르) 으로 정규화되고, Calu-3 세포 수 판독에 대해 총 세포는 자극기 (10 μM 렘데시비르) - 중성 대조군 (DMSO) 으로 정규화되었다. 감염되지 않은 숙주 세포 세포 독성 카운터 스크리닝을 위해, 40 μM 퓨로마이신 (Sigma) 은 HeLa-ACE2, HepG2 및 HEK293T 세포에서 양성 (억제) 대조군으로 사용되었고, 30 μM 퓨로마이신 (Sigma) 은 Calu-3 세포에 대해 양성 (억제) 대조군으로 사용되었다. 용량 반응 실험들을 위해, 화합물들은 상이한 분석 플레이트들 상에서 기술적인 삼중으로 테스트되었고, 용량 곡선들은 4 개의 파라미터 Hill Equation과 피팅되었다 (fit). 기술 복제 데이터는 중앙값 응축을 사용하여 분석되었다. 기하학적 평균 및 기하학적 표준 편차는 복수의 독립적인 생물학적 실험들에서 획득된 화합물 활성도 (EC50s 및 CC50s) 에 대해 보고되었다. R (버전 3.6.3) 의 synergyfinder package가 시너지 분석을 위해 사용되었다 Ianevski, A., He, L., Aittokallio, T. & Tang, J. SynergyFinder: a web application for analyzing drug combination dose-response matrix data. Bioinformatics 33, 2413-2415, doi:10.1093/bioinformatics/btx162 (2017)). 기하학적 평균은 모든 값들의 로그 (밑수 10) 를 계산하고, 이들 로그들의 평균을 계산하고, 그리고 그 평균의 역로그를 취함으로써 계산된다. 기하 표준 편차들은 로그 변환된 개별 값들의 표준 편차를 취하고 표준 편차의 역로그를 취함으로써 계산된다. 기하 표준 편차는 단위가 없고 +/- 대신 ×÷로 보고된다. 즉, 보고된 0.123 μM ×÷ 1.276에 대해, 표준 편차 범위는 0.096 μM 내지 0.157 μM (즉, 0.123 μM ÷ 1.276 내지 0.123 μM × 1.276) 이다.
SARS- CoV -2에 대한 고 처리량 Calu -3 표현형 ReFRAME 스크리닝. 상대적으로 신속한 24 시간 HeLa-ACE2 분석을 보완하고 적중의 우선 순위를 지정하기 위해, (상기 (supra)) SARS-CoV-2 감염 후 48 시간에 판독 (hpi) 과 함께, 동일한 항체 검출 및 유사한 분석 워크플로우에 의존하는 Calu-3 세포들을 사용하여 두 번째, 보다 생리적으로 관련된 감염 분석을 개발했다. Calu-3은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 프로세싱 및 숙주 세포 내로의 바이러스 진입에 필요한 ACE2 수용체 및 숙주 세린 프로테아제 TMPRSS2 모두를 내인적으로 발현하는 인간 폐 상피 세포들이지만 (Hoffmann, M. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell 181, 271-280 e278, doi:10.1016/j.cell.2020.02.052 (2020)), TMPRSS2 발현이 결여된 HeLa-ACE2 세포의 강력한 감염은 일반적으로 코로나 바이러스에 대해 인식된 메커니즘인, 아마도 엔도좀, 카텝신-매개된 바이러스 진입 경로에 의존적일 것이다(Yang, N. & Shen, H. M. Targeting the Endocytic Pathway and Autophagy Process as a Novel Therapeutic Strategy in COVID-19. Int J Biol Sci 16, 1724-1731, doi:10.7150/ijbs.45498 (2020)).
렘데시비르는 TMPRSS2 억제제 나파모스타트 메실레이트 (nafamostat mesylate) (EC50 = 24 nM ×÷ 1.55 (n = 3)) 와 같이 Calu-3 세포에서 활성이었다 (EC50 = 444 nM ×÷ 1.514 (n = 4)). HeLa-ACE2 스크리닝과 대조적으로, 세포 변성 효과는 (아마 보다 높은 MOI 및 사용된 보다 긴 인큐베이션 시간으로 인해) Calu-3 분석에서 보다 두드러졌다. 그 결과, 항바이러스 화합물들은 또한 바이러스-유도된 세포 사멸로부터 세포들을 보호하고, 화합물 항-바이러스 활성과 관련된 제 2 메트릭을 제공한다. 특히, 52 개의 HeLa-ACE2 ReFRAME 적중들의 대부분은 Calu-3 세포-기반 분석에서 활성이 아니거나 (58 ％, 30/52) 선택적이지 않았다.
HeLa-ACE2 및 Calu-3 세포들에서 활성의 제한된 중첩은 Calu-3 세포들을 사용하여 ReFRAME 라이브러리의 재-스크리닝을 촉발시켰다. 스크리닝은 2.5 μM, RZ' = 0.744의 최종 농도에서 수행되고, 50 ％ 초과의 감염 억제, 80 ％ 미만의 세포 독성 또는 40 ％ 초과의 감염 억제 및 40 ％ 초과 세포 수의 증가 (바이러스 유발 세포 사멸로부터 보호) 를 입증하는 235 개의 1 차 적중이 확인되었다. 이들 중 145 개는 용량-응답 포맷 (EC50 < 10 μM) 으로 테스트될 때 중간 정도의 활성이었지만, 42 개만이 또한 선택적이었다 (CC50/EC50 > 10 또는 CC50 > 30 μM). 88 개의 추정되는 적중 화합물이 새로운 분말 스톡으로 테스트하도록 선택되고 (CC50/EC50 > 5 또는 CC50 > 30 μM, CC50/EC50 < 5이지만 감염되지 않은 세포 독성 분석에서 50 ％ 미만 감소, 그리고 EC50 < 1 μM을 갖는 3 개의 추가 화합물들은 감염된 세포 수 판독에서 보호를 보임) 87 개는 강력한 것으로 재확인되고 41 개는 또한 Calu-3 세포에서 선택적인 것으로 재확인되었다. 41 개의 재확인된 Calu-3 ReFRAME 적중들은 마찬가지로 HeLa-ACE2 감염 분석에서 재 테스트되었다. 이들 중 63 ％ (26/41) 는 HeLa-ACE2 세포에서 SARS-CoV-2에 대해 불활성인 반면, 34 ％ (14/41) 는 활성이지만 강한 세포 독성이었고, CC50은 감염되지 않은 HeLa-ACE2 세포에서 3 μM 미만이었다. 엔도좀 카텝신-매개된 진입 억제제 식별. Calu-3 분석에서 HeLa-ACE2 ReFRAME 적중의 제한된 활성 소스 중 하나가 세포주 각각에서 바이러스에 의해 사용되는 진입 메커니즘이기 때문에, TMPRSS2-진입의 맥락에서 활성일 것 같지 않은, ReFRAME 적중들 중 카텝신 매개된 바이러스 진입 억제제를 식별하기 위해 HeLa-ACE2 세포에서 TOA (time of addition) 분석을 확립하였다. 먼저 감염의 동역학을 결정하기 위해, HeLa-ACE2 세포들을 SARS-CoV-2로 1 시간 동안 감염시키고, 그 후 흡착되지 않은 바이러스는 세척되고, 세포들을 10 μM의 최종 농도로 DMSO, 하이드록시클로로퀸, 아필리모드, 또는 렘데시비르의 존재하에 세포들이 384-웰 플레이트들에 평판 배양되었다. 웰들 내의 세포들은 지시된 바와 같이, 4 내지 24 hpi로 고정되고 시점 각각에서 감염된 세포 백분율이 정량화되었다.
렘데시비르를 제외한 모든 치료제들에서, 바이러스 감염은 6 hpi에서 항체 염색에 의해 처음으로 나타나고 10 내지 12 hpi에서 거의 최대 레벨에 도달하였다. 치료가 1 hpi에서 개시될 때 아필리모드 및 하이드록시클로로퀸 모두의 활성의 손실은 이들 화합물들이 HeLa-ACE2 세포에서 바이러스 진입을 차단하는 한편, 렘데시비르 치료는 직접적인 항바이러스 작용 메커니즘과 일치하여 1 hpi에서 치료의 개시에도 불구하고 감염을 효과적으로 차단한다는 것을 나타낸다.
이들 결과들에 기초하여, 본 발명자들은 용량 반응에서 모든 HeLa-ACE2 ReFRAME 적중들의 활성을 평가하는 (상기) TOA 분석에서 복제 사이클들을 제한하기 위해 10 hpi 시점을 사용하였다. 본 발명자들은 Calu-3 세포에서 불활성인 화합물들의 33 ％ (10/30) 는 TOA 분석에서 활성도의 감소, 즉 표준 24 h 사이 및 TOA 분석의 10보다 큰 EC50 비에 기초하여 HeLa-ACE2의 진입 억제제임을 발견했다. 반대로, Calu-3 세포들에서도 활성이었던 (EC50 < 10 μM) 화합물은 이 문턱 값에서 진입 억제제로 명확하게 분류될 수 없다. 오시머티닙 및 MK-2206은 각각 8 초과의 비를 갖고, HeLa-ACE2 세포의 바이러스 진입에 관여할 수도 있지만, Calu-3 세포에서 이들의 항바이러스 활성은 비특이적이다 (SI < 2).
ReFRAME 적중 우선 순위 지정 및 유효성 검사. ReFRAME 라이브러리는 생체 활성 소분자들의 컬렉션이고, 대부분은 승인된 약물들이거나 개발의 임상 단계에 있고 다양한 적응증에 사용된다. HeLa-ACE2 스크리닝에서 분말로 재확인된 상위 5 개 부류의 강력하고 선택적인 화합물은 종양 용해성 화합물 (9), 이온 채널 조절제 (7), 소염제 (5), 항바이러스성 (5) 및 신호 전달 조절제 (5) 이고, Calu-3 스크리닝에서 상위 5 개 부류는 신호 전달 조절제 (14), 종양 용해성 화합물 (11), 프로테아제 억제제 (7), 항생제 (3) 및 이온 채널 조절제 (3) 였다. 두 스크리닝들에서 강력하고 선택적인 적중들의 5 분의 1은 빠르게 증식하는 세포들에 존재하는 숙주 세포 프로세스들에 대한 바이러스의 의존성을 반영하는, 종양 용해성 약물들로서 분류될 수 있다. HeLa-ACE2 세포들에서만 항정신병제 및 항기생충 (소외 열대성 질병들 (neglected tropical diseases)) 부류들에 속하는 화합물들의 식별은 이들 분자들 중 일부의 양이온성 양친매성 (amphiphilic) 특성 및 산성 세포 내 구획들 (예를 들어, 후기 엔도좀/ 리소좀) 에 축적되고 영향을 주는 능력을 반영할 수도 있다. 엔도-리소좀 경로 및 지질 항상성의 결과적인 조절 이상은 바이러스 진입 및/또는 복제를 손상시키는 것으로 제안되었고 (Salata, C., Calistri, A., Parolin, C., Baritussio, A. & Palu, G. Antiviral activity of cationic amphiphilic drugs. Expert Rev Anti Infect Ther 15, 483-492, doi:10.1080/14787210.2017.1305888 (2017)), 이 작용 모드는 아미오다론 및 하이드록시클로로퀸에 대해 추측되고, 둘 다 HeLa-ACE2 스크리닝에서 SARS-CoV-2에 대한 강력하고 선택적인 적중으로 확인되었다. 그러나, 하이드록시클로로퀸만이 이 분석에서 진입 억제제로 확인되었다.
고 관심의 1 차 스크리닝에서 적중으로 확인된 화합물들로부터 HeLa-ACE2 및 Calu-3 분석 모두에서 활성이고 선택적이고 HeLa-ACE2 세포에서 진입 억제제로 분류되지 않은 렘데시비르와 유사한 프로파일을 갖는 화합물들이 있다. 전구 약물 (prodrug) MK-4482의 모체, N-하이드록시시티딘은 MK-4482 자체가 시험관 내에서 활성이 아니었지만, 아마도 활성 형태로 전환될 대사의 결여로 인해 프로파일과 매칭되었다.
부가적으로, Calu-3에서 활성이지만 HeLa-ACE2 세포에서 활성이 아닌 나파모스타트 메실레이트, TMPRSS2 억제제와 같은 화합물들은 발전된 감염 모델에서 활성일 가능성이 있다. 반대로, Calu-3 세포들에서 활성이 아닌 HeLa-ACE2 세포들의 진입 억제제들 (예를 들어, 아필리모드, 하이드록시클로로퀸, 아지트로마이신 (azithromycin)) 은 우선 순위가 떨어진다. 이 우선 순위에 기초하여, 본 발명자들은 감염의 직교 공기-액체 계면 1 차 인간 기관지 상피 세포 (ALI-HBEC) 모델에서 SARS-CoV-2에 대한 대표적인 적중들의 활성을 테스트하였다. 이들 분화된 기도 세포들은 고 레벨의 ACE2 및 TMPRSS2 모두를 발현한다. 예상된 바와 같이, 렘데시비르 및 나파모스타트 메실레이트는 ALI-HBEC에서 바이러스 복제를 억제하는 한편, 아필리모드는 그렇지 않았다. 더욱이, 넬피나비르 메실레이트, MK-4482 및 이의 모 N-하이드록시시티딘은 모두 72 hpi에서 선단 바이러스 부하들에서 > 1-log 감소를 유발한다. 이 결과들은 본 발명의 적중 우선 순위 모델과 일치한다.
전반적으로, 본 발명자는 이 분석 모두에서의 활성 및 상대적으로 높은 노출 또는 치료제로서의 긴 사용 이력 및 따라서 동물 모델들에서 추가 유효성 검사 후 COVID-19 치료제로 신속하게 용도 변경될 가능성으로 인해 가장 관심 있는 적중으로 승인된 경구용 약물 할로판트린 HCl, 넬피나비르 메실레이트, 시메프레비르 및 마니디핀을 식별하였다. 바이러스성 프로테아제 억제제인 넬피나비르 및 시메프레비르는 우수한 혈장 노출을 보고하고 이들의 기술된 작용 모드에 기초하여 SARS-CoV-2를 직접적으로 억제할 수도 있다. 승인된 칼슘 채널 차단제 마니디핀은 낮은 혈장 노출을 갖지만 환자들의 COVID-19 질병 결과를 개선할 가능성을 가질 수도 있다. 다양한 개발 단계의 9 개의 다른 화합물들은 또한 스크리닝 분석들 또는 약동학 프로파일들에서 유효성으로 인해 효능을 나타낼 가능성이 높다 (표 참조). TO-195 및 RWJ-56423은 모두 트립신 억제제들이고 아보랄스탯은 바이러스 진입을 차단할 수도 있는 Calu-3 세포들에서 활성인 칼리크레인 (kallikrein) 억제제이다. p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 억제제, LY222820/랄리메티닙 메실레이트는 HeLa-ACE2 및 Calu-3 스크리닝 모두에서 활성이었고 이전에 p38 MAPK23의 억제를 통해 다른 코로나 바이러스들의 복제를 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, p38 MAPK는 코로나 바이러스 복제를 억제하기 위한 중요한 숙주 타깃일 수도 있다. 주목할 점은, 전구 약물 MK-4482 (Molnupiravir, EIDD-2801) 의 모체인 N-하이드록시시티딘은 HeLa-ACE2 및 Calu-3 분석 모두에서 강력하고 선택적인 적중이다. MK-4482는 현재 COVID-19 환자들의 치료에서 Ridgeback Biotherapeutics와 Merck에 의해 평가되고 있는 경구용 항바이러스성 뉴클레오사이드 유사체이다.
MK-4482 경구 투약은 SARS-CoV-2-감염으로부터 완전히 보호한다. ALI-HBEC 1 차 세포 모델에서 입증된 시험관 내 유효성 및 넬피나비르 및 MK-4482/N-하이드록시시티딘의 적절한 노출로 인해 (넬피나비르의 500 ㎎/㎏의 단일 PO 용량에 대해 Calu-3 SARS-CoV-2 EC50에 대한 3 시간까지의 시간 경과, 및 MK-4482의 500 ㎎/㎏의 단일 PO 용량에 대해 HeLa-ACE2 및 Calu-3 EC50에 대한 7 시간 이하의 시간 경과), SARS-CoV-2 감염의 골든 시리아 햄스터 동물 모델에서 넬피나비르 및 MK-4482의 효능을 조사하였다. 넬피나비르는 500 ㎎/㎏ BID로 (매일 2 회) PO 전달하고 MK-4482는 500 ㎎/㎏, 150 ㎎/㎏, 및 50 ㎎/㎏ BID로 PO 전달하여 용량-의존적 보호를 평가하였다. 매칭된 비히클 전용 현탁액이 대조군으로 사용되었다. 첫번째 치료 4 시간 후, 동물들은 비강 내 투여에 의해 1x106 PFU의 SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020) 로 시험되었다 (challenge). 동물들은 질병 진행의 측정치로서 매일 체중을 쟀고, 폐 조직은 바이러스 역가, 폐 조직학 및 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위해 감염 5 일차에 분리되었다. 넬피나비르는 잠재적으로 햄스터에서 부적절한 혈장 노출로 인해 체중 감소 및 바이러스 복제로부터 동물을 보호하지 못했다. 그러나, MK-4482는 500 ㎎/㎏의 심각한 체중 감소로부터 동물들을 보호하고, 감염 5 일째에 시작 체중의 평균 97 ％를 기록했다. 150 ㎎/㎏ 및 50 ㎎/㎏ 그룹은 감염 5 일째에 비히클 대조군 85 ％와 비교하여, 각각 시작 중량의 평균 89 ％ 및 90 ％인, 체중 감소를 통해 부분적인 보호를 나타냈다.
체중 감소에 대한 상관 관계를 분석하기 위해, 크리스탈 바이올렛-기반 플라크 분석을 사용하여 5 일째 폐 샘플로부터 상대적인 바이러스 역가를 결정하였다. 500 ㎎/㎏ 및 150 ㎎/㎏ 용량은 폐에서 검출할 수 없는 생존 바이러스 역가를 갖고, 바이러스 복제로부터 완전한 보호를 나타낸다. 50 ㎎/㎏ 그룹은 평균 4.5 x 103 PFU/폐이고, 평균 4.5 x 105 PFU/폐인 비히클 대조 그룹과 비교하여 적당히 우수한 효능 (99 ％ 바이러스 감소) 을 나타낸다.
500 ㎎/㎏ 치료군에서 체중 감소 및 바이러스 혈증 (viremia) 으로부터의 보호는 햄스터 폐에 대한 RNA Seq 분석에 이어서 감독되지 않은 계층적 클러스터링에 의해 결정된 바와 같이, 숙주 면역 반응으로부터 거의 완전한 보호와 연관되고; MK-4482-치료된 (500 ㎎/㎏) 샘플들은 감염되지 않은 샘플들과 함께 클러스터링되었다. DESeq2 분석은 감염된 비히클-처리된 폐들이 인터페론 신호 전달 및 인터페론 자극된 유전자들을 포함하여, COVID-19에서 상향 조절되는 것으로 보고된 경로들과 연관된 66 개의 유전자들의 발현을 유도한다는 것을 확인하였다 (Tindle, C. et al. Adult Stem Cell-derived Complete Lung Organoid Models Emulate Lung Disease in COVID-19. bioRxiv, doi:10.1101/2020.10.17.344002 (2020); Sahoo, D. et al. AI-guided discovery of the invariant host response to viral pandemics. bioRxiv, doi:10.1101/2020.09.21.305698 (2020)). 마지막으로, 조직학적 검사는 MK-4482-처치된 햄스터들의 폐들이 보호되고 감염되지 않은 동물들의 조직들과 보다 유사하다는 것을 확인하였다. 완전히 대조적으로, 비히클-처리된 대조군에서 폐 조직의 검사는 폐포 공간의 소멸 및 압도적인 면역 세포 침윤을 드러냈다.
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Figure pct00069
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Figure pct00070
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참조로서 인용
본 명세서에 언급된 모든 공보들, 특허들, 및 특허 출원들은 마치 개별 공보들, 특허들, 또는 특허 출원들 각각이 참조로서 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로서 인용된다.

Claims (11)

  1. 이하의 표로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원체에 의해 감염된 피험자를 치료하는 방법.
    Figure pct00071

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  2. 이하의 표로부터 선택된 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원체에 의해 감염된 피험자를 치료하는 방법.
    Figure pct00095

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    Figure pct00105

    Figure pct00106
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 병원체는 코로나 바이러스인, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 병원체는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항감염제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 항감염제는 항바이러스제를 포함하는, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 항바이러스제는 진입-억제 약물들 (entry-inhibiting drugs), 코팅되지 않은 억제 약물들 (uncoating inhibiting drugs), 역전사 억제 약물들 (reverse transcriptase inhibiting drugs), 안티센스 약물들 (antisense drugs), 리보자임 약물들 (ribozyme drugs), 프로테아제 억제제들 (protease inhibitors), 어셈블리 억제 약물들 (assembly inhibiting drugs), 및 방출 억제 약물들 (release inhibiting drugs) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 항바이러스제는 렘데시비르 (remdesivir), 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine), 피로나리딘 (pyronaridine), 아지트로마이신 (azithromycin), 및 파비피라비르 (favipiravir) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 항바이러스제는 아모디아퀸 (amodiaquine),
    Figure pct00107

    및
    Figure pct00108
    , 선택 가능하게 (optionally) 덱사메타손과 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  10. 화학식 RFM-011-200-5에 따른 화합물 또는 이의 제약 상 허용되는 염.
    Figure pct00109
  11. 화학식 RFM-007-454-4에 따른 화합물 또는 이의 제약 상 허용되는 염.
    Figure pct00110
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