KR20230004563A - 강력한 암 면역치료제로서 리포좀성 구형 핵산 내 캡슐화된 산화된 종양 세포 용해물 - Google Patents

강력한 암 면역치료제로서 리포좀성 구형 핵산 내 캡슐화된 산화된 종양 세포 용해물 Download PDF

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KR20230004563A
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cancer
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차드 에이. 머킨
카산드라 엘리자베스 칼만
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노오쓰웨스턴 유니버시티
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Abstract

본 개시는 일반적으로 내부에 캡슐화된 산화된 종양 세포 용해물 및 이의 표면 상에 올리고뉴클레오타이드를 갖는 나노입자에 관한 것이다. 상기 나노입자를 제조하고 사용하는 방법이 또한 본원에 제공된다.

Description

강력한 암 면역치료제로서 리포좀성 구형 핵산 내 캡슐화된 산화된 종양 세포 용해물
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 4월 10일자로 출원된 미국 가출원 제63/008,229호의 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원의 진술
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 CA199091 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
본 개시의 일부인 서열목록은 텍스트 파일로서 명세서와 동시에 제출된다. 서열목록이 포함된 텍스트 파일의 명칭은 "2020-042P_Seqlisting.txt"이며, 이는 2020년 4월 10일에 생성되었으며 크기는 1,047 바이트이다. 서열목록의 대상물은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시는 일반적으로 내부에 캡슐화된 산화된 종양 세포 용해물 및 이의 표면 상에 올리고뉴클레오타이드를 갖는 나노입자에 관한 것이다. 상기 나노입자를 제조하고 사용하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
종양에 대한 면역 체계를 동원하는 것은 개인 맞춤형 암 치료의 중심 목표이다. 실제로, 종양-관련 항원(TAA)의 식별 및 세포-기반 요법의 출현은 이러한 목표를 달성하기 위한 상당한 진전을 나타낸다 (1-5). 그러나, 수지상 세포 (DC) 백신 (6) 및 CAR-T 세포 요법 (7)을 포함한, 이러한 접근법은, 환자로부터 미성숙 면역 세포의 추출, 생체외 세포의 확장, TAA와의 배양, 및 환자에 대한 재주입이 필요하기 때문에 비용이 많이 들고 노동 집약적이다. 또한, 이러한 요법은 종양이 알려진 TAA를 발현하는 환자의 하위 집합으로 제한되며 (8), 단일-항원 백신으로 면역 반응을 높이는 것은 궁극적으로 종양 이질성과 시간 경과에 따른 항원 발현의 손실로 인해 제한된 효능을 가질 수 있다 (9-11).
요약
종양 관련 항원 (TAA)을 활용하는 요법이 개발되었지만, 이러한 접근법은 종양이 알려진 TAA를 발현하는 환자의 하위 집합으로 제한되며, 단일-항원 백신으로 면역 반응을 높이는 것은 궁극적으로 종양 이질성과 시간 경과에 따른 항원 발현의 손실로 인해 제한된 효능을 가질 수 있다. 암 면역 요법에서 항원 공급원으로 종양 세포로부터 분리된 용해물을 활용하면 이러한 문제가 해결된다; 그러나, 종양 용해물을 사용한 직접적인 백신 접종은 이들의 최소한의 면역원성 때문에 제한된 성공을 거두었다. 용해물 분리 및 제조 전에 종양 세포를 산화시키면 용해물이 항원 공급원으로 활용될 때 면역원성을 유의미하게 증가시키지만, 이러한 변화가 항원 제시를 촉진하고 종양 미세환경 (TME)을 변경하는 방법의 근본적인 메커니즘은 불분명하게 남아 있다. 더욱이, 면역치료제 개발의 주요 과제는 성분이 제형화되는 방식이 면역계로의 전달 및 이에 따라 면역자극성 경로의 활성화에 유의미하게 영향을 미칠 수 있기 때문에 보조제 및 항원을 모두 전달하기 위한 적절한 비히클의 선택이다. 가장 강력한 면역 반응을 위해 보조제 및 항원의 공동 전달이 필요하기 때문에, 나노스케일 치료제는 보조제 및 항원의 혼합물에 비해 항원-제시 세포 (APC) 활성화를 향상시키는 데 있어서, 이와 관련하여 가능성을 보여주었다. 면역자극성 핵산으로 장식된 구형 핵산 (SNA)의 코어 내 산화된 종양 세포 용해물을 캡슐화하면 동일한 표적 면역 세포에 높은 공동 전달을 가능하게 하며, 이는 비-산화된 용해물 및 산화된 용해물과 보조제 DNA (예를 들어 및 제한 없이, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제)의 혼합물을 포함하는 SNA와 비교하여, 우수한 항종양 효능 및 생존율, 뿐만 아니라 극적으로 변경된 TME로 이어진다. 본 개시는 용해물이 처리되고, 패키징되고, 면역 세포에 제시되는 방식이 용해물-기반 면역치료제의 치료 가능성의 중요한 결정인자임을 입증한다.
따라서, 일부 측면에서 본 개시는 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 갖는 나노입자를 제공하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 상기 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 1 (TLR1) 작용제, 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 작용제, 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 작용제, 톨-유사 수용체 5 (TLR5) 작용제, 톨-유사 수용체 6 (TLR6) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 톨-유사 수용체 10 (TLR10) 작용제, 톨-유사 수용체 11 (TLR11) 작용제, 톨-유사 수용체 12 (TLR12) 작용제, 톨-유사 수용체 13 (TLR13) 작용제, 또는 이들의 조합이다. 바람직한 구현예에서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 TLR9 작용제는 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (서열번호 1)이다. 추가 구현예에서, 상기 나노입자는 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(아크릴레이트), 또는 폴리(메타크릴레이트) 나노입자이다. 일부 구현예에서, 상기 TLR9 작용제는 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT(스페이서-18 (헥사에틸렌글리콜))2콜레스테롤-3' (서열번호 2)이다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 친유성기를 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 친유성기는 토코페롤 또는 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 콜레스테롤은 콜레스테릴-트리에틸렌글리콜 (콜레스테릴-TEG)이다. 일부 구현예에서, 토코페롤은 토코페롤 유도체, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 또는 델타-토코페롤이다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 복수의 지질기를 포함한다. 추가 구현예에서, 적어도 하나의 지질기는 지질의 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 또는 포스파티딜에탄올아민 계열의 것이다. 또 다른 추가 구현예에서, 적어도 하나의 지질기는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-포스파티딜콜린 (DMPC), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (DPPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DSPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1-올레오일-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-스테아로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DOPE-PEG-아지드), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DOPE-PEG-말레이미드), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DPPE-PEG-아지드), 1,2-디팔미토릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DPPE-PEG-말레이미드), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DSPE-PEG-아지드), 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DSPE-PEG-말레이미드), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 지질기는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 지질기는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자의 직경은 약 20 나노미터 (nm) 내지 약 150 nm이다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자의 직경은 약 100 나노미터 이하이다. 추가 구현예에서, 상기 나노입자의 직경은 약 80 나노미터 이하이다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 약 10개 내지 약 200개의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 나노입자는 75개의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 0.5 nmol 내지 약 25 nmol: 약 5 μg 내지 약 150 μg이다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 5 nmol 올리고뉴클레오타이드:20 μg 종양 세포 용해물이다. 일부 구현예에서, 상기 산화된 종양 세포 용해물은 차아염소산 (HOCl), 과산화수소, 차아염소산나트륨, 아염소산나트륨, 질산, 또는 황에 노출된 종양 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 종양 세포는 약 10 μM 내지 약 100 μM HOCl에 노출된다. 추가 구현예에서, 상기 종양 세포는 약 60 μM HOCl에 노출된다. 일부 구현예에서, 상기 종양 세포 용해물은 유방암 세포, 복막암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 식도암 세포, 안구암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포, 폐암 세포, 피부암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 위암 세포, 고환암 세포, 갑상선암 세포, 뇌암 세포, 또는 이들의 조합으로부터 유래된다. 추가 구현예에서, 상기 종양 세포 용해물은 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA이다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA이다. 일부 측면에서, 본 개시는 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 갖는 나노입자를 제공하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 상기 나노입자, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 내에 캡슐화된다.
일부 측면에서, 본 개시는 종양 세포를 산화제에 노출시켜 산화된 종양 세포를 생성하고; 이후 산화된 종양 세포로부터 용해물을 분리하고; 이후 지질 필름을 용해물과 접촉시켜 내부에 캡슐화된 용해물을 포함하는 소형 단층 소포체 (SUV)를 생성하고; 이후 SUV에 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 리포좀성 나노입자를 제조하는 것을 포함하는, 리포좀성 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 산화제는 차아염소산 (HOCl)이다. 일부 구현예에서, 상기 종양 세포는 약 10 μM 내지 약 100 μM의 산화제에 노출된다. 추가 구현예에서, 상기 종양 세포는 약 60 μM의 HOCl에 노출된다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이다. 추가 구현예에서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 1 (TLR1) 작용제, 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 작용제, 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 작용제, 톨-유사 수용체 5 (TLR5) 작용제, 톨-유사 수용체 6 (TLR6) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 톨-유사 수용체 10 (TLR10) 작용제, 톨-유사 수용체 11 (TLR11) 작용제, 톨-유사 수용체 12 (TLR12) 작용제, 톨-유사 수용체 13 (TLR13) 작용제, 또는 이들의 조합이다. 바람직한 구현예에서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 리포좀성 나노입자는 직경이 약 50 나노미터 (nm) 내지 약 100 나노미터 (nm)이다. 추가 구현예에서, 상기 리포좀성 나노입자는 직경이 약 100 nm 미만이다. 또 다른 추가 구현예에서, 상기 리포좀성 나노입자는 직경이 약 80 nm이다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 친유성 테더링된 기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드-지질 접합체이고, 상기 친유성 테더링된 기는 SUV의 표면에 흡착된다. 일부 구현예에서, 상기 친유성 테더링된 기는 토코페롤 또는 콜레스테롤을 포함한다. 추가 구현예에서, 토코페롤은 토코페롤 유도체, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 또는 델타-토코페롤이다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA이다. 일부 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 0.5 nmol 내지 약 25 nmol: 약 5 μg 내지 약 150 μg이다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 5 nmol 올리고뉴클레오타이드:20 μg 종양 세포 용해물이다.
일부 측면에서, 본 개시는 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 갖는 나노입자를 포함하는 항원성 조성물을 제공하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 안정화제, 보존제, 또는 보조제 내의 상기 나노입자, 또는 본 개시의 약학적 제제 내에 캡슐화되며, 상기 항원성 조성물은 포유동물 대상체에서 항체 생성 또는 보호 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 항체 반응은 중화 항체 반응 또는 보호 항체 반응이다.
일부 측면에서, 본 개시는 대상체에게 본 개시의 항원성 조성물의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 것을 포함하는, 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 암은 유방암, 복막암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 식도암, 안구암, 간암, 췌장암, 후두암, 폐암, 피부암, 난소암, 전립선암, 위암, 고환암, 갑상선암, 뇌암, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 유방암이다. 추가 구현예에서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암 (TNBC)이다.
일부 측면에서, 본 개시는 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 갖는 나노입자의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 나노입자; 항원성 조성물; 또는 본 개시의 약학적 제제 내에 캡슐화되며, 이로써 대상체에서 암을 치료한다. 일부 구현예에서, 상기 투여는 피하이다. 추가 구현예에서, 상기 투여는 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 근육내이다.
본원에 개시된 기술의 적용은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00001
암 면역요법 및 암 백신
Figure pct00002
광범위한 종양 관련 항원에 대한 백신 접종
Figure pct00003
개인 맞춤형 암 요법
Figure pct00004
단백질 용해물의 면역원성 증가
Figure pct00005
항원 제시 세포의 자극
Figure pct00006
종양 미세환경 변경
Figure pct00007
면역조절
본원에 개시된 기술의 장점은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00008
분리 후 종양 용해물의 증가된 면역원성
Figure pct00009
두 성분이 나노스케일 상에서 함께 패키징되기 때문에, 생체내 동일한 표적 면역 세포에 대한 보조제 및 항원의 높은 공동 전달
Figure pct00010
생체외 면역 세포 확장 및 활성화를 필요로 하지 않는, 용해물-함유 면역치료제의 직접적인 적용
Figure pct00011
나노입자 코어 내 이들의 캡슐화로 인한 분해로부터 용해물의 보호
Figure pct00012
변경된 면역 세포 집단
도 1은 용해물-로딩된, 면역자극성 구형 핵산 (Lys-SNA)을 나타낸다. (a) Lys-SNA의 개략도. 산화된 또는 비-산화된 TNBC 세포로부터의 TNBC 용해물 (주황색)은 SNA를 생성하기 위해 콜레스테롤-변형된 핵산 (녹색)으로 기능화된 리포좀 (보라색)의 코어에 캡슐화된다. (b) Lys-SNA의 초저온-TEM. (c) 유리 CpG-1826 (좌측 레인), Lys-SNA (중간 레인), 및 리포좀을 분해하기 위한 Triton-X에 노출 후의 Lys-SNA (우측 레인)의 겔 전기영동. (d) DLS에 의해 측정된, 용해물-로딩된 리포좀 및 SNA의 유체역학적 직경.
도 2는 접종 후 11일째에 종양 부위에서 CD8+ (세포독성) T 세포 집단의 대표적인 예를 나타낸다.
도 3은 접종 후 11일째에 종양 부위에서 MDSC 집단의 대표적인 예를 나타낸다.
도 4는 용해물-로딩된 리포좀으로부터의 용해물-로딩된 SNA 형성을 나타낸다. CpG-1826은 콜레스테롤로 3'-변형되어 이중층 삽입을 유도한다.
도 5는 Cy5-표지된 SNA 내의 FITC-표지된 용해물의 전달을 나타낸다. (a) 이중 형광단-표지된 Lys-SNA 및 Lys-Mix와 함께 1시간 및 24시간 동안 인큐베이션된 BMDC의 공초점 현미경 이미지(스케일 막대 = 10 μm). (b) 유세포 분석을 통해 평가된 1시간 및 24시간 인큐베이션 후 시험관내에서 Lys-SNA (n=3, 검은색 막대) 및 Lys-Mix (n=3, 녹색 막대)에 의한 용해물 및 DNA의 BMDC로의 공동 전달. (c) 피하 주사 후 2시간 및 24시간에 생체내에서 Lys-SNA (n=3, 검은색 막대) 및 Lys-Mix (n=3, 녹색 막대)에 의한 용해물 및 DNA의 림프성 세포로의 공동 전달. 림프절을 분리하고 CD11c+ 림프성 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었으며, 여기서 "*"는 < 0.05의 p-값을 나타내고, "**"는 < 0.01의 p-값을 나타내고, "***"는 < 0.001의 p-값을 나타낸다.
도 6은 생체내 Lys-SNA 및 Lys-Mix의 항종양 효과를 나타낸다. (a) Lys-SNA (검은색 원), Lys-Mix (녹색 사각형), 또는 식염수(흰색 다이아몬드)가 투여된 경우 정위성(orthotopic) 동계 (a) Py230 종양, (b) Py8119 종양, 또는 (c) EMT6 종양 보유 마우스의 항종양 효능. 치료 개시는 접종 후 6일째에 시작되었고, 10일 및 15일째에 반복되었다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었으며, 여기서 "*"는 < 0.05의 p-값을 나타내고, "**"는 < 0.01의 p-값을 나타내고, "***"는 < 0.001의 p-값을 나타낸다.
도 7은 (a) EMT6, Py230, 및 Py8119로부터 분리된 용해물, 및 (b) 비-산화된 (좌측 레인) 및 산화된 EMT6 세포 (우측 레인)로부터 분리된 용해물의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 8은 인큐베이션 후 시험관내 BMDC의 활성화를 나타낸다. C57BL6 마우스로부터 분리된 세포를 정제하고, CpG-1826 및 산화된 용해물 (노란색 막대), 비-산화된 용해물 (검은색 막대), 또는 용해물 없음 (회색 막대)과 공동-배양하였다. 2일 후, DC 활성화는 (a) CD40, (b) CD80, (c) CD86, 및 (d) MHC-II의 발현 수준에 대해 유세포 분석으로 측정하였다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었으며, 여기서 "*"는 < 0.05의 p-값을 나타내고, "**"는 < 0.01의 p-값을 나타내고, "***"는 < 0.001의 p-값을 나타낸다.
도 9는 OxLys-SNA 생체내 분석을 나타낸다. (a) 항종양 효능 및 (b) OxLys-SNA (노란색 원), OxLys-Mix (회색 사각형), Lys-SNA (검은색 원), 또는 식염수 (흰색 다이아몬드)가 투여된 경우 정위성 동계 EMT6 종양 보유 Balb/c 마우스의 해당 생존율 곡선. 치료 개시는 접종 후 6일째에 시작되었고, 10일 및 15일째에 반복되었다. 6일 및 15일에 OxLys-SNA (노란색 막대), Lys-SNA (검은색 막대), OxLys-Mix (회색 막대), 또는 식염수 (흰색 막대)로 처리한 후, 접종 후 11일째에 EMT6-보유 마우스의 종양 미세환경으로부터 분리된 (d) 세포독성 CD8+ T 세포 및 (e) MDSC의 집단.
도 10은 (a) 접종 후 0일부터 25일까지 OxLys-SNA가 투여된 동물의 개별 종양 성장 (스파이더) 플롯을 나타낸다. 20일째, OxLys-SNA 처리를 받은 2마리를 제외한 모든 동물은 완전한 종양 관해를 경험하였다. (b) 접종 후 50일까지 OxLys-SNA (노란색 선) 또는 식염수(검은색 선)가 투여된 동물의 스파이더 플롯. 모든 식염수-처리된 동물은 첫 번째 OxLys-SNA 처리된 동물 전에 종양 부담(tumor burden)에 굴복하였다. 파란색 박스는 패널 a의 영역을 나타낸다.
도 11은 Py8119 TNBC 모델에서 L-SNA의 생체내 항종양 활성을 나타낸다. (a) 식염수 (삼각형), DOPC-SNA (사각형) 또는 DPPC-SNA (원) 투여 후, 리포좀 안정성의 함수로서 "보조제 단독" L-SNA의 항종양 효능. (b) 리포좀 안정성의 함수로서 Py8119 용해물을 캡슐화하는 L-SNA의 항종양 효능. 동물은 식염수 (삼각형), DOPC-Lys-SNA (사각형), 또는 DPPC-Lys-SNA (원)가 투여되었다. (c) 리포좀 안정성의 함수로서 산화된 Py8119 용해물을 캡슐화하는 L-SNA의 항종양 효능. 동물은 식염수 (삼각형), DOPC-OxLys-SNA (사각형), 또는 DPPC-OxLys-SNA (원)가 투여되었다. ((d) 본 연구에서 28일째에 DPPC-함유 처리군 간의 종양 부피 비교. 흰색 점은 각 군의 개별 동물을 나타낸다. 오차 막대는 평균 표준 오차를 나타낸다. 통계 분석은 독립표본 t-검정(unpaired t-test)을 사용하여 수행되었으며, 여기서 "*"는 < 0.05의 p-값을 나타내고, "**"는 < 0.01의 p-값을 나타내고, "***"는 < 0.001의 p-값을 나타내고, "ns"는 > 0.05의 p-값을 나타낸다.
본 개시는 산화된 종양 세포로부터 분리된 용해물을 캡슐화하고 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, CpG-1826)를 이들의 표면 상에 보조제로서 제시하는 면역치료제 구형 핵산 (SNA) (예를 들어, 리포좀성 SNA)을 포함한다. 생성된 나노구조 (OxLys-SNA)는 선형 올리고뉴클레오타이드와 용해물의 단순한 혼합물과 비교하여 면역 세포에 대한 보조제 및 항원의 공동 전달을 향상시키고, 비-산화된 대응물에 비해 수지상 세포의 활성화를 유의미하게 증가시킨다.
단일-항원 백신에 대한 매력적인 대안은 TAA 공급원으로서 환자 자신의 종양으로부터 분리된 용해물을 사용하는 것이다 (12-18). 종양 세포 용해물을 항원으로서 이용하면 면역 세포에 의해 처리되고 표적화될 수 있는 단백질 세트가 확장되며 - 원칙적으로, 전체 종양 프로테옴에 접근할 수 있다 (18). 따라서, 이것은 또한 하기를 포함하여, 잘 정의된 TAA의 유한 집합을 사용하는 몇 가지 잠재적인 한계를 해결한다: 1) 종양으로부터 면역원성 에피토프를 확인하는 과제, 2) 주조직적합성 복합체 (MHC)에 의한 에피토프 제한, 및 3) 종양에서 표적화된 항원의 손실. 그러나, 종양 용해물을 사용한 직접적인 백신 접종은 낮은 세포 흡수 및 주사 후 생체이용률로 인해 제한된 성공을 거두었으며, 최소한의 면역원성을 초래하였다 (19). 용해물 분리 및 제조 전에 종양 세포를 산화시키면 DC 백신에서 용해물이 항원 공급원으로서 활용될 때 면역원성이 유의미하게 증가한다 (19-21). 중요하게도, 적응 면역 반응의 일부로서 호중구에 의해 생성된 산화제인, HOCl에 의한 단백질 염소화는 잠재적으로 증가된 단백질 분해 감수성으로 인해 (23), 항원의 면역원성을 몇 배까지 증가시킨다 (22). 또한, HOCl 산화는 이들의 비변형된 대응물보다 더 면역원성인 알데히드-변형된 항원을 생성한다 (24). 그러나, 이러한 변화가 어떻게 항원 제시를 촉진하고 종양 미세환경 (TME)을 변경하는지에 대한 근본적인 메커니즘은 불분명하다. 더욱이, 면역치료제 개발의 주요 과제는 구성요소가 제형화되는 방식이 면역계로의 전달 및 따라서, 면역자극성 경로의 활성화에 유의미하게 영향을 미칠 수 있기 때문에 (26, 27), 보조제와 항원을 모두 전달하기 위한 적절한 비히클의 선택이다 (25). 나노스케일 치료제는 이와 관련하여 보조제와 항원의 혼합물에 비해 항원-제시 세포 (APC) 활성화를 향상시키는 가능성을 나타내었다 (28).
구형 핵산 (SNA)은 보조 형질감염 시약 (30)의 사용 없이 신속한 세포 흡수를 포함하는, 이들의 선형 유사체 (29)와 완전히 상이한 거동을 나타내는 새로운 종류의 핵산이다. SNA 구조는 구형 형태로 핵산의 조밀하고, 고도로 배향된 패킹에 의해 정의되며, 이는 SNA가 유래된 핵산에 새로운 화학적, 생물학적 및 물리적 특성을 부여한다. 현재까지, SNA는 금 및 기타 무기 나노입자 (29-36), 리포좀 (37-41), 중합체 (42-44) 및 단백질 (45)을 포함하는, 다양한 나노입자 코어로부터 형성되었다. 리포좀은 생성된 시스템이 생분해성 및 생체적합성이고, 리포좀이 약물 전달을 위한 검증되고, FDA-승인된 나노스케일 제형이기 때문에 SNA 템플릿을 위한 특히 매력적인 스캐폴드이다 (46). 또한, 리포좀성 SNA의 중공 코어는 TAA 및 기타 카고(cargo)를 캡슐화할 수 있다. 리포좀성 SNA는 이전에 항원 제시를 개시하고, 면역 세포를 활성화하고, 암 치료 및 기타 적용을 위한 전염증성 사이토카인의 생산을 유도하는 것으로 관찰되었다 (39, 41, 47-49). 이러한 많은 예에서, 올리고뉴클레오타이드 쉘의 서열은 CpG-1826으로 칭해지는 비메틸화된 시토신-구아노신 서열로 구성된다. CpG-1826은 미생물 게놈을 모방하고 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP)으로서 작용하며 (50), 이는 DC를 포함하는, 항원-제시 세포 (APC)의 엔도솜에 위치하는 선천성 면역계의 구성요소인, 톨-유사 수용체 9 (TLR9)에 의해 인식된다 (51).
본 개시는 다양한 측면 및 구현예에서, 공지된 TAA가 없는 암, 예컨대, 제한 없이 삼중 음성 유방암 (TNBC)의 치료를 위한 강력한 나노스케일 면역치료제를 개발하는 데 사용되는 종양 세포 용해물을 함유하는 SNA를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "구형 핵산 (SNA)"은 나노입자 코어 주위에 배열된 핵산을 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "한(a)", "하나(an)" 및 "그(the)"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 본원에 사용된 바와 같이 상호교환가능하다.
물질의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 임상 결과를 포함하여 유익하거나 목적한 결과에 영향을 미치는 데 필요한 양이며, 따라서 "유효량"은 이것이 적용되는 맥락에 따라 달라진다. 항원성 조성물을 투여하는 맥락에서, 유효량은 면역 반응을 유발하기에 충분한 항원 (예를 들어, 본 개시의 산화된 종양 세포 용해물을 포함하는 SNA)을 함유한다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 효능은 예를 들어, 실험 대조군과 비교하여 관심 물질로 달성된 결과를 비교함으로써, 실험 또는 임상 시험에서 나타날 수 있다.
항원성 조성물과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "용량"은 임의의 하나의 시간에 대상체에 의해 취해진 (투여되거나 수용된) 항원성 조성물의 측정된 부분을 지칭한다.
값과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 그 값의 90% 내지 110%를 포괄한다 (예를 들어, 직경이 약 100 나노미터 (nm)인 나노입자는 직경이 90 nm 내지 110 nm인 나노입자를 지칭한다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "백신 접종"은 유기체의 체내에 백신을 도입하는 것을 지칭한다.
"대상체"는 살아있는 다세포 척추동물 유기체이다. 본 개시의 맥락에서, 대상체는 비인간 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 또는 비인간 영장류)과 같은 실험 대상체일 수 있다. 대안적으로, 대상은 인간 대상체일 수 있다.
"항원성 조성물"은 예를 들어, 종양 관련 항원과 같은 항원에 대해 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 인간 또는 동물 대상체 (예를 들어, 실험 또는 임상 환경에서)에 투여하기에 적합한 물질의 조성물이다. 이와 같이, 항원성 조성물은 하나 이상의 항원 (예를 들어, 종양 관련 항원) 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 항원성 조성물은 또한 부형제, 담체, 및/또는 보조제와 같은 면역 반응을 유발하거나 향상시킬 수 있는 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 항원성 조성물은 항원에 의해 유도된 증상 또는 상태에 대해 대상체를 보호하는 면역 반응을 유도하기 위해 투여된다. 일부 경우에, 항원에 의해 유발된 증상 또는 질병은 예를 들어 종양과 관련된 세포의 확장을 억제함으로써 예방 (또는 감소 또는 개선)된다. 본 개시의 맥락에서, 용어 항원성 조성물은 종양 관련 항원에 대한 보호 또는 완화 면역 반응을 유발할 목적으로 대상체 또는 대상체 집단에 투여하기 위해 의도된 조성물을 포괄하는 것으로 이해될 것이다.
"보조제(adjuvant)"는 항원을 포함하는 조성물에 첨가된 경우, 노출 시 수용자에서 항원에 대한 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강화시키는 물질을 지칭한다. 본 개시의 임의의 측면 또는 구현예에서, 본원에 제공된 SNA는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어 및 제한 없이 CpG-1826)를 보조제로서 포함하고, 항원으로서 종양 세포로부터 유래된 용해물을 캡슐화한다. 본 개시의 조성물에 사용될 수 있는 다른 일반적인 보조제는 항원이 흡착되는 미네랄 현탁액 (명반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄); 유중수(water-in-oil) 및 수중유(oil-in-water)를 포함하는 에멀젼 (및 이중 에멀젼 및 가역적 에멀젼을 포함하는 이의 변이체), 리포사카라이드, 리포폴리사카라이드, 패턴 인식 수용체 (PRR) 작용제 (예를 들어, NALP3. RIG-I-유사 수용체 (RIG-I 및 MDA5), 및 이러한 성분의 다양한 조합을 포함한다.
"면역 반응"은 항원 (예를 들어, 항원성 조성물 또는 백신으로 제형화됨)과 같은 자극에 대한 B 세포, T 세포 또는 단핵구와 같은 면역계 세포의 반응이다. 면역 반응은 항원 특이적 중화 항체와 같은 특이적 항체의 생산을 초래하는 B 세포 반응일 수 있다. 면역 반응은 또한 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응과 같은 T 세포 반응일 수 있다. B 세포 및 T 세포 반응은 "세포" 면역 반응의 측면이다. 면역 반응은 또한 항체에 의해 매개되는 "체액성" 면역 반응일 수 있다. 일부 경우에, 반응이 특정 항원에 대해 특이적이다 (즉, "항원-특이적 반응"). "보호 면역 반응"은 항원의 유해한 기능 또는 활성을 억제하거나, 항원으로 인한 증상 (사망 포함)을 감소시키는 면역 반응이다. 보호 면역 반응은 예를 들어, 종양 세포 확장의 억제에 대한 혈청 항체의 능력을 테스트하기 위해 면역화된 대상체로부터의 혈청 샘플을 사용하는 면역 검정에 의해 측정될 수 있다, 예컨대: ELISA-중화 검정, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 검정 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 (CDC), 항체 의존성 세포-매개 식균 작용 (ADCP), 효소-결합 면역스팟 (ELISpot). 또한, 백신 효능은 유세포 분석기 (FACS) 분석 또는 ELISpot 검정을 사용하여, 면역화 후 T 세포 반응 CD4+ 및 CD8+를 측정함으로써 테스트될 수 있다. 보호 면역 반응은 동물 모델에서 생체내 항원 공격에 대한 내성을 측정함으로써 테스트될 수 있다. 인간에서, 보호 면역 반응은 미처리 대조군과 비교하여 처리된 대상체의 증상, 이환율, 사망률 등의 측정치를 비교하는, 집단 연구에서 입증될 수 있다. 항원 (예를 들어, 항원성 조성물 또는 백신으로 제형화됨)과 같은 면역원성 자극에 대한 대상체의 노출은 그 자극에 특이적인 1차 면역 반응을 유발하며, 즉 노출은 면역 반응을 "프라임" 한다. 예를 들어, 면역화에 의한 자극에 대한 후속 노출은 특정 면역 반응의 크기 (또는 지속기간, 또는 둘 다)를 증가 또는 "부스트" 할 수 있다. 따라서, 항원성 조성물을 투여함 (예를 들어, 항체 역가 및/또는 친화도를 증가시킴에 의해, 항원 특이적 B 또는 T 세포의 빈도를 증가시킴에 의해, 성숙 이펙터 기능을 유도함에 의해, 또는 이들의 조합)에 의해 기존의 면역 반응을 "부스팅"하는 것은 항원-특이적 반응의 크기를 증가시킨다.
구형 핵산 . 구형 핵산 (SNA)은 유기 (예를 들어, 리포좀) 또는 중합체 (예를 들어, 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(아크릴레이트), 또는 폴리(메타크릴레이트)일 수 있는 나노입자의 표면 상에 조밀하게 기능화되고 고도로 배향된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 쉘의 구형 구조는 형질감염제와는 관계없이 거의 모든 세포로의 진입 및 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 포함하여, 전통적인 핵산 전달 방법에 비해 고유한 이점을 부여한다. 또한, SNA는 혈액-뇌(blood-brain) (예를 들어, 미국특허 출원 공개번호 제2015/0031745호 참조, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 및 혈액-종양 장벽 뿐만 아니라 표피 (예를 들어, 미국특허 출원 공개번호 제2010/0233270호 참조, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)를 포함한, 생물학적 장벽을 관통할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 개시의 SNA는 SNA의 코어 내에 캡슐화된 산화된 종양 세포 용해물을 추가로 포함한다.
따라서, 부착된 폴리뉴클레오타이드를 갖도록 기능화된 나노입자가 제공된다. 일반적으로, 고려되는 나노입자는 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드에 대한 높은 로딩 용량을 갖는 임의의 화합물 또는 물질을 포함하며, 이는 예를 들어 및 제한 없이, 리포좀성 입자, 중합체-기반 입자 (예를 들어, 폴리 (락틱-코-글리콜산) (PLGA) 입자), 또는 덴드리머 (유기물 대 무기물)를 포함한다.
나노입자 중합체는 폴리스티렌, 실리콘 고무, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에스테르, 폴리에테르 및 폴리에틸렌을 포함한다. 생분해성, 생체고분자 (예를 들어, BSA, 다당류 등과 같은 폴리펩타이드), 기타 생물학적 물질 (예를 들어, 탄수화물), 및/또는 중합체 화합물이 또한 나노입자를 생산하는데 사용하기 위해 고려된다.
예를 들어 국제 특허 출원 PCT/US2014/068429호 (특히 리포좀성 입자의 논의와 관련하여, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같은 리포좀성 입자가 또한 본 개시에 의해 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 공개번호 제2012/0282186호 (본원에 그 전체가 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같은 중공 입자가 또한 본원에서 고려된다. 본 개시의 리포좀성 입자는 적어도 실질적으로 구형인 기하학적 구조, 내부 측면 및 외부 측면을 갖고, 지질 이중층을 포함한다. 지질 이중층은 다양한 구현예에서, 복수의 지질기를 포함하며, 이때 적어도 하나의 지질기는 지질의 포스포콜린 계열 또는 지질의 포스포에탄올아민 계열의 것이다. 제한하려는 것은 아니지만, 상기 적어도 하나의 지질기는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-포스파티딜콜린 (DMPC), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (DPPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DSPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1-올레오일-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-스테아로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DOPE-PEG-아지드), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DOPE-PEG-말레이미드), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DPPE-PEG-아지드), 1,2-디팔미토릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)](DPPE-PEG-말레이미드), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DSPE-PEG-아지드), 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DSPE-PEG-말레이미드), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 지질기는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 지질기는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함하거나 이로 구성된다.
나노입자는 직경이 약 10 nm 내지 약 150 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 140 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 130 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 120 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 110 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 100 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 90 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 80 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 70 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 60 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 50 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 40 nm, 직경이 약 10 nm 내지 약 30 nm, 또는 직경이 약 10 nm 내지 약 20 nm의 크기 범위일 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시는 복수의 나노입자를 제공하고, 각각의 나노입자는 이에 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 가지며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 나노입자 내에 캡슐화된다. 이러한 측면에서, 상기 복수의 나노입자의 크기는 약 10 nm 내지 약 150 nm (평균 직경), 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 140 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 130 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 120 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 110 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 100 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 90 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 80 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 70 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 60 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 50 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 40 nm, 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 30 nm, 또는 평균 직경이 약 10 nm 내지 약 20 nm이다. 일부 구현예에서, 나노입자의 직경 (또는 복수의 나노입자에 대한 평균 직경)은 약 10 nm 내지 약 150 nm, 약 30 내지 약 100 nm, 또는 약 40 내지 약 80 nm이다. 일부 구현예에서, 방법에 사용되는 나노입자의 크기는 이들의 특정 용도 또는 적용에 의해 요구되는 바에 따라 달라진다. 크기의 변화는 나노입자의 특정 물리적 특성, 예를 들어, 광학 특성 또는 본원에 기술된 바와 같이 기능화될 수 있는 표면적의 양을 최적화하는 데 유리하게 사용된다. 추가 구현예에서, 복수의 SNA (예를 들어, 리포좀성 입자)가 생성되고, 복수의 SNA는 약 150 나노미터 이하 (예를 들어, 약 10 나노미터 내지 약 150 나노미터), 또는 약 100 나노미터 이하 (예를 들어, 약 10 나노미터 내지 약 100 나노미터, 또는 약 80 나노미터 이하 (예를 들어, 약 10 나노미터 내지 약 80 나노미터)의 평균 직경을 갖는다. 추가 구현예에서, 본 개시의 방법에 의해 생성된 복수의 나노입자는 약 20 나노미터 이하, 또는 약 25 나노미터 이하, 또는 약 30 나노미터 이하, 또는 약 35 나노미터 이하, 또는 약 40 나노미터 이하, 또는 약 45 나노미터 이하, 또는 약 50 나노미터 이하, 또는 약 55 나노미터 이하, 또는 약 60 나노미터 이하, 또는 약 65 나노미터 이하, 또는 약 70 나노미터 이하, 또는 약 75 나노미터 이하, 또는 약 80 나노미터 이하, 또는 약 85 나노미터 이하, 또는 약 90 나노미터 이하, 또는 약 95 나노미터 이하, 또는 약 100 나노미터 이하, 또는 약 100 나노미터 이하, 또는 약 120 나노미터 이하, 또는 약 130 나노미터 이하, 또는 약 140 나노미터 이하, 또는 약 150 나노미터 이하의 직경 또는 평균 직경을 갖는다. 나노입자의 전술한 직경은 나노입자 자체의 직경 또는 나노입자 및 이와 회합된 올리고뉴클레오타이드의 직경에 적용될 수 있음이 이해될 것이다.
올리고뉴클레오타이드 . 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드" 또는 이의 복수형은 본원에 논의되고, 당업계에 달리 공지된 변형된 형태와 상호교환가능하다. 특정 예에서, 당해 분야는 천연 발생 뉴클레오타이드, 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 비천연 발생 뉴클레오타이드를 포함하는 "핵염기"라는 용어를 사용한다. 따라서, 뉴클레오타이드 또는 핵염기는 천연 발생 핵염기 A, G, C, T, 및 U를 의미한다. 비천연 발생 핵염기는, 예를 들어 및 제한 없이, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N',N'-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신 (mC), 5-(C3―C6)-알키닐-시토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner 등, U.S. 특허 제5,432,272호 및 Susan M. Freier 및 Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443에 기술된 "비천연 발생" 핵염기를 포함한다. 용어 "핵염기"는 또한 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클, 뿐만 아니라 그의 헤테로사이클릭 유사체 및 이의 호변이성질체를 포함한다. 또한, 천연 및 비천연 발생 핵염기는 U.S. 특허 제3,687,808호 (Merigan 등), Sanghvi 저술, 15장, Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke 및 B. Lebleu, CRC Press, 1993, Englisch 등, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722 (특히 페이지 622 및 623 참조, 및 the Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, 페이지 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 폴리뉴클레오타이드는 또한 가장 고전적인 관점에서 뉴클레오사이드 염기가 아니지만 뉴클레오사이드 염기로서 작용하는 특정 "보편적인 염기"를 포함하는, 핵염기 같이 작용할 수 있는 헤테로사이클릭 화합물과 같은 화합물을 포함하는 비천연 발생 뉴클레오타이드의 범주인 하나 이상의 "뉴클레오사이드 염기" 또는 "염기 단위"를 포함한다. 보편적인 염기는 3-니트로피롤, 임의로 치환된 인돌 (예를 들어, 5-니트로인돌), 및 임의로 치환된 하이포잔틴을 포함한다. 다른 바람직한 보편적인 염기는 당업계에 공지된 보편적인 염기를 포함하는, 피롤, 디아졸 또는 트리아졸 유도체를 포함한다.
변형된 뉴클레오타이드는 EP 1 072 679호 및 WO 97/12896호에 기술되어 있으며, 이의 개시는 본원에 참조로 포함된다. 변형된 핵염기는 제한 없이, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 피리미딘 염기의 5-프로피닐 우라실 및 시토신 및 기타 알키닐 유도체, 6-아조우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가로 변형된 염기는 삼환형 피리미딘 예컨대 펜옥사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프 예컨대 치환된 펜옥사진 시티딘 (예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥스-아진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d)]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 추가의 핵염기는 미국 특허 번호 제3,687,808호에 개시된 것, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것, Englisch 등, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613에 개시된 것, 및 Sanghvi, Y. S., 15장, Antisense Research and Applications, 페이지 289-302, Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 개시된 것들을 포함한다. 특정의 이들 염기는 결합 친화도를 증가시키는 데 유용하고, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 특정 측면에서 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된다. 이의 개시는 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 제3,687,808호, 미국 특허 번호 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,830,653호; 제5,763,588호; 제6,005,096호; 제5,750,692호 및 제5,681,941호를 참조한다.
미리결정된 서열의 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) 및 F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)를 참조한다. 고체상 합성 방법이 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 둘 다에 대해 바람직하다 (DNA를 합성하는 잘 알려진 방법이 또한 RNA를 합성하는 데 유용하다). 폴리리보뉴클레오타이드는 또한 효소적으로 제조될 수 있다. 비천연 발생 핵염기는 또한 올리고뉴클레오타이드 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,223,833호; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, 등, J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, 등, Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, 등, J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005); 및 Zimmermann, 등, J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002)를 참조한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형된 형태로 기능화된 제공된 나노입자는 일반적으로 약 5개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 구체적으로, 나노입자는 약 5개 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 70개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 45개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 35개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 25개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 15개의 뉴클레오타이드 길이, 약 5개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 길이인 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드가 목적한 결과를 달성할 수 있을 정도로 구체적으로 개시된 크기의 중간 길이의 모든 폴리뉴클레오타이드로 기능화된다. 따라서, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 약 125개, 약 150개, 약 175개, 약 200개, 약 250개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 500개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드가 고려된다.
일부 구현예에서, 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. DNA가 나노입자에 부착될 때, DNA는 일부 구현예에서 나노입자에 부착된 DNA 폴리뉴클레오타이드와 표적 폴리뉴클레오타이드의 혼성화가 일어나고, 이로써 나노입자에 표적 폴리뉴클레오타이드가 회합되도록 폴리뉴클레오타이드의 표적 영역에 충분히 상보적인 서열로 구성된다. 다양한 측면에서 DNA는 이중-가닥 분자가 또한 표적 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 영역에 혼성화되는 단일 가닥 영역을 포함하는 한, 단일 가닥 또는 이중-가닥이다. 일부 측면에서, 나노입자 상에 기능화된 폴리뉴클레오타이드의 혼성화는 이중-가닥 표적 폴리뉴클레오타이드와 삼중 구조를 형성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 삼중 구조는 단일-가닥 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 나노입자 상에서 기능화된 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 의해 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시는 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 것으로 고려된다. RNA는 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있는 한 단일-가닥 또는 이중-가닥 (예를 들어, siRNA)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 100% 상보적, 즉 완벽한 일치인 반면, 다른 측면에서, 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오타이드는 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 길이 전반에 걸쳐 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 95% 상보적이며, 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 길이 전반에 걸쳐 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 20% 상보적이다.
일부 측면에서, 다중 폴리뉴클레오타이드는 나노입자로 기능화된다. 다양한 측면에서, 다중 폴리뉴클레오타이드 각각은 동일한 서열을 갖는 반면, 다른 측면에서 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상이한 서열을 갖는다. 추가 측면에서, 다중 폴리뉴클레오타이드는 나란히 배열되고 스페이서에 의해 분리된다. 스페이서는 본원에서 하기에 보다 상세하게 기술된다.
나노입자에 대한 폴리뉴클레오타이드 부착 . 방법에 사용하기 위해 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 수단 (예를 들어, 공유 또는 비-공유 부착)을 통해 상기 나노입자에 결합된 것들을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드가 나노입자에 부착되는 수단에 관계없이, 다양한 측면에서 부착은 5' 연결, 3' 연결, 일부 유형의 내부 연결, 또는 이들 부착의 임의의 조합을 통해 이루어진다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 나노입자에 공유적으로 부착된다. 추가 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 나노입자에 비-공유적으로 부착된다. 본 개시의 올리고뉴클레오타이드는 다양한 구현예에서, 토코페롤, 콜레스테롤 모이어티, DOPE-부트아미드-페닐말레이미도, 또는 리소-포스포에탄올아민-부트아미드-페닐말레이미도를 포함한다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤은 콜레스테릴-트리에틸렌글리콜(콜레스테릴-TEG)이다. 일부 구현예에서, 토코페롤은 토코페롤 유도체, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤 및 델타-토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본원에 그 전체가 참조로 포함된, 미국 특허 출원 공개번호 제2016/0310425호를 참조한다.
부착 방법은 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 제2009/0209629호에 기술되어 있다. RNA를 나노입자에 부착하는 방법은 PCT/US2009/65822호에 일반적으로 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 폴리뉴클레오타이드를 리포좀성 입자와 회합시키는 방법은 PCT/US2014/068429호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
스페이서 . 특정 측면에서, 올리고뉴클레오타이드가 스페이서를 통해 나노입자에 부착된 것을 포함하는 기능화된 나노입자가 고려된다. 본원에 사용된 바와 같이 "스페이서"는 그 자체로 유전자 발현을 조절하는 데 참여하지 않지만, 이는 나노입자와 기능성 올리고뉴클레오타이드 사이의 거리를 증가시키거나, 다중 카피로 상기 나노입자에 부착될 때 개별 올리고뉴클레오타이드 사이의 거리를 증가시키는 역할을 하는 모이어티를 의미한다. 따라서, 스페이서는 올리고뉴클레오타이드가 동일한 서열을 가지든 상이한 서열을 가지든, 개별 올리고뉴클레오타이드 사이에 나란히 위치하는 것으로 고려된다. 일 측면에서, 스페이서는 존재하는 경우 유기 모이어티이다. 또 다른 측면에서, 스페이서는 수용성 중합체, 핵산, 폴리펩티드, 올리고당, 탄수화물, 지질, 에틸글리콜, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 중합체이다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 스페이서(예를 들어, 스페이서-18 (헥사에틸렌글리콜)) 모이어티를 포함한다.
스페이서의 나노입자에 대한 결합의 결과로서, 폴리뉴클레오타이드는 나노입자의 표면으로부터 간격을 두게 되며, 이는 이의 표적과의 회합을 위해 더 접근가능하다. 다양한 구현예에서, 스페이서의 길이는 적어도 약 5개의 뉴클레오타이드, 5-10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 10-30개의 뉴클레오타이드, 또는 심지어 30개 초과의 뉴클레오타이드이거나 이와 동등하다. 상기 스페이서는 나노입자 또는 표적에 결합되는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 방해하지 않는 임의의 서열을 가질 수 있다. 특정 측면에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 스페이서의 염기는 모두 아데닐산, 모두 티미딜산, 모두 시티딜산, 모두 구아닐산, 모두 우리딜산, 또는 모두 일부 다른 변형된 염기이다.
나노입자 표면 밀도 . 안정된 나노입자를 제조하기에 적절한 표면 밀도와 나노입자 및 폴리뉴클레오타이드의 목적한 조합을 얻기 위해 필요한 조건은 실증적으로 결정할 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 2 pmoles/cm2의 표면 밀도는 안정된 나노입자-올리고뉴클레오타이드 조성물을 제공하기에 적절할 것이다. 일부 측면에서, 표면 밀도는 적어도 15 pmoles/cm2이다. 폴리뉴클레오타이드가 적어도 2 pmol/cm2, 적어도 3 pmol/cm2, 적어도 4 pmol/cm2, 적어도 5 pmol/cm2, 적어도 6 pmol/cm2, 적어도 7 pmol/cm2, 적어도 8 pmol/cm2, 적어도 9 pmol/cm2, 적어도 10 pmol/cm2, 적어도 약 15 pmol/cm2, 적어도 약 19 pmol/cm2, 적어도 약 20 pmol/cm2, 적어도 약 25 pmol/cm2, 적어도 약 30 pmol/cm2, 적어도 약 35 pmol/cm2, 적어도 약 40 pmol/cm2, 적어도 약 45 pmol/cm2, 적어도 약 50 pmol/cm2, 적어도 약 55 pmol/cm2, 적어도 약 60 pmol/cm2, 적어도 약 65 pmol/cm2, 적어도 약 70 pmol/cm2, 적어도 약 75 pmol/cm2, 적어도 약 80 pmol/cm2, 적어도 약 85 pmol/cm2, 적어도 약 90 pmol/cm2, 적어도 약 95 pmol/cm2, 적어도 약 100 pmol/cm2, 적어도 약 125 pmol/cm2, 적어도 약 150 pmol/cm2, 적어도 약 175 pmol/cm2, 적어도 약 200 pmol/cm2, 적어도 약 250 pmol/cm2, 적어도 약 300 pmol/cm2, 적어도 약 350 pmol/cm2, 적어도 약 400 pmol/cm2, 적어도 약 450 pmol/cm2, 적어도 약 500 pmol/cm2, 적어도 약 550 pmol/cm2, 적어도 약 600 pmol/cm2, 적어도 약 650 pmol/cm2, 적어도 약 700 pmol/cm2, 적어도 약 750 pmol/cm2, 적어도 약 800 pmol/cm2, 적어도 약 850 pmol/cm2, 적어도 약 900 pmol/cm2, 적어도 약 950 pmol/cm2, 적어도 약 1000 pmol/cm2 또는 그 이상의 표면 밀도에서 나노입자에 결합되는 방법이 또한 제공된다.
대안적으로, SNA 표면 상의 폴리뉴클레오타이드의 밀도는 SNA 표면 상의 폴리뉴클레오타이드의 수에 의해 측정된다. 본 개시의 SNA 표면 상의 폴리뉴클레오타이드의 표면 밀도와 관련하여, 본원에 기술된 바와 같은 SNA는 이의 표면 상에 약 1개 내지 약 25,000개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, SNA는 이의 표면 상에 약 10개 내지 약 200개, 또는 약 10개 내지 약 190개, 또는 약 10개 내지 약 180개, 또는 약 10개 내지 약 170개, 또는 약 10개 내지 약 160개, 또는 약 10개 내지 약 150개, 또는 약 10개 내지 약 140개, 또는 약 10개 내지 약 130개, 또는 약 10개 내지 약 120개, 또는 약 10개 내지 약 110개, 또는 약 10개 내지 약 100개, 또는 10개 내지 약 90개, 또는 약 10개 내지 약 80개, 또는 약 10개 내지 약 70개, 또는 약 10개 내지 약 60개, 또는 약 10개 내지 약 50개, 또는 약 10개 내지 약 40개, 또는 약 10개 내지 약 30개, 또는 약 10개 내지 약 20개의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, SNA는 이의 표면 상에 약 80개 내지 약 140개의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 추가 구현예에서, SNA는 이의 표면 상에 적어도 약 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 또는 200개의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 추가 구현예에서, SNA는 이의 표면 상에 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 또는 200개의 폴리뉴클레오타이드로 구성된다. 일부 구현예에서, 리포좀성 SNA (이는 다양한 구현예에서, 직경이 약 150 나노미터 또는 그 이하이거나, 직경이 약 100 나노미터 또는 그 이하이거나, 직경이 약 80 나노미터 또는 그 이하이거나, 직경이 약 70 나노미터 또는 그 이하일 수 있음)는 이의 표면 상에 약 10개 내지 약 1,000개의 올리고뉴클레오타이드 또는 약 10개 내지 약 40개의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 추가 구현예에서, PLGA SNA (이는 다양한 구현예에서, 직경이 약 100 나노미터 미만 또는 직경이 약 80 나노미터 미만일 수 있음)는 이의 표면 상에 약 10개 내지 약 800개의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
구형 핵산 (SNA)을 제조하는 방법
본 개시에 따르면, 용해물이 처리되고, 패키징되고, 면역 세포에 제시되는 방식이 용해물-기반 면역치료제의 치료 가능성의 중요한 결정인자이다. 따라서, 본 개시는 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 갖는 나노입자를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체(TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 상기 나노입자 내에 캡슐화된다. 상기 방법은 종양 세포를 산화제에 노출시켜 산화된 종양 세포를 생성하고; 이후 산화된 종양 세포로부터 용해물을 분리하고; 이후 지질 필름을 용해물과 접촉시켜 내부에 캡슐화된 용해물을 포함하는 소형 단층 소포체 (SUV)를 생성하고; 이후 SUV에 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 리포좀성 나노입자를 제조하는 것을 포함한다. 본 개시는 또한 전술한 방법에 의해 생성된 나노입자를 구체적으로 고려한다.
종양 세포는 용해물 분리, 제조 및 나노입자 코어 내 캡슐화 전에 산화된다. 종양 세포는 산화제에 대한 노출을 통해 산화된다. 종양 세포는 25-37℃에서 약 30분 내지 약 2시간, 또는 약 30분 내지 약 1시간 동안 산화제에 노출된다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 37℃에서 약 1시간 동안 산화제에 노출된다. 산화제는 다양한 구현예에서, 차아염소산 (HOCl), 과산화수소, 차아염소산나트륨, 아염소산나트륨, 질산, 황, 또는 이들의 조합이다. 다양한 구현예에서, 종양 세포는 약 10 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 90 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 80 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 70 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 60 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 40 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 30 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 20 μM의 산화제에 노출된다. 추가 구현예에서, 종양 세포는 약 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 산화제에 노출된다. 추가 구현예에서, 종양 세포는 적어도 약 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM의 산화제에 노출된다. 추가 구현예에서, 종양 세포는 약 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM 미만의 산화제에 노출된다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 37℃에서 약 1시간 동안 약 60 μM의 HOCl에 노출된다. 다양한 구현예에서, 종양 세포는 유방암 세포, 복막암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 식도암 세포, 안구암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포, 폐암 세포, 피부암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 위암 세포, 고환암 세포, 갑상선암 세포, 뇌암 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포이다.
종양 세포 용해물은 이후 산화된 종양 세포로부터 분리되고, 이는 지질 필름과 접촉되어 내부에 캡슐화된 용해물을 포함하는 소형 단층 소포체 (SUV)를 생성한다. 본원에 기술된 바와 같이, 산화된 종양 세포 용해물은 또한 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 나노입자, 폴리(아크릴레이트) 나노입자, 또는 폴리(메타크릴레이트) 나노입자 내에 캡슐화될 수 있다. 다양한 구현예에서, 나노입자 내에 캡슐화되는 종양 세포 용해물의 양은 약 5 μg 내지 약 150 μg 종양 세포 용해물이다. 추가 구현예에서, 나노입자 내에 캡슐화되는 종양 세포 용해물의 양은 약 5 μg 내지 약 140 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 130 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 120 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 110 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 100 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 90 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 80 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 70 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 60 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 50 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 40 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 30 μg 종양 세포 용해물 또는 약 5 μg 내지 약 20 μg 종양 세포 용해물, 또는 약 5 μg 내지 약 10 μg 종양 세포 용해물이다. 또 다른 추가 구현예에서, 나노입자 내에 캡슐화되는 종양 세포 용해물의 양은 약 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 또는 150 μg 종양 세포 용해물이다. 추가 구현예에서, 나노입자 내에 캡슐화되는 종양 세포 용해물의 양은 적어도 약 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 또는 150 μg 종양 세포 용해물이다. 일부 구현예에서, 나노입자 내에 캡슐화되는 종양 세포 용해물의 양은 약 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 또는 150 μg 미만의 종양 세포 용해물이다.
다음으로, 올리고뉴클레오타이드는 내부에 캡슐화된 종양 세포 용해물을 갖는 나노입자 (예를 들어, SUV)에 첨가된다. 다양한 구현예에서, 내부에 캡슐화된 종양 세포 용해물을 갖는 나노입자에 첨가되는 올리고뉴클레오타이드의 양은 약 0.5 nmol 내지 약 25 nmol이다. 추가 구현예에서, 내부에 캡슐화된 종양 세포 용해물을 갖는 나노입자에 첨가되는 올리고뉴클레오타이드의 양은 약 0.5 nmol 내지 약 20 nmol, 또는 약 0.5 nmol 내지 약 15 nmol, 또는 약 0.5 nmol 내지 약 10 nmol, 또는 약 1 nmol 내지 약 10 nmol, 또는 약 1 nmol 내지 약 8 nmol, 또는 약 1 nmol 내지 약 6 nmol이다. 또 다른 추가 구현예에서, 내부에 캡슐화된 종양 세포 용해물을 갖는 나노입자에 첨가되는 올리고뉴클레오타이드의 양은 약 0.5 nmol, 1 nmol, 1.5 nmol, 2 nmol, 2.5 nmol, 3 nmol, 3.5 nmol, 4 nmol, 4.5 nmol, 5 nmol, 6.5 nmol, 7 nmol, 7.5 nmol, 8 nmol, 8.5 nmol, 9 nmol, 9.5 nmol, 10 nmol, 11 nmol, 12 nmol, 13 nmol, 14 nmol, 15 nmol, 16 nmol, 17 nmol, 18 nmol, 19 nmol, 20 nmol, 21 nmol, 22 nmol, 23 nmol, 24 nmol, 또는 25 nmol이다. 추가 구현예에서, 내부에 캡슐화된 종양 세포 용해물을 갖는 나노입자에 첨가되는 올리고뉴클레오타이드의 양은 적어도 약 0.5 nmol, 1 nmol, 1.5 nmol, 2 nmol, 2.5 nmol, 3 nmol, 3.5 nmol, 4 nmol, 4.5 nmol, 5 nmol, 6.5 nmol, 7 nmol, 7.5 nmol, 8 nmol, 8.5 nmol, 9 nmol, 9.5 nmol, 10 nmol, 11 nmol, 12 nmol, 13 nmol, 14 nmol, 15 nmol, 16 nmol, 17 nmol, 18 nmol, 19 nmol, 20 nmol, 21 nmol, 22 nmol, 23 nmol, 24 nmol, 또는 25 nmol이다. 추가 구현예에서, 내부에 캡슐화된 종양 세포 용해물을 갖는 나노입자에 첨가되는 올리고뉴클레오타이드의 양은 약 0.5 nmol, 1 nmol, 1.5 nmol, 2 nmol, 2.5 nmol, 3 nmol, 3.5 nmol, 4 nmol, 4.5 nmol, 5 nmol, 6.5 nmol, 7 nmol, 7.5 nmol, 8 nmol, 8.5 nmol, 9 nmol, 9.5 nmol, 10 nmol, 11 nmol, 12 nmol, 13 nmol, 14 nmol, 15 nmol, 16 nmol, 17 nmol, 18 nmol, 19 nmol, 20 nmol, 21 nmol, 22 nmol, 23 nmol, 24 nmol, 또는 25 nmol 미만이다. 일부 구현예에서, 내부에 캡슐화된 종양 세포 용해물을 갖는 나노입자에 첨가되는 올리고뉴클레오타이드의 양은 5 nmol이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이다. 추가 구현예에서, TLR 작용제는 톨-유사 수용체 1 (TLR1) 작용제, 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 작용제, 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 작용제, 톨-유사 수용체 5 (TLR5) 작용제, 톨-유사 수용체 6 (TLR6) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 톨-유사 수용체 10 (TLR10) 작용제, 톨-유사 수용체 11 (TLR11) 작용제, 톨-유사 수용체 12 (TLR12) 작용제, 톨-유사 수용체 13 (TLR13) 작용제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, TLR 작용제는 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 또는 이들의 조합이다.
다양한 구현예에서, 전술한 방법은 약 0.5 nmol 내지 약 25 nmol: 약 5 μg 내지 약 150 μg인 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비를 포함하는 나노입자를 생성한다. 추가 구현예에서, 나노입자는 약 5 nmol 올리고뉴클레오타이드:20 μg 종양 세포 용해물인 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비를 포함한다.
본 개시는 또한 전술한 특징을 갖는 나노입자를 구체적으로 고려한다.
조성물
본 개시는 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 갖는 나노입자 (즉, 구형 핵산 (SNA))를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 항원성 조성물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 용어 "담체"는 본원에 기술된 바와 같은 나노입자가 포유동물 대상체에게 투여되는 비히클을 지칭한다. 용어 담체는 희석제, 부형제, 보조제 및 이들의 조합을 포괄한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 마틴 저서의 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1975 참조).
예시적인 "희석제"는 멸균수, 식염수, 및 완충액 (예를 들어, 포스페이트, 트리스, 보레이트, 숙시네이트, 또는 히스티딘)과 같은 멸균 액체를 포함한다. 예시적인 "부형제"는 백신 안정성을 향상시킬 수 있는 불활성 물질이며, 이에 제한되지는 않으나, 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 탄수화물 (예를 들어, 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 또는 셀룰로오스), 및 알코올 (예를 들어, 글리세롤, 소르비톨, 또는 자일리톨)을 포함한다.
보조제는 항원 제시 세포 (APC)에 관련된 항원을 표적화하는 백신 전달 시스템 (예를 들어, 에멀젼, 마이크로입자, 면역 자극 복합체 (ISCOMS), 또는 리포좀); 및 면역자극성 보조제를 포함한다.
면역 반응을 유도하는 방법
본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 산화된 종양 세포 용해물을 포함하는 하나 이상의 SNA를 포함하는 항원성 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 항원성 조성물은 면역원성 조성물이다.
본 개시의 방법에 의해 발생된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 중화 항체 반응, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체 세포-매개 식균작용 (ADCP), 보체 의존성 세포독성 (CDC), 및 CD4+, CD8+와 같은 T 세포-매개 반응을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 산화된 종양 세포 용해물을 포함하는 SNA에 의해 생성된 면역 반응은 본원에 기술된 바와 같은 암을 인식하고, 바람직하게는 개선하고/하거나 중화하는 면역 반응을 생성한다. 항원성 조성물의 투여 (면역화 또는 백신 접종) 후 항체 반응을 평가하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 T 세포-매개 반응 (예를 들어, 증식 반응 또는 사이토카인 반응과 같은 펩티드-특이적 반응)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 면역 반응은 B 세포 및 T 세포 반응 둘 다를 포함한다. 항원성 조성물은 다수의 적합한 방식, 예컨대 근육내 주사, 피하 주사, 피내 투여 및 경구 또는 비강내 투여와 같은 점막 투여로 투여될 수 있다. 추가적인 투여 방식은 정맥내, 복강내, 비강내 투여, 질내, 직장내 및 경구 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역화된 대상체에서의 상이한 투여 경로의 조합, 예를 들어 동시에 근육내 및 비강내 투여가 또한 본 개시에 의해 고려된다.
항원성 조성물은 임산부를 포함하여 어린이 및 성인 모두를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서 대상체는 1세 미만, 1-5세, 5-15세, 15-55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신을 수용하기 위한 바람직한 대상체는 노인 (예를 들어, >55세, >60세, 바람직하게는 >65세) 및 젊은이 (예를 들어, <6세, 1-5세, 바람직하게는 1세 미만)이다. 본 개시의 백신 또는 조성물을 수용하기 위한 추가적인 대상체는 나이브 (대 이전에 감염된) 대상체, 현재 감염된 대상체, 또는 면역저하된 대상체를 포함한다.
투여는 단일 용량 또는 다중 용량 일정을 수반할 수 있다. 다중 용량은 1차 면역화 일정 및/또는 추가(booster) 면역화 일정에서 사용될 수 있다. 다중 용량 일정에서 다양한 용량은 동일하거나 상이한 경로, 예를 들어 비경구 프라임 및 점막 부스트, 또는 점막 프라임 및 비경구 부스트에 의해 제공될 수 있다. 1회 이상의 용량 (전형적으로 2회 용량)의 투여는 면역학적으로 나이브 대상체 또는 저반응 집단의 대상체 (예를 들어, 당뇨병, 또는 만성 신장 질환이 있는 대상체 (예를 들어, 투석 환자))에서 특히 유용하다. 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주 간격으로 (예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 또는 약 16주) 투여될 것이다. 바람직하게는 다중 용량은 1, 2, 3, 4 또는 5개월 간격으로 투여된다. 본 개시의 항원 조성물은 다른 백신과 실질적으로 동시에 (예를 들어, 동일한 의료 상담 또는 의료 전문가 방문 동안) 환자에게 투여될 수 있다.
일반적으로, 항원성 조성물의 각 용량에서 산화된 종양 세포 용해물을 포함하는 SNA의 양은 대상체에서 유의미한 부작용 유발 없이, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 데 효과적인 양으로서 선택된다. 바람직하게는 유도된 면역 반응은 중화 항체 반응; 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 항체 세포-매개 식균작용 (ADCP); 보체 의존성 세포독성 (CDC); CD4+, CD8+와 같은 T 세포-매개 반응, 또는 보호 항체 반응을 포함한다. 이러한 맥락에서 보호는 반드시 대상체가 감염에 대해 완전히 보호되는 것을 필요로 하지는 않는다. 보호 반응은 대상체가 질병의 발병 증상으로부터 보호될 때 달성된다. 상기 기술된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 산화된 종양 세포 용해물을 포함하는 SNA에 의해 생성된 면역 반응은 본원에 기술된 바와 같은 암을 인식하고, 바람직하게는 개선하고/하거나 중화하는 면역 반응을 생성한다.
실시예
하기 실시예는 종양 세포 용해물을 함유하는 SNA가 공지된 TAA 없는 암, 예컨대 삼중 음성 유방암 (TNBC)의 치료를 위한 강력한 나노스케일 면역치료제를 개발하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
확인된 종양-관련 항원 (TAA) 없는 암, 예컨대 삼중 음성 유방암 (TNBC)은 여전히 도전적인 면역치료제 표적으로 남아있다. 본원에서, TNBC의 치료를 위한 면역치료제 리포좀성 구형 핵산 (SNA)의 합성 및 평가가 기술된다. SNA는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 (CpG-1826)를 보조제로서 포함하고 TNBC 세포주로부터 유래된 용해물을 항원으로서 캡슐화한다. 생성된 나노구조 (Lys-SNA)는 시험관내 및 생체내 모두에서 선형 올리고뉴클레오타이드를 갖는 용해물의 단순한 혼합물과 비교할 때 면역 세포에 대한 보조제 및 항원의 공동 전달을 향상시키고, TNBC의 Py230 및 Py8119 동위 동계 마우스 모델 모두에서 용해물 및 CpG-1826의 단순한 혼합물 (Lys-Mix)에 비해 종양 성장을 감소시킨다. 또한, 용해 및 SNA (OxLys-SNA)로의 통합 전에, 산화된 TNBC 세포는 이들의 비-산화된 대응물에 비해 수지상 세포의 활성화를 유의미하게 증가시킨다. EMT6 마우스 유방 암종 모델에서 생체내 종양 주위로 투여될 때, OxLys-SNA는 세포독성 CD8+ T 세포의 집단을 유의미하게 증가시키고, Lys-SNA 및 산화된 용해물과 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 단순한 혼합물과 비교할 때 골수 유래 억제 세포 (MDSC)의 집단을 동시에 감소시킨다. 중요하게는, OxLys-SNA로 처리된 동물은 다른 모든 처리군에 비해 유의미한 항종양 활성 및 연장된 생존율을 나타내고, 종양 재도전에 저항한다. 함께, 이러한 결과는 용해물이 처리되고 패키징되는 방식이 이들의 면역원성 및 치료 효능에 중대한 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 더욱이, 본 연구는 확인된 종양-관련 항원이 없는 암에 대한 강력한 새로운 종류의 면역치료제로서 산화된 종양 세포 용해물-로딩 SNA의 사용을 가리킨다.
모든 유방암-관련된 사망률 (52, 53)의 대부분을 차지하는, TNBC는 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체 둘 다의 기능적 발현이 결여되고 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 단백질의 과발현이 없는 고도로 이질적이고 공격적인 질병이다 (52-55). 역설적이게도, TNBC 1차 종양은 종종 초기에 화학요법에 잘 반응한다; 하지만, 재발 및 전이의 발생률이 높다. TNBC 재발의 초기 및 공격적인 특성은 무진행 및 3년 전체 생존율 대 다른 유방암 하위 유형의 비율이 유의미하게 감소된 것으로 예시되며 (53, 56, 57), 새롭고 효과적인 치료 옵션의 개발을 필요로 한다. TNBC 치료를 위한 치료제로서 SNA의 가능성을 탐구하기 위한 노력으로, TNBC 세포주로부터 유래된 용해물을 코어에 캡슐화하고, 표면 상에 CpG-1826이 존재하는 리포좀성 SNA (Lys-SNA, 도 1), 뿐만 아니라 용해 전에 차아염소산 (HOCl)으로 산화된 TNBC 세포로부터의 용해물을 함유하는 유사체 (OxLys-SNA)를 합성하였고, TNBC의 동계, 정위성 마우스 모델에서 이들의 면역조절 활성 및 항종양 특성을 평가하였다.
실시예 1
재료 및 방법
세포 용해물의 생성 및 특성화. EMT6 세포주는 ATCC로부터 수득하고, 10% 열-불활성화 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 최소 필수 배지 (MEM)에서 성장시켰다. Py230 및 Py8119는 F-12K 배지 (ATCC), 5% 소태아혈청, 0.1% MITO+ 혈청 증량제 (Corning), 2.5 μg/mL 암포테리신 B (Gibco) 및 50 μg/mL 젠타마이신 (Gibco)에서 성장시켰다. 모든 용해물은 계대 수 6 하에서 세포로부터 제조되었다. 용해물 제조를 위해, 세포를 트립신 처리하고, 세척하고, 수집하고, 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 106개 세포/mL로 재현탁한 후 액체 질소 및 37℃ 수조에서 5회의 동결-해동 주기를 실시하였다. 세포 파편(debris)을 10,000 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 제거한 후 상층액을 단백질 용해물로서 수집하였다. 총 단백질 농도는 단백질 표준으로서 알부민을 이용한 비신코닌산 (BCA) 검정을 사용하여 측정하였다 (Pierce, ThermoFisher Scientific). 단백질 함량은 100 V에서 1시간 동안 4-12% SDS-PAGE 전기영동을 사용하고 총 단백질 20 μg을 로딩하여 특성화하였다.
산화된 용해물을 제조하기 위해, EMT6 세포를 페트리 디쉬에서 컨플루언스(confluence)가 되도록 성장시켰다. 세포를 DPBS (3×)로 세척한 후 DPBS에서 60 μM 차아염소산 (HOCl)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수집하고 DPBS로 세척하여 임의의 미반응 HOCl을 제거하였다. 500 RCF에서 5분 동안 원심분리한 후, 세포를 1×107개 세포/mL의 밀도로 DPBS에 재현탁시켰다. 세포를 액체 질소 및 37℃ 수조를 사용하여 5회의 동결-해동 주기를 실시한 후, 10,000 RCF에서 10분 동안 원심분리하였다. 가용성 분획물을 산화된 용해물로서 수집하였다.
정제된 세포 용해물은 시험관내 및 생체내 흡수 실험을 위해 형광단-표지하였다. 오레곤 그린 488-NHS (Thermo Fisher) 및 플루오레세인-5-말레이미드 (Thermo Fisher) 염료 각각 1 mg을 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.5)에서 1 mg/mL 용해물과 함께 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 50 kDa 컷오프 원심분리 필터 (4000 g, 10분)를 사용하여 용해물을 10 mL의 PBS로 10회 세척하여 미반응 염료를 제거하였다. 형광단-표지된 용해물은 후속적으로 용해물-SNA를 제조하는 데 사용되었다.
DNA 합성. 콜레스테릴-변형된 CpG-1826 (5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (스페이서-18 (헥사에틸렌글리콜))2 Chol-3') (서열번호 2), 뿐만 아니라 콜레스테릴-Cy5-변형된 CpG-1826 (5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT -Cy5-(스페이서-18 (헥사에틸렌글리콜))2 Chol-3') (서열번호 3)을 활성화제로서 DCI 그리고 황화제로서 3-((디메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온을 사용하여, MerMade 12 합성기 (Bioautomation)를 사용한 자동화된 고체상 DNA 합성을 통해 포스포로티오에이트 (PS) 골격으로 합성하였다. 합성 후, DNA 가닥을 RT에서 30% 수산화암모늄으로 밤새 인큐베이션을 통해 고체 지지체로부터 절단하였다. 과량의 암모니아는 질소 하에서 증발을 통해 제거하고, 올리고뉴클레오타이드는 30분에 걸쳐 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA) 및 아세토니트릴 (10%에서 100% 아세토니트릴)의 구배를 사용하여, C4 또는 C18 컬럼 상에서 HPLC (Agilent)를 사용하여 정제하였다. 정제된 올리고뉴클레오타이드를 수집하고 동결건조시켰다. 분말화된 올리고뉴클레오타이드를 5 mL 아세트산에 재구성하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 에틸 아세테이트 (7 mL, 3×)로 추출하였다. 이후 정제되고, 탈보호된 DNA를 동결건조하고, 1 mL 탈이온수에 재현탁하고, MALDI-TOF 및 천연 겔 전기영동으로 분석하였다.
용해물-로딩된 SNA의 합성. 종양 세포 용해물 (산화되거나 산화되지 않음)은 박막 재수화 방법을 사용하여 DOPC 리포좀 내에 캡슐화되었다 (56). 용액을 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (단백질 농도에 대하여) 1 mg/mL로 조정하고, 이를 실온에서 1시간 동안 5 mg DOPC를 재수화하는 데 사용하였다. 재수화 기간 후, 37℃ 수조에서 액체 질소 및 초음파 처리를 사용하여, 5회의 동결-해동 주기를 통해 리포좀을 형성하였다. 이후, 상업적으로 이용가능한 포스포티딜콜린 (PC) 검정 (Sigma)에 의해 측정된 바와 같이, 리포좀을 지질의 최고 농도가 압출을 위한 지질 2 mg/mL 이하가 되도록 PBS로 희석하였다. 리포좀 크기는 200, 100, 80 및 50 nm의 기공 크기를 갖는 폴리카보네이트 필터 (T&T Scientific)를 사용하여 순차적 고압 압출을 통해 제어되었다. 리포좀을 각 필터 크기에 10회 통과시켰다. 최종 압출 후, 500 kDa의 기공 크기를 갖는 접선 유동 여과 (TFF) (스펙트럼)를 사용하여 임의의 비-캡슐화된 단백질을 제거하고, 샘플은 UV-vis 분광법 (Cary) 및 BCA 검정을 사용하여 280 nm에서 통과액의 흡수를 측정함으로써 모니터링된 바와 같이, 단백질이 통과액에서 검출되지 않을 때까지 PBS로 반복적으로 세척하였다. 리포좀 내에 캡슐화된 단백질의 양은 캡슐화된 단백질을 방출하기 위해 1% SDS로 리포좀의 파괴 후 BCA 검정을 사용하여 측정하였다. 인지질 농도는 상업적으로 이용가능한 PC 검정 키트를 사용하여 측정하였다.
SNA를 형성하기 위해, 콜레스테롤-말단 올리고뉴클레오타이드 (3')를 25℃에서 밤새 1.63 mM 지질의 리포좀 용액과 20 μM 올리고뉴클레오타이드를 혼합함으로써 리포좀의 외막에 삽입하였다. 올리고뉴클레오타이드 농도는 UV-vis로 260 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 이후, 생성된 SNA (OxLys-SNA 및 Lys-SNA 둘 다)를 원심분리 필터 유닛 (Milipore)을 사용하여 DNA에 의해 20 μM로 농축시켰으며, 이는 또한 임의의 비결합된 DNA를 제거하였다. 생성된 구조는 제타 전위 (Malvern Zetasizer), 겔 전기영동, 및 DLS로 분석하였다 (도 1).
용해물-로딩된 SNA의 특성화. 용해물-로딩된 SNA는 초저온-TEM, 겔 전기영동, DLS (도 1d), 및 제타 전위 (표 1)를 사용하여 특성화하였다. CryoEM 샘플을 레이시 탄소 필름이 있는 200-메시 구리 TEM 그리드 상에 4 μL를 떨어뜨리고, 5초 동안 블롯팅하여 FEI Vitrobot Mark III으로 준비한 후, 이미징 전에 초저온 홀더로 옮기고 액체 질소에 보관하기 전에 액체 에탄에 담궜다. cryoEM 이미징은 120kV 가속 전압 하에서 가탄(Gatan) 초저온-트랜스퍼 홀더가 있는 Hitachi HT7700 투과 전자 현미경을 사용하여 수행되었으며, 이미지는 30,000× 배율에서 가탄 이미징 카메라로 촬영하였다. DNA 로딩의 확인은 겔 전기영동, DLS 및 제타 전위 측정을 사용하여 수행되었다. 리포좀을 분리하기 위해 Cy5-표지, 콜레스테릴-변형된 올리고뉴클레오타이드, Cy5-표지된 Lys-SNA, 및 Triton-X와 인큐베이션된 Cy5-표지된 Lys-SNA (각각 50 pmol)를 얼음 상에서 1% 아가로스 겔에 로딩하고, 100 V에서 45분 동안 실행하였다 (도 1c).
표 1. Lys-SNA 및 OxLys-SNA의 제타 전위 분석.
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시험관내 BMDC에 의한 Lys-SNA 및 Lys-Mix의 흡수. 골수는 Balb/C 또는 C57BL/6 마우스의 대퇴골로부터 분리하고, 10% 열-불활성화 소태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및 20 ng/mL GM-CSF가 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 배지는 3일째에 보충되었고, 세포는 6일째에 수확되었다. SNA는 리포좀성 코어 내에 AlexaFluor488-표지된 용해물을 캡슐화하고, 상기 기술된 바와 동일한 방법을 사용하여 Cy5-표지된 DNA를 기능화함으로써 제조하였다. 형광단-표지된 SNA를 사용하여 BMDC에서 입자의 흡수를 측정하였다. BMDC를 웰당 500,000개 세포로 24-웰 플레이트에 첨가하고, 즉시 1 μM Cy5-표지된 DNA 및 AlexaFluor488-표지된 용해물, 또는 이중-표지된 SNA로 1시간 또는 24시간 동안 처리하였다. 세포를 세척하고, 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 유세포 분석 (BD LSRFortessa)을 위해 DPBS에 재현탁하거나, DAPI로 염색하고 63× 대물렌즈를 사용하여 공초점 현미경 (Zeiss LSM 800)으로 이미지화하였다.
생체내 림프성 세포에 의한 Lys-SNA 및 Lys-Mix의 흡수. 암컷 C57BL/6 마우스 (n=3, 8-10 주령)는 200 μL의 50 μM 형광단-표지된 Lys-SNA 또는 CpG-1826 및 용해물의 혼합물 (Lys-Mix)을 피하 (옆구리)로 주사하였다. 마우스를 주사 후 2시간 또는 24시간에 안락사시키고, 배액 림프절을 절제하였다. 림프절은 세포 스트레이너(strainer)를 사용하여 단일 세포로 분리하였다. 단일 세포 현탁액을 CD11c (PE-Cy7)에 대한 항체 뿐만 아니라 생/사(live/dead) 염색으로 염색하고, 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
Lys-SNA 항종양 효능. 암컷 마우스 (8-10 주령)는 우측 서혜부 유방 지방 패드에 피하 주사를 통해 1×106개의 TNBC 세포 (Py230 및 Py8119의 경우 C57Bl/6 마우스; EMT6의 경우 Balb/C 마우스)를 접종하였다. 6일, 10일 및 15일째에, 동물은 Lys-SNA, Lys-Mix, 또는 식염수를 종양 주위 주사 (50 μM, 200 μL)를 통해 투여하였다 (군 당 n=5). 종양 부피는 캘리퍼스로 길이 및 너비를 측정하고, 공식 V = L × W × W / 2를 적용하여 계산하였다. 연구는 식염수-처리된 동물의 종양 부담이 1200 mm3를 초과할 때 중단하고 동물을 희생시켰다.
OxLys-SNA 항종양 효능. 암컷 Balb/C 마우스 (8-10 주령)는 우측 서혜부 유방 지방 패드에 피하 주사를 통해 1×106개의 EMT6 세포를 접종하였다. 6일, 10일 및 15일째에, 동물은 OxLys-SNA, OxLys-Mix, 또는 식염수를 5 nmol DNA 및 20 μg 단백질의 용량으로 종양 주위를 통해 투여하였다 (군 당 n=9). 종양 부피는 캘리퍼스로 길이 및 너비를 측정하고, 공식 V = L × W × W / 2를 적용하여 계산하였다. 동물 생존율을 최대 100일까지 모니터링하고, 동물은 종양 부담이 1500 mm3를 초과할 때 희생시켰다. 접종 후 60일째에, 생존한 OxLys-SNA 동물의 하위 집합 (n=3)은 우측 서혜부 유방 지방 패드에 대략 106개의 EMT6 세포를 접종하여 재-챌린지하고, 추가 40일 동안 종양 성장의 증거를 모니터링하였다.
BMDC 활성화. BMDC를 상기 기술된 바와 같이 분리하고 배양하였다. 6일째에, BMDC를 수확하고, CpG-1826 (0.1nmol) 뿐만 아니라 산화된 용해물, 비-산화된 용해물, 또는 식염수 (1 μg 총 단백질)와 함께 배양 (100,000 BMDC/샘플)하여 BMDC 성숙을 유도하였다. 48시간 배양 후, 세포를 DPBS (3×)로 세척하고, 실온 (RT)에서 20분 동안 적절한 항체와 함께 인큐베이션하여, CD40, CD80, CD86 및 MHC-II에 대한 항체 뿐만 아니라 생/사 염색으로 염색하였다. 이후, 세포를 DPBS (3×)로 세척하고, 유세포 분석기를 사용하여 분석하기 전에 파라포름알데히드로 고정하였다. 면역 세포는 CD11b+/CD11c+ 이중-양성 세포에 대해 게이팅한 후, 적절한 마커 (CD40, CD80, CD86 또는 MHC-II)에 대해 게이팅하여 확인하였다.
EMT6 종양 부위에서 면역 세포 집단의 분석. 암컷 Balb/C 마우스 (8-10 주령)는 우측 서혜부 유방 지방 패드에 주사를 통해 대략 106개의 EMT6 세포를 접종하였다. 접종 후 6일 및 10일째에, 동물 (군 당 n=3)은 OxLys-SNA, OxLys-Mix, Lys-SNA, 또는 식염수를 종양 주위 주사를 통해 투여하였다. 11일째에, 동물을 희생시키고, 면역 세포 집단 분석을 위해 종양을 수확하였다. 종양을 DPBS로 세척하고, 세포 스트레이너를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분리하였다. 이후, 종양 세포를 2개의 샘플로 분할하였다. CD8+ 세포독성 T 세포를 확인하기 위해 CD45, CD3 및 CD8에 대한 항체로 하나의 샘플을 염색하였다. 두 번째 샘플은 CD45, CD11b 및 Gr1과 함께 인큐베이션하여 MDSC를 확인하였다. RT에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 DPBS (3×)로 세척하고, 유세포 분석기를 통해 분석 전에 파라포름알데히드로 고정하였다. CD8+ T 세포는 먼저 CD45+ 세포에 대해 게이팅한 후, CD3+/CD8+ 이중-양성 세포에 대해 게이팅하여 확인하였다 (도 2). MDSC는 먼저 CD45+ 세포에 대해 게이팅한 후, CDllb+/Gr1+ 이중-양성 세포에 대해 게이팅하여 확인하였다 (도 3).
결과
TNBC 세포주로부터의 용해물은 Lys-SNA에서 구획화될 수 있다. TNBC 용해물을 항원 공급원으로서 사용하는 타당성을 평가하기 위해, 3개의 뮤린 유방 암종 세포주를 활용하여 TNBC의 이질성을 재현하였다 (58, 59). 이를 위해, 진행됨에 따라 에스트로겐 및 프로게스테론의 발현을 상실하는 (63), 유방암의 마우스 유방 종양 바이러스-폴리오마 중간 종양 항원 (MMTV-PyMT) 마우스 모델로부터 유래된, 내강 세포주인 Py230 (60-62) 및 기저 세포주인 Py8119 (60-62)를 활용하였다. EMT6 세포주는 이 동계 계통이 최근에 TNBC에서 면역 반응을 연구하기 위한 귀중한 모델로서 인식되었기 때문에, 세 번째 모델로 선택하였다 (64, 65). 세포는 단층 세포 배양에서 컨플루언스(confluence)가 되도록 성장시켰으며, 분리하고 여러 번의 동결-해동 주기를 실시하여 세포 괴사 및 세포막 파열을 유도하고, 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 가용성 단백질 분획물은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)으로부터 제조된 대략 70-nm 리포좀에 캡슐화하였다. 비캡슐화된 용해물을 제거하기 위한 정제 후, 리포좀을 3'-콜레스테릴-변형된 CpG-1826 (도 4)과 인큐베이션하여 Lys-SNA (도 1a)를 생성하고, 이의 단일-층상 구형 형태는 초저온 투과 전자 현미경 (초저온-TEM, 도 1b)으로 검증하였다. 단백질 대 DNA의 평균 비율은 EMT6 Lys-SNA의 3개의 독립적인 배치(batch)에 대해 μmol DNA당 1.1 ± 0.65 mg 단백질로 결정되었다. 겔 전기영동을 통한 분석 (도 1c) 및 동적 광 산란 (DLS, 도 1d)에 의해 측정된 바와 같은, 유체역학적 직경의 증가는 DNA 기능화 및 SNA 생성과 일치한다.
Lys-SNA는 시험관내 및 생체내에서 DC에 대한 용해물 및 CpG DNA의 공동 전달을 증가시킨다. 동일한 APC에 대한 항원 및 보조제의 공동 전달은 최대 항원 처리 및 제시, 뿐만 아니라 가장 강력한 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 데 중요하다 (66). 따라서, APC에 대한 용해물 및 DNA의 공동 전달을 시험관내 및 생체내에서 조사하였다. 이를 위해, 형광단-표지된 용해물 (플루오레세인 및 오레곤 그린 488) 및 CpG-1826 (Cy5)을 함유하는 Lys-SNA를 합성하였다. 정제된 용해물을 오레곤 그린 488-숙신이미딜 에스테르 (OR488-NHS) 염료 및 플루오레세인-5-말레이미드 (FITC-말레이미드) 염료와 함께 인큐베이션하여 대량 단백질 용액에서 유리 아민 및 티올을 모두 표지하였다. 임의의 미반응 염료의 제거 후, FITC/OR488-표지된 용해물 및 Cy5-변형된 DNA를 사용하여 이중 형광단-표지된 Lys-SNA를 생성하였다. 골수-유래 수지상 세포 (BMDC)는 C57Bl/6 마우스로부터 분리하였고, Lys-SNA와 동일한 단백질 및 DNA 농도에서 형광단-표지된 Lys-SNA 또는 형광단-표지된 용해물 및 CpG-1826의 혼합물 (도 5)과 함께 인큐베이션하였다. 설정된 시점에서, 세포를 수집하고, 공초점 현미경 (도 5a)과 유세포 분석기 (도 5b)로 분석하여 FITC/OR488 및 Cy5 모두에 대해 양성인 세포의 수를 결정하였다. 모든 시점에서, Lys-SNA는 CpG-1826 (Lys-Mix)과 용해물의 단순한 혼합물보다 시험관내 면역 세포에 더 높은 공동 전달을 나타내었으며, 2시간 및 24시간 인큐베이션 후 공동 전달에서 각각 3배 및 2.5배 향상을 나타내었다. 생체내 항원 및 보조제의 공동 전달을 평가하기 위해, C57Bl/6 마우스는 형광단-표지된 용해물 및 CpG-1826을 함유하는 Lys-SNA 또는 Lys-Mix를 피하로 투여하였다 (군 당 n=3). 주사 후 2시간 및 24시간째에, 동물을 희생시키고, 서혜부 림프절을 분리하고 단일-세포 현탁액으로 분리한 후, 유세포 분석기로 분석하였다 (도 5c). 시험관내 데이터와 일치하여, 생체내 CD11c+ 면역 세포에 대한 공동 전달은 용해물 및 보조제 DNA가 주사 후 2시간째에 Lys-SNA로 제형화될 때 4배 향상되었으며, 24시간째에도 여전히 2.3배 이상의 향상이 관찰되었다.
Lys-SNA는 다중 TNBC 모델에서 항종양 활성을 나타낸다. 생체내 Lys-SNA의 항종양 활성을 평가하기 위해, TNBC의 정위성 동계 모델은 좌측 서혜부 유방 지방 패드에 대략 106개의 TNBC 세포 (Py230, Py8119 또는 EMT6)를 마우스에 접종함으로써 확립되었다. 접종 후 6일, 10일 및 15일째에, 동물은 10 nmol CpG-1826 및 20 μg 용해물의 용량으로 Lys-SNA, Lys-Mix 또는 음성 대조군으로서 식염수를 종양 주위에 투여하였다. Py230 및 Py8119 모델에서, Lys-SNA를 투여한 동물은 연구 30일째에 Lys-Mix를 투여한 동물에 비해 종양 부피가 각각 42% 및 53% 감소한 것으로 나타났으며 (도 6a-b), SNA의 코어 내로 용해물을 패키징하면 항종양 효능을 증가시킴을 시사하였다. EMT6 모델에서, CpG-1826과 함께 용해물의 투여는 식염수에 비해 종양 성장을 지연시켰고, 이는 25일째에 종양 성장의 73% 감소를 나타내었으며; 그러나, Lys-SNA와 Lys-Mix를 투여한 동물 간에 종양 성장의 유의미한 차이는 관찰되지 않았다 (도 6c). 종양 용해물을 항원 공급원으로서 사용한 이전 보고서에 기초하여 (22-24), EMT6 모델에서 생성된 용해물은 면역원성이 낮고, 따라서 최적이 아닌 T 세포 프라이밍 및 후속 항종양 활성을 유도하는 것으로 가정되었다. 따라서, 산화된 종양 세포로부터 유래된 용해물의 사용이 본 모델에서 조사되었다.
용해 전에 종양 세포를 산화시키는 것은 관찰된 면역원성을 증가시킨다. 산화가 종양 용해물의 면역원성을 증가시킨다고 보고되었기 때문에, 산화된 종양 세포로부터 유래된 용해물이 SNA 내로 혼입 후 강력한 항원 공급원으로서 활용될 수 있는지 여부를 결정하고자 하였다. 완전한 세포 사멸을 보장하기 위해 1시간 동안 60 μM 차아염소산 (HOCl)에서 EMT6 세포를 인큐베이션하여 산화된 종양 세포 용해물을 생성하였다 (67). 이후, 세포를 여러 번의 동결-해동 주기를 실시하고 원심분리하여 세포 파편을 제거함으로써 산화된 용해물을 제조하였다. 산화된 종양 세포로부터 수집된 단백질 용해물 ("산화된 용해물")의 총량은 비-산화된 종양 세포로부터 수집된 단백질 용해물 ("비-산화된 용해물")의 총량과 유사하였으며; 그러나, 산화된 용해물의 대량 단백질 집단은 산화된 샘플에 나타나는 더 큰 단백질 밴드를 갖는, 비-산화된 용해물의 집단과는 상이하였다 (도 7).
용해물 생성 전에 산화가 분리된 용해물의 면역원성을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해, BMDC는 CpG-1826 (0.1 nmol)과 동등한 단백질 농도 (1 μg 총 단백질)에서 비-산화된 용해물 또는 산화된 용해물과 함께 인큐베이션하였다. 성숙 마커 CD40, CD80 및 CD86의 발현은 비-산화된 용해물 단독 처리에 비해 산화된 용해물과 인큐베이션된 BMDC (도 8a-c)에서 유의미하게 상승하였으며, 비-산화된 용해물에 비해 CD40, CD80 및 CD86 마커 발현이 각각 75%, 20% 및 34% 증가하였으며, 뿐만 아니라 CpG-1826 단독에 비해 160%, 47% 및 98% 증가하였다. 또한, MHC-II의 발현은 CpG-1826 단독으로 인큐베이션된 것과 비교하여 산화된 용해물과 인큐베이션된 BMDC에서 47%까지 상승하였다 (도 8d).
OxLys-SNA는 생체내 종양 성장을 유의미하게 억제하고 생존율을 연장한다. 암 면역치료제로서 OxLys-SNA의 기능을 평가하기 위해, TNBC의 EMT6 모델에서 OxLys-SNA의 생체내 항종양 활성을 Lys-SNA 및 산화된 용해물과 CpG-1826 (OxLys-Mix)의 혼합물과 비교하였다. Balb/C 마우스는 좌측 서혜부 유방 지방 패드에 대략 106개의 종양 세포를 접종하고, 접종 후 6일째에, 5 nmol DNA 및 20 μg 단백질의 용량으로 OxLys-SNA, Lys-SNA, OxLys-Mix, (군 당 n=9)의 종양 주위 피하 주사를 통해 치료를 개시하였다. 식염수-처리된 동물을 음성 대조군으로 사용하였다. 주사는 10일 및 15일째에 반복하였다. 종양 질량 및 동물 생존율은 접종 후 100일 동안 모니터링하였다. OxLys-SNA를 투여한 동물은 다른 모든 처리군과 비교하여 처리에 현저하게 잘 반응하였으며 (도 9a), OxLys-SNA 처리된 동물 9마리 중 7마리가 20일째에 완전한 종양 관해를 경험하였다 (도 10a). 또한, OxLys-SNA를 투여했을 때 동물 생존율은 유의미하게 연장되었으며 (도 9b), OxLys-SNA 처리된 동물 9마리 중 6마리가 접종 후 100일 이상 생존하였다. 실제로, 첫 번째 OxLys-SNA 처리된 동물은 종양 부담 (1500 mm3을 초과하는 종양 부피)에 굴복하여 모든 식염수-처리된 동물보다 더 오래 생존한다 (도 10b). 기억 면역 반응을 부여하는 OxLys-SNA의 능력을 평가하기 위해, OxLys-SNA를 투여한 동물의 작은 코호트(cohort)는 초기 종양 이식 후 60일째에 서혜부 유방 지방 패드에 대략 106개의 EMT6 세포를 이식하여 재-챌린지하였다 (도 9c). 모든 동물 (n=3)은 EMT6 세포로 재-챌린지한 후 종양이 없는 상태로 유지되었으며, 이는 OxLys-SNA를 사용한 백신 접종이 기존 종양을 근절할 뿐만 아니라 새로운 종양이 형성되는 것을 방지함을 나타낸다.
OxLys-SNA는 종양 미세환경 내에서 면역 세포 집단을 변경한다. 종양 부위의 면역 세포 집단에 대한 OxLys-SNA 투여의 효과를 결정하기 위해, Balb/c 마우스의 좌측 서혜부 유방 지방 패드에 EMT6 세포를 접종하였다. 접종 후 6일 및 10일째에, 동물은 OxLys-SNA, Lys-SNA, OxLys-Mix 또는 식염수를 종양 주위 피하 주사를 통해 투여하였다 (군 당 n=3). 11일째에, 동물을 희생시켰다. 종양을 단일 세포 현탁액으로 분리하고, 2개의 분획물로 분할하였다. 하나의 세포 분획물을 CD45, CD3 및 CD8에 대한 항체와 함께 인큐베이션하여 종양 미세환경에 존재하는 CD8+ (세포독성) T 세포를 확인하였다. 두 번째 세포 분획물을 CD45, CD11b 및 Gr1과 함께 인큐베이션하여 종양 미세환경에 존재하는 골수 유래 억제 세포 (MDSC)를 확인하였다. 항체 인큐베이션 후, 세포를 고정하고 유세포 분석기를 통해 분석하였다. 흥미롭게도, 종양 부위에서 CD8+ T 세포의 집단은 다른 모든 처리군에 비해 OxLys-SNA를 투여한 동물에서 유의미하게 상승하였으며(도 9d), 식염수-처리된 대조군에 비해 2.3배 증가를 나타내었다. 동시에, OxLys-SNA를 투여한 동물에서 MDSC의 집단 (도 9e)은 식염수-처리된 대조군에 비해 2.5배 감소하였다.
논의
종양 세포 용해물을 리포좀성 SNA의 코어 내로 캡슐화하는 것은 시험관내 및 생체내 둘 다에서, 간단한 혼합물에 비해 면역 세포에 대한 용해물 및 보조제 DNA의 공동 전달을 증가시킨다. 이는 보조제 및 항원 둘 다 동일한 표적 세포에 전달될 때 최대 면역 반응이 달성되기 때문에, 면역치료제 설계에서 구조적 배열의 중요성을 강조한다 (66). 실제로, SNA 내로 용해물 및 CpG-1826의 제형화는 선형 CpG-1826 및 용해물을 함유하는 기본적인 리포좀의 단순한 혼합물과 비교하여, 주사 후 2시간째에 생체내 배액 림프절에서 동일한 CD11c+ 세포에 대한 두 면역조절 성분의 더 높은 공동 전달을 유도한다. 중요하게는, Cy5-표지된 DNA 및 형광단-표지된 용해물 둘 다에 대해 양성으로 염색된 CD11c+ 세포의 퍼센트는 Lys-SNA를 사용하여 생체내 전달 후 최대 24시간까지 유지되는 반면, 이중 양성 세포의 퍼센티지는 Lys-SNA 수준까지는 아니나, 단순 혼합물로 처리시 증가하였다.
또한, 세포 사멸을 유도하기 위해 HOCl로 산화 스트레스를 받은 세포로부터 용해물을 생성하면 산화 스트레스를 받지 않은 세포로부터 분리된 것보다 더 높은 분자량의 단백질 집단이 생성된다. 이 발견은 용해물 생성 전에 세포 산화가 사용가능한 항원 풀을 변화시킴을 확인하며, 이는 DC 백신에서 산화된 용해물의 사용에 대한 발표된 연구와 일치한다 (20, 68). 시험관내 BMDC와 함께 인큐베이션될 때, 산화된 용해물은 비-산화된 용해물 및 CpG-1826 둘 다에 비해 DC 성숙을 향상시킨다. 이 발견은 산화를 통해 세포 사멸을 유도하면 DC 성숙이 주로 보조제를 사용한 활성화에 의해 지시되기 때문에, 상승된 보조제 거동 뿐만 아니라 항원 거동을 갖는 용해물 집단을 유도한다는 것을 시사하였다 (69).
TNBC의 EMT6 모델에서, OxLys-SNA는 유의미한 항종양 활성을 나타내며, 9마리 중 6마리의 동물이 20일까지 완전한 종양 관해를 경험하였다. 흥미롭게도, OxLys-SNA가 투여된 첫 번째 동물은 마지막 식염수-처리된 동물 (접종 후 27일) 5일 후까지 종양 부담 (접종 후 32일)에 굴복하지 않는다. 따라서, OxLys-SNA는 Lys-SNA 및 OxLys-Mix 둘 다 보다 우수한 성능을 갖는, 강력한 면역치료제로서 작용한다. 흥미롭게도, OxLys-SNA를 받은 동물은 접종 후 60일째에 EMT6 세포를 사용한 재-챌린지에 저항하였으며, 이는 이 치료 요법이 보호 면역을 제공할 가능성을 가짐을 나타낸다. 더욱이, OxLys-SNA는 다른 모든 처리군에 비해, 세포독성 CD8+ T 세포의 집단을 유의미하게 증가시키고 동시에 TME에서 MDSC의 집단을 감소시킨다. 유방 종양의 미세환경에서 높은 수준의 세포독성 T 세포는 긍정적인 항종양 효과와 상관관계가 있는 것으로 나타난 반면 (70, 71), 높은 수준의 MDSC는 면역 회피를 촉진한다 (72). 따라서, 이 발견은 OxLys-SNA의 관찰된 항종양 효능을 담당하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다.
이 연구는 새로운 나노치료제 내에 산화된 용해물의 형태로 항원의 구획화에 기초한 새로운 종류의 강력한 백신을 기술하기 때문에 중요하다. 3개의 TNBC 종양 모델에서, 이러한 구조는 용해물 및 보조제 및 DNA의 공동 전달, 항종양 효능, 연장된 동물 생존율 및 TME 내 면역 세포 집단의 변경과 관련하여 매우 유망한 활성을 나타내었다. 종합하면, 이러한 결과는 종양 세포 용해물이 생성되는 방법, 뿐만 아니라 보조제 및 항원(들)이 패키징되고 면역계에 전달되는 방식이 결과적인 항종양 효능에 중대한 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 따라서, 이러한 결과는 TNBC 및 기타 암에 대한 개인 맞춤형 면역 요법의 개발에 중요한 의미를 갖는다.
결론
삼중 음성 유방암의 마우스 모델에서, 보조제 DNA로 구성된 리포좀성 구형 핵산 (SNA)의 코어 내에서 이들의 구획화와 결합되는, 용해물 생성 전에 종양 세포의 산화는 종양 성장을 유의미하게 억제하고, 생존을 극적으로 연장시키는 강력한 면역치료제를 생성하며, 종양 미세환경 내에서 종양파괴성 면역 세포 집단을 촉진한다는 것이 본원에 제시된다. 구체적으로, 본 연구는 생체분포, 수지상 세포 활성화 및 치료 효능이 제어될 수 있도록 보조제 및 항원을 적절하게 패키징하고 제시하는 것의 중요성을 입증하였다.
실시예 2
본 실시예는 TNBC의 Py8119 모델에서 리포좀성 SNA의 항종양 활성을 테스트하도록 설계된 추가 실험의 결과를 기술한다. 보다 구체적으로, 본 실험은 DPPC를 포함하고 종양 용해물을 함유하는 리포좀성 SNA와 DOPC를 포함하고 종양 용해물을 함유하는 리포좀성 SNA ("L-SNA")의 능력을 테스트하도록 설계되었다.
재료 및 방법
Py8119 세포로부터 용해물의 생성. Py8119 세포를 ATCC로부터 수득하고, 5% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 F-12K 배지에서 성장시켰다. 용해물을 준비하기 위해, 세포를 트립신을 사용하여 배양 플레이트로부터 분리하고, 세척하고, 수집하고, 둘베코의 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 1×106개 세포/mL로 재현탁하였다. 현탁액을 이후 액체 질소 및 37℃ 수조에서 침지를 번갈아가며, 4회의 동결-해동 주기를 실시하였다. 세포 파편을 10,000 RCF에서 10분 동안 원심분리를 통해 제거하고, 상층액을 용해물로서 수집하였다. 총 단백질 농도는 단백질 표준으로서 알부민을 이용한, 브래드포드(Bradford) 검정을 사용하여 측정하였다 (Pierce, ThermoFisher Scientific). 산화된 용해물을 준비하기 위해, Py8119 세포를 단층 세포 배양에서 컨플루언스(confluence)가 되도록 성장시켰다. 세포를 DPBS로 3회 세척한 후, DPBS에서 60 μM 차아염소산 (HOCl)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 분리된 세포를 수집하고, DPBS로 세척하여 임의의 미반응 HOCl을 제거하고, 500 RCF에서 5분 동안 원심분리하고, 1×107개 세포/mL의 밀도로 DPBS에 재현탁시켰다. 세포를 4회의 동결-해동 주기를 실시하고, 상기 기술된 바와 같이 원심분리하였다. 가용성 분획물을 산화된 용해물로서 수집하고, 단백질 농도는 브래드포드 검정을 사용하여 분석하였다.
용해물-로딩된 L-SNA의 합성. 용해물은 박막 재수화 방법을 사용하여 리포좀으로 캡슐화되었다. 간략하게, 용해물 (정상과 산화 둘 다)을 단백질 농도에 대해 1.0 mg/mL로 DPBS에 현탁시키고, 1 mL의 각 용액을 10 mg의 DOPC 또는 10 mg의 DPPC를 함유하는 바이알에 첨가하였다. 리포좀은 말번 제타사이저(Malvern Zetasizer)를 사용하여 DLS에 의한 유체역학적 직경이 100 nm (표 2) 미만이 될 때까지, 37℃ 수조에서 액체 질소 및 초음파 처리를 사용하여, 여러 번의 동결-해동/초음파 주기를 통해 형성하였다. 100 kDa의 기공 크기를 갖는 접선 유동 여과 (TFF) (스펙트럼)를 사용하여 리포좀 용액으로부터 임의의 비캡슐화된 용해물을 제거하였다. 리포좀 내에 캡슐화된 단백질은 1% 소듐 도데실 설페이트를 사용하여 리포좀 파괴 후, 브래드포드 검정을 사용하여 정량화하였다. SNA를 형성하기 위해, 콜레스테롤-말단 올리고뉴클레오타이드 (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT(스페이서-18 (헥사에틸렌글리콜))2콜레스테롤-3' (서열번호 2))를 T > TC에서 밤새 용해물-로딩된 리포좀 용액과 20 μM 올리고뉴클레오타이드를 혼합함으로써 리포좀의 외막에 삽입하였다. 올리고뉴클레오타이드 농도는 UV-vis 분광법 (Cary)으로 260 nm에서 흡광도를 사용하여 결정하였다. 이후, 생성된 SNA를 3 KD 분자량 컷오프를 갖는 원심분리 필터 유닛 (Milipore)을 사용하여 DNA에 의해 20 μM로 농축시켰으며, 이는 또한 임의의 비결합된 DNA를 제거하고, DLS로 분석하여 성공적인 DNA 기능화를 확인하였다 (표 2).
표 2.
Figure pct00014
Py8119 모델에서 항종양 효능. 암컷 마우스 (Balb/C)는 우측 서혜부 유방 지방 패드에 피하 주사를 통해 1×106개의 Py8119 세포를 접종하였다. 접종 후 6일, 10일 및 15일째에, 동물은 DOPC-SNA, DPPC-SNA, DOPC-Lys-SNA, DPPC-Lys-SNA, DOPC-OxLys-SNA, DPPC-OxLys-SNA, 또는 식염수를 종양 주위 피하 주사 (100 μL에서 5 nmol DNA)를 통해 투여하였다 (군 당 n=4). 종양 부피는 캘리퍼스로 길이 및 너비를 측정하고, 공식 V = L/2 × W × W를 적용하여 계산하였다. 상대적 종양 부피는 공식 Vrel = V / V0을 사용하여 계산하였으며, 여기서 V = 측정 당일의 부피 및 V0 = 첫 번째 주사 당일의 종양 부피이다. 본 연구는 미처리 동물에서 종양 궤양으로 인해 24일째에 중단되었다.
결과
도 11a는 DPPC-SNA 및 DOPC-SNA가 "보조제 단독" 면역치료제로서 투여된 실험의 결과를 나타낸다. TNBC에 대해 TAA가 확인되지 않았기 때문에, Py8119 세포로부터의 용해물을 생성하고, 이후 항원 공급원으로서 활용하였다. 이러한 용해물은 DOPC (DOPC-Lys-SNA) 또는 DPPC (DPPC-Lys-SNA)로 구성된 L-SNA 내로 캡슐화되었다. 두 작제물의 항종양 효능은 5 nmol의 CpG-1826 및 10 μg의 용해물의 용량으로 6일, 10일 및 15일째에 L-SNA 투여 후 생체내에서 비교되었다. 결과는 식염수를 투여한 동물과 비교하여 DPPC-Lys-SNA 투여 시 종양 성장이 대략 60% 감소한 것으로 나타난 반면, DOPC-Lys-SNA를 투여한 동물에서는 종양 성장에 차이가 없었으며 (도 11b), 다시 L-SNA 안정성에 대한 항종양 효능의 의존성을 나타낸다.
실시예 1에 나타낸 바와 같이, 산화된 용해물을 L-SNA의 코어 내로 혼입시키면 TNBC의 마우스 모델에서 항종양 효능의 극적인 증가를 유도한다. 따라서, 종양 세포 산화 및 L-SNA 안정성의 효과가 부가적인지 여부를 결정하기 위해, 산화된 Py8119 세포로부터의 용해물을 함유하는 L-SNA를 DOPC (DOPC-OxLys-SNA) 및 DPPC (DPPC-OxLys-SNA)를 사용하여 합성하였다. DPPC-OxLys-SNA는 본 연구 기간에 걸쳐 종양 성장을 유의미하게 억제한 반면 (도 11c), DOPC-OxLys-SNA는 이러한 용량의 DNA 및 용해물에서 덜 효과적이었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 용해물 제조 방법 및 L-SNA 안정성의 효과가 상승적임을 나타내며, 이는 모든 DPPC-기반 L-SNA에 대한 연구 종점을 비교할 때 더 분명해진 경향이다(도 11d). L-SNA (DPPC-Lys-SNA) 내로 용해물의 포함이 효과적인 것으로 나타났으며, 산화된 세포로부터의 용해물을 항원 공급원 (DPPC-OxLys-SNA)으로서 사용 시 최대 항종양 효능이 관찰되었으며, 이는 이러한 작제물에서 항원 처리 방법 및 리포좀 안정성 둘 다의 중요성을 나타낸다.
결론
Py8119 마우스 모델에서, DPPC로 합성된 L-SNA에 캡슐화된 용해물은 종양 성장을 지연시키는 데 이들의 DOPC 유사체보다 더 효과적이었으며; 산화된 Py8119 세포로부터의 용해물을 L-SNA 스캐폴드 내로 혼입 시 더 뚜렷해지는 경향이며, 이는 용해물 혼입 방법 및 L-SNA 안정성 간의 시너지 효과를 나타낸다. 그러나, 실시예 2에서 사용된 DOPC SNA는 실시예 1 (실시예 1의 경우 EMT6, 실시예 2의 경우 4T1 및 Py8119)과 상이한 TNBC 모델에 투여되었음을 유의한다. 또한, 실시예 2에서 투여되는 보조제 DNA의 용량은 실시예 1에서 사용된 것의 50%였다.
참고문헌
1. S. A. Ali, V. Shi, I. Maric, M. Wang, D. F. Stroncek 등, T Cells Expressing an Anti-B-Cell Maturation Antigen Chimeric Antigen Receptor Cause Remissions of Multiple Myeloma. Blood 128, 1688-1700 (2016).
2. S. L. Maude, T. W. Laetsch, J. Buechner, S. Rives, M. Boyer 등, Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. N. Engl. J. Med. 378, 439-448 (2018).
3. S. S. Neelapu, F. L. Locke, N. L. Bartlett, L. J. Lekakis, D. B. Miklos 등, Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. N. Engl. J. Med. 377, 2531-2544 (2017).
4. J. H. Park, I. Riviere, M. Gonen, X. Wang, B. Senechal 등, Long-Term Follow-up of CD19 CAR Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia. N. Engl. J. Med. 378, 449-459 (2018).
5. S. J. Schuster, J. Svoboda, E. A. Chong, S. D. Nasta, A. R. Mato 등, Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. N. Engl. J. Med. 377, 2545-2554 (2017).
6. M. John M. Timmerman, M. Ronald Levy, Dendritic Cell Vaccines for Cancer Immunotherapy. Annu. Rev. Med. 50, 507-529 (1999).
7. C. E. Brown, C. L. Mackall, CAR T cell therapy: inroads to response and resistance. Nat. Rev. Immunol. 19, 73-74 (2019).
8. R. Kuai, L. J. Ochyl, K. S. Bahjat, A. Schwendeman, J. J. Moon, Designer Vaccine Nanodiscs for Personalized Cancer Immunotherapy. Nat. Mater. 16, 489 (2016).
9. J. Fang, B. Hu, S. Li, C. Zhang, Y. Liu 등, A Multi-Antigen Vaccine in Combination with an Immunotoxin Targeting Tumor-Associated Fibroblast for Treating Murine Melanoma. Mol. Ther.--Oncolytics 3, 16007-16007 (2016).
10. C. L. Slingluff, Jr., The Present and Future of Peptide Vaccines for Cancer: Single or Multiple, Long or Short, Alone or in Combination? Cancer J. 17, 343-350 (2011).
11. F. R. Balkwill, M. Capasso, T. Hagemann, The Tumor Microenvironment at a Glance. J. Cell Sci. 125, 5591-5596 (2012).
12. M. Kawahara, H. Takaku, A Tumor Lysate is an Effective Vaccine Antigen for the Stimulation of CD4(+) T-Cell Function and Subsequent Induction of Antitumor Immunity Mediated by CD8(+) T Cells. Cancer Biol. Ther. 16, 1616-1625 (2015).
13. F. E. Gonzalez, A. Gleisner, F. Falcon-Beas, F. Osorio, M. N. Lopez 등, Tumor Cell Lysates as Immunogenic Sources for Cancer Vaccine Design. Hum. Vaccines Immunother. 10, 3261-3269 (2014).
14. J. S. Moyer, G. Maine, J. J. Mule, Early Vaccination with Tumor-Lysate-Pulsed Dendritic Cells after Allogeneic Bone Marrow Transplantation has Antitumor Effects. Biol. Blood Marrow Transplant. 12, 1010-1019 (2006).
15. S. J. Win, D. G. McMillan, F. Errington-Mais, V. K. Ward, S. L. Young 등, Secretomes from Metastatic Breast Cancer Cells, Enriched for a Prognostically Unfavorable LCN2 Axis, Induce Anti-Inflammatory MSC Actions and a Tumor-Supportive Premetastatic Lung. Br. J. Cancer 106, 92-98 (2012).
16. R. C. Fields, K. Shimizu, J. J. Mule, Murine Dendritic Cells Pulsed with Whole Tumor Lysates Mediate Potent Antitumor Immune Responses in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9482-9487 (1998).
17. J. Kim, D. J. Mooney, In Vivo Modulation of Dendritic Cells by Engineered Materials: Towards New Cancer Vaccines. Nano Today 6, 466-477 (2011).
18. L. C. Chiang, G. Coukos, E. L. Kandalaft, Whole Tumor Antigen Vaccines: Where Are We? Vaccines 3 (2015).
19. C. L.-L. Chiang, F. Benencia, G. Coukos, Whole tumor antigen vaccines. Seminars in Immunology 22, 132-143 (2010).
20. M. L. Grant, N. Shields, S. Neumann, K. Kramer, A. Bonato 등, Combining dendritic cells and B cells for presentation of oxidised tumour antigens to CD8(+) T cells. Clinical & translational immunology 6, e149-e149 (2017).
21. C. L. Chiang, L. E. Kandalaft, J. Tanyi, A. R. Hagemann, G. T. Motz 등, A dendritic cell vaccine pulsed with autologous hypochlorous acid-oxidized ovarian cancer lysate primes effective broad antitumor immunity: from bench to bedside. Clin. Cancer Res. 19, 4801-4815 (2013).
22. J. Marcinkiewicz, Neutrophil Chloramines: Missing Links Between Innate and Acquired Immunity. Immunol. Today 18, 577-580 (1997).
23. J. Marcinkiewicz, B. M. Chain, E. Olszowska, S. Olszowski, J. M. Zgliczynski, Enhancement of Immunogenic Properties of Ovalbumin as a Result of its Chlorination. Int. J. Biochem. 23, 1393-1395 (1991).
24. M. E. D. Allison, D. T. Fearon, Enhanced Immunogenicity of Aldehyde-Bearing Antigens: A Possible Link Between Innate and Adaptive Immunity. Eur. J. Immunol. 30, 2881-2887 (2000).
25. P. G. Coulie, B. J. Van den Eynde, P. van der Bruggen, T. Boon, Tumour Antigens Recognized by T Lymphocytes: At the Core of Cancer Immunotherapy. Nat. Rev. Cancer 14, 135-146 (2014).
26. S. Frey, A. Castro, A. Arsiwala, R. S. Kane, Bionanotechnology for Vaccine Design. Curr. Opin. Biotechnol. 52, 80-88 (2018).
27. D. J. Irvine, M. C. Hanson, K. Rakhra, T. Tokatlian, Synthetic Nanoparticles for Vaccines and Immunotherapy. Chem. Rev. (Washington, DC, U. S.) 115, 11109-11146 (2015).
28. J. A. Kemp, M. S. Shim, C. Y. Heo, Y. J. Kwon, "Combo" Nanomedicine: Co-Delivery of Multi-Modal Therapeutics for Efficient, Targeted, and Safe Cancer Therapy. Adv. Drug Delivery Rev. 98, 3-18 (2016).
29. C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, R. C. Mucic, J. J. Storhoff, A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature 382, 607 (1996).
30. J. I. Cutler, E. Auyeung, C. A. Mirkin, Spherical nucleic acids. J. Am. Chem. Soc. 134, 1376-1391 (2012).
31. D. S. Seferos, A. E. Prigodich, D. A. Giljohann, P. C. Patel, C. A. Mirkin, Polyvalent DNA Nanoparticle Conjugates Stabilize Nucleic Acids. Nano Lett. 9, 308-311 (2009).
32. A. K. R. Lytton-Jean, J. M. Gibbs-Davis, H. Long, G. C. Schatz, C. A. Mirkin 등, Highly Cooperative Behavior of Peptide Nucleic Acid-Linked DNA-Modified Gold-Nanoparticle and Comb-Polymer Aggregates. Adv. Mater. 21, 706-709 (2009).
33. J.-S. Lee, A. K. R. Lytton-Jean, S. J. Hurst, C. A. Mirkin, Silver Nanoparticle-Oligonucleotide Conjugates Based on DNA with Triple Cyclic Disulfide Moieties. Nano Lett. 7, 2112-2115 (2007).
34. G. P. Mitchell, C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, Programmed Assembly of DNA Functionalized Quantum Dots. J. Am. Chem. Soc. 121, 8122-8123 (1999).
35. J. I. Cutler, D. Zheng, X. Xu, D. A. Giljohann, C. A. Mirkin, Polyvalent Oligonucleotide Iron Oxide Nanoparticle "Click" Conjugates. Nano Lett. 10, 1477-1480 (2010).
36. K. L. Young, A. W. Scott, L. Hao, S. E. Mirkin, G. Liu 등, Hollow Spherical Nucleic Acids for Intracellular Gene Regulation Based Upon Biocompatible Silica Shells. Nano Lett. 12, 3867-3871 (2012).
37. R. J. Banga, N. Chernyak, S. P. Narayan, S. T. Nguyen, C. A. Mirkin, Liposomal Spherical Nucleic Acids. J. Am. Chem. Soc. 136, 9866-9869 (2014).
38. A. J. Sprangers, L. Hao, R. J. Banga, C. A. Mirkin, Liposomal Spherical Nucleic Acids for Regulating Long Noncoding RNAs in the Nucleus. Small 13, 1602753 (2016).
39. B. Meckes, R. J. Banga, S. T. Nguyen, C. A. Mirkin, Enhancing the Stability and Immunomodulatory Activity of Liposomal Spherical Nucleic Acids through Lipid-Tail DNA Modifications. Small 14, 1702909 (2017).
40. A. F. Radovic-Moreno, N. Chernyak, C. C. Mader, S. Nallagatla, R. S. Kang 등, Immunomodulatory Spherical Nucleic Acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 3892-3897 (2015).
41. K. Skakuj, S. Wang, L. Qin, A. Lee, B. Zhang 등, Conjugation Chemistry-Dependent T-Cell Activation with Spherical Nucleic Acids. Journal of the American Chemical Society 140, 1227-1230 (2018).
42. Z. Li, Y. Zhang, P. Fullhart, C. A. Mirkin, Reversible and Chemically Programmable Micelle Assembly with DNA Block-Copolymer Amphiphiles. Nano Lett. 4, 1055-1058 (2004).
43. C. M. Calabrese, T. J. Merkel, W. E. Briley, P. S. Randeria, S. P. Narayan 등, Biocompatible infinite-coordination-polymer nanoparticle-nucleic-acid conjugates for antisense gene regulation. Angew. Chem., Int. Ed. 54, 476-480 (2014).
44. S. Zhu, H. Xing, P. Gordiichuk, J. Park, C. A. Mirkin, PLGA Spherical Nucleic Acids. Adv. Mater. 30, 1707113 (2018).
45. J. D. Brodin, A. J. Sprangers, J. R. McMillan, C. A. Mirkin, DNA-Mediated Cellular Delivery of Functional Enzymes. J. Am. Chem. Soc. 137, 14838-14841 (2015).
46. U. Bulbake, S. Doppalapudi, N. Kommineni, W. Khan, Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics 9, 12 (2017).
47. A. F. Radovic-Moreno, N. Chernyak, C. C. Mader, S. Nallagatla, R. S. Kang 등, Immunomodulatory spherical nucleic acids. Proceedings of the National Academy of Sciences 112, 3892-3897 (2015).
48. C. Guan, N. Chernyak, D. Dominguez, L. Cole, B. Zhang 등, RNA-Based Immunostimulatory Liposomal Spherical Nucleic Acids as Potent TLR7/8 Modulators. Small 10.1002/smll.201803284, e1803284 (2018).
49. Z. N. Huang, L. E. Cole, C. E. Callmann, S. Wang, C. A. Mirkin, Sequence Multiplicity within Spherical Nucleic Acids. ACS Nano 14, 1084-1092 (2020).
50. J. Vollmer, R. Weeratna, P. Payette, M. Jurk, C. Schetter 등, Characterization of Three CpG oligodeoxynucleotide Classes with Distinct Immunostimulatory Activities. Eur. J. Immunol. 34, 251-262 (2004).
51. Y. Kumagai, O. Takeuchi, S. Akira, TLR9 as a Key Receptor for the Recognition of DNA. Adv. Drug Delivery Rev. 60, 795-804 (2008).
52. B. P. Gross, A. Wongrakpanich, M. B. Francis, A. K. Salem, L. A. Norian, A Therapeutic Microparticle-Based Tumor Lysate Vaccine Reduces Spontaneous Metastases in Murine Breast Cancer. AAPS J. 16, 1194-1203 (2014).
53. Z. Li, Y. Qiu, W. Lu, Y. Jiang, J. Wang, Immunotherapeutic interventions of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Translational Medicine 16, 147 (2018).
54. J. Stagg, B. Allard, Immunotherapeutic Approaches in Triple-Negative Breast Cancer: Latest Research and Clinical Prospects. Ther. Adv. Med. Oncol. 5, 169-181 (2013).
55. C. Anders, L. A. Carey, Understanding and Treating Triple-Negative Breast Cancer. Oncology 22, 1233-1243 (2008).
56. F. Andre, C. C. Zielinski, Optimal Strategies for the Treatment of Metastatic Triple-Negative Breast Cancer with Currently Approved Agents. Ann. Oncol. 23 Suppl 6, vi46-51 (2012).
57. C. K. Anders, L. A. Carey, Biology, Metastatic Patterns, and Treatment of Patients with Triple-Negative Breast Cancer. Clin. Breast Cancer 9 Suppl 2, S73-S81 (2009).
58. M. Fedele, L. Cerchia, G. Chiappetta, The Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Breast Cancer: Focus on Basal-Like Carcinomas. Cancers 9, 134 (2017).
59. Y. Su, N. R. Hopfinger, T. D. Nguyen, T. J. Pogash, J. Santucci-Pereira 등, Epigenetic Reprogramming of Epithelial Mesenchymal Transition in Triple Negative Breast Cancer Cells with DNA Methyltransferase and Histone Deacetylase Inhibitors. J. Exp. Clin. Cancer Res. 37, 314 (2018).
60. K. J. Meade, F. Sanchez, A. Aguayo, N. Nadales, S. G. Hamalian 등, Secretomes from metastatic breast cancer cells, enriched for a prognostically unfavorable LCN2 axis, induce anti-inflammatory MSC actions and a tumor-supportive premetastatic lung. Oncotarget 10, 3027-3039 (2019).
61. L. G. Ellies, C. Kuo, PyVmT Luminal and EMT Cell Lines Exhibit Characteristic Patterns of Orthotopic and Tail Vein Metastasis. Cancer Research 73, C91-C91 (2013).
62. T. Biswas, J. Yang, L. Zhao, L. Sun, Abstract P2-04-07: Modeling orthotopic and metastatic progression of mammary tumors to evaluate the efficacy of TGF-β inhibitors in a pre-clinical setting. Cancer Research 72, P2-04-07-P02-04-07 (2012).
63. J. L. Christenson, K. T. Butterfield, N. S. Spoelstra, J. D. Norris, J. S. Josan 등, MMTV-PyMT and Derived Met-1 Mouse Mammary Tumor Cells as Models for Studying the Role of the Androgen Receptor in Triple-Negative Breast Cancer Progression. Horm. Cancer 8, 69-77 (2017).
64. M. Ouzounova, E. Lee, R. Piranlioglu, A. El Andaloussi, R. Kolhe 등, Monocytic and Granulocytic Myeloid Derived Suppressor Cells Differentially Regulate Spatiotemporal Tumour Plasticity During Metastatic Cascade. Nat. Commun. 8, 14979-14979 (2017).
65. S. Barnes, "EMT-6 Syngeneic Breast Tumor Model - A Powerful Tool for Immuno-Oncology Studies." Available at https://www.mibioresearch.com/knowledge-center/emt-6-syngeneic-breast-tumor-model-a-powerful-tool-for-immuno-oncology-studies/. Accessed 2 March 2020.
66. Y. Krishnamachari, A. K. Salem, Innovative Strategies for Co-Delivering Antigens and CpG Oligonucleotides. Adv. Drug Delivery Rev. 61, 205-217 (2009).
67. Z. M. Prokopowicz, F. Arce, R. Biedron, C. L.-L. Chiang, M. Ciszek 등, Hypochlorous Acid: A Natural Adjuvant That Facilitates Antigen Processing, Cross-Priming, and the Induction of Adaptive Immunity. J. Immunol. 184, 824-835 (2010).
68. C. L. Chiang, L. E. Kandalaft, J. Tanyi, A. R. Hagemann, G. T. Motz 등, A dendritic cell vaccine pulsed with autologous hypochlorous acid-oxidized ovarian cancer lysate primes effective broad antitumor immunity: from bench to bedside. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 19, 4801-4815 (2013).
69. N. I. Ho, L. G. M. Huis In 't Veld, T. K. Raaijmakers, G. J. Adema, Adjuvants Enhancing Cross-Presentation by Dendritic Cells: The Key to More Effective Vaccines? Front. Immunol. 9, 2874-2874 (2018).
70. N. R. Maimela, S. Liu, Y. Zhang, Fates of CD8+ T cells in Tumor Microenvironment. Comput. Struct. Biotechnol. J. 17, 1-13 (2018).
71. P. S. Kim, R. Ahmed, Features of Responding T cells in Cancer and Chronic Infection. Curr. Opin. Immunol. 22, 223-230 (2010).
72. A. M. Lesokhin, T. Merghoub, J. D. Wolchok, Myeloid-Derived Suppressor Cells and the Efficacy of CD8(+) T-cell Immunotherapy. OncoImmunology 2, e22764-e22764 (2013).
S. Wang, L. Qin, G. Yamankurt, K. Skakuj, Z. Huang 등, Rational Vaccinology with Spherical Nucleic Acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 116, 10473 (2019).
73. Callmann, C. E., Cole, Lisa E., Kusmierz, Caroline D., Huang, Ziyin, Horiuchi, Dai, Mirkin, Chad A., Tumor cell lysate-loaded immunostimulatory spherical nucleic acids as therapeutics for triple-negative breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020
SEQUENCE LISTING <110> Northwestern University <120> OXIDIZED TUMOR CELL LYSATES ENCAPSULATED IN LIPOSOMAL SPHERICAL NUCLEIC ACIDS AS POTENT CANCER IMMUNOTHERAPEUTICS <130> 30938/2020-042 <150> US 63/008,229 <151> 2020-04-10 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Spacer-18 (hexaethyleneglycol))2 Chol <400> 2 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Cy5-(Spacer-18 (hexaethyleneglycol))2 Chol <400> 3 tccatgacgt tcctgacgtt 20

Claims (57)

  1. 접합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 실질적으로 구형 기하학적 구조를 갖는 나노입자로서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제이고, 산화된 종양 세포 용해물은 상기 나노입자 내에 캡슐화되는 것인, 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 1 (TLR1) 작용제, 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 작용제, 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 작용제, 톨-유사 수용체 5 (TLR5) 작용제, 톨-유사 수용체 6 (TLR6) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 톨-유사 수용체 10 (TLR10) 작용제, 톨-유사 수용체 11 (TLR11) 작용제, 톨-유사 수용체 12 (TLR12) 작용제, 톨-유사 수용체 13 (TLR13) 작용제, 또는 이들의 조합인 것인, 나노입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 또는 이들의 조합인 것인, 나노입자.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 TLR9 작용제는 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (서열번호 1)인, 나노입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(아크릴레이트), 또는 폴리(메타크릴레이트) 나노입자인 것인, 나노입자.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 TLR9 작용제는 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT(스페이서-18 (헥사에틸렌글리콜))2콜레스테롤-3' (서열번호 2)인, 나노입자.
  7. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 친유성기를 포함하는 것인, 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 친유성기는 토코페롤 또는 콜레스테롤을 포함하는 것인, 나노입자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 콜레스테롤은 콜레스테릴-트리에틸렌글리콜 (콜레스테릴-TEG)인, 나노입자.
  10. 제8항에 있어서, 상기 토코페롤은 토코페롤 유도체, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 또는 델타-토코페롤인, 나노입자.
  11. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 복수의 지질기를 포함하는 것인, 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 적어도 하나의 지질기는 지질의 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 또는 포스파티딜에탄올아민 계열인 것인, 나노입자.
  13. 제11항에 있어서, 적어도 하나의 지질기는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-포스파티딜콜린 (DMPC), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (DPPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DSPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1-올레오일-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-스테아로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DOPE-PEG-아지드), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DOPE-PEG-말레이미드), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DPPE-PEG-아지드), 1,2-디팔미토릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DPPE-PEG-말레이미드), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아지도(폴리에틸렌 글리콜)] (DSPE-PEG-아지드), 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)] (DSPE-PEG-말레이미드), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 또는 이들의 조합인 것인, 나노입자.
  14. 제11항에 있어서, 상기 복수의 지질기는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)을 포함하는 것인, 나노입자.
  15. 제11항에 있어서, 상기 복수의 지질기는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함하는 것인, 나노입자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 직경은 약 20 나노미터 (nm) 내지 약 150 nm인, 나노입자.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 직경은 약 100 나노미터 이하인, 나노입자.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 직경은 약 80 나노미터 이하인, 나노입자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 약 10개 내지 약 200개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 나노입자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 나노입자는 75개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 나노입자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 0.5 nmol 내지 약 25 nmol: 약 5 μg 내지 약 150 μg인, 나노입자.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 5 nmol 올리고뉴클레오타이드:20 μg 종양 세포 용해물인, 나노입자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화된 종양 세포 용해물은 차아염소산 (HOCl), 과산화수소, 차아염소산나트륨, 아염소산나트륨, 질산, 또는 황에 노출된 종양 세포로부터 유래된 것인, 나노입자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 종양 세포는 약 10 μM 내지 약 100 μM HOCl에 노출되는 것인, 나노입자.
  25. 제23항에 있어서, 상기 종양 세포는 약 60 μM HOCl에 노출되는 것인, 나노입자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포 용해물은 유방암 세포, 복막암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 식도암 세포, 안구암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포, 폐암 세포, 피부암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 위암 세포, 고환암 세포, 갑상선암 세포, 뇌암 세포, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 것인, 나노입자.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포 용해물은 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포로부터 유래된 것인, 나노입자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA인, 나노입자.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA인, 나노입자.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약학적 제제.
  31. 리포좀성 나노입자를 제조하는 방법으로서:
    종양 세포를 산화제에 노출시켜 산화된 종양 세포를 생성하고; 이후
    산화된 종양 세포로부터 용해물을 분리하고; 이후
    지질 필름을 용해물과 접촉시켜 내부에 캡슐화된 용해물을 포함하는 소형 단층 소포체 (SUV)를 생성하고; 이후
    SUV에 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 리포좀성 나노입자를 제조하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 산화제는 차아염소산 (HOCl)인, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 종양 세포는 약 10 μM 내지 약 100 μM의 산화제에 노출되는 것인, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포는 약 60 μM의 HOCl에 노출되는 것인, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 1 (TLR1) 작용제, 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 작용제, 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 작용제, 톨-유사 수용체 5 (TLR5) 작용제, 톨-유사 수용체 6 (TLR6) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 톨-유사 수용체 10 (TLR10) 작용제, 톨-유사 수용체 11 (TLR11) 작용제, 톨-유사 수용체 12 (TLR12) 작용제, 톨-유사 수용체 13 (TLR13) 작용제, 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 TLR 작용제는 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 작용제, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 작용제, 톨-유사 수용체 8 (TLR8) 작용제, 톨-유사 수용체 9 (TLR9) 작용제, 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀성 나노입자는 직경이 약 50 나노미터 (nm) 내지 약 100 나노미터 (nm)인, 방법.
  39. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀성 나노입자는 직경이 약 100 nm 미만인, 방법.
  40. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀성 나노입자는 직경이 약 80 nm인, 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 친유성 테더링된 기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드-지질 접합체이고, 상기 친유성 테더링된 기는 SUV의 표면에 흡착되는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 친유성 테더링된 기는 토코페롤 또는 콜레스테롤을 포함하는 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 토코페롤은 토코페롤 유도체, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 또는 델타-토코페롤인, 방법.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 DNA인, 방법.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 0.5 nmol 내지 약 25 nmol: 약 5 μg 내지 약 150 μg인, 방법.
  48. 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 대 종양 세포 용해물의 비는 약 5 nmol 올리고뉴클레오타이드:20 μg 종양 세포 용해물인, 방법.
  49. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 안정화제, 보존제, 또는 보조제(adjuvant) 내의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 나노입자, 또는 제30항의 약학적 제제를 포함하는 항원성 조성물로서, 상기 항원성 조성물은 포유동물 대상체에서 항체 생성 또는 보호 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 생성할 수 있는 것인, 항원성 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 항체 반응은 중화 항체 반응 또는 보호 항체 반응인 것인, 항원성 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항의 항원성 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 것을 포함하는, 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 암은 유방암, 복막암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 식도암, 안구암, 간암, 췌장암, 후두암, 폐암, 피부암, 난소암, 전립선암, 위암, 고환암, 갑상선암, 뇌암, 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암 (TNBC)인, 방법.
  55. 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 나노입자, 제30항의 약학적 제제, 또는 제49항 또는 제50항의 항원성 조성물을 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 투여는 피하인, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 근육내인, 방법.
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