CN115955955A - 作为有效的癌症免疫治疗剂的包封在脂质体球形核酸中的氧化的肿瘤细胞裂解物 - Google Patents

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Abstract

本公开总体上涉及纳米颗粒，所述纳米颗粒具有包封在其中的氧化的肿瘤细胞裂解物和在其表面上的寡核苷酸。本文还提供了制备和使用所述纳米颗粒的方法。

Description

作为有效的癌症免疫治疗剂的包封在脂质体球形核酸中的氧化的肿瘤细胞裂解物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年4月10日提交的美国临时专利申请第63/008,229号的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。
政府支持声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA199091下由政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。
通过引用并入电子提交的材料
作为本公开的一部分的序列表与说明书作为文本文件同时提交。含有序列表的文本文件的名称为“2020-042P_Seqlisting.txt”，所述文件于2020年4月10日创建，并且大小为1,047字节。序列表的主题以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及纳米颗粒，所述纳米颗粒具有包封在其中的氧化的肿瘤细胞裂解物和在其表面上的寡核苷酸。本文还提供了制备和使用所述纳米颗粒的方法。
背景技术
动员免疫系统对抗肿瘤是个性化癌症治疗的中心目标。事实上，肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定和基于细胞的疗法的出现代表了实现这一目标的重大进展(1-5)。然而，这些方法，包含使用树突状细胞(DC)疫苗(6)和CAR-T细胞疗法(7)，是昂贵的并且是劳动密集型的，因为它们需要从患者中提取未成熟的免疫细胞，体外扩增细胞，与TAA一起温育，并再输注给患者。此外，这些疗法仅限于其肿瘤表达已知TAA的患者的子集(8)，并且由于肿瘤异质性和随时间推移抗原表达的丧失，用单抗原疫苗提高免疫应答最终可能具有有限的功效(9-11)。
发明内容
已经开发了利用肿瘤相关抗原(TAA)的疗法，但是这些疗法仅限于其肿瘤表达已知TAA的患者的子集，并且由于肿瘤异质性和随时间推移抗原表达的丧失，用单抗原疫苗提高免疫应答最终可能具有有限的功效。利用从肿瘤细胞中分离的裂解物作为癌症免疫疗法中的抗原来源解决了这些问题；然而，使用肿瘤裂解物的直接疫苗接种由于其最小的免疫原性而获得了有限的成功。当裂解物用作抗原来源时，在裂解物分离和制备之前氧化肿瘤细胞显著增加了免疫原性，但是这些变化如何促进抗原呈递和改变肿瘤微环境(TME)的潜在机制仍然不清楚。此外，免疫治疗发展中的主要挑战是选择适当的媒剂来递送佐剂和抗原，因为组分的调配方式可以显著影响对免疫系统的递送，并且从而影响免疫刺激通路的激活。在这方面，纳米级治疗剂在增强对佐剂和抗原混合物的抗原呈递细胞(APC)激活方面显示出前景，因为佐剂和抗原的共递送是最有效的免疫应答所必需的。相对于含有非氧化裂解物和氧化裂解物与佐剂DNA(例如但不限于，Toll样受体9(TLR9)激动剂)的混合物的SNA，将氧化的肿瘤细胞裂解物包封在用免疫刺激性核酸修饰的球形核酸(SNA)的核中能够实现对相同靶免疫细胞的高共递送，这导致优异的抗肿瘤功效和生存期，以及显著改变的TME。本公开证明了裂解物被加工、包装和呈递至免疫细胞的方式是基于裂解物的免疫治疗剂的治疗潜力的关键决定因素。
因此，在一些方面，本公开提供了一种具有基本上球形几何形状的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内。在一些实施例中，所述TLR激动剂是toll样受体1(TLR1)激动剂、toll样受体2(TLR2)激动剂、toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体4(TLR4)激动剂、toll样受体5(TLR5)激动剂、toll样受体6(TLR6)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂、toll样受体10(TLR10)激动剂、toll样受体11(TLR11)激动剂、toll样受体12(TLR12)激动剂、toll样受体13(TLR13)激动剂或其组合。在优选实施例中，所述TLR激动剂是toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂或其组合。在一些实施例中，所述TLR9激动剂是5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO:1)。在另外的实施例中，所述纳米颗粒是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(丙烯酸酯)或聚(甲基丙烯酸酯)纳米颗粒。在一些实施例中，所述TLR9激动剂是5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT(间隔子-18(六乙二醇))2胆固醇-3'(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，所述寡核苷酸包括亲脂性基团。在另外的实施例中，所述亲脂性基团包括生育酚或胆固醇。在一些实施例中，所述胆固醇是胆固醇基-三甘醇(胆固醇基-TEG)。在一些实施例中，生育酚是生育酚衍生物、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚。在一些实施例中，所述纳米颗粒包括多个脂质基团。在一些实施例中，至少一个脂质基团属于磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺脂质家族。在仍另外的实施例中，至少一个脂质基团是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DOPE-PEG-叠氮化物)、1,2-二油酰-sn–甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DOPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DPPE-PEG-叠氮化物)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DPPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DSPE-PEG-叠氮化物)以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DSPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)或其组合。在一些实施例中，所述多个脂质基团包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)。在一些实施例中，所述多个脂质基团包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一些实施例中，所述纳米颗粒的直径为约20纳米(nm)至约150nm。在一些实施例中，所述纳米颗粒的直径小于或等于约100纳米。在一些实施例中，所述纳米颗粒的直径小于或等于约80纳米。在一些实施例中，所述纳米颗粒包括约10至约200个寡核苷酸。在另外的实施例中，所述纳米颗粒包括75个寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约0.5nmol至约25nmol:约5μg至约150μg。在另外的实施例中，寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约5nmol寡核苷酸:20μg肿瘤细胞裂解物。在一些实施例中，所述氧化的肿瘤细胞裂解物源自暴露于次氯酸(HOCl)、过氧化氢、次氯酸钠、亚氯酸钠、硝酸或硫的肿瘤细胞。在一些实施例中，所述肿瘤细胞暴露于约10μM至约100μM HOCl。在另外的实施例中，所述肿瘤细胞暴露于约60μM HOCl。在一些实施例中，所述肿瘤细胞裂解物源自乳腺癌细胞、腹膜癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、食道癌细胞、眼癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、喉癌细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞或其组合。在另外的实施例中，所述肿瘤细胞裂解物源自三阴性乳腺癌(TNBC)细胞。在一些实施例中，所述寡核苷酸是DNA。在一些实施例中，所述寡核苷酸是RNA。在一些方面，本公开提供了一种药物调配物，所述药物调配物包括具有基本上球形几何形状的纳米颗粒以及药学上可接受的载体或稀释剂，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内。
在一些方面，本公开提供了一种制备脂质体纳米颗粒的方法，所述方法包括：将肿瘤细胞暴露于氧化剂以产生氧化的肿瘤细胞；然后从所述氧化的肿瘤细胞中分离裂解物；然后使脂质膜与所述裂解物接触以产生包括所述裂解物的小单层囊泡(SUV)，所述裂解物包封在所述SUV中；然后将寡核苷酸添加到所述SUV中以制备所述脂质体纳米颗粒。在一些实施例中，所述氧化剂是次氯酸(HOCl)。在一些实施例中，所述肿瘤细胞暴露于约10μM至约100μM所述氧化剂。在另外的实施例中，所述肿瘤细胞暴露于约60μM HOCl。在一些实施例中，所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂。在另外的实施例中，所述TLR激动剂是toll样受体1(TLR1)激动剂、toll样受体2(TLR2)激动剂、toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体4(TLR4)激动剂、toll样受体5(TLR5)激动剂、toll样受体6(TLR6)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂、toll样受体10(TLR10)激动剂、toll样受体11(TLR11)激动剂、toll样受体12(TLR12)激动剂、toll样受体13(TLR13)激动剂或其组合。在优选实施例中，所述TLR激动剂是toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂或其组合。在一些实施例中，所述脂质体纳米颗粒的直径为约50纳米(nm)至约100纳米(nm)。在另外的实施例中，所述脂质体纳米颗粒的直径小于约100nm。在仍另外的实施例中，所述脂质体纳米颗粒的直径为约80nm。在一些实施例中，所述寡核苷酸是含有亲脂性拴系基团的寡核苷酸-脂质缀合物，其中所述亲脂性拴系基团被吸附到所述SUV的表面中。在一些实施例中，所述亲脂性拴系基团包括生育酚或胆固醇。在另外的实施例中，生育酚是生育酚衍生物、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚。在一些实施例中，所述寡核苷酸包括RNA或DNA。在一些实施例中，所述寡核苷酸是DNA。在一些实施例中，所述寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率比率为约0.5nmol至约25nmol:约5μg至约150μg。在另外的实施例中，寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约5nmol寡核苷酸:20μg肿瘤细胞裂解物。
在一些方面，本公开提供了一种抗原组合物，所述抗原组合物包括在药学上可接受的载体、稀释剂、稳定剂、防腐剂或佐剂中的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有基本上球形几何形状，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内；或本公开的药物调配物，其中所述抗原组合物能够在哺乳动物受试者中产生免疫应答，包含抗体产生或保护性免疫应答。在一些实施例中，所述抗体应答是中和抗体应答或保护性抗体应答。
在一些方面，本公开提供了一种在受试者中产生对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的抗原组合物，由此在所述受试者中产生对癌症的免疫应答。在一些实施例中，所述癌症是乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、眼癌、肝癌、胰腺癌、喉癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌或其组合。在一些实施例中，所述癌症是乳腺癌。在另外的实施例中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的纳米颗粒、抗原组合物或本公开的药物调配物，由此治疗所述受试者的癌症，所述纳米颗粒具有基本上球形几何形状，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内。在一些实施例中，所述施用是皮下的。在另外的实施例中，所述施用是静脉内的、腹膜内的、鼻内的或肌肉内的。
本文所公开的技术的应用包含但不限于：
·癌症免疫疗法和癌症疫苗
·针对多种肿瘤相关抗原的疫苗接种
·个性化癌症疗法
·增加蛋白质裂解物的免疫原性
·对抗原呈递细胞的刺激
·改变肿瘤的微环境
·免疫调节
本文所公开的技术的优势包含但不限于：
·分离之后肿瘤裂解物的免疫原性增加
·佐剂和抗原在体内对同一靶免疫细胞的高度共递送，因为两种组分在纳米级上包装在一起
·直接施加含裂解物的免疫治疗剂，无需体外免疫细胞扩增和活化
·由于裂解物被包封在纳米颗粒核内，因此可防止其降解
·免疫细胞群体改变
附图说明
图1示出了裂解物负载的免疫刺激性球形核酸(Lys-SNA)。(a)Lys-SNA的示意图。来自氧化或非氧化TNBC细胞的TNBC裂解物(橙色)被包封在脂质体(紫色)的核中，所述脂质体用经胆固醇修饰的核酸(绿色)功能化以产生SNA。(b)Lys-SNA的低温TEM。(c)游离CpG-1826(左泳道)、Lys-SNA(中泳道)和暴露于Triton-X之后裂解脂质体(右泳道)的Lys-SNA的凝胶电泳。(d)如由DLS测量的裂解物负载的脂质体和SNA的流体动力学直径。
图2示出了接种后第11天时肿瘤位点处的CD8+(细胞毒性)T细胞群体的代表性实例。
图3示出了接种后第11天时肿瘤位点处的MDSC群体的代表性实例。
图4示出了由裂解物负载的脂质体形成裂解物负载的SNA。CpG-1826被胆固醇3'-修饰以诱导双层嵌入。
图5示出了Cy5标记的SNA内的FITC标记的裂解物的递送。(a)BMDC与双荧光团标记的Lys-SNA和Lys-Mix温育1小时和24小时的共聚焦显微镜图像(比例尺＝10μm)。(b)如通过流式细胞术评估的，在体外温育1小时和24小时之后，通过Lys-SNA(n＝3，黑色条)和Lys-Mix(n＝3，绿色条)将裂解物和DNA共递送至BMDC。(c)皮下注射后2小时和24小时，通过Lys-SNA(n＝3，黑色条)和Lys-Mix(n＝3，绿色条)将裂解物和DNA共递送至体内淋巴样细胞。分离淋巴结，并且通过流式细胞术分析CD11c+淋巴样细胞。使用普通的单向ANOVA进行统计分析，其中“*”表示p值<0.05，“**”表示p值<0.01，并且“***”表示p值<0.001。
图6示出了Lys-SNA和Lys-Mix在体内的抗肿瘤作用。(a)当施用Lys-SNA(黑色圆圈)、Lys-Mix(绿色方块)或盐水(白色菱形)时，携带原位同基因(a)Py230肿瘤、(b)Py8119肿瘤或(c)EMT6肿瘤的小鼠的抗肿瘤功效。接种后第6天开始初始治疗，并在第10天和第15天重复治疗。使用普通的单向ANOVA进行统计分析，其中“*”表示p值<0.05，“**”表示p值<0.01，并且“***”表示p值<0.001。
图7示出了(a)从EMT6、Py230和Py8119分离的裂解物以及(b)从非氧化(左泳道)和氧化的EMT6细胞(右泳道)分离的裂解物的蛋白质印迹。
图8示出了温育后BMDC的体外活化。纯化从C57BL6小鼠分离的细胞，并与CpG-1826和氧化的裂解物(黄色条)、非氧化的裂解物(黑色条)或无裂解物(灰色条)共培养。两天之后，通过流式细胞术测量DC活化的(a)CD40、(b)CD80、(c)CD86和(d)MHC-II的表达水平。使用普通的单向ANOVA进行统计分析，其中“*”表示p值<0.05，“**”表示p值<0.01，并且“***”表示p值<0.001。
图9示出了OxLys-SNA的体内分析。(a)抗肿瘤功效和(b)当施用OxLys-SNA(黄色圆圈)、OxLys-Mix(灰色方块)、Lys-SNA(黑色圆圈)或盐水(白色菱形)时，携带原位同基因EMT6肿瘤的Balb/c小鼠的对应生存期曲线。接种后第6天开始初始治疗，并在第10天和第15天重复治疗。在接种后第11天，在第6天和第15天用OxLys-SNA(黄色条)、Lys-SNA(黑色条)、OxLys-Mix(灰色条)或盐水(白色条)处理后，从携带EMT6的小鼠的肿瘤微环境中分离的(d)细胞毒性CD8+T细胞和(e)MDSC的群体。
图10示出了(a)接种后第0天至第25天施用OxLys-SNA的动物的个体肿瘤生长(蜘蛛)图。在第20天，除了2只接受OxLys-SNA治疗的动物外，所有动物都经历了肿瘤完全缓解。(b)接种后50天内施用OxLys-SNA(黄色线)或盐水(黑色线)的动物的蜘蛛图。在第一只经OxLys-SNA治疗的动物之前，所有经盐水治疗的动物都死于肿瘤负荷。蓝框表示图a中的区域。
图11示出了L-SNA在Py8119 TNBC模型中的体内抗肿瘤活性。(a)在施用盐水(三角形)、DOPC-SNA(正方形)或DPPC-SNA(圆形)后,“仅佐剂”的L-SNA的抗肿瘤功效作为脂质体稳定性的函数。(b)包封Py8119裂解物的L-SNA的抗肿瘤功效作为脂质体稳定性的函数。向动物施用盐水(三角形)、DOPC-Lys-SNA(正方形)或DPPC-Lys-SNA(圆形)。(c)包封氧化的Py8119裂解物的L-SNA的抗肿瘤功效作为脂质体稳定性的函数。向动物施用盐水(三角形)、DOPC-OxLys-SNA(正方形)或DPPC-OxLys-SNA(圆形)。(d)在研究的第28天，比较含DPPC的治疗组之间的肿瘤体积。白点表示每组中的个体动物。误差条表示平均值的标准误差。使用不成对的t检验进行统计分析，其中“*”表示p值<0.05，“**”表示p值<0.01，“***”表示p值<0.001，并且“ns”表示p值>0.05。
具体实施方式
本公开涵盖免疫治疗球形核酸(SNA)(例如，脂质体SNA)，所述SNA包封从氧化的肿瘤细胞中分离的裂解物，并且在其表面上呈递免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG-1826)作为佐剂。与裂解物与线性寡核苷酸的简单混合物相比，所得纳米结构(OxLys-SNA)增强了佐剂和抗原向免疫细胞的共递送，相对于其非氧化对应物，显著增加了树突状细胞的活化。
单一抗原疫苗的有吸引力的替代方案是使用从患者自身肿瘤中分离的裂解物作为TAA来源(12-18)。利用肿瘤细胞裂解物作为抗原扩大了可以被免疫细胞加工和靶向的蛋白质组——原则上，可以访问整个肿瘤蛋白质组(18)。因此，这也解决了使用有限的一组明确定义的TAA的若干潜在限制，包含：1)从肿瘤中鉴定免疫原性表位的挑战，2)主要组织相容性复合物(MHC)的表位限制以及3)肿瘤中的靶向抗原的丢失。然而，由于注射之后细胞摄取和生物利用度低，使用肿瘤裂解物的直接疫苗接种取得了有限的成功，导致免疫原性最小(19)。当裂解物用作DC疫苗中的抗原来源时，在裂解物分离和制备之前氧化肿瘤细胞显著增加了免疫原性(19-21)。重要的是，HOCl(由中性粒细胞产生的氧化剂，作为适应性免疫应答的一部分)对蛋白质的氯化作用将抗原的免疫原性增加了若干倍(22)，这可能是由于器蛋白水解敏感性增加(23)。另外，HOCl氧化产生经醛修饰的抗原，所述经醛修饰的抗原比其未经修饰的对应物更具免疫原性(24)。然而，这些变化如何促进抗原呈递和改变肿瘤微环境(TME)的潜在机制仍不清楚。此外，免疫治疗发展中的主要挑战是选择适当的媒剂来递送佐剂和抗原(25)，因为组分的调配方式可以显著影响对免疫系统的递送，并且从而影响免疫刺激通路(26，27)的激活。在这方面，纳米级治疗剂已经显示出前景，增强了对佐剂和抗原的混合物的抗原呈递细胞(APC)活化(28)。
球形核酸(SNA)是一类新型核酸，其表现出与其线性类似物完全不同的行为(29)，包含不使用辅助转染试剂的快速细胞摄取(30)。SNA结构被定义为将核酸密集、高度定向堆积成球形形态，这赋予衍生SNA的核酸新的化学、生物和物理性质。迄今为止，SNA已经由各种纳米颗粒核形成，包含金和其它无机纳米颗粒(29-36)、脂质体(37-41)、聚合物(42-44)和蛋白质(45)。脂质体是SNA模板化的特别有吸引力的支架，因为所得系统是可生物降解和生物相容的，并且脂质体是经FDA批准的用于药物递送的有效纳米级调配物(46)。另外，脂质体SNA的中空核可以包封TAA和其它货物。先前已经观察到脂质体SNA启动抗原呈递，激活免疫细胞，并诱导产生用于癌症治疗和其它应用的促炎细胞因子(39，41，47-49)。在这些实例中的许多实例中，寡核苷酸壳的序列包含被称为CpG-1826的未甲基化的胞嘧啶-鸟苷序列。CpG-1826模拟微生物基因组，并且充当种病原体相关的分子模式(PAMP)(50)，其被toll样受体9(TLR9)(先天免疫系统的定位于抗原呈递细胞(APC)(包含DC(51))的内体中的组分)识别。
本公开提供了含有肿瘤细胞裂解物的SNA，所述SNA用于开发有效的纳米级免疫治疗剂，用于在各个方面和实施例中治疗没有已知TAA的癌症，如但不限于三阴性乳腺癌(TNBC)。
如本文所用，“球形核酸(SNA)”包括布置在纳米颗粒核周围的核酸。
如在此说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”包含复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是可互换的。
物质的“有效量”或“足够量”是实现有益的或期望的结果(包含临床结果)所必需的量，并且因此，“有效量”取决于其施加的环境。在施用抗原组合物的上下文中，有效量含有足以引发免疫应答的抗原(例如，包括本公开的氧化的肿瘤细胞裂解物的SNA)。可以以一个或多个剂量来施用有效量。可以在实验或临床试验中显示功效，例如，通过将通过所关注物质获得的结果与实验对照进行比较。
如本文所用，提及抗原组合物的术语“剂量”是指受试者在任一时间摄入(施用或接受)的抗原组合物的测得部分。
如本文所用，提及值的术语“约”涵盖所述值的90％至110％(例如，直径为约100纳米(nm)的纳米颗粒是指直径为90nm至110nm的纳米颗粒)。
如本文所用，术语“疫苗接种”是指将疫苗引入到生物体的身体中。
“受试者”是活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开的上下文中，受试者可以是实验受试者，如非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或非人灵长类动物)。可替代地，受试者可以是人受试者。
“抗原组合物”是适于施用于人或动物受试者(例如，在实验或临床环境中)的能够引发例如针对抗原如肿瘤相关抗原的特异性免疫应答的物质组合物。因此，抗原组合物包含一种或多种抗原(例如，肿瘤相关抗原)或抗原表位。抗原组合物还可以包含一种或多种能够引发或增强免疫应答的另外的组分，如赋形剂、载体和/或佐剂。在某些情况下，施用抗原组合物以引发免疫应答，所述免疫应答保护受试者免受由抗原诱导的症状或病状。在一些情况下，通过抑制与例如肿瘤相关的细胞的扩增来预防(或减少或改善)由抗原引起的症状或疾病。在本公开的上下文中，术语“抗原组合物”将被理解为涵盖出于引发针对肿瘤相关抗原的保护性或姑息性免疫应答的目的而打算施用于受试者或受试者群体的组合物。
“佐剂”是指当添加到包括抗原的组合物中时，在暴露时非特异性地增强或加强受体对抗原的免疫应答的物质。在本公开的各方面或实施例中的任何方面或实施例中，本文所提供的SNA包括免疫刺激性寡核苷酸(例如但不限于CpG-1826)作为佐剂，并包封源自肿瘤细胞的裂解物作为抗原。可以用于本公开的组合物的其它常见佐剂包含吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)悬浮液；乳剂，包含油包水和水包油(以及其变体，包含双重乳剂和可逆乳剂)、脂糖、脂多糖、模式识别受体(PRR)激动剂(例如，NALP3.RIG-I样受体(RIG-I和MDA5)以及此类组分的各种组合。
“免疫应答”是免疫系统的细胞，如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激如抗原(例如，调配为抗原组合物或疫苗)的应答。免疫应答可以是B细胞应答，这导致产生特异性抗体，如抗原特异性中和抗体。免疫应答可以是T细胞应答，如CD4+应答或CD8+应答。B细胞应答和T细胞应答是“细胞”免疫应答的各方面。免疫应答也可以是由抗体介导的“体液”免疫应答。在一些情况下，所述应答对特定抗原具有特异性(即，“抗原特异性应答”)。“保护性免疫应答”是抑制抗原的有害功能或活性，或减少由抗原引起的症状(包含死亡)的免疫应答。保护性免疫应答可以通过例如免疫测定来测量，所述免疫测定使用来自经免疫的受试者的血清样品，用于测试血清抗体抑制肿瘤细胞扩增的能力，所述免疫测定如：ELISA-中和测定、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、酶联免疫斑点(ELISpot)。另外，可以通过使用流式细胞术(FACS)分析或ELISpot测定，在免疫之后测量T细胞应答CD4+和CD8+来测试疫苗功效。保护性免疫应答可以通过在动物模型中体内测量对抗原攻击的抗性来测试。在人类中，可以在群体研究中证明保护性免疫应答，比较经治疗的受试者与未经治疗的对照的症状、发病率、死亡率等的测量结果。受试者暴露于免疫原性刺激物，如抗原(例如，调配为抗原组合物或疫苗)，引发对所述刺激物具有特异性的初级免疫应答，即，暴露“引发”免疫应答。随后暴露于刺激物，例如通过免疫，可以增加或“增强”特异性免疫应答的幅值(或持续时间，或两者)。因此，通过施用抗原组合物“加强”预先存在的免疫应答增加了抗原特异性应答的幅值(例如，通过增加抗体滴度和/或亲和力，通过增加抗原特异性B细胞或T细胞的频率，通过诱导成熟效应子功能，或其组合)。
球形核酸。球形核酸(SNA)包括纳米颗粒的表面上的密集功能化和高度定向的多核苷酸，所述纳米颗粒可以是有机的(例如，脂质体)或者聚合物的(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(丙烯酸酯)或聚(甲基丙烯酸酯))。多核苷酸壳的球形结构赋予了优于传统核酸递送方法的独特优势，包含不依赖于转染剂进入几乎所有细胞和对核酸酶降解的抗性。此外，SNA可以穿透生物屏障，包含血脑屏障(参见例如，美国专利申请公开第2015/0031745号，所述美国专利申请通过引用整体并入本文)和血液肿瘤屏障以及表皮(参见例如，美国专利申请公开第2010/0233270号，所述美国专利申请通过引用整体并入本文)。如本文所描述的，本公开的SNA进一步包括包封在SNA的核内的氧化的肿瘤细胞裂解物。
因此，提供了功能化的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有与其连接的多核苷酸。通常，预期的纳米颗粒包含对如本文所描述的多核苷酸具有高负载能力的任何化合物或物质，包含例如但不限于脂质体颗粒、基于聚合物的颗粒(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒)或树状物(有机对无机)。
纳米颗粒聚合物包含聚苯乙烯、硅橡胶、聚碳酸酯、聚氨酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚酯、聚醚和聚乙烯。还设想了可生物降解的生物聚合物(例如，多肽如BSA、多糖等)、其它生物材料(例如，碳水化合物)和/或聚合化合物以用于产生纳米颗粒。
例如在国际专利申请第PCT/US2014/068429号(通过引用整体并入本文，具体地是关于脂质体颗粒的讨论)中公开的脂质体颗粒也是本公开所设想的。例如在美国专利公开第2012/0282186号(通过引用整体并入本文)中所描述的中空颗粒也是本文所设想的。本公开的脂质体颗粒具有至少基本上球形的几何形状、内侧和外侧，并且包括脂质双层。在各个实施例中，脂质双层包括多个脂质基团，其中至少一个脂质基团属于磷酸胆碱脂质家族或磷酸乙醇胺脂质家族。尽管不旨在是限制性的，所述至少一个脂质基团是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DOPE-PEG-叠氮化物)、1,2-二油酰-sn–甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DOPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DPPE-PEG-叠氮化物)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DPPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DSPE-PEG-叠氮化物)以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DSPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)或其组合。在一些实施例中，所述多个脂质基团包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)或由其组成。在一些实施例中，所述多个脂质基团包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)或由其组成。
纳米颗粒的直径可以在约10nm至约150nm的大小范围内，直径为约10nm至约140nm，直径为约10nm至约130nm，直径为约10nm至约120nm，直径为约10nm至约110nm，直径为约10nm至约100nm，直径为约10nm至约90nm，直径为约10nm至约80nm，直径为约10nm至约70nm，直径为约10nm至约60nm，直径为约10nm至约50nm，直径为约10nm至约40nm，直径为约10nm至约30nm或直径为约10nm至约20nm。在其它方面，本公开提供了多个纳米颗粒，每个纳米颗粒具有基本上球形几何形状，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内。在这些方面，所述多个纳米颗粒的大小为约10nm至约150nm(平均直径)，平均直径为约10nm至约140nm，平均直径为约10nm至约130nm，平均直径为约10nm至约120nm，平均直径为约10nm至约110nm，平均直径为约10nm至约100nm，平均直径为约10nm至约90nm，平均直径为约10nm至约80nm，平均直径为约10nm至约70nm，平均直径为约10nm至约60nm，平均直径为约10nm至约50nm，平均直径为约10nm至约40nm，平均直径为约10nm至约30nm或平均直径为约10nm至约20nm。在一些实施例中，纳米颗粒的直径(或多个纳米颗粒的平均直径)为约10nm至约150nm、约30至约100nm或约40至约80nm。在一些实施例中，方法中使用的纳米颗粒的大小根据其特定用途或应用的需要而变化。大小的变化有利地用于优化纳米颗粒的某些物理特性，例如，光学性质或可以如本文所描述功能化的表面积的量。在另外的实施例中，产生多个SNA(例如，脂质体颗粒)，并且所述多个SNA中的SNA的平均直径小于或等于约150纳米(例如，约10纳米至约150纳米)，或小于或等于约100纳米(例如，约10纳米至约100纳米)或小于或等于约80纳米(例如，约10纳米至约80纳米)。在另外的实施例中，通过本公开的方法产生的所述多个纳米颗粒中的纳米颗粒的直径或平均直径小于或等于约20纳米、或小于或等于约25纳米、或小于或等于约30纳米、或小于或等于约35纳米、或小于或等于约40纳米、或小于或等于约45纳米、或小于或等于约50纳米、或小于或等于约55纳米、或小于或等于约60纳米、或小于或等于约65纳米、或小于或等于约70纳米、或小于或等于约75纳米、或小于或等于约80纳米、或小于或等于约85纳米、或小于或等于约90纳米、或小于或等于约95纳米、或小于或等于约100纳米、或小于或等于约100纳米、或小于或等于约120纳米、或小于或等于约130纳米、或小于或等于约140纳米或小于或等于约150纳米。应当理解，纳米颗粒的前述直径可以适用于纳米颗粒本身的直径，或者适用于纳米颗粒和与其相关的寡核苷酸的直径。
寡核苷酸。如本文所用，术语“核苷酸”或其复数可与本文所讨论的以及另外本领域已知的经修饰的形式互换。在某些情况下，本领域使用术语“核碱基”，其涵盖天然存在的核苷酸以及包含经修饰的核苷酸的非天然存在的核苷酸。因此，核苷酸或核碱基意指天然存在的核碱基A、G、C、T和U。非天然存在的核碱基包含，例如且不限于，黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶、N',N'-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3—C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和Benner等人,美国专利第5,432,272号以及以下中描述的“非天然存在的”核碱基：Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,第25卷：第4429-4443页。术语“核碱基”还不仅包含已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包含其杂环类似物和互变异构体。另外的天然和非天然存在的核碱基包含以下中公开的那些：美国专利第3,687,808号(Merigan等人)、Sanghvi于《反义研究与应用(Research and Application)》,S.T.Crooke和B.Lebleu编辑,CRC出版社(CRC Press),1993的第15章、Englisch等人,1991,《德国应用化学国际版(Angewandte Chemie,International Edition)》,30:613-722(尤其参见第622页和第623页以及《聚合物科学和工程化简明百科全书(Concise Encyclopedia of PolymerScience and Engineering)》,J.I.Kroschwitz编辑,翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons),1990,第858-859页,Cook,《抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)》1991,6,585-607，所述文献中的每一个特此以全文引用的方式并入)。在各个方面，多核苷酸还包含作为一种类别的非天然存在的核苷酸的一个或多个“核苷碱基”或“碱基单元”，其包含如杂环化合物等可以如核碱基一样发挥作用的化合物，所述化化合物包含在最经典的意义上不是核苷碱基但用作核苷碱基的某些“通用碱基”。通用碱基包含3-硝基吡咯、任选地经取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任选地经取代的次黄嘌呤。其它期望的通用碱基包含吡咯、二唑或三唑衍生物，包含本领域已知的那些通用碱基。
经修饰的核苷酸描述于EP 1 072 679和WO 97/12896号中，其公开内容通过引用并入本文中。经修饰的核碱基包含但不局限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其它8-经取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其是5-溴、5-三氟甲基以及其它5-经取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。经进一步修饰的碱基包含三环嘧啶，如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-clamps，如经取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5,4-b][1,4]苯并-嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶[3',2':4,5]吡咯[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还可以包含其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环置换的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包含美国专利第3,687,808号中公开的那些、在《聚合物科学和工程化简明百科全书》第858-859页,Kroschwitz,J.I.编辑,约翰威利父子出版公司,1990中公开的那些、在Englisch等人,1991,《德国应用化学国际版》,30:613中公开的那些以及在Sanghvi,Y.S.,第15章,《反义研究与应用》,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC出版社,1993中公开的那些。这些碱基中的某些可用于增加结合亲和力并且包含5-经取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和经N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经示出5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃并且在某些方面与2'-O-甲氧基乙基糖修饰结合。参见，美国专利第3,687,808号、美国专利第4,845,205号；第5,130,302号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,645,985号；第5,830,653号；第5,763,588号；第6,005,096号；第5,750,692号以及第5,681,941号，所述美国专利的公开内容通过引用并入本文中。
制备预定序列的多核苷酸的方法是众所周知的。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第2版1989)和F.Eckstein(编辑)《寡核苷酸和类似物(Oligonucleotides and Analogues)》,第1版(纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press,New York),1991)。固相合成方法对于多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸两者均为优选的(合成DNA的众所周知的方法也可用于合成RNA)。多核糖核苷酸也可以以酶方式制备。也可以将非天然存在的核碱基掺入到多核苷酸中。参见例如美国专利第7,223,833号；Katz,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,74:2238(1951)；Yamane等人,《美国化学学会杂志》,83:2599(1961)；Kosturko等人,《生物化学(Biochemistry)》,13:3949(1974)；Thomas,《美国化学学会杂志》,76:6032(1954)；Zhang等人,《美国化学学会杂志》,127:74-75(2005)；以及Zimmermann等人,《美国化学学会杂志》,124:13684-13685(2002)。
所提供的用多核苷酸或其经修饰的形式功能化的纳米颗粒通常包括长度为约5个核苷酸至约100个核苷酸的多核苷酸。更具体地，用多核苷酸功能化的纳米颗粒的长度为约5个至约90个核苷酸，长度为约5个至约80个核苷酸，长度为约5个至约70个核苷酸，长度为约5个至约60个核苷酸，长度为5个至约50个核苷酸，长度为约5个至约45个核苷酸，长度为约5个至约40个核苷酸，长度为约5个至约35个核苷酸，长度为约5个至约30个核苷酸，长度为约5个至约25个核苷酸、长度为约5个至约20个核苷酸，长度为约5个至约15个核苷酸，长度为约5个至约10个核苷酸，并且所有多核苷酸的具体公开的大小的长度为中等，其范围为多核苷酸能够实现的期望的结果。因此，设想的多核苷酸的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、约125个、约150个、约175个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个或更多个核苷酸。
在一些实施例中，与纳米颗粒连接的多核苷酸是DNA。当DNA与纳米颗粒连接时，在一些实施例中，所述DNA包含与多核苷酸的靶区域充分互补的序列，使得与所述纳米颗粒连接的DNA多核苷酸和靶多核苷酸发生杂交，由此将所述靶多核苷酸与所述纳米颗粒缔合。在各个方面，DNA是单链或双链的，只要双链分子也包含与靶多核苷酸的单链区杂交的单链区。在一些方面，在纳米颗粒上功能化的多核苷酸的杂交可以与双链靶多核苷酸形成三链体结构。另一方面，三链体结构可以通过在纳米颗粒上功能化的双链寡核苷酸与单链靶多核苷酸的杂交来形成。在一些实施例中，本公开设想了与纳米颗粒连接的多核苷酸是RNA。RNA可以是单链或双链的(例如，siRNA)，只要它能与靶多核苷酸杂交。在各个实施例中，与纳米颗粒连接的多核苷酸与靶多核苷酸100％互补，即完全匹配，而在其它方面，与纳米颗粒连接的多核苷酸在与纳米颗粒连接的多核苷酸的长度上与靶多核苷酸至少约95％互补，在与纳米颗粒连接的多核苷酸的长度上与靶多核苷酸至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％或至少约20％互补。
在一些方面，多个多核苷酸被功能化成纳米颗粒。在各个方面，多个多核苷酸各自具有相同的序列，而在其它方面，一个或多个多核苷酸具有不同的序列。在另外的方面，多个多核苷酸一前一后地布置，并被间隔子分开。下文将更详细地描述间隔子。
多核苷酸与纳米颗粒连接。设想的用于所述方法的多核苷酸包含通过任何方式(例如，共价或非共价连接)与纳米颗粒结合的那些。不论多核苷酸与纳米颗粒连接的方式如何，在各个方面，连接都是通过5'键、3'键、某种类型的内部键或这些连接的任意组合实现的。在一些实施例中，多核苷酸与纳米颗粒共价连接。在另外的实施例中，多核苷酸与纳米颗粒非共价连接。在各个实施例中，本公开的寡核苷酸包括生育酚、胆固醇部分、DOPE-氨磺丁脲-苯基马来酰亚胺或溶血磷酸乙醇胺-氨磺丁脲-苯基马来酰亚胺。在一些实施例中，所述胆固醇是胆固醇基-三甘醇(胆固醇基-TEG)。在一些实施例中，生育酚选自由以下组成的组：生育酚衍生物、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。还参见美国专利申请公开第2016/0310425号，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
连接方法对于本领域普通技术人员来说是已知的，并且描述于美国公开第2009/0209629号中，所述美国公开通过引用整体并入本文。将RNA与纳米颗粒连接的方法总体上描述于PCT/US2009/65822中，所述文献通过引用整体并入本文。将多核苷酸与脂质体颗粒缔合的方法描述于PCT/US2014/068429中，所述文献通过引用整体并入本文。
间隔子。在某些方面，设想了功能化的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含其中寡核苷酸通过间隔子与纳米颗粒连接的那些。如本文所用，“间隔子”意指本身不参与调节基因表达，但用于增加纳米颗粒与功能性寡核苷酸之间的距离，或当以多个拷贝与纳米颗粒连接时增加个体寡核苷酸之间的距离的部分。因此，无论寡核苷酸具有相同的序列还是不同的序列，设想了间隔子定位于串联的个体寡核苷酸之间。一方面，当存在时，所述间隔子是有机部分。另一方面，间隔子是聚合物，包含但不限于水溶性聚合物、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂质、乙二醇或其组合。在各个实施例中，寡核苷酸包括1、2、3、4、5或更多个间隔子(例如，间隔子-18(六乙二醇))部分。
由于间隔子与纳米颗粒的结合，多核苷酸与纳米颗粒的表面间隔开，并且更容易与其靶标缔合。在各个实施例中，间隔子的长度是或等于至少约5个核苷酸、5至10个核苷酸、10个核苷酸、10至30个核苷酸或甚至大于30个核苷酸。间隔子可以具有不干扰多核苷酸与纳米颗粒或与靶结合的能力的任何序列。在某些方面，多核苷酸间隔子的碱基是所有腺苷酸、所有胸苷酸、所有胞苷酸、所有鸟苷酸、所有尿苷酸或所有其它经修饰的碱基。
纳米颗粒表面密度。足以使纳米颗粒稳定的表面密度和获得纳米颗粒和多核苷酸的期望组合的表面密度所需的条件可以凭经验确定。通常，至少约2皮摩尔/cm2的表面密度将足以提供稳定的纳米颗粒-寡核苷酸组合物。在一些方面，所述表面密度为至少15皮摩尔/cm2。还提供了方法，其中所述多核苷酸以以下表面密度与所述纳米颗粒结合：至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少约15pmol/cm2、至少约19pmol/cm2、至少约20pmol/cm2、至少约25pmol/cm2、至少约30pmol/cm2、至少约35pmol/cm2、至少约40pmol/cm2、至少约45pmol/cm2、至少约50pmol/cm2、至少约55pmol/cm2、至少约60pmol/cm2、至少约65pmol/cm2、至少约70pmol/cm2、至少约75pmol/cm2、至少约80pmol/cm2、至少约85pmol/cm2、至少约90pmol/cm2、至少约95pmol/cm2、至少约100pmol/cm2、至少约125pmol/cm2、至少约150pmol/cm2、至少约175pmol/cm2、至少约200pmol/cm2、至少约250pmol/cm2、至少约300pmol/cm2、至少约350pmol/cm2、至少约400pmol/cm2、至少约450pmol/cm2、至少约500pmol/cm2、至少约550pmol/cm2、至少约600pmol/cm2、至少约650pmol/cm2、至少约700pmol/cm2、至少约750pmol/cm2、至少约800pmol/cm2、至少约850pmol/cm2、至少约900pmol/cm2、至少约950pmol/cm2、至少约1000pmol/cm2或更高。
可替代地，SNA的表面上的多核苷酸的密度通过SNA的表面上的多核苷酸的数量来测量。关于本公开的SNA的表面上的多核苷酸的表面密度，经考虑如本文所描述的SNA包括在其表面上的约1至约25,000个寡核苷酸。在各个实施例中，SNA包括在其表面上的约10至约200个、或约10至约190个、或约10至约180个、或约10至约170个、或约10至约160个、或约10至约150个、或约10至约140个、或约10至约130个、或约10至约120个、或约10至约110个、或约10至约100、或10至约90个、或约10至约80个、或约10至约70个、或约10至约60个、或约10至约50个、或约10至约40个、或约10至约30个或约10至约20个寡核苷酸。在一些实施例中，SNA包括在其表面上的约80至约140个寡核苷酸。在另外的实施例中，SNA包括在其表面上的至少约5个、10个、20个、30个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、185个、190个、195个或200个多核苷酸。在另外的实施例中，SNA由在其表面上的至少约5个、10个、20个、30个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、185个、190个、195个或200个多核苷酸组成。在一些实施例中，脂质体SNA(在各个实施例中，其直径可以为约或小于约150纳米，或直径为约或小于约100纳米，或直径为约或小于约80纳米或直径为约或小于约70纳米)包括在其表面上的约10至约1,000个寡核苷酸或约10至约40个寡核苷酸。在另外的实施例中，PLGA SNA(在各个实施例中，其直径小于约100纳米或直径小于约80纳米)包括在其表面上的约10至约800个寡核苷酸。
制备球形核酸(SNA)的方法
根据本公开，裂解物被加工、包装和呈递至免疫细胞的方式是基于裂解物的免疫治疗剂的治疗潜力的关键决定因素。因此，本公开提供了制备纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒具有基本上球形几何形状，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内。所述方法包括：将肿瘤细胞暴露于氧化剂以产生氧化的肿瘤细胞；然后从所述氧化的肿瘤细胞中分离裂解物；然后使脂质膜与所述裂解物接触以产生包括所述裂解物的小单层囊泡(SUV)，所述裂解物包封在所述SUV中；并且然后将寡核苷酸添加到所述SUV中以制备所述脂质体纳米颗粒。本公开还具体地设想了通过前述方法产生的纳米颗粒。
所述肿瘤细胞在裂解物分离、制备和包封在纳米颗粒核内之前被氧化。所述肿瘤细胞通过暴露于氧化剂而被氧化。所述肿瘤细胞在25-37℃下暴露于氧化剂约30分钟至约2小时或约30分钟至约1小时。在一些实施例中，所述肿瘤细胞在37℃下暴露于氧化剂约1小时。在各个实施例中，所述氧化剂是次氯酸(HOCl)、过氧化氢、次氯酸钠、亚氯酸钠、硝酸、硫或其组合。在各个实施例中，所述肿瘤细胞暴露于约10μM至约100μM、或约10μM至约90μM、或约10μM至约80μM、或约10μM至约70μM、或约10μM至约60μM、或约10μM至约50μM、或约10μM至约40μM、或约10μM至约30μM、或约10μM至约20μM所述氧化剂。在另外的实施例中，所述肿瘤细胞暴露于约10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM所述氧化剂。在另外的实施例中，所述肿瘤细胞暴露于至少约10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM所述氧化剂。在另外的实施例中，所述肿瘤细胞暴露于小于约10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM所述氧化剂。在一些实施例中，所述肿瘤细胞在37℃下暴露于约60μM的HOCl约1小时。在各个实施例中，所述肿瘤细胞是乳腺癌细胞、腹膜癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、食道癌细胞、眼癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、喉癌细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞或其组合。在一些实施例中，所述肿瘤细胞是三阴性乳腺癌(TNBC)细胞。
然后将肿瘤细胞裂解物从氧化的肿瘤细胞中分离出来，并与脂质膜接触以产生小单层囊泡(SUV)，所述SUV包括包封在其中的裂解物。如本文所描述的，所述氧化的肿瘤细胞裂解物也可以被包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒、聚(丙烯酸酯)纳米颗粒或聚(甲基丙烯酸酯)纳米颗粒内。在各个实施例中，包封在纳米颗粒内的肿瘤细胞裂解物的量为约5μg至约150μg肿瘤细胞裂解物。在另外的实施例中，包封在纳米颗粒内的肿瘤细胞裂解物的量为约5μg至约140μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约130μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约120μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约110μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约100μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约90μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约80μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约70μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约60μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约50μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约40μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约30μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约20μg肿瘤细胞裂解物、或约5μg至约10μg肿瘤细胞裂解物。在仍另外的实施例中，包封在纳米颗粒内的肿瘤细胞裂解物的量为或为约5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg肿瘤细胞裂解物。在另外的实施例中，包封在纳米颗粒内的肿瘤细胞裂解物的量为至少约5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg肿瘤细胞裂解物。在一些实施例中，包封在纳米颗粒内的肿瘤细胞裂解物的量小于约5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg肿瘤细胞裂解物。
接下来，将寡核苷酸添加到其中包封有肿瘤细胞裂解物的纳米颗粒(例如，SUV)中。在各个实施例中，添加到其中包封有肿瘤细胞裂解物的纳米颗粒中的寡核苷酸的量为约0.5nmol至约25nmol。在另外的实施例中，添加到其中包封有肿瘤细胞裂解物的纳米颗粒中的寡核苷酸的量为约0.5nmol至约20nmol、或约0.5nmol至约15nmol、或约0.5nmol至约10nmol、或约1nmol至约10nmol、或约1nmol至约8nmol或约1nmol至约6nmol。在仍另外的实施例中，添加到其中包封有肿瘤细胞裂解物的纳米颗粒中的寡核苷酸的量为或为约0.5nmol、1nmol、1.5nmol、2nmol、2.5nmol、3nmol、3.5nmol、4nmol、4.5nmol、5nmol、6.5nmol、7nmol、7.5nmol、8nmol、8.5nmol、9nmol、9.5nmol、10nmol、11nmol、12nmol、13nmol、14nmol、15nmol、16nmol、17nmol、18nmol、19nmol、20nmol、21nmol、22nmol、23nmol、24nmol或25nmol。在另外的实施例中，添加到其中包封有肿瘤细胞裂解物的纳米颗粒中的寡核苷酸的量为至少约0.5nmol、1nmol、1.5nmol、2nmol、2.5nmol、3nmol、3.5nmol、4nmol、4.5nmol、5nmol、6.5nmol、7nmol、7.5nmol、8nmol、8.5nmol、9nmol、9.5nmol、10nmol、11nmol、12nmol、13nmol、14nmol、15nmol、16nmol、17nmol、18nmol、19nmol、20nmol、21nmol、22nmol、23nmol、24nmol或25nmol。在另外的实施例中，添加到其中包封有肿瘤细胞裂解物的纳米颗粒中的寡核苷酸的量小于约0.5nmol、1nmol、1.5nmol、2nmol、2.5nmol、3nmol、3.5nmol、4nmol、4.5nmol、5nmol、6.5nmol、7nmol、7.5nmol、8nmol、8.5nmol、9nmol、9.5nmol、10nmol、11nmol、12nmol、13nmol、14nmol、15nmol、16nmol、17nmol、18nmol、19nmol、20nmol、21nmol、22nmol、23nmol、24nmol或25nmol。在一些实施例中，添加到其中包封有肿瘤细胞裂解物的纳米颗粒中的寡核苷酸的量为5nmol。在一些实施例中，所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂。在另外的实施例中，所述TLR激动剂是toll样受体1(TLR1)激动剂、toll样受体2(TLR2)激动剂、toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体4(TLR4)激动剂、toll样受体5(TLR5)激动剂、toll样受体6(TLR6)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂、toll样受体10(TLR10)激动剂、toll样受体11(TLR11)激动剂、toll样受体12(TLR12)激动剂、toll样受体13(TLR13)激动剂或其组合。在一些实施例中，所述TLR激动剂是toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂或其组合。
在各个实施例中，前述方法产生纳米颗粒，所述纳米颗粒包括的寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约0.5nmol至约25nmol:约5μg至约150μg。在另外的实施例中，所述纳米颗粒包括的寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约5nmol寡核苷酸:20μg肿瘤细胞裂解物。
本公开还具体地设想了具有前述特征的纳米颗粒。
组合物
本公开包含组合物，所述组合物包括纳米颗粒，所述纳米颗粒具有基本上球形几何形状，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸(即，球形核酸(SNA))，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内。在一些实施例中，所述组合物是抗原组合物。在一些实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。术语“载体”是指在其中向哺乳动物受试者施用如本文所描述的纳米颗粒的媒剂。术语载体涵盖稀释剂、赋形剂、佐剂和其组合。药学上可接受的载体是本领域众所周知的(参见例如，Martin,1975的《雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》)。
示例性“稀释剂”包含无菌液体，如无菌水、盐水溶液和缓冲液(例如，磷酸盐、tris、硼酸盐、琥珀酸盐或组氨酸盐)。示例性“赋形剂”是惰性物质，其可以增强疫苗稳定性并且包含但不限于聚合物(例如，聚乙二醇)、碳水化合物(例如，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖或纤维素)和醇(例如，甘油、山梨糖醇或木糖醇)。
佐剂包含将相关抗原靶向抗原呈递细胞(APC)的疫苗递送系统(例如，乳剂、微粒、免疫刺激复合物(ISCOMS)或脂质体)；以及免疫刺激性佐剂。
诱导免疫应答的方法
本公开包含用于引发有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗原组合物，所述抗原组合物包括一种或多种SNA，所述SNA包括如本文所描述的氧化的肿瘤细胞裂解物。除非另有说明，否则抗原组合物是免疫原性组合物。
由本公开的方法引起的免疫应答通常包含抗体应答，优选地中和抗体应答、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体细胞介导的吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和T细胞介导的应答，如CD4+、CD8+。由包括如本文所公开的氧化的肿瘤细胞裂解物的SNA产生的免疫应答产生识别并且优选地缓解和/或中和如本文所描述的癌症的免疫应答。用于在施用抗原组合物(免疫或疫苗接种)之后评估抗体应答的方法是本领域已知的和/或本文所描述的。在一些实施例中，所述免疫应答包括T细胞介导的应答(例如，肽特异性应答，如增殖应答或细胞因子应答)。在优选实施例中，所述免疫应答包括B细胞应答和T细胞应答两者。抗原组合物可以以多种合适的方式施用，如肌内注射、皮下注射、皮内施用和粘膜施用，如口服施用或鼻内施用。另外的施用模式包含但不限于静脉内、腹膜内、鼻内施用、阴道内、直肠内和口服施用。本公开还设想了在经免疫的受试者中的不同施用途径的组合，例如同时肌内和鼻内施用。
抗原组合物可以用于治疗儿童和成人两者，包含孕妇。因此，受试者可以小于1岁、1至5岁、5至15岁、15至55岁或至少55岁。用于接受疫苗的优选受试者是老年人(例如，>55岁、>60岁，优选地>65岁)和年轻人(例如，<6岁、1至5岁，优选地小于1岁)。用于接受本公开的疫苗或组合物的另外的受试者包含原初(相对于先前感染的)受试者、当前感染的受试者或免疫受损的受试者。
施用可以涉及单剂量或多剂量方案。在初次免疫方案中和/或在加强免疫方案中可以使用多个剂量。在多剂量方案中，各种剂量可以通过相同或不同的途径给予，例如胃肠外初始和粘膜加强，或粘膜初始和胃肠外加强。施用超过一个剂量(通常为两个剂量)对于免疫原初受试者或低反应性群体中的受试者(例如，糖尿病患者或患有慢性肾病的受试者(例如，透析患者))特别有用。多个剂量通常将间隔至少1周(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周或约16周)施用。优选地，多个剂量将间隔一个月、两个月、三个月、四个月或五个月施用。本公开的抗原组合物可以与其它疫苗基本上同时(例如，在相同的医疗咨询或医疗保健专业人员就诊期间)施用于患者。
通常，每个剂量的抗原组合物中的包括氧化的肿瘤细胞裂解物的SNA的量被选择作为有效诱导受试者的免疫应答而不会在受试者中引起显著的不利副作用的量。优选地，引发的免疫应答包含：中和抗体应答；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体细胞介导的吞噬作用(ADCP)；补体依赖性细胞毒性(CDC)；T细胞介导的应答，如CD4+、CD8+或保护性抗体应答。此上下文中的保护性不一定要求受试者被完全保护以免受感染。当受试者被保护免于出现疾病症状时，就实现了保护性应答。如上文所描述的，由包括如本文所公开的氧化的肿瘤细胞裂解物的SNA产生的免疫应答产生识别并且优选地缓解和/或中和如本文所描述的癌症的免疫应答。
实例
以下实例证明了含有肿瘤细胞裂解物的SNA可以用于开发有效的纳米级免疫治疗剂，用于治疗没有已知TAA的癌症，如三阴性乳腺癌(TNBC)。
不具有经鉴定的肿瘤相关抗原(TAA)的癌症，如三阴性乳腺癌(TNBC)，仍然是具有挑战性的免疫治疗靶标。在本文中，描述了用于治疗TNBC的免疫治疗性脂质体球形核酸(SNA)的合成和评价。SNA包括作为佐剂的免疫刺激性寡核苷酸(CpG-1826)并且包封作为抗原的源自TNBC细胞系的裂解物。当与裂解物与线性寡核苷酸的简单混合物相比时，所得纳米结构(Lys-SNA)既在体外又在体内增强了佐剂和抗原向免疫细胞的共递送，并且相对于裂解物和CpG-1826的简单混合物(Lys-Mix)，在TNBC的Py230和Py8119原位同基因小鼠模型两者中，降低了肿瘤生长。此外，在裂解和并入到SNA(OxLys-SNA)中之前，氧化的TNBC细胞相对于其非氧化的对应物显著增加了树突状细胞的活化。当与Lys-SNA以及氧化的裂解物与免疫刺激性寡核苷酸的简单混合物相比时，当在EMT6小鼠乳腺癌模型中体内瘤周施用时，OxLys-SNA显著增加了细胞毒性CD8+T细胞的群体，并且同时减少了髓源性抑制细胞(MDSC)的群体。重要的是，相对于所有其它治疗组，用OxLys-SNA治疗的动物表现出显著的抗肿瘤活性和延长的生存期，并抵抗肿瘤的重新攻击。总之，这些结果表明裂解物的加工和包装方式对其免疫原性和治疗效果具有深远的影响。此外，这项工作指向使用氧化的肿瘤细胞裂解物负载的SNA作为一种有效的新类型的免疫疗法用于没有经鉴定的肿瘤相关抗原的癌症。
占所有乳腺癌相关死亡率(52，53)的大部分，TNBC是一种缺乏雌激素和孕激素受体两者的功能性表达，并且没有人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白(52-55)的过度表达的高度异质性和侵袭性的疾病。矛盾的是，TNBC原发性肿瘤通常最初对化疗应答良好；然而，存在复发和转移的高发生率。与其它乳腺癌亚型(53，56，57)相比，TNBC复发的早期和侵袭性例示为无进展率和三年总生存率显著降低，这就需要开发新的有效治疗选项。在探索SNA作为用于治疗TNBC的潜在疗法的努力中，合成了脂质体SNA，所述脂质体SNA将源自TNBC细胞系的裂解物包封在其核中，并在其表面呈递CpG-1826(Lys-SNA，图1)，以及含有来自TNBC细胞的裂解物的类似物，所述裂解物在裂解前用次氯酸(HOCl)氧化(OxLys-SNA)，并在TNBC的同基因原位小鼠模型中评估了其免疫调节活性和抗肿瘤性质。
实例1
材料与方法
细胞裂解物的产生和表征。EMT6细胞系获自ATCC，并在补充有10％热灭活胎牛血清和1％青霉素-链霉素的最低必需培养基(MEM)中生长。Py230和Py8119在F-12K培养基(ATCC)、5％胎牛血清、0.1％ MITO+血清增充剂(康宁公司(Corning))、2.5μg/mL两性霉素B(吉博科公司(Gibco))和50μg/mL庆大霉素(吉博科公司)中生长。所有裂解物均由第六次传代下的细胞制备。对于裂解物制备，将细胞胰蛋白酶化、洗涤、收集并以106个细胞/mL重新悬浮于杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中，然后在液氮和37℃水浴中进行五次冻融循环。通过以10,000RCF离心10分钟除去细胞碎片，并且然后收集上清液作为蛋白质裂解物。总蛋白浓度使用过二辛可宁酸(BCA)测定，以白蛋白作为蛋白标准品(Pierce，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))来测量。使用4-12％ SDS-PAGE电泳在100V下进行1小时并加载20μg总蛋白质来表征蛋白质含量。
为了制备氧化的裂解物，EMT6细胞在陪替氏培养皿中生长至汇合。用DPBS(3x)洗涤细胞，并且然后在DPBS用60μM次氯酸(HOCl)在37℃温育1小时。温育后，收集细胞并用DPBS洗涤以除去任何未反应的HOCl。以500RCF离心5分钟后，将细胞以1×107个细胞/mL的密度重新悬浮于DPBS中。使用液氮和37℃水浴对细胞进行5次冻融循环，然后以10,000RCF离心10分钟。收集可溶部分作为氧化的裂解物。
纯化的细胞裂解物被荧光团标记用于体外和体内摄取实验。将各一毫克的OregonGreen 488-NHS(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))和荧光素-5-马来酰亚胺(赛默飞世尔公司)染料与1mg/mL裂解物在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.5)中于4℃下温育16小时。通过使用50kDa截止离心过滤器(4000g，10分钟)用10mL PBS洗涤裂解物10次来去除未反应的染料。荧光团标记的裂解物随后用于制备裂解物-SNA。
DNA合成。将经胆固醇基修饰的CpG-1826(5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(间隔子-18(六乙二醇))2胆固醇-3')(SEQ ID NO:2)以及经胆固醇基-Cy5修饰的CpG-1826(5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-Cy5-(间隔子-18(六乙二醇))2胆固醇-3')(SEQ ID NO:3)使用MerMade 12合成仪(生物自动化公司(Bioautomation))，使用DCI作为活化剂和3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮作为硫化剂，通过自动化固相DNA合成，用硫代磷酸酯(PS)主链合成。合成后，通过在RT下与30％氢氧化铵过夜温育，将DNA链从固体支持物上切割下来。通过在氮气下蒸发去除过量的氨，并且使用HPLC(安捷伦公司(Agilent))在C4或C18柱上纯化寡核苷酸，使用乙酸三乙基铵(TEAA)和乙腈(10％至100％乙腈)的梯度超过30分钟。收集纯化的寡核苷酸并冻干。粉末状寡核苷酸在5mL乙酸中重构，并在RT下温育1小时，然后用乙酸乙酯(7mL，3x)萃取。然后将纯化的、脱保护的DNA冻干，重新悬浮于1mL去离子水中，并通过MALDI-TOF和天然凝胶电泳进行分析。
裂解物负载的SNA的合成。使用薄膜再水合方法将肿瘤细胞裂解物(氧化的或未经氧化的)包封在DOPC脂质体内(56)。将磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液调整至1mg/mL(相对于蛋白质浓度)，用于在室温下将5mg DOPC再水合1小时。在再水合期之后，通过五次冻融循环，使用液氮并在37℃水浴中超声处理，形成脂质体。然后用PBS稀释脂质体，使得用于挤出的最高脂质浓度不大于2mg/mL脂质，如通过可商购获得的磷脂酰胆碱(PC)测定(西格玛公司(Sigma))测量的。脂质体大小通过使用孔径为200、100、80和50nm的聚碳酸酯过滤器(T&T科技公司(T&T Scientific))的连续高压挤出来控制。脂质体通过每个过滤器大小十次。最终挤出后，使用孔径为500kDa(光谱公司(Spectrum))的切向流过滤(TFF)来去除任何未经包封的蛋白质，并且用PBS重复洗涤样品，直到在流通液中检测不到蛋白质，如通过用UV-vis光谱法(加利公司(Cary))和BCA测定在280nm处测量流通液的吸收来监测的。在用1％SDS破坏脂质体以释放包封的蛋白质之后，使用BCA测定测量包封在脂质体内的蛋白质的量。使用可商购获得的PC测定试剂盒测量磷脂浓度。
为了形成SNA，通过将20μM寡核苷酸与1.63mM脂质的脂质体溶液在25℃混合过夜，将胆固醇封端的寡核苷酸(3')包埋在脂质体的外膜中。通过用UV-vis测量260nm处的吸收来确定寡核苷酸浓度。然后使用离心过滤器单元(密理博(Milipore))通过DNA将所得SNA(OxLys-SNA和Lys-SNA两者)浓缩至20μM，这也去除了任何未结合的DNA。通过ζ电位(Malvern Zetasizer)、凝胶电泳和DLS分析所得结构(图1)。
裂解物负载的SNA的表征。使用冷冻TEM、凝胶电泳、DLS(图1d)和ζ电位(表1)表征裂解物负载的SNA。通过FEI Vitrobot Mark III制备CryoEM样品，通过将4μL滴在具有莱西碳膜的200目铜TEM网格上，吸干5秒钟，并且然后投入到液态乙烷中，然后转移到低温保持器中，并在成像前储存在液氮中。使用Hitachi HT7700透射电子显微镜和Gatan冷冻转移保持器在120kV加速电压下进行cryoEM成像，并且使用Gatan成像照相机以30,000倍放大率拍摄图像。使用凝胶电泳、DLS和ζ电位测量来确认DNA负载。将Cy5标记的经胆固醇基修饰的寡核苷酸、Cy5标记的Lys-SNA和已经与Triton-X一起温育以解离脂质体的Cy5标记的Lys-SNA(各50pmol)加载到冰上的1％琼脂糖凝胶中，并在100V下运行45分钟(图1c)。
表1.Lys-SNA和OxLys-SNA的ζ电位分析。
Figure BDA0003931709310000251
体外BMDC对Lys-SNA和Lys-Mix的摄取。从Balb/C或C57BL/6小鼠的股骨中分离骨髓，并在补充有10％热灭活胎牛血清、1％青霉素-链霉素和20ng/mL GM-CSF的RPMI-1640中培养。在第三天补充培养基，并且在第六天采集细胞。通过将AlexaFluor488标记的裂解物包封在脂质体核内并使用与上文所描述的相同的方法功能化Cy5标记的DNA来制备SNA。荧光团标记的SNA用于测量对BMDC中的颗粒的摄取。将BMDC以每孔500,000个细胞添加到24孔板中，并立即用1μM Cy5标记的DNA和AlexaFluor488标记的裂解物或双标记的SNA处理1或24小时。洗涤细胞，用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟，或者重新悬浮于DPBS中用于流式细胞术(BD LSRFortessa)，或者用DAPI染色并用63倍物镜用共聚焦显微镜(蔡司LSM 800)成像。
体内淋巴样细胞对Lys-SNA和Lys-Mix的摄取。对雌性C57BL/6小鼠(n＝3，8至10周龄)皮下(侧腹)注射200μL的50uM荧光团标记的Lys-SNA或CpG-1826和裂解物的混合物(Lys-Mix)。注射后2或24小时对小鼠实施安乐死，并切除引流淋巴结。使用细胞过滤器将淋巴结解离成单细胞。单细胞悬浮液用CD11c抗体(PE-Cy7)以及活/死染色剂染色，并使用流式细胞术进行分析。
Lys-SNA抗肿瘤功效。通过皮下注射到右侧腹股沟乳房脂肪垫中，将雌性小鼠(8至10周龄)用1×106个TNBC细胞(C57Bl/6小鼠用于Py230和Py8119；Balb/C小鼠用于EMT6)接种。在第6天、第10天和第15天，通过肿瘤周围注射(50μM，200μL)向动物施用Lys-SNA、Lys-Mix或盐水(每组n＝5)。通过用卡尺测量长度和宽度并应用公式V＝L×W×W/2来计算肿瘤体积。当经盐水治疗的动物的肿瘤负荷超过1200mm3时，停止研究并处死动物。
OxLys-SNA抗肿瘤功效。通过皮下注射到右侧腹股沟乳房脂肪垫中，将雌性Balb/C小鼠(8至10周龄)用1×106个EMT6细胞接种。在第6天、第10天和第15天，通过肿瘤周围以5nmol DNA和20μg蛋白质的剂量向动物施用OxLys-SNA、OxLys-Mix、Lys-SNA或盐水(每组n＝9)。通过用卡尺测量长度和宽度并应用公式V＝L×W×W/2来计算肿瘤体积。监测动物生存期至多100天，并且当肿瘤负荷超过1500mm3时处死动物。在接种后第60天，存活的OxLys-SNA动物的子集(n＝3)通过在右侧腹股沟乳房脂肪垫中接种大约106个EMT6细胞而被重新攻击，并在另外40天内监测肿瘤生长的证据。
BMDC活化。如上文所描述的分离和培养BMDC。在第6天，采集BMDC并与CpG-1826(0.1nmol)加氧化的裂解物、非氧化的裂解物或盐水(1μg总蛋白)一起温育(100,000个BMDC/样品)以诱导BMDC成熟。温育48小时后，用DPBS(3x)洗涤细胞，并用针对CD40、CD80、CD86和MHC-II的抗体染色，以及用活/死染色剂染色，通过在室温(RT)下与适当的抗体温育20分钟。然后用DPBS(3x)洗涤细胞，并用多聚甲醛固定，然后用流式细胞术分析。通过对CD11b+/CD11c+双阳性细胞进行门控，然后对适当的标志物(CD40、CD80、CD86或MHC-II)进行门控来鉴定免疫细胞。
对EMT6肿瘤位点处的免疫细胞群体的分析。通过注射到右侧腹股沟乳房脂肪垫中，将雌性Balb/C小鼠(8至10周龄)用大约106个EMT6细胞接种。在接种后第6天和第10天，通过肿瘤周围注射向动物(每组n＝3)施用OxLys-SNA、OxLys-Mix、Lys-SNA或盐水。在第11天，处死动物并采集肿瘤用于免疫细胞群体分析。用DPBS洗涤肿瘤，并使用细胞过滤器将所述肿瘤解离成单细胞悬浮液。然后将肿瘤细胞分成两个样品。一个样品用针对CD45、CD3和CD8的抗体染色，以鉴定CD8+细胞毒性T细胞。第二个样品与CD45、CD11b和Gr1一起温育以鉴定MDSC。在RT下温育20分钟之后，用DPBS(3x)洗涤细胞，并且用多聚甲醛固定，然后通过流式细胞术进行分析。通过首先对CD45+细胞进行门控，然后对CD3+/CD8+双阳性细胞进行门控来鉴定CD8+T细胞(图2)。通过首先对CD45+细胞进行门控，然后对CDllb+/Gr1+双阳性细胞进行门控来鉴定MDSC(图3)。
结果
来自TNBC细胞系的裂解物可以被划分在Lys-SNA中。为了评估使用TNBC裂解物作为抗原来源的可行性，使用了三种鼠乳腺癌细胞系来再现TNBC的异质性(58，59)。为此目的，利用Py230(一种腔细胞系(60-62))和Py8119(一种基底细胞系(60-62))，其源自小鼠乳腺肿瘤病毒-乳腺癌的多瘤中间肿瘤抗原(MMTV-PyMT)小鼠模型，所述模型随着其发展丧失雌激素和孕酮的表达(63)。选择EMT6细胞系作为第三个模型，因为此同基因系最近被认为是研究TNBC的免疫应答的有价值的模型(64，65)。细胞在单层细胞培养物中生长至汇合，解离并经受若干次冻融循环以诱导细胞坏死和细胞膜破裂，并离心以去除细胞碎片。可溶性蛋白质部分被包封在由1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)制备的大约70nm脂质体中。在纯化以去除未经包封的裂解物之后，脂质体与3'-经胆固醇基修饰的CpG-1826(图4)一起温育以产生Lys-SNA(图1a)，其单层球形形态通过低温透射电子显微术(低温TEM，图1b)验证。对于三个独立批次的EMT6 Lys-SNA，蛋白质与DNA的平均比率被确定为每μmolDNA 1.1±0.65mg蛋白质。通过凝胶电泳进行的分析(图1c)和如通过动态光散射测量的流体动力学直径的增加(DLS，图1d)与DNA功能化和SNA产生一致。
Lys-SNA增加了裂解物和CpG DNA在体外和体内向DC的共递送。抗原和佐剂向同一APC的共递送对于最大的抗原加工和呈递以及诱导最有效的抗原特异性免疫应答是至关重要的(66)。因此，研究了裂解物和DNA在体外和体内向APC的共递送。为此目的，合成了含有荧光团标记的裂解物(荧光素和Oregon Green 488)和CpG-1826(Cy5)的Lys-SNA。将纯化的裂解物与Oregon Green 488-琥珀酰亚胺酯(OR488-NHS)染料和荧光素-5-马来酰亚胺(FITC-马来酰亚胺)染料一起温育，以标记大量蛋白质溶液中的游离胺和硫醇两者。去除任何未反应的染料后，FITC/OR488标记的裂解物和经Cy5修饰的DNA用于产生双荧光团标记的Lys-SNA。将骨髓来源的树突状细胞(BMDC)从C57Bl/6小鼠中分离出来，并在与Lys-SNA相同的蛋白质和DNA浓度下与荧光团标记的Lys-SNA或荧光团标记的裂解物和CpG-1826的混合物一起温育(图5)。在设定的时间点，收集细胞并通过共聚焦显微术(图5a)和流式细胞术(图5b)两者进行分析，以确定对FITC/OR488和Cy5两者具有阳性的细胞的数量。在所有时间点，Lys-SNA在体外显示出比裂解物与CpG-1826的简单混合物(Lys-Mix)更高的对免疫细胞的共递送，在进行2小时和24小时温育之后分别显示出3倍和2.5倍的共递送增强。为了评估抗原和佐剂在体内的共递送，C57Bl/6小鼠被皮下施用含有荧光团标记的裂解物和CpG-1826的Lys-SNA或Lys-Mix(每组n＝3)。在注射后2小时和24小时，处死动物，分离腹股沟淋巴结并解离成单细胞悬浮液，并且然后通过流式细胞术进行分析(图5c)。与体外数据一致，当在注射后2小时将裂解物和佐剂DNA调配为Lys-SNA时，体内共递送至CD11c+免疫细胞增强了4倍，其中在24小时仍观察到超过2.3倍增强。
Lys-SNA在多种TNBC模型中显示抗肿瘤活性。为了评估Lys-SNA的体内抗肿瘤活性，通过在小鼠的左侧腹股沟乳房脂肪垫中接种大约106个TNBC细胞(Py230、Py8119或EMT6)来建立TNBC的原位同基因模型。在接种后的第6天、第10天和第15天，以10nmol CpG-1826和20μg裂解物的剂量向动物瘤周施用Lys-SNA、Lys-Mix或盐水作为阴性对照。在Py230和Py8119模型中，相对于在研究的第30天施用Lys-Mix的动物，施用Lys-SNA的动物显示肿瘤体积分别减少42％和53％(图6a至b)，这表明将裂解物包装到SNA的核中增加了其抗肿瘤功效。在EMT6模型中，相对于盐水，施用具有CpG-1826的裂解物阻止了肿瘤生长，显示在第25天肿瘤生长减少了73％；然而，在施用Lys-SNA和Lys-Mix的动物之间没有观察到肿瘤生长的显著差异(图6c)。基于先前使用肿瘤裂解物作为抗原来源的报告(22-24)，假设EMT6模型中产生的裂解物免疫原性差，并且因此导致次优的T细胞启动和随后的抗肿瘤活性。因此，在此模型中研究了源自氧化的肿瘤细胞的裂解物的使用。
在裂解前氧化肿瘤细胞增加了观察到的免疫原性。由于已报告氧化增加了肿瘤裂解物的免疫原性，因此寻求确定源自氧化的肿瘤细胞的裂解物在并入到SNA中后是否可以用作有效的抗原来源。通过在60μM次氯酸(HOCl)中温育EMT6细胞1小时以确保细胞完全死亡来产生氧化的肿瘤细胞裂解物(67)。然后通过使细胞经受若干次冻融循环并离心以去除细胞碎片来制备氧化的裂解物。从氧化的肿瘤细胞中收集的蛋白质裂解物(“氧化的裂解物”)的总量与从非氧化的肿瘤细胞中收集的蛋白质裂解物(“非氧化的裂解物”)的总量类似；然而，氧化的裂解物的大量蛋白质群体不同于非氧化的裂解物的大量蛋白质群体，其中氧化的样品中出现更大的蛋白质条带(图7)。
为了确定裂解物产生前的氧化是否增加了分离的裂解物的免疫原性，BMDC与CpG-1826(0.1nmol)和等量蛋白质浓度(1μg总蛋白质)的非氧化的裂解物或氧化的裂解物一起温育。相对于仅用非氧化的裂解物进行的处理，成熟标志物CD40、CD80和CD86在与氧化的裂解物一起温育的BMDC中的表达显著增加(图8a至c)，显示出CD40、CD80和CD86标志物表达分别比非氧化的裂解物增加75％、20％和34％，以及比仅CpG-1826增加160％、47％和98％。此外，与仅与CpG-1826一起温育的BMDC相比，与氧化的裂解物一起温育的BMDC中MHC-II的表达提高了47％(图8d)。
OxLys-SNA显著抑制肿瘤生长并延长体内生存期。为了评估OxLys-SNA作为癌症免疫治疗剂的功能，在TNBC的EMT6模型中将OxLys-SNA的体内抗肿瘤活性与Lys-SNA以及氧化的裂解物与CpG-1826的混合物(OxLys-Mix)进行比较。Balb/C小鼠在左侧腹股沟乳房脂肪垫中接种有大约106个肿瘤细胞，并且在接种后第6天，以5nmol DNA和20μg蛋白质的剂量通过肿瘤周围皮下注射OxLys-SNA、Lys-SNA、OxLys-Mix(每组n＝9)开始治疗。经盐水治疗的动物用作阴性对照。在第10天和第15天重复注射。接种后100天内监测肿瘤质量和动物生存期。与所有其它治疗组相比，施用OxLys-SNA的动物对治疗的反应非常好(图9a)，其中9只经OxLys-SNA治疗的动物中有7只在第20天经历完全肿瘤缓解(图10a)。此外，当施用OxLys-SNA时，动物生存期显著延长(图9b)，其中9只动物中有6只经OxLys-SNA处理的动物生存超过接种后第100天。事实上，第一个死于肿瘤负荷(肿瘤体积超过1500mm3)的经OxLys-SNA治疗的动物比所有经盐水治疗的动物生存更长时间(图10b)。为了评估OxLys-SNA赋予记忆免疫应答的能力，在最初肿瘤植入后第60天，通过在腹股沟乳房脂肪垫中植入大约106个EMT6细胞，对施用OxLys-SNA的一小组动物进行重新攻击(图9c)。在用EMT6细胞重新攻击后，所有动物(n＝3)保持无肿瘤，表明用OxLys-SNA进行疫苗接种不仅根除了现有肿瘤，而且防止了新肿瘤的形成。
OxLys-SNA改变了肿瘤微环境中的免疫细胞群体。为了确定OxLys-SNA施用对肿瘤位点处的免疫细胞群体的影响，在Balb/c小鼠的左侧腹股沟乳房脂肪垫中接种EMT6细胞。在接种后的第6天和第10天，通过肿瘤周围皮下注射向动物施用OxLys-SNA、Lys-SNA、OxLys-Mix或盐水(每组n＝3)。在第11天，处死动物。将肿瘤解离成单细胞悬浮液并分成两部分。一个细胞部分与针对CD45、CD3和CD8的抗体一起温育，以鉴定肿瘤微环境中存在的CD8+(细胞毒性)T细胞。将第二细胞部分与CD45、CD11b和Gr1一起温育，以鉴定肿瘤微环境中存在的骨髓源性抑制细胞(MDSC)。抗体温育之后，将细胞固定并通过流式细胞术进行分析。令人兴奋的是，在施用OxLys-SNA的动物中，肿瘤位点处的CD8+T细胞群体相对于所有其它治疗组显著增加(图9d)，显示出相对于经盐水治疗的对照组增加了2.3倍。同时，施用OxLys-SNA(图9e)的动物中的MDSC的群体相对于经盐水治疗的对照减少了2.5倍。
讨论
相对于简单混合物，既在体外又在体内，将肿瘤细胞裂解物包封到脂质体SNA的核中增加了裂解物和佐剂DNA向免疫细胞的共递送。这突出了免疫治疗剂的设计中结构布置的重要性，因为当佐剂和抗原两者均被递送到相同的靶细胞时，获得了最大的免疫应答(66)。事实上，与线性CpG-1826和含有裂解物的裸脂质体的简单混合物相比，将裂解物和CpG-1826调配成SNA导致注射后2小时两种免疫调节组分更高程度地共递送至体内引流淋巴结中的相同CD11c+细胞。重要的是，在用Lys-SNA体内递送之后，对Cy5标记的DNA和荧光团标记的裂解物两者具有染色阳性的CD11c+细胞的百分比维持至多24小时，而当用简单混合物处理时，双阳性细胞的百分比增加，但没有达到Lys-SNA的水平。
此外，从已经用HOCl经受氧化应激以诱导细胞死亡的细胞中产生裂解物，导致比从未经受氧化应激的细胞中分离的蛋白质群体具有更高分子量的蛋白质群体。此发现证实了裂解物产生前的细胞氧化改变了可用的抗原池，这与已发表的关于在DC疫苗中使用氧化的裂解物的研究一致(20，68)。当与BMDC体外温育时，氧化的裂解物比非氧化的裂解物和CpG-1826两者都增强了DC成熟。此发现表明，通过氧化诱导细胞死亡导致裂解物群体具有提高的佐剂行为和抗原行为，因为DC成熟主要由佐剂的活化决定(69)。
在TNBC的EMT6模型中，OxLys-SNA显示出显著的抗肿瘤活性，其中9只动物中有6只在第20天经历完全肿瘤缓解。有趣的是，施用OxLys-SNA的第一只动物直到最后一只经盐水治疗的动物(接种后第27天)之后5天才屈服于肿瘤负荷(接种后第32天)。因此，OxLys-SNA作为有效的免疫治疗剂，具有优于Lys-SNA和OxLys-Mix两者的性能。令人兴奋的是，接受OxLys-SNA的动物在接种后60天时抵抗EMT6细胞的重新攻击，表明这种治疗方案具有提供保护性免疫的潜力。此外，与所有其它治疗组相比，OxLys-SNA显著增加了细胞毒性CD8+T细胞的数量，并且同时减少了TME中MDSC的群体。已表明乳腺肿瘤微环境中的高水平的细胞毒性T细胞与积极的抗肿瘤作用相关(70，71)，而高水平的MDSC促进免疫逃避(72)。因此，此发现为负责观察到的OxLys-SNA抗肿瘤功效的机制提供了见解。
这项工作很重要，因为它描述了一类新的有效疫苗，所述疫苗基于呈新型纳米治疗剂中的氧化的裂解物的形式的抗原的区室化。在三个TNBC肿瘤模型中，这些结构在裂解物和佐剂以及DNA的共递送、抗肿瘤功效、延长的动物生存期以及TME内免疫细胞群体的改变方面显示出非常有前景的活性。综上所述，这些结果表明，产生肿瘤细胞裂解物的方法，以及包装佐剂和抗原并将其递送至免疫系统的方式，对所得抗肿瘤功效具有深远影响。因此，这些结果对TNBC和其它癌症的个性化免疫疗法的发展具有重要意义。
结论
在三阴性乳腺癌的小鼠模型中，本文显示了肿瘤细胞在裂解物产生之前的氧化，以及它们在包含佐剂DNA的脂质体球形核酸(SNA)的核中的区室化，产生了强效的免疫治疗剂，所述免疫治疗剂显著抑制肿瘤生长，显著延长生存期，并且促进肿瘤微环境中的杀肿瘤免疫细胞群体。具体地，这项工作证明了正确包装和呈递佐剂和抗原使得可以控制生物分布、树突状细胞活化和治疗功效的重要性。
实例2
此实例描述了为测试脂质体SNA在TNBC Py8119模型中的抗肿瘤活性而设计的另外的实验的结果。更具体地，所述实验被设计成用包括DOPC并含有肿瘤裂解物的脂质体SNA(“L-SNA”)来测试包括DPPC并含有肿瘤裂解物的脂质体SNA的能力。
材料与方法
从Py8119细胞产生裂解物。Py8119细胞从ATCC获得，并在补充有5％ FBS和1％青霉素-链霉素的F-12K培养基中生长。为了制备裂解物，使用胰蛋白酶从培养板解离细胞，洗涤，收集，并以1×106个细胞/mL重新悬浮于杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。然后将悬浮液进行四次冻融循环，交替浸没在液氮中和37℃水浴中。通过以10,000RCF离心10分钟除去细胞碎片，并且收集上清液作为裂解物。总蛋白浓度使用布拉德福德测定(Bradford assay)，以白蛋白作为蛋白标准品(Pierce，赛默飞世尔科技公司)来测量。为了制备氧化的裂解物，Py8119细胞在单层细胞培养物中生长至汇合。用DPBS洗涤细胞三次，然后在DPBS用60μM次氯酸(HOCl)在37℃下温育1小时。收集解离的细胞，并且用DPBS洗涤以去除任何未反应的HOCl，以500RCF离心5分钟，并以1×107个细胞/mL的密度重新悬浮于DPBS中。细胞经受四次冻融循环，并且如上文所描述进行离心。收集可溶部分作为氧化的裂解物，并且使用布拉德福德测定分析蛋白质浓度。
裂解物负载的L-SNA的合成。使用薄膜再水化方法将裂解物包封到脂质体中。简言之，将裂解物(正常的和氧化的)以1.0mg/mL的蛋白质浓度重新悬浮于DPBS中，并将每种溶液各1mL添加到含有10mg DOPC或10mg DPPC的小瓶中。使用液氮和在37℃水浴中超声处理，通过若干次冻融/超声处理循环形成脂质体，直到使用Malvern Zetasizer通过DLS测定的流体动力学直径低于100nm(表2)。孔径为100kDa(光谱公司)的切向流过滤(TFF)用于从脂质体溶液中去除任何未经包封的裂解物。在使用1％十二烷基硫酸钠破坏脂质体后，使用布拉德福德测定对包封在脂质体内的蛋白质进行定量。为了形成SNA，通过在T>TC下将20μM寡核苷酸与裂解物负载的脂质体溶液混合过夜，将胆固醇封端的寡核苷酸(5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT(间隔子-18(六乙二醇))2胆固醇-3'(SEQ ID NO:2))包埋到脂质体的外膜中。使用UV-vis光谱法(加利公司)在260nm处的吸收来确定寡核苷酸浓度。然后使用具有3KD分子量截断值的离心过滤单元(密理博)通过DNA将所得SNA浓缩至20μM，这也去除了任何未结合的DNA，并用DLS分析以确认成功的DNA功能化(表2)。
表2
Figure BDA0003931709310000321
Py8119模型中的抗肿瘤功效。将1×106个Py8119细胞通过皮下注射接种于雌性小鼠(Balb/C)的右侧腹股沟脂肪垫中。在接种后的第6天、第10天和第15天，通过肿瘤周围皮下注射(100μL中有5nmol DNA)向动物施用DOPC-SNA、DPPC-SNA、DOPC-Lys-SNA、DPPC-Lys-SNA、DOPC-OxLys-SNA、DPPC-OxLys-SNA或盐水(每组n＝4)。通过用卡尺测量长度和宽度并应用公式V＝L/2×W×W来计算肿瘤体积。使用公式Vrel＝V/V0计算相对肿瘤体积，其中V＝测量当天的体积，并且V0＝第一次注射当天的肿瘤体积。由于未经治疗的动物的肿瘤溃疡，所述研究在第24天停止。
结果
图11a示出了实验结果，其中DPPC-SNA和DOPC-SNA作为“仅佐剂”免疫治疗剂施用。因为没有鉴定出TNBC的TAA，所以产生了来自Py8119细胞的裂解物，并且然后用作抗原来源。这些裂解物包封到包含DOPC(DOPC-Lys-SNA)或DPPC(DPPC-Lys-SNA)的L-SNA中。在以5nmol CpG-1826和10μg裂解物的剂量在第6天、第10天和第15天施用L-SNA后，在体内比较两种构建体的抗肿瘤功效。结果显示，与施用盐水的动物相比，当施用DPPC-Lys-SNA时肿瘤生长减少大约60％，而施用DOPC-Lys-SNA的动物的肿瘤生长没有差异(图11b)，再次显示了抗肿瘤功效对L-SNA稳定性的依赖性。
如实例1所示，将氧化的裂解物并入到L-SNA的核中导致TNBC小鼠模型中抗肿瘤功效的显著增加。因此，为了确定肿瘤细胞氧化和L-SNA稳定性的作用是否是相加的，使用DOPC(DOPC-OxLys-SNA)和DPPC(DPPC-OxLys-SNA)合成了来自氧化的Py8119细胞的含有L-SNA的裂解物。在研究持续时间内，DPPC-OxLys-SNA显著抑制肿瘤生长(图11c)，而DOPC-OxLys-SNA在这些剂量的DNA和裂解物下效果较差。总之，这些数据表明裂解物制备方法和L-SNA稳定性的作用是协同的，当比较所有基于DPPC的L-SNA的研究终点时，这一趋势变得更加明显(图11d)。将裂解物包含到L-SNA(DPPC-Lys-SNA)中被证明是有效的，并且当来自氧化的细胞的裂解物被用作抗原源(DPPC-OxLys-SNA)时，观察到最大的抗肿瘤功效，揭示了抗原加工方法和脂质体稳定性两者在这些构建体中的重要性。
结论
在Py8119小鼠模型中，包封在用DPPC合成的L-SNA中的裂解物在延缓肿瘤生长方面比其DOPC类似物更有效；当将氧化的Py8119细胞的裂解物并入到L-SNA支架中时，这一趋势变得更加明显，揭示了裂解物并入方法与L-SNA稳定性之间的协同作用。然而，应注意，实例2中使用的DOPC SNA在不同于实例1的TNBC模型中施用(实例1中为EMT6，并且实例2中为4T1和Py8119)。进一步地，在实例2中施用的佐剂DNA的剂量是实例1中所使用的剂量的50％。
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20、M.L.Grant、N.Shields、S.Neumann、K.Kramer、A.Bonato等人,将树突状细胞和B细胞组合用于将氧化的肿瘤抗原呈递至CD8(+)T细胞(Combining dendritic cells andB cells for presentation of oxidised tumour antigens to CD8(+)T cells.)《临床和翻译免疫学(Clinical&translational immunology)》6,e149-e149(2017)。
21、C.L.Chiang、L.E.Kandalaft、J.Tanyi、A.R.Hagemann、G.T.Motz等人,用经自体次氯酸氧化的卵巢癌裂解物致敏的树突状细胞疫苗引发有效的广谱抗肿瘤免疫：从实验室到床边(A dendritic cell vaccine pulsed with autologous hypochlorous acid-oxidized ovarian cancer lysate primes effective broad antitumor immunity:frombench to bedside.)《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》19,4801-4815(2013)。
22、J.Marcinkiewicz,(中性粒细胞氯胺：先天免疫与获得性免疫之间缺失的联系(Neutrophil Chloramines:Missing Links Between Innate and Acquired Immunity.)《今日免疫学(Immunol.Today)》18,577-580(1997)。
23、J.Marcinkiewicz、B.M.Chain、E.Olszowska、S.Olszowski、J.M.Zgliczyński,由于卵清蛋白的氯化而增强其免疫原性性质(Enhancement of Immunogenic Propertiesof Ovalbumin as a Result of its Chlorination.)《国际生物化学杂志(Int.J.Biochem.)》23,1393-1395(1991)。
24、M.E.D.Allison、D.T.Fearon,含醛抗原的免疫原性增强：先天免疫与获得性免疫之间的可能联系(Enhanced Immunogenicity of Aldehyde-Bearing Antigens:APossible Link Between Innate and Adaptive Immunity.)《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》30,2881-2887(2000)。
25、P.G.Coulie、B.J.Van den Eynde、P.van der Bruggen、T.Boon,T淋巴细胞识别的肿瘤抗原：癌症免疫疗法的核心(Tumour Antigens Recognized by T Lymphocytes:At the Core of Cancer Immunotherapy.)《自然综述：癌症(Nat.Rev.Cancer)》14,135-146(2014)。
26、S.Frey、A.Castro、A.Arsiwala、R.S.Kane,用于疫苗设计的生物纳米技术(Bionanotechnology for Vaccine Design.)《生物技术新见(Curr.Opin.Biotechnol.)》52,80-88(2018)。
27、D.J.Irvine、M.C.Hanson、K.Rakhra、T.Tokatlian,用于疫苗和免疫疗法的合成纳米颗粒(Synthetic Nanoparticles for Vaccines and Immunotherapy.)《化学评论(Chem.Rev.)》(美国华盛顿特区(Washington,DC,U.S.))115,11109-11146(2015)。
28、J.A.Kemp,M.S.Shim,C.Y.Heo,Y.J.Kwon,“组合”纳米医学：用于高效、靶向和安全的癌症疗法的多模式治疗剂的共递送("Combo"Nanomedicine:Co-Delivery ofMulti-Modal Therapeutics for Efficient,Targeted,and Safe Cancer Therapy.)《先进药物递送评论(Adv.Drug Delivery Rev.)》98,3-18(2016)。
29、C.A.Mirkin、R.L.Letsinger、R.C.Mucic、J.J.Storhoff,用于将纳米颗粒合理地组装成宏观材料的基于DNA的方法(A DNA-based method for rationally assemblingnanoparticles into macroscopic materials.)《自然(Nature)》382,607(1996)。
30、J.I.Cutler、E.Auyeung、C.A.Mirkin,球形核酸(Spherical nucleic acids.)《美国化学学会杂志》134,1376-1391(2012)。
31、D.S.Seferos、A.E.Prigodich、D.A.Giljohann、P.C.Patel、C.A.Mirkin,多价DNA纳米颗粒缀合物稳定核酸(Polyvalent DNA Nanoparticle Conjugates StabilizeNucleic Acids.)《纳米快报(Nano Lett.)》9,308-311(2009)。
32、A.K.R.Lytton-Jean、J.M.Gibbs-Davis、H.Long、G.C.Schatz、C.A.Mirkin等人,肽核酸连接的经DNA修饰的金纳米颗粒和梳状聚合物聚集体的高度协同行为(HighlyCooperative Behavior of Peptide Nucleic Acid-Linked DNA-Modified Gold-Nanoparticle and Comb-Polymer Aggregates.)《先进材料(Adv.Mater.)》21,706-709(2009)。
33、J.-S.Lee、A.K.R.Lytton-Jean、S.J.Hurst、C.A.Mirkin,基于具有三环二硫化物部分的DNA的银纳米颗粒-寡核苷酸缀合物(Silver Nanoparticle-OligonucleotideConjugates Based on DNA with Triple Cyclic Disulfide Moieties.)《纳米快报》7,2112-2115(2007)。
34、G.P.Mitchell、C.A.Mirkin、R.L.Letsinger,DNA功能化量子点的程序化组装(Programmed Assembly of DNA Functionalized Quantum Dots.)《美国化学学会杂志》121,8122-8123(1999)。
35、J.I.Cutler、D.Zheng、X.Xu、D.A.Giljohann、C.A.Mirkin,多价寡核苷酸氧化铁纳米颗粒“点击”缀合物(Polyvalent Oligonucleotide Iron Oxide Nanoparticle“Click”Conjugates.)《纳米快报》10,1477-1480(2010)。
36、K.L.Young、A.W.Scott、L.Hao、S.E.Mirkin、G.Liu等人,基于生物相容性二氧化硅壳的用于细胞内基因调控的中空球形核酸(Hollow Spherical Nucleic Acids forIntracellular Gene Regulation Based Upon Biocompatible Silica Shells.)《纳米快报》12,3867-3871(2012)。
37、R.J.Banga、N.Chernyak、S.P.Narayan、S.T.Nguyen、C.A.Mirkin,脂质体球形核酸(Liposomal Spherical Nucleic Acids.)《美国化学学会杂志》136,9866-9869(2014)。
38、A.J.Sprangers、L.Hao、R.J.Banga、C.A.Mirkin,用于调节细胞核中的长非编码RNA的脂质体球形核酸(Liposomal Spherical Nucleic Acids for Regulating LongNoncoding RNAs in the Nucleus.)《Small(小型)》13,1602753(2016)。
39、B.Meckes、R.J.Banga、S.T.Nguyen、C.A.Mirkin,通过脂质尾DNA修饰增强脂质体球形核酸的稳定性和免疫调节活性(Enhancing the Stability and ImmunomodulatoryActivity of Liposomal Spherical Nucleic Acids through Lipid-Tail DNAModifications.)《小型》14,1702909(2017)。
40、A.F.Radovic-Moreno、N.Chernyak、C.C.Mader、S.Nallagatla、R.S.Kang等人,免疫调节球形核酸(Immunomodulatory Spherical Nucleic Acids.)《美国国家科学院院刊》112,3892-3897(2015)。
41、K.Skakuj、S.Wang、L.Qin、A.Lee、B.Zhang等人,用球形核酸激活缀合化学依赖性T细胞(Conjugation Chemistry-Dependent T-Cell Activation with SphericalNucleic Acids.)《美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)》140,1227-1230(2018)。
42、Z.Li、Y.Zhang、P.Fullhart、C.A.Mirkin,具有DNA嵌段共聚物两亲物的可逆和化学可编程胶束组装体(Reversible and Chemically Programmable Micelle Assemblywith DNA Block-Copolymer Amphiphiles.)《纳米快报》4,1055-1058(2004)。
43、C.M.Calabrese、T.J.Merkel、W.E.Briley、P.S.Randeria、S.P.Narayan等人,用于反义基因调控的生物相容性无限配位聚合物纳米颗粒-核酸缀合物(Biocompatibleinfinite-coordination-polymer nanoparticle–nucleic-acid conjugates forantisense gene regulation.)《德国应用化学国际版(Angew.Chem.,Int.Ed.)》54,476-480(2014)。
44、S.Zhu、H.Xing、P.Gordiichuk、J.Park、C.A.Mirkin,PLGA球形核酸(PLGASpherical Nucleic Acids.)《先进材料》30,1707113(2018)。
45、J.D.Brodin、A.J.Sprangers、J.R.McMillan、C.A.Mirkin,功能酶的DNA介导的细胞递送(DNA-Mediated Cellular Delivery of Functional Enzymes.)《美国化学学会杂志》137,14838-14841(2015)。
46、U.Bulbake、S.Doppalapudi、N.Kommineni、W.Khan,临床应用中的脂质体调配物：更新评论(Liposomal Formulations in Clinical Use:An Updated Review.)《药剂学(Pharmaceutics)》9,12(2017)。
47、A.F.Radovic-Moreno、N.Chernyak、C.C.Mader、S.Nallagatla、R.S.Kang等人,免疫调节球形核酸《美国国家科学院院刊》112,3892-3897(2015)。
48、C.Guan、N.Chernyak、D.Dominguez、L.Cole、B.Zhang等人,作为有效TLR7/8调节剂的基于RNA的免疫刺激性脂质体球形核酸(RNA-Based Immunostimulatory LiposomalSpherical Nucleic Acids as Potent TLR7/8Modulators.)《小型》10.1002/smll.201803284,e1803284(2018)。
49、Z.N.Huang、L.E.Cole、C.E.Callmann、S.Wang、C.A.Mirkin,球形核酸中的序列多重性(Sequence Multiplicity within Spherical Nucleic Acids.)《ACS纳米(ACSNano)》14,1084-1092(2020)。
50、J.Vollmer、R.Weeratna、P.Payette、M.Jurk、C.Schetter等人,具有不同免疫刺激活性的三个CpG寡脱氧核苷酸类别的表征(Characterization of Three CpGoligodeoxynucleotide Classes with Distinct Immunostimulatory Activities.)《欧洲免疫学杂志》34,251-262(2004)。
51、Y.Kumagai、O.Takeuchi、S.Akira,TLR9作为识别DNA的关键受体(TLR9as aKey Receptor for the Recognition of DNA.)《先进药物递送评论》60,795-804(2008)。
52、B.P.Gross、A.Wongrakpanich、M.B.Francis、A.K.Salem、L.A.Norian,基于治疗性微粒的肿瘤裂解物疫苗减少小鼠乳腺癌的自发转移(A Therapeutic Microparticle-Based Tumor Lysate Vaccine Reduces Spontaneous Metastases in Murine BreastCancer.)《美国药剂学科学家协会杂志(AAPS J.)》16,1194-1203(2014)。
53、Z.Li、Y.Qiu、W.Lu、Y.Jiang、J.Wang,三阴性乳腺癌的免疫治疗干预(Immunotherapeutic interventions of Triple Negative Breast Cancer.)《转化医学杂志(Journal of Translational Medicine)》16,147(2018)。
54、J.Stagg、B.Allard,三阴性乳腺癌的免疫治疗方法：最新研究和临床前景(Immunotherapeutic Approaches in Triple-Negative Breast Cancer:LatestResearch and Clinical Prospects.)《医学肿瘤学的治疗进展(Ther.Adv.Med.Oncol.)》5,169-181(2013)。
55、C.Anders、L.A.Carey,理解和治疗三阴性乳腺癌(Understanding andTreating Triple-Negative Breast Cancer.)《肿瘤学(Oncology)》22,1233-1243(2008)。
56、F.Andre、C.C.Zielinski,用于用目前批准的药剂治疗转移性三阴性乳腺癌的最佳策略(Optimal Strategies for the Treatment of Metastatic Triple-NegativeBreast Cancer with Currently Approved Agents.)《肿瘤学年鉴(Ann.Oncol.)》23增刊6,vi46-51(2012)。
57、C.K.Anders、L.A.Carey,患有三阴性乳腺癌的患者的生物学、转移模式和治疗(Biology,Metastatic Patterns,and Treatment of Patients with Triple-NegativeBreast Cancer.)《临床乳腺癌(Clin.Breast Cancer)》9增刊2,S73-S81(2009)。
58、M.Fedele、L.Cerchia、G.Chiappetta,乳腺癌的上皮细胞向间质细胞的转变：聚焦基底样癌(The Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Breast Cancer:Focuson Basal-Like Carcinomas.)《癌症》9,134(2017)。
59、Y.Su、N.R.Hopfinger、T.D.Nguyen、T.J.Pogash、J.Santucci-Pereira等人,使用DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂对三阴性乳腺癌细胞的上皮间质转化的表观遗传重编程(Epigenetic Reprogramming of Epithelial Mesenchymal Transition inTriple Negative Breast Cancer Cells with DNA Methyltransferase and HistoneDeacetylase Inhibitors.)《实验与临床癌症研究杂志(J.Exp.Clin.Cancer Res.)》37,314(2018)。
60、K.J.Meade、F.Sanchez、A.Aguayo、N.Nadales、S.G.Hamalian等人,富含预后不利的LCN2轴的转移性乳腺癌细胞的分泌液诱导抗炎MSC作用和肿瘤支持性抑制前肺(Secretomes from metastatic breast cancer cells,enriched for a prognosticallyunfavorable LCN2 axis,induce anti-inflammatory MSC actions and a tumor-supportive premetastatic lung.)《肿瘤靶标(Oncotarget)》10,3027-3039(2019)。
61、L.G.Ellies、C.Kuo,PyVmT Luminal和EMT细胞系表现出原位和尾静脉转移的特征性模式(PyVmT Luminal and EMT Cell Lines Exhibit Characteristic Patternsof Orthotopic and Tail Vein Metastasis.)《癌症研究(Cancer Research)》73,C91-C91(2013)。
62、T.Biswas、J.Yang、L.Zhao、L.Sun,摘要P2-04-07：对乳腺肿瘤的原位和转移进展进行建模以评估TGF-β抑制剂在临床前环境中的疗效(Abstract P2-04-07:Modelingorthotopic and metastatic progression of mammary tumors to evaluate theefficacy of TGF-βinhibitors in a pre-clinical setting.)《癌症研究》72,P2-04-07-P02-04-07(2012)。
63、J.L.Christenson、K.T.Butterfield、N.S.Spoelstra、J.D.Norris、J.S.Josan等人,MMTV-PyMT和衍生的Met-1小鼠乳腺肿瘤细胞作为用于研究雄激素受体在三阴性乳腺癌进展中的作用的模型(MMTV-PyMT and Derived Met-1 Mouse Mammary Tumor Cells asModels for Studying the Role of the Androgen Receptor in Triple-NegativeBreast Cancer Progression.)《激素与癌症(Horm.Cancer)》8,69-77(2017)。
64、M.Ouzounova、E.Lee、R.Piranlioglu、A.El Andaloussi、R.Kolhe等人,单核细胞和粒细胞髓样衍生抑制细胞在转移级联期间差异调节时空肿瘤可塑性(Monocytic andGranulocytic Myeloid Derived Suppressor Cells Differentially RegulateSpatiotemporal Tumour Plasticity During Metastatic Cascade.)《自然通讯(Nat.Commun.)》8,14979-14979(2017)。
65、S.Barnes,“EMT-6同基因乳腺肿瘤模型——用于免疫肿瘤学研究的强有力工具(EMT-6Syngeneic Breast Tumor Model–A Powerful Tool for Immuno-OncologyStudies.)”可从https://www.mibioresearch.com/knowledge-center/emt-6-syngeneic-breast-tumor-model-a-powerful-tool-for-immuno-oncology-studies/获得2020年3月2日访问。
66、Y.Krishnamachari、A.K.Salem,用于共递送抗原和CpG寡核苷酸的创新策略(Innovative Strategies for Co-Delivering Antigens and CpG Oligonucleotides.)《先进药物递送评论》61,205-217(2009)。
67、Z.M.Prokopowicz、F.Arce、R.Biedron、C.L.-L.Chiang、M.Ciszek等人,次氯酸：一种有助于抗原加工、交叉引发和诱导适应性免疫的天然佐剂(Hypochlorous Acid:ANatural Adjuvant That Facilitates Antigen Processing,Cross-Priming,and theInduction of Adaptive Immunity.)《免疫学杂志(J.Immunol.)》184,824-835(2010)。
68、C.L.Chiang、L.E.Kandalaft、J.Tanyi、A.R.Hagemann、G.T.Motz等人,用经自体次氯酸氧化的卵巢癌裂解物致敏的树突状细胞疫苗引发有效的广谱抗肿瘤免疫：从实验室到床边《临床癌症研究：美国癌症研究协会的官方杂志(Clinical cancer research:anofficial journal of the American Association for Cancer Research)》19,4801-4815(2013)。
69、N.I.Ho、L.G.M.Huis In't Veld、T.K.Raaijmakers、G.J.Adema,佐剂增强树突状细胞的交叉呈递：更有效疫苗的关键？(Adjuvants Enhancing Cross-Presentation byDendritic Cells:The Key to More Effective Vaccines？)《免疫学前沿(Front.Immunol.)》9,2874-2874(2018)。
70、N.R.Maimela、S.Liu、Y.Zhang,CD8+T细胞在肿瘤微环境中的命运(Fates ofCD8+T cells in Tumor Microenvironment.)《计算和结构生物科技期刊(Comput.Struct.Biotechnol.J.)》17,1-13(2018)。
71、P.S.Kim、R.Ahmed,癌症和慢性感染中应答性T细胞的特征(Features ofResponding T cells in Cancer and Chronic Infection.)《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)》22,223-230(2010)。
72、A.M.Lesokhin、T.Merghoub、J.D.Wolchok,髓源性抑制细胞和CD8(+)T细胞免疫疗法的功效(Myeloid-Derived Suppressor Cells and the Efficacy of CD8(+)T-cell Immunotherapy.)《肿瘤免疫学(OncoImmunology)》2,e22764-e22764(2013)。
S.Wang、L.Qin、G.Yamankurt、K.Skakuj、Z.Huang等人,使用球形核酸的理性疫苗学(Rational Vaccinology with Spherical Nucleic Acids.)《美国国家科学院院刊》116,10473(2019)。
73、Callmann,C.E.、Cole,Lisa E.、Kusmierz,Caroline D.、Huang,Ziyin、Horiuchi,Dai、Mirkin,Chad A.,作为用于三阴性乳腺癌的治疗剂的肿瘤细胞裂解物负载的免疫刺激性球形核酸(Tumor cell lysate-loaded immunostimulatory sphericalnucleic acids as therapeutics for triple-negative breast cancer.)《美国国家科学院院刊》2020。
                         序列表
<110>  西北大学
<120>  作为有效的癌症免疫治疗剂的包封在脂质体球形核酸中的氧化的肿瘤细胞裂解物
<130>  IP40-220938
<150>  US 63/008,229
<151>  2020-04-10
<160>  3
<170>  PatentIn 3.5版
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>  合成引物
<400>  1
tccatgacgt tcctgacgtt                                                 20
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>  合成引物
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(20)
<223>  (间隔子-18（六乙二醇）)2胆固醇
<400>  2
tccatgacgt tcctgacgtt                                                  20
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>  合成引物
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(20)
<223>  Cy5-(间隔子-18（六乙二醇）)2胆固醇
<400>  3
tccatgacgt tcctgacgtt                                                  20

Claims (57)

1.一种具有基本上球形几何形状的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括与其缀合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂，并且其中氧化的肿瘤细胞裂解物被包封在所述纳米颗粒内。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述TLR激动剂是toll样受体1(TLR1)激动剂、toll样受体2(TLR2)激动剂、toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体4(TLR4)激动剂、toll样受体5(TLR5)激动剂、toll样受体6(TLR6)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂、toll样受体10(TLR10)激动剂、toll样受体11(TLR11)激动剂、toll样受体12(TLR12)激动剂、toll样受体13(TLR13)激动剂或其组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述TLR激动剂是toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂或其组合。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述TLR9激动剂是5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO:1)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(丙烯酸酯)或聚(甲基丙烯酸酯)纳米颗粒。
6.根据权利要求2或权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述TLR9激动剂是5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT(间隔子-18(Spacer-18)(六乙二醇))2胆固醇-3'(SEQ ID NO:2)。
7.根据权利要求1至4或6中任一项所述的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸包括亲脂性基团。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述亲脂性基团包括生育酚或胆固醇。
9.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述胆固醇是胆固醇基-三甘醇(胆固醇基-TEG)。
10.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中生育酚是生育酚衍生物、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚。
11.根据权利要求1至4或6至10中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括多个脂质基团。
12.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中至少一个脂质基团属于磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺脂质家族。
13.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中至少一个脂质基团是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DOPE-PEG-叠氮化物)、1,2-二油酰-sn–甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DOPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DPPE-PEG-叠氮化物)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DPPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)](DSPE-PEG-叠氮化物)以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)](DSPE-PEG-马来酰亚胺)、1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)或其组合。
14.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述多个脂质基团包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)。
15.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述多个脂质基团包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径为约20纳米(nm)至约150nm。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径小于或等于约100纳米。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径小于或等于约80纳米。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括约10至约200个寡核苷酸。
20.根据权利要求19所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括75个寡核苷酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的纳米颗粒，其中寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约0.5nmol至约25nmol:约5μg至约150μg。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的纳米颗粒，其中寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约5nmol寡核苷酸:20μg肿瘤细胞裂解物。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的纳米颗粒，其中所述氧化的肿瘤细胞裂解物源自暴露于次氯酸(HOCl)、过氧化氢、次氯酸钠、亚氯酸钠、硝酸或硫的肿瘤细胞。
24.根据权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述肿瘤细胞暴露于约10μM至约100μMHOCl。
25.根据权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述肿瘤细胞暴露于约60μM HOCl。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的纳米颗粒，其中所述肿瘤细胞裂解物源自乳腺癌细胞、腹膜癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、食道癌细胞、眼癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、喉癌细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞或其组合。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的纳米颗粒，其中所述肿瘤细胞裂解物源自三阴性乳腺癌(TNBC)细胞。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸是DNA。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸是RNA。
30.一种药物调配物，其包括根据权利要求1至29中任一项所述的纳米颗粒以及药学上可接受的载体或稀释剂。
31.一种制备脂质体纳米颗粒的方法，所述方法包括：
将肿瘤细胞暴露于氧化剂以产生氧化的肿瘤细胞；然后
从所述氧化的肿瘤细胞中分离裂解物；然后
使脂质膜与所述裂解物接触以产生包括所述裂解物的小单层囊泡(SUV)，所述裂解物包封在所述SUV中；然后
将寡核苷酸添加到所述SUV中以制备所述脂质体纳米颗粒。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述氧化剂是次氯酸(HOCl)。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述肿瘤细胞暴露于约10μM至约100μM所述氧化剂。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞暴露于约60μMHOCl。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是Toll样受体(TLR)激动剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述TLR激动剂是toll样受体1(TLR1)激动剂、toll样受体2(TLR2)激动剂、toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体4(TLR4)激动剂、toll样受体5(TLR5)激动剂、toll样受体6(TLR6)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂、toll样受体10(TLR10)激动剂、toll样受体11(TLR11)激动剂、toll样受体12(TLR12)激动剂、toll样受体13(TLR13)激动剂或其组合。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述TLR激动剂是toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体8(TLR8)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂或其组合。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述脂质体纳米颗粒的直径为约50纳米(nm)至约100纳米(nm)。
39.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述脂质体纳米颗粒的直径小于约100nm。
40.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述脂质体纳米颗粒的直径为约80nm。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是含有亲脂性拴系基团的寡核苷酸-脂质缀合物，其中所述亲脂性拴系基团被吸附到所述SUV的表面中。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述亲脂性拴系基团包括生育酚或胆固醇。
43.根据权利要求42所述的方法，其中生育酚是生育酚衍生物、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA或DNA。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述寡核苷酸是DNA。
46.根据权利要求31至45中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸。
47.根据权利要求31至46中任一项所述的方法，其中寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约0.5nmol至约25nmol:约5μg至约150μg。
48.根据权利要求31至47中任一项所述的方法，其中寡核苷酸与肿瘤细胞裂解物的比率为约5nmol寡核苷酸:20μg肿瘤细胞裂解物。
49.一种抗原组合物，其包括在药学上可接受的载体、稀释剂、稳定剂、防腐剂或佐剂中的根据权利要求1至29中任一项所述的纳米颗粒，或根据权利要求30所述的药物调配物，其中所述抗原组合物能够在哺乳动物受试者中产生免疫应答，包含抗体产生或保护性免疫应答。
50.根据权利要求49所述的抗原组合物，其中所述抗体应答是中和抗体应答或保护性抗体应答。
51.一种在受试者中产生对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求49或权利要求50所述的抗原组合物，由此在所述受试者中产生对癌症的免疫应答。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、眼癌、肝癌、胰腺癌、喉癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌或其组合。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。
55.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至29中任一项所述的纳米颗粒、根据权利要求30所述的药物调配物或根据权利要求49或权利要求50所述的抗原组合物，由此治疗所述受试者的癌症。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述施用是皮下的。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述施用是静脉内的、腹膜内的、鼻内的或肌肉内的。
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