KR20230006886A - 분할된-인테인의 안정성과 용해성을 향상시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
단백질 정제 시스템, 및 이러한 시스템의 제조 방법이 본원에 개시되어 있다. 특히, 본 발명은 N-말단 인테인 세그먼트를 고체 지지체에 고정시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은: N-말단 인테인과 동족 폴딩 파트너 사이의 결합을 촉진하는 조건 하에서, 상기 N-말단 인테인 세그먼트를 상기 동족 폴딩 파트너에 노출시키는 단계; 상기 N-말단 인테인을 고체 지지체에 고정시키는 단계; 상기 N-말단 인테인을 상기 N-말단 인테인과 상기 동족 폴딩 파트너 사이의 결합을 파괴시키는 조건 하에 두는 단계; 및 상기 고체 지지체를 세척하여 비-결합된 물질을 제거함으로써 N-말단 인테인 세그먼트를 고체 지지체에 고정시키는 단계를 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 4월 30일자 제출된 미국 임시 출원 제63/018,084호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 포함된다.
연방 지원 연구에 대한 진술
본 발명은 미국 식품 의약청 (NIH)이 수여한 보조금 R21GM126543 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 갖는다.
인테인(intein)은 자연 발생적인 자가-스플라이싱 단백질의 하위도메인으로, 더 큰 단백질 구조로부터 이들의 자체 단백질 하위 도메인을 잘라내는 동안, 앞쪽의 2개의 측접 펩티드 부위 ("엑스테인(extein)")들이 자발적으로 함께 연결되어 성숙한 숙주 단백질을 형성한다.
인테인이 측접하는 펩티드 결합을 재배열하고 이들의 자연적인 엑스테인이 아닌 단백질과 융합할 때에도 활성을 유지하는 능력으로 인해, 다수의 인테인-기반의 생체 기술이 생겨났다. 이들은 다양한 유형의 단백질 라이게이션(ligation) 및 활성화 응용, 뿐만 아니라 단백질 표지 및 추적에 대한 적용도 포함한다. 분할된 인테인은 최근 친화성 크로마토그래피 응용에서 관심을 끌고 있는데, 여기에서 N-인테인 리간드-특정 쌍의 하나의 개별 단백질-는 표준 세포 배양 기술 (보통 미생물 발현)로 재조합에 의해 발현된 후, 고체 크로마토그래피 지지체 매체 (수지, 비드, 막 등)에 고정된다. N-인테인 리간드는 N-말단 인테인 (INTN) 세그먼트를 포함할 것인데, 이는 변형될 수 있고, INTN 세그먼트의 정제, 고정 또는 기능 조절을 돕는 관능기를 추가로 포함할 수 있다. 단백질 정제에 사용되기 위하여, 상응하는 C-말단 인테인 세그먼트 '태그'는 소정의 표적 단백질과 융합하여 발현된 후, 고정된 N-인테인 리간드에 의해 포획됨으로써 자가-절단 친화성 태그로서 작용하여 표적 단백질을 용이하게 정제할 수 있게 한다. 그러나, 자가-절단 태그 응용이 사용가능하려면, (예를 들어, 미국 특허 제10,066,027호 B2에 기재된 바와 같이) N-인테인 리간드는 재조합 시스템에서 경제적으로 제조되어, 정제되고, 고체 기질에 고정되어야 한다.
임의의 종래의 단백질 제조 공정에서 전체 수율은 기본적으로 세포 배양 시 생산되는 단백질의 총량과, 세포로부터 추출될 때 용해성을 유지하는 단백질의 백분율에 의해 제한되는 것이 효과적이다. 재조합 단백질이 세포 배양 시 얼마나 효율적으로 생산되는 지와는 무관하게, 단지 용해성 단백질만 회수하여 종래의 크로마토그래피 기술에 의해 정제할 수 있는데, 이는 불용성 응집체를 형성하는 어느 단백질이 상류에서-발현, 수확, 용해, 세척 또는 여과 단계 중 어느 하나 동안- 제조 공정에서 소실되어 버려질 것이라는 의미이다. 일부의 경우, 불용성 응집체로서 발현되는 단백질은 회수되어 시험관내에서 정제 공정의 일부로서 재폴딩될 수 있으나, 필요한 재폴딩 공정은 개발도 어렵고, 전형적으로는 비효율적이다.
표준 미생물 발효 기술은 재조합 N-인테인 리간드를 약간 높은 발현 역가로 과다-발현할 수 있으나, 단백질의 고유의 구조 -또는 이의 결핍- 때문에 생성된 단백질은 응집되는 경향이 있고, 분해에 취약하며, 세포 숙주로부터 추출될 때 종종 불용성이다. 이로 인해 신뢰할 수 있고 경제적으로 가능성 있는 N-인테인 리간드 제조 공정을 구축하는 것은 매우 어렵다. 사실, 발효에서 발현된 총 단백질의 대부분-때때로 90% 초과-은 세포 용해 이후 불용성인 것으로 보이고, 제조 공정 동안 소실된다. 표준 E. coli 발현으로부터의 생성된 용해성 N-인테인 리간드의 총 수율은, 발현 배양액 1 리터당 10-30 mg 단백질의 규모이며, 이는 가장 상업적으로 가동되는 재조합 단백질 제조 공정보다 대략 두 자릿수(two orders of magnitude) 더 낮다. 이는 분할된-인테인 매개 친화성 크로마토그래피 플랫폼에 대한 상품의 비용 및 생산 비용을 직접적이고 비례적으로 발생시켜서, 이들의 상업적 가능성을 본질적으로 위태롭게 한다.
일반적으로, 용해성은 단백질 조작이 처음 시작한 이래로 과학자와 기술자가 대처하고 있는 통상의 이종 발현에 대한 문제인데 - 많은 잠재적인 해결책을 이용하여 다양한 정도의 성공을 이루었다. 이들 대부분은 통상 생체내에서 적합한 구조적 조립을 촉진시키거나, 가혹한 화학적 재폴딩 처리를 하여 응집체를 생체외에서 재가용화시키는데 중점을 둔다. N-인테인의 적절한 폴딩을 촉진시키기 위한 다수의 접근법들이 생체내에서 시도되었는데, 이는 (예를 들어, Millipore 특허 출원 WO 2016/073228 A1 및 GE 특허 출원 US 2019/0263856 A1에 기재된 바와 같이) 제조 시 약하지만 비일관적으로 전체 용해성 회복을 개선시키는 것으로 나타났다. 심지어 발현되어 적절하게 폴딩되고 세포 배양액에서 용해성일 때에도, 심지어 동일한 생체외 취급 조건 하에서도, 단백질은 비일관적이고 예측할 수 없는 양으로 여전히 자발적이고 독특한 응집화에 매우 민감한 것으로 보인다. 이러한 관찰은 다른 연구 그룹의 문헌 (Shah, Eryilmaz et al. 2013)에 공개된 야생-형 INTN 세그먼트의 구조 연구에 의해 보강된다.
따라서, 필요한 것은 발현된 산물의 용해성와 하류 제조 공정에서의 안정성을 크게 증가시키는 분할된-인테인의 이종 단백질 발현을 위한 방법과 조성물이다.
발명의 개요
본 발명의 목적(들)에 따라서, 본원에서 구현되고 널리 기재된 바에 의하면, 일 양태에서, 본 발명은 발현과 정제 동안 N-인테인 리간드를 안정화시키고, N-인테인 리간드를 정제하고, N-인테인 리간드를 고체 지지체에 고정시키는 방법에 관한 것이다. 특히, N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너 (예를 들어, 상응하는 C-말단 인테인 세그먼트; 단독으로 있거나, 또는 절단성 또는 비-절단성 융합 파트너와 융합됨)의 조립을 통해 안정한 용해성 인테인 복합체를 형성하는 단계; 인테인 복합체를 정제하는 단계; 및 인테인 복합체를 고체 지지체에 고정시키는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 이후, N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너 사이의 결합을 파괴시키고; 상기 고체 지지체를 세척하여 비-결합된 동족 결합 파트너를 제거하는 조건; 및 N-인테인 리간드가 활성 상태로 폴딩되도록 하는 조건을 인테인 복합체에 가한다.
동족 결합 파트너는 C-말단 인테인 (INTC) 세그먼트를 포함할 수 있는데, 이는 N-인테인 리간드에 결합하여 구조화된 용해성 인테인 복합체를 유도한다. N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너는 생체내에서 단일 플라스미드 또는 2-플라스미드 시스템 유래의 단일 세포 내에서 발현되거나, 또는 트랜스 방식으로(in trans) (별개 세포에서 발현되고), 정제 공정 전에 또는 정제 공정 동안 혼합될 수 있다. 이러한 고정은 고체 지지체, 예컨대 크로마토그래피 매체, 막, 또는 자성 비드에 대해 일어날 수 있다. 일 예에서, 크로마토그래피 매체는 고체 크로마토그래피 수지 골격일 수 있다.
동족 결합 파트너를 이용하여 N-인테인 리간드를 안정화시키면, N-인테인 리간드가 임의의 다른 INTC 세그먼트와 결합할 수 없게 된다. 따라서, N-인테인 리간드는 고정된 후 변성되거나 또는 동족 결합 파트너로부터 분리되어야 하며, 이로 인해 동족 결합 파트너가 제거되거나, 세척되거나 또는 N-인테인 리간드로부터 "분리된다". 일단 동족 결합 파트너가 제거되면, 고정된 N-인테인 리간드는 (새로운 파트너와 결합할 수 있는) 활성 상태로 변환되어, 기능성 친화성 포획 매체를 형성해야 한다.
편리한 기질에 공유적으로 결합된 N-인테인 리간드를 포함한 친화성 매체, 뿐만 아니라 제조 공정과 관련된 조성물의 제조 방법이 개시된다. N-인테인 리간드는 내부 N-말단 인테인 세그먼트 (INTN)와 함께 작용가능하게 연결된 융합 파트너를 포함할 수 있다. N-인테인 리간드 내의 INTN 세그먼트는 자연적인 인테인, 예컨대 Npu DnaE 인테인으로부터 유래하였을 수 있다. INTN 세그먼트는 추가로 변형되어 그 이용성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 태그는 (예를 들어, INTN 세그먼트 내에 임의의 시스테인 잔기를 포함하지 않아서, 기질에 대한 단일-지점 부착을 촉진시키기 위해) INTN 세그먼트의 C-말단 잔기 이후의 영역 내에서 INTN 세그먼트에 부착되어 N-인테인 리간드의 정제, 검출 및/또는 용해성 발현의 강화를 도울 수 있다. N-인테인 리간드는 또한 INTN 세그먼트의 C-말단 잔기 이후의 영역 내에 아미노산을 포함하여, N-인테인 리간드를 기질에 공유적으로 고정시킬 수 있다. N-인테인 리간드는 민감성-향상 모티프를 추가로 포함하여, 이의 절단 활성이 외부 조건에 매우 민감해질 수 있다. 민감성-향상 모티프는 INTN 세그먼트의 N-말단에 융합될 수 있다. 외부 조건은 pH, 온도, 아연 이온 농도 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 단백질 정제 매체도 개시되는데, 상기 매체는 고체 지지체에 공유적으로 고정된 N-인테인 리간드를 포함하는데, 상기 N-인테인 리간드 분자의 90% 이상은 동족 결합 파트너에 결합되며, 상기 동족 결합 파트너의 적어도 90%는 원하는 관심 단백질에 융합되어 발현되지 않는다. 상기 동족 결합 파트너는 N-인테인 리간드에 결합된 INTC 세그먼트를 포함하여, 구조화된 용해성 인테인 복합체를 유도할 수 있다.
추가적인 단백질 정제 매체도 개시되는데, 상기 매체는 고체 지지체에 공유적으로 부착된 N-인테인 리간드를 포함하고, 상기 N-인테인 리간드 분자의 .001% 초과는 동족 결합 파트너와 결합되어 있으며, 상기 동족 결합 파트너의 적어도 90%는 원하는 관심 단백질과 융합하여 발현되지 않는다. 다시, 동족 결합 파트너는 N-인테인 리간드에 결합하여 구조화된 용해성 인테인 복합체를 유도하는 INTC 세그먼트를 포함할 수 있다.
또한, 공유-결합된 N-인테인 리간드를 갖는 기본 수지를 포함한 크로마토그래피 수지가 개시되어 있는데, 상기 수지의 측정된 압축 차분(compressibility differential, ΔC)은 이의 기본 수지 기질에 비해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 더 작다.
또한, 공유-결합된 N-인테인 리간드를 갖는 기본 수지를 포함한 크로마토그래피 수지도 개시되는데, 상기 수지의 측정된 본질적 기능성 압축 인자 (IFCF)는 1.10 내지 1.25이다.
또한, 외인성 핵산을 포함한 발현 벡터가 개시되는데, 상기 외인성 핵산은 N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너를 암호화하고, 상기 N-인테인 리간드는 정제 태그와 함께 발현되도록 암화화될 수 있으며, 상기 동족 결합 파트너는 원하는 관심 단백질과 융합하여 발현되도록 암호화되지 않을 수 있다. 또한, 2-플라스미드 시스템도 개시되는데, 여기에서 N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너는 단일 세포 내에 수용된 2개의 별도의 양립가능성 플라스미드에서 암호화된다. 또한, 발현 벡터(들)을 포함하는 세포도 개시된다. 동족 결합 파트너는 원하는 관심 단백질, 예컨대 친화성 태그가 아닌 단백질 또는 펩티드에 융합되어 발현되도록 암호화될 수 있다.
본 발명의 양태는 특정한 법정 범위(statutory class), 예컨대 시스템 법정 범위로 개재되고 주장될 수 있지만, 이는 단지 편의를 위한 것이며, 당업계의 숙련자는 본 발명의 각각의 양태가 어떠한 법정 범위로도 설명 및 주장될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 달리 명확히 기술되지 않는 경우, 본원에 제시된 임의의 방법 또는 양태에서 이의 단계들이 특정한 순서로 실시될 필요가 있다고 이해되지는 않는다. 따라서, 방법 청구항이 청구 범위나 상세한 설명에서 그 단계들이 특정 순서로 국한될 것이라고 특별히 기술되는 않는 경우, 어떠한 양태에서도 순서가 추측되지 않을 것이다. 이것은 단계들의 배열 또는 작동상의 흐름에 대한 논리의 문제, 문법적 구성 또는 구두점에서 나오는 명확한 의미, 또는 본 명세서에 기재된 양태의 수나 종류를 포함한 임의의 가능한 비-표현 해석 기준에 대해서도 적용된다.
본 명세서의 일부로서 포함되어 이를 구성하는 첨부된 도면은, 몇몇 양태를 나타내며, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원칙을 설명하는 역할을 한다.
도 1은 E. coli에서 종래의 단일-산물 과다 발현에 의해 생산된 N-인테인 리간드의 세포 용해물들을 비교한 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 2는 종래의 단일 산물 과다 발현을 동족 결합 파트너와의 공동-발현과 비교한 SDS PAGE 분석을 보여준다.
도 3은 동족 결합 파트너는 변화되거나, 다양한 융합 파트너와 함께 발현될 수 있다는 것을 나타내는 SDS PAGE 분석을 보여준다.
도 4a-4c는 종래의 단일-산물 과다 발현 대 CBP 공동-발현 배치에 대한 리간드 용해성을 비교한 것을 나타낸다. 각각의 배치는 동일한 조건 하에서 병렬적으로 발현되고 처리되었다. 도 4a는 SDS Page 비교를 나타낸다. 도 4b는 종래의 공정 대 리간드 및 CBP 공정에서의 체류 부피(retention volume)를 나타낸다. 도 4c는 정규화 수율에 관한 용출 피크를 나타낸다.
도 5는 최종-용도 정제 및 절단 속도론 검정을 나타내는 SDS PAGE 분석을 보여준다. 하부 패널에서 사용된 수지는 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성되었다.
도 6a-6c는 개시된 발명을 포함한 주요 요소의 일반화된 모듈 구조를 나타낸다. (도 6a) 분할된 인테인 세그먼트와 작용가능하게 연결된 융합 파트너를 포함한 N-인테인 리간드의 모듈 구조. 리간드는 최소한 N-말단 인테인 세그먼트 (INTN)를 포함하나, INTN 세그먼트와의 융합 파트너로서 발현된 추가적인 단백질/펩티드 도메인/모티프/모이어티도 또한 포함할 수 있다. 이러한 융합 파트너는 민감성 강화 모티프 (SEM), 및 다양한 "고정" 모이어티 (I), "링커" 모이어티 (L), 및/또는 "태그" 모이어티 (T)를 포함할 수 있다. (도 6b) 최소한 INTN 상대(counterpart)와 결합하여 폴딩된 안정화 상태를 유도할 수 있는 펩티드/단백질로서 정의되는 동족 결합 파트너 (CBP). CBP는 선택적 태그 및 어느 말단과 융합되어 발현된 링커 모이어티를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다. INTC 세그먼트 및 INTC 종으로부터 유래한 펩티드는 INTN 안정화를 유도하기 위해 사용될 수 있는 CBP의 특정 하위 세트를 구성한다. '동족 결합 파트너(cognate binding partner)'라는 용어는, INTN 세그먼트와 CBP 사이의 결합으로부터 생성된 인테인 복합체가 반드시 절단 또는 스플라이싱 활성을 나타내지 않을 수도 있기 때문에 사용되며; 더욱 특정한 INTC 하위 세트와는 미묘하지만 중요하게 구별된다 (도 6c) INTN 세그먼트와 동족 결합 파트너 사이의 결합 사건에 의해 유도된 INTN 안정화의 일반화 예.
도 7은 인테인-매개의 포획 매체를 제조하려는 목적으로 동족 결합 파트너에 의해 안정화된 N-인테인 리간드를 생산하는데 사용될 수 있는 다양한 표준 이종 발현 기술을 나타내는 일반화 공정을 보여준다.
도 8a-8b는 (도 8a) '종래의' 생물공정 단계와 (도 8b) 본원에서 청구된 제조 공정을 비교한 일반화 제조 공정을 나타낸다. 두 공정 모두 동일한 서열 조성의 고정된 N-인테인 리간드를 포함한 친화성 포획 매체를 생산한다. 최종 "인테인-매개의 친화성 포획(affinity capture)" 단계에서 나타난 바와 같이, 최종-사용 바로 전의 '활성' 친화성 포획 매체는 각 패널의 점선 상자 내에 나타나 있다. 이것은 동족 결합 파트너의 도입이 필수적인 제조 공정에서의 중요한 차이점을 나타내고, 이를 대조한다. 본 발명의 추가적인 장점은 부분적으로는 이하의 설명에 제시될 것이며, 부분적으로는 상세한 설명에서 볼 때 명백하거나, 본 발명을 실행할 때 배울 수 있다. 본 발명의 장점은 특히 첨부된 청구항에서 지적한 요소 및 조합에 의해 실현되고 보유될 것이다. 상기 일반적 설명과 이하의 상세한 설명은 둘 다 예시이며, 단지 설명을 위한 것이고, 청구된 본 발명에 제한되지 않는다고 이해될 것이다.
도 9a-9d는 압축 인자(compression factor), 피크 비대칭(peak asymetry) 및 환원 단 높이 컬럼 효율 측정기준(reduced plate height column efficiency metrics)에 대한 표준 계산 기준을 나타낸다. (도 9a) 컬럼 패킹 과정 동안의 층 압축 인자의 측정에 대한 설명. (도 9b) 추적제 펄스 주입 시험(tracer pulse injection test) 크로마토그램의 일반화 예. (A280에 의해 모니터링된) 컬럼 용출물의 추적제 농도는 체류 부피의 함수로 플로팅된다. 컬럼 효율을 계산하는데 사용된 변수를 설명하고 정의하기 위해 주석이 추가되었다. (도 9c) 관련 변수 및 컬럼 패킹의 평가와 컬럼 효율 측정기준의 계산에 사용된 용어에 대해 정의된 관련 개념의 목록. (도 9d) 컬럼 효율 측정기준을 계산하는데 사용된 정의 및 표현.
도 10a-10b는 실시예 5에 기재된 바와 같이, 동족 결합 파트너 (각각, +CBP 및 -CBP)의 도움을 받거나 또는 이들의 도움 없이 패킹된 2개의 수지 배치에서 실시된 추적제 펄스 주입 시험의 컬럼 효율 데이터를 나타낸다. (도 10a) 컬럼 용출물의 UV 흡광도 (A280) 대 체류 시간으로 플로팅한 각 배치의 크로마토그램. (도 10b) 도 10a에 나타난 크로마토그램 데이터로부터 계산한, 각 배치에 대한 컬럼 효율 측정기준을 비교한 막대 그래프. 동족 결합 파트너가 컬럼 패킹에 대해 갖는 효과를 나타내기 위해, 도 10b는 각각의 배치에 대해 보고된 중요한 컬럼 효율 측정기준 - Cf, AS 및 h을 요약한다. 또한, 각각의 측정기준에 대한 이상적 값/범위와 허용가능한 값/범위가 도 10b에 나타나 있는데 (각각, 점선과 녹색 음영 부분으로 나타남), 이는 각각의 배치에 대한 실험 결과로부터 계산된 값과 비교하기 위해 제공된다.
도 1은 E. coli에서 종래의 단일-산물 과다 발현에 의해 생산된 N-인테인 리간드의 세포 용해물들을 비교한 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 2는 종래의 단일 산물 과다 발현을 동족 결합 파트너와의 공동-발현과 비교한 SDS PAGE 분석을 보여준다.
도 3은 동족 결합 파트너는 변화되거나, 다양한 융합 파트너와 함께 발현될 수 있다는 것을 나타내는 SDS PAGE 분석을 보여준다.
도 4a-4c는 종래의 단일-산물 과다 발현 대 CBP 공동-발현 배치에 대한 리간드 용해성을 비교한 것을 나타낸다. 각각의 배치는 동일한 조건 하에서 병렬적으로 발현되고 처리되었다. 도 4a는 SDS Page 비교를 나타낸다. 도 4b는 종래의 공정 대 리간드 및 CBP 공정에서의 체류 부피(retention volume)를 나타낸다. 도 4c는 정규화 수율에 관한 용출 피크를 나타낸다.
도 5는 최종-용도 정제 및 절단 속도론 검정을 나타내는 SDS PAGE 분석을 보여준다. 하부 패널에서 사용된 수지는 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성되었다.
도 6a-6c는 개시된 발명을 포함한 주요 요소의 일반화된 모듈 구조를 나타낸다. (도 6a) 분할된 인테인 세그먼트와 작용가능하게 연결된 융합 파트너를 포함한 N-인테인 리간드의 모듈 구조. 리간드는 최소한 N-말단 인테인 세그먼트 (INTN)를 포함하나, INTN 세그먼트와의 융합 파트너로서 발현된 추가적인 단백질/펩티드 도메인/모티프/모이어티도 또한 포함할 수 있다. 이러한 융합 파트너는 민감성 강화 모티프 (SEM), 및 다양한 "고정" 모이어티 (I), "링커" 모이어티 (L), 및/또는 "태그" 모이어티 (T)를 포함할 수 있다. (도 6b) 최소한 INTN 상대(counterpart)와 결합하여 폴딩된 안정화 상태를 유도할 수 있는 펩티드/단백질로서 정의되는 동족 결합 파트너 (CBP). CBP는 선택적 태그 및 어느 말단과 융합되어 발현된 링커 모이어티를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다. INTC 세그먼트 및 INTC 종으로부터 유래한 펩티드는 INTN 안정화를 유도하기 위해 사용될 수 있는 CBP의 특정 하위 세트를 구성한다. '동족 결합 파트너(cognate binding partner)'라는 용어는, INTN 세그먼트와 CBP 사이의 결합으로부터 생성된 인테인 복합체가 반드시 절단 또는 스플라이싱 활성을 나타내지 않을 수도 있기 때문에 사용되며; 더욱 특정한 INTC 하위 세트와는 미묘하지만 중요하게 구별된다 (도 6c) INTN 세그먼트와 동족 결합 파트너 사이의 결합 사건에 의해 유도된 INTN 안정화의 일반화 예.
도 7은 인테인-매개의 포획 매체를 제조하려는 목적으로 동족 결합 파트너에 의해 안정화된 N-인테인 리간드를 생산하는데 사용될 수 있는 다양한 표준 이종 발현 기술을 나타내는 일반화 공정을 보여준다.
도 8a-8b는 (도 8a) '종래의' 생물공정 단계와 (도 8b) 본원에서 청구된 제조 공정을 비교한 일반화 제조 공정을 나타낸다. 두 공정 모두 동일한 서열 조성의 고정된 N-인테인 리간드를 포함한 친화성 포획 매체를 생산한다. 최종 "인테인-매개의 친화성 포획(affinity capture)" 단계에서 나타난 바와 같이, 최종-사용 바로 전의 '활성' 친화성 포획 매체는 각 패널의 점선 상자 내에 나타나 있다. 이것은 동족 결합 파트너의 도입이 필수적인 제조 공정에서의 중요한 차이점을 나타내고, 이를 대조한다. 본 발명의 추가적인 장점은 부분적으로는 이하의 설명에 제시될 것이며, 부분적으로는 상세한 설명에서 볼 때 명백하거나, 본 발명을 실행할 때 배울 수 있다. 본 발명의 장점은 특히 첨부된 청구항에서 지적한 요소 및 조합에 의해 실현되고 보유될 것이다. 상기 일반적 설명과 이하의 상세한 설명은 둘 다 예시이며, 단지 설명을 위한 것이고, 청구된 본 발명에 제한되지 않는다고 이해될 것이다.
도 9a-9d는 압축 인자(compression factor), 피크 비대칭(peak asymetry) 및 환원 단 높이 컬럼 효율 측정기준(reduced plate height column efficiency metrics)에 대한 표준 계산 기준을 나타낸다. (도 9a) 컬럼 패킹 과정 동안의 층 압축 인자의 측정에 대한 설명. (도 9b) 추적제 펄스 주입 시험(tracer pulse injection test) 크로마토그램의 일반화 예. (A280에 의해 모니터링된) 컬럼 용출물의 추적제 농도는 체류 부피의 함수로 플로팅된다. 컬럼 효율을 계산하는데 사용된 변수를 설명하고 정의하기 위해 주석이 추가되었다. (도 9c) 관련 변수 및 컬럼 패킹의 평가와 컬럼 효율 측정기준의 계산에 사용된 용어에 대해 정의된 관련 개념의 목록. (도 9d) 컬럼 효율 측정기준을 계산하는데 사용된 정의 및 표현.
도 10a-10b는 실시예 5에 기재된 바와 같이, 동족 결합 파트너 (각각, +CBP 및 -CBP)의 도움을 받거나 또는 이들의 도움 없이 패킹된 2개의 수지 배치에서 실시된 추적제 펄스 주입 시험의 컬럼 효율 데이터를 나타낸다. (도 10a) 컬럼 용출물의 UV 흡광도 (A280) 대 체류 시간으로 플로팅한 각 배치의 크로마토그램. (도 10b) 도 10a에 나타난 크로마토그램 데이터로부터 계산한, 각 배치에 대한 컬럼 효율 측정기준을 비교한 막대 그래프. 동족 결합 파트너가 컬럼 패킹에 대해 갖는 효과를 나타내기 위해, 도 10b는 각각의 배치에 대해 보고된 중요한 컬럼 효율 측정기준 - Cf, AS 및 h을 요약한다. 또한, 각각의 측정기준에 대한 이상적 값/범위와 허용가능한 값/범위가 도 10b에 나타나 있는데 (각각, 점선과 녹색 음영 부분으로 나타남), 이는 각각의 배치에 대한 실험 결과로부터 계산된 값과 비교하기 위해 제공된다.
상세한 설명
본 발명은 이하의 본 발명의 상세한 설명 및 본원에 포함된 실시예를 참고하여 더욱 용이하게 이해될 수 있다.
본 발명의 화합물, 조성물, 물품, 시스템, 장치 및/또는 방법을 개시하고 설명하기 전에, 이들은 달리 특정되지 않는 이상 특정한 합성 방법에 국한되지 않거나, 또는 달리 특정되지 않는 이상 특정 시약에 국한되지 않으며, 물론 이러한 이유로 바뀔 수도 있다고 이해될 것이다. 또한, 본원에 사용된 기술은 단지 특정 양태를 설명하기 위한 목적으로만 사용되며, 제한되지 않는다고 이해될 것이다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 어떠한 방법과 물질도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이하에는 예시적인 방법과 물질이 기재되어 있다.
본원에 언급된 모든 간행물들은 그 간행물에서 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로서 포함된다. 본원에서 논의된 간행물들은 단지 본 출원의 출원일 전의 이들의 개시 내용에 대해서만 제공된다. 본원에서, 본 발명이 이전의 발명으로 인해 이러한 간행물에 선행할 자격이 없다라는 인정으로 해석될 부분은 없다. 또한, 본원에 제공된 공개 일자는 실제 공개 일자와 다를 수 있으므로, 개별적으로 확인할 필요가 있을 수 있다.
A. 정의
본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용된 단수형["a", "an" 및 "the"]은, 문맥상 명확히 달리 지시된 바 없는 경우 복수형 언급물도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "관능기", "알킬" 또는 "잔기"를 언급할 때에는 둘 이상의 이러한 관능기, 알킬 또는 잔기 등의 혼합물도 포함한다.
범위는 "약(about)" 하나의 특정값 및/또는 내지 "약" 다른 특정값까지로 본원에 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 추가적인 양태는 하나의 특정값 및/또는 내지(and/or to) 다른 특정값을 포함한다. 유사하게는, 값이 선행사 "약"을 사용하여 근사치로 표현될 때, 특정 값은 추가 양태를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 각 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점과는 독립적으로 유의하다고 이해될 것이다. 또한, 본원에는 다수의 값들이 개시되어 있는데, 각 값은 본원에서 그 값 자체 외에도 "약" 그 특정 값으로 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어, "10"이라는 값이 개시된 경우, "약 10"도 또한 개시된 것이다. 또한, 두 특정 단위 사이의 각각의 단위도 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어, 만약에 10과 15가 개시된 경우, 11, 12, 13 및 14도 또한 개시된 것이다.
성분의 중량 퍼센트 (wt. %)는 특별히 반대로 기술되지 않는 이상, 그 성분이 포함된 제제 또는 조성물의 총 중량을 기준으로 개시된 것이다.
본원에서 사용된 "선택적인" 또는 "선택적으로"는, 이후에 기재된 사건 또는 환경이 발생할 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있으며, 그 기재 내용은 상기 사건 또는 환경이 발생한 경우와 그렇지 않은 경우를 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "접촉하는"이라는 용어는, 화합물이 직접적으로; 즉, 표적 그 자체와, 또는 간접적으로 상호작용함으로써; 즉, 이에 따라 표적의 활성이 달라지는 다른 분자, 보조-인자, 인자 또는 단백질과 상호작용함으로써 표적의 활성에 영향을 미칠 수 있는 방식으로 2개의 생물학적 엔터티가 함께 모이게 하는 것을 말한다. "접촉하는"이라는 것은, 또한 2개의 생물학적 엔터티, 예컨대 펩티드의 상호작용을 용이하게 하여, 공유적으로 또는 다른 방식으로 결합한다는 것을 의미할 수도 있다.
본원에서 사용된 "키트"는, 키트를 구성하는 적어도 2개의 구성 요소들의 모음을 의미한다. 이와 함께, 구성 요소들은 소정의 목적을 위한 기능적 단위를 구성한다. 개별 구성 요소들은 물리적으로 함께 포장되거나, 개별 포장될 수 있다. 예를 들어, 키트의 사용 설명서를 포함하는 키트는, 다른 개별 구성 요소와 함께 설명서를 물리적으로 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다. 그 대신, 설명서는 개별 구성 요소로서 종이 형태나 컴퓨터 판독 메모리 장치에 공급될 수 있는 전자 형태로 제공될 수 있거나, 인터넷 웹사이트로부터 다운로드받을 수 있거나, 또는 기록된 발표물일 수도 있다.
본원에서 사용된 "설명서(들)"은, 키트에 대한 관련 재료 또는 방법을 설명하는 문서를 의미한다. 이러한 재료는 이하의 것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다: 배경 정보, 구성 요소들의 목록 및 이들의 가용 정보 (구입 정보 등), 키트를 사용하기 위한 간단하거나 상세한 프로토콜, 고장 수리(troubleshooting), 참고 문헌, 기술 지원 및 임의의 다른 관련 문서. 설명서는 키트와 함께 제공되거나, 또는 개별 구성 요소로서 종이 형태나 컴퓨터 판독 메모리 장치에 제공될 수 있는 전자적 형태로 제공되거나, 또는 인터넷 웹사이트로부터 다운로드받거나, 또는 기록된 발표물일 수 있다. 설명서는 하나 또는 다수의 문서를 포함할 수 있고, 장래의 업데이트본을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 "표적 단백질", "관심 단백질(protein of interest)" 및 "치료제"는, 임의의 합성 또는 자연 발생적인 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 "관심 단백질"은, 정제 매체 자체의 제조에 대한 임의의 맥락과는 반대로, 실험실 또는 제조 환경에서 최종 사용자가 분할된 인테인 정제 기술을 사용하여 정제할 단백질이다. 이러한 정의는 연구 또는 다른 조사 응용을 위해 정제할 필요가 있는 임의의 단백질 또는 펩티드에도 적용될 것이다. 상기 용어는 추가로 전통적으로 단백질, 펩티드 등과 같은 분자를 포함한 약물, 백신 및 생약으로 간주되는 화합물을 포괄한다. 치료제의 예는 잘-알려진 참고 문헌, 예컨대 문헌[Merck Index (14판)], 문헌[Physicians' Desk Reference (64판)], 및 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics (1판)]에 기재되어 있으며, 이들은 제한 없이, 약; 치료, 예방, 진단, 치유 또는 질병 또는 질환(illness)의 완화에 사용되는 물질; 신체의 구조나 기능에 영향을 주는 물질, 또는 생리적 환경에 놓인 후 생물학적 활성을 갖게 되거나, 더욱 활성이 높아지는 프로-드러그를 포함한다.
본원에서 사용된 "변형체(variant)"는, 원래 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 기능적 활성을 보유한 분자를 말한다. 변형체는 동일하거나 상이한 종으로부터 유래되거나, 또는 자연적인 또는 선행 분자에 기초한 합성 서열일 수 있다. 게다가, 본원에서 사용된 "변형체"는 모 분자 (예를 들어, 본원에 개시된 단백질 또는 펩티드)의 구조로부터 얻은 구조를 갖고, 구조 또는 서열이 본원에 개시된 것들과 충분히 유사하며, 그 유사성에 기초하여 당업계의 숙련자가 모 분자와 비교할 때 동일하거나 유사한 활성과 활용성을 나타낼 것으로 기대하는 분자를 말한다. 예를 들어, 소정의 펩티드의 특정 아미노산을 치환하면, 모 분자와 유사한 활성을 갖는 변형 펩티드를 얻을 수 있다.
본원에서 사용된 "아미노산 서열"이라는 용어는, 아미노산 잔기를 나타내는 약칭, 글자, 특징, 또는 단어의 목록을 말한다. 본원에 사용된 아미노산 약칭은 아미노산에 대한 종래의 한 글자-코드이며, 이하와 같이 표현된다: A, 알라닌; C, 시스테인; D 아스파르트산; E, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H 히스티딘; I 이소류신; K, 리신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 티로신.
본원에서 사용된 "펩티드"는, 임의의 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 유전자 산물, 발현 산물 또는 단백질을 말한다. 펩티드는 연속하는 아미노산들로 구성된다. "펩티드"라는 용어는 자연 발생적이거나 합성된 분자를 포괄한다.
또한, 본원에서 사용된 "펩티드"라는 용어는, 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산들, 예를 들어, 펩티드 동배체(isosteres) 등을 말하며, 20개의 유전자-암호화 아미노산이 아닌 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 펩티드는 천연 공정, 예컨대 번역-후 공정, 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측-쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한 펩티드 내의 어느 부위에서도 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형은 소정의 폴리펩티드 내의 몇몇 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다. 또한, 소정의 펩티드는 많은 유형의 변형을 가질 수 있다. 상기 변형은 제한 없이 별개의 도메인 또는 모티프의 연결, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 공유적 교차-결합 또는 고리화, 플라빈의 공유적 부착, 헴 모이어티의 공유적 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스피티딜이노시톨의 공유적 부착, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 시스테인 또는 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스톨화, 산화, 퍼길화, 단백질용해 공정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 및 전달-RNA 매개의 단백질에 대한 아미노산의 첨가, 예컨대 아르기닐화를 포함한다. (문헌[Proteins―Structure and Molecular Properties 2판, T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993)]; 문헌[Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)] 참고).
본원에서 사용된 "단리된(isolated) 펩티드" 또는 "정제된 펩티드"는, 펩티드가 자연에서 정상적으로 결합하는 물질, 또는 발현 숙주 세포 용해물, 성장 배지 성분, 완충제 성분, 세포 배양 상청액, 또는 합성 시험관내 번역 시스템의 요소를 포함하나 이에 제한되지 않는 인공 발현 또는 생산 시스템에서 펩티드가 결합하는 물질을 실질적으로 포함하지 않는 펩티드 (또는 이의 절편)을 의미할 것이다. 본원에 개시된 펩티드 또는 이의 절편은 예를 들어, 천연 공급원 (예를 들어, 포유류 세포)의 추출, 펩티드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현(예를 들어, 세포 또는 무-세포 번역 시스템 내)에 의해, 또는 펩티드를 화학 합성함으로써 얻을 수 있다. 또한, 펩티드 절편은 이들 방법 중 어느 것에 의하거나, 또는 전장 단백질 및/또는 펩티드를 절단함으로써 얻을 수도 있다.
본원에서 사용된 "또는"이라는 단어는, 특정 목록의 어느 한 멤버를 의미하며, 또한 그 목록의 멤버들의 조합을 포함하기도 한다.
본원에서 사용된 "핵산"이라는 어구는, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-쌍 형성에 의해 상보적인 핵산과 혼성화할 수 있는 자연 발생적 또는 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말하는데, DNA 또는 RNA 또는 DNA-RNA 혼성체, 단일-가닥 또는 이중-가닥, 센스 또는 안티센스인지는 상관없다. 본 발명의 핵산은 또한 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어, BrdU), 및 비-포스포디에스테르 뉴클레오시드 간의 연결기 (예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA) 또는 티오디에스테르 연결기)도 포함할 수 있다. 특히, 핵산은 제한 없이, DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "단리된 핵산" 또는 "정제된 핵산"은, 본 발명의 DNA가 유래한 유기체의 자연-발생적인 게놈에서, 유전자 옆에 위치하였지만 유전자를 포함하지 않는 DNA를 의미하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어, 벡터, 예컨대 자가 복제 플라스미드나 바이러스에 혼입되거나; 또는 원핵 생물이나 진핵 생물의 게놈 DNA에 혼입되거나 (예를 들어, 전이유전자); 또는 별개 분자 (예를 들어, PCR, 제한 엔도뉴클라제(endonuclease) 소화, 또는 화학적 또는 시험관내 합성에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 절편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 또한 추가적인 폴리펩티드 서열을 암호화하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 DNA도 포함한다. "단리된 핵산"이라는 용어는, 또한 단리된 DNA 분자에 의해 암호화되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 분리되거나 적어도 일부 세포 요소, 예를 들어, 다른 유형의 RNA 분자 또는 펩티드 분자를 실질적으로 포함하지 않는 RNA, 예를 들어, mRNA 분자를 말하기도 한다.
"인테인"은 Perler (Perler, Davis et al. 1994)가 설명한 바와 같이, 단백질 내의 프레임에 맞는(in-frame) 개재 서열을 말한다. 인테인은 번역-후 단백질 스플라이싱 공정을 통해 단백질로부터의 자체 절단을 촉매화하여, 자유 인테인과 성숙한 단백질을 얻는다. 인테인은 또한 인테인-엑스테인 말단의 인테인 N-말단, 또는 인테인 C-말단 또는 둘 다에서 인테인-엑스테인 결합의 절단을 촉매화할 수도 있다. 본원에서 사용된 "인테인"은 미니-인테인, 변형되거나 돌연변이화된 인테인, 및 분할된 인테인을 포괄한다.
"분할된 인테인(split intein)"이라는 단어는, 서로 다른 2개의 별도로 번역된 단백질 세그먼트의 한 쌍을 말하는데, 이는 "N-말단 인테인 세그먼트" (INTN)와 상응하는 "C-말단 인테인 세그먼트" (INTC) 결합 파트너를 포함하되, 이하의 특성들 중 적어도 하나를 특징으로 한다:
(1) INTN 및 INTC 세그먼트는 이들 각각의 상응하는 단백질에 대해 본질적인 친화성을 나타내므로, 그 쌍은 자발적으로 연결되고, 폴딩되고, 비-공유적으로 함께 "결합"하여, "인테인 복합체"를 형성한다.
(2) 결합 시, 인테인 복합체는 "스플라이싱 활성" 또는 "절단 활성"을 갖게 될 수 있으며, 상기 복합체는 복합체와 이의 엑스테인 융합 파트너 사이의 절단 또는 스플라이싱 사건을 촉매화한다. 이러한 활성은 일반적으로 인테인 복합체의 형성에 좌우된다고 간주되는데, INTN도 INTC도 이들의 결합 파트너 없이는 자율적으로 상기 활성을 갖지 않는다고 한다.
(3) 자연 발생적인 또는 인공적으로 분할된 인테인, 예컨대 Perler (Perler 1999, Perler 2002)이 확립한 소위 "InBase, The Intein DATABASE"에 실린 것들과 동일하거나, 유사하거나, 이들로부터 유래한 펩티드, 단백질 도메인 또는 아미노산 서열을 함유한 INTN 및 INTC 세그먼트. 인테인 종의 예는 또한 표 2에도 나열되어 있다.
(4) 그러나, 절단 및/또는 스플라이싱 활성을 나타내는 복합체의 형성은 "분할된 인테인" 및/또는 INTN 및/또는 INTC 세그먼트의 정의를 엄격히 만족시킬 필요는 없다는 점에 주의한다. 달리 말해, 예를 들어, "분할된 인테인"이 더 이상 스플라이싱 및/또는 절단 활성을 나타내는 특징을 갖지 않도록 변형된 경우에도, 이는 여전히 본 발명 내에 포괄된다.
"동족 결합 파트너" 또는 "동족"이라는 용어는, 이것이 접촉한 임의의 "결합 활성" INTN 상대와 자발적인 비-공유적 결합을 이룰 수 있는 임의의 펩티드 또는 단백질 세그먼트를 말한다. 동족 결합 파트너는 INTC 펩티드로서 정의된 종을 포함한 펩티드와 단백질 세그먼트의 하위 셋트를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 상기 INTC 펩티드는 도 6(b)에 도시되고 이하에서 설명된 추가적인 링커 및 태그 모이어티에 작용가능하게 연결된 INTC 펩티드를 포함한다. 예를 들어, INTC 세그먼트는 동족 결합 파트너의 일 예일 수 있으나, 동족 결합 파트너는 정의에 의하면 INTC의 한 종일 것을 엄격히 요구하지 않는다.
INTC는 또한, 본원에서 INTC가 특히 INTN와 결합하여 활성 인테인 복합체를 형성하는 결합 파트너인 점에서 동족 슈퍼패밀리와는 더욱 차별화된다.
INTC는 INTN와 결합하여 인테인 복합체로 폴딩되는 경우 동족으로 보아야 하나, 생성된 복합체는 불활성 인테인 복합체이다 (스플라이싱 또는 절단 활성을 나타내지 않음).
본원에서 사용된 "엑스테인"이라는 용어는, INTN 세그먼트의 N-말단, INTC 세그먼트의 C-말단 중 하나에 공유적으로 융합되어 발현되는 임의의 펩티드, 단백질, 도메인 또는 아미노산을 말한다. 엑스테인은 추가로, 인테인 또는 인테인 복합체가 잘려나갈 때 절단되거나 스플라이싱될 수 있는 상기 인테인-융합된 폴리펩티드의 일부분인 것을 특징으로 한다.
N-말단 엑스테인 (N-EXT)은 특히 INTN 세그먼트의 N-말단과 융합하여 발현되는 엑스테인이다. N-EXT는 단지 INTN 세그먼트와 융합되어 발현될 때에만 그 자체로 분류되나, INTN 세그먼트는 INTN 세그먼트의 정의를 만족시키기 위해 N-EXT의 존재를 엄격히 요구하지 않는다.
C-말단 엑스테인 (C-EXT)는 특히 INTC 세그먼트의 C-말단 또는 동족 결합 파트너와 융합하여 발현되는 엑스테인이다. C-EXT는 단지 INTC 세그먼트 또는 동족 결합 파트너와 융합하여 발현되는 경우에만 그와 같이 분류되나, INTC 세그먼트와 동족 결합 파트너는 이들 각각의 정의를 만족시키기 위해 C-EXT의 존재를 엄격히 요구하지 않는다.
또한, N-EXT와 C-EXT 도메인은 이들 각각의 INTN 및 INTC 융합 파트너로부터 잘려나감에도 불구하고, 절단 또는 스플라이싱 사건이 일어난 후에도 계속하여 그와 같이 식별될 수 있다.
"N-인테인 리간드"라는 용어는, 고체 표면, 기질 또는 크로마토그래피 매체에 고정되거나 될 것이므로 친화성 리간드로서 작용하는 단백질을 말한다. 본원에서 정의된 N-인테인 리간드는 최소한 INTN 세그먼트를 포함하지만, 작용가능하게 연결된 추가 단백질, 펩티드, 기능성 도메인, 아미노산 모티프 및 또는 화학적 모이어티도 또한 포함할 수 있어서, INTN 세그먼트와의 융합 파트너로서 발현된다 (도 6). N-인테인 리간드를 포함하는 융합 파트너는, 민감성 강화 모티프 (SEM) 뿐만 아니라 "ILT 모이어티"라고 종합적으로 언급되는 다양한 "고정 모이어티", "링커 모이어티" 및/또는 "태그 모이어티"를 포함할 수 있다 (그러나 이에 제한되지 않는다).
"민감성 강화 모티프"(SEM)라는 용어는, INTN 세그먼트의 N-말단에 융합되어 발현된 3개 이상의 잔기의 아미노산 서열을 말하는데, 미국 특허 제10,066,027호에서 이전에 설명한 바와 같이, 이로 인해 인테인 복합체의 스플라이싱 또는 절단 활성이 외부 조건에 매우 민감하게 된다. SEM은 N-인테인 리간드의 구성 요소이나, INTN 세그먼트 및 상기 N-인테인 리간드를 포함할 수 있는 다른 융합 파트너와는 구별된다.
"ILT 모이어티"는 INTN와의 융합 파트너로서 발현되어 N-인테인 리간드를 포함하는 하나 이상의 아미노산에 대한 종합적인 용어이다. ILT 모이어티는 이하에 추가로 정의되어 있는 "고정" (I), "링커" (L) 및/또는 "태그"(T) 모이어티 유형들 중 적어도 하나를 포함한 구성 요소의 그룹으로 추가로 나뉠 수 있다. 개별 모이어티들은 작용가능하게 연결되며, 많지 않은 횟수로 반복되거나, 서로에 대해 그리고 INTN에 대해 결합하거나 재배열될 수 있다(예를 들어, 도 6 참고).
"고정 모이어티"라는 용어는, INTN와 융합하여 발현되어, N-인테인 리간드 (및 나아가 이의 융합 파트너)를 공유적으로 고정시키는 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, Cys)를 말한다.
"링커 모이어티" 또는 "링커"라는 유형은, INTN, 고정 모이어티 및/또는 다른 융합 파트너 사이에 구조, 공간 또는 유연성을 부여하는, INTN와 융합하여 발현된 하나 이상의 아미노산 잔기를 말한다. 링커 모이어티의 통상의 예는: 글리신-세린 반복부 ((Glyn1Sern2)n3), 폴리프롤린 이합체 ((XaaPro)n), 및 α-나선 (A(EAAAK)nA) 링커 모티프를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"태그 모이어티" 또는 "태그"라는 유형은, 단백질과 융합하여 발현되는 펩티드, 도메인 또는 특정 아미노산 모티프를 말하는데, 이는 정제, 검출을 돕고/거나 융합 파트너의 용해성 발현을 강화시킨다. 통상의 "태그" 모이어티의 예는: 정제 태그(예를 들어 폴리-His, 폴리-Arg, GST, CBD, MBP, CBP, 스트렙-태그, FLAG-태그 등), 검출 태그 (예를 들어, GFP, 루시퍼라제(luciferase), 에피토프 태그 (즉 FLAG, HA, c-myc), HRP 등) 및 발현/용해성 강화 태그 (예를 들어 T7-태그, NusA, TrxA, DsbA, DsbC, GST, MBP 등)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
INTN, INTC 또는 동족 결합 파트너 도메인은 세그먼트가 이의 상응하는 결합 파트너에 대해 친화성을 나타내고, 결합 사건에 참여하여 새로운 인테인 복합체를 형성할 수 있는 경우, "결합 활성" 세그먼트로 간주된다. "결합 활성을 갖는(binding active)" 및 "결합 불활성인(binding inactive)"이라는 용어는, 기능성 단일 INTN, INTC 및/또는 동족 세그먼트를 형태적으로 동일한 세그먼트와 구별하기 위해 사용되는데, 이는 (a) 이미 파트너에 결합되어 인테인 복합체를 형성하거나, 또는 (b) 이의 잠재적인 결합 파트너에 대한 세그먼트의 친화성을 억제하는 방식으로 잘못 폴딩된다. 중요한 점은, 인테인 복합체를 포함할 때, 구성 요소 INTN, INTC 및/또는 동족 세그먼트는 서로 결합할 수 있어서, 인테인 복합체가 존재하는 동안 이들이 만날 수 있는 추가적인 다른 양립가능하였을 결합 파트너와는 더이상 결합하지 않는다. 예를 들어, 소정의 INTN과 INTC는 연결되고 서로 결합하여 인테인 복합체를 형성할 수 있으나, 상기 복합체를 형성할 때, INTN과 INTC는 기능적으로 "결합 불활성"이 될 수 있어서-어느 세그먼트도 인테인 복합체를 포함하는 동안에는 임의의 추가적인 결합 사건에 참여할 수 없다. 그러나, 인테인 복합체가 분해된 경우, INTN과 INTC는 분리된 후 다시 폴딩되어, 이들의 친화성이 회복되고, 개별 세그먼트들이 다시 "결합 활성"을 가질 수 있다.
인테인 복합체는 인테인 스플라이싱 및/또는 절단 활성에 대해 기능적으로 "불활성" 또는 "활성"을 갖는 것으로 추가로 분류될 수 있다. 불활성 인테인 복합체는 인테인 복합체가 이의 엑스테인 융합 파트너에 의해 10% 미만의 절단 또는 스플라이싱 거동을 나타내는 것이다. 역으로, 활성 인테인 복합체는 절단 또는 스플라이싱 사건을 촉매화하여, 이의 엑스테인 융합 파트너 중 적어도 하나의 펩티드 결합을 변화시키는 것이다.
활성 인테인 복합체는: C-말단 절단, N-말단 절단, 이중 절단 또는 스플라이싱을 촉매화하는 특정 유형의 기본 인테인 사건에 의해 추가로 분류될 수 있다.
일단 "활성 인테인 복합체"가 절단 또는 스플라이싱 사건을 촉매화하면, 생성된 인테인 복합체는 이의 융합 파트너의 펩티드 결합에 더이상 영향을 줄 수 없으므로 (스플라이싱과 절단 반응은 비가역적임), 생성된 인테인 복합체는 일반적으로 임의의 절단 또는 스플라이싱 사건을 촉매화한 후에는 "불활성 인테인 복합체"로 간주될 수 있다. "추가적 영향이 없다"라는 것은, 10% 미만으로 영향을 미친다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "스플라이스[splice 또는 splices]"라는 용어는, 폴리펩티드의 중심 부분을 잘라내어 둘 이상의 더 작은 폴리펩티드 분자를 형성하는 것을 의미한다. 일부 경우, 스플라이싱은 또한 둘 이상의 더 작은 폴리펩티드를 함께 융합하여 새로운 폴리펩티드를 형성하는 단계도 포함한다. 스플라이싱은 또한 분할된 인테인의 작용을 통해 2개의 폴리펩티드를 2개의 별개 유전자 산물에 연결시키는 것을 말할 수도 있다.
본원에서 사용된 "절단하다[cleave, cleaves]", "절단" 및 "절단 사건"이라는 용어는, 폴리펩티드 내의 펩티드 결합이 파괴됨으로써 단일 폴리펩티드가 나눠져서 둘 이상의 더 작은 폴리펩티드 분자를 형성하는 화학적 반응을 말한다. 일부 경우, 절단은 외부 엔도펩티다제(endopeptidase)의 첨가에 의해 매개되며, 이는 종종 "단백질 분해성 절단"이라고 지칭된다. 다른 경우, 절단된 펩티드 서열들 중 하나 또는 둘 다의 내재성 활성에 의해 절단이 매개될 수 있는데, 이는 종종 "자가-절단"이라고 지칭된다. 절단은 본원에 기재된 분할된 인테인 시스템의 작용에서와 같이, 외부 조건 (예컨대, 완충제 pH)에 의해 조절될 수 있다.
"융합된" 또는 "~와 융합된"이라는 용어는, 공유적으로 결합된 것을 의미한다. 예를 들어, 두 펩티드가 서로 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해) 공유적으로 결합할 때, 제1 펩티드는 제2 펩티드에 융합된 것이다. 펩티드 결합에 의해 결합된 펩티드 및/또는 단백질 도메인은 또한 "융합 파트너"라고도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 "분리된" 또는 "실질적으로 순수한" 물질은, 자연적으로 이에 수반하는 성분들로부터 분리된 것이다. 전형적으로, 폴리펩티드는 중량 기준으로 적어도 50% (예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 99%)가 자연적으로 결합하는 다른 단백질과 자연-발생적인 유기 분자를 포함하지 않을 때, 실질적으로 순수하다.
본원에서, "결합하다"[bind, binds]", "결합하는" 또는 "결합 사건"은 시료 내 다른 분자를 인식하여 이에 접착되나, 시료 내의 또 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 이에 접착되지 않는 것을 의미한다. "결합하다", "결합하는" 또는 "결합 사건"이라는 용어는, 또한 두 분자 사이의 상호작용이 비-공유적이고 비가역적이라는 것을 암시한다. 한 분자가 다른 분자에 대한 결합 친화성이 약 105 내지 106 리터/몰을 초과하는 경우, 상기 다른 분자에 "특이적으로 결합한다". 이 용어들은 "결합하다"[associate with, associates with]" 또는 "결합하는(associating with)"과 상호 교환하여 사용된다.
본원에서 지칭된 핵산, 뉴클레오티드 서열, 단백질 또는 아미노산 서열은 단리되거나, 정제되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 재조합 DNA 기술을 통해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 모두 당업계에 잘 알려져 있다.
"변형된 인테인" 또는 "돌연변이된 인테인"과 같은 본원에서 사용된 "변형된" 또는 "돌연변이된"이라는 용어는, 핵산 또는 아미노산 서열, 예컨대 인테인에서 자연적 구조 또는 자연 발생적인 구조에 비해 하나 이상의 변형이 일어난 것을 말한다. 이러한 변형은 치환, 첨가 또는 결실일 수 있다. 변형은 언급되는 구조, 예컨대 인테인의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 하나 이상의 뉴클레오티드에서 일어날 수 있다.
본원에서 사용된 "작용가능하게 연결된"이라는 것은, 둘 이상의 생체 분자들이 생체 분자들의 정상 기능을 수행할 수 있도록 서로에 대해 배치되어 연결된 것을 말한다. 뉴클레오티드 서열에 대하여, "작용가능하게 연결된"이라는 것은 둘 이상의 핵산 서열들이 효소적 라이게이션에 의하여 연결되거나, 또는 서열들의 정상 기능이 수행될 수 있도록 서로 배치된 것을 말한다. 예를 들어, 전-서열 또는 분비성 리더(leader)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전-단백질로서 발현되는 경우, 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열에 작용가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서는 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작용가능하게 연결된 것이며; 리보솜 결합 부위는 상기 서열의 번역이 용이하게 하도록 배치된 경우 암호화 서열에 작용가능하게 연결된 것이다.
"서열 상동성(sequence homology)"은 핵산 또는 단백질 서열들이 공통적인 진화적 기원을 가지기 때문에 유사한 상황을 지칭할 수 있다. "서열 상동성"은 서열들이 매우 유사하다는 것을 나타낸다. 서열 유사성은 관찰될 수 있으며; 상동성은 관찰에 기초할 수 있다. "매우 유사한"이라는 것은, 적어도 70%의 동일성(identity), 상동성 또는 유사성; 적어도 75%의 동일성, 상동성 또는 유사성; 적어도 80%의 동일성, 상동성 또는 유사성; 적어도 85%의 동일성, 상동성 또는 유사성; 적어도 90%의 동일성, 상동성 또는 유사성; 예컨대 적어도 93% 또는 적어도 95% 또는 심지어 적어도 97%의 동일성, 상동성 또는 유사성을 의미할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 유사성 또는 상동성 또는 동일성은 문헌[Myers et al. (1988) CABIOS 4:11-17]의 "Align" 프로그램을 사용하여 결정할 수 있고, 이는 NCBI에서 이용가능하다.
추가로 또는 대안적으로, 아미노산 서열 유사성 또는 동일성 또는 상동성은 NCBI에서 이용가능 BlastP 프로그램 (Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25:3389-3402)을 사용하여 결정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어 뉴클레오티드 서열에 대한 "유사성" 또는 "동일성" 또는 "상동성"이라는 용어는, 두 서열 간의 상동성에 대한 정량적 측정치를 가리키는 것으로 의도된다.
대안적으로 또는 추가로, 서열에 대한 "유사성"이란 동일한 뉴클레오티드를 갖는 위치의 수를 두 서열 중 더 짧은 것의 뉴클레오티드 수로 나눈 것을 말하는데, 상기 두 서열의 정렬은 문헌[Wilbur and Lipman Algorithm. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726]에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 20개 뉴클레오티드의 창 크기, 4개 뉴클레오티드의 단어 길이 및 4의 갭 패널티를 사용하는, 컴퓨터-지원 분석과 정렬을 포함한 서열 데이터의 해석은, 상업적으로 이용가능한 프로그램 (예를 들어, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA)을 사용하여 편리하게 실시될 수 있다. RNA 서열이 유사하다거나 또는 DNA 서열과 어느 정도의 서열 동일성을 가질 때, DNA 서열 내 티민 (T)은 RNA 서열 내의 우라실 (U)과 동일하다고 간주된다. 이하의 참고 문헌은 또한 두 단백질의 아미노산 잔기의 상대적인 동일성 또는 상동성 또는 유사성을 비교하기 위한 알고리즘도 제공하며, 상기의 것 외에 추가로 또는 대안적으로, 참고 문헌은 상동성 또는 동일성 또는 유사성의 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있다. 문헌[Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453]; 문헌[Smith et al. (1983) Advances App. Math. 2:482-489]; 문헌[Smith et al. (1981) Nuc. Acids Res. 11:2205-2220]; 문헌[Feng et al. (1987) J. Molec. Evol. 25:351-360]; 문헌[Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153]; 문헌[Thompson et al. (1994) Nuc. Acids Res. 22:4673-480]; 및 문헌[Devereux et al. (1984) 12:387-395]. "엄격한 혼성화 조건"은 당업계에 잘 알려진 용어인데; 예를 들어, 문헌[Sambrook, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" 2판, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989]; 문헌[“Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach”Hames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985]을 참고하고; 또한 도 2와 서열 비교가 나와 있는 이에 대한 본원의 설명도 참고한다.
"플라스미드" 및 "벡터" 및 "카세트"라는 용어는, 세포의 중심 대사 작용의 일부가 아니며 통상 환형 이중-가닥 DNA 분자의 형태인 유전자를 종종 운반하는 염색체 외의 요소를 말한다. 이러한 요소는 임의의 공급원 유래의 단일- 또는 이중-가닥의 DNA 또는 RNA의 선형 또는 환형의 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있는데, 여기에서 다수의 뉴클레오티드 서열들은 프로모터 절편과 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 적합한 3' 비번역 서열과 함께 세포로 도입시킬 수 있는 독특한 구조에 연결되거나, 이에 재조합되었다. 전형적으로, "벡터"는 클로닝을 위한 추가적인 다수의 삽입 부위와, 숙주 세포에서 발현시키기 위한 선택된 유전자 산물 (즉, 전이유전자)의 DNA 서열을 함유한 "발현 카세트"를 포함하는 변형된 플라스미드이다. 이러한 "발현 카세트"는 전형적으로 5' 프로모터 부분, 전이유전자 ORF 및 3' 종결자 부분과 함께, ORF의 전사와 번역에 필요한 모든 필수 조절 서열도 포함한다. 따라서, 발현 카세트를 숙주에 통합시키면, 카세트 내의 전이유전자 ORF가 발현된다.
"완충제" 또는 "완충 용액"이라는 용어는, 이의 짝산-짝염기 범위의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 용액을 말한다.
"로딩 완충제" 또는 "결합 완충제"라는 용어는, 단백질 제제를 컬럼에 로딩하기 위해 단백질 제제와 혼합되는 염 또는 염들을 함유한 완충제를 말한다. 이 완충제는 또한 로딩 전에 컬럼을 평형화시키고, 단백질을 로딩한 후 컬럼을 세척하는데에도 사용된다.
"세척 완충제"라는 용어는, 본원에서 (예를 들어) 관심 단백질 (예컨대, C-말단 인테인 절편에 연결된 것)을 로딩한 후 및 관심 단백질을 용출하기 전에 컬럼을 통과하는 완충제를 지칭하는 것으로 사용된다. 세척 완충제는 원하는 단백질을 실질적으로 용출하지 않고도 하나 이상의 오염물을 제거하는 역할을 할 수 있다.
"용출 완충제"라는 용어는, 원하는 단백질을 컬럼으로부터 용출하는데 사용된 완충제를 말한다. 본원에서 사용된 "용액"은, 완충되거나 비-완충된 용액을 말하는데, 물을 포함한다.
"세척"이라는 용어는, 고체 지지체, 예컨대 크로마토그래피 수지를 통해 또는 이에 대해 적합한 완충제가 지나가도록 하는 것을 의미한다.
고체 지지체로부터 분자 (예를 들어, 원하는 단백질 또는 오염물)를 "용출한다"라는 용어는, 이러한 물질로부터 그 분자를 제거하는 것을 의미한다.
"오염물" 또는 "불순물"이라는 용어는, 정제 중인 단백질의 시료에 존재하는 정제 중인 단백질이 아닌 임의의 외부 또는 부적당한 분자, 특히 생물학적 거대 분자, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질을 말한다. 오염물은 예를 들어 정제 중인 단백질을 발현하고/거나 분비하는 세포에서 유래한 다른 단백질을 포함한다.
단백질 정제와 함께 사용된 "분리하다" 또는 "단리하다"라는 용어는, 원하는 단백질과 제2 단백질 또는 다른 오염물이나 불순물의 혼합물을 모두 포함한 혼합물 중의 제2 단백질, 또는 다른 오염물 또는 불순물의 혼합물로부터 원하는 단백질을 분리하는 것을 말하는데, 적어도 원하는 단백질의 분자의 대부분이 적어도 제2 단백질 분자의 대부분, 또는 다른 오염물이나 불순물의 혼합물을 포함하는 혼합물의 부분으로부터 제거된다.
원하는 단백질과 하나 이상의 오염물을 포함한 조성물 또는 용액으로부터 원하는 단백질을 "정제하다" 또는 "정제하는"이라는 용어는, 조성물 또는 용액으로부터 적어도 하나의 오염물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 조성물 또는 용액 내의 원하는 단백질의 순도의 정도를 증가시키는 것을 의미한다.
"크로마토그래피 매체" 또는 "크로마토그래피 매체"이라는 용어는, 임의의 유형의 고정상 기질 (고체 지지체), 골격, 또는 크로마토그래피나 정제에 사용된 매트릭스를 말하는데, 관심있는 2차 분자를 분리하거나, 농축하거나, 정제할 목적으로 여기에 N-인테인 리간드가 (공유적으로 또는 다른 방식으로) 부착되거나, 고정되거나, 결합되거나 또는 접합된다. 크로마토그래피 매체의 통상의 예는: 크로마토그래피 수지 (예를 들어 교차결합 아가로스, 중합체, 또는 실리카-계 입자/다공성 비드); 관능화 막; 마이크로- 및 나노-스케일 자성 입자; 및 구조화된 다공성/구조화된 채널 매체 (예를 들어, 단일체들과 단일체는 컬럼임)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"크로마토그래피 매체"에 N-인테인 리간드를 고정시키는 것과 관련된 본원의 개시 내용은, 본원에서 어느 유형의 "크로마토그래피 매체"에도 일반적으로 적용되는 것으로 추정된다. "크로마토그래피 매체"의 기본적인 기능 요건은, 고체 지지체 표면이 N-인테인 리간드를 보유하도록 하기 위해 제공된다. 그런 이유로, 다양한 크로마토그래피 매체들은 고정된 N-인테인 리간드에 대해 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않고 자유롭게 독립적으로 대체될 수 있다고 이해된다.
기호 "AS"로 나타낸 "비대칭 인자"라는 용어는, 패킹-층 크로마토그래피 컬럼을 통한 흐름의 균일성을 평가하기 위해 사용된 컬럼 효율 측정기준을 말한다. 비대칭 인자는 추적제 펄스 주입에 의해 수행한 표준 컬럼 효율 시험에서 수집한 후 도 9에 나타난 표현과 정의를 사용하여 계산한 데이터에 의해 결정되었다.
기호 "h"로 나타난 "환원 단 높이"라는 용어는, 이론상 단 높이에 기초한 컬럼 효율 측정기준을 말하는데, 패킹-층 크로마토그래피 컬럼 내의 입자 크기에 대해 정규화되었다. 환원 단 높이는 추적제 펄스 주입에 의해 수행된 표준 컬럼 효율 시험에서 수집하여 도 9에 나타난 표현과 정의를 사용하여 계산한 데이터에 의해 결정되었다.
"컬럼 효율 측정기준"이라는 용어는, 패킹의 품질과 패킹-층 크로마토그래피 컬럼을 통한 흐름의 균일성을 판단하기 위해 통상 인용되는 표준 측정기준인 "효율 측정기준"(AS) 및 환원 단 높이 (h)를 종합적으로 말한다.
기호 "Cf"로 나타낸 "압축 인자"라는 용어는, 압축성 크로마토그래피 수지가 크로마토그래피 컬럼에 패킹될 때 경험하게 될 상대적인 부피 변화를 말한다. 산업계와 당업계의 숙련자들이 사용하는 통상의 정의인 압축 인자는, 전형적으로 (Cf = V확장/V압축)이라는 표현에 의해 계산되는데; 여기에서 V확장은 충분히 확장되거나 "중력 침전될 때"의 수지 고체의 부피를 나타내고, V압축은 패킹된 수지층에서 압축될 때 동일한 수지 고체가 차지하는 부피를 나타낸다. 일정한 횡단면 영역을 갖는 컬럼에서, 이러한 표현은 Cf = L0/L로 축약될 수 있는데, 여기에서 L0는 충분히 확장되거나 "중력 침전될 때"의 수지층의 높이이고, L는 도 9 (a)에 나타난 바와 같이 압축될 때 동일한 수지층의 높이이다.
"충분히 잘 패킹된"이라는 용어는, 압축 인자 (Cf), 비대칭 인자 (AS) 및 환원 단 높이 (h) 모두가 이들 각각의 허용가능한 범위 내로 측정되었을 때의 크로마토그래피 컬럼 패킹의 상태를 말한다.
컬럼 효율 측정기준과 상기 기재된 "충분히 잘 패킹된" 이라는 정의는, 당 업계에서 보편적으로 인지되어 있으며, 당업계의 숙련자들에 의해 잘 확립되어 있다.
"내재성 기능성 압축 인자(intrinsic functional compressibility factor)"라는 용어는 또한 약칭 "IFCF"로도 쓰이는데, 수지가 크로마토그래피 컬럼에 패킹될 때, 표준화 패킹 조건 대비 수지에서 일어나는 분획 부피의 변화를 나타내는 크로마토그래피 수지의 특성을 말한다. IFCF는 본질적으로 '표준화 기준' 측정 방법을 추가로 규정하는 압축 인자 (Cf)의 측정치로서, 관찰된 층 압축이 수지의 배타적인 내재적 특성을 나타내도록 보장하는데 필요하다. 본원에서 정의된 IFCF는 크로마토그래피 컬럼에 패킹될 때 이하의 모든 '표준화 기준' 조건을 만족시키는 방식으로 얻은 계산된 압축 인자 (Cf)이다:
(1) 수지는 슬러리로서 현탁되고, 인산염 완충 식염수 (PBS) 중에 패킹되어야 한다.
(2) 컬럼 패킹 동안 생성된 패킹된 수지층은 0.8 내지 1.4의 비대칭 인자 (AS)를 나타내어야 한다.
(3) 컬럼 패킹 동안 생성된 패킹된 수지층은 5.0 미만의 환원 단 높이(h)를 나타내어야 한다.
예를 들어, 수지가 PBS에 슬러리로서 현탁된 다음 크로마토그래피 컬럼 내에서 층 부피 X까지 중력-침전된 후 압축되어 패킹된 수지층 부피 Y를 생성하는 경우, 패킹된 수지층은 Cf = X/Y의 압축 인자를 갖는다고 한다. 패킹된 수지층의 비대칭 인자와 환원 단 높이가 조건 (2)와 (3) (예를 들어, 비대칭 인자 AS = 1.0, 및 환원 단 높이 h =3.0)에 맞는 지를 검증하는 컬럼 효율 시험이 이후에 실시된 경우, 수지층이 패킹될 때 모든 '표준 기준' 조건이 만족되기 때문에 수지의 본질적 기능성 압축 인자는 IFCF = Cf = X/Y일 것이라고 한다.
두번째 예에서, 과다 압축에 의해 패킹되어 수지의 다공성, 반-탄성 입자 구조가 부서질 때 더 작은 패킹층 부피 Z가 생성되는, 중력-침전된 동일한 수지층을 고려한다. 이러한 수지층은 비록 이전의 예와 동일한 수지에서 생성되기는 했지만 계산된 압축 인자 Cf = X/Z를 갖는다. 이러한 시나리오들을 비교하면, 압축 인자 (Cf)는 명백히 소정의 패킹층에 특화되며 - 부피 Y 및 Z는 부분적으로는 수지의 본질적 압축성에 의해 결정되나, Y는 외부적인 및 임의적인 압축 패킹력 둘 다에 차이가 있어서 Z와 다를 것이다. 따라서, 패킹 동안 가해진 압축력을 정상화하도록 기준이 특정되어, 압축 시 어떠한 추가적인 차이도 수지의 본질적 압축성에 따라 전적으로 달라진다. 조건 (2)와 (3)은 이러한 표준화된 기준을 제공하는데, 그 이유는 패킹층의 제조시 과다하거나 (또는 불충분한) 압축이 불규칙한 유동 역학을 생성하여, 비대칭 인자 (AS) 및/또는 환원 단 높이 (h)의 차이로 나타날 것이기 때문이다. 사실, 비대칭 인자 (AS)와 환원 단 높이 (h)는 패킹하는 동안 층에 가해진 압축 정도가 소정의 수지의 기계적인 구조에 기능적으로 적합할 때에만, 조건 (2)와 (3)을 만족시킬 것이다. 제2 예에서, 수지층은 부적당한 양의 압축으로 패킹되어서, 비대칭 인자 (AS) 및/또는 환원 단 높이 (h)(예를 들어, AS = 0.6 또는 AS = 1.8, 및/또는 h = 6.5)가 좋지 않게 나타낼 것이므로, "표준화 기준" 규정을 만족시키지 못할 것이다. 따라서, 이후 이러한 패킹된 수지층의 측정된 압축 인자 Cf = X/Z는 수지의 IFCF에 대한 타당한 측정치로 고려하지 말아야 한다.
마찬가지로, 수지는 종종 슬러리화되어 다양한 조성물의 완충제 중에 패킹되지만, 대안적인 완충제 조성물이 다공성 수지를 다양한 정도로 팽창시키거나 수축시킨다고 알려진 것을 감안하여 다른 완충제에 의해 제조된 패킹층으로부터 수지의 압축성을 측정하면, 압축 인자 (Cf)의 관측치가 달라질 수 있다. 따라서, IFCF의 측정이 PBS 완충제에서 이루어진다는 기준을 구체적으로 명시하여, 측정된 압축 인자의 임의의 차이가 수지의 본질적인 압축성에 영향을 미치는 수지 조성의 차이에 전적으로 기인한다는 것을 확실히 해둘 필요가 있다.
측정된 압축 인자는 IFCF의 3개의 '표준 기준' 조건을 만족할 때, 수지 자체의 내재적 특성을 반영하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, IFCF의 차이는 수지의 조성의 차이를 탐지하기 위한 간접적인 방법으로 사용될 수 있다.
"기본 수지"라는 용어는, N-인테인 리간드 또는 임의의 다른 리간드가 부착되지 않은 수지 지지체 기질을 말한다.
기호 "ΔC"라고 나타낸 "압축 차분"이라는 용어는, 리간드가 크로마토그래피 수지에 부착될 때 소정의 수지가 나타낼 수 있는 압축성의 상대적인 차이를 말한다. 압축 차분은 부착된 리간드를 보유한 수지의 본질적 기능성 압축 인자 (IFCF)와 이의 기본 수지 기질의 인자 (IFCF기본) 사이의 백분율 차이를 계산한 것이다. 본원에서 정의된 압축 차분은 이하와 같이 계산된다: ΔC=|(IFCF) -(IFCF기본)|/(IFCF기본)×100%. 예를 들어, 실시예 5에 제시된 데이터를 사용하면, "-CBP" 수지 배치에 대한 압축 차분은 ΔC = |(1.01)-(1.15)|/(1.15)×100% = 12.2%로서 계산될 것이며, 이는 "-CBP" 배치를 생산할 때 N-인테인 리간드를 수지에 부착한 결과 수지의 압축성이 12% 넘게 변한다는 것을 암시한다. 수지의 압축 차분 (ΔC)는 이의 기본 수지 기질에 비해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20% 미만일 수 있다.
본 발명의 조성물 뿐만 아니라 본원에 개시된 방법에서 사용될 조성물 자체를 제조하는데 사용된 성분이 개시된다. 이러한 물질 및 다른 물질들도 본원에 개시되는데, 이러한 물질들의 조합, 하위 세트, 상호 작용, 그룹은 각각의 다양한 개별적 및 종합적인 조합과 이러한 화합물들의 변경에 대한 특정 언급이 명시적으로 개시될 수는 없겠지만, 이들 각각은 구체적으로 고려되고 본원에 기재된 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 화합물이 개시되어 논의되고, 화합물을 포함한 다수의 분자에 대해 이루어질 수 있는 여러가지 변형들이 논의된 경우, 특히 화합물의 모든 조합과 변경, 및 구체적으로 반대로 나타난 바 없는 경우 가능한 변형이 고려된다.
따라서, 분자 A, B 및 C의 부류 뿐만 아니라, 분자 D, E 및 F와 조합 분자의 예도 개시된 경우, A-D가 개시된 것이고, 이후 각각이 개별적으로 열거되지 않았다고 하더라도, 각각은 개별적으로 종합적으로 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F 조합이 개시된 것으로 고려된다는 것을 의미한다. 마찬가지로, 임의의 하위 셋트 또는 이들의 조합도 또한 개시된 것이다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 하위 그룹도 개시된 것으로 간주될 것이다. 이러한 개념은 본 발명의 조성물을 제조 및 사용하기 위한 방법의 단계를 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 양태에 적용된다. 따라서, 다양한 추가 단계들이 실시될 수 있는 경우, 이러한 추가 단계들은 각각 본 발명의 방법의 임의의 특정 구현예 또는 구현예들의 조합으로 실시될 수 있다고 이해된다.
본원에 개시된 조성물은 특정한 기능을 갖는다고 이해된다. 개시된 기능을 수행하기 위한 특정한 구조 요건이 본원에 개시되어 있는데, 개시된 구조와 관련된 동일한 기능을 수행할 수 있는 다양한 구조들이 있고, 이러한 구조들은 동일한 결과를 얻을 것이라고 이해된다. 예를 들어, 나타낸 예에서 pH를 조절하는데 사용된 화합물은 pH를 조절하는 다른 완충성 화합물로 치환될 수 있으며, 그 이유는 pH는 조절될 중요 변수이고, 특정 완충성 화합물은 달라질 수 있기 때문이다.
B. N-말단 인테인 세그먼트를 고정시키는 방법
단백질 변형과 라이게이션에 대한 인테인-기반의 방법이 개발되었다 (미국 특허 제10,066,027호 및 미국 특허 제9,796,967호, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 포함됨). 인테인은 전구체 단백질로부터 인테인 서열을 잘라내어, 펩티드 결합에 의해 측접한 서열들 (N- 및 C-엑스테인)과 연결시키는 단백질 스플라이싱 반응을 촉매화할 수 있는 내부 단백질 서열이다(Perler et al. (1994)). 수백 개의 인테인과 인테인-유사 서열들이 매우 다양한 유기체 및 단백질에서 발견되었고 (문헌[Perler et al. (2002)]; 문헌[Liu et al. (2003)]), 이들은 전형적으로 350-550 개의 아미노산 크기이며, 또한 귀소 엔도뉴클레아제(homing endonuclease) 도메인도 함유하나, ~140-aa 스플라이싱 도메인만을 갖는 자연적인 및 조작된 미니-인테인만으로도 단백질 스플라이싱에 충분하다 (문헌[Liu et al. (2003)]; 문헌[Yang et al. (2004)]; 문헌[Telenti et al. (1997)]; 문헌[Wu et al. (1998)]; 문헌[Derbyshire et al. (1997)]).
연속 및 분할된 인테인은 둘 다 단백질 정제 응용을 위해 조작되었으며 (미국 특허 제10,066,027호 및 미국 특허 제9,796,967호), 여기에서 변형된 인테인은 두번째 관심 단백질의 친화성 포획을 매개하는데 사용된다. 분할된 인테인은 특히 이들의 이량체 구조, 결합-의존성 절단 활성, 및 상응하는 세그먼트들 간의 강한 자연적인 친화성 때문에 이러한 응용에 유용하다. 그러나, 분할된 인테인은 또한 '종래의' 생물공정 기술을 사용하여 생산될 때, 통상 수율이 낮거나 용해성이 좋지 않다(Shah, Dann et al. 2012). 사실, 종래의 공정을 통해 얻은 단백질 수율은 매우 좋지 못하여, 분할된 인테인-기반의 크로마토그래피 매체의 측정가능한 제조는 엄두도 못낼 정도로 비싸지므로 경제적으로 사업성이 없을 수도 있다.
임의의 단백질-기반의 친화성 리간드의 생산은 확실히 전체 수율에 영향을 주는 많은 요인들이 관여하는 복합한 다단계 공정인 반면, 병목(bottleneck) 제조는 전형적으로 생산량-제한 단위 가동의 확장에 의해 상쇄된다. 그러나, 용해성과 응집이 종종 제조 공정에서 수율-제한 요인이기 때문에, 이러한 접근법은 특히 분할된 인테인에서 비효율적으로 보인다. 이종 단백질 발현 시 용해성은 전형적으로 세포 배양 조건과 생체내 단백질 폴딩에 대한 이들의 영향(예를 들어, 2차 및 3차 구조의 적절한 형성)의 함수로서 간주되나 (Rosano and Ceccarelli 2014) (Dyson and Wright 2005), 분할된 인테인은 도 1의 예에 나타난 바와 같이 이러한 관점의 예외인 것으로 보인다. 따라서, 본 발명자들은 분할된 인테인-기반의 크로마토그래피 매체에 대한 제조 수율을 개선시키기 위해, 본원에 개시된 신규한 공정 기술을 개조하여 분할된 인테인과 이들의 고유한 구조에 특정된 안정성 문제를 감소시켰다.
INTN 및 INTC 세그먼트는 원래 이들의 자연적 결합 파트너가 없을 때에는, 특정된 구조 형태가 거의 없거나 전혀 없이 내재적으로 무질서한 도메인을 포함한다 (문헌[Zheng, Wu et al. 2012], 문헌[Shah, Eryilmaz et al. 2013], 문헌[Eryilmaz, Shah et al. 2014]). 이러한 내재적 무질서는 분할된 인테인 세그먼트들 사이에서 나타나는 신속하고 장거리(long-range)의 고-친화성 결합을 설명한다고 추정적으로 인정된다 (Pontius 1993, Shoemaker, Portman et al. 2000, Wright and Dyson 2009).
내재적 무질서는 분할된 인테인이 친화성 포획 응용에 사용될 수 있게 만드는 정확한 품질을 부여하기도 하지만, 또한 무질서한 도메인 내의 소수성 및 전하성 잔기가 접근가능하거나, 노출될 수 있어서, 분할된 인테인 세그먼트가 응집화되고 불용성을 갖게 될 가능성이 크다는 것을 암시하기도 한다(
and Villaverde 2002) (Saleh and Perler 2006) (Aranko, Wlodawer et al. 2014). 사실, 문헌[Zheng et al. (2012)]에서는, 인테인 폴딩에 대한 기본 연구 동안, 시네코시스티스 종 PCC6803의 INTN 세그먼트가 이의 자연적인 INTC 상대 없이 발현될 때 용해성이 낮아지는 것을 관찰하였는데, 저자들은 그 이유를 단리된 INTN 세그먼트의 "무질서한" 구조 때문인 것으로 보았다. 저자들은 자신이 관찰한 사실에 의해 인테인이 복합체를 형성하는 동안 무질서 상태에서 폴딩된 상태로 변한다는 이들의 가설을 뒷받침한다.
본원에서 주장된 바와 같이, N-인테인 리간드는 동족 결합 파트너를 도입시켜 INTN 안정성과 용해성을 개선시키는 신규한 폴딩 상태를 유도함으로써, 제조 공정 동안 안정될 수 있다. 이것은 도 4에 나타난 예에서 입증된 바와 같이, 전체 제조 공정 수율을 급격히 증가시킨다.
그럼에도 불구하고 중요한 사실은 비록 동족 결합 파트너의 존재가 공정 수율을 개선시키기는 하지만, 이는 또한 INTN 세그먼트를 기능적으로 불활성화시키기도 하므로, N-인테인 리간드가 이들이 만날 수 있는 어떠한 INTC-융합된 관심 단백질과도 결합하거나 연결되지 못하게 된다는 점이다. 친화성 포획 매체의 기본 기능은 이들이 관심 단백질에 결합하는 능력에서 예측된다는 사실을 감안하면, 제조 공정 동안 N-인테인 리간드를 불안정화시킨다고 알려진 부형제 단백질을 도입하는 것은 표면상으로는 직관에 반하는 일이다.
따라서, 개시된 제조 공정의 실현 가능성은 (1) 공유적으로 고정된 후 동족 결합 파트너를 INTN 세그먼트로부터 분리하고, (2) 고정된 N-인테인 리간드를 결합-활성 폴딩 상태로 되돌리는 능력에 따라 크게 달라진다. 이들 중 어느 것도 이전에 문헌에서 입증되지 않았다.
공정에서 분할된 인테인의 강제 분리가 이들의 구조 및/또는 활성을 손상시키지 않고도 가능한지는 명확하지 않다. 야생-형 INTN과 INTC 세그먼트 사이의 결합 친화성은 소 나노몰 범위로 측정되었다(Shi and Muir 2005) (Zettler, 
et al. 2009). 이것은 친화성 포획을 위해 변형된 분할된 인테인에 대해 과소 평가된 것일 가능성이 높은데, 그 이유는 스플라이싱 엑스테인은 본 출원에서 불필요하므로 제거되어 입체적 결합 억제를 감소시킬 수 있기 때문이다. 변성제는 결합된-단백질 복합체를 불안정화시키는데 사용될 수 있다고 이해되지만 (O'Brien, Dima et al. 2007), 평형 결합 친화성이 더욱 강해진다는 것은, 전형적으로 분리될 때 유의한 에너지 장벽이 있다는 것을 나타낸다(Kastritis and Bonvin 2013). 이러한 장벽은 비교적 가혹한(proportionally harsh) 변성제를 사용하여 극복할 수 있지만, 이는 종종 단백질 성분의 구조 또는 활성에 비가역적인 손상을 입히지 않고서는 달성될 수 없다. 또한, 몇몇 분할된 인테인은 심지어 변성 조건에 대해서도 저항하여, 변성 카오트로프, 예컨대 6M 우레아 (Southworth, Adam et al. 1998), 뿐만 아니라 변성 농도의 계면 활성제와 환원제, 예컨대 2% w/v SDS 및 150mM DTT (Nichols, Benner et al. 2003)의 존재 하에서 복합체를 유지하는 것으로 나타났다. 따라서, 단백질-기반의 친화성 리간드를 제거하기 위한 전통적인 접근법으로는 INTN 및 INTC 세그먼트를 분리할 수 없다는 결론을 내리는 것이 논리적일 수 있다. 이것은 N-인테인 리간드에 점점 더 가혹한 변성제를 처리하여 극복할 수 있으나, 인테인 구조와 기능에 비가역적으로 손상을 끼칠 위험이 있다.
결합 가역성 문제 외에도, N-인테인 리간드가 동족 결합 파트너와 복합체를 형성하는 동안 N-인테인 리간드를 선택적으로 고정시키기 위한 고정 반응을 디자인하는 것이 사소한 문제는 아니다. 복합체의 형성은 N-인테인 리간드에서 제한된 폴딩 상태를 유도하고, 그 다음에는 리간드 내에서 반응성 고정 모이어티에 대한 접근성을 감소시킬 수 있다. 또한, 단백질을 기질에 공유적으로 고정시키는데 사용된 화학 물질은, N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너 둘 다에 대해 반응성을 가져서, 후자가 기질에 접합될 수 있다(grafted).
매우 선택적인 고정 반응을 디자인할 수 있다 하더라도, 동족 결합 파트너는 제조 공정에서 효과적으로 소모되므로, 생산에 추가 비용이 발생된다. 도 7에 나타난 바와 같이, 동족 결합 파트너는 개별적으로 발현 및 정제되어, 트랜스 방식으로 N-인테인 리간드에 부가되거나, 또는 세포 배양 시 N-인테인 리간드와 함께 공동-발현되어야 한다. 전자는 동족 결합 파트너에 대한 제2 생산 공정을 필요로 하나 - 여기에서 제조 비용이 추가되는 것은 명백하고 - 후자의 선택지는 도 2의 예에서 나타난 바와 같이 N-인테인 리간드의 발현 역가를 확실히 감소시킨다.
그럼에도, 용해도 문제로 인해 종래의 제조 공정을 사용하는 N-인테인 리간드의 생산이 전적으로 배제되지 않는다는 점은 주목할만하다. 사실, Millipore 특허 출원 WO 2016/073228 A1과 GE 특허 출원 US 2019/0263856 A1에 기재된 조성물은, N-인테인 리간드가 이미 안정화 동족 결합 파트너의 도움 없이도 제조될 수 있다는 것을 암시한다. 명백히, 종래의 방법에 의해서도 허용가능한 수준의 용해성 산물이 생산될 수 있으며, 이것은 용해성 수율의 개선이 제조 공정의 전체 생산성에 크게 영향을 주지 않을 것이라는 사실을 암시한다. 이러한 이유로, 도 4에 나타난 바와 같이 동족 결합 파트너가 수율을 대폭 개선시킬 수 있다는 발견은 매우 놀라운 일이다.
동족 결합 파트너에 의해 N-인테인 리간드를 안정화할 때 발생하는 추가적인 공정 요건-(a) 리간드에 손상을 주지 않고 인테인 복합체를 강제로 분리할 것, (b) 동족이 존재할 때 리간드를 선택적으로 공유적 고정을 시킬 것, 및 (c) 리간드의 생산시 비용 증가 및/또는 발현 역가가 감소될 것-을 고려하면, 제조 공정 동안 동족 결합 파트너를 도입하여 초래된 장벽 및 비용이 용해성 수율의 근소한 증가로 의해 정당하게 상쇄될 수 있다는 발견은 예상치 못한 일이었다.
이 방법에서, N-인테인 리간드의 발현은 동족 결합 파트너, 예컨대 INTC 세그먼트가 있을 때 일어날 수 있다. 동족 결합 파트너와 N-인테인 리간드는 생체내에서, 단일 또는 이중 플라스미드 시스템으로부터 공동 발현될 수 있거나, 또는 도 7에 나타난 바와 같이, 하류 공정 이전에 동족 결합 파트너가 별개 세포에서 발현되어 N-인테인 리간드에 트랜스 방식으로 노출될 수 있다. N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너 사이의 자연적인 친화성 때문에, 이들은 자발적으로 한 쌍을 이룰 것이다. 이러한 복합체는 N-인테인 리간드가 스스로 채택할 수 없는 '신규한' 폴딩 상태를 유도하고, 이 경우 동족 결합 파트너는 핵화 사건, 응집화 및 불용성을 유도하였을 N-인테인 리간드 내의 특정 소수성 및 전하성 잔기를 차폐할 수 있다. 이러한 단계들을 통해, 기능성 인테인 포획 매체가 생성되면, 이는 (예를 들어, 미국 특허 제10,066,027호 B2에 기재된 바와 같이) 단백질 정제 응용을 위한 C-말단 인테인 태그를 포획할 수 있다.
인테인 복합체의 결합 (동족 결합 파트너와 결합된 N-인테인 리간드로서 정의됨)은 구형 구조를 이루어, N-인테인 리간드가 채택할 수 있는 다양한 형태를 제한함으로서 단백질 안정성이 증가시킬 수 있다. 이로 인해 N-인테인 리간드가 공정 동안 분해 및/또는 응집화에 더욱 잘 저항할 수 있게 된다. 예를 들어, 인테인 복합체는 동족 결합 파트너와 결합하지 않은 N-인테인 리간드보다 용해성 및/또는 분해에 대한 저항성이 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%, 또는 1, 2, 3, 4 이상의 자릿수 이상일 수 있다. 추가로, N-인테인 리간드의 구조적 및 화학적 안정성의 증가 때문에, 인테인 복합체는 응집화 및 분해 공정과 관련된 산물-관련 불순물의 형성을 감소시켜서, 단독 N-말단 인테인 세그먼트보다는 단백질 집단에 대한 물리적 및 화학적 균일성이 더 커지므로, 하류 분리 공정을 유의하게 단순화시킨다.
또한, 폴딩된 인테인 복합체의 용해성은 단독 N-인테인 리간드보다 유의하게 더 높기 때문에, 이는 수지 커플링 반응의 전과 커플링 반응 동안 유의하게 더 높은 수준으로 농축될 수 있어서, 고정 공정 동안 N-인테인 리간드 밀도를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 인테인 복합체는 용해성이 단독 N-인테인 리간드보다 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%, 또는 1, 2, 3, 4 이상의 자릿수 이상일 수 있으므로, N-인테인 리간드 밀도가 10 mg 리간드/mL 수지층 부피를 초과하게 된다. 예를 들어, N-인테인 리간드 밀도는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 mg 또는 그 이상의 리간드/mL 수지층 부피일 수 있다.
일단 인테인 복합체가 정제되고 농축되면, N-말단 인테인 세그먼트는 표준 생체접합 기술을 사용하여 선택적으로 크로마토그래피 매체에 공유적으로 고정될 수 있다. 이것은 이하에서 더욱 상세히 논의된다. 이러한 선택성은 N-말단 인테인 세그먼트가 조작된 몇몇 돌연변이 (또한, 이하에 논의됨)를 통해 가능해진다. N-말단 인테인 세그먼트는 고정된 후, 동족 폴딩 파트너에 의한 유도된 폴딩 상태 때문에 결합에 대한 불활성을 유지한다. 이 시점에서, N-말단 인테인 세그먼트에 대한 결합 활성이 회복되어, 생성된 인테인 포획 수지가 기능성을 갖게 된다. 이는 고정된 인테인 복합체에 강한 카오트로프, 강산, 또는 강염기 (예를 들어 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 150 mM 인산, 또는 0.5 M 수산화나트륨, 각각)를 가하여 달성될 수 있다. 이것은 N-인테인 리간드를 효과적으로 변성시키고/거나 N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너 사이의 결합을 파괴시키는 임의의 다른 시약 또는 조건 (예를 들어, 가열)을 사용한 후, 이를 세척하거나 제거하여 고정된 N-인테인 리간드를 남겨둠으로써 잠재적으로 달성될 수 있다는 것을 주목해야 한다.
동족 폴딩 파트너를 무질서 유발제(chaotropic agent) 또는 산에 의해 "세척한다"고 할 때, 대부분의 동족 폴딩 파트너는 이 방법을 사용하여 제거되지만, 동족 결합 파트너의 1% 미만, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50% (또는 이러한 양 미만 또는 그 사이의 임의의 양)은 N-인테인 리간드와 결합된 채 남아 있을 수 있다는 것을 주목한다. 본원에서 논의된 바와 같이 이러한 동족 결합 파트너는 원하는 관심 단백질과 융합하여 발현되지는 않지만, 그 대신 제조 공정의 나머지 일부라는 점을 주목하는 것이 중요하다.
또한, N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너 사이의 결합의 파괴는, 변성 조건에서 영구히 불안정화되는 것과는 반대로 N-인테인 리간드가 활성 상태로 돌아가는 방식으로 이루어져야 한다는 것도 주목한다. 하나의 예가 도 5 (하부 패널)에 나타나 있는데, 여기에서 N-인테인 리간드는 구아니딘 하이드로클로라이드에 의해 분리된 후 INTC 태그가 달린 새로운 관심 단백질을 받아들인다. "이들 사이의 결합을 파괴시키는"이라는 것은, N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너의 연결 또는 결합을 적극적으로 방해하는 것을 의미한다는 점에 주목한다. 동족 결합 파트너의 이러한 "제거" 또는 "파괴"는, 고정된 인테인 복합체에 카오트로프, 강산 또는 강염기 (예를 들어, 각각 구아니딘 하이드로클로라이드, 인산, 또는 수산화나트륨)를 가하여 달성될 수 있으나, 이것은 N-인테인 리간드를 효과적으로 변성시키고/거나 N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너 사이의 결합을 파괴시킬 수 있는 임의의 다른 시약 또는 조건 (예를 들어, 가열)을 사용하여 잠재적으로 달성될 수 있기도 하다.
본원에 개시된 방법의 1차 동기는 N-인테인 리간드의 용해성을 증가시키는 것이지만, 동족 결합 파트너의 영향을 안정화시키면 인테인 포획 수지를 종래의 크로마토그래피 컬럼에 패킹할 때 예상치 못한 유익한 효과를 갖는 것으로 나타났다.
컬럼 패킹은 고정층 액체 크로마토그래피의 쉽게 간과되나 사소하지 않은 양태이다. 고정층의 패킹 품질은 분리 효율에 유의한 영향을 미칠 수 있으며, 일관적이고 재생가능한 성능에 중요하다. 상기 층의 균일한 패킹은 유체 흐름의 고른 분포와 컬럼 전체의 일관적인 접촉 시간에 필수적이다. 따라서, 부적합한 패킹은 채널링, 불-균일한 혼합, 불규칙한 접촉 시간 분포 및/또는 층의 충분히 이용되지 않은 분획을 생성할 수 있다 (Rathore, Kennedy et al. 2003). 이러한 문제는 분리 효율과 분리도(resolution)를 효과적으로 감소시키고, 산물의 수율과 순도를 낮추고, 비일관적인 성능과 재생성 불량이 발생시킬 수 있다. 운이 나쁘게도, N-인테인 리간드가 입자-기반의 크로마토그래피 기질에 접합될 때, 기질의 대규모(bulk) 유동적 거동은 인테인 포획 수지를 적절히 패킹하기가 극히 어렵도록 변화된다.
미립자 크로마토그래피 지지체 기질 (즉, 가교된 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 또는 다른 중합체로 제조된 수지)은 일반적으로 다공성이며, 약한(moderate) 압력, 예컨대 가동시 크로마토그래피 컬럼에서 발생하는 차등적 압력 강하를 가할 때 압축가능하다. 단지 중력 압축으로만 패킹될 때, 이러한 기질을 포함한 고정층은 컬럼을 통한 흐름이 이어짐과 끊김을 반복하면서(on and off) 순환할 때 각각 수축하고 팽창할 것이다. 압축-완화 사이클은 크로마토그래피 수지에 손상을 주거나, 패킹층의 무결성을 불안정화함으로써 컬럼 성능을 감소시켜, 채널링, 공극 형성, 입자 마찰, 과다 배압, 컬럼의 비사용(dead)-부피, 불-균일 흐름 및 비일관적인 체류 시간 분포를 생성할 수 있다. 이러한 문제를 피하기 위해, 크로마토그래피 매체를 컬럼에 압축할 때에는 우선 이를 압축한 후 물리적으로 상기 층을 압축된 부피 내로 구속시켜 매체의 잠재적인 재확장을 제한하는 것이 당업계의 표준 관행이다. 이것은 전형적으로 수지를 슬러리로서 유동-패킹하고/거나 (즉, 슬러리를 컬럼에 빠른 유속으로 펌핑하여, 정상 가동 컬럼의 압력 차분을 넘어섬), 수지층에 수직으로 기계적인 압축을 직접 가함으로써 달성된다. 그러나, 수지의 과다 압축은 또한 컬럼 기능에 대해 손상 효과를 가질 수 있어서, 전형적으로 상이한 크로마토그래피 기질들을 정확히 정의된 압축 범위로 패킹하여, 허용가능한 컬럼 성능을 갖도록 보장한다.
허용가능한 매체 압축의 범위는 전형적으로 압축 인자 (Cf)로서 특정되는데, 이는 부피의 비: 완전히-완화/확장되거나 "중력 침전된" 수지의 부피를 패킹된 컬럼 내의 (압축된) 수지층의 부피로 나눈 값(Cf = V확장/V압축)으로 표현된다. Cf에 대한 허용가능한 값의 범위는, 기질의 매트릭스 조성물 및 패킹되는 컬럼의 직경에 맞는 상이한 컬럼에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 기질 제조업체는 기본 매트릭스와 이것이 견디는 것으로 나타난 압력의 경험적 평가에 기초하여 적합한 Cf를 특정한다. 조제용 생물 공정에 사용된 대부분의 연질 다공성 메트릭스는, 좁은-구멍의 실험실-규모 컬럼에 대해서는 1.10 < Cf < 1.15, 또는 큰-직경 공정-규모 컬럼에 대해서는 1.15 < Cf < 1.20 범위로 압축될 필요가 있다(Stickel and Fotopoulos 2001).
패킹된 컬럼이 원하는 압축 인자를 얻을 만큼 충분히 압축되지 않을 때, 추가적인 기계적 또는 수역학적 압력을 가하여 특정 Cf 범위에 도달하도록 층을 추가로 압축하는 것은 대단한 일은 아니다. 그러나, 수지층에 과다한 힘을 가하면 기질 입자에 균열이 생기고, 파손되고/거나 부서질 수 있다. 과다 압축 또는 과소 압축의 증거는 종종 패킹층을 통과하는 유동 균일성을 평가함으로써 탐지될 수 있으며, 당업계에서는 또한 압축 인자를 특정하는 외에, 압축 패킹을 실시한 후 층의 무결성을 입증하기 위해 표준 컬럼 효율 시험을 실시하는 것이 통상적인 관행이다. 따라서, 컬럼은 압축 인자와 컬럼 효율 측정기준이 둘 다 특정 범위에 속할 때에만 "충분히 잘 패킹되었다"고 간주된다.
컬럼 효율을 평가하는데 사용된 통상의 검정법은, 추적제 펄스 주입 시험이다. 이 방법의 수많은 변수는 문헌([Rathore, Kennedy et al. 2003, GE-Healthcare 2010], [Andres, Broeckhoven et al. 2015])에 기재되어 있으나, 모두 일반적으로 등용매를 사용하여 컬럼을 일정한 유속으로 가동하고, 불활성 추적제를 펄스로 주입시키고, 추적제가 패킹층을 통과하여 흐를 때 컬럼 용출물을 모니터링한 후, 추적제 분포를 분석하여 컬럼 패킹의 품질과 균일성을 추론함으로써 실시된 공통 과정을 따른다. 컬럼 용출물 내 추적제의 농도는 전체 시험 동안 시간의 함수로서 계속 모니터링되고, 도 9에 나타난 관계 및 방법을 사용하여 표준 컬럼 효율 측정기준 - 피크 비대칭 인자 (AS) 및 환원 단 높이 (h)-을 계산하는데 사용된다. 이상적인 패킹 조건 하에서, 컬럼은 AS = 1.00의 비대칭 인자와 h < 3의 환원 단 높이를 가질 것이다. 실제로, 0.8 < AS < 1.4 범위의 비대칭 인자와 h < 5의 환원 단 높이를 나타내는 컬럼이, 일반적으로 컬럼 효율 측정기준을 만족시킨다고 간주된다. 전형적으로, AS < 0.8의 컬럼 비대칭 인자가 과다 패킹 또는 과다 압축의 표시라면, As > 1.4의 비대칭 인자는 느슨한 패킹 또는 층 불안정성을 나타낼 수 있다.
대부분의 다공성 미립자 크로마토그래피 기질에서, 컬럼은 특정 압축 인자 Cf로 패킹될 수 있으나, 또한 기질 입자의 관능기 또는 부착된 리간드 조성과는 무관하게 컬럼 효율 측정기준 AS 및 h에 대한 허용가능한 제한도 만족시킨다. 그러나, 이 작업의 전개로부터 발생한 예상치 못한 발견에서, 미립자 기질은 일단 N-인테인 리간드가 접합되면 훨씬 압축성이 덜해지는 것으로 나타났다. 이러한 현상을 감안하여, 컬럼을 인테인 포획 수지로 패킹할 때 충분히 잘 패킹되는 수지층을 얻는 것은-불가능하지는 않다 해도-대단히 어려운 것으로 나타난다. 운좋게도, 수지 압축성 감소의 원인이라고 추정되는 기저 메커니즘은, N-인테인 리간드의 응집화를 유발한다고 생각되는 것들과 유사하므로, 실시예 5에 나타난 바와 같이 패킹 공정 동안 동족 결합 파트너를 포함할 때 유사하게 완화될 수 있다.
이전에 기재한 바와 같이, 분할된 인테인을 정의하는 특징 중 하나는 분할된 인테인이 이들 각각의 상대로부터 분리된 때의 INTN 및 INTC 도메인의 내재적으로 무질서한 구조이다. 무질서 상태에서, 인테인의 소수성 및 전하성 아미노산 잔기는 주위 환경에 노출되고; 인테인의 연결 및 결합은 이러한 노출된 잔기에 의해 유발되는데, 이들의 상대 도메인의 상보성 잔기를 끌어당기고 차폐함으로써 함께 폴딩되어, 더욱 안정한 구조화 복합체를 형성할 수 있다 (Shah, Eryilmaz et al. 2013). 이러한 노출된 잔기는 분할된 인테인을 친화성 포획에 유용하도록 만드는 기능에 필수적인 반면, 이들 고유의 불안정성은 또한 농축될 때 자기-자기 상호작용을 유발할 수도 있어서, 원치않는 부작용을 생성한다. 이전에 기재된 리간드 용해성 문제의 원인이 되는 INTN 도메인 응집화 외에, 이러한 현상은 표면-고정된 N-인테인 리간드를 갖는 수지 입자들 간의 상호작용에도 또한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 실시예 5에 나타난 바와 같이, 자연 압축성 아가로스 기본 수지 (Cf=1.15)는 N-인테인 리간드와 접합될 때 비압축성이 된다(Cf=1.01). 그러나, 이러한 효과는 접합된 리간드가 동족 결합 파트너의 존재로 인해 안정화될 때 없어지고, 수지는 원래 전-접합 압축성 (Cf=1.15)으로 회복된다. 따라서, 본 발명은 수지 산물의 유용성에 매우 중요한 컬럼 패킹을 돕는다.
원하는 관심 단백질에 융합되어 발현된 INTC 세그먼트는, 본 발명에서 단백질 정제 프로토콜의 일부로서 고려되지만, 이들은 본 발명에서 N-인테인 리간드가 고체 지지체에 이미 공유적으로 부착되고 동족 결합 파트너가 제거될 때까지는 사용되지 않는다는 것을 주목한다. 본 발명에서, 유사한 INTC 세그먼트들은 인테인 포획 수지의 제조 및 의도된 최종-용도 둘 다에 사용된다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 제1 시간에는 동족 결합 파트너로서 인테인 포획 수지를 생산하고 인테인 포획 수지를 종래의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하는 동안, N-인테인 리간드를 보호하고 이의 안정성을 촉진시킨다. 이 INTC 세그먼트에는 단백질 또는 펩티드가 결합되어 있을 수 있으나, 원하는 관심 단백질 (표적 단백질, 또는 이 단백질 정제 공정의 최종-산물로서 요망되는 단백질)을 갖지는 않을 것이다. 일단 N-인테인 리간드가 고체 지지체에 공유적으로 접합되면, INTC 세그먼트는 본원에 개시된 방법에 의해 세척될 수 있다. N-인테인 리간드를 고정시키고 동족 결합 파트너를 세척하여 이를 재활성화된 후, 제조 공정은 본질적으로 완료된다. 이 지점에서, 수지가 의도된 최종 용도로 사용되는 동안, 원하는 관심 단백질을 포함한 제2 INTC 세그먼트는 원하는 관심 단백질을 정제하는 동안에 N-인테인 리간드에 결합될 수 있다.
INTN 및 본원에 개시된 INTC 세그먼트들은 둘 다 예를 들어, Npu DnaE 인테인로부터 유래할 수 있다.
본원에서 정의된 N-인테인 리간드는 자연적인 인테인 (예컨대 Npu DnaE, 예를 들어; 서열 번호: 1)으로부터 유래될 수 있으나, 기본적으로 정의된 인테인 서열의 내부와 외부에 모두 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, Npu DnaE 유전자에 의해 암호화된 INTN 세그먼트는 종래의 표적화 돌연변이 유발에 의해 변형될 수 있어서, INTN 부분 내에 시스테인 잔기를 포함하지 않는다(서열 번호: 2). 이는 또한 이의 N-말단 및/또는 C-말단 ("N-말단 또는 C-말단 부위"로도 정의됨)에 추가적인 아미노산이 연결되어, 절단 성능을 개선시키고, 수지에 공유적으로 고정될 수 있다. 이것은 상기에 상세히 설명되어 있다. N-인테인 리간드의 일반화 구조 및 이의 기본 요소들은 도 6(a)에 도시되어 있다.
일 예에서, N-인테인 말단 세그먼트는 적어도 하나의 내부 시스테인 잔기가 적어도 하나의 세린 잔기로 돌연변이화되고, 펩티드 서열이 C-말단에 추가되어 단순 정제와 수지에 대한 고정이 가능해지고, 민감성 강화 펩티드 서열이 N-말단에 결합되어 신속하고 pH-민감한 절단을 촉진시키도록 변형될 수 있다 (서열 번호: 5, 및 이하의 추가적인 예를 참고한다). 완전히 변형된 서열은 본원에 기재된 "N-인테인 리간드"(서열 번호: 5)라고 할 것인데, Npu 인테인 서열은 물론 기재된 돌연변이와 첨가 서열도 포함할 것이다.
N-인테인 리간드는 또한 공유적으로 고정시키거나 공유적 고정을 증가시키는 고정 모이어티를 포함할 수도 있다. 예를 들어, C-말단의 영역 내에서 하나 이상의 아미노산은 시스테인 잔기일 수 있다. 이것은 N-인테인 리간드를 고체 지지체에 비특이적으로 고정시키는 것과 관련된 부 반응을 제거하기 위해서 요망된다.
시스테인 잔기가 돌연변이될 수 있는 N-인테인 리간드의 예는, 서열 번호: 2에서 찾을 수 있다. 대체되는 첫번째 시스테인 잔기 (INTN 세그먼트의 첫번째 아미노산)는 알라닌이나 글리신과 대체되어, 조립된 인테인 복합체에서 인테인 스플라이싱이 제거될 수 있다는 것을 주목한다.
본원에 개시된 방법에서, 동족 결합 파트너에 의해 안정화된 인테인 복합체는 고체 지지체 기질에 고정될 수 있다. 다양한 지지체들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 N-인테인 리간드를 고정시킬 수 있는 중합체 매체일 수 있는데, 상기 리간드의 고정은 적합한 링커에 의해 또는 적합한 링커 없이 공유적으로 또는 친화성 태그를 통해 일어날 수 있다. 링커가 사용될 때, 링커는 N-인테인 리간드에 융합하여 발현된 추가적인 아미노산 잔기일 수 있거나, 또는 펩티드를 지지체에 부착하기 위한 다른 공지의 링커일 수 있다.
본원에 개시된 N-인테인 리간드는 도 6(a)에 나타난 바와 같이 친화성 태그를 포함할 수 있다. 링커 서열은 또한 INTN 세그먼트과 친화성 태그 사이에 거리가 생기되, 인테인 절단 활성 부위에 대한 입체적인 방해를 최소화하기 위해 이용된다. 일반적으로, 링커는 비교적 비구조화된 아미노산 서열과 관련된 것으로 인식되며, 링커의 디자인과 용도는 융합 펩티드를 디자인하는 분야에서 통상적이다. 당업계의 숙련자도 인정할 다양한 단백질 링커 데이터베이스가 있다. 이것은 문헌[Argos et al. J Mol Biol 1990 Feb 20; 211(4) 943-58]; 문헌[Crasto et al. Protein Eng 2000 May; 13(5) 309-12]; 문헌[George et al. Protein Eng 2002 Nov; 15(11) 871-9]; 문헌[Arai et al. Protein Eng 2001 Aug; 14(8) 529-32]; 및 문헌[Robinson et al. PNAS May 26, 1998 vol. 95 no. 11 5929-5934]에 나온 것들을 포함하는데, 상기 문헌들은 링커의 예를 교시하기 위해 본원에 전문이 참조로서 포함된다.
표 1은 N-말단 인테인 세그먼트 및 C-말단 인테인 세그먼트의 예시적인 서열을 나타낸다:
[표 1]
주의: 관례상, INTC 세그먼트의 잔기 번호는 개시 코돈의 포르밀메티오닌 번역을 배제한 후, INTN 세그먼트의 마지막 잔기로부터 다시 번호를 재개한다.
일 예에서, 고체 지지체 기질은 고체 크로마토그래피 수지 골격, 예컨대 가교된 아가로스일 수 있다. 이는 또한 막, 단일체(monolith), 또는 자성 비드일 수도 있다. "고체 지지체 매트릭스" 또는 "고체 매트릭스"라는 용어는, 리간드 (예컨대 N-인테인 리간드)가 공유적으로 부착될 수 있게 하는 반응성 관능기를 함유한 수지의 고체 골격 물질을 말한다. 골격 물질은 무기성(예를 들어, 실리카) 또는 유기성일 수 있다. 골격 물질이 유기성일 때, 바람직하게는 고체 중합체이며, 적합한 유기 중합체는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 기재된 수지에 사용하는데 적합한 고체 지지체 매트릭스는, 예를 들어 셀룰로스, 재생 셀룰로스, 아가로스, 실리카, 코팅된 실리카, 덱스트란, 중합체 (예컨대, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 상업적으로 이용가능한 중합체, 예컨대 Fractogel, Enzacryl, 및 Azlactone를 포함한 폴리메타아크릴아미드), 공중합체 (예컨대, 스티렌과 디비닐-벤젠의 공중합체), 이들의 혼합물 등을 포함한다. 또한, 생성된 중합체에서 단량체 중 적어도 하나가 반응성 관능기를 함유하거나, 함유하도록 유도될 수 있는 경우, 공-중합체, 삼원-중합체 및 고급 중합체도 사용될 수 있다. 추가 구현예에서, 고체 지지체 매트릭스는 이의 골격에 혼입되는 이온성 관능기를 함유할 수 있다.
고체 지지체 매트릭스 기질의 반응성 관능기는 당업계에 잘 알려져 있는데, N-인테인 리간드가 공유적으로 부착될 수 있도록 한다. 이러한 관능기는 하이드록실, 카르복실, 티올, 아미노 등을 포함하는 특정 펩티드 모이어티와 반응한다. 이러한 관능기를 사용하여 종래의 화학물질에 리간드, 예컨대 N-인테인 리간드를 공유적으로 부착시킬 수도 있다. 추가로, 종래의 화학물질에서는 고체 지지체 매트릭스 상에 이러한 기가 포함될 수 있다. 예를 들어, 아크릴산 또는 이의 에스테르를 중합 공정에 이용함으로써 카르복시기가 직접 포함될 수 있다. 중합 시, 아크릴산이 이용되는 경우 카르복실 기가 존재하고, 또는 아크릴레이트 에스테르가 이용되는 경우 중합체는 카르복실 기를 함유하도록 유도될 수 있다.
친화성 태그는 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합되어 발현된 펩티드 또는 단백질 서열일 수 있는데, 이는 세포로부터 단백질을 정제하는데 도움을 주는 특정한 화학적 또는 물리적 특성을 부여한다. 친화성 태그를 포함한 펩티드를 발현하는 세포는 펠렛화되어, 용해될 수 있고, 세포 용해물은 컬럼, 수지 또는 리간드를 친화성 태그에 제시하는 다른 고체 지지체에 적용된다. 친화성 태그와 임의의 융합된 펩티드는 고체 지지체에 결합되며, 또한 이를 완충제로 수 회 세척하여 비결합된 (오염) 단백질을 제거할 수도 있다. 관심 단백질은, 친화성 태그에 부착된 경우, 리간드로부터 친화성 태그를 분리하는 완충제를 통해 고체 지지체로부터 용출되어 정제된 단백질을 생성할 수도 있고, 또는 용해성 프로테아제를 사용하여 결합된 친화성 태그로부터 절단될 수도 있다.
친화성 태그의 예는 문헌[Kimple et al. Curr Protoc Protein Sci 2004 Sep]; 문헌[Arnau et al. Protein Expr Purif 2006 Jul; 48(1) 1-13]; 문헌[Azarkan et al. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2007 Apr 15; 849(1-2) 81-90]; 및 문헌[Waugh et al. Trends Biotechnol 2005 Jun; 23(6) 316-20]에서 찾아볼 수 있으며, 상기 문헌 모두는 친화성 태그의 예에 대해 교시하기 위해 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
친화성 태그는 또한 선택적 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 침전-가능성 리간드에 대한 결합, (표적 단백질의 크기 및/또는 전하의 변화에 의한) 투석 및 매우 선택적인 다른 분리 방법을 포함한 다양한 방법들을 통해 변형된 개시된 펩티드를 사용하여, 관심 단백질의 정제를 용이하게 하는데 사용될 수 있다.
N-인테인 리간드는 민감성-향상 모티프 (SEM)를 추가로 포함할 수 있어서, 조립된 인테인 복합체의 스플라이싱 또는 절단 활성은 외부 조건에 대해 매우 민감해진다. 이러한 민감성-향상 모티프로 인해, 절단-활성 인테인 복합체 (INTC-태그 관심 단백질과 결합한 N-인테인 리간드)는 특정 조건 하에서 절단될 가능성이 더욱 높아질 수 있다. 따라서, 상기 민감성-향상 모티프로 인해, 분할된 인테인은 자연적인 인테인 또는 자연 발생적인 인테인에 비해 외부 조건에 더욱 민감해질 수 있다.
인테인의 목록은 표 2에서 나와 있다. 모든 인테인은 분할된 인테인이 될 가능성이 있지만, 일부 인테인은 자연적으로 분할된 형태로 존재하기도 한다. 표 2에 나와 있는 모든 인테인은 분할된 인테인으로 존재하거나, 또는 분할된 인테인이 될 가능성이 있다.
[표 2: 자연 발생적 인테인]
개시된 조성물 또는 개시된 방법에서 사용될 수 있는 분할된 인테인은, 변형되거나 돌연변이된 인테인일 수 있다. 변형된 인테인은 INTN 세그먼트, INTC 세그먼트 또는 둘 다에 대한 변형을 포함할 수 있다. 변형은 분할된 인테인의 어느 세그먼트의 N-말단 C-말단 부위에 융합된 아미노산을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 분할된 인테인의 어느 세그먼트 내에 있을 수 있다. 표 3은 아미노산, 이들의 약칭, 극성 및 전하의 목록을 나타낸다.
[표 3]: 아미노산
일단 동족 결합 파트너와 N-인테인 리간드를 얻은 후에 이를 분리하여, 공지 기술을 적절히 조합하여 정제할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 용해성을 이용한 방법, 예컨대 염 침전과 용매 침전; 분자량의 차이를 이용한 방법, 예컨대 투석, 한외-여과, 겔-여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 전하의 차이를 이용한 방법, 예컨대 이온-교환 컬럼 크로마토그래피; 특정 친화성을 이용하는 방법, 예컨대 친화성 크로마토그래피; 소수성의 차이를 이용한 방법, 예컨대 역-상 고성능 액체 크로마토그래피; 및 등전점의 차이를 이용한 방법, 예컨대 등전점 전기영동을 포함할 수 있다. 이들은 이하에 더욱 상세히 논의되어 있다.
C. 단백질 정제를 위한 조성물 및 시스템
고체 지지체에 공유적으로 고정된 인테인 복합체 복합체를 포함하는 단백질 정제 시스템이 본원에 개시되는데, 상기 인테인 복합체를 포함한 N-인테인 리간드의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%, 또는 그 이상은 동족 결합 파트너와 결합되고, 상기 동족 결합 파트너의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%, 또는 그 이상은 원하는 관심 단백질과 융합하여 발현되지 않는다.
N-인테인 리간드는 동족 결합 파트너와 함께 폴딩되어 N-인테인 리간드를 안정화시킬 뿐만 아니라 N-인테인 리간드의 용해성 회복을 증가시킬 수 있으나, N-인테인 리간드는 처리되면서 고체 지지체 기질에 공유적으로 고정된다. 또한, N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너는 인테인 복합체 내에서 결합하여 폴딩되는데, 단독 N-인테인 리간드보다 더욱 균일한 크기와 전하 분포를 갖기 때문에 하류 공정의 복합성을 완화할 수 있다.
또한, N-인테인 리간드가 공유-결합된 기본 수지를 포함한 크로마토그래피 수지도 개시되는데, 여기에서 상기 수지의 측정된 압축 차분 (ΔC)은 이의 기본 수지 기질에 비해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 더 작다. 본원에서 정의된 "기본 수지(base resin)"는 N-인테인 리간드 또는 어떠한 다른 리간드도 부착되지 않은 지지체 기질을 말한다. "압축 차분 (ΔC)"의 정의는 본원의 다른 곳에 제공되어 있다.
또한, N-인테인 리간드가 공유-결합된 기본 수지를 포함한 크로마토그래피 수지가 개시되는데, 여기에서 상기 수지의 측정된 본질적 기능성 압축 인자 (IFCF, intrinsic functional compression factor)는 1.10 내지 1.25이다. "본질적 기능성 압축 인자" (IFCF)의 정의는 본원의 다른 곳에 제공된다.
개시된 수지(들)의 압축 차분과 본질적 기능성 압축 인자는 부착된 N-인테인 리간드의 안정화로부터 발생된 고유의 기계적 특성인 것으로 이해되며, 이는 동족 결합 파트너가 있어야 유도된다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 고체 수지에 공유적으로 부착된 N-인테인 리간드를 포함한 미립자 매체를 고려할 때, ΔC < 10%의 압축 차분 및/또는 1.10 내지 1.25의 본질적 기능성 압축 인자 (IFCF)는, 동족 결합 파트너가 존재한다는 것을 나타낼 수 있다.
상기 방법에 관하여 논의된 바와 같이, 수지에 공유적으로 부착된 N-인테인 리간드는 동족 결합 파트너에 의해 안정화될 수 있다. 동족 결합 파트너는 C-말단 인테인 세그먼트 (INTC)를 포함할 수 있다. N-인테인 리간드는 리간드를 수지 기질에 공유적으로 고정시키기 전의 어느 공정 단계에서 동족 결합 파트너와의 결합을 통해 안정화될 수 있다. 고체 표면 상의 N-인테인 리간드 밀도는 10 mg N-인테인 리간드/수지 부피 mL를 초과할 수 있다. N-인테인 리간드는 자연적인 인테인, 예컨대 Npu DnaE 인테인으로부터 유래될 수 있다. 동족 결합 파트너는 Npu DnaE 인테인으로부터 유래될 수 있다. N-인테인 리간드는 정제 태그와 INTN 세그먼트를 포함할 수 있다. N-인테인 리간드는 N-인테인 리간드의 INTN 부분 내에 어떠한 시스테인 잔기도 포함하지 않을 수 있다. N-인테인 리간드는 적어도 하나의 내부 시스테인 잔기가 적어도 하나의 세린 잔기로 돌연변이되도록 변형된 자연 발생적인 INTN 세그먼트를 포함할 수 있다. 정제 태그는 하나 이상의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 패킹된 수지층에서, N-인테인 리간드는 고정 모이어티를 구성하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산들은 INTN 세그먼트의 C-말단에 직접 융합되어 발현되거나 작용가능하게 연결되도록 암호화될 수 있다. 고정 모이어티 내의 하나 이상의 아미노산은 시스테인 잔기일 수 있다. N-인테인 리간드는 민감성-향상 모티프를 추가로 포함하여, 외부 조건에 매우 민감해질 수 있다. 민감성-향상 모티프는 N-인테인 리간드의 N-말단 부위에 있을 수 있다. 외부 조건은 pH, 온도, 아연 또는 이들의 조합일 수 있다. N-인테인 리간드는 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9를 포함할 수 있다. 동족 결합 파트너는 서열 번호: 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 포함할 수 있다.
중요한 것은 단백질 정제 시스템의 이러한 특정 예에서, 동족 결합 파트너는 관심 단백질과 융합하여 발현되지 않는다는 점이다. 이것의 의미는 동족 결합 파트너가 제조 공정 동안 단백질 정제 시스템 자체의 최종-산물로서 바람직한 단백질 또는 펩티드를 포함하지 않거나, 이에 붙어있거나 결합되거나 연결되지 않는다는 것이다. 이로 인해 INTC 세그먼트에 연결되는(결합되는) N-인테인 리간드는 원하는 관심 단백질과 융합되어 발현되는 이전의 단백질 정제 시스템과 구별될 뿐만 아니라 이러한 단백질 정제 시스템의 "2차" 용도와도 구별된다. 또한, 본원에 기재된 동족 결합 파트너는 다른 단백질 또는 펩티드, 예컨대 이전에 기재된 링커 또는 태그 모이어티와 융합하여 발현될 수 있다는 것을 주목하는 것도 중요하다.
또한, 고체 친화성 포획 매체가 본원에 개시되는데, 상기 포획 매체는 표면에 공유적으로 부착된 N-인테인 리간드를 포함하는데, 또한 상기 부착된 N-인테인 리간드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50% 미만이나, .001, .01, .10, .20, .30, .40, .50, .60, .70, .80, .90, 1.0, 5.0, 또는 10% 초과 (또는 이러한 양을 초과하거나, 이들 사이에 있거나, 또는 이들 미만의 임의의 양)는 동족 결합 파트너와 결합하여 (인테인 복합체를 형성하고), 상기 동족 결합 파트너의 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% % (또는 이러한 양을 초과하거나, 이들 사이에 있거나, 또는 이들 미만의 임의의 양)는 원하는 관심 단백질과 결합하지 않는다.
이러한 조성물은, 인테인 복합체가 고체 기질에 노출되고 N-인테인 리간드는 기질 표면에 고정되고 동족 결합 파트너는 N-인테인 리간드로부터 분리되며 동족 결합 파트너의 주요 분획을 포함한 비-결합된 물질이 제거된 후의 친화성 포획 매체의 특성을 나타낸다. 수지가 결합을 파괴하는 조건에 노출된 후 세척된 때, N-인테인 리간드의 잔여량은 이들의 동족 결합 파트너와 결합하여 유지될 것이라는 점을 유의한다. 이것은 본원에 기재된 동족 결합 파트너를 이용하는 특정 제조 방법을 실시할 때를 제외하고는 존재하지 않는 독특한 조성물을 갖는 포획 매체를 생성한다.
또한, 키트도 본원에 개시되어 있다. 키트는 예를 들어, 본원에 기재된 인테인 복합체를 포함할 수 있다. 중요한 점은, 인테인 복합체가 N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너로 구성될 수 있으며, 상기 동족 결합 파트너는 원하는 관심 단백질을 포함하지 않는 점이다. 키트는 동족 복합체를 암호화하는 벡터 또는 벡터들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 N-말단 인테인을 암호화하는 하나의 벡터와, 동족 결합 파트너를 암호화하는 다른 벡터를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 이들은 동일한 벡터에 의해 암호화될 수도 있다. 키트는 또한 사용 설명서를 포함할 수도 있다.
D. 실험
이하의 실시예는 당업계의 통상의 숙련자들에게 본원에 주장된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 제조되고 평가되는지를 전부 개시하고 설명하기 제시되었으며, 본 발명의 순수한 예로서 의도되어, 본 발명자들이 본 발명으로 간주한 것의 범주를 제한하지 않을 것이다. 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대해서는 정확성을 보장하려고 애썼으나 일부 오류와 오차가 있을 수 있다.
실시예
1: N-인테인 리간드의 세포 용해물들을
비교한
SDS PAGE 분석
N-인테인 리간드 (서열 번호: 5)의 발현은 별도의 3개의 1.0 L 배양 배치에서 동일한 배양 조건 하에 실시하였다. 각각의 발현 배양 배치 후에, 세포를 수확하고, 분취하여, 리간드 용해성을 평가하였다. 시료 분취액을 지정된 농도로 용해 완충제에 재현탁시키고, 동일한 조건 하에서 용해시켰다.
결과는 도 1에서 볼 수 있다. 래인은 문자로 표시된다: 전체-세포 용해물 (WCL), 정화된 용해물 (CL) 및 펠렛 (P) 시료. WCL 래인은 총 세포성 단백질 생산을 나타내고; CL 래인은 용해물을 정화할 때 가용성을 유지하는 단백질 분획을 나타내고, P 래인은 용해물을 원심 분리할 때 소실되는 불용성 단백질의 분획을 나타낸다. N-인테인 리간드의 용해성은 각각의 배치에 대한 리간드 밴드 (화살표)의 크기와 강도를 육안으로 비교하여 대략 추정할 수 있다. 이것은 동일한 용해 배치에 대한 래인 WCL에 처음부터 존재한 총 리간드의 분획으로서 래인 CL에 나타나는 용해성 리간드의 양을 추정함으로써 이루어진다.
다시 도 1로 돌아가서, 발현 배치 A와 B를 비교한 것을 보면 가용성을 유지하는 총 리간드의 분획에서 특징적인 배치별 가변성이 나타난다. 기본적으로, 단백질 용해성은 본질적으로 2차 및 3차 구조가 적합하게 형성되었다고 가정하고 생체내에서 결정한다. 그러나, 발현 배치 C로부터 채취한 다수의 롯트들을 분석하면, 발현-후 공정이 N-인테인 리간드의 용해성에 크게 영향을 미칠 수 있다고 나타난다. 예를 들어, 롯트 B-1을 용해할 때 리간드 용해성은 90%를 초과한다고 나타났으며, 이는 발현 배치 B에서 '적합한' 생체내 합성이 이루어졌음을 암시할 것이다. 그러나, 하루 후 배치 B의 제2 분취액에 대해 용해 및 원심분리를 반복할 때에는 (롯트 B-2), 동일한 발현 배양액으로부터 공급되고 동일한 조건 하에서 용해되었음에도 불구하고 겉보기 용해성은 <10%로 떨어졌다. 롯트 B-2의 래인 P에서는, 처음부터 용해물 내에 존재했던 거의 모든 리간드가 원심분리 동안 침전된다는 것을 확인하였다. 이 데이터는 N-인테인 리간드가 불안정하여 적합한 생체내 합성 및 폴딩과는 무관하게 불용성 응집체를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 동족 결합 파트너와의 공동-발현
동일한 배양 조건 하에서 1.0 L의 발현 배치를 병렬적으로 수행하여, 종래의 단일-산물 과다 발현을 동족 결합 파트너와의 공동-발현과 비교하였다. 각각의 배치에는 비교되는 각각의 발현 제조물을 암호화하는 pET 벡터에 의해 형질전환된 E. coli (BLR) 품종을 접종하였다. 대조군 배치 (종래의 단일-산물 과다 발현)는 단독 N-인테인 리간드 (서열 번호: 5)를 암호화하는 벡터에 의해 형질전환시켰다. 공동-발현 배치 (리간드 + CBP-GFP 융합체의 공동-발현)는 공동-발현을 동시에 발생시키기 위해 N-인테인 리간드 (서열 번호: 5)와 동족 결합 파트너-GFP 태그 융합체 (서열 번호: 13)를 별도로 암호화하는 이중 시스트론 벡터에 의해 형질전환시킨다. 제2 공동-발현 배치 (리간드 + CBP의 공동-발현체)는 공동-발현을 동시에 발생시키기 위해 N-인테인 리간드 (서열 번호: 5)와 동족 결합 파트너 (서열 번호: 14)를 별도로 암호하하는 다른 이중 시스트론 벡터를 형질전환시킨다. 모든 배치는 병렬 처리되며, LB-아가 플레이트 유래의 LB 성장 배지의 10 mL 분취액을 접종하고, 선별 마커로서 암피실린을 사용하여 이를 37℃에서 ~16 시간 동안 성장시켰다. 이후, 이러한 종자 배양액을 사용하여 1.0 L의 강화 성장 배지와 암피실린을 함유한 플라스크에 접종한 다음, 37℃의 진탕 배양기에서 성장시켰다. 일단 배양액이 대수 성장기(mid-log phase)에 도달하면 (OD600 = ~5.0), IPTG를 최종 농도 1.0mM로 첨가하여 발현을 유도하고, 배양기 온도를 20℃로 낮춰서 적절한 폴딩과 용해를 촉진시켰다. 유도된 배양액을 추가 ~16 시간 동안 진탕 배양한 후, 원심분리에 의해 별도로 수확하여, 칭량하였다. 각각의 배치로부터 수확한 세포를 이들의 습윤-세포 중량에 비례하도록 용해 완충제에 재현탁하여, 각각의 배치의 농도를 이의 배양 세포 밀도에 맞게 효율적으로 정상화하였다. 각각의 정상화 재현탁액의 분취액을 기계적으로 용해하고, 시료를 채취한 후, 20,000×g로 10 분간 원심분리하여, 용해물을 정화하였다. 정화된 용해물에서 시료를 채취하고, 따라낸 후, 잔여 고체를 동동한 부피의 완충제에 재현탁한 다음, 다시 시료를 채취하였다. 이후, 이러한 시료: 전체-세포 용해물 (WCL), 정화된 용해물 (CL) 및 펠렛 (P)을 각각 SDS-PAGE를 통해 분석하여, 각각의 발현 배양액에 대한 리간드 용해성을 평가하였다.
도 2에 나타난 결과는 동족 결합 파트너 (CBP)를 생체내에서 공동-발현시키면 세포에 대사적 부담을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 세포의 재료들은 제한되어 있어서, 2차 공동-발현 산물을 도입하면 세포가 1차 과다 발현 산물의 합성을 위해 배당할 수 있었을 중요 물질과 에너지를 소모한다.
또한, 동족 결합 파트너는 1:1 입체화학적 기준에 따라 리간드를 안정화시키는데, 그 의미는 동족 결합 파트너가 동량 또는 과량의 몰량으로 존재할 때에만 동족 결합 파트너의 첨가가 리간드에 구조적으로 유익하다는 것이다. 이것은 동족 결합 파트너의 임의의 유용한 공동-발현 시 리간드에 비례하는 양으로 생산될 필요가 있어서, 세포의 제한된 재료의 유의한 부분이 소모되면 리간드의 총 생산 역가가 효과적으로 감소된다는 것을 암시한다.
도 2에서, 이 효과는 각각의 처리 방법으로부터의 WCL 래인과 비교하여 명확히 볼 수 있는데: 단일 리간드 산물의 종래의 과다 발현에서, 리간드 밴드의 크기와 밀도가 클수록 동족 결합 파트너와 공동-발현된 리간드의 상응하는 WCL 래인에 비해 발현 수준이 높아진다는 것을 나타낸다.
동족 결합 파트너 공동-발현이 리간드의 생산 역가를 감소시키기 때문에, 동족 결합 파트너의 도입이 제조 공정의 전체 생산성에 긍정적인 영향을 줄 것으로 예상되지는 않는다. 사실, 동족 결합 파트너와의 결합은 또한 기능적으로 리간드를 불활성화시켜서, 동족 결합 파트너를 제거하고 리간드를 불활성화시키기 위해서는 추가 공정 단계가 필요하다는 점을 고려하면, 이러한 접근법은 실제로는 오히려 직관에 반한다.
그러나, CBP에 의해 유도된 리간드 안정성과 용해성의 증가는 제조 공정의 다른 부분에 대해 긍정적인 효과를 미치므로, 동족 결합 파트너 공동-발현에 의해 유도된 리간드 산물 역가의 상대적인 감소를 상쇄시킬 수 있다.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 동족 결합 파트너의 존재는 확실히 리간드의 용해성에 대해 극적인 효과를 갖는다. 비록 이들 각각의 INTC-유래 도메인 내의 돌연변이는 물론 동족 결합 파트너와 융합되어 발현된 GFP와 His6 태그의 존재 (또는 부재)도 다르지만, 이러한 효과는 (서열 번호: 13)과 (서열 번호: 14) 둘 다에서 관찰된다. 이것은 다양한 동족 결합 파트너들이 N-인테인 리간드의 용해성을 강화시키도록 고안될 수 있다는 개념을 뒷받침하는데 - 인테인 복합체의 형성을 유도하는 중요한 능력을 보유하는 이상, 동족 결합 파트너 내의 돌연변이 및/또는 다양한 융합 파트너와의 교환은 사소하게 이루어질 수 있다. 이러한 경향은 또한 몇몇 다른 동족 결합 파트너-예컨대, 서열 번호: 10 내지 서열 번호: 16에 나열된 임의의 것들에서도 관찰할 수 있다.
실시예 3: 리간드 용해성
도 4는 전체-세포 용해물 (WCL), 정화된 용해물 (CL) 및 펠렛 (P) 시료를 나타내는, 각각의 배치에 대한 쿠마시(coomassie) 염색된 SDS-PAGE 분석을 보여준다. WCL 래인은 리간드의 총 세포 생산 역가를 나타내고; P 래인은 불용성 찌꺼기를 원심분리하여 폐기할 때 손실되는 리간드의 상대적 분획을 나타내고; CL 래인은 이후의 IMAC 정제에서 로딩되고 포획될 수 있는 용해성 리간드의 분획(화살표)을 포함한 피드 스톡(feedstock)을 나타낸다.
도 4는 또한 종래의 단일-산물 과다 발현 (상부) 및 CBP 공동-발현 (하부) 배치에 대해 실시된 병렬적 IMAC 정제 동안 280 nm에서의 흡광도 (A280)를 추적한 크로마토그램을 나타낸다. A280은 각 IMAC 컬럼의 유출구에서 빠져나올 때의 이동상 내 총 단백질 농도의 양적 추정치를 제공한다. 각각의 정제 시 회수된 리간드의 총량은 용출상 동안 발생하는 A280 피크를 적분하여 추정할 수 있다 (정규화된 체류 부피 > 21 CV). E1 및 E2로 표기된 피크로부터 채취된 시료를 SDS-PAGE에 의해 추가로 분석하여 순도를 평가하고, 우측 패널에 나타난 정확한 A280 양을 확인하였다.
도 4는 병렬적 IMAC 용출 피크 E1 (종래의 단일-산물 과다 발현) 및 E2 (CBP 공동-발현)로부터 채취한 시료의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 각 분획은 고도로 정제 및 농축된 리간드 산물을 나타내며, 공동-정제된 숙주-세포 단백질에서 발생한 약간의 오염물을 유사한 정도로 포함한다. 각각의 IMAC 정제에 의해 회수한 리간드의 총 질량은 용출상 전체의 A280 신호를 적분하여 계산하였다. 발현 배치들 간의 세포 밀도의 차이를 설명하기 위해, 각 용출물에서 회수한 총 질량을, 용해된 후 정제를 위해 피드스톡으로 제조된 총 생물량 (습윤 세포 중량)에 대해 정규화한다. 이러한 정규화된 수율은 각 정제에 대해 상응하는 용출 래인 아래에 기록되었다.
실시예 4: 최종-용도 정제 및 절단 속도론
인테인 포획 수지의 2개의 배치는 동일한 고정된 N-인테인 리간드 (서열 번호: 5)에 의해 제조하였다. 제1 배치는 종래의 단일-산물 과다 발현과 표준 생물공정 기술을 사용하여 제조하였고, 제2 배치는 본원에서 주장된 신규한 제조 공정을 사용하여 제조하였다.
신규한 제조 공정에서, N-인테인 리간드 (서열 번호: 5)는 동족 결합 파트너 (서열 번호: 13)와 공동-발현되었다. 공동-발현 산물은 서로 결합하여 인테인 복합체를 형성한 후, 정제되고, 농축되고, 완충제 교환되어, 크로마토그래피 수지에 공유적으로 고정된다. 이후, 수지에 6M GdnHCl 구배 세척제를 처리하여 복합체를 분리시키고, N-인테인 리간드를 재폴딩시킨다. 고정 반응은 N-인테인 리간드에서 선택적으로 일어나기 때문에, 상기 리간드는 수지에 공유 결합하여 유지되나, 분리된 동족 결합 파트너는 씻겨 나간다. 이로 인해 수지가 "활성화되고", N-인테인 리간드는 이제 자유 상태로 풀려나서 관심있는 INTC-태그 단백질을 포획한다.
제조 공정이 완료된 후, 중력-유동 크로마토그래피 컬럼에 각 배치의 수지를 패킹하고, 이를 사용하여 관심있는 INTC-태그 단백질을 동일하게 병렬적으로 정제하였다 (서열 번호: 17). 이러한 정제 시, 관심있는 INTC-태그 단백질을 함유한 용해물의 단일 배치는, 단일 발현 배치로부터 처리된 후 동일하게 나눠져서 각 컬럼에 적용되므로, 각 수지 배치의 성능을 평가할 때 확실한 비교가 가능하다. 이러한 정제로 인해 인테인 포획 매체의 의도된 최종 용도도 또한 입증된다.
도 5에서, 상부 패널은 종래의 방식으로 제조된 물질의 성능을 나타내는데, 이는 포획 매체를 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조한 아래쪽 패널과는 표면적으로만 달라 보인다. 이러한 비교는 강한 카오트로프 세척제 (6M GdnHCl)가 동족 결합 파트너를 인테인 복합체로부터 효과적으로 분리시켜서, 고정된 N-인테인 리간드를 재활성화시킬 수 있다는 것을 입증한다. 나아가, 이것은 또한 제조 동안 동족 결합 파트너가 존재하더라도 최종 산물 (인테인 포획 매체)의 성능에 유해한 영향을 주지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 5: 동족 결합 파트너에
의해 보강된
크로마토그래피 수지의 컬럼 패킹
정제된 N-인테인 리간드의 배치는, 본원에서 주장한 신규한 동족 결합 파트너 안정화 기술을 사용하여 제조하였다. 도 7에서 설명된 바와 같이, E. coli (BLR)를 단일-벡터 이중 시스트론 플라스미드에 의해 형질전환하여, 생체내 리간드 안정화를 위한 N-인테인 리간드 (서열 번호: 18)와 동족 결합 파트너 (서열 번호: 13)를 별도로 암호화한다. N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너를 공동-발현시키고, 수확하고, 표준 조제용 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제하였다. 이후, 생성된 산물-N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너의 자발적인 결합으로 형성된 인테인 복합체-을 크로마토그래피 수지에 공유적으로 고정시키기 위해 2개의 반응 배치로 나누었다.
고정 반응은 티올-반응성 관능기에 의해 유도된 6% 가교성 아가로스 크로마토그래피 수지 (평균 입자 크기 dp = 90 μm)를 사용하여 수행하였다. 정제 분취액을 이 수지와 반응시켜, N-인테인 리간드를 조작된 시스테인 고정 모이어티를 통해 선택적으로 접합시켰다. 이후, 각각의 반응 배치를 과다 티올로 부동태화하여, 수지 상의 임의의 잔여 고정 부위를 불활성화시켰다. 반응 및 부동태화 후, 제1 수지 반응 배치 ("-CBP"라고 함)를 교반 용기 내에서 변성 저-pH 제거 처리를 하여, 동족 결합 파트너를 수지로부터 분리하여 제거하였다 (도 7 및 8(b)에 나타남). 제2 수지 반응 배치 ("+CBP"라고 함)는 상기 처리를 하지 않고 그대로 둬서, 동족 결합 파트너가 수지-고정된 N-인테인 리간드와 복합체를 유지하게 한다. 이로 인해 N-인테인 리간드가 동족 결합 파트너에 의해 안정화될 때, 수지 특성의 직접적인 비교 및 평가가 가능해진다. 이후, 두 배치 모두에 >20 부피 등량의 인산염-완충 식염수 (PBS) pH 7.4를 각각의 배치에 흘려주는 최종 세척 처리를 하여, 용매, 반응물, 비반응된 리간드 및/또는 분리된 동족 결합 파트너를 제거한다. 여과 깔때기에서 수지를 배수시킨 후, 새로운 PBS를 추가하여 재현탁시키고, 눈금 실린더로 옮겨, 적어도 12 시간 동안 중력-침전시킨 후, 피펫으로 50% 슬러리가 되도록 조절하였다.
이후, 이러한 수지를 동일한 크로마토그래피 컬럼에 병렬로 유동-패킹하여, 컬럼 패킹과 패킹층의 유동 균일성에 대한 동족 결합 파트너의 영향을 평가하였다. 각각의 수지 배치에 대해, 4.0 mL의 50% 슬러리를 6.6mm 직경 크로마토그래피 컬럼에 첨가하고, 각 컬럼의 잔여 헤드 공간에 PBS를 추가로 채워넣어 컬럼 내의 임의의 공기를 대체하였다. 이후, 컬럼을 컬럼 유입구에서 높이-조절 유동 어뎁터(flow adapter)로 밀봉한 후, FPLC에 연결시켰다. 유동 어뎁터는 처음에는 가라앉은 수지층의 ~5 cm 위에 유입구 프릿(inlet frit)이 오도록 연장된 위치로 설정되었다, PBS를 50 cm/hr의 선형 표면 속도로 컬럼에 펌핑하여 확실히 수지를 침전시켰다. 가라앉은 수지층 (L0)의 높이를 측정하여, 각 컬럼에 대해 기록하였다. 컬럼 유입구를 통기시키고, 유동 어뎁터를 조절하여, 가라앉은 수지층의 0.5 cm 위에 유입구 프릿이 위치하도록 하였다. 이후, 컬럼 유입구를 FPLC에 재연결하여 일정-압력의 흐름 패킹을 시작한다: 컬럼을 통과하는 추가적인 PBS는 ΔP = 2.0 bar의 컬럼의 압력 강하를 유지하도록 설정된 PID-조절 유속으로 컬럼을 통과한다. 층의 압축이 안정화된 후 적어도 5 분 동안 패킹 흐름을 유지하고, 그 후 유입구 프릿이 물리적으로 압축된 수지층의 상부에 닿을 때까지 유동 어뎁터를 더 하향 조절하였다. FPLC 흐름을 50 cm/hr에 상응하는 일정한 유속으로 재시작하고, 추가적인 5 분 동안 펌핑하였다. 수지층을 육안으로 검사하여, 최종 패킹 단계 동안 추가적인 층 압축 또는 공극 형성이 더 이상 일어나지 않는다는 것을 확인하였다. 압축된 수지층의 높이 (L)를 측정하고, 각 컬럼에 대해 기록하였다. 이러한 측정치는 공식 Cf = L0/L을 사용하여 각 수지에 대한 패킹층의 부피 압축 인자 (Cf)를 계산하는데 사용하였다. 결과는 도 10에 나와 있다.
컬럼 패킹이 끝난 후, 불활성 추적제 펄스 주입을 사용한 표준 컬럼 효율 시험을 각 컬럼에 대해 실시하여, 패킹층에 대한 유동 균일성을 평가하였다. 각 시험은 PBS 전개 완충제를 50 cm/hr의 일정 선속도(constant linear velocity)로 펌핑하여 실시하였다. 평형화 시킨 후, 컬럼에 200 μL의 추적제 용액 (PBS pH 7.4 + 1.0 M NaCl + 0.1% (v/v) 아세톤)을 펄스로 주입하였다. 추적제의 등용매성 용출을 인라인(inline) UV-분광분석법에 의해 추가 5 CV에 대해 계속 모니터링하였고; 컬럼 용출물 중의 추적제의 농도는 파장 λ=280nm에서의 흡광도(A280)로 나타내었다. 각 수지에 대해 실시한 추적제 펄스 시험의 크로마토그램은 도 10(a)에 나와 있다. 도 9에 나타난 당업계의 숙련자들이 통상 실시하는 방법을 적용한 후, 이러한 데이터를 사용하여 각각의 배치에 대한 피크 비대칭 인자 (As)와 환원 단 높이 (h)를 계산하고 각 수지 배치의 컬럼 패킹의 양을 검증하였다. Cf, As 및 h는 도 10(b)에서 각각의 배치에 대해 기록되어 있는데, 동족 결합 파트너의 도움을 받을 때와 이들의 도움이 없을 때의 인테인 포획 수지에 대한 패킹의 효과를 나타낸다.
흥미롭게도, 아가로스 수지 기본 매트릭스 (즉, 리간드가 고정되지 않은 기본 수지)는 압축 인자 Cf = 1.15로 패킹될 수 있으나, 일단 N-인테인 리간드가 접합되면 (-CBP 배치), 수지는 ΔP = 2.0 bar로 슬러리-패킹될 때 더 이상 압축될 수 없어서, Cf = 1.01의 압축 인자만을 얻을 수 있을 뿐이다. 기계적인 압축에 의해 수지층을 더욱 압축하려고 노력한 결과, 비대칭 및 환원 단 높이 시험의 측정기준이 허용가능한 제한에서 벗어났고, 이는 과다 압력이 수지 기질을 깨고 부술 가능성이 커서, 패킹층의 무결성을 손상시켰다는 것을 나타낸다. 그러나, 동일한 조건 하에 동족 결합 파트너 (+CBP 배치)에 의해 안정화된 수지 배치를 패킹할 때, 수지의 압축성은 회복된다. 도 10(b)에서 관찰할 수 있는 바와 같이, +CBP은 압축 인자 Cf = 1.15로 슬러리 패킹될 수 있으나, 허용가능한 비대칭 및 환원 단 높이 시험의 측정기준을 유지하여, 비변형된 기본 수지의 성능을 반영한다.
인용 문헌
Claims (56)
- 발현과 정제 동안 N-인테인 리간드를 안정화시키는 방법으로서, 상기 방법은:
a. N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너의 조립을 통해 인테인 복합체를 형성하는 단계;
b. 상기 인테인 복합체를 정제하는 단계; 및
c. 상기 인테인 복합체를 고체 지지체에 고정시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
d. 상기 인테인 복합체를 상기 N-인테인 리간드와 상기 동족 결합 파트너 사이의 결합을 파괴시키는 조건 하에 두는 단계; 및
e. 상기 N-인테인 리간드가 고정 상태를 유지하면서 폴딩되어 활성 상태가 되도록 하는 조건을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 C-말단 인테인 세그먼트를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서, 상기 N-인테인 리간드와 상기 동족 결합 파트너는 생체내에서 공동-발현되는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드와 상기 동족 결합 파트너는 단일 플라스미드 또는 2-플라스미드 시스템의 단일 세포에서 발현되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서, 상기 N-인테인 리간드는 상기 N-인테인 리간드의 발현 후 트랜스 방식으로 상기 동족 결합 파트너에 노출되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서, N-말단 인테인 세그먼트는 고체 지지체에 공유적으로 고정되는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 다공성 수지, 막, 단일체 또는 자성 비드를 포함한 종래의 크로마토그래피 매체인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 크로마토그래피 매체는 고체 크로마토그래피 수지 골격인, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체 상의 N-인테인 리간드의 밀도는 10 mg의 N-인테인 리간드/수지 부피 mL를 초과하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 무질서 유발제나 염기성 또는 산성 용액을 사용하여, 상기 N-인테인 리간드와 상기 동족 결합 파트너 사이의 결합을 파괴하는 조건을 생성할 수 있는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드와 상기 동족 결합 파트너 사이의 결합을 파괴한 후, 상기 N-인테인 리간드가 새로운 결합 파트너를 받아들일 수 있는 활성 상태로 상기 N-인테인 리간드를 변환시키는 조건이 뒤따르는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 파괴 조건은 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 무질서 유발제, 인산과 같은 산, 또는 수산화나트륨과 같은 염기 중 어느 하나를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 자연적인 인테인으로부터 유래했었던, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 Npu DnaE 인테인으로부터 유래하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 Npu DnaE 인테인으로부터 유래하는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 정제 태그와 INTN 세그먼트를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 상기 N-인테인 리간드의 INTN 부분 내에 어떠한 시스테인 잔기도 포함하지 않는, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 자연 발생적 INTN 세그먼트를 포함하는 N-인테인 리간드는 적어도 하나의 내부 시스테인 잔기가 적어도 하나의 세린 잔기로 돌연변이되게끔 변형되었던, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 정제 태그는 하나 이상의 히스티딘 잔기를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 고정 모이어티를 구성하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 아미노산은 상기 INTN 세그먼트의 C-말단에 직접 융합되어 발현되거나 작용가능하게 연결되도록 암호화되어, N-인테인 리간드를 공유적으로 고정시킬 수 있게 하는, 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 고정 모이어티 내의 하나 이상의 아미노산은 시스테인 잔기인, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 민감성-향상 모티프를 추가로 포함하여, 외부 조건에 매우 민감하게 되는, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 민감성-향상 모티프는 상기 N-인테인 리간드의 N-말단 부위에 있는, 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 외부 조건은 pH, 온도, 아연, 또는 이들의 조합인, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 18을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 서열 번호: 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 포함하는, 방법.
- 단백질 정제 매체로서, 상기 매체는 고체 지지체에 공유적으로 고정된 N-인테인 리간드를 포함하되, 상기 N-인테인 리간드의 90% 이상은 동족 결합 파트너와 결합되어 있고, 상기 동족 결합 파트너의 90%는 원하는 관심 단백질과 융합하여 발현되지 않는, 단백질 정제 매체.
- 제29항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 C-말단 인테인 (INTC) 세그먼트를 포함하는, 단백질 정제 매체.
- N-인테인 리간드가 공유-결합된 기본 수지를 포함한 크로마토그래피 수지로서, N-인테인 리간드의 .001% 초과는 동족 결합 파트너와 결합되며, 추가로, 상기 동족 결합 파트너의 90%는 원하는 관심 단백질과 융합하여 발현되지 않는, 크로마토그래피 수지.
- 제31항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 C-말단 인테인 (INTC) 세그먼트를 포함하는, 크로마토그래피 수지.
- 외인성 핵산을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 외인성 핵산은 N-인테인 리간드와 동족 결합 파트너를 암호화하되, 상기 N-인테인 리간드는 정제 태그와 함께 발현되도록 암호화되고, 상기 동족 결합 파트너는 원하는 관심 단백질과 융합하여 발현되도록 암호화되지 않는, 발현 벡터.
- 제33항의 발현 벡터를 포함하는, 세포.
- 제34항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 원하는 관심 단백질이 아닌 단백질 또는 펩티드와 융합하여 발현되도록 암호화되는, 벡터.
- 제35항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩티드는 친화성 태그인, 벡터.
- 공유-결합된 N-인테인 리간드를 갖는 기본 수지를 포함한 크로마토그래피 수지로서, 상기 수지의 측정된 압축 차분 (ΔC)은 이의 기본 수지 기질에 비해 10% 더 적은, 크로마토그래피 수지.
- 공유-결합된 N-인테인 리간드를 갖는 기본 수지를 포함한 크로마토그래피 수지로서, 상기 수지의 측정된 내부 기능성 압축 인자 (IFCF)는 1.10 내지 1.25인, 크로마토그래피 수지.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 동족 결합 파트너에 의해 안정화되는, 수지.
- 제39항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 C-말단 인테인 세그먼트 (INTC)를 포함하는, 수지.
- 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 표면 상의 N-인테인 리간드 밀도는 10 mg의 N-인테인 리간드/수지 부피 mL를 초과하는, 수지.
- 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 자연적인 인테인으로부터 유래하는, 수지.
- 제42항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 Npu DnaE 인테인으로부터 유래하는, 수지.
- 제39항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 Npu DnaE 인테인으로부터 유래하는, 수지.
- 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 정제 태그와 INTN 세그먼트를 포함하는, 수지.
- 제45항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 상기 N-인테인 리간드의 INTN 부분 내에 어떠한 시스테인 잔기도 포함하지 않는, 수지.
- 제45항에 있어서, 자연 발생적 INTN 세그먼트를 포함하는 상기 N-인테인 리간드는 적어도 하나의 내부 시스테인 잔기가 적어도 하나의 세린 잔기로 돌연변이되도록 변형되었던, 수지.
- 제45항에 있어서, 상기 정제 태그는 하나 이상의 히스티딘 잔기를 포함하는, 수지.
- 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 고정 모이어티를 구성하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 수지.
- 제49항에 있어서, 상기 아미노산은 INTN 세그먼트의 C-말단에 직접 융합되어 발현되거나 작용가능하게 연결되도록 암호화되는, 수지.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 고정 모이어티 내의 하나 이상의 아미노산은 시스테인 잔기인, 수지.
- 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 민감성-향상 모티프를 추가로 포함하여 외부 조건에 매우 민감하게 되는, 수지.
- 제45항에 있어서, 상기 민감성-향상 모티프는 N-인테인 리간드의 N-말단 부위에 있는, 수지.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 외부 조건은 pH, 온도, 아연 또는 이들의 조합인, 수지.
- 제37항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-인테인 리간드는 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 18을 포함하는, 수지.
- 제39항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동족 결합 파트너는 서열 번호: 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 포함하는, 수지.
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