KR20230004557A

KR20230004557A - 코로나바이러스 감염 치료

Info

Publication number: KR20230004557A
Application number: KR1020227038351A
Authority: KR
Inventors: 라스 브루스
Original assignee: 티엑스 메딕 에이비
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2023-01-06
Also published as: CN115461060A; CA3174977A1; WO2021211043A1; BR112022020881A2; BR112022019206A2; JP2023521919A; WO2021211044A1; AU2021255044A1; US20230126862A1; JP2023521916A; CA3174935A1; KR20230002698A; EP4135720A1; IL296600A; CN115551520A; US20230346827A1; AU2021255662A1; EP4135719A4; EP4135720A4; IL297275A

Abstract

본 발명은 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환 및 다른 HSPG 결합 병원체들에 의해 야기되는 감염의 치료에 사용하기 위한 용도의 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 감염과 연관하여 발생될 수 있는 염증성 질환, 이를 테면, ARDS 및 SIRS의 치료에 또한 관한 것이다.

Description

코로나바이러스 감염 치료

본 발명은 일반적으로 감염 질환 및 염증성 질환의 치료, 그리고 이러한 감염성 질환의 장기적인 후유증의 치료에 관한 것이며, 구체적으로, 이러한 코로나바이러스 감염 및 코로나바이러스 감염에 의해 야기될 수 있는 감염성 질환 및 염증성 질환의 치료에 있어서 덱스트란 설페이트의 용도에 관한 것이다.

코로나바이러스(CoV)는 포유류와 조류에서 질환을 일으키는 외피 관련 바이러스 군이다. 인간의 경우, 코로나바이러스 감염은 기도 감염으로 이어지는데, 이를 테면, 경미한 일부 경우 감기, 그리고 다른 치명적인 경우, 이를 테면, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 중동 호흡기 증후군 (MERS), 및 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)가 될 수 있다.

코로나바이러스는 위험 요소가 상당히 다양하다. 코로나바이러스는 주요 증상, 이를 테면, 열, 부어오른 인두편도로 인한 인후통과 같은 증상이 있는 감기의 원인일 수 있다. 코로나바이러스는 직접적인 바이러스성 폐렴이거나 또는 이차성 박테리아성 폐렴, 그리고 직접적인 바이러스성 기관지염 또는 이차성 박테리아성 기관지염을 유발할 수도 있다. 코로나바이러스는 또한 "장기적 코로나바이러스(long-COVID)"라고도 하는 장기적인(long-term) 장기(organ)의 질환 및 기능 쇠약과 관련될 수 있다.

2019년 12월에 중국의 우한(Wuhan)에서 폐렴 발병이 보고되었다. 2019년 12월 31일에 이 발병은 코로나바이러스의 새로운 변종으로 추적되었으며, 이는 World Health Organization (WHO)에서 잠정적 이름으로 2019-nCoV를 부여했으며, 나중에 International Committee on Taxonomy of Viruses에 의해 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 개명되었다. 우한 균주는 SARS-CoV와 유전적 유사성이 약 70%인 그룹 2B의 베타 코로나바이러스(β-CoV)의 새로운 균주로 확인되었다.

폐는 일반적으로 SARS-CoV-2의 가장 큰 영향을 받는 기관인데, 그 이유는 바이러스는 폐 내에서 폐의 유형 II 폐포 세포에 가장 풍부한 효소 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)를 통해 숙주 세포에 접근하기 때문이다. 이 바이러스는 "스파이크"(페플로머(peplomer))라고 불리는 특별한 표면 당단백질을 사용하여, ACE2에 연계되고, 숙주 세포로 진입한다. 스파이크 단백질과 ACE2 사이의 이러한 결합은 해당 숙주 세포 표면에 존재하는 헤파란 설페이트에 의해 도움을 받는다. 폐포 질환이 진행됨에 따라, 호흡 부전이 발생하고, 사망할 수 있다.

ACE2는 위, 십이지장, 직장 상피의 샘 세포들은 소장의 내피 세포, 뿐만 아니라 창자세포에서도 풍부하게 발현되기 때문에, 코로나바이러스는 위장 기관에도 영향을 미칠 수 있다.

SARS-CoV-2, 즉, COVID-19에 의해 유발되는 감염 질환은 발열, 기침, 호흡곤란 등의 일반적인 증상을 갖는다. 근육통, 가래 생성, 설사 및 인후통은 덜 일반적이다. 대부분의 경우 경미한 증상이 나타나지만, 일부는 폐렴으로 진행되며, 가장 심하게 영향을 받는 경우에는 COVID-19는 특히 장기적인 COVID 환자들에서 호흡 부전, 패혈성 쇼크, 과-염증, 산화 스트레스, 신경 손상, 미세혈전증, 섬유증 및/또는 다중-기관 부전을 유발하는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)으로 빠르게 진행될 수 있다.

SARS-CoV-2에 대한 백신을 개발하기 위해 전 세계적으로 많은 노력을 기울이고 있다. 현재, COVID-19 및 SARS-CoV-2 감염에 대한 효과적인 치료법이 없으며, 손상된 조직에 대한 더 장기적인 유해한 결과가 있다. 따라서, COVID-19를 비롯한 코로나바이러스 감염 치료에 효과적인 치료가 일반적으로 필요하다.

코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 치료를 제공하는 것이 일반적인 목적이다.

SARS-CoV-2 감염 및 COVID-19의 치료를 제공하는 것이 특정 목적이다.

이들 목적 및 다른 목적은 본 명세서에 개시된 실시형태들에 의해 충족된다.

본 발명의 측면은 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 이용하기 위한 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 측면은 급성 호흡기 장애 증후군(ARDS) 및 전신 염증 반응 증후군(SIRS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 사용하기 위한 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

본 발명의 추가 측면은 세포 표면 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 결합할 수 있는 병원체에 의한 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 이용하기 위한 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

본 명세서에 제시된 실험 데이터에서 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 코로나바이러스 감염 및 코로나바이러스 감염성 질환 및 기타 감염, 그리고 HSPG에 결합할 수 있는 병원체들에 의해 발생되는 이의 더 장기적인 결과의 치료에 이용될 수 있음을 나타낸다. 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염들은 또한 조직 저장소로부터 회복성 성장 인자들의 방출을 촉진시키고, 선별된 면역 세포에서 전-염증성 사이토킨을 억제시킬 수 있다. 이것은 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 코로나바이러스 감염 이후, 또는 ARDS 또는 SIRS에서 염증성 질환의 원인이 되는 순환 혈액에서 이들 사이토킨의 수준 증가를 방지하거나, 또는 적어도 유의적으로 억제한다는 것을 의미한다. 실시형태의 덱스트란 설페이트는 염증성 상태로 인한 염증성 반흔을 해결하고, 기능적 조직 재생을 촉진시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 이들 효과는 장기적 COVID-19 환자들게 중요한 대사 정상화 및 근육 및 간 개선을 유도하는 덱스트란 설페이트의 효과들이 포함된다.

추가의 목적 및 장점과 함께, 실시형태들은 첨부 도면과 함께 취해진 다음의 설명을 참조함으로써, 가장 잘 이해될 수 있다, 이때:
도 1은 아밀로이드-β와 PrP^c간의 단백질-단백질 상호작용에 대한 덱스트란 설페이트 경쟁을 보여준다.
도 2는 근위축성 측삭 경화증(ALS) 환자들에게서 저-분자량 덱스트란 설페이트(LMW-DS)의 투여 전 및 투여-후 2 시간 시점에 혈장 간세포 성장 인자(HGF) 수준을 도시한다.
도 3은 뇌 글루타메이트 수준에서 LMW-DS-유도된 변화를 도시하는 도표이다.
도 4a-4d는 미토콘드리아 포스포릴화 능력 측도로써 아데닌 뉴클레오타이드(ATP, ADP, AMP)의 LMW-DS-변화된 수준과 ATP/ADP 비율을 도시하는 도표들이다.
도 5a-5d는 산화성 및 환원 니코틴성 조효소의 LMW-DS-변화된 수준을 도시하는 도표들이다.
도 6a-6c는 산화성 스트레스를 나타내는 바이오마커들의 LMW-DS-변화된 수준을 도시하는 도표들이다.
도 7은 NO-매개된 질산화적 스트레스의 척도로써 질산염의 LMW-DS-변화된 수준을 도시하는 도표이다.
도 8a-8c는 N-아세틸아스파테이트(NAA) 및 이의 기질들의 LMW-DS-변화된 수준을 도시하는 도표들이다.
도 9는 외상 유도-후 30분 시점에, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 증량 투여분량을 단회 투여하거나, 또는 이의 투여없이, 중증 외상성 뇌 손상(sTBI)-후 2일차 시점에 희생된 래트(rat)의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 NAA의 농도를 보여준다. 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 12마리 동물의 평균이다. 표준 편차는 수직 막대로 표시된다. *대조군과 상당히 다름, p < 0.01. **sTBI 2일차와 상당히 다름, p < 0.01.
도 10은 LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 ATP의 농도를 보여준다. 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 12마리 동물의 평균이다. 표준 편차는 수직 막대로 표시된다. *대조군과 상당히 다름, p < 0.01. **sTBI 2일차와 상당히 다름, p < 0.01.
도 11은 LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 아스코르브산의 농도를 보여준다. 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 12마리 동물의 평균이다. 표준 편차는 수직 막대로 표시된다. *대조군과 상당히 다름, p < 0.01. **sTBI 2일차와 상당히 다름, p < 0.01.
도 12는 LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 글루타티온(GSH)의 농도를 보여준다. 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 12마리 동물의 평균이다. 표준 편차는 수직 막대로 표시된다. *대조군과 상당히 다름, p < 0.01. **sTBI 2일차와 상당히 다름, p < 0.01.
도 13은 LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 NAA의 농도를 보여준다. 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 12마리 동물의 평균이다. 표준 편차는 수직 막대로 표시된다. *대조군과 상당히 다름, p < 0.01. **sTBI 2일차와 상당히 다름, p < 0.01.
도 14는 LMW-DS 투여-후 혈액에서 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)의 변화를 도시한다.
도 15는 인간 소주(trabecular) 그물망 세포를 LMW-DS(4.0μM)의 부재 하에 (식염수) 또는 존재 하에서, 72시간 동안 형질전환 성장 인자 베타 2(TGFβ2)(1.0ng/ml)로 자극시킨 후, 피브로넥틴의 면역형광 라벨링(녹색) 및 Hoecsht를 사용한 핵 착색(청록색)을 보여준다. (15A) 대표적인 이미지는 공초점 Z-스택으로부터 최대 강도 투영이며, (15B) 막대그림은 피브로넥틴 착색의 정량화 (평균 ± SEM, n=6), P<0.05 (Wilcoxon 테스트)를 보여준다.
도 16은 전안부(anterior segment) 섬유증 모델을 유도하는 방법을 나타내는 개략도(16a)이다. 매주 2회 TGFβ1의 전방내 주사로 소주 그물망(TM)에서 섬유증이 유도되며, AqH 유출은 차단되고, IOP는 상승된다. (16b) 처음 14일 동안 IC TGFβ1 처리한-후, 추가 14일 동안 매일 피하로 염수 비히클 대조군, 또는 LMW-DS 처리로 IC TGFβ1을 처리하는 동안 IOP 측정을 보여주는 선 그래프. 정상적인 IOP 수준은 회색 음영 영역으로 표시된다. ** P<0.01, **** P<0.0001 (2-원(way) ANOVA). (16c + 16d) 염수 처리 그룹 및 LMW-DS 처리 그룹의 TM에서 면역반응성 라미닌 및 피브로넥틴 착색 수준을 나타내는 관련 막대그림과 함께, 전안부의 각도를 비롯한, 안구 조직 단편들의 대표적인 이미지, ** P<0.01 *** P<0.001 (t-테스트). (16e) 염수 처리 그룹 및 LMW-DS 처리 그룹의 망막 단편에서 RGC 마커 BRN3a를 보여주는 대표적인 이미지 및 막대그림, ** P<0.01 (Mann-Whitney 테스트), GCL - 신경절 세포층. (16f) 염수 처리 그룹 및 LMW-DS 처리 그룹의 분절된 RNFL(화살표)을 보여주는 대표적인 광간섭 단층촬영 이미지 및 관련 막대그림, **** P<0.0001 (t-테스트). 염수 그룹 n=5, LMW-DS 그룹 n=7. (16G) POAG에서 LMW-DS의 잠재적 메커니즘을 보여주는 개략도.
도 17 PBMC는 자극의 부재(배지, 자극안됨) 또는 자극 존재 하에서 배양되었다: (17a) LPS(0.01 ng/ml), (17b) 펩티도글리칸(30 ng/ml), (17c) 포크위드 미토겐(pokeweed mitogen)(1.0μg/ml), (17d) PHA-L(1.0μg/ml), (17e, 17f) CpG(0.2μM 또는 1.0μM) + IL-15(15 ng/ml), 또는 (17g, 17h) 사이토스팀(cytostim)(10μl/ml 또는 30μl/ml) + 비히클(0.027% 염수) 또는 LMW-DS(ILB^TM,60, 200 또는 600μg/ml), 24시간 동안. IL-6의 수준은 ELISA에 의해 상청액에서 정량화되었다. 데이터는 6명 또는 10-11명 (LPS) 공여자로부터 발생된 평균 ± SEM로 나타낸다. 데이터는 자극 + 비히클 백분율로 표시된다. (-)는 적어도 한 명의 공여자가 검출 한계 미만임을 나타낸다. ** 비히클 + LPS 및 600μg/ml ILB^TM + LPS 간의 Mann-Whitney U 테스트 비교, p=0.005. * 비히클 + PHA-L 및 600μg/ml ILB^TM + PHA-L 간의 Mann-Whitney U 테스트 비교, p=0.048.
도 18 (18a, 18d) LMW-DS(ILB^TM; 60μg/ml, 200μg/ml 또는 600μg/ml), (18b, 18e) 덱사메타손(3.0μM) 또는 (18c, 18f) 헤파린(2.0μg/ml, 6.0μg/ml 또는 20μg/ml)의 존재 하에 또는 부재 하에(비히클), 24시간 동안 LPS(0.01 ng/ml) 또는 펩티도글리칸(30 ng/ml)로 자극된, 또는 자극 없이(배지), 배양된 PBMC로부터 정제된 단핵구. IL-6의 수준은 세포 배양물에서 ELISA에 의해 상청액에서 정량화되었다. 데이터는 평균 ± SEM, n=10을 나타낸다. *는 감지 한계(5 pg/ml) 미만을 나타낸다. +P<0.05, +++P<0.001 자극에 대한 유의미적인 차이 (Mann Whitney U 테스트).
도 19 PBMC는 자극의 부재(배지, 자극안됨) 또는 존재 하에서 배양되었다: LPS(0.01 ng/ml), 펩티도글리칸(30 ng/ml), PHA-L(1.0μg/ml), CpG(0.2μM) + IL-15(15 ng/ml), 포크위드 미토겐(1.0μg/ml) 또는 사이토스팀(10μl/ml) + 비히클(0.027% 염수) 또는 LMW-DS(ILB^TM, 60, 200 또는 600μg/ml), 24시간 동안. 인터페론 감마(IFNγ) 수준은 Luminex에 의해 상청액에서 정량화되었다. 달리 표시되지 않는 한, 데이터는 12명의 공여자로부터 자극 백분율 + 비히클 및 평균 ± SEM으로 제시된다. (-) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 미만임을 나타낸다, (+) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 이상임을 나타낸다, (^) 11명의 공여자로부터 데이터를 나타내고, (*) 6명의 공여자로부터 데이터를 나타낸다. 비히클로 자극한 것과 비교: # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001, 그리고 N.S는 유의미적이지 않음을 나타낸다(Mann Whitney 테스트, 양방(two tailed)).
도 20 PBMC는 자극의 부재(배지, 자극안됨) 또는 존재 하에서 배양되었다: LPS(0.01 ng/ml), 펩티도글리칸(30 ng/ml), PHA-L(1.0μg/ml), CpG(0.2μM) + IL-15(15 ng/ml), 포크위드 미토겐(1.0μg/ml) 또는 사이토스팀(10μl/ml) + 비히클(0.027% 염수) 또는 LMW-DS(ILB^TM, 60, 200 또는 600μg/ml), 24시간 동안. 인터루킨 8/케모킨(C-X-C 모티프) 리간드 8(IL-8/CXCL8)의 수준은 Luminex에 의해 상청액에서 정량화되었다. 달리 표시되지 않는 한, 데이터는 12명의 공여자로부터 자극 백분율 + 비히클 및 평균 ± SEM으로 제시된다. (-) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 미만임을 나타낸다, (+) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 이상임을 나타낸다, (^) 11명의 공여자로부터 데이터를 나타내고, (*) 6명의 공여자로부터 데이터를 나타낸다. 비히클로 자극한 것과 비교: # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001, 그리고 N.S는 유의미적이지 않음을 나타낸다(Mann Whitney 테스트, 양방).
도 21 PBMC는 자극의 부재(배지, 자극안됨) 또는 존재 하에서 배양되었다: LPS(0.01 ng/ml), 펩티도글리칸(30 ng/ml), PHA-L(1.0μg/ml), CpG(0.2μM) + IL-15(15 ng/ml), 포크위드 미토겐(1.0μg/ml) 또는 사이토스팀(10μl/ml) + 비히클(0.027% 염수) 또는 LMW-DS(ILB^TM, 60, 200 또는 600μg/ml), 24시간 동안. 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 수준은 Luminex에 의해 상청액에서 정량화되었다. 달리 표시되지 않는 한, 데이터는 12명의 공여자로부터 자극 백분율 + 비히클 및 평균 ± SEM으로 제시된다. (-) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 미만임을 나타낸다, (+) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 이상임을 나타낸다, (^) 11명의 공여자로부터 데이터를 나타내고, (*) 6명의 공여자로부터 데이터를 나타낸다. 비히클로 자극한 것과 비교: # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001, 그리고 N.S는 유의미적이지 않음을 나타낸다(Mann Whitney 테스트, 양방).
도 22 PBMC는 자극의 부재(배지, 자극안됨) 또는 존재 하에서 배양되었다: LPS(0.01 ng/ml), 펩티도글리칸(30 ng/ml), PHA-L(1.0μg/ml), CpG(0.2μM) + IL-15(15 ng/ml), 포크위드 미토겐(1.0μg/ml) 또는 사이토스팀(10μl/ml) + 비히클(0.027% 염수) 또는 LMW-DS(ILB^TM, 60, 200 또는 600μg/ml), 24시간 동안. IL-1β의 수준은 Luminex에 의해 상청액에서 정량화되었다. 달리 표시되지 않는 한, 데이터는 12명의 공여자로부터 자극 백분율 + 비히클 및 평균 ± SEM으로 제시된다. (-) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 미만임을 나타낸다, (+) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 이상임을 나타낸다, (^) 11명의 공여자로부터 데이터를 나타내고, (*) 6명의 공여자로부터 데이터를 나타낸다. 비히클로 자극한 것과 비교: # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001, 그리고 N.S는 유의미적이지 않음을 나타낸다(Mann Whitney 테스트, 양방).
도 23 PBMC는 자극의 부재(배지, 자극안됨) 또는 존재 하에서 배양되었다: LPS(0.01 ng/ml), 펩티도글리칸(30 ng/ml), PHA-L(1.0μg/ml), CpG(0.2μM) + IL-15(15 ng/ml), 포크위드 미토겐(1.0μg/ml) 또는 사이토스팀(10μl/ml) + 비히클(0.027% 염수) 또는 LMW-DS(ILB^TM, 60, 200 또는 600μg/ml), 24시간 동안. IL-10의 수준은 Luminex에 의해 상청액에서 정량화되었다. 달리 표시되지 않는 한, 데이터는 12명의 공여자로부터 자극 백분율 + 비히클 및 평균 ± SEM으로 제시된다. (-) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 미만임을 나타낸다, (+) 적어도 하나의 레플리케이터가 정량화 한계 이상임을 나타낸다, (^) 11명의 공여자로부터 데이터를 나타내고, (*) 6명의 공여자로부터 데이터를 나타낸다. 비히클로 자극한 것과 비교: # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001, 그리고 N.S는 유의미적이지 않음을 나타낸다(Mann Whitney 테스트, 양방).
도 24 (24a, 24b) 세포 표면에 SARS-CoV-2의 흡착 모델 및 (24c) 스파이크 단백질과 ACE2 간의 상호작용이 LMW-DS에 의해 억제.
도 25는 COVID-19와 관련하여, LMW-DS의 유익한 효과 및 작용을 개략적으로 도시한다.
도 26 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 NAA 수준.
도 27 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 요산 수준.
도 28 LMW-DS 치료-후, 환자들의 혈청내 옥시퓨린의 합.
도 29 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 질산염 수준.
도 30 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 질산염 + 아질산염 수준.
도 31 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 MDA 수준.
도 32 LMW-DS 치료- 후, 환자들에서 혈청 ALA 수준.
도 33 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 CITR 수준.
도 34 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 ORN/CITR 수준.
도 35 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 α-토코페롤 수준.
도 36 LMW-DS 치료-후, 환자들에서 혈청 γ-토코페롤 수준.
도 37 RayBiotech® Life ELISA 검정을 이용하여 평가된, ACE-2와 상호작용하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 상에 LMW-DS(ILB®)의 영향. 데이터는 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다.
도 38은 덱스트란 설페이트 치료-후, ALS 환자들에서 혈청 락테이트 수준을 개략적으로 도시한다.
도 39는 덱스트란 설페이트 치료-후, ALS 환자들에서 ALSAQ-40 ADL 점수를 개략적으로 도시한다.
도 40은 덱스트란 설페이트 치료-후, ALS 환자들에서 혈청 미오글로빈 수준을 개략적으로 도시한다.
도 41은 덱스트란 설페이트 치료-후, ALS 환자들에서 혈청 크레아틴 키나제 수준을 개략적으로 도시한다.
도 42는 덱스트란 설페이트 치료-후, ALS 환자들에서 혈청 간세포 성장 인자(HGF) 수준을 개략적으로 도시한다.
도 43은 덱스트란 설페이트 치료-후, ALS 환자들의 혈청내 총 빌리루빈 수준을 도시한다.

본 발명은 일반적으로 감염 질환 및 염증성 질환의 치료, 그리고 이러한 감염성 질환의 더 장기적인 후유증의 치료에 관한 것이며, 구체적으로, 이러한 코로나바이러스 감염 및 코로나바이러스 감염에 의해 야기될 수 있는 감염성 질환 및 염증성 질환의 치료에 있어서 덱스트란 설페이트의 용도에 관한 것이다.

코로나바이러스(CoV)는 아과(subfamily) 오쏘코로나비리네(Orthocoronavirinae), 과(family) 코로나비리데(Coronaviridae), 목(order) 니도바이러스성(Nidovirales), 및 영역 리보비리아(Riboviria)로 구성된다. 이들은 포지티브-센스 단일-가닥으로된 RNA 게놈 및 나선형 대칭의 뉴클레오캡시드를 갖는 외피 바이러스다. 6종의 인간 코로나바이러스가 알려져 있으며, 한 종은 두 개의 다른 균주로 세분화되어, 총 7종의 인간 코로나바이러스 균주가 된다. 이들 균주 중 4개 균주는 일반적으로 경미한 감기 증상을 만들어낸다; 속(genus) β-CoV의 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 속(genus) β-CoV의 인간 코로나바이러스 HKU1(HCoV-HKU1), 속(genus) α-CoV의 인간 코로나바이러스 229E(HCoV-229E), 그리고 속(genus) α-CoV의 인간 코로나바이러스 NL63(HCoV-NL63). 세 가지 균주들은 잠재적으로 심각한 증상을 만들어낸다; 이들 세 가지 균주는 모두 β-CoV 균주들이다; 중동 호흡기 증후군-관련된 코로나바이러스(MERS-CoV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV 또는 SARS-CoV-1) 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 코로나바이러스 및 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환은 포유류, 바람직하게는 인간, 대상체 또는 환자에서 임의의 코로나바이러스 및 이러한 코로나바이러스에 의해 야기되는 감염 또는 감염성 질환을 지칭한다. 실시형태들에서, 상기 코로나바이러스는 MERS-CoV, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 코로나바이러스는 MERS-CoV의 경우 MERS, SARS-CoV의 경우 SARS, 그리고 SARS-CoV-2의 경우 COVID-19로 이루어진 군으로부터 선택된 코로나바이러스 감염성 질환을 야기할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2이며, 상기 코로나바이러스 감염성 질환은 COVID-19이다.

본 발명은 코로나바이러스 감염 및 코로나바이러스 감염성 질환 및 이의 결과의 예방, 억제 및/또는 치료에 있어서 덱스트란 설페이트의 용도와 관련된다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 SARS-CoV-2에 감염된 자들의 초기 감염, 질환 진행 및 유해한 조직 반응과 관련된 다중-모드 작용 기전을 가지고 있다(도 25). 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 장기적 COVID 및 포스트-COVID 상태로도 지칭되는, COVID-19 증상의 장기간 영향으로부터 고통을 받고 있는 환자들에게 긍정적인 효과를 또한 갖는다.

이러한 다중-모드 작용 메커니즘에는 초기 감염 단계에서 숙주-병원체 단백질-단백질 상호작용의 파괴가 내포되고, 이로 인하여 표적 분자, 이를 테면, SARS-CoV-2의 경우 ACE2에 이들 코로나바이러스의 결합이 억제 또는 진압되고, 이로 인하여 숙주 세포에 이들 바이러스의 접근을 막거나, 또는 적어도 억제된다.

도 24a 및 24b에 개략적으로 나타낸 것과 같이, SARS-CoV-2의 흡착 및 세포내 진입은 다른 베타코로나바이러스와 마찬가지로, 스파이크 당단백질(SPG)에 의해 중개된다. SPG는 이의 수용체, 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)와 상호작용할 뿐만 아니라, 글리코사미노글리칸, 이를 테면, 헤파란 설페이트(HS)-헤파란 설페이트 프로테오글리칸 형태(HSPG)로 대부분의 포유동물 세포 표면에서 발견됨-에 또한 결합한다. 세포 표면의 테터링된 HS에 SPG가 결합함으로써, 세포 표면에서 바이러스 입자의 국소 농도가 증가되고, SPG의 ACE2 결합이 촉진된다(도 24b). 가용성의, 테더링되지 않은 덱스트란 설페이트는 수용체 제시-전, HS로서 SPG에 결합할 수 있고, 이로 인하여 세포 표면의 HSPG 및 ACE2에 대한 SPG의 결합이 억제되고, 감염된 대상체들에서 코로나바이러스, 이를 테면, SARS-CoV-2의 국소 농도, 흡착 및 세포 진입을 막거나, 또는 적어도 유의적으로 감소시킨다(도 24c). 따라서, 실시형태들의 덱스트란 설페이트은 코로나바이러스 감염의 방지 또는 적어도 억제에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 대상체가 일단 코로나바이러스에 감염되면, 세포 표면 상에서 코로나바이러스와 ACE2 및 HSPG 간의 상호작용을 간섭함으로써, 대상체의 신체에서 코로나바이러스의 확신 및 복제를 제한시킬 수 있다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 코로나바이러스의 전파, 즉, 집단내 코로나바이러스의 확산을 또한 감소시킬 수 있다. 좀더 상세하게, 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 이들 코로나바이러스가 인간 세포에 접근하는 것을 억제시켜, 바이러스 복제 및 감염된 세포로부터의 후속 바이러스 발산(shedding)을 억제한다. 이러한 감소된 바이러스 발산 부하는 대상체 신체에서 확산을 제한함으로써, 대상체 및 감염된 대상체가 다른 대상체들에게 코로나바이러스를 퍼뜨릴 가능성이 적기 때문에, 집단에 이익이 된다.

이로 인하여, 덱스트란 설페이트는 바이러스 입자 상의 SPG에 결합함으로써, ACE2 수용체와 SPG 간의 상호작용을 방해함으로써, 도 24a-24c, 37에 도시된 바와 같이 단계 I(조기 감염, 도 25)에서 의학적 효과를 갖는다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 조직 복구 성장 인자들, 이를 테면, 간세포 성장 인자(HGF)의 대사 정상화 및 활성화에 또한 영향을 미친다(도 2, 42). 실시형태들의 덱스트란 설페이트의 이러한 작용들은 폐 단계(단계 II, 도 25) [여기서 상기 바이러스는 폐렴을 유발할 수 있고, 성장 인자-매개된 반흔-없는 조직 복구에 영향을 줌으로써, 대상체의 호흡기 조직에 부정적인 영향을 미칠 수 있음] 동안 감염된 대상체에서 코로나바이러스의 부정적인 영향을 억압하는데 중요한다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 자리잡은 반흔을 해소시키고, 되돌리는 능력이 있어, 손상된 조직을 또한 치유할 수 있다. 또한, 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 개선된 미토콘드리아 기능에서 보여지는 것과 같이, 세포에서 대사 정상화를 유도할 수 있다(도 4a-4d, 27-28; 표 5-8, 15-18).

좀더 상세하게, 이 실시형태의 덱스트란 설페이트는 다른 무엇보다도 미토콘드리아 기능을 보호하고, 산화 스트레스를 감소시키고, 항산화 상태 회복 개선, ATP 생산 및 대사를 보존하여 미토콘드리아 ATP 에너지 공급 보호, 덱스트란 설페이트에 의해 유도되는 모든 미토콘드리아 포스포릴화 능력의 정상화시킨다. 결과적으로, 덱스트란 설페이트는 손상 또는 질환에 노출된 세포에서 미토콘드리아 기능을 정상화시키고, 보호하고, 그리고 보존할 수 있으며, 이것은 감염성 질병과 싸울 수 있는 최적의 기능 세포를 갖는 데 중요하다.

이 실시형태의 덱스트란 설페이트는 이로 인하여, 조직 복구 성장 인자들을 활성화시키고, 대사 정상화를 유도함으로써, 감염의 단계 II (폐 단계)에서 의학적 효과를 갖는다(도 25).

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 급성 호흡기 장애 증후군(ARDS), 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 폐혈 쇼크, 파종 혈관내 응고(DIC) 및 심지어 장기(organ) 부전을 비롯한 임상적 증상과 연합된 과염증 단계에서 또한 효과가 있다. 실제로, 심하게 앓고 있는 환자들은 DIC를 추가로 유발하고, 폐포 모세혈관을 비롯한 말초 미세혈전증을 유발할 수 있는 상당한 염증 반응을 보이는데, 이것은 영향을 받은 혈관에 미세응고를 일으킨다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 항-염증제로 나타났으며, 따라서 대상체의 사이토킨 폭풍 및 과염증 그리고 이 과염증으로 인한 유해한 결과를 해소시키거나, 또는 최소한 감소시킬 수 있다(도 17a, 17d, 18a, 19-23). 덱스트란 설페이트는 항응고 효과가 또한 있어, 심하게 앓고 있는 환자들에서 볼 수 있는 DIC와 미세응고(microclots)의 퇴치에 유용할 것이다(도 14).

덱스트란 설페이트의 항-염증 효과는 면역계의 특이적 세포들에 작용하고, 이들 세포에 의해 방출되는 전-염증성 사이토킨을 선택적으로 감소시킨다는 점에서 선택적이다. 좀더 상세하게, 본 명세서에 제시된 실험 데이터에서는 덱스트란 설페이트는 단핵구 및 T 림프구를 특히 표적으로 하여, 활성화된 단핵구에 의해 IL-6, IL-10, IL-1β, IL-8, TNFα 및 IFNγ의 농도 의존적, 유의적인 감소, 그리고 활성화된 T 림프구에 의해 IL-6, IL-10 TNFα 및 IFNγ의 농도 의존적, 유의적인 감소를 일으킨다는 것을 보여준다(도 17-23). 예를 들어, 덱사메타손 및 기타 스테로이드에 비해 덱스트란 설페이트에 의한 전-염증성 사이토킨의 선택적 감소의 중요한 이점은 덱스트란 설페이트가 면역계에 의한 모든 사이토킨 생산에 영향을 미치지 않으며, 사이토킨 생산을 매우 낮은 수준으로 감소시키지 않는다는 점이다. 감염성 질환, 이를 테면, 코로나바이러스 감염에서, 이들 감염과 싸우기 위해서, 면역 체계의 통제된 활성화가 필요하다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 차단과 대조적으로, 과염증 상태, 이를 테면, ARDS, SIRS 및 패혈성 쇼크의 발병 위험을 감소시키는 면역계의 선택된 세포들로부터 선택된 전-염증성 사이토킨을 감소시키면서, 한편으로 여전히 면역계가 코로나바이러스 감염과의 싸움은 허용함으로써, 이러한 통제된 활성화를 이룰 수 있다.

항체-기반 염증성 치료에 비해 덱스트란 설페이트의 장점은 덱스트란 설페이트는 항체가 하는 것처럼 단일 전-염증성 사이토킨을 표적으로 하지 않고, 오히려 몇 가지 주요 전-염증성 사이토킨의 수준을 감소시킨다는 점이다. 또다른 장점은 항체와 비교하였을 때, 체내에서 덱스트란 설페이트의 반감기가 비교적 낮고(인간의 경우 C_max는 2~3시간임), 이로 인하여, 코로나바이러스 감염-후 과염증 위험이 있는 기간과 공시적으로 잘-특정된 기간 동안 항-염증 효과의 제어를 가능하게 한다.

COVID-19로부터 회복 중인 대상체들은 ARDS, SIRS 및 미세혈전증으로 인한 장기들의 섬유증을 앓을 수 있다. 이러한 장기들의 섬유증에는 폐 섬유증 뿐만 아니라 신장 섬유증 및 심근병증과 같은 기타 장기들의 섬유증도 내포될 수 있다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 항-혈전 효과를 가지며, 이 효과는 이러한 장기의 섬유증에 유용하다(도 15-16). 추가적으로, 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 항-섬유화 효과, 뿐만 아니라 섬유용해성 효과, 즉, 섬유증-후 기존 반흔을 제거하고, 반흔-없는 조직 재형성을 촉진할 수 있는 것으로 나타났다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 따라서, 모든 사이토킨 폭풍 및 과염증을 해결하고, 항-섬유화 및 항-응고 효과가 있어 감염의 단계 III(과염증 단계)에 의학적 효과가 있다(도 25).

장기적 COVID 영향, 이를 테면, 만성 피로 증후군 또는 근육성 뇌척수염이 대사적 조절 장애로 인해 발생한다는 새로운 증거가 있다. 좀더 상세하게, 미토콘드리아 기능 장애 및 산화/질산화적 스트레스는 ATP 생산 변경 및 산화/질산화 스트레스 증가를 비롯하여, 장기적 COVID 환자에서 볼 수 있다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 대사 기능 및 미토콘드리아 기능을 정상화시킴으로써, 이러한 대사적 조절장애 및 산화적/질산화적 스트레스에 대응할 수 있다, 도 4a-4d, 27-28; 표 5-8, 15-18).

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 트라이포스페이트 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오타이드의 농도에 대한 긍정적인 효과와 함께, 정상적인 미토콘드리아 관련된 에너지 대사를 회복시키는 데 효과적이었다. 사실, 덱스트란 설페이트 치료는 건강한 대조군과 비교하였을 때, 손상된 조직에서 ATP 수준과 NAA 농도를 거의 정상화할 수 있다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 산화적/질산화적 스트레스를 유의미적으로 감소시켰다. 구체적으로, 주요 수용성 뇌 항산화제인 아스코르브산과 주요 세포내 설프히드릴기(SH) 공여자인 글루타티온(GSH)의 수준이 유의적으로 개선되었다. 또한, 막 인지질의 다중불포화 지방산의 최종 산물이며, 반응성 산소종(ROS) 매개된 지질 과산화의 마커로 취해지는 말론디알데하이드(MDA) 수준은 덱스트란 설페이트 투여-후 상당히 감소된 것으로 나타냈다. 또한, 손상된 조직에서 아질산염/질산염의 합도 상당히 감소했다(도 30). 상기에서 설명한 산화적/질산화적트레스 마커는 모두 덱스트란 설페이트 치료-후 항산화/항질산화 상태의 회복이 개선되었음을 나타낸다(도 29-31, 33-36).

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 항-혈전, 항-섬유화 및 섬유용해성 효과를 가짐으로써, 본 발명의 단계 IV(회복 단계, 도 25)에서 또한 의학적 효과를 갖는다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 환자 세포들의 미토콘드리아 기능을 향상시켜, 대사 정상화를 추가적으로 유도한다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 근육 퇴화를 감소시키고, 근육 기능을 개선함으로써, 단계 IV(회복 단계, 도 25)에서 추가적인 의학적 효과를 갖는다(도 38 ~도 42).

COVID-19, 특히 장기적 COVID-19는 간 손상을 유발할 수 있음을 보여주는 새로운 데이터가 있다. 본 명세서에 제시된 실험 데이터에서 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 간 기능에 긍정적인 영향을 미쳤고, 인간 환자들에서 교란된 간 기능을 정상화할 수 있었는데(도 43), 이점은 단계 IV에 유익하다(도 25)는 것을 보여준다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 간세포 성장 인자(HGF)(이것은 장기의 재생 및 상처 치유에 중요한 역할을 한다)의 상당한 방출을 유도함으로써, 회복 단계(도 25)에 또한 유익한 효과가 있다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트에 의해 유도된 혈장 HGF 수준 상승(도 2, 42)은 SARS-CoV-2 감염 및 SARS-CoV-2 감염에 의해 유발된 염증 반응으로 인한 부정적인 영향을 받은 장기들 및 조직들의 조직 복구 및 재생 및 상처 치유를 유도함으로써, COVID-19 환자에게 유익하다.

실시형태들에서, 상기 코로나바이러스 감염성 질환은 MERS, SARS 및 COVID-19로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태들에서, 상기 코로나바이러스 감염성 질환은 COVID-19이다.

실시형태들에서, 상기 코로나바이러스 감염은 MERS-CoV, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2로 이루어진 군으로부터 선택된 코로나바이러스에 의해 야기되는 코로나바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태들에서, 상기 코로나바이러스 감염은 SARS-CoV-2에 의한 것이다.

본 발명은 또한 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료용 약물 제조용으로 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환을 예방, 억제 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 효과량을 상기 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환을 앓고 있는 대상체 또는 상기 코로나바이러스 감염의 감염성 질환을 앓을 위험에 처한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 이용된 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 치료는 상기 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 치유적인 처치를 반드시 의미하는 것은 아니며, 상기 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 단기적 증상 및 장기적 증상의 억제 또는 감소도 또한 포괄된다. 따라서, 치료에는 상기 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환과 연합된 이미 나타난 병리의 증상 개시를 지연, 예방하거나, 또는 해결하는 것을 비롯한, 상기 코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 개시 지연 또한 포괄된다.

코로나바이러스는 세포 표면 글리코사미노글리칸 헤파란 설페이트(HSPG)를 수용체로 사용하는 유일한 병원체가 아니다. 명백하게 대조적으로, HSPG는 아래 표 1과 같이 몇 가지 바이러스들과 세균 및 기생충 병원체에 대한 수용체 역할을 한다(Bartlett and Woo Park, Heparan Sulfate Proteoglycans in Infection, Glycans in Diseases and Therapeutics 2011: Chapter 2: 31-62, M.S.G

(ed.)).

표 1 - HSPG - 병원체 상호작용

이런 이유로, 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 세포 표면 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 결합할 수 있는, 그리고 구체적으로 최초 세포성 흡착 및/또는 후속적인 세포성 진입을 용이하게 하기 위해 HSPG에 결합할 수 있는 병원체에 의한 병원체 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 또한 이용될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 세포 표면 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 결합할 수 있는 병원체에 의한 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 이용하기 위한 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

특정 실시형태들에서, 상기 병원체는 최초 세포성 흡착 및/또는 후속적인 세포성 진입을 촉진시키기 위해 HSPG에 결합할 수 있다.

또다른 특정 실시형태에서, 상기 병원체는 HSPG의 헤파란 설페이트 부분에 결합할 수 있다.

실시형태들에서, 상기 병원체는 표 1에서 선택된 박테리아, 바이러스, 프리온 또는 기생충이다. 특정 실시형태들에서, 상기 병원체는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 이를 테면, HIV-1 및 HIV-2를 제외한 병원체이다.

실시형태들에서, 상기 병원체는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 보렐리아 부르고도르페리(Borrelia burgdorferi), 보르데테라 페르투시스(Bordetella pertussis), 클라미디아 뉴모니에(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 나이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝지티데스(Neisseria meningitides), 나이세리아 메닝지티데스(Neisseria meningitides), 오리엔티아 투슈투슈가무시(Orientia tsutsugamushi), 포르피로모나스 깅지발리스(Porphyromonas gingivalis), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모이네(Streptococcus pneumoniae) 및 에르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아다.

B. 안트라시스는 탄저병을 일으키고; B. 세레우스는 메스꺼움, 구토 및 설사를 일으키고; B. 부르고도르페리는 라임(Lyme) 질환을 일으키고; B. 페르투시스는 백일해를 일으키고; C. 뉴모니에는 폐렴을 일으키고; C. 트라코마티스는 클라미디아를 일으키고; H. 인플루엔자는 균혈증, 폐렴, 후두덮개염, 급성 박테리아성 뇌수막염, 봉와직염, 골수염, 및 감염성 관절염을 일으키고; H. 피로리는 위염과 위궤양을 초래하지만, 그러나 기타 광범위한 질환, 가령, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 철결핍성 빈혈, 동맥경화증, 알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 관상 동맥 질환, 치주염, 파킨슨 질환, 길랑-바레 증후군, 주사비, 건선, 만성 두드러기, 반점탈모, 각종 자가면역 피부 질환, 쇤라인-헤노흐(Henoch-

) 자반병, 혈액내 비타민 B12의 낮은 수준, 자가면역 호중구감소증, 항인지질 증후군, 형질구 질환, 반응성 관절염, 중심장액 맥락망막염, 개방각 녹내장, 안검염, 당뇨병, 대사증후군, 다양한 유형의 알레르기, 비-알콜성 지방 간 질환, 비-알콜성 지방간염, 간성 섬유증, 및 간 암과 연합되며; L. 모노사이토게네스는 리스테리아병을 일으키고, M. 투베르쿨로시스는 결핵을 일으키고; N. 고노로아에는 임질을 일으키고; N. 메닝지티데스는 수막염 및 다른 형태의 수막구균성 질환, 이를 테면, 수막구균혈증, 생명을 위협하는 패혈증을 일으키고; O. 츠츠가무시는 털진드기병을 일으키고; P. 깅지발리스는 치주의 질환을 일으키고, 뿐만 아니라 상부 위장관, 호흡기관 및 결장에서 질환, 그리고 알츠하이머 질환 및 류마티스 관절염과 또한 연계되며; P. 에어루기노사는 폐렴 및 각종 폐혈증 상태를 일으키고; S. 아우레우스는 농양을 비롯한 피부 감염, 호흡기 감염, 이를 테면, 부비강염, 및 식중독을 일으키고; S. 아갈락티에는 신생아 감염 패혈증, 폐렴 및 수막염을 비롯한 신생아 감염을 일으키고; S. 피오게네스는 피부 감염, 신생아 감염, 그러나 류마티스 열, 감염-후 급성 사구체신염 및 PANDAS를 일으키고; S. 뉴모니에는 폐렴을 일으키고; 그리고 Y. 엔테로콜리티카는 에르시니아증을 일으킨다.

실시형태들에서, 상기 병원체는 아데노-연합된 바이러스 유형 2(AAV2), 아데노바이러스, 코로나바이러스, 콕사키에바이러스, 사이토메갈로바이러스, 뎅기 바이러스(DENV), 구제역 질환 바이러스(FMDV), 단순 헤르페스 바이러스 1(HSV-1) 및 HSV-2, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 감마 헤르페스바이러스 8(HHV-8)(카포시 육종-연합된 헤르페스바이러스(KSHV)), 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1), 인간 유두종바이러스(HPV), 인간 T-세포 림프친화적 바이러스 유형 1(HTLV1), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 가성광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 리노바이러스, 신드비스 바이러스(SINV), 백시니아 바이러스(VACV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 및 황열 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스다.

또다른 실시형태에서, 상기 병원체는 AAV2, 아데노바이러스, 코로나바이러스, 콕사키에바이러스, 사이토메갈로바이러스, DENV, FMDV, HSV-1 및 HSV-2, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HHV-8, HPV, HTLV1, JEV, 가성광견병 바이러스, RSV, 리노바이러스, SINV, VACV, WNV 및 황열 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스다.

콕시케에바이러스는 무균성 뇌수막염을 일으키고; 사이토메갈로바이러스는 단핵구증, 및 폐렴을 일으키고; DENV는 뎅기 열을 일으키고; FMDV는 구제역 질환을 일으키고; HSV는 구순포진, 생식기 포진 및 전염성을 일으키고; B형 간염 바이러스는 B형 간염을 일으키고; C형 간염 바이러스는 C형 간염을 일으키고, 간세포성 암종 및 림프종을 일으키고; HHV-8는 카포시 육종, 원발성 삼출성 림프종, HHV-8-연합된 다중심정 캐슬맨 질환 및 KSHV 염증성 사이토킨 증후군을 일으키고; HPV는 전암 병변, 자궁경부암, HPV 양성 구인두암, 생식기 사마귀 및 후두 유두종증을 일으키고; HTLV1는 성인 T-세포 림프종 (ATL), HTLV-I-연합된 골수증, 포도막염, 및 스트롱일로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis)는 초-감염을 일으키고; JEV는 일본 뇌염을 일으키고; 가성광견병 바이러스는 아우제스키(Aujeszky's) 질환을 일으키고; RSV는 세기관지염 및 폐렴을 비롯한 기도 감염을 일으키고; 리노바이러스 감기를 일으키고; SINV는 신드비스 열을 일으키고; WNV는 웨스트 나일 열을 일으키고; 그리고 황열 바이러스는 황열을 일으킨다.

실시형태들에서, 상기 병원체는 기아르디아 람비야(Giardia lamblia), 레쉬마니아(Leishmania) spp., 엔세팔리토존(Encephalitozoon) spp., 네오스포라 카니눔(Neospora caninum), 플라스모디움(plasmodium) spp., 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 및 트립파노조마 크루지(trypanosoma cruzi)로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충이다.

기아르디아 람비야(Giardia lamblia)는 람블편모충증을 일으키고, 레쉬마니아(Leishmania) spp.는 리슈마니아증을 일으키고, 엔세팔리토존(Encephalitozoon) spp.는 미포자충증을 일으키고 네오스포라 카니눔(Neospora caninum)는 감염된 가축의 자연 유산의 원인이되며; 플라스모디움(plasmodium) spp.는 말라이아를 일으키고; 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)는 톡스플라미스증을 일으키고, 그리고 트립파노조마 크루지(trypanosoma cruzi)는 인간에서 샤가스병, 말에서의 구역과 수라, 소의 브루셀라병-유사한 질환을 일으킨다.

본 발명은 또한 세포 표면 HSPG에 결합할 수 있는 병원체에 의한 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료용 약물 제조용으로 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 세포 표면 HSPG에 결합할 수 있는 병원체에 의한 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 효과량을 세포 표면 HSPG에 결합할 수 있는 병원체에 의한 감염 또는 감염성 질환을 앓고 있는 대상체 또는 세포 표면 HSPG에 결합할 수 있는 병원체에 의한 감염 또는 감염성 질환을 앓을 위험에 처한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 이용된 세포 표면 HSPG에 결합할 수 있는 병원체에 의한 감염 또는 감염성 질환의 치료는 감염 또는 감염성 질환의 치유적인 처치를 반드시 의미하는 것은 아니며, 감염 또는 감염성 질환과 연합된 이미 나타난 병증의 증상을 억제 또는 감소시키거나, 또는 이를 해결하는 것들도 내포된다. 그러한 이유로, 치료에는 상기 감염 또는 감염성 질환 개시 지연, 및 이 감염 또는 감염성 질환과 연합된 증상의 개시 지연이 또한 포괄된다.

ARDS는 폐에 광범위한 염증이 빠르게 발병하는 것을 특징으로 하는 일종의 호흡 부전이다. ARDS는 패혈증, 췌장염, 외상, 폐렴 및 흡인으로 인해 발생할 수 있다. 기저 메커니즘은 폐의 미세한 기낭의 장벽을 형성하는 세포들에 대한 미만성 손상, 계면활성제 기능장애, 면역 체계의 활성화 및 혈액 응고에 대한 신체의 조절 기능 장애가 연루된다. 실제로, ARDS는 산소와 이산화탄소를 교환하는 폐의 능력을 손상시킨다. 성인의 진단은 호기-말 양압(PEEP)이 5cm H₂O를 초과함에도 불구하고, PaO₂/FiO₂ 비율(동맥 분압과 흡기 산소 비율)이 300mmHg 미만인 경우를 기준으로 한다.

SIRS는 전신에 영향을 미치는 염증 상태다. 이것은 감염성 또는 비-감염성 공격에 대한 신체의 반응이다. SIRS는 하나 또는 그 이상의 장기 또는 장기 시스템의 부전으로 빈번하게 연루되며, 급성 신장 손상, 쇼크 및 다발성 장기 기능 장애 증후군을 유발할 수 있다.

SIRS는 전신 염증, 장기의 기능 장애 및 장기의 부전과 관련된 심각한 상태다. 이것은 다양한 사이토킨이 비-정상적으로 조절되는 사이토킨 폭풍의 하위집합이다. SIRS는 또한 환자들이 SIRS의 기준을 충족하고, 감염이 의심되거나 또는 확증된 패혈증과 밀접한 관련이 있다. SIRS의 현시에는 36℃ 미만 또는 38℃ 이상의 체온, 분당 90회 이상 박동 심박수, 분당 20회 이상의 호흡과 함께 호흡빈삭(높은 호흡속도); 또는 4.3kPa(32mmHg) 미만의 이산화탄소의 동맥 분압, 백혈구 수가 4000개 세포/mm³(4×10⁹ 세포/L) 미만 또는 12,000개 세포/mm³(12×10⁹ 세포/L) 이상; 또는 10% 이상의 미성숙 호중구의 존재(띠 형태)들이 내포된다. 감염의 증거가 있거나 또는 증거 없이, 이러한 기준 중 두 가지 또는 그 이상이 충족되면 해당 환자들을 SIRS로 진단내릴 수 있다. SIRS 및 급성 장기의 기능 장애가 있는 환자들을 중증 SIRS라고 명명할 수 있다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트는 항-염증제로 나타났으며, 따라서 대상체의 사이토킨 폭풍 및 ARDS 및 SIRS와 연합된 염증을 해소시키거나, 또는 최소한 감소시킬 수 있다(도 17a, 17d, 18a, 19-23).

덱스트란 설페이트의 항-염증 효과는 면역계의 특이적 세포들에 작용하고, 이들 세포에 의해 방출되는 전-염증성 사이토킨을 선택적으로 감소시킨다는 점에서 선택적이다. 좀더 상세하게, 본 명세서에 제시된 실험 데이터에서는 덱스트란 설페이트는 단핵구 및 T 림프구를 특히 표적으로 하여, 활성화된 단핵구에 의해 IL-6, IL-10, IL-1β, IL-8, TNFα 및 IFNγ의 농도 의존적, 유의적인 감소, 그리고 활성화된 T 림프구에 의해 IL-6, IL-10 TNFα 및 IFNγ의 농도 의존적, 유의적인 감소를 일으킨다는 것을 보여준다(도 17-23). 예를 들어, 덱사메타손 및 기타 스테로이드에 비해 덱스트란 설페이트에 의한 전-염증성 사이토킨 감소의 중요한 이점은 덱스트란 설페이트가 사이토킨을 완전하게 차단시키지 않으며, 사이토킨 생산을 매우 낮은 수준으로 감소시키지 않는다는 점이다. 감염성 질환, 이를 테면, 코로나바이러스 감염에서, 이들 감염과 싸우기 위해서, 면역 체계의 통제된 활성화가 필요하다. 실시형태들의 덱스트란 설페이트는 ARDS 및 SIRS의 발병 위험을 감소시키는 면역계의 선택된 세포들로부터 선택된 전-염증성 사이토킨을 차단시키는 것과 대조적으로, 이를 감소시키면서 이러한 통제된 활성화를 이룰 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 ARDS 및 SIRS로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 사용하기 위한 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 ARDS의 예방, 억제 및/또는 치료를 위한 것이다.

또다른 실시형태에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 SIRS의 예방, 억제 및/또는 치료를 위한 것이다.

특정 실시형태들에서, 상기 염증성 질환은 감염, 이를 테면, 코로나바이러스 감염 또는 HSPG 결합 병원체에 의한 감염으로 인한 것이다.

본 발명은 또한 ARDS 및 SIRS로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료용 약물 제조용으로 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 염증성 질환 ARDS 및 SIRS로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료 방법에 더 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 효과량을 ARDS 및 SIRS로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환을 앓고 있거나, 또는 상기 염증성 질환을 앓을 위험에 처한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 이용된, ARDS 및 SIRS로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환 치료에 상기 염증성 질환의 치유적인 처치를 반드시 의미하는 것은 아니며, 상기 염증성 질환의 단기적 증상 및 장기적 증상의 억제 또는 감소도 또한 포괄된다. 따라서, 치료에는 염증성 질환과 관련된 증상의 개시 지연을 비롯한 감염 또는 감염성 질환 개시를 지연시키거나, 또한 장기적 병리, 이를 테면, 섬유증식성, 근병증 및 이러한 질환 후에 나타난 만성 피로 상태를 해결하는 것이 내포된다.

본 발명은 또한 SARS-CoV-2 감염으로 인한 장기간 영향의 COVID-19 증후를 예방, 억제 또는 치료에 사용을 위한 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.

장기적 영향 COVID-19 증후에는 장기 손상, 특히 대상자의 심장, 간 및 폐 손상이 내포된다. COVID-19로부터 회복-후, 몇 달 동안 실시한 영상 검사에서는 단지 경미한 COVID-19 증상만 경험한 사람들에게도 심장 근육에 지속적인 손상이 있는 것으로 나타났다. 더욱이, COVID-19는 폐의 작은 기낭(폐포)에 오래-지속되는 손상을 일으킬 수 있다. 그 결과적으로 생긴 반흔 조직은 장기적인 호흡 문제를 유발할 수 있다. 입원한 COVID-19 환자들의 상당 비율은 비정상적인 간 기능을 갖는다. 일반적인 장기적 증상들은 대개 피로, 숨가쁨, 기침, 심계항진 및 후각 장애다. 다른 증상으로는 흉통, 근육 및 관절 통증, 체중 감소, 위장 장애가 내포된다. 장기적 영향 COVID-19 환자들에서 보고된 임상 척도는 폐 기능 장애 및 폐 손상, 심근 염증과 같은 심혈관 영향, 뇌 변화 및 후각 및 미각 장애 (후각상실 및 후각감퇴)들이었다.

본 발명은 또한 SARS-CoV-2 감염으로 인한 장기간 영향의 COVID-19 증후를 예방, 억제 및/또는 치료에 사용을 위한 약물의 제작용으로 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 SARS-CoV-2 감염으로 인한 장기적 영향 COVID-19 증후의 예방, 억제 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 효과량을 SARS-CoV-2 감염으로 인한 장기적인 영향 COVID-19 증후를 앓고 있는 대상체 또는 SARS-CoV-2 감염으로 인한 장기적인 영향 COVID-19 증후를 앓을 위험에 처한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

하기에서, 덱스트란 설페이트의 (평균) 분자량 및 황 함량에 대한 언급은 덱스트란 설페이트의 임의의 약학적으로 수용가능한 염에 또한 적용된다. 그런 서유로, 덱스트란 설페이트의 약학적으로 수용가능한 염은 바람직하게는 하기 실시형태에서 논의된 바와 같이 평균 분자량 및 황 함량을 갖는다.

실시형태들의 바람직한 범위를 벗어난 덱스트란 설페이트는 하등한 효과 및/또는 세포 또는 대상체에게 부정적인 부작용을 일으키는 것으로 간주된다.

예를 들자면, 10,000 Da(10kDa)를 초과하는 분자량의 덱스트란 설페이트는 일반적으로 낮은 평균 분자량을 갖는 덱스트란 설페이트에 비해, 독성 대비 더 낮은 효과를 갖는다. 이는 바람직한 범위 내의 평균 분자량을 갖는 덱스트란 설페이트 분자와 비교하여, 더 큰 덱스트란 설페이트 분자(>10,000 Da)의 경우 대상에게 안전하게 투여될 수 있는 덱스트란 설페이트의 최대 용량은 더 낮다는 것을 의미한다. 결과적으로, 이러한 큰 덱스트란 설페이트 분자는 임상 용도에서 덱스트란 설페이트가 생체 내에서 대상에게 투여될 때 덜 적합하다.

덱스트란 설페이트는 설페이트화된 다당류, 특히, 설페이트화된 글루칸, 가령, 많은 포도당 분자로 만들어진 다당류다. 본 명세서에 정의된 평균 분자량은 개별 설페이트화된 다당류가 이 평균 분자량과는 다른 분자량을 가질 수 있지만, 그러나 평균 분자량은 설페이트화된 다당류의 평균 분자량을 나타낸다는 것을 의미한다. 이것은 또한 덱스트란 설페이트 샘플에 대한 이 평균 분자량 주변에 분자량의 자연 분포가 있을 것이라는 것을 암시한다.

덱스트란 설페이트의 평균 분자량, 또는 더 정확하게는 중량 평균 분자량(M_w)은 겔 배제/침투 크로마토그래피, 광 산란 또는 점도와 같은 간접적인 방법을 사용하여 전형적으로 측정된다. 이러한 간접적인 방법을 사용하여 평균 분자량을 결정하는 것은 칼럼 및 용리액 선택, 유속, 눈금측정(calibration) 절차 등, 여러 가지 요인에 따라 달라진다.

중량 평균 분자량(M_w):

, 수치보다는 분자 크기에 민감한 방법, 예를 들어, 광 산란 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법이 전형적이다. 정규 분포가 추정되는 경우, M_w의 각면에서 동일한 중량, 즉, M_w 미만의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 총 중량은 M_w 이상의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 총 중량과 동일하다. 파라미터 N _i 는 샘플 또는 배취(batch)에서 분자량이 M _i 인 덱스트란 설페이트 분자의 수를 나타낸다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 10,000 Da이거나, 또는 이 이하의 M_w를 갖는다. 특정 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 2,000 Da ~ 10,000 Da 범위 내의 M_w을 갖는다.

또다른 실시형태에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 2,500 Da ~ 10,000 Da 범위 내, 바람직하게는 3,000 Da ~ 10,000 Da 범위 내의 M_w을 갖는다. 특정 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 3,500 Da ~ 9,500 Da 범위 내, 이를 테면, 3,500 Da ~ 8,000 Da 범위 내의 M_w을 갖는다.

또다른 특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 4,500 Da ~ 7,500 Da, 이를 테면, 4,500 Da ~ 6,500 Da 또는 4,500 Da ~ 5,500 Da 범위 내의 M_w을 갖는다.

따라서, 일부 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 10,000 Da이거나 또는 이 미만의, 9,500 Da이거나 또는 이 미만의, 9,000 Da이거나 또는 이 미만의, 8,500 Da이거나 또는 이 미만의, 8,000 Da이거나 또는 이 미만의, 7,500 Da이거나 또는 이 미만의, 7,000 Da이거나 또는 이 미만의, 6,500 Da이거나 또는 이 미만의, 6,000 Da이거나 또는 이 미만의, 또는 5,500 Da이거나 또는 이 미만의 M_w을 갖는다.

일부 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 1,000 Da이거나 또는 그 이상의, 1,500 Da이거나 또는 그 이상의, 2,000 Da이거나 또는 그 이상의, 2,500 Da이거나 또는 그 이상의, 3,000 Da이거나 또는 그 이상의, 3,500 Da이거나 또는 그 이상의, 4,000 Da이거나 또는 그 이상의, 또는 4,500 Da이거나 또는 그 이상의 M_w을 갖는다. 이들 실시형태들 중 임의의 것은 M_w의 상한을 정의하는 상기에 제시된 실시형태들 중 임의의 것과 조합될 수 있으며, 이러한 조합은 10,000 Da이거나 또는 그 미만의 상한을 갖는다.

특정 실시형태들에서, 상기에서 제시된 바와 같이, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 M_w는 평균 M_w이며, 바람직하게는 겔 배제/침투 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 광 산란 또는 점도-기반 방법에 의해 측정된다.

수 평균 분자량(M_n):

, 전형적으로 말단 그룹 검정에 의해 유도되며, 가령, 핵 자기 공명(NMR) 분광법 또는 크로마토그래피. 정규 분포가 추정되는 경우, 덱스트란 설페이트 분자의 동일 수는 M_n의 각면에서 찾을 수 있는데, 가령, M_n 미만의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 수는 M_n 이상의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 수와 동일하다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 NMR 분광법으로 측정하였을 때, 1,850 ~ 3,500 Da 범위 내의 M_n을 갖는다.

특정 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 NMR 분광법으로 측정하였을 때, 1,850 Da ~ 2,500 Da 범위 내, 바람직하게는 1,850 Da ~ 2,300 Da 범위 내, 이를 테면, 1,850 Da ~ 2,000 Da 범위 내의 M_n을 갖는다.

따라서, 일부 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 3,500 Da이거나 또는 그 미만의, 3,250 Da이거나 또는 그 미만의, 3,000 Da이거나 또는 그 미만의, 2,750 Da이거나 또는 그 미만의, 2,500 Da이거나 또는 그 미만의, 2,250 Da이거나 또는 그 미만의, 또는 2,000 Da이거나 또는 그 미만의 M_n을 갖는다. 또한, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 1,850 Da이거나 또는 그 이상의 M_n을 갖는다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 단위 포도당 당(per) 2.5 ~ 3.0 범위 내의 평균 설페이트 수를 갖는다.

특정 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 단위 포도당 당(per) 2.5 ~ 2.8, 바람직하게는 2.6 ~ 2.7 범위 내의 평균 설페이트 수를 갖는다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 단위 포도당 당(per) 4.0 ~ 6.0 범위 내의 평균 설페이트 수를 갖는다.

특정 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 단위 포도당 당(per) 4.5 ~ 5.5, 바람직하게는 5.0 ~ 5.2 범위 내의 평균 설페이트 수를 갖는다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 M_n NMR 분광법으로 측정하였을 때, 1,850 ~ 3,500 Da 범위 내의 M_n을 갖고, 단위 포도당 당(per) 2.5 ~ 3.0 범위 내의 평균 설페이트 수를 갖고, 그리고 덱스트란 설페이트의 포도당 단위에서 C2 위치의 평균 설페이트화는 적어도 90%이다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트는 평균 단위 포도당 수 약 5.1, 단위 포도당 당(per) 2.6 ~ 2.7 범위 내의 평균 설페이트 수, 그리고 1,850 Da ~ 2,000 Da 범위 내의 M_n을 갖는다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트의 약제학적으로 허용 가능한 염은 덱스트란 설페이트의 나트륨 염이다. 특정 실시형태들에서, 상기 덱스트란 설페이트의 나트륨 염은 단위 포도당의 평균 수 약 5.1, 단위 포도당 당(per) 2.6 ~ 2.7 범위 내의 평균 설페이트 수, 그리고 Na⁺ 반대 이온이 내포된 2,100 Da ~ 2,300 Da 범위 내의 M_n을 갖는다.

실시형태들에서, 덱스트란 설페이트는 단위 포도당의 평균 수 5.1, 단위 포도당 당(per) 2.7의 평균 설페이트 수, NMR 분광법으로 측정하였을 때, Na⁺ 없이, 약 1,900-1,950 Da의 평균 M_n, NMR 분광법으로 측정하였을 때, Na⁺와 함께, 약 2,200-2,250 Da의 평균 M_n을 갖는다.

실시형태들에 따른 덱스트란 설페이트는 덱스트란 설페이트의 약제학적으로 허용 가능한 염, 이를 테면, 나트륨 염 또는 칼륨 염으로 제공될 수 있다.

실시형태들에 따른, 현재 선호되는 덱스트란 설페이트는 WO 2016/076780에서 기술된다.

상기 대상체는 바람직하게는 포유류 대상체, 더욱 바람직하게는 영장류, 특히 인간 대상체이다. 그러나, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 수의학 분야에서도 사용할 수 있다. 동물 대상체의 비-제한적 예는 영장류, 고양이, 개, 돼지, 말, 마우스, 래트가 내포된다.

덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 바람직하게는 주사를 통하여 해당 대상체에게 투여되는데, 구체적으로 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사 또는 복막내(i.p.) 주사에 의해 투여되며, 바람직하게는 i.v. 또는 s.c. 주사에 의해 투여된다. 사용될 수 있는 다른 비-경구 투여 경로에는 근육내 주사 및 관절내 주사가 내포된다. 덱스트란 설페이트 또는 이로부터 파생된 약제학적으로 허용되는 유도체들은 대안적으로, 또는 추가로, 예를 들어, 표적 효과가 발생하는 대상체의 신체의 조직 또는 장기 또는 기타 부위에서 직접 주사할 수 있다.

실시형태들의 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 바람직하게는 선택된 용매 또는 부형제와 함께 수성 주사 용액으로 제형화된다. 상기 용매는 유리하게는 수성 용매이며, 특히, 완충 용액이다. 이러한 완충액의 비-제한적인 예는 시트르산 완충제, 예를 들어 시트르산 일수화물(CAM) 완충제 또는 포스페이트 완충액이다. 예를 들면, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 0.9% NaCl 식염수와 같은 식염수에 용해되고, 이어서 75mM CAM으로 임의선택적으로 완충되고, 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 약 5.9로 조절할 수 있다. 수성 주사 용액, 이를 테면, 염수, 즉, NaCl(aq)을 비롯한, 비-완충된 용액 또한 가능하다. 더욱이, 완충 용액이 필요한 경우, CAM 이외의 완충계가 사용될 수 있다.

실시형태들은 주사로 한정되지 않으며, 대안적으로 경구, 비강, 협측, 직장, 피부, 기관, 기관지 또는 국소를 비롯한, 다른 투여 경로가 사용될 수 있다. 이어서, 활성 화합물인 덱스트란 설페이트는 특정 투여 경로에 기초하여 선택된 적합한 부형제 또는 담체와 함께 제형화된다.

덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 적절한 투여량 범위는 이를 테면, 시험관-내 대비 생체-내와 같이 응용 프로그램에 따라 다를 수 있고, 대상체의 체격 및 체중, 치료받는 대상체의 상태 및 다른 고려 사항에 따라 달라질 수 있다. 구체적으로, 인간 대상체의 경우, 가능한 투여 용량 범위는 체중 기반 1μg/kg ~ 100 mg/kg, 바람직하게는 체중 기반 10μg/kg ~ 50 mg/kg 일 수 있다.

바람직한 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염은 대상체의 체중 기반 0.05 ~ 50 mg/kg, 바람직하게는 체중기반 0.05 또 0.1 ~ 40 mg/kg의 범위의 용량, 보다 바람직하게는 대상체의 체중기반 0.05 또는 0.1 ~ 30 mg/kg, 또는 0.1 ~ 25 mg/kg 또는 0.1 ~ 15 mg/kg 또는 0.1 ~ 10 mg/kg이 투여되도록 제형화된다. 바람직한 투여량은 대상체의 체중 기반으로 0.25 ~ 5 mg/kg, 바람직하게는 0.5 ~ 2.5 mg/kg, 그리고 더욱 바람직하게는 0.75 ~ 2 mg/kg 범위에서 선택된다.

덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 단회 투여 사례에서, 이를 테면, 단일 볼루스(bolus) 주사 형태로 투여될 수 있다. 이 볼루스 투여분량(dose)은 해당 대상체에게 매우 신속하게 주사될 수 있지만, 그러나 덱스트란 설페이트 용액이 해당 대상체에게 몇 분에 걸쳐, 이를 테면, 5 분 ~ 10분 동안 주입되도록 시간의 경과에 따라 주입되는 것이 유익하다.

대안으로, 상기 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염은 치료 기간 동안 다수, 즉, 최소 2 회에 투여될 수 있다.

덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 다른 활성제들과 함께, 순차적으로, 동시에 투여될 수 있고, 또는 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 그리고 적어도 하나의 다른 활성제를 포함하는 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 상기 적어도 하나의 활성제는 상기에서 언급된 질환, 장애 또는 상태들중 임의의 것에 유용한 임의의 제제중에서 선택될 수 있다. 상기 적어도 하나의 활성제는 세포 요법에서 세포의 형태, 이를 테면, 배아 줄기 세포(ESC) 및 중간엽 기질 세포(MSC)를 비롯한, 그러나, 이에 국한되지 않는 줄기 세포의 형태일 수 있다.

실시예

다음의 실시예들에서, 본 명세서에서 저-분자량 덱스트란 설페이트(LMW-DS)로 명시된 덱스트란 설페이트의 나트륨 염이 이용된다(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780).

실시예 1

코로나바이러스 침입 및 전파를 위한 중요한 단계는 숙주 조직에 흡착하는 단계다. 이런 이유로, 숙주-병원체 단백질-단백질 상호작용을 파괴시키는 것이 코로나바이러스 침투를 억제하는 효과적인 방법일 수 있다.

본 연구는 단백질-단백질 상호작용을 억제할 수 있는 LMW-DS(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780)의 능력을 밝히려는 시도에서, 올리고머 β-아밀로이드와 상기 병원체 단백질 PrP^c 간의 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 이의 능력에 대해 조사하였다.

재료 및 방법

화학물 및 항체

스트렙타아비딘 HRP은 BioLegend의 것이며; β-아밀로이드-(1-42)-바이오틴은 Innovagen의 것이며; 정상적인 인간 세포성 프리온 단백질(PrP^c)은 Merck의 것이며; TMB는 eBioscience의 것이며; 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)은 Sigma의 것이며; 항-아밀로이드 β 항체 클론 6E10은 BioLegend의 것이며; 항-마우스 HRP는 Cell Signaling의 것이며; 평균 M.W. > 500,000 Da인 덱스트란 설페이트 나트륨 염(DSSS)은 Sigma의 것이며; 덱스트란(M.W. 450,000 - 650,000 Da)은 Sigma의 것이며; Maxisorp 플레이트는 Sigma의 것이다.

아밀로이드-β 올리고머의 준비

β-아밀로이드의 올리고머와는 기존 방법을 기반으로 최적화되었다(Stine et al., Methods Mol. Biol. 2011, 670: 13-32; Aimi et al., J Neurochem. 2015, 134: 611-617). 간략하게 설명하자면, 아밀로이드-β를 HFIP에 1.0mM의 최종 농도로 용해시키고, 보호된(protected) 초음파 처리를 하고, HFIP를 조심스럽게 증발시켰다. 발생하는 펩디드 필름은 밀봉된 용기에 -20℃에서 보관되었다. 사용 전, 펩타이드 필름을 DMSO에 최종 농도 5.0mM이 되도록 천천히 녹이고, 10분간 보호된 초음파 처리하였다. 올리고머를 제조하기 위해, DMSO 용액을 얼음처럼 차가운 DMEM 배지에 최종 농도 100μM로 희석하고, 37℃(β-아밀로이드-바이오틴)에서 16시간 동안 항온처리였다. 단량체를 제조하기 위해, DMSO 용액을 얼음처럼 차가운 18 MOhm 물에 최종 농도 100μM로 희석하고, 바로 사용했다.

아밀로이드-β 단량체 및 올리고머 확인

아밀로이드-β의 단량체 또는 올리고머를 만들기 위한 최적화된 조제물을 5% SDS를 함유하는 비-환원 겔 샘플 완충액에 용해시켰다 단백질들은 비-환원 MES 러닝(running) 완충액을 사용하여, 15% Bis-Tris 겔에서 이동시켰다. 겔을 PVDF로 옮기고, 10% 무-지방 우유에서 차단한 다음, 항-아밀로이드-β 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하고, 항-마우스 HRP와 함께, ECL로 현상하고, 필름에 노출시켰다.

올리고머 아밀로이드-β와 PrP ^c 사이의 단백질-단백질 사이의 상호작용을 정량화시키기 위한 ELISA 방법

PrP^c를 탄산염 코팅 완충액에 코팅량(100μl, 웰당 500ng PrP^c의 최종 양)으로 10× 희석시키고, Maxisorp 플레이트에 적용했다. 그런 다음 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 밤새 방치했다. 코팅된 플레이트를 PBS-TWEEN 20®에서 조심스럽게 세척하고, PBS에서 2% BSA로 차단시켰다. 플레이트를 세척하였고, 100μl의 올리고머 아밀로이드-β-바이오틴 펩타이드 조제물(최종 농도 200nM)을 각 웰에 첨가하기 전, 시험 화합물과 조심스럽게 혼합하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 항온처리하였고, 세척하였고, 스트렙타비딘-HRP로 처리하였고, 추가 세척-후 TMB(2N H₂SO₄을 이용하여 반응 중단시킴)를 사용하여 발색시켰다. 흡광도는 450 nm에서 30분 이내에 판독되었다.

모든 조건은 삼중으로 수행되었다. PrP^c에 아밀로이드-β-바이오틴 결합 결합은 Aimi et al., J Neurochem. 2015, 134: 611-617에서 기술된 바와 같이 산출되었다.

곡선 피팅(fitting)

정량적 약리학적 분석은 부동(floating) 4개 매개변수 로지스틱 방정식에 대한 반복 곡선 피팅에 의해 수행되었다.

결과

DSSS는 LMW-DS와 마찬가지로, 농도 의존적 방식으로 올리고머 아밀로이드-β와 PrP^c 사이의 단백질-단백질 상호작용에 대해 경쟁했다(도 1; 표 2). 정량적 약리학적 분석에서, LMW-DS는 DSSS에 대해 필적할 만한 전반적인 친화도를 나타내었지만, 나란한 수준의 경쟁 결합에서 명백한 차이와 Hill 계수는 두 화합물간의 차등적 상호 작용을 암시한다(도 1; 표 2). DSSS 및 LMW-DS와 대조적으로, 덱스트란은 올리고머 아밀로이드-β와 PrP^c사이의 단백질-단백질 사이의 상호작용에 대해 눈에 띄는 경쟁은 하지 못했다.

표 2 - 아밀로이드-β와 PrP^c사이의 단백질-단백질 사이의 상호작용에 경쟁하는 능력의 정량적 약리학적 분석

논의

고-분자량 덱스트란 설페이트(DSSS)는 올리고머 아밀로이드-β와 PrP^c 사이의 단백질-단백질 사이의 상호작용에 경쟁하는 것으로 이미 보고되었으며, 효과 농도는 낮은μg/ml 범위다(Aimi et al., J Neurochem. 2015, 134: 611-617). 본 연구에서, 상기 방법의 최적화로 Aimi et al의 연구에 비해, 올리고머 아밀로이드-β의 명백한 더 큰 비율이 생성되었다. 단백질-단백질 상호작용의 최적화 ELISA는 특정 단백질-단백질 상호작용의 정도를 더욱 높였고; 경쟁의 더 큰 동적 범위는 경쟁 화합물들에 의한 상호작용의 정량적 약리학적 분석을 용이하게 했다. 따라서, 본 연구는 Aimi et al들이 보고한 연구보다 개선된 것이다.

DSSS 및 LMW-DS는 올리고머 아밀로이드-β와 PrP^c사이의 단백질-단백질 사이의 상호작용에 대해 경쟁하는 필적할 수준의 친화력을 나타내었고, 차례로 IC₅₀ 값은 0.62±0.07 및 0.42±0.16μg/mL이었다. 경쟁의 속성에 대한 Hill 분석에서 LMW-DS는 DSSS와 관련된 상대적으로 높은 Hill 계수에 비해, 더 얕은 경쟁 곡선을 나타내었고, 이는 DSSS와 LMW-DS 간의 차등적인 약리학적 작용에 대한 증거를 제공한다.

이로 인하여, LMW-DS는 올리고머 아밀로이드-β와 PrP^c 사이의 단백질-단백질 사이의 상호작용에 대해 경쟁하고, 이로 인하여 단백질-단백질 상호작용을 방지하거나, 또는 적어도 억제시키는 데 이용될 수 있다. LMW-DS에서 볼 수 있는 이러한 효과는 단백질-단백질 상호작용이 연루된 코로나바이러스 감염 및 코로나바이러스 감염성 질환에 대해 잠재력을 갖는다. 따라서, LMW-DS는 SARS-CoV-2 삼량체 스파이크 단백질과 ACE2의 상호작용 파괴에 잠재력을 갖고, 이 점은 실시예 13에서 추가 실증된다.

실시예 2

이 실시예에서는 ALS 환자들의 혈액에서 조직 복구 성장 인자의 방출 및 활성화 향상에 있어서 LMW-DS의 가능성을 조사했다.

재료 및 방법

이것은 ALS 환자를 대상으로 피하(s.c.) 투여된 LMW-DS의 안전성, 내약성 및 효능을 평가한 단일-중심, 개방 단일-부분 연구였다. 클리닉에 10회의 예정된 방문을 하였다: 1회, 2부(방문 1a 및 방문 1b)로 나누어 스크리닝 방문, 5회, 연구용 의약품(IMP) 투여 방문(방문 2 ~ 방문 6), 그리고 3회 추적 방문(방문 7 ~ 방문 9). 각 개별 환자의 연구 참여는 스크리닝 및 추적 방문을 포함하여, 대략적으로 4개월로 계획되었다.

IMP의 활성 약제학적 성분은 저-분자량 덱스트란 설페이트(LMW-DS), (ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780)이다. 약물은 s.c. 주사를 위한 용액으로 사용되었고, 20 mg/mL LMW-DS 및 9 mg/mL NaCl로 구성된다. 각 유리 바이알에는 10mL이 함유되었다. 투여되는 투여분량은 첫 번째 LMW-DS 투여 이전, 방문 2 시점에서 환자의 체중에 따라 결정되었다. LMW-DS를 양측을 교대로, 복부, 허벅지 또는 엉덩이(우선 순위에 따라)에 s.c. 주사했다. 1주 투여 간격으로, 1 mg/kg을 5회 투여했다. 면역반응성 HGF의 변화는 각 방문에서 채취한 혈액 샘플에서 상용 ELISA(R&D HGF ELISA)로 측정했다.

결과

LMW-DS는 ALS 환자들에게 LMW-DS 투여-후, 약 2시간 시점에 최대 피크로 이들의 혈장 HGF 수준의 유의한 증가를 유도했고(도 2, 표 3), 이는 감소했지만, 그러나 LMW-DS 투여-후 6시간 시점에 여전히 유의미적으로 상승되어 있었다(표 3).

표 3 - LMW-DS는 ALS 환자들에서 혈장 HGF를 기하급수적으로 증가시킨다.

*P<0.01 대비 LMW-DS 투여-전

논의

때때로, 산란 인자(SF)라고도 하는 HGF는 측분비(paracrine) 세포성 성장, 운동성 및 형태형성 인자다. 배아 기관 발달, 뿐만 아니라 성인 장기(organ)의 재생 및 상처 치유에도 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.

LMW-DS에 의해 유도된 혈장 HGF 수준 상승은 SARS-CoV-2 감염에 의해 부정적인 영향을 받는 기관 및 조직의 조직 복구 및 재생 및 상처 치유를 유도함으로써, 그리고 ARDS, SIRS 및 장기의 섬유증을 비롯한 SARS-CoV-2에 의해 유도된 염증 반응의 치유를 유도함으로써 COVID-19 환자에게 유익할 것이다.

실시예 3

래트의 심각한 외상성 뇌 손상(sTBI)-후, 글루타메이트 흥분성독성 및 미토콘드리아 기능에 대한 LMW-DS의 매일 피하-주사 효과는 뇌의 냉동 샘플의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 의해 평가되었다. 이 결과에서 LMW-DS가 미토콘드리아 기능을 간섭하여, 에너지 대사를 개선시키고, 글루타메이트 흥분성독성을 또한 감소시킨다는 것을 암시된다.

재료 및 방법

sTBI 및 약물 투여 프로토콜 유도

이 연구에 사용된 실험 프로토콜은 동물 보호에 대한 국제 표준 및 지침에 따라 Ethical Committee of the Catholic University of Rome의 승인을 받았다. 300-350 g 체중(b.w.)의 수컷 Wistar 래트에게 통제된 환경 하에서 표준 실험실 식단과 물을 자유롭게 먹도록 하였다.

그들은 세 그룹으로 나뉘었다:

1) n = sTBI를 받은 6마리 동물, 30분 후 약물 투여 및 TBI-후 2일차 시점에 희생시킴(급성 단계 1)

2) n = sTBI를 받은 6마리 동물, 30분 후 약물 투여 및 TBI-후 7일차 시점에 희생시킴(급성 단계 2)

3) n = sTBI를 받은 6마리 동물, 3일 후 약물 투여 및 TBI-후 7일차 시점에 희생시킴(만성 단계)

마취 혼합물을 동물에게 35 mg/kg b.w의 케타민 및 0.25 mg/kg b.w.의 미다졸람을 i.p.로 주입하였다. sTBI는 "무거운 것을 떨어뜨림(weight drop)" 충격 가속 모델에 따라, 사전에 두개골에 고정된 금속 디스크로 보호되었던 래트의 머리로 2m 높이에서 450g의 무게를 떨어뜨림으로써 유도되었다(Marmarou et al., J Neurosurg. 1994; 80: 291-300). 두개골 골절, 발작, 코 출혈로 고통받거나, 또는 충격에서 살아남지 못한 래트는 연구에서 제외되었다. 각 치료 기간이 끝나면, 래트를 다시 마취시킨 다음, 즉시 희생시켰다.

약물 치료는 0.5 ml의 LMW-DS(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780; 15 mg/kg)의 피하 주사이었으며, 앞서 언급한 개략적 프로토콜에 따라 투여되었다.

대뇌 조직 프로세싱

모든 동물에게 마취 중 생체-내 두개골절제술을 시행했으며, 래트의 두개골을 조심스럽게 제거한 후, 외과용 주걱으로 뇌를 노출시켜 제거하고, 액체 질소에 빠르게 넣었다. 습-중량(w.w.) 측정 후, 조직 준비물은 이전에 개시된 바와 같이 영향을 받았다(Tavazzi et al., Neurosurgery. 2005; 56: 582-589; Vagnozzi et al., Neurosurgery. 2007; 61: 379-388; Tavazzi et al., Neurosurgery. 2007; 61: 390-395; Amorini et al., J Cell Mol Med. 2017; 21: 530-542.). 간략하게 설명하자면, CH₃CN + 10 mM KH₂PO₄, pH 7.40, (3:1; v:v)로 구성된 얼음-냉각된, 질소-포화된 침전 용액 7ml를 사용하여, 24,000rpm/분으로 설정된 Ultra-Turrax를 사용하여 전체 뇌 균질화를 수행했다(Janke & Kunkel, Staufen, Germany). 20,690×g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 투명한 상층액을 보관하고, 펠릿에 3 ml의 침전 용액을 보충하고, 상기에서 설명한 대로 다시 균질화했다. 두 번째 원심분리를 수행하고(4℃에서 10분 동안 20,690×g), 펠릿을 보관하고, 상층액을 이전에 얻은 것과 합하여, 2배 부피의 HPLC- 등급 CHCl₃로 격렬하게 교반하여 추출하고, 상기와 같이 원심분리했다. 수용성 저-분자량 화합물들을 함유하는 상부 수성상을 수집하였고, 2회 더 클로로포름 세척을 하였으며(이 절차를 통해 완충 조직 추출물에서 임의의 유기 용매 및 지용성 화합물을 제거할 수 있었다), 궁극적으로 수성 10% 조직 균질물을 갖도록 10 mM KH₂PO₄, pH 7.40로 부피를 조정하였으며, 분석될 때까지 -80℃에서 보관된다.

퓨린-피리미딘 대사산물의 HPLC 분석

각 탈단백질화된 조직 샘플의 분취량을 0.45μm HV Millipore 필터를 통해 여과하였고, 200~300nm 파장으로 설정된 고감도 다이오드 어레이 검출기(5cm 광 경로 플로우 셀 장착)와 함께, Surveyor System로 구성된 HPLC 장치에 연결되어 있는, 자체 가드 칼럼(Thermo Fisher Scientific, Rodano, Milan, Italy)이 제공된 Hypersil C-18, 250×4.6 mm, 5μm 입자 크기 칼럼에 로드(200μl)했다. 데이터 수집 및 분석은 HPLC 제조업체에서 제공한 ChromQuest® 소프트웨어 패키지를 사용하여 PC에서 수행되었다.

퓨린-피리미딘 프로파일(아래 열거됨)에 속하고, 조직 에너지 상태, 미토콘드리아 기능 및 산화적-질산화적 스트레스와 관련된 대사산물들은 존재하는 이온-페어링 HPLC 방법 (Lazzarino et al., Anal Biochem. 2003; 322: 51-59; Tavazzi et al., Clin Biochem. 2005; 38: 997-1008)을 약간 변형시켜, 단일 크로마토그래피 실행에서 분리시켰다. 조직 추출물의 크로마토그래피 실행에서 관심대상 화합물의 할당 및 산출은 적절한 파장(206, 234 및 260 nm)에서 머무름 시간, 흡수 스펙트럼 및 피크 면적을 공지 농도로 새로-준비된 초-순도 표준 혼합물의 크로마토그래피 실행 피크와 비교함으로써 수행되었다.

화합물들의 목록: 시토신, 크레아티닌, 우라실, 에타-슈두우리딘, 시티딘, 하이포잔틴, 구아닌, 잔틴, 시티딘 다이포스페이트-콜린(CDP-콜린), 아스코르브산, 우리딘, 아데닌, 아질산염(-NO₂ ^-), 환원된 글루타티온(GSH), 이노신, 요산, 구아노신, 시티딘 모노포스페이트(CMP), 말론디알데하이드(MDA), 티미딘, 오로트산, 질산염(-NO₃ ^-), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드, 산화된 (NAD⁺), 아데노신(ADO), 이노신 모노포스페이트(IMP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 우리딘 다이포스페이트-포도당(UDP-Glc), UDP-갈락토스(UDP-Gal), 산화된 글루타티온(GSSG), UDP-N-아세틸-글루코사민(UDP-GlcNac), UDP-N-아세틸-갈락토사민(UDP-GalNac), 아데노신 모노포스페이트(AMP), 구아노신 다이포스페이트-포도당(GDP-포도당), 시티딘 다이포스페이트(CDP), UDP, GDP, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트, 산화된 (NADP⁺), 아데노신 다이포스페이트-리보스(ADP-리보스), 시티딘 트라이포스페이트(CTP), ADP, 우리딘 트라이포스페이트(UTP), 구아노신 트라이포스페이트(GTP), 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드, 환원된 (NADH), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트, 환원된 (NADPH), 말로닐-CoA, 조효소 A (CoA-SH), 아세틸-CoA, N-아세틸아스파테이트(NAA).

유리 아미노산 및 아미노기 함유 화합물의 HPLC 분석

주요 유리 아미노산(FAA) 및 아미노기를 함유하는 화합물들(AGCC)(아래 열거됨)의 동시 측정은 도체에서 기술된 바와 같이(Amorini et al., J Cell Mol Med. 2017; 21: 530-542; Amorini et al., Mol Cell Biochem. 2012; 359: 205-216), 오쏘-프탈알데하이드(OPA) 및 3-멀캅토프로피온산 (MPA)의 혼합물로 샘플의 프레칼럼 유도체화(precolumn derivatization)를 이용하여 수행되었다. 간략하게 설명하자면, 25mmol/l OPA, 1% MPA, 237.5mmol/l 붕산나트륨, pH 9.8로 구성된 유도체화 혼합물을 매일 준비하였고, 오토샘플러에 넣었다. OPA-MPA를 사용한 샘플(15μl)의 자동화된 프레칼럼 유도체화는 24℃에서 수행되었고, 후속 크로마토그래피 분리를 위해, 이러한 유도체화된 혼합물 25μl를 HPLC 칼럼(Hypersil C-18, 250×4.6 mm, 입자 크기 5μm, 온도 21℃로 설정됨)에 로딩하였다. 글루탐산염의 경우, 단백질이 제거된 뇌 추출물은 상기 유도체화 절차 및 후속 주입-전, HPLC-등급 H₂O로 20배 희석되었다. OPA-AA와 OPA-AGCC의 분리는 적절한 단계 구배를 사용하여, 두 가지 이동상(이동상 A = 24mmol/l CH₃COONa + 24mmol/l Na₂HPO₄ + 1% 테트라하이드로퓨란 + 0.1% 트라이플루오로아세트산, pH 6.5, 이동상 B = 40% CH₃OH + 30% CH₃CN + 30% H₂O을 사용하여 1.2 ml/분의 유속으로 수행되었다(Amorini et al., J Cell Mol Med. 2017; 21: 530-542; Amorini et al., Mol Cell Biochem. 2012; 359: 205-216).

전체 뇌 추출물의 크로마토그래피 실행에서 OPA-AA 및 OPA-AGCC의 할당 및 산출은 338 nm 파장에서 머무름 시간 및 피크 면적을 공지 농도로 새로-준비된 초-순도 표준 혼합물의 크로마토그래피 실행 피크와 비교함으로써 수행되었다.

FAA 화합물 및 ACGC 화합물의 목록: 아스파르트산염(ASP), 글루타메이트(GLU), 아스파라긴(ASN), 세린(SER), 글루타민(GLN), 히스티딘(HIS), 글리신(GLY), 트레오닌(THR), 시트룰린(CITR), 아르기닌(ARG), 알라닌(ALA), 타우린(TAU), 감마-아미노부티르산(GABA), 티로신(TYR), S-아데노실호모시스테인(SAH), L-시스타티오닌(L-Cystat), 발린(VAL), 메티오닌(MET), 트립토판(TRP), 페닐알라닌(PHE), 이소류신(ILE), 류신(LEU), 오르니틴(ORN), 리신(LYS).

통계학적 분석

정규 데이터 분포는 Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 테스트되었다. 그룹 간 차이는 반복 측정에 대한 양-방향 ANOVA로 추정되었다. 포스트 hoc 검정으로 Fisher의 보호된 최소 제곱을 사용했다. 오로지 0.05 미만의 양방(Two-tailed) P-값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.

결과

24개의 표준 아미노산과 비-표준 아미노산, 그리고 1차 아미노기 함유 화합물들의 대뇌 수치 중 가장 분명한 결과는 LMW-DS 치료가 sTBI에 의해 유도된 글루타메이트(GLU)의 증가를 현저하게 억제했고(도 3), 따라서 이 화합물의 과잉으로 인한 흥분성의 감소를 확실히 야기한다는 것이다.

그러나, 이 효과는 약물이 손상-후 조기(sTBI 후 30분)에 투여된 경우에만 가시적이었고, LMW-DS가 sTBI 후 3일에 주사되었을 때 이 흥분성독성 마커에 대한 효능이 없었다. LMW-DS가 소위 메틸-회로에 관여하는 화합물들에 있어서 상당한 유익한 효과가 있다는 점을 또한 강조할 가치가 있다(Met, L-Cystat, SAH), 표 4 참고.

표 4 - 대뇌 화합물들의 농도

^a p<0.01 (대조군과 비교), ^b p<0.05 (대조군과 비교), ^c p<0.01 (TBI 2 일차와 비교), ^d p<0.05 (TBI 2 일차와 비교), ^e p<0.01 (TBI 5 일차와 비교), ^f p<0.05 (TBI 5 일차와 비교), ^g p<0.01 (급성 단계 2와 비교), ^h p<0.05 (급성 단계 2와 비교), ⁱ p<0.01 (만성 단계와 비교), ^j p<0.05 (만성 단계와 비교)

표 3은 화합물, μmol/g(w.w.)을 열거한다.

표 5에서 볼 수 있듯이, LMW-DS는 에너지 대사 및 미토콘드리아 기능과 관련된 다양한 화합물들에게 긍정적인 영향을 미쳤다. 특히 흥미로운 것은, 미토콘드리아 포스포릴화 능력의 측정으로서 아데닌 뉴클레오타이드의 농도와 ATP/ADP 비율이다(도 4a-4d).

표 5 - 에너지 대사산물의 농도

표 4는 화합물, nmol/g (w.w.)을 열거한다.

산화 및 환원 니코틴 조효소의 현저한 변화도 관찰되었다(도 5a-5d).

산화성 스트레스와 관련된 매개변수도 측정되었으며, LMW-DS 투여-후 산화성 스트레스의 상당한 감소가 감지되었다. 구체적으로, 아스코르브산(주요 수용성 뇌 항산화제) 및 GSH (주요 세포내 SH 공여자)를 측정했다. 결과에서 표 5 및 도 6a-6c에 나타낸 바와 같이, LMW-DS 투여-후 이들의 수준에서 상당한 개선을 보여주었다.

또한, 막 인지질의 다중불포화 지방산의 최종 산물이며, 따라서 ROS 매개 지질 과산화의 마커로 사용되는 MDA 또한 측정되었다. MDA 수준은 LMW-DS 투여-후 상당한 감소를 보였다. 상기에서 설명된 산화성 스트레스 마커는 모두 LMW-DS로 치료-후 항산화 상태 회복에 있어서 개선을 나타냈다(도 6a-6c).

NO-매개된 질산화적 스트레스의 대표적인 지수들 (아질산염 및 질산염) 또한 분석되었다. LMW-DS 투여로 sTBI의 급성 단계와 만성 단계 모두에서 질산염 농도가 유의적으로 감소되었다(도 7).

NAA는 뇌 특이적 대사 산물이며, TBI-후 악화 또는 회복의 모니터링에 유용한 생화학적 마커다. NAA는 아스파르트산염 및 아세틸-CoA로부터 아스파르트산염 N-아세틸트렌스퍼라제에 의해 뉴런에서 합성된다. NAA 전환을 보장하기 위해, 이 분자는 세포 구획 사이를 이동하여 희소돌기아교세포에 도달해야 하며, 여기서 이것은 아스파르토아실라제(ASPA)에 의해 아세테이트와 아스파르테이트로 분해된다. 기질인 아스파르트산염과 아세틸-CoA를 공급하기 위해, 이화 효소 ASPA의 상향 조절과 NAA 감소는 대사 장애 상태를 나타낸다. 이 연구에서, NAA와 이의 기질은 sTBI-후 측정되었으며, LMW-DS 투여-후 수준에서 상당한 개선을 보였다(도 8a-8c).

에너지 대사 산물에 대한 이러한 효과는 동물이 손상-후 초기(30분) 시점에 LMW-DS 투여를 받았을 때, 특히 분명했다. LMW-DS의 전반적인 유익한 효과는 동물이 sTBI-후 2일차 시점에 희생되었을 때, 또는 희생이 sTBI 후 7일에 일어났을 때 관찰되었다. 이들 동물 그룹에서, AGCC 및 에너지 대사 산물과 관련된 대사의 일반적인 개선은 더욱 분명했고, 이것은 뇌 대사에 있어서 LMW-DS 투여의 오래-지속되는 긍정적 효과를 암시한다.

논의

여기에 제시된 데이터에서 LMW-DS의 조기 투여로 미토콘드리아 기능이 보호됨으로써, 글루타메이트 흥분성독성 수준이 감소되며, 대사 항상성에서 불리한 변화도 개선됨이 시사된다.

좀더 상세하게, 이 LMW-DS는 다른 무엇보다도 미토콘드리아 기능을 보호하고, 산화 스트레스를 감소시키고, 항산화 상태 회복 개선, ATP 생산 및 대사를 보존하여 미토콘드리아 ATP 에너지 공급 보호, LMW-DS에 의해 유도되는 모든 미토콘드리아 포스포릴화 능력의 정상화시킨다. 결과적으로, LMW-DS는 손상 또는 질환에 노출된 세포에서 미토콘드리아 기능을 보호하고, 그리고 보존할 수 있으며, 이것은 감염성 질병과 싸울 수 있는 기능 세포를 갖는 데 중요하다. LMW-DS에 의해 유도되는 대사 정상화는 폐 단계(단계 II)와 회복 단계(단계 IV) 모두에서 COVID-19 환자에게 유익하다(도 25).

실시예 4

이 연구의 목적은 래트의 폐쇄형-머리 미만성 중증 TBI(sTBI)의 실험 모델에 의해 생성된 생화학적, 분자 및 조직-해부학적 손상에 대한 LMW-DS의 잠재적인 신경 보호 효과를 평가하는 것이었다. 본 연구에서는, 처리된 동물의 대뇌 조직 추출물에서 에너지 대사, 산화성/질산화적 스트레스, 항산화제 및 유리 아미노산을 나타내는 저-분자량 대사산물의 HPLC 분석을 통해 결과는 얻었다.

재료 및 방법

sTBI 및 약물 투여 프로토콜 유도

체중 300-350g의 수컷 Wistar 래트(n=160)가 본 연구에 사용되었다. 이들 래트에게 통제된 환경에서 표준 실험실 식단과 물을 자유롭게 먹도록 하였다.

허용된 마취 혼합물을 동물에게 체중 기반 35mg/kg b.w의 케타민 및 0.25 mg/kg의 미다졸람을 근육내 주사하여 제공하였다. 미민성 sTBI는 Marmarou et al. J. Neurosurg. 1994, 80: 291-300에 의해 설정된 무거운 것을 떨어뜨림(weight drop)" 충격 가속 모델에 따라 유도되었다. 인간의 미만성 TBI의 물리적 및 기계적 특성을 재현할 수 있도록 하기 위해 이 모델은 미만성 축삭 손상을 유발하였다.

기계적 힘을 뇌에 균일하게 분배하기 위해, 헬멧(치과용 시멘트를 사용하여 두개골에 미리 고정된 금속 디스크)으로 보호된 래트의 머리로 2미터 높이에서 450g의 중량을 떨어뜨려 심각한 TBI를 유발시켰다. 래트를 특수 용기에 삽입된 특정 폴리우레탄 폼 침대에 엎드려 눕혔고; 이 폼은 위치 에너지(기계적 힘에서 파생됨)의 대부분을 분산시키고, 척추 손상을 일으킬 수 있는 충격- 후 동물의 반동을 막는다.

두개골 골절, 발작, 코 출혈로 고통받거나, 또는 충격에서 살아남지 못한 래트는 연구에서 제외되었다. TBI 유도로부터 2일차 또는 7일차 이후, 래트를 다시 마취시킨 후, 즉시 희생시켰다. 이들 시점은 최악의 생화학적 교란(2일차), 또는 경미한 뇌 손상의 경우, 완전한 대사 회복(7일차) 시점과 일치한다.

약물 치료는 LMW-DS 0.5ml의 피하 주사(ILB®, Tikomed, Viken, Sweden, WO 2016/076780)로 구성되며, 하기에서 언급한 개략적 프로토콜에 따라 3 상이한 농도(체중 기반 1, 5 및 15 mg/kg)로 투여되었다. 모의-수술을 받은 동물들은 TBI를 제외한, 동일한 마취 절차를 거쳤으며, 대조군으로 사용되었다.

실험 기획

TBI-후 두 가지 상이한 시점에 세 가지 상이한 농도의 LMW-DS의 효능에 대한 연구를 수행하기 위해, 본 연구에 사용된 래트를 4개의 그룹으로 나눴다. 이후에 명시된 바와 같이, 각 그룹에는 아래에 설명된 절차에 따라, 대사 분석을 위한 특정 처리를 받은 동물들, 그리고 조직-형태학적 연구를 목적으로 하는 다른 동물들이 있었다.

그룹-1

생화학적 평가 전용 대조군(n = 12). 조직-형태학적 연구에 4마리의 추가 동물들이 사용되었다. 이 그룹의 전체 래트 마리 수: n = 16.

그룹-2

약리학적 치료 없이, sTBI를 겪은 래트를 다음 하위그룹으로 나누었다:

1. 12마리 동물들은 sTBI를 겪고, TBI-이후 2일차 시점 이후에 희생됨

2. 12마리 동물들은 sTBI를 겪고, TBI-이후 7일차 시점 이후에 희생됨

조직-형태학적 연구에 각 하위그룹에서 4마리의 추가 동물들이 사용되었다. 이 그룹의 전체 래트 마리 수: n = 32.

그룹-3

래트는 sTBI를 겪고, LMW-DS TBI-이후 30분 시점 후에 LMW-DS의 단회 투여를 제공받았고, TBI-이후 2일차 시점에 희생되었다. 동물들을 다음과 같이 하위그룹으로 나누었다:

1. 12마리 동물들은 sTBI를 겪었고, 1 mg/kg b.w.의 LMW-DS로 처리되었다.

2. 12마리 동물들은 sTBI를 겪었고, 5 mg/kg b.w.의 LMW-DS로 처리되었다.

3. 12마리 동물들은 sTBI를 겪었고, 15 mg/kg b.w.의 LMW-DS로 처리되었다.

조직-형태학적 연구에 각 하위그룹에서 4마리의 추가 동물들이 사용되었다. 이 그룹의 전체 래트 마리 수: n = 48.

그룹-4

래트는 sTBI를 겪고, LMW-DS TBI-이후 30분 시점 후에 LMW-DS의 단회 투여를 제공받았고, TBI-이후 7일차 시점에 희생되었다. 동물들을 다음과 같이 하위그룹으로 나누었다:

그룹-5

래트(n = 12)는 sTBI를 겪었고, TBI-이후 30분, 3일차, 그리고 5일차 이후 최대 투여분량의 LMW-DS(15 mg/kg b.w)를 반복 투여에 의해 제공받았고, TBI-이후 7일차 시점에 희생되었다. 조직-형태학적 연구에 4마리의 추가 동물들이 사용되었다. 이 그룹의 전체 래트 마리 수: n = 16.

생화학 분석 및 유전자 발현 분석을 위한 뇌 조직 프로세싱

대사 산물 손실을 최소화하기 위해, 마취 동안 모든 동물에서 생체-내 두개골절제술을 수행했다. 래트의 두개골을 조심스럽게 제거하였고, 뇌를 노출시켜, 시상 틈을 따라 예리하게 자르고, 두 개의 반구를 분리했다. 생화학 분석에 사용될 반구를 액체 질소에서 사전-냉각된 알루미늄 텅(tongues)으로 동결-클램핑시킨 다음, 액체 질소에 담그었다. 동결-클램핑 절차는 해당 조직의 동결을 가속화시켜, 대사산물 손실 가능성을 최소화하기 위해 도입되었다.

분자 생물학 분석에 사용될 나머지 반구는 NA를 안정화시키고 분해로부터 보호하는 RNA 안정화 용액인, 5-10 부피에 RNAlater® 용액(Invitrogen Life Technologies)에 배치되었다. 용액이 조직에 완전히 침투할 수 있도록, 뇌 샘플을 4℃에서 밤새 보관했다.

대사산물 분석을 위한 조직 균질화는 하기에 기술된 바와 같이 수행되었다. 습중량(w.w.) 측정 후, 상기 동결된 반구를 7 ml의 얼음-냉각된, 질소-포화된 침전 용액(CH₃CN + 10 mM KH₂PO₄, pH 7.40, (3:1; v:v)로 구성됨)에 넣었고, 24,000rpm/분으로 설정된 Ultra-Turrax 균질화기를 사용하여 균질화를 수행했다(Janke & Kunkel, Staufen, Germany). 20,690×g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 투명한 상층액을 보관하고, 펠릿에 10 mM KH₂PO₄의 분액을 보충하였고, 상기에서 설명한 대로 다시 균질화했고, -20℃에서 하룻밤 동안 보관하여, 조직으로부터 수성상을 완벽하게 회수하였다. 제2 원심분리를 수행하였고(20,690×g, 10분, 4℃), 상층액을 이전에 얻은 것과 합하여, 2배 부피의 HPLC-등급 CHCl₃로 격렬하게 교반하여 추출하고, 상기와 같이 원심분리했다. 수용성 저-분자량 화합물들을 함유하는 상부 수성상을 수집하였고, 2회 더 클로로포름 세척을 하였으며(이 절차를 통해 완충 조직 추출물에서 임의의 유기 용매 및 지용성 화합물을 제거할 수 있었다), 궁극적으로 수성 10% 조직 균질물을 갖도록 10 mM KH₂PO₄, pH 7.40로 부피를 조정하였으며, 분석될 때까지 -80℃에서 보관된다.

에너지 대사산물, 항산화제 및 산화적/질산화적 스트레스 바이오마커의 HPLC 분석

각 탈단백질화된 조직 샘플의 분취량을 0.45μm HV Millipore 필터를 통해 여과하였고, 200~300nm 파장으로 설정된 고감도 다이오드 어레이 검출기(5cm 광 경로 플로우 셀 장착)와 함께, Surveyor System로 구성된 HPLC 장치에 연결되어 있는, 자체 가드 칼럼(Thermo Fisher Scientific, Rodano, Milan, Italy)이 제공된 Hypersil C-18, 250 4.6 mm, 5μm 입자 크기 칼럼에 로드(200μl)했다. 데이터 수집 및 분석은 HPLC 제조업체에서 제공한 ChromQuest® 소프트웨어 패키지를 사용하여 PC에서 수행되었다.

조직 에너지 상태와 관련된, 미토콘드리아 기능 항산화제 및 산화적/질산화적 스트레스를 나타내는, 대사산물들(하기 열거됨)을 존재하는 이온-페어링 HPLC 방법(Lazzarino et al., Anal Biochem. 2003; 322: 51-59; Tavazzi et al., Clin Biochem. 2005; 38: 997-1008)을 약간 변형시켜, 단일 크로마토그래피 실행에서 분리시켰다. 조직 추출물의 크로마토그래피 실행에서 관심대상 화합물의 할당 및 산출은 적절한 파장(206, 234 및 260 nm)에서 머무름 시간, 흡수 스펙트럼 및 피크 면적을 공지 농도로 새로-준비된 초-순도 표준 혼합물의 크로마토그래피 실행 피크와 비교함으로써 수행되었다.

화합물들의 목록: 시토신, 크레아티닌, 우라실, 베타-슈도우리딘, 시티딘, 하이포잔틴, 구아닌, 잔틴, CDP-콜린, 아스코르브산, 우리딘, 아질산염(NO₂), 환원된 글루타티온(GSH), 이노신, 요산, 구아노신, CMP, 말론디알데하이드(MDA), 질산염(NO₃), UMP, NAD⁺, ADO, IMP, GMP, UDP-포도당(UDP-Glc), UDP-갈락토스(UDP-Gal), UDP-N-아세틸-글루코사민(UDP-GlcNac), UDP-N-아세틸-갈락토사민(UDP-GalNac), AMP, GDP-포도당, UDP, GDP, NADP⁺, ADP-리보스, CTP, ADP, UTP, GTP, NADH, ATP, NADPH, 말로닐-CoA, 조효소 A(CoA-SH), 아세틸-CoA, N-아세틸아스파테이트(NAA).

유리 아미노산 및 아미노기 함유 화합물의 HPLC 분석

주요 유리 아미노산(FAA) 및 아미노기를 함유하는 화합물들(AGCC)(아래 열거됨)의 동시 측정은 도체에서 기술된 바와 같이(Amorini et al., J Cell Mol Med. 2017, 21(3): 530-542; Amorino et al., Mol Cell Biochem. 2012, 359: 205-216), OPA 및 MPA의 혼합물로 샘플의 프레칼럼 유도체화(precolumn derivatization)를 이용하여 수행되었다. 간략하게 설명하자면, 25mmol/l OPA, 1% MPA, 237.5mmol/l 붕산나트륨, pH 9.8로 구성된 유도체화 혼합물을 매일 준비하였고, 오토샘플러에 넣었다. OPA-MPA를 사용한 샘플(15μl)의 자동화된 프레칼럼 유도체화는 24℃에서 수행되었고, 후속 크로마토그래피 분리를 위해, 이러한 유도체화된 혼합물 25μl를 HPLC 칼럼(Hypersil C-18, 250×4.6 mm, 입자 크기 5μm, 온도 21℃로 설정됨)에 로딩하였다. 글루탐산염을 정확하게 정량화시키기 위해, 단백질이 제거된 뇌 추출물은 상기 유도체화 절차 및 후속 주입-전, HPLC-등급 H₂O로 20배 희석되었다. OPA-AA와 OPA-AGCC의 분리는 적절한 단계 구배를 사용하여, 두 가지 이동상(이동상 A = 24mmol/l CH₃COONa + 24mmol/l Na₂HPO₄ + 1% 테트라하이드로퓨란 + 0.1% 트라이플루오로아세트산, pH 6.5, 이동상 B = 40% CH₃OH + 30% CH₃CN + 30% H₂O)을 사용하여 1.2 ml/분의 유속으로 수행되었다.

FAA 화합물 및 AGCC 화합물의 목록: 아스파르트산염(ASP), 글루타메이트(GLU), 아스파라긴(ASN), 세린(SER), 글루타민(GLN), 히스티딘(HIS), 글리신(GLY), 트레오닌(THR), 시트룰린(CITR), 아르기닌(ARG), 알라닌(ALA), 타우린(TAU), γ-아미노부티르산(GABA), 티로신(TYR), S-아데노실호모시스테인(SAH), L-시스타티오닌(L-Cystat), 발린(VAL), 메티오닌(MET), 트립토판(TRP), 페닐알라닌(PHE), 이소류신(ILE), 류신(LEU), 오르니틴(ORN), 리신(LYS).

조직-형태학적 분석을 위한 뇌 조직 프로세싱

적절한 마취 후, 래트를 (Di Pietro et al., Sci Rep. 2017, 7(1): 9189)에서 기술된 바와 같이, 경동맥 관류시켰다. 간략하게 설명하자면, 가슴절개술을 시행하였고, 모든 수술 동안 혈액 응고를 피하기 위해, 문맥에 헤파린 용액을 투여했다. 이후, 우심방 절개를 시행하였고, 관류바늘을 상행 대동맥을 향해 진격시켰다. pH 7.4의 PBS 용액에서 100 ml 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 추가 관류하기 전, 혈액을 씻어내기 위해, pH 7.4에서 포스페이트 완충 용액(PBS) 100ml로 관류를 수행했다. 두개골에서 신속하게 제거한 후, 각 뇌를 4℃에서 2시간 동안 PBS 용액내 4% PFA에 침지에 의해 고정시켰다. 4℃에서 24시간 동안 증가하는 수크로스 용액을 증가시키면서(10%, 20% 및 30%) 풍부화된 PBS에 전체 뇌를 침지시켜, 동결 보호하였고, 그 다음 그 다음 박리-형 몰드 용기 (Agar Scientific, Essex, UK)에서 최적의 절단 온도 매립 매질(OCT) (Thermo Shandon, Runcorn, UK)에 매립하였다. OCT에 침지된 뇌는 -80℃에서 보관하기 전, 분쇄된 드라이아이스에 급속 냉동시켰다.

통계학적 분석

그룹 간 차이는 반복 측정에 대한 양-방향 Student's t-테스트로 추정되었다. 오로지 0.05 미만의 양방(two-tailed) P-값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.

결과

sTBI-후 2일차 시점에 기록된 생화학적 데이터 요약

측정된 뇌 에너지 대사에 있어서 LMW-DS의 용량 증가 효과

표 6은 포스포릴화된 고-에너지 퓨린 화합물 및 피리미딘 화합물에 대한 값을 요약한 것이다. sTBI로 인한 트라이포스페이트 뉴클레오타이드(ATP, GTP, UTP 및 CTP)의 고갈이 특히 명백하며, ADP 및 UDP-포도당(UDP-GlcNac) 및 UDP-갈락토스(UDP-GalNac)의 N-아세틸화 유도체의 증가도 동반되었다.

손상-후 이 시점에서, LMW-DS를 이용한 치료는 세포 에너지 대사의 개선에 있어서 단지 부분적으로만 효과적이었다: 테스트된 약물의 세 가지 용량 모두에서 고-에너지 포스페이트(ATP, GTP, 및 CTP)의 유의미하게 더 높은 값이 기록되었다. UTP와 ADP의 농도에는 영향이 나타나지 않았다. 래트에서 TBI-후 48시간 시점이 뇌 대사의 중요한 시점임을 상기할 가치가 있으며, 미토콘드리아 품질 관리의 변화를 비롯한, 미토콘드리아 기능의 최대 변경과 일치한다. 이러한 TBI 실험 모델에서, 이 시점은 대뇌 대사의 회복 또는 회복이 특정되지 않는, 일종의 "전환점"으로 간주될 수 있다.

표 6 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 에너지 대사산물(포스포릴화된 퓨린 및 피리미딘)의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

표 6 - 25에서, 굵게 표시된 부분은 대조군과 유의미하게 상이함을 나타낸다(p < 0.05); 굵게 밑줄로 표시된 부분은 TBI와 유의미하게 상이함을 나타내고 (p < 0.05); 그리고 굵게 기울기체로 표시된 부분은 대조군과 TBI모두와 유의미하게 상이함을 나타낸다(p < 0.05).

니코틴 조효소에 대한 LMW-DS의 용량 증가 효과

산화된(NAD⁺ 및 NADP⁺), 그리고 환원된(NADH 및 NADPH) 니코틴 조효소의 값은 표 7에 요약되어 있다. 표 7은 대사가 해당작용(glycolysis) 또는 미토콘드리아 산화적 포스포릴화에 얼마나 의존하는 지의 평가에 적합한 NAD⁺/NADH 비율로 산출된 무차원(adimensional) 값을 보고한다.

본 명세서에서 이전에 관찰된 바와 같이, sTBI는 NAD⁺, NADP⁺ 및 NAD⁺/NADH 비율의 감소를 야기하였다. 이 시점에서, LMW-DS를 이용한 치료는 니코틴 조효소 풀(pool)을 상당히 보호하였고, 해당작용으로의 대사 전환을 회피하고, 이로 인하여 전반적으로 더 나은 미토콘드리아 기능을 간접적으로 암시하게 되는, 테스트된 최대 용량(15 mg/kg b.w.)에서만 효과적이었다.

표 7 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 니코틴 조효소의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다. NAD⁺/NADH 비율은 무차원적이다(adimensional).

CoA-SH 유도체에 있어서 LMW-DS 투여분량 증가 효과

표 8은 유리 CoA-SH 및 CoA-SH 유도체에 대한 데이터를 보고한다. 특히, Acetyl-CoA는 미토콘드리아 대사에 중요한 화합물로써 트라이카복실산 회로(TCA 회로)의 올바른 기능을 가능하게 하고, 따라서 전자 전달 체인(ETC)에 대한 지속적인 전자 공급을 확보한다. TCA는 환원된 조효소(NADH 및 FADH₂) 생성을 위한 주요 세포 주기이며, 전자를 미토콘드리아 복합체 I 및 II로 각각 전달함으로써, ETC 및 산화 대사의 연료가 된다. 모든 화합물, 특히, Acetyl-CoA는 sTBI의 영향을 크게 받는다. 이 화합물의 부분적인 구제(rescue)는 5 또는 15 mg/kg b.w일 때 관찰되었다. LWM-DS는 손상-후 30분 시점에 동물들에게 투여되었다.

표 8 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 유리 CoA-SH 및 CoA-SH 유도체(아세틸-CoA 및 말로닐-CoA)의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

항산화제 및 산화적/질산화적 스트레스 바이오마커에 있어서 LMW-DS 투여분량 증가 효과

표 9는 주요 수용성 뇌 항산화제(아스코르브산 및 GSH)의 농도 및 산화적 (MDA) 스트레스 및 질산화적 스트레스(-NO₂ ^- 및 -NO₃ ^-)의 바이오마커의 농도를 보여준다. 말론디알데하이드(MDA)는 ROS-매개된 지질 과산화의 결과로써, 막 인지질의 불포화 지방산 분해로부터 비롯된다. 아질산염(-NO₂ ^-) 및 질산염(-NO₃ ^-)은 산화질소(NO) 대사의 안정적인 최종 산물이며, 병리학적 상태서 유도성 형태의 산화질소 합성효소(iNOS)에 의해 과도하게 생성되며, ROS와의 반응을 통해 반응성 질소 종(RNS)을 발생시킨다:

충격-후 2일차 시점에, sTBI를 경험한 래트에서 두 가지 수용성 항산화제들이 25~45% 감소했다. 산화적/질산화적 스트레스의 조짐에서 결과적인 증가도 또한 기록되었다. LWM-DS의 투여에 의해 뇌 조직의 아질산염과 질산염의 명백한 감소와 함께, 아스코르브산과 환원된 글루타티온(GSH)의 농도가 유의적으로 개선되었다. 이러한 효과는 15 mg kg/b.w가 사용될 때, 더 두드러졌다.

표 9 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 항산화제 및 산화적/질산화적 스트레스 바이오마커의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

탈-포스포릴화된 퓨린 및 피리미딘에 있어서 LMW-DS 투여분량 증가 효과

표 10에 보고된 대부분의 화합물들은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오타이드의 분해 경로에서 유래된 것으로써, 세포 에너지 대사와 간접적으로 연계된다. sTBI를 겪은 래트는 이러한 모든 화합물의 대뇌 농도가 더 높았지만, 그러나, 이들 중에서 CDP-콜린은 투여에 의해 가장 긍정적인 영향을 받았다.

표 10 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 탈-포스포릴화된 퓨린 및 피리미딘의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

N-아세틸아스파테이트(NAA)에 있어서 LMW-DS 투여분량 증가 효과

NAA는 포유류 뇌에서 가장 풍부한 N-아세틸화 아미노산이며, 인간의 신경 전달 물질인 글루탐산염와 거의 같은 농도로 존재한다. NAA의 생물학적 역할에도 불구하고, 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 전-임상 연구 및 임상 연구 모두에서, TBI는 NAA 농도를 감소시키고, 머리 부상-후 시간 경과는 ATP의 농도를 반영한다고 이미 밝혀졌다. 특히, sTBI는 NAA 항상성에 비-가역적 변형을 일으키고, NAA는 뇌 에너지 대사의 좋은 대리 표지자이며, NAA 수준의 감소 및 회복은 뇌진탕-후 운동선수의 증상 제거보다 훨씬 더 느리다. 따라서, NAA는 TBI에 대한 연구에서 특별한 관련이 있다.

영향 2일 후 sTBI 래트에서 전체 뇌 NAA의 40% 감소가 관찰되었다(도 9). LMW-DS를 5 또는 15 mg/kg b.w로 투여했을 때, NAA 농도에 유익한 효과들이 나타났다. 대조군보다 현저히 낮음에도 불구하고, 두 가지 약물 투여분량 중 하나를 투여한 래트의 NAA는 sTBI 쥐에서 발견된 값보다 훨씬 높았고, 가장 높은 투여분량의 LMW-DS를 투여받은 래트에서 NAA 수준이 가장 높았다.

신경 전달에 관여하는 유리 아미노산에 대한 LMW-DS의 투여분량 증가 효과

표 11에 열거된 화합물들은 신경전달에 직접적으로 관련된 아미노산(GLU, GABA), 간접적으로 연루된 아미노산(GLN, ASP, ASN, GLY, SER, THR, ALA)이다. 특히, GLU는 GABA에 의해 이의 작용에 반대-작용하는 주요 흥분성 아미노산이다. GLU의 흥분성독성은 SER, GLY, THR 및 ALA에 의해 조절되며, 뉴런 및 성상세포들이 연루된 GLU-GLN 주기의 기능과 연계된다. 기존 연구에서 볼 수 있듯이, 우리는 여기에서 sTBI 래트에서 손상-후 2일차 시점에 이들 아미노산의 대부분이 증가한다는 것을 알아냈다. LMW-DS의 단회 투여로 동물 치료에서 해당 약물이 5 또는 15 mg/kg b.w로 피하 주입될 때 부분적으로 효과적이었다. 대부분의 경우, 상이한 화합물들의 값은 치료받지 않은 sTBI 동물들의 그룹에서 발견된 값보다 유의미적으로 더 좋았지만, 대조군의 값보다는 좋지 않았다.

표 11 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 신경전달 기능이 있는 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

메틸 사이클에 관여하는 유리 아미노산에 대한 LMW-DS의 투여분량 증가 효과

표 12에 보고된 유리 아미노산들은 소위 메틸 주기에 관여하여 세포 대사, 유리 -SH 기를 갖는 유일한 아미노산인 시스테인의 형성에서 메틸 공여체로 작용하는 화합물의 항상성을 조절한다. 심각한 두부 외상은 이러한 중요한 대사 경로의 주요 행위자에 중대한 변화를 일으켰다. 메티오닌의 복원은 테스트된 모든 용량에서 LWM-DS에 의해 달성되었다. 약물 치료는 다른 아미노산들의 정상화에 부분적으로 효과적이었다. 영향을 받은 후 7일 시점에서 L-시스타티오닌(L-Cystat)의 변화에 대한 설명은 해당 표에 제공될 것이다.

표 12 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 메틸 사이클 및 -SH 그룹의 항상성에 연루된 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

산화질소 (NO) 생성에 관여하는 유리 아미노산에 대한 LMW-DS 용량 증가 효과

표 13은 산화질소 합성효소 (NOS)에 의해 촉매되는 반응에서 NO 생성에 관여하는 유리 아미노산의 농도를 도시하며, 상기 효소는 3가지 아이소형인 내피 NOS(eNOS), 뉴런 NOS(nNOS), 유도성 NOS(iNOS)으로 존재하는 효소 패밀리다. 마지막 아이소형(iNOS)은 질산화적 스트레스에 연루된다. 산화질소는 아르기닌(ARG)이 질소 원자를 공여하여, 부분 산화되어 시트룰린(CITR)과 NO를 형성하는 복합 반응을 통해 생성된다. sTBI-후 2일차 시점에서 동물들에서 ARG의 감소 및 CITR의 증가가 동시에 나타냈는데, 이는 안정적인 NO 최종 생성물인 아질산염 및 질산염의 증가를 보여주는 데이터와 일치한다(표 8). LMW-DS을 15 mg/kg b.w의 투여분량으로 투여할 때, 특히 효과적이었다.

표 13 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 산화질소 형성에 연루된 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

장쇄(long-chain) 유리 아미노산에 대한 LMW-DS의 투여분량 증가 효과

표 14에 보고된 유리 아미노산들은 세포가 TCA 회로를 보충하기 위해 사용하는 α-케토산 생성에 유용한 탄소 골격의 공급원을 나타낸다. 이들 화합물 중, 유일하게 이소류신(ILE)만이 sTBI에 의해 유의미하게 영향을 받았고, 약물 치료를 받은 쥐에서 회복되었다.

표 14 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 장쇄 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

삼투질 및 방향족 유리 아미노산으로 작용하는 유리 아미노산에 대한 LMW-DS의 투여분량 증가 효과

표 15에 요약된 결과는 sTBI가 이러한 모든 유리 아미노산의 농도를 증가시켰음을 분명히 보여준다. 특히, 타우린(TAU)의 증가는 가장 중요한 뇌 삼투물질 중 하나의 수준을 증가시켜, 세포 부종에 대응하려는 시도를 시사할 수 있다. 이와 달리, 방향족 유리 아미노산들의 증가는 신경전달물질인 세로토닌(트립토판으로부터 형성됨)과 도파민(먼저 페닐알라닌의 생체전환, 그 다음 티로신의 생체변환으로부터 생성됨)의 생합성 감소를 암시할 수 있다. 영향을 받은 이후, 이 시점에서 LMW-DS 투여의 현저한 효과는 관찰되지 않았다.

표 15 - 뇌외상 유도-후 30분 시점에 시행된, LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.)의 투여분량이 증량되는 단회 투여와 함께, 또는 이러한 투여 없이, sTBI-후 2일차 시점에 희생된 래트의 단백질제거된 뇌 균질액에서 측정된 삼투질 및 방향족 유리 아미노산으로 작용하는 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

sTBI-후 7일차 시점에 기록된 생화학적 데이터 요약

측정된 뇌 에너지 대사에 있어서 LMW-DS의 용량 증가 효과

표 16은 포스포릴화된 고-에너지 퓨린 화합물 및 피리미딘 화합물에 대한 값을 요약한 것이다. sTBI 후 7일차 시점에 트라이포스페이트 뉴클레오타이드(ATP, GTP, UTP 및 CTP)의 고갈 개선이 관찰되지 않았다는 것은 특히 분명하다. AMP와 ADP의 동반 증가는 UDP 유도체들(UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-GlcNac 및 UDP-GalNac) 농도에 상당한 변화와 동반되었다. 일반적으로, 부상-후 상당 시간이 흐른 후 sTBI에 의해 유도된 생화학적, 대사적, 분자적 변경이 악화된다는 점을 특징으로 하는 점을 주의해야 한다.

손상 후, 이 시점에서 LMW-DS 치료는 약물 투여분량이 1 mg/kg b.w보다 높을 때 더 분명하게 대뇌 에너지 대사의 일반적인 개선을 가져왔다. 15 mg/kg b.w. LWM-DS를 반복 투여받은 래트에서 조차도 대조군과의 차이가 기록되었지만, 약물 치료를 받은 동물들에서 뉴클레오타이드 트라이포스페이트의 상당히 높은 값이 발견되었다. sTBI 동물들에게 투여되는 약물의 투여분량을 증가시키면서 점진적으로 증가되는 ATP/ADP 비율(미토콘드리아 포스포릴화 능력의 좋은 지표로 간주됨)의 무차원 값의 산출된, 무차원 값의 진행적 회복이 특히 유의미적이다.

표 16 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 에너지 대사산물 (포스포릴화된 퓨린 및 피리미딘)의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

약물 효과가 약물 복용량과 관련이 있음을 더 잘 보여주기 위해, ATP에 관한 결과를 도 10에서 그래프를 통하여 보고했다. ATP 증가는 투여된 투여량과 어떤 식으로든 관련되었고, 약물 투여는 테스트된 임의의 투여분량에서 가장 중요한 고-에너지 포스페이트를 상당히 증가시켰음을 관찰할 수 있다.

니코틴 조효소에 대한 LMW-DS의 용량 증가 효과

산화된(NAD⁺ 및 NADP⁺), 그리고 환원된(NADH 및 NADPH) 니코틴 조효소의 값은 표 17에 요약되어 있다. 표 17은 대사가 해당작용 또는 미토콘드리아 산화적 포스포릴화에 얼마나 의존하는 지의 평가에 적합한 NAD⁺/NADH 비율로 산출된 무차원 값을 보고한다.

이전에 관찰된 바와 같이, sTBI 래트에서 손상-후 7일차 시점에서 니코틴 조효소 및 NAD⁺/NADH 비율의 현저한 감소가 기록되었다. 최저 투여분량을 제외하고, LMW-DS을 이용한 치료에서 니코틴 조효소 농도가 크게 개선되었다. 특히, 15 mg/kg b.w의 LMW-DS 단회 투여 및 반복 투여로 NAD+ 수준은 정상화되고, 대조군 동물에서 결정된 정확한 NAD⁺/NADH 비율을 복원할 수 있었다.

표 17 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 니코틴 조효소의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

CoA-SH 유도체에 있어서 LMW-DS 투여분량 증가 효과

표 18은 유리 CoA-SH 및 CoA-SH 유도체에 대한 데이터를 보고한다. 5 또는 15 mg/kg b.w(이 투여분량은 단일 및 반복 투여 모두에서)를 투여하는 경우 CoA-SH 및 Acetyl-CoA 모두에 대해 상당한 긍정적 효과가 탐지되었으며, 이로써 TCA 주기의 기능을 위한 훨씬 더 유리한 대사 조건이 제시된다.

표 18 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 유리 CoA-SH 및 CoA-SH 유도체(아세틸-CoA 및 말로닐-CoA)의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

표 19는 주요 수용성 뇌 항산화제(아스코르브산 및 GSH)의 농도 및 산화적 (MDA) 스트레스 및 질산화적 스트레스(-NO₂ ^- 및 -NO₃ ^-) 스트레스의 바이오마커의 농도를 보여준다. 충격-후 7일차 시점에, sTBI를 경험한 래트에게서 이들 모든 수용성 항산화제들의 농도에서 회복은 없었다. 산화적/질산화적 스트레스의 현저하게 높은 수준의 특징들도 기록되었다. LWM-DS 투여의 가장 높은 단회 투여분량 및 반복 투여분량의 효과는 뇌 조직의 아질산염과 질산염의 명백한 감소와 함께, 아스코르브산 및 환원된 글루타티온(GSH) 농도 구제에 특히 유익했다. 이들 효과는 5 mg kg/b.w일 때 또한 유의미했다.

표 19 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 항산화제 및 산화적/질산화적 스트레스 바이오마커의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

약물 효과가 약물 복용량과 관련이 있음을 더 잘 이해하기 위해, ATP에 관한 결과를 도 11 및 도 12에서 아스코르브산 및 GSH 관련된 결과를 그래프를 통하여 보고했다.

퓨린 뉴클레오타이드 및 피리미딘 뉴클레오타이드의 분해 경로로부터 기인되며, 세포 에너지 대사와 간접적으로 연결되는 표 20에 보고된 대부분의 화합물에서 추가 악화는 sTBI를 받은 래트의 손상-후 7일차 시점에서 관찰되었다. 이들 화합물의 대부분은 약물 투여에 의해 긍정적인 영향을 받았다.

표 20 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 탈-포스포릴화된 퓨린 및 피리미딘의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

앞서 언급한 바와 같이, sTBI는 NAA 항상성에 돌이킬 수 없는 변형을 일으킨다. 심지어 이 연구에서도, 도 13을 참조하면, 우리는 sTBI-후 7일차 시점에 전체 뇌 NAA는 대조군 쥐에서 측정된 것보다 약 50% 낮다는 것을 발견했다. 흥미롭게도, NAA의 투여분량 의존적 증가는 LMW-DS의 단회 투여분량을 증가시키거나, 또는 시험된 최대 투여분량을 반복 투여한 래트에서 검출되었다.

표 21에 열거된 화합물들은 신경전달에 직접적으로 관여하는 아미노산(GLU, GABA)과 간접적으로 관여하는 아미노산(GLN, ASP, AASN, GLY, SER, THR, ALA)이다. 이들 아미노산의 대부분은 대조군과 비교할 때, 손상 후 7일차 시점에 sTBI 래트에서 여전히 더 높았다. 이 표에서 LMW-DS를 15 mg/kg b.w.로 단회 투여 또는 반복 투여로 약물을 피하 주입할 때, 특히 효과적이었다는 것이 분명하였다. GLU의 정상화에 특히 관련되며, 따라서 LMW-DS가 sTBI-후 과도한 GLU 방출로 인한 흥분독성을 제거할 수 있음을 나타낸다.

표 21 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 신경전달 기능이 있는 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

표 22에 나타낸 바와 같이, 소위 메틸 주기 또는 시스테인 형성에 관여하는 유리 아미노산들의 수준은 대조군의 상응하는 값과 비교할 때, sTBI 래트에서 충격-후 7일차 시점에 여전히 상이하였다. 최고 용량의 LWM-DS를 투여받은(단회 투여 또는 반복 투여 모두) 동물들에서 MET의 증가가 관찰되었다. 손상-후 2일차 시점에 이미 관찰된 바와 같이, 이러한 약물 수준에서 L-시스타티오닌(L-Cystat)이 상당히 증가했다. 이 화합물은 시스테인(CYS) 생성의 중간체이기 때문에, L-Cystat의 증가는 결과적으로 CYS의 증가를 야기할 수 있다는 가설을 세울 수 있다. CYS를 측정하려면 2차 아민 및 CYS와 반응하는 형광 화합물인 F-MOC를 사용한 추가 유도체화와 함께, 특정 추가 HPLC 분석이 필요하다는 점을 상기할 가치가 있다.

표 22 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 메틸 사이클 및 -SH 그룹에 연루된 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

표 23은 NO 생성에 직접 관여하는 유리 아미노산의 농도를 보여준다. sTBI-후 7일차 시점에서 동물들에서 ARG의 감소 및 CITR의 증가가 동시에 나타냈는데, 이는 안정적인 NO 최종 생성물인 아질산염 및 질산염의 증가를 보여주는 데이터와 일치한다(표 8). LMW-DS를 5 또는 15 mg/kg b.w.(단회 및 반복)의 투여분량으로 투여할 때, 특히 효과적이었다.

표 23 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 산화질소 형성에 연루된 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

세포가 TCA 회로를 보충하기 위해 사용하는 α-케토산 생성에 유용한 탄소 골격의 공급원을 나타내는 표 24에 보고된 유리 아미노산들은 sTBI-후 7일차 시점 및 관심대상 약물로 치료된 다른 동물군에서 실질적으로 정상이었다.

표 24 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 장쇄 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

표 25에 요약된 결과에서는 sTBI가 손상-후 7일 시점에 타우린(TAU) 농도의 증가를 야기했음을 분명히 보여준다. LMW-DS의 투여로 TAU 농도는 정상화되고, 방향족 아미노산이 증가되었다.

표 25 - LWM-DS(1, 5 및 15 mg/kg b.w.의 단회 투여 및 15 mg/kg b.w.의 반복 투여)의 증량 투여분량을 투여하거나, 또는 이의 투여없이, sTBI-후 7일차 시점에 희생된 래트의 단백질-제거된 뇌 균질액에서 측정된 삼투질 및 방향족 유리 아미노산으로 작용하는 유리 아미노산의 농도 대조군들은 모의-수술 동물로 나타낸다. 값은 각 그룹에 12마리의 동물의 평균 ± S.D.이며, nmol/g w.w로 표시된다.

논의

손상-후 다양한 시간대에서 sTBI를 경험한 래트의 뇌 대사산물에 대한 LMW-DS의 투여분량 증가 효과를 평가하기 위해 수행된 연구에서 이 화합물을 투여하면 대뇌 대사가 전반적으로 개선된다는 것을 증명하였다.

LMW-DS는 치료를 받지 않은 sTBI 동물에서 심하게 불균형을 이루는 미토콘드리아 관련 에너지 대사 회복에 효과적이었고, 트라이포스페이트 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오타이드의 농도에 긍정적 효과가 있었다. 특히, 충격-후 7일차 시점에 ATP 수준은 대조군의 값보다 단지 16% 낮았지만, sTBI 래트에서는 35% 감소되었다(표 16 및 도 10). 놀랍게도, 동일한 시점에에서 LMW-DS로 치료된 동물들의 NAA 농도는 대조군보다 단지 16% 낮은 반면, sTBI 동물들에서는 이 화합물의 값이 48% 더 낮게 나타났다. 이러한 발견은 NAA의 항상성과 올바른 미토콘드리아 에너지 대사 사이의 엄격한 연관 성을 다시 한 번 강력하게 확인시켜주며, 미콘드리아 기능에 있어서 긍정적으로 작용할 수 있는 약리학적 개입의 중요성이 강조된다.

LMW-DS 투여에 의해 생성되는 뇌 대사의 전반적인 개선에는 니코틴 조효소 및 유리 CoA-SH 및 CoA-SH 유도체의 대사도 연루되어 있었다. 이것은 약물 치료 동물이 sTBI에 제출되었음에도 불구하고, 정확한 산화-환원 반응을 보장하기 위해, TCA 사이클의 우수한 기능을 허용하는 준-정상 조효소를 가지고 있음을 의미한다.

앞서 언급한 뇌 대사의 개선은 다른 현저한 약물 효과, 즉, GLU 흥분성독성의 제거에 확실히 기여했다. 추가적으로, 이 약물은 황-함유 아미노산에 영향을 미쳤다. 아마도 이 효과는 S 원자들을 함유하는 약물 분자와 관련이 있을 수 있다. 이 원자의 생체이용률을 높이면 이러한 아미노산의 생합성이 순(net) 증가할 수 있고, 그 중 하나(MET)는 메틸화 반응과 소위 메틸 회로에서 중요하다.

이 연구에서 기록된 추가적인 긍정적 효과는 LMW-DS를 투여받은 sTBI 래트에서 항산화제의 증가, 그리고 산화적/질산화적 스트레스의 생화학적 징후의 감소였다. 심지어 이 현상조차도 미토콘드리아 기능의 정상화와 관련있을 수 있는데, 그 이유는 기능 장애 미토콘드리아가 ROS와 RNS 모두의 주요 세포 내 공급원이기 때문이다. LMW-DS의 효과가 sTBI-후 2일차 시점보다 7일차 시점에 더 분명했다는 것이 관련성있다. 이점은 약물 투여로 인한 뇌 대사의 전반적인 개선이 일시적인 현상이 아님을 강력하게 시사한다.

이 실험을 통해 무엇보다도, 항산화 상태 회복의 개선, ATP 생산 및 대사를 보존함으로써 미토콘드리아 ATP 에너지 공급 보호, LMW-DS에 의해 유도된 모든 미토콘드리아 포스포릴화 능력 정상화에서 볼 수 있는 것과 같이, LMW-DS가 미토콘드리아 기능을 보호하고 산화 스트레스를 줄이는 긍정적인 효과를 확인했다. 결과적으로, LMW-DS는 손상 또는 질환에 노출된 세포에서 미토콘드리아 기능을 보호하고, 그리고 보존할 수 있으며, 이것은 감염성 질병과 싸울 수 있는 기능 세포를 갖는 데 중요하다. LMW-DS에 의해 유도되는 대사 정상화는 폐 단계(단계 II)와 회복 단계(단계 IV) 모두에서 COVID-19 환자들에게 유익하다(도 25).

실시예 5

이 실시예는 ALS 환자들에서 항-응고제 및 항-혈전제로서의 LMW-DS의 가능성을 조사하였다.

재료 및 방법

이것은 ALS 환자를 대상으로 피하(s.c.) 투여된 LMW-DS의 안전성, 내약성 및 효능을 평가한 단일-중심, 개방 단일-부분 연구였다. 클리닉에 10회의 예정된 방문을 하였다: 1회, 2부(방문 1a 및 방문 1b)로 나누어 스크리닝 방문, 5회 IMP 투여 방문(방문 2 ~ 방문 6), 그리고 3회 추적 방문(방문 7 ~ 방문 9). 각 개별 환자의 연구 참여는 스크리닝 및 추적 방문을 포함하여, 대략적으로 4개월로 계획되었다.

IMP의 활성 약제학적 성분은 저-분자량 덱스트란 설페이트(LMW-DS), (ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780)이다. LMW-DS는 s.c. 주사를 위한 용액으로 사용되었고, 20 mg/mL LMW-DS 및 9 mg/mL NaCl로 구성된다. 각 유리 바이알에는 10mL이 함유되었다. 투여되는 투여분량은 첫 번째 LMW-DS 투여 이전, 방문 2 시점에서 환자의 체중에 따라 결정되었다. LMW-DS를 양측을 교대로, 복부, 허벅지 또는 엉덩이 (우선 순위에 따라)에 s.c. 주사했다. 1주 투여 간격으로, 1 mg/kg을 5회 투여했다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)의 변화는 방문할 때마다 채취한 혈액 샘플에서 기록되었다.

결과

기선 시점에서 평균 APTT는 LMW-DS 주입-전, 26.5초였다. 각 LMW-DS 치료-후, 투여-후 최대 2~2.5시간 시점에서 일시적인 증가가 관찰되었으며, 기선 시점과 비교하여 상대적인 변화가 있었다: 차례로, +33.5% 및 +26.5%. APTT 값은 투여-후 6시간 시점에서 투여-전 수준으로 복귀되었다.

논의

급성 조직 염증은 응고 인자 VIII를 상승시켜, 혈액에서 aPTT를 감소시키고, 조직에서 미세혈전증을 유발하다. 이 실시예에 제시된 실험 데이터는 LMW-DS가 혈액에서 aPTT를 증가시켜 항-응고제 및 항-혈전제로서 작용함을 보여준다. 이러한 항-응고 및 항-혈전 효과는 과다염증 단계(단계 III) 동안 COVID-19 대상체에게 유익하다(도 25).

실시예 6

이 연구에서, LMW-DS는 BioMAP® Diversity PLUS 패널의 프로파일링을 특징으로 한다. BioMAP® 패널은 시험관-내 형식으로 인체의 다양한 측면을 모델링하도록 설계된 인간 1차 세포 기반 시스템으로 구성된다. BioMAP® Diversity PLUS 패널의 12개 시스템(표 26)으로 인간의 다양한 질환 상태를 모델링하는 광범위한 시스템 세트에 걸쳐 편향되지 않은 방식으로 테스트 물질의 특성화가 가능하다. BioMA®P 시스템은 건강한 인간 공여자들로부터 하나 또는 그 이상의 1차 세포 유형, 그리고 인간 조직 또는 병리학적 상태에서 자연적으로 발생되는 관련 신호 네트워크를 포착하기 위해 추가된 사이토킨 또는 성장 인자와 같은 자극으로 구성된다. 혈관 생물학은 Th1(3C 시스템) 및 Th2(4H 시스템) 염증 모두의 환경, 뿐만 아니라 동맥 평활근 세포에 특정한 Th1(CASM3C 시스템)염증 상태에서 모델링된다. 추가 시스템은 단핵구-유도된 Th1 염증(LPS 시스템) 또는 T 세포 자극(SAg 시스템), 대식세포 활성화에 의해 유도되는 만성 Th1 염증(lMphg 시스템) 그리고 미발달(germinal) 중심에서 발생되는 B 세포의 T 세포 의존적 활성화(BT 시스템)를 비롯한, 전신 면역 반응의 측면들을 개괄한다. BE3C 시스템(Th1) 및 BF4T 시스템(Th2)은 폐의 기도 염증을 나타내는 한편, MyoF 시스템은 근섬유모세포-폐 조직 리모델링을 모델링한다. 마지막으로, 피부 생물학은 Th1 피부 염증을 모델링하는 KF3CT 시스템, 그리고 상처 치유를 모델링하는 HDF3CGF 시스템에서 다루어진다.

각 테스트 물질은 개별 시스템 환경 내에서 단백질 바이오마커 판독값의 변화로부터 생성되는 특징적 BioMAP® 프로필을 생성한다. 바이오마커 판독값(시스템당 7 - 17개)은 치료 관련성 및 생물학적 관련성을 위해 선택되고, 질환 결과 또는 특정 약물 효과에 대해 예측되며, 알려진 작용 기전(MoA)이 있는 약제를 사용하여 검증이다. 각 판독값은 단백질을 검출하는 면역-기반 방법, 가령, ELISA, 또는 증식 및 생존력을 측정하는 기능적 검정에 의해 정량적으로 측정된다. BioMAP® 판독값은 다양하며, 세포 표면 수용체, 사이토킨, 케모킨, 기질 분자 및 효소들이 내포된다. 전체적으로 BioMAP® Diversity PLUS 패널은 특정 BioMAP® 시스템의 생리학적 맥락 내에서 발생하는 생물학적 변화를 포착하는 148개의 바이오마커 판독값을 함유한다.

재료 및 방법

4가지 농도의 LMW-DS(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780; 150nM, 440nM, 1.3μM, 4μM)가 Eurofins의 BioMAP® Diversity PLUS 패널에서 조사되었다.

다양성 PLUS를 위한 방법

BioMAP 시스템의 인간 1차 세포는 세포 배양 조건에 대한 적응을 최소화하고, 생리학적 신호 반응을 보존하기 위해, 초기 계대(4회차 계대 또는 이보다 일찍)에서 사용된다. 모든 세포는 제조업체의 권장 사항에 따라, 상업적으로 구입하고, 처리된된 다수(n = 2 - 6)의 공여자 풀에서 가져온 것이다. 인간 혈액 유래 CD14⁺ 단핵구는 Mphg 시스템에 추가되기-전, 시험관 내에서 대식세포로 분화된다. 이용된 약어는 다음과 같다: 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 인간 신생아 진피 섬유아세포(HDFn), B 세포 수용체(BCR), T 세포 수용체(TCR) 및 Toll-유사 수용체(TLR).

각 시스템에서 사용되는 세포 유형 및 자극은 다음과 같다: 3C 시스템[HUVEC + (IL-1β, TNFα 및 IFNγ)], 4H 시스템[HUVEC + (IL-4 및 히스타민)], LPS 시스템[PBMC 및 HUVEC + LPS(TLR4 리간드)], SAg 시스템[PBMC 및 HUVEC + TCR 리간드], BT 시스템[CD19⁺ B 세포 및 PBMC + (α-IgM 및 TCR 리간드)], BF4T 시스템[기관지 상피 세포 및 HDFn + (TNFα 및 IL-4)], BE3C 시스템[기관지 상피 세포 + (IL-1β, TNFα 및 IFNγ)], CASM3C 시스템[관상 동맥 평활근 세포 + (IL-1β, TNFα 및 IFNγ)], HDF3CGF 시스템[HDFn + (IL-1β, TNFα, IFNγ, EGF, bFGF 및 PDGF-BB)], KF3CT 시스템[각질세포 및 HDFn + (IL-1β, TNFα, IFNγ 및 TGFβ)], MyoF 시스템[분화된 폐 근섬유아세포 + (TNFα 및 TGFβ)] 및 Mphg 시스템[HUVEC 및 M1 대식세포 + Zymosan(TLR2 리간드)].

시스템은 단일 세포 유형 또는 공동 배양 시스템으로부터 파생된다. 흡착 세포 유형은 합류될 때까지, 96-웰 또는 384-웰 플레이트에서 배양한 다음, PBMC(SAg 및 LPS 시스템)를 추가한다. BT 시스템은 PBMC와 공동 배양되고, BCR 활성화제 및 낮은 수준의 TCR 자극으로 자극된 CD19+ B 세포로 구성된다. 자극 1-hr 전, DMSO(소분자; 최종 농도 ≤ 0.1%) 또는 PBS(생물학적 제제)에서 준비된 테스트 제제들을 표시된 농도로 첨가하고, 24시간 동안, 또는 달리 언급이 없는 한, 배양물에 유지시킨다(48-hr, MyoF 시스템; 72-hr, BT 시스템(가용성 판독값); 168-hr, BT 시스템(분비된 IgG)). 각 플레이트는 각 시스템에 적합한 약물 대조군(가령, 1.1μM의 전해내려오는(legacy) 대조군 테스트 제제 콜히친), 음성 대조군(가령, 비-자극 조건) 및 비히클 대조군(가령, 0.1% DMSO)을 함유한다. 직접적인 ELISA는 세포 관련 및 세포막 표적의 바이오마커 수준 측정에 사용된다. 상청액의 가용성 인자들은 HTRF® 검출, 비드- 기반 멀티플렉스 면역분석, 또는 포획 ELISA를 사용하여 정량화된다. 세포 증식 및 생존력(세포독성)에 대한 시험 제제들의 명백한 역효과는 흡착 세포의 경우 설포로다민 B(SRB) 착색으로 검출되며, 현탁된 세포의 경우 alamarBlue® 환원에 의해 검출된다. 증식 분석의 경우, 개별 세포 유형들을 준-합류로 배양시키고, 각 시스템에 최적화된 시점(3C 시스템 및 CASM3C 시스템의 경우 48-hr; BT 시스템 및 HDF3CGF 시스템의 경우 72-hr; SAg 시스템의 경우 96-hr)에서 측정한다. 흡착 세포들에 대한 세포독성은 SRB로 측정된 (3C 시스템, 4H 시스템, LPS 시스템, SAg 시스템, BF4T 시스템, BE3C 시스템, CASM3C 시스템, HDF3CGF 시스템, KF3CT 시스템, 및 Mphg 시스템의 경우 24-hr; MyoF 시스템의 경우 48-hr), 그리고 현탁 세포의 경우, 명시된 시점에서 alamarBlue 착색(SAg 시스템의 경우 24-hr; BT 시스템의 경우 42-hr)으로 측정된다.

데이터 분석

테스트 제제-처리된 샘플에서 바이오마커 측정값을 대조군 샘플의 평균(동일한 플레이트의 적어도 6개의 비히클 대조군)으로 나누어, log₁₀ 변환되는 비율을 생성한다. 유의성 예측 범위는 95% 신뢰 구간에서 기록된 비히클 대조군 데이터를 사용하여 산출된다.

프로파일 분석

2개 또는 그 이상의 연속 농도가 비히클 대조군에 비해 동일한 방향으로 변경되고, 유의성 범위를 벗어나 효과 크기가 > 20%인 (|log₁₀ 비율| > 0.1), 적어도 이상의 농도를 가질 때, 바이오마커 활성의 주석이 달린다. 바이오마커 주요 활성은 이들 활성이 일부 시스템에서는 증가하지만, 그러나 다른 시스템에서는 감소하는 경우, 조정된 것으로 기술된다. 총 단백질 수준이 50% 이상 감소할 때, 세포독성 상태로 표시되며(SRB 또는 alamarBlue 수준의 log₁₀ 비율 < -0.3), X축 상에 얇은 검은색 화살표로 표시된다. 3개 또는 그 이상의 시스템에서 세포독성이 검출될 때, 해당 화합물은 광범위한 세포독성을 갖는 것으로 간주된다. 검출가능한 광범위한 세포독성을 갖는 테스트 제제들의 농도는 바이오마커 활성 주석 및 다운스트림 벤치마킹, 유사성 검색 및 클러스터 분석에서 배제된다. 항-증식 효과는 더 낮은 밀도로 도말된 세포들로부터 SRB 또는 alamarBlue log₁₀ 비율 값 < -0.1로 특정되며, X축 상에 회색 화살표로 표시된다. 세포독성 및 항-증식 화살표는 프로파일 주석에 대해 표시된 임계값을 충족하기 위해, 오로지 하나의 농도만 필요로 한다.

벤치마크 분석

두 프로파일에 대한 판독값이 동일한 방향에서 효과 크기 > 20%로 유의성 범위 밖에 있을 때, 공통 바이오마커 판독값의 주석이 달린다. 하나의 프로파일이 효과 크기 > 20%의 유의성 범위 밖의 판독값을 가지고, 그리도 또다른 프로파일에 대한 판독값은 범위 내부 또는 반대 방향일 경우, 차별적 바이오마커로 주석이 달린다. 명시되지 않는 한, 테스트 제제와 벤치마크 제제 모두의 최고 비-세포독성 농도는 벤치마크 오버레이 분석에 내포된다.

유사성 분석

두 프로파일에 대한 판독값이 동일한 방향에서 효과 크기 > 20%로 유의성 범위 밖에 있을 때, 공통 바이오마커 판독값의 주석이 달린다. 세포독성이 있는 3개 또는 그 이상의 검출가능한 시스템을 갖는 테스트 제제들의 농도는 유사성 분석에서 배제된다. 탐지가능한 세포독성을 가진 1 - 2개 시스템을 갖는 테스트 제제들의 농도는 테스트 제제의 최고 농도와 일치하는 데이터베이스의 오버레이와 함께, 유사성 검색 분석에 내포될 것이다. 그 다음에는 검출가능한 세포독성을 갖는 시스템을 함유하지 않는 테스트 제제의 다음으로 가장 높은 농도와 해당 데이터베이스가 일치하는 추가 오버레이가 뒤따를 것이다. Diversity PLUS 패널에서 실행되는 화합물들의 BioMAP® 프로파일 간의 유사성 정도를 결정하기 위해, 우리는 테스트된 다른 측정값(Pearson 및 Spearman의 상관 계수를 비롯하여)과 비교하여, 참조 제제들의 메커니즘 분류에서 개선된 수행능을 갖는 조합적 접근 방식인, 사용자 지정 유사성 메트릭(BioMAP Z-표준)을 개발했다. 이 접근 방식은 BioMAP® 프로파일의 특징인 데이터 포인트, 시스템, 활성 바이오마커 판독값 및 바이오마커 판독값 변동폭의 변화를 보다 효과적으로 설명한다. 관계의 방향과 크기의 유사성을 기반으로 하는 두개 프로파일 간의 선형 연관성을 측정하기 위해, Pearson의 상관 계수(r)가 우선 생성된다. Pearson의 상관관계는 임의의 바이오마커 활성의 크기에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 시스템별 가중 평균 Tanimoto 메트릭은 양호성이 약한 시스템의 과소표시 설명하는 필터로 사용된다. Tanimoto 메트릭은 바이오마커 활성의 폭을 고려하지 않지만, 판독값의 확인 및 판독값의 수는 시스템별 가중 기준으로 공통적인지 여부를 다룬다. 실제-값 Tanimoto 메트릭은 각 프로파일을 단위 벡터로 정규화시킴으로써, 먼저 산출되며(가령,

), 그다음, 다음 공식을 적용한다:

, 여기에서 A 및 B는 2개 프로파일 벡터다. 그런 다음, 이 계산에서 시스템 가중된-평균 실제-값 Tanimoto 메트릭에 통합된다:

계산은 각 i번째 시스템의 실제 값 Tanimoto 점수(T _i) 와 각 i번째 시스템의 가중치(W _i) 를 사용한다. W _i 는 다음 공식

로 각 시스템에 대해 계산되며, 여기서 lr 은 비교되는 2개의 프로파일 비율의 가장 큰 절대값이다. 참조 화합물들의 최적 성능을 기반으로, 프로필은 Pearson의 상관 계수(r) ≥ 0.7인 경우 기계적 관련 유사성을 갖는 것으로 확인된다. 마지막으로 Fisher r-에서-z로의 변환은 다음과 같이 짧은 꼬리 분포를 정규 분포로 변환하기 위해 z-점수 계산에 사용된다:

그런 다음, 공통 판독값(CR)의 수를 조정하는 BioMAP® Z-표준이 다음 공식에 따라 생성된다: Z-표준 =

. 더 큰 BioMAP® Z-Standard 값은 더 높은 신뢰 수준에 해당하며, 이는 유사성 결과 순위 매김에 사용되는 메트릭이다.

클러스터 분석

클러스터 분석(기능 유사성 맵)은 쌍별 상관 분석 결과(pairwise correlation analysis)를 사용하여, 다-차원 공간에서 제제 프로파일의 "근접성(proximity)"을 2차원으로 투영한다. 이 분석 동안 생성된 해당 제제 프로파일의 기능적 클러스터링은 각 제제의 각 농도에 대한 프로파일의 쌍별 비교를 위해 Pearson 상관 값을 사용하고, 그런 다음, 쌍별 상관 데이터를 다-차원 스케일링에 적용시킨다. Pearson의 상관 계수 (r) ≥ 0.7과 유사한 프로파일을 선으로 연결한다. 서로 클러스터되지 않는 제제들은 기계적으로 구별되는 것으로 해석된다. 이 분석은 3가지 또는 그 이상의 제제들이 테스트된 프로젝트에 대해 수행된다. 세포독성 농도는 클러스터 분석에서 배제된다.

Mechanism HeatMAP 분석

Mechanism HeatMAP 분석은 모든 화합물 농도 및 합의 메커니즘 전반에 걸쳐 바이오마커 활성을 비교할 수 있는 테스트 화합물 및 19개 합의 메커니즘의 시각화를 제공한다. HeatMAP 분석에 사용된 합성 합의 프로파일들은 구조적으로 구별되는 화학 부류들로부터 여러 화합물들의 평균에 대한 대표적인 BioMAP® 프로파일이다. 합의 메커니즘 프로파일을 구축하기 위해 선택된 모든 프로파일(다양한 농도의 다중 제제들에 대한 각 바이오마커 종점 값을 평균화하여 프로파일을 계산했다. 바이오마커 활동은 비히클 대조군에 대해 유의성 범위를 벗어난 발현이 있을 때, 합의 메커니즘 및 화합물에 대한 히트맵에 색으로 표시된다. 빨간색은 단백질 발현증가를 나타내고, 파란색은 발현 감소를 나타내고, 흰색은 수준의 변경이 없거나 또는 필터링 조건 내에서 있음 나타낸다. 더 어두운 음영의 색상은 비히클 대조군에 비해 바이오마커 활성의 더 큰 변화를 나타낸다. Mechanism HeatMAP은 R 및 R을 위한 gplots 패키지를 사용하여 준비되었다.

분석 허용 기준

BioMAP® 분석에는 Diversity PLUS 패널을 구성하는 시스템에서 테스트된 제제들에 대해 BioMAP® 플랫폼에서 생성된 다중-매개변수 데이터 세트가 내포된다. 분석은 각 시스템에 적합한 약물 대조군(가령, 전해내려오는(legacy) 대조군 테스트 제제 콜히친), 음성 대조군(가령, 비-자극 조건) 및 비히클 대조군(가령, DMSO)을 함유한다. BioMAP® 분석은 플레이트-기반이며, 데이터 허용 기준은 플레이트 성능(비히클 대조군어 웰의 %CV)과 해당 시스템에 대한 이력 대조군들에 대한 시스템 성능에 따라 달라진다. QA/QC Pearson 테스트는 먼저 이력에 따른 양성 대조군의 참조 데이터 세트로부터 1% 위음성 Pearson 컷오프를 설정하여 수행된다. 이 프로세스는 양성 대조군 참조 데이터세트에서 시스템 바이오마커 판독값의 모든 프로파일을 통하여 반복되며, 각 프로파일과 데이터세트의 나머지 프로파일 평균 간의 Pearson 값을 산출한다. 1% 위음성 컷오프 결정에 사용된 Pearson 값의 전체 수는 참조 데이터세트에 있는 프로파일의 총 수이다. 계산된 모든 값의 1 백분위수에서 Pearson 값은 1% 위음성 Pearson 컷오프이다. 실험 플레이트의 음성 대조군 또는 약물 대조군 프로파일과 참조 데이터세트의 과거이력 대조군 프로파일 평균 사이의 Pearson 값이 이 1% 위음성 Pearson 컷오프를 초과하면, 시스템이 통과하게 될 것이다. 전반적인 분석은 각 개별 시스템이 Pearson 테스트를 통과하고, 모든 프로젝트 플레이트의 95%가% CV <20%일 때 수용된다.

결과

BioMAP® Diversity PLUS 패널은 표 26에 나타낸 바와 같이, 12개의 개별 BioMAP 인간 1차 세포 기반 공동-배양 시스템을 함유한다.

표 26 - BioMAP® Diversity + 패널

두 개 또는 그 이상의 연속 농도가 비히클 대조군에 비해 동일한 방향으로 변경되었고, 95% 유의성 범위를 벗어났으며, 효과 크기가 > 20%인 (|log₁₀ 비율| > 0.1), 적어도 이상의 농도를 가질 때, 바이오마커 활성의 주석이 달렸다. 바이오마커 주요 활성은 이들 활성이 일부 시스템에서는 증가하였지만, 그러나 다른 시스템에서는 감소했다면 경우, 조정된 것으로 기술되었다.

LMW-DS는 25개의 주석이 달린 판독값으로, 활성이 있었다. LMW-DS는 이 연구에서 테스트된 농도들에서 인간 1차 세포에 대해 세포독성이 없었다. 주요 바이오마커 활성에서 LMW-DS 매개된 변화에는 감소된 맥관 세포 흡착 분자 1(VCAM-1), 단핵 세포 화학 유인 물질 단백질-1(MCP-1), 가용성 종양 괴사 인자 알파(sTNFα), 인터페론-유도성 T 세포 알파 화학유인물질(I-TAC), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노카인(MIG), 및 인터페론 감마-유도된 단백질 10(IP-10) 그리고 증가된 에오탁신 3(Eot3), 및 인터루킨 8(IL-8)의 형태의 염증-관련된 활성이 내포되었다. LMW-DS는 감소된 분비된 면역글로블린 G(sIgG) 및 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF) 및 증가된 가용성 IL-17a(sIL-17a), 및 분화 69의 클러스터(CD69) 형태의 면역조정 활성 또한 갖는다. LMW-DS는 증가된 매트릭스 메탈로프로테나제-1(MMP-1), 플라스미노겐 활성체 억제제-1(PAI-1), 유로카나제 플라스미노겐 활성체 수용체(uPAR) 및 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 형태의 조직 리모델링 활성, 그리고 증가된 트롬보모둘린(TM) 형태의 지혈-관련된 활성을 또한 나타내었다. 표 27은 BioMAP® Diversity PLUS 패널에서 12개의 상이한 인간 1차 세포에 대한 LMW-DS의 효과를 요약한다.

표 27 - BioMAP® Diversity + 결과의 요약

BioMAP® 참조 데이터베이스는 생물 활성제(생물학적 제제, 승인된 약물, 화학 물질 및 실험 제제)의 4,500개 이상의 BioMAP® 프로파일을 함유하며, 이는 가장 유사한 프로파일을 분류 및 식별에 사용할 수 있다.

BioMAP® 참조 데이터베이스에서 수학적으로 유사한 화합물 프로파일에 대한 비-감독 조사에서 LMW-DS(4M)는 클렉산(30μg/ml)과 가장 유사하다(Pearson의 상관 계수, r = 0.701). 클렉산 (에녹사파린 나트륨)은 심부정맥 혈전증(DVT) 치료에 사용되는 항응고제인 저-분자량 헤파린이다. 다음 시스템 내에서 주석이 달린 5가지 공통 활성이 있다: BT(sIgG, sIL-17a), CASM3C(MIG), 및 HDF3CGF(VCAM-1, IP-10).

논의

연구에서, 인간 1차 세포 기반 분석의 BioMAP® Diversity PLUS 패널에서 복합 조직 및 장기(혈관, 면역계, 피부, 폐)의 질환 생물학 및 일반 조직 생물학을 모델링에 의해 LMW-DS를 특징화시켰다. BioMAP® Diversity PLUS 패널은 생체-내 결과와 관련된 복합적인 교차(crosstalk) 및 피드백 메커니즘을 보존하는 조건 하에서 LMW-DS의 생물학적 영향을 평가했다.

이 연구에서 테스트된 농도에서 LMW-DS는 활성이 있었고, 비-세포독성이었다. LMW-DS는 최고 농도(4μM)에서만 인간 1차 내피 세포에 대해 중등도의, 선택적 항-증식성을 보였다. LMW-DS 프로파일은 면역 및 염증-관련 판독값 뿐만 아니라 매트릭스 관련된 바이오마커의 조정 나타내는 25개의 주석이 달린 판독값을 보유하였다. 특이적 활성에는 감소된 염증-관련된 sTNFα, VCAM-1, IP-10(CXCL10), MIG(CXCL9), I-TAC(CXCL11), 및 MCP-1, 그리고 증가된 IL-8이 내포되었다. 중등도로 증가된 에오탁신-3은 BF4T 시스템에서 더 낮은 농도에서만 관찰되었다. 면역 조절 활성에는 BT 시스템에서 감소된 sIgG 및 IL-17a 및 IL-17f가 포함되었지만, 그러나, B 세포에 대한 항-증식 효과는 없었다. 감소된 M-CSF, 그리고 증가된 CD69, sIL-17a 및 sIL-17f 또한 확인되었다. LMW-DS는 증가된 MMP-1, PAI-1, uPAR, EGFR 및 지혈-관련된 TM을 비롯한, 조직 리모델링 바이오마커를 조절했다. MIG, VCAM, IP-10 및 ITAC를 비롯한 주요 염증 바이오마커들은 CASM3C 시스템 및 HDF3CGF 시스템에서 테스트된 모든 농도에 걸쳐 감소했고, 한편 다수 시스템에서 화학주성 인자 IL-8의 증가가 관찰되었다. 종합적으로, 이들 데이터는 LMW-DS가 염증 및 상처 치유 생물학의 맥락에서 면역 활성화 및/또는 면역 분해 반응을 조절하는 역할을 한다는 것을 나타낸다.

이들 염증 마커의 조절은 염증 성분들이 내포된 다수의 만성 염증 상태 및 급성 염증 상태 및 질환 치료에 있어서 LMW-DS의 유용성을 나타낸다.

손상 후 초기에, 선천적/전염증 반응과 획득된 면역 반응의 선택된 구성 요소들은 이질성 병원체에 대항하는 방어 유지를 위해 상향- 조절되며, 손상 부위에 존재하는 조직 부스러기들을 제거하고, 조직 리모델링, 세포 증식 그리고 상처 반응과 관련된 혈관신생 과정을 편집조정한다. 그러나, 적절한 상처 치유가 진행되도록 매트릭스의 재-확립, 재-세포화 및 조직 리모델링이 될 수 있도록 하기 위해서, 이러한 초기 염증 반응은 조절되거나 또는 차단되어야 한다. 이러한 면역 해결(resolving) 활성은 MMP-1, PAR-1 및 uPAR의 활성화를 포함한 LMW-DS에 의해 유도되었으며, 이는 유도된 면역 소실은 COVID-19로 손상된 조직을 치료하는 데 유용하며, 그렇지 않으면 유해한 섬유증 형성을 초래할 수 있음을 나타낸다.

LMW-DS는 HDF3CGF 시스템에서 많은 바이오마커 활성을 조절하지만, 그러나, MyoF 시스템에서는 단지 IL-8만을 조절한다. 이들 두 시스템 모두에 섬유아세포들이 내포되지만, HDF3CGF는 이러한 상처 치유와 관련하여 상처 치유 및 매트릭스 리모델링을 모델링하고, 한편 MyoF는 콜라겐 침착의 섬유증 모델이다. 이로 인하여, 이들 결과에서 LMW-DS는 면역 조절 및 조직 리모델링 활성을 보유하였지만, 그러나 유해한 섬유증 침착을 초래할 수 있는 바람직하지 않은 콜라겐 섬유증을 유도하지 않는다는 사실이 밝혀졌다.

결론적으로, LMW-DS는 외상 또는 질병 후 조직에 존재하는 염증의 정상화 및 해결시키는 것으로 보이며, 이에 따라 이들 결과는 상기 실시예들에서 나타난 LMW-DS의 효과와 일치한다.

따라서, LMW-DS는 전-염증성 사이토킨들과 케모킨들의 분비를 조절하여, 질환에 의해 손상된 조직에서 염증 신호전달을 억제시킨다. 이러한 발견들은 가장 심각하게 영향을 받는 COVID-19 대상체들에서 볼 수 있는 ARDS 및 SIRS 및 패혈성 쇼크를 비롯한, 유해한 염증 반응 억제와 관련이 있다. 더욱이, LMW-DS의 조직 리모델링 효과는 COVID-19 대상체들의 폐 섬유증, 신장 섬유증 및 심근병증을 표적으로 하는 데 도움이 될 것이다.

실시예 7

LMW-DS에 의해 유도된 유전자-발현의 변화를 세포주에서 분석하였다.

재료 및 방법

실험 기획

각 세포주의 경우, n=8 x 25 cm² 배양 플라스크를 설치한다. 각 세포 유형에 대해 처리 당일(씨딩 후 24시간) 2 개의 플라스크를 수거하였다. 이것을 0일차 시점을 한다. 나머지 플라스크로부터, 3 개의 플라스크를 대조군 배지로 처리하고, 3 개의 플라스크를 LMW-DS를 함유하는 배양 배지(CM)로 처리하여 0.01 mg/ml의 최종 농도를 수득하였다. 처리된 플라스크로부터의 세포를 48 시간 후에 수집하였다. 따라서, 수집된 데이터는 (a) 미처리 세포(0일차 대조군 및 2일차 대조군) 및 (b) 48시간 동안 LMW-DS(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780)로 처리된 세포(2일차 LMW-DS 처리됨)를 나타낸다.

모든 세포에 대한 조직 배양 플레이트 코팅

25 cm² 플라스크는 Hank의 균형 염 용액(HBSS)에 50μg/ml 폴리-d-리신 용액을 플라스크당 2ml씩 첨가하였고, 암실에서 37℃에서 밤새 항온처리하여 코팅하였다. 플라스크를 세포 배양 수로 세척하였고, 어둠 속에서 30분 동안 공기-건조시켰다. 포스페이트 완충된 염수(PBS)에 25μg/ml 라미닌 용액을 플라스크 당 1 ml를 첨가하였고, 어두운 곳에서 37℃에서 2시간 동안 배양함으로써 플라스크를 코팅하였다. 상기 라미닌 플라스크에 세포를 도말하기 전, PBS로 3 회 세척하였다.

인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVECs)

배지 200 + 대형 혈관 내피 보충제(M200+LVES) 첨가제(1:50)를 준비하였고, 37℃로 예열시켰다. 세포를 37℃ 수조에서 2분을 넘지 않는시간 동안 해동시켰고, Dulbecco Modified Eagle Medium, Nutrient Mixture F-12(DMEM-F12) 20ml를 함유하는 50ml 튜브로 조심하면서 옮겼다. 튜브를 조심스럽게 두 번 뒤집어 이 세포 현탁액을 혼합했다. 세포를 400×g에서 10분 동안 회전시켰다. 상청액을 제거하였고, 세포를 10 ml의 배양 배지(M200+LVES 첨가제)에 재-현탁시켰다.

Cellometer로 세포를 계수하였다. 플라스크당 1,000,000개 세포를 25 cm² 플라스크(n=8)에 접종하였고, 배지를 플라스크당 총 5ml까지 채웠다. 세포를 5% CO₂와 함께 37℃에서 배양하였다. LMW-DS 처리 전, 세포를 24시간 동안 침강시켰다.

인간 Schwann 세포

10%의 태아 소 혈청(FBS)을 고-포도당 DMEM에 첨가하였고, 37℃로 예열함으로써, Schwann 세포 성장 배지를 제조하였다. 세포를 37℃ 수조에서 2 분을 넘기지 않도록 해동시켰다.

12 개의 바이알로부터 세포를 각각 10ml의 고-포도당 DMEM 배지를 함유하는 튜브로 부드럽게 옮기고, 400 상대 원심 필드(RCF)에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 배양 배지에 재-현탁시켰다. 12 개의 바이알로부터의 세포를 혼합하고, 이전에 코팅된 25 cm² 플라스크(n = 8)에 균등하게 분배하였다. 세포를 5% CO₂와 함께 37℃에서 배양하였다. LMW-DS 처리 전, 세포를 24시간 동안 침강시켰다.

마우스 피질 뉴런(Lonza)

10ml의 B-27 무-혈청 보충제와 2.5ml의 GlutaMAX™-I 보충제를 500ml의 Neurobasal 배지에 첨가하여 배지를 만들었다. 이 배지를 37℃로 예열시켰다. 12개 바이알로부터 세포를 37℃ 수조에서 2분 이하로 후속적으로 해동시켰고, 15ml 튜브로 조심하면서 옮겼다. 9ml의 배지를 각각에 조심스럽게 점적-추가하였다. 튜브를 조심스럽게 두 번 뒤집어 이 세포 현탁액을 혼합했다.

이들 세포를 200×g에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 제거하였고(최종 0.5 ml로), 세포를 분쇄에 의해 부드럽게 재-현탁시켰다. 12 개의 바이알로부터의 세포를 혼합하고, 이전에 코팅된 25 cm² 플라스크(n = 8)에 균등하게 분배하였다. 세포를 5% CO₂와 함께 37℃에서 24시간 항온처리하였다.

마우스 운동 뉴런 (Aruna)

배양 배지는 표 28에 따라 준비하였다.

표 28 - 배양 배지의 준비

배지(표 28 참고) 37℃로 예열시켰다. 37℃ 수조에서 세포들을 2분 이하로 해동시켰다. 9ml의 배지를 조심스럽게 점적-추가하였다. 튜브를 조심스럽게 두 번 뒤집어 이 세포 현탁액을 혼합했다. Cellometer로 세포를 계수하였다. 이들 세포를 200×g에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 제거하였고(최종 0.5 ml로), 세포를 분쇄에 의해 부드럽게 재-현탁시켰다. 8 개의 바이알로부터의 세포를 혼합하고, 이전에 코팅된 25 cm² 플라스크(n = 8)에 균등하게 분배하였다. 처리-전, 세포를 5% CO₂와 함께 37℃에서 24시간 항온처리하였다.

약물 치료

LMW-DS를 20 mg/ml 의 원액 농도로 제공하고, 4℃에서 온도 모니터링된 냉장고에 보관하였다. 새로운 100× LMW-DS 스톡(1.0 mg/ml)은 멸균 DMEM-F12에서 준비하였다. 농축된 약물 원액을 멸균 여과하였고, 각각의 배양 배지에 첨가하였다(19.6 ml CM 및 0.4 ml LMW-DS 스톡 용액). 대조군은 19.6 ml CM 및 0.4 ml의 DMEM-F12를 이용하여 만들었다. LMW-DS 및 CM은 각 플라스크(각 5 ml)에 각 접시에서 LMW-DS 농도가 0.01 mg/ml이 되도록 추가하였고, 각 접시는 총 10 ml CM을 갖게 된다.

배양물 수거 및 세포 용해

CM을 깨끗하고, 라벨링된 15 ml 팔콘 튜브에 흡입시켰다. 플라스크(배양 배지없이)를 -80℃ 냉동고에 30분 동안 두었다. 팔콘 튜브의 CM을 3000×g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 제거하고, 작은 펠릿을 실온(RT, ~ 22℃)에서 2.5 ml 트리졸:물(4:1) 용액에 재-현탁시켰다.

냉동 플라스크를 냉동고에서 하나씩 빼내어, 적절한 튜브로부터 트리졸-물을 이 플라스크로 옮겼다. 플라스크를 실온에서 5분 동안 방치한 후, 내용물을 15 ml 팔콘 튜브 내로 다시 흡입시켰다(플라스크의 바닥을 용액으로 완전히 세척한 후). 세포의 완전한 제거를 확인하기 위하여, 플라스크를 현미경으로 검사하였다. 15 ml 팔콘 튜브에서 수집된 용해물을 -80℃ 냉동고에 넣었다.

RNA 추출

균질물(homogenate)을 함유하는 팔콘 튜브를 냉동고에서 빼내고, 핵 단백질 복합체가 완전하게 해리되도록 실온에서 5분 동안 보관하였다.

1ml 용해물 2분액을 각각의 샘플에서 빼내었고, 200μl의 클로로포름을 각각에 첨가하였고(세포 용해 단계 동안 사용된 1ml의 트리졸 시약당 클로로포름 0.2ml), 튜브를 격렬하게 흔들었다. 샘플을 RT에서 2-3분 동안 보관한 후, 4℃에서 15분 동안 12,000×g에서 원심분리하였다.

이 혼합물은 3개의 층, 즉 하부 적색 페놀-클로로포름 상, 중간상 그리고 무색의 상부 수성 상으로 분리되었다. RNA는 상부 수성 상에, DNA는 백색 중간(간기) 상에, 그리고 단백질은 분홍색 하부(유기) 상에 남아있었다. 수성상의 상부 ¾를 새로운 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮겼다.

동일한 양의 100% 에탄올을 첨가하여. RNA를 수성상으로부터 침전시켰다. 침전된 RNA를 Spin Cartridge에 고정시키고, 2회 세척하고, 그리고 건조시켰다. RNA를 50μl 따뜻한 RNase-없는 물에서 용리시켰다. 정제된 RNA의 양 및 품질은 Nanodrop에 의해 측정되었다. Array 분석을 위해 Source Bioscience로 이전하기 전, RNA를 -80℃에 보관하였다.

발현 데이터 분석 계획

발현 데이터를 각 세포주에 대해 별도의 파일로 다운로드하였다. '수정된 백그라운드(Background corrected)' 표현은 어레이(array)의 "gProcessedSignal" 데이터로써, 이는 관련 프로브의 실제 신호에서 추출된 배경 신호의 결과다. 이것은 어레이 분석에서 가장 자주 사용되는 변수이다. 통계적 분석용 백그라운드 보정 신호를 모든 샘플에 대해 log2 변환시켰다. 샘플에서 잘못된 발견율을 줄이기 위해, '발현 수준' 아래의 신호는 제거되었다. log2 변환된 발현 값에 대해 '발현 아래' 수준은 5로 설정되었다.

통계학적 분석

각 어레이에서 대조군 프로브의 발현 패턴을 기반으로 결과의 변동성을 줄이기 위해, 분석 전에 모든 어레이에 대해 중앙값 센터링(Median Centering)을 수행하기로 결정했다. 데이터는 다음 알고리즘을 사용하여 분석되었다:

ㆍ D0 대조군과 D2 대조군 샘플의 비교 - 정상 배양물에서 세포에서 나타나는 발현 변화

ㆍ D0 대조군과 D2 LMW-DS 처리군 샘플 비교 - LMW-DS 처리된 배양물에서 세포에서 나타나는 발현 변화

ㆍ D2 대조군과 D2 LMW-DS 처리군 샘플 비교 - 배양물에서 LMW-DS에 의해 유도된 차등 발현

3 개의 데이터 세트의 임의의 조합 사이에서 차별적으로 발현되지 않은 유전자를 스크리닝하기 위해, 예비 분석을 수행하였다. 발현 패턴을 찾기 위해, 단순한 비-엄격성 ANOVA(p <0.05)를 수행하였다. 세 가지 데이터 세트에서 변경이 없는 프로브는 제거되었다. 남은 프로브 세트는 Volcano 플롯을 사용하여, 배수 변화 및 중요성에 대해 분석되었다. 프로브의 발현에서 20% 이상의 변화(배수 변화 (FC) ≥ 1.2 또는 FC ≤ 0.84)는 발현 패턴의 검출을 허용하기 위해, 첫 번째 경우에 중요한 것으로 간주되었다.

품질 매개변수

씨딩 밀도는 Schwann 세포에 대한 세포 원료로부터 검색된 세포 카운트로부터 계산되었다. HUVECS는 최적의 밀도로 씨딩되었다.

Array 서비스 제공 업체의 추가 품질 관리 결과에서 RNA는 고품질이며(분해되지 않음), 그 양은 Agilent의 낮은-유입 RNA 마이크로어레이의 매개 변수 내에 있었다.

원시(raw) 데이터의 분석에 따르면, 예상대로 어레이간에 유의적인 차이가 있었다. 그러나, 이들 차이(모든 어레이에 포함된 동일한 대조군 샘플에서의 차이에 의해 반영됨)는 정규화 기술에 의해 쉽게 제거되었다. 어레이-대-어레이 변이를 제거하는 데이터의 선택된 정중값 센터링은 상이한 농도의 RNA를 나타내는 대조군 사이에서 예상되는 전체적인 차이에 영향을 미치지 않았다.

Schwann 세포의 발현 분석

전술한 바와 같이, Schwann 세포에서 발현되지 않은 유전자는 데이터 분석 전에 제거되었다. log2 변환된 발현 값에 대해 '발현 아래' 수준은 5로 설정되었다. 이것은 Schwann 세포 배양에서 분석할 15,842 개의 독특한 프로브를 남겼다. 분석의 다음 단계에서, 세포에서 CM의 효과 및 LMW-DS에 의해 유도된 상대적인 변화를 확립하기 위해, 3 세트의 데이터(D0 대조군과 D2 대조군 샘플의 비교; D0 대조군과 D2 LMW-DS 처리된 샘플의 비교; D2 대조군과 D2 LMD-DS 처리된 샘플의 비교)는 분석하였다.

585개의 유전자는 D0 대조군과 D2 대조군 샘플을 비교할 때, Schwann 세포 배양에서 차등적으로 발현되었다. 이들 유전자에 의해 영향을 받은 분자 기능은 세포 운동(1.14E-07-2.49E-03); 세포 형태학(5.56E-07-2.36E-03); 세포 발달(7.3E-06-2.48E-03); 세포 성장 및 증식(7.3E-06-2.48E-03); 세포 어셈블리 및 조직화(1.23E-05-2.36E-03); 세포 기능 및 유지(1.23E-05-2.47E-03); 세포 사멸 및 생존(1.53E-05-2.51E-03); 지질 대사(8.14E-05-1.6E-03); 소분자 생화학(8.14E-05-1.6E-03); 분자 운반(1.18E-04-2.29E-03); 단백질 이동능(trafficking)(1.62E-04-1.6E-03); 탄수화물 대사(3.22E-04-1.78E-03); 유전자 발현(3.98E-04-2.2E-03); 세포 신호생성(4.39E-04-2.25E-03); 세포-세포 간 신호생성 및 상호작용(5.05E-04-2.48E-03); 세포 절충(7.69E-04-1.58E-03); 세포 주기(1.12E-03-1.8E-03); 아미노산 대사(1.6E-03-1.6E-03); 그리고 핵산 대사(1.6E-03-1.6E-03)에 관련된다.

상기 제시된 값은 이들 유전자와 상이한 경로와의 연관성의 통계적 유의성을 나타내는 p-값이다. 2 개의 p 값은 관찰된 통계적 유의성의 하한 및 상한을 나타낸다(p <0.05는 유의적임).

LMW-DS는 D0 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 1244개의 유전자의 Schwann 세포 배양에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받은 분자 기능은 세포 형태학(1.43E-08-8.39E-04); 세포 운동(1.4E-07-9.6E-04); 해독-후 변형(3.93E-07-6.71E-05); 단백질 합성(3.93E-07-1.08E-04); 단백질 이동능(3.93E-07-1.26E-06); 세포 사멸 및 생존(2.13E-06-8.65E-04); 세포 어셈블리와 조직화(7.46E-06-8.24E-04); DNA 복제, 재조합 및 복구(7.46E-06-7.46E-06); 세포 기능 및 유지(9.53E-06-6.46E-04); 유전자 발현(1.27E-05-4.92E-04); 세포 발달(1.29E-05-9.06E-04); 세포 성장 및 증식(1.29E-05-9.06E-04); 세포-세포 간 신호생성 및 상호작용(1.97E-05-8.81E-04); 아미노산 대사(4.22E-05-8.24E-04); 소분자 생화학(4.22E-05-8.24E-04); 지질 대사(4.81E-05-3.64E-04); 분자 운반(3.64E-04-3.64E-04); 그리고 세포 주기(4.53E-04-4.86E-04)와 관련된다.

LMW-DS는 D2 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 700개의 유전자의 Schwann 세포 배양에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 세포 형태학(1.49E-07-5.62E-03); 세포 어셈블리 및 조직화(1.49E-07-5.95E-03); 세포 운동(7.24E-07-6.06E-03); 세포 사멸 및 생존(9.41E-06-5.95E-03); 아미노산 대사(2.56E-05-3.7E-03); 해독-후 변형(2.56E-05-1.05E-03); 소분자 생화학(2.56E-05-3.7E-03); 세포-세포간 신호생성 및 상호작용(5.05E-05-5.76E-03); 유전자 발현(7.18E-05-4.94E-03); 세포 주기(1.06E-04-5.95E-03); 세포 발달(1.06E-04-5.95E-03); 세포 기능 및 유지(1.96E-04-5.95E-03); 세포 성장 및 증식(2.35E-04-5.95E-03); DNA 복제, 재조합 및 복구(2.75E-04-5.95E-03); 세포 신호생성(5.92E-04-2.54E-03); 세포 절충(6.26E-04-6.26E-04); 지질 대사(6.26E-04-1.85E-03); 분자 운반(6.26E-04-5.95E-03); 단백질 합성(1.05E-03-1.93E-03); 치료제에 대한 세포 반응(1.85E-03-1.85E-03); 단백질 이동능(2.66E-03-5.95E-03); 그리고 RNA 해독-후 변형(4.32E-03-4.32E-03)에 관련된다.

기계적 분자 네트워크 모델은 이러한 변화의 기능적 결과를 평가할 수 있게 하는 LMW-DS에 의해 차등적으로 조절된 분자의 효과를 시뮬레이션한다. 가상(in silico) 모델에서 LMW-DS는 신경 세포 사멸; 자가사멸; 그리고 단백질의 합성을 억제하고, 혈관신생; 세포 이동; 세포 생존능력; 세포 생존; 세포 운동; 세포의 증식; 세포의 분화; 세포 항상성; 세포 주기 진행; 세포 형질전환; 그리고 RNA의 발현을 활성화시킨다.

표 29는 배양된 Schwann 세포에서 유전자 발현 변화의 결과를 요약한 것이다.

표 29 - Schwann 세포에서 유전자 발현 변화의 전체적인 패턴

이틀 동안 대조군 배양물에서 발현이 변경된 21개의 유전자는 동일한 이틀 동안 LMW-DS 처리된 배양물에서 전혀 변화를 나타내지 않았다. 대조군 배양물에서 발현이 증가된 1개의 유전자는 동일한 2 일 동안 LMW-DS 처리된 배양물에서 하향 조절되었다. 대조군 배양물에서 하향 조절된 13개의 유전자는 이틀 동안 LMW-DS 처리된 배양 물에서 상향 조절되었다. 122개의 유전자는 배양 배지에서 성장 인자에 의해 상당히 하향조절되었고, 이러한 하향 조절은 LMW-DS 처리된 배양물에서 더욱 강했다. 대조군 배양물에서 441개의 유전자가 상향 조절되었고, LMW-DS의 첨가는 이러한 상향 조절을 상당히 강하게 만들었다.

HUVECs의 발현 분석

전술한 바와 같이, HUVECs에서 발현되지 않은 유전자는 임의의 분석을 하기 전 제거되었다. log2 변환된 발현 값에 대해 '발현 아래' 수준은 5로 설정되었다. 이것은 HUVEC 배양물에서 분석할 15,239 개의 독특한 프로브를 남겼다. 다음 단계에서, 세 가지 데이터 세트를 분석하였고, 세포의 유전자 발현과 LMW-DS에 의해 유도된 차이에 있어서 CM의 효과를 확인했다. 3 개의 데이터 세트의 임의의 조합 사이에서 차별적으로 발현되지 않은 유전자를 스크리닝하기 위해, 예비 분석을 수행하였다. 발현 패턴을 찾기 위해, 단순한 비-엄격성 ANOVA(p <0.05)를 수행하였다. 3개의 데이터 세트에 걸쳐 변화가 없는 유전자들은 제거되었으며, 총 12,313개의 프로브(10,368개의 유전자)가 분석에 남게 되었다.

1551개의 유전자는 D0 대조군과 D2 대조군 샘플을 비교할 때, HUVEC 세포 배양물에서 차등적으로 발현되었다. HUVEC 세포성 어셈블리 및 조직화(2.55E-15-1.29E-03); 세포성 기능 및 유지(2.55E-15-1.29E-03); 세포 주기(1.98E-11-1.32E-03); 세포 형태(3.18E-10-1.29E-03); 유전자 발현(1.05E-08-2.01E-04); 세포 발달(1.66E-07-1.37E-03); 세포 성장 및 증식(1.66E-07-1.37E-03); DNA 복제, 재조합, 및 복구(2.04E-07-9.84E-04); 세포 사멸 및 생존(2.09E-07-1.3E-03); RNA 전사-후 변형(4.86E-06-6.53E-04); 세포 이동(9.9E-06-1.18E-03); 해독-후 변형(1.92E-05-1.34E-03); 세포-세포간 신호생성 및 상호작용(2.19E-05-9.1E-04); 단백질 합성(5.49E-05-1.14E-03); 세포 절충(8.16E-05-8.16E-05); 분자 운반(6.27E-04-6.27E-04); 단백질 이동능(6.27E-04-6.27E-04); 세포 신호전달 (8.86E-04-8.86E-04); 치료제에 대한 세포 반응(9.84E-04-9.84E-04); 그리고 단백질 분해 (1.14E-03-1.14E-03).

LMW-DS는 D0 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 1779개의 유전자의 HUVEC 세포 배양에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받은 분자 기능은 세포성 어셈블리 및 조직화(4.14E-17-9.7E-04); 세포성 기능 및 유지(4.14E-17-8.05E-04); 세포 주기(5.83E-14-9.85E-04); 세포 형태(1.69E-10-7.48E-04); 유전자 발현(7.99E-09-8.62E-04); 세포 사멸 및 생존(2E-08-8.4E-04); 세포 발달(1.28E-07-8.88E-04); 세포 성장 및 증식(1.28E-07-8.88E-04); DNA 복제, 재조합, 및 복구(3.07E-07-9.7E-04); RNA 전사-후 변형(1.13E-06-6.31E-04); 세포 이동 (1.42E-06-8.34E-04); 해독-후 변형(3.4E-05-9.17E-04); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(6.97E-05-9.56E-04); 분자 운반(7.43E-05-9.7E-04); 단백질 이동능(7.43E-05-7.43E-05); RNA 이동능(1.57E-04-5.72E-04); 단백질 합성(1.92E-04-9.02E-04); 세포 절충(2.47E-04-6.28E-04); 그리고 세포 신호전달 (4.64E-04-9.02E-04)에 관한 것이다.

LMW-DS는 D2 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 76개의 유전자의 HUVEC 세포 배양에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 DNA 복제, 재조합, 및 복구(9.62E-05-2.57E-02); 세포 주기(1.22E-04-2.4E-02); 세포 발달(1.59E-04-2.67E-02); 세포 형태(4.64E-04-2.42E-02); 세포성 기능 및 유지(4.64E-04-2.57E-02); 지질 대사(9.49E-04-1.07E-02); 분자 운반(9.49E-04-1.61E-02); 소분자 생화학(9.49E-04-1.87E-02); 세포 절충(1.6E-03-2.62E-02); 세포 사멸 및 생존(2.06E-03-2.67E-02); 아미노산 대사(2.7E-03-2.7E-03); 탄수화물 대사(2.7E-03-1.07E-02); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(2.7E-03-2.4E-02); 세포성 어셈블리 및 조직화(2.7E-03-2.57E-02); 세포 성장 및 증식(2.7E-03-2.4E-02); 세포 이동 (2.7E-03-2.4E-02); 에너지 생산 (2.7E-03-2.7E-03); 대사(2.7E-03-1.07E-02); 해독-후 변형(2.7E-03-1.61E-02); 유전자 발현(5.39E-03-2.36E-02); RNA 전사-후 변형(5.39E-03-2.4E-02); 약물 대사(8.07E-03-1.61E-02); 비타민 및 미네랄 대사(8.07E-03-8.07E-03); 단백질 합성(1.07E-02-1.07E-02); RNA 이동능(1.07E-02-1.07E-02); 치료제에 대한 세포 반응(1.24E-02-1.24E-02); 및 유리 라디칼 소거 (1.43E-02-1.43E-02)에 관한 것이다.

직접 처리 2일 차 시점 이후 대조군과 LMW-DS 처리된 배양물 간의 전반적인 차이는 크지 않은 것으로 보이지만, 유전자 발현 변화에 있어서 LMW-DS의 효과는 특히, LMW-DS에 의한 성장 인자 유도된 유전자 발현의 조절을 고려할 때 유의적이었다.

기계적 분자 네트워크 모델을 사용하면, 이러한 변화의 기능적 결과를 찾기 위해 LMW-DS에 의해 차등적으로 조절되는 유전자의 효과를 시뮬레이션할 수 있다. 가상(in silico) 모델에서 LMW-DS는 신경 세포 사멸; 자가사멸; 그리고 단백질의 합성을 억제하고, 혈관신생; 세포 이동; 세포 생존능력; 세포 생존; 세포 운동; 세포의 증식; 세포의 분화; 세포 항상성; 세포 주기 진행; 세포 형질전환; 그리고 RNA의 발현을 활성화시킨다.

HUVEC 대조군 배양물은 성장 인자들을 포함한다. 처리된 배양물에서, LMW-DS는 이미 성장 인자들을 함유하는 배양 배지에 첨가되었다.

표 30은 배양된 HUVECs에서 유전자 발현 변화의 결과를 요약한 것이다. 이틀 동안 대조군 배양물(성장 인자들의 효과 하에서)에서 발현이 변경된 67개의 유전자는 동일한 이틀 동안 LMW-DS 처리된 배양물에서 전혀 변화를 나타내지 않았다. 성장 인자들이 있는 대조군 배양물에서 발현이 증가된 4개의 유전자는 동일한 2 일 동안 LMW-DS 처리된 배양물에서 하향 조절되었다. 대조군 배양물에서 성장 인자들에 의해 하향 조절된 11개의 유전자는 이틀 동안 LMW-DS 처리된 배양 물에서 상향 조절되었다. 120개의 유전자는 성장 인자들에 의해 상당히 하향조절되었고, 이러한 하향 조절은 LMW-DS 처리된 배양물에서 더욱 강했다. 대조군 배양물에서 229개의 유전자가 상향 조절되었고, LMW-DS의 첨가는 이러한 상향 조절을 상당히 강하게 만들었다.

표 30 - HUVECs 세포에서 유전자 발현 변화의 전체적인 패턴

다양한 질환 상태 및 치료 적용에 중요한 여러 분자 경로에 대한 LMW-DS의 효과가 분석되었다. 이 분석을 위해, 유전자 발현에 대한 LMW-DS 첨가 효과를 CM 세포에서 관찰된 효과와 비교하였고, 이러한 관찰된 발현 패턴의 변화를 기반으로 기능적 효과를 예측하였다.

운동 뉴런의 발현 분석

전술한 바와 같이, 운동 뉴런에서 발현되지 않은 유전자는 임의의 분석을 하기 전 제거되었다. log2 변환된 발현 값에 대해 '발현 아래' 수준은 5로 설정되었다. 이로 인해 발현 임계값이 이들 시리즈의 최소 3개 샘플에 의해 충족된 12,240개의 고유한 프로브가 남게 되었다. 다음 단계에서, 세 가지 데이터 세트를 분석하였고, 세포에서 CM 효과 및 LMW-DS에 의해 유도된 차이를 확인했다.

정상적인 배양 조건에서 유전자 발현의 변화는 분리된 세포 세트에서 운동 뉴런 표현형을 개발할 때 운동 뉴런의 정상적인 발달 과정을 모방한다. 정상 배양 배지의 성장 인자들은 이러한 세포가 분화하는 데 필요한 것들이다. 이러한 배양물에 존재하는 스트레스 인자는 산화 스트레스이다(조직 배양 조건에서는 정상).

485개의 유전자는 D0 대조군과 D2 대조군 샘플을 비교할 때, 운동 뉴런 세포 배양물에서 차등적으로 발현되었다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 세포 사멸 및 생존(1.99E-17-1.98E-04); 세포 이동 (1.14E-16-1.91E-04); 세포성 어셈블리 및 조직화(1.22E-16-1.93E-04); 세포성 기능 및 유지(1.22E-16-1.95E-04); 세포 형태(6.46E-16-1.74E-04); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(3.16E-12-1.95E-04); 세포 발달(1.59E-10-1.93E-04); 세포 성장 및 증식(1.59E-10-1.9E-04); 분자 운반(4.27E-10-1.89E-04); 단백질 합성(9.85E-09-5.03E-05); 지질 대사(1.08E-08-1.61E-04); 소분자 생화학(1.08E-08-1.89E-04); 유전자 발현(8.45E-08-3.8E-05); 세포 주기(4.55E-07-1.09E-04); 유리 라디칼 소거 (7.12E-07-1.65E-04); 세포 신호전달 (1.23E-05-1.89E-04); 비타민 및 미네랄 대사(1.23E-05-1.89E-04); 단백질 분해 (3.07E-05-1.31E-04); 탄수화물 대사(3.32E-05-1.61E-04); 약물 대사(4.16E-05-4.16E-05); 해독-후 변형(7.1E-05-1.31E-04); 및 단백질 폴딩 (7.1E-05-7.1E-05)에 관한 것이다.

LMW-DS는 D0 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 315개의 유전자의 운동 뉴런에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 세포 사멸 및 생존(6.54E-08-9.06E-03), 세포 이동 (8.21E-08-5.42E-03); 세포성 어셈블리 및 조직화(8.36E-08-9.01E-03); 세포성 기능 및 유지(8.36E-08-9.01E-03); 세포 형태(2.9E-06-8.75E-03); 세포 발달(1.04E-05-9.01E-03); 세포 성장 및 증식(1.04E-05-7.83E-03); DNA 복제, 재조합, 및 복구(2.79E-05-8.01E-03); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(8.18E-05-7.11E-03); 해독-후 변형(1.32E-04-7.56E-03); 단백질 분해 (1.32E-04-4.35E-03); 단백질 합성(1.32E-04-5.09E-03); 유전자 발현(1.9E-04-9.01E-03); 세포 절충(3.58E-04-9.01E-03); 세포 주기(6.08E-04-9.01E-03); 유리 라디칼 소거 (7.41E-04-7.31E-03); 아미노산 대사(7.67E-04-6.61E-03); 소분자 생화학(7.67E-04-9.01E-03); 비타민 및 미네랄 대사(7.67E-04-1.13E-03); 지질 대사(1.05E-03-9.01E-03); 분자 운반(1.05E-03-9.01E-03); 세포 신호전달 (1.13E-03-5.09E-03); 및 탄수화물 대사(4.71E-03-4.71E-03)에 관한 것이다.

LMW-DS는 D0 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 425개의 유전자의 운동 뉴런에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은세포 사멸 및 생존(2.87E-08-6.27E-03); 세포 이동 (4.73E-07-6.47E-03); 세포 형태(4.95E-07-7.47E-03); 세포 발달(1.02E-06-7.13E-03); 세포 성장 및 증식(1.02E-06-7.48E-03); 세포성 어셈블리 및 조직화(7.03E-06-7.47E-03); 세포성 기능 및 유지(7.03E-06-7.47E-03); 유전자 발현(1.95E-05-6.18E-03); 세포 주기(2.88E-05-7.48E-03); DNA 복제, 재조합, 및 복구(3.39E-05-5.16E-03); 아미노산 대사(7.75E-05-4.68E-03); 소분자 생화학(7.75E-05-4.68E-03); 세포 절충(8.23E-05-4.61E-03); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(3.27E-04-7.48E-03); 비타민 및 미네랄 대사(3.27E-04-3.27E-04); 단백질 합성(8.94E-04-5.29E-03); 해독-후 변형(9.67E-04-9.67E-04); 분자 운반(9.7E-04-4.68E-03); 단백질 이동능(9.7E-04-9.7E-04); 탄수화물 대사(1.44E-03-1.92E-03); 치료제에 대한 세포 반응(1.92E-03-1.92E-03); 및 지질 대사(4.68E-03-4.68E-03)에 관한 것이다.

표 31 - 운동 뉴런에서 유전자 발현 변화의 전체적인 패턴

피질 뉴런의 발현 분석

전술한 바와 같이, 운동 뉴런에서 발현되지 않은 유전자는 임의의 분석을 하기 전 제거되었다. log2 변환된 발현 값에 대해 '발현 아래' 수준은 5로 설정되었다. 이로 인해 발현 임계값이 이들 시리즈의 최소 3개 샘플에 의해 충족된 10,653개의 고유한 프로브가 남게 되었다. 다음 단계에서, 세 가지 데이터 세트를 분석하였고, 세포에서 CM 효과 및 LMW-DS에 의해 유도된 차이를 확인했다.

정상적인 배양 조건에서 유전자 발현의 변화는 분리된 세포 세트에서 피질 뉴런 표현형을 개발할 때 피질 뉴런의 정상적인 발달 과정을 모방한다. 정상 배양 배지의 성장 인자들은 이러한 세포가 분화하는 데 필요한 것들이다. 이러한 배양물에 존재하는 스트레스 인자는 산화 스트레스이다(조직 배양 조건에서는 정상).

1101개의 유전자는 D0 대조군과 D2 대조군 샘플을 비교할 때, 운동 뉴런 세포 배양물에서 차등적으로 발현되었다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 세포성 어셈블리 및 조직화(3.57E-25-6.65E-04); 세포성 기능 및 유지(3.57E-25-6.65E-04); 세포 형태(4.28E-22-6.36E-04); 세포 발달(4.28E-22-6.53E-04); 세포 성장 및 증식(4.28E-22-6.6E-04); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(2.16E-13-6.65E-04); 분자 운반(5.18E-12-4.95E-04); 세포 이동 (1.86E-11-6.65E-04); 세포 사멸 및 생존(3.37E-11-6.41E-04); 유전자 발현(1.27E-08-8.96E-05); 단백질 합성(3.84E-07-8.69E-05); 소분자 생화학(6.65E-07-5.18E-04); 세포 절충(7.12E-06-4.54E-04); 단백질 분해 (1.62E-05-1.62E-05); 아미노산 대사(2.11E-05-4.25E-04); 단백질 이동능(3.4E-05-3.4E-05); 세포 신호전달 (8.69E-05-3E-04); 해독-후 변형(8.69E-05-2.15E-04); 단백질 폴딩 (2.15E-04-2.15E-04); 세포 주기(2.69E-04-3.07E-04); DNA 복제, 재조합, 및 복구(2.69E-04-4.77E-04); 핵산 대사(2.69E-04-2.69E-04); 지질 대사(3.12E-04-5.18E-04); 및 탄수화물 대사(5.18E-04-5.18E-04)에 관한 것이다.

LMW-DS는 D0 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 609개의 유전자의 운동 뉴런에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 세포성 어셈블리 및 조직화(3.91E-15-1.83E-03); 세포성 기능 및 유지(3.91E-15-1.83E-03); 세포 형태(2.53E-13-1.43E-03); 세포 발달(2.53E-13-1.81E-03); 세포 성장 및 증식(2.53E-13-1.83E-03); 세포 이동 (4.95E-09-1.2E-03); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(5.96E-09-1.47E-03); 세포 사멸 및 생존(2.25E-08-1.77E-03); 분자 운반(7.08E-08-1.79E-03); DNA 복제, 재조합, 및 복구(3.03E-06-1.71E-03); 세포 절충(9.23E-06-7.65E-04); 아미노산 대사(1.75E-05-1.64E-03); 세포 주기(1.75E-05-1.77E-03); 소분자 생화학(1.75E-05-1.79E-03); 단백질 합성(2.77E-05-1.5E-03); 단백질 이동능(2.77E-05-1.9E-04); 세포 신호전달 (7.65E-05-1.73E-03); 해독-후 변형(3.01E-04-1.4E-03); 유전자 발현(3.65E-04-1.15E-03); 약물 대사(6.49E-04-6.49E-04); 탄수화물 대사(6.95E-04-7.69E-04); 비타민 및 미네랄 대사(1.09E-03-1.09E-03); 및 핵산 대사(1.44E-03-1.73E-03)에 관한 것이다.

LMW-DS는 D0 대조군을 D2 LMW-DS 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 247개의 유전자의 운동 뉴런에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 세포 형태(6.01E-08-1.01E-02); 세포 발달(7.46E-08-1.01E-02); 세포 성장 및 증식(7.46E-08-1.01E-02); 세포 사멸 및 생존(4.23E-07-1.01E-02); 세포 이동 (2.69E-06-9.91E-03); 세포성 어셈블리 및 조직화(1.57E-05-1.01E-02); 세포성 기능 및 유지(1.57E-05-1.01E-02); 세포 주기(1.01E-04-1.01E-02); 세포-세포간 신호전달 및 상호작용(1.01E-04-1.01E-02); 지질 대사(1.56E-04-1.01E-02); 소분자 생화학(1.56E-04-1.01E-02); 유전자 발현(2.28E-04-3.38E-03); RNA 손상 및 복구(2.28E-04-2.28E-04); RNA 전사-후 변형(2.28E-04-2.28E-04); 분자 운반(4.18E-04-8.32E-03); 세포 절충(4.47E-04-2.2E-03); 단백질 합성(2.66E-03-7.29E-03); 단백질 이동능(4.11E-03-8.32E-03); 단백질 분해 (5.64E-03-7.29E-03); 및 DNA 복제, 재조합, 및 복구(7.31E-03-1.01E-02)에 관한 것이다.

표 32 - 피질 뉴런에서 유전자 발현 변화의 전체적인 패턴

미토콘드리아의 산화 스트레스 경로에 대한 LMW-DS의 효과

미토콘드리아에서 발생하는 산화성 스트레스 경로는 다양한 감염성 질환, 그리고 노화 및 노화- 관련된 퇴행성 질환에 또한 중요하다. 정상적인 성장 조건은 세포에서 일정량의 산화 스트레스를 유발하고, 생체-내 및 시험관-내 노화 과정에 모두 기여한다.

정상 조건에서 배양한 Schwann 세포에서는 복합체 I(NADH 탈수소효소)이 억제되고 복합체 IV(시토크롬 c 산화효소)가 활성화되었다. LMW-DS가 배양물에 첨가되었을 때, 복합체 III(사이토크롬 bc1)이 억제되었다. 복합체 III의 억제로 암 및 신경계 질환의 발병 기전에 관여하는 산화성 스트레스 현상이 억제된다.

코엔자임 Q: 시토크롬 c - 산화환원효소 또는 시토크롬 bc1 복합체라고도 하는 복합체 III은 ATP의 생화학적 생성(산화적 포스포릴화)에 중요한 역할을 하는 전자 수송 사슬(EC 1.10.2.2)의 세 번째 복합체다. 복합체 III는 미토콘드리아(사이토크롬 b)와 핵 게놈(다른 모든 소단위) 모두에 의해 암호화되는 다중-소단위 막횡단 단백질이다. 복합체 III는 모든 동물과 모든 호기성 진핵생물의 미토콘드리아와 대부분의 진핵생물의 내막에 존재한다. 복합체 III의 돌연변이는 운동 불내성과 다기관 장애를 일으킨다. bc1 복합체는 11개의 서브유닛, 3개의 호흡기 서브유닛(사이토크롬 B, 사이토크롬 C1, Rieske 단백질), 2개의 코어 단백질 그리고 6개의 저-분자량 단백질을 함유한다.

HUVECs에서, LMW-DS로 처리한 후, 미토콘드리아에 대한 산화성 스트레스 효과의 유의미한 조절이 감지되지 않았다.

정상적인 배양 조건에서, 운동 뉴런은 상당한 산화성 스트레스를 겪는 것으로 보인다. 이것은 일부 세포 아팝토시스 기전의 활성화와 시토크롬 C, AIF, 카스파제 3, 8 및 9의 활성화에 연루된다. 또한, 운동 뉴런은 FIAS1을 통한 산화성 스트레스와 미토콘드리아 단편화 및 지방산 산화를 더욱 악화시키는 세포에서 아밀로이드-β의 생성을 특징으로 한다. 더욱이, 복합체 V가 활성화되었다.

배양물에 LMW-DS를 첨가하면, 아팝토시스를 방지 및 억제시킴으로써, 미토콘드리아 단편화 및 기능 장애와 후속 손상에 대한 아밀로이드-β생성 및 이의 부정적 효과를 방지함으로써, 그리고 지방산 산화를 억제함으로써, 이러한 부정적인 영향이 개선되었다. LMD-DS는 또한 TRAK1 및 PINK1가 연루된 반응 경로를 억제하였고, 이로 인하여 미토콘드리아 기능이 개선되었다. LMW-DS는 H₂O₂ 수준을 더 감소시켰다. 추가 효과는 아팝토시스 억제에 기여하는 HtrA2의 억제였다.

정상적인 배양 조건에서, 피질 뉴런은 상당한 산화성 스트레스에 노출되어 아밀로이드-β 및 루이소체 형성을 유발하고, 시누클레인 α활성화 및 ROS 수준 증가; 아팝토시스; 미토콘드리아 단편화; 그리고 미토콘드리아 기능 및 관련 C161의 감소로 이어진다. 이 배양물에 LMW-DS를 추가하면 유해한 영향의 대부분, 이를 테면, 아밀로이드-β 축적 및 루이소체 병리, 미토콘드리아 기능 장애를 예방하고, 역전시킬 수 있었다. 아팝토시스를 유도하는 일부 기전은 아마도 배양물의 강력한 활성화로 인해 활성 상태로 남아 있다.

글루타메이트 흥분독성에 대한 LMW-DS의 효과

글루타메이트는 장기적(long-term) 강화(LTP), 즉, 학습 및 기억 기능과 관련된 필수 흥분성 아미노산이다. 그러나, 너무 많은 글루타메이트는 또한 흥분독성과 연관되어 신경세포의 사멸을 일으킨다. 이 나중 현상은 만성 신경퇴행성 질환, 뿐만 아니라 TBI에서도 유발되는 신경 세포 사멸과 관련이 있다고 가정한다. 글루타메이트 신호전달에 관여하는 유전자들은 HUVECs에서 발현되지 않지만, 그러나 본 연구에서 사용된 Schwann 세포주 및 뉴런 세포주에 존재한다.

글루타메이트 생산은 운동 뉴런 배양의 기준선 조건에 의해 억제되었다. 이러한 억제는 LMW-DS에 의해 영향을 받지 않았다. 기선 시점에서 피질 뉴런에서 글루타메이트 생산이 증가했다. 이들 세포에서 LMW-DS의 첨가로 글루타메이트 생산이 변경되지 않았다.

Schwan 세포들의 CM에 LMW-DS를 첨가하면, 단백질 복합체 (CALM, Gβγ, GRM7, PICK1) 발현이 유도되었다. 더욱 중요한 것은, LMW-DS는 Schwann 세포, 특히, SLC1A2/3에서 글루타메이트 수송체의 활성 및/또는 수준을 증가시켰고, 이로 인하여 시냅스-전 뉴런에서 생성되고, 방출된 글루타메이트의 소거를 유도한다. 따라서, LMW-DS는 Schwann 세포가 시냅스 틈(cleft)에서 독성 글루타메이트를 제거하도록 유도하여, 흥분 독성을 발휘하는 것이 방지된다.

SLC1A3, 용질 운반체 패밀리 1(신경교 고-친화성 글루타메이트 수송체), 구성원 3은 인간에서 SLC1A3 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. SLC1A3은 글루타메이트 아스파르트산염 수송체(GLAST) 또는 흥분 아미노산 수송체 1 (EAAT1)로도 종종 불린다. SLC1A3은 원형질막에서 주로 발현되고, 이로써 세포외 공간에서 글루타메이트의 제거가 이루어지게 되다. 이는 말레이트-아스파르트산염 셔틀의 일부로 내부 미토콘드리아 막에 또한 국소화되었다. SLC1A3은 생체-내에서 동종삼량체로 기능한다. SLC1A3은 3개의 Na⁺와 1개의 H⁺ 양이온의 동시수송, 그리고 1개의 K⁺ 양이온의 반대수송으로 글루탐산과 아스파르트산의 이동을 매개한다. 이 공동 수송 커플링(또는 공수송(symport))은 농도 구배에 대항하여 세포 내로 글루타메이트의 수송을 허용한다. SLC1A3은 CNS 전체에 걸쳐 발현되며, 소뇌의 성상교세포와 Bergmann 신경교에서 상당히 발현된다. 망막에서, SLC1A3은 Muller 세포에서 발현된다. SLC1A3은 심근 세포를 비롯한 많은 다른 조직에서 또한 발현된다.

흥분성 아미노산 수송체 2(EAAT2) 및 글루타메이트 수송체 1(GLT-1)로도 알려진 용질 운반체 패밀리 1 구성원 2인 SLC1A2는 인간에서 SLC1A2 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. SLC1A2는 용질 운반체 계열 단백질의 구성원이다. 막-결합된 단백질은 CNS의 시냅스에 있는 세포외 공간에서 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트를 청소하는 주요 수송체다. 글루타메이트 청소는 적절한 시냅스 활성화와 글루타메이트 수용체의 과도한 활성화로 인한 신경 손상 방지에 필수적이다. SLC1A2는 뇌 안에서 글루타메이트 재-취입의 90% 이상을 담당한다.

이러한 발견은 LMW-DS가 TBI 이후와 같이, 높은 세포외 수준이 유해한 조건에서 글루타메이트 흥분성독성 예방에 유용할 수 있음을 나타낸다.

세포 흡착에서 LMW-DS의 효과

LMW-DS의 현저한 표현형적 효과 중 하나는 세포 유형 특이적인 세포 흡착에 대한 영향이었다. 세포 흡착은 뉴런에서 가장 강하게 영향을 받았고, 그 다음으로 Schwann 세포에서 영향을 받은 반면, HUVECs는 영향을 받지 않았다.

유전자 발현의 분석에서 이것이 메탈로펩티다제(매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)로도 지칭됨)를 포함하는 세포 흡착을 조절하는 효소의 발현에 대한 LMW-DS의 효과에 기인한다는 것을 나타내며, 표 33 참조.

Schwann 세포(17개 분자, 표 33 참조)에서의 세포 운동 및 흡착을 조절하는 경로에 대한 이들 분자의 집합 효과는 세포 이동이 활성화되는 동안 세포 흡착이 억제되도록 하는 것이었고, 반면 HUVEC(1개 분자, ADAM11)에서는 흡착은 영향을 받지 않지만, 혈관신생이 활성화될 것이다.

표 33 - Schwann 세포에서 세포 운동 및 흡착을 조절하는 경로의 분자

뉴런에서 LMW-DS에 의해 유도된 차등 유전자 발현의 효과를 분석하였다. 운동 뉴런에서, 동일한 메탈로펩티다제-의존성 경로가 Schwann 세포에서 관찰되는 세포 분리의 원인이 될 수 있다, 표 34 참조.

표 34 - 운동 뉴런에서 세포의 움직임과 흡착을 조절하는 경로의 분자

그러나, MMP 관련 유전자 중 어느 것도 피질 뉴런에서 차등적으로 발현되는 것으로 밝혀지지 않았다.

이 발견은 세포 흡착 및 흡착 관련 분자에 영향을 미치는 모든 분자 상호 작용의 재평가 및 네 가지 상이한 배양물에서의 세포 흡착에 대한 그들의 영향의 재평가를 얻었다. 217 개의 흡착-관련 분자 (197 개의 개전자 및 20 개의 약물)의 전체 목록은 다음과 같다:

ACE2, ACP1, ADAM15, ADGRB1, ADGRE2, ADIPOQ, AG490, AMBN, ANGPT1, ANTXR1, ARAP3, ARMS2, 바티마스타트, BCAM, BCAP31, BCAR1, 벤질옥시카보닐-Leu-Leu-Leu-알데하이드, BMP2, BMP4, BTC, C1QBP, Ca²⁺, CA9, CADM1, CALR, 칼리쿨린 A, 카스파제, CBL, CD209, CD36, CD44, CD46, CDH13, 세리바스타틴, 클로람페니콜, 콘드로이틴 술페이트, CLEC4M, 콜치신, 콜라겐 유형 I, 콜라겐(들), COMP, CRK, CRP, CSF1, CSF2RB, CTGF, 쿠르쿠민, CXCL12, 환형 AMP, DAB2, DAG1, DCN, DDR1, 데스페리엑소켈린 772SM, DOCK2, DSG2, DSG4, 두라파티테, Efna, EFNA1, EFNB, EFNB1, EGF, EGFR, EGR1, ELN, ENG, EP300, Eph 수용체, EPHA8, EPHB1, 에피티피바타이드, 에틸렌디아민테트라아세트산, ETS1, F11R, F3, FBLN5, FBN1, Fc 수용체, FCN2, FERMT2, FES, FGF2, FGFR1, 피브린, FN1, 초점의 흡착 키나제, FSH, FUT3, FUT6, FUT7, FYN, HACD1, 헤파린, 히스톤 h3, 히스톤 h4, HRAS, HSPG2, HTN1, 히알루론산, 하이드로코르티손, 과산화수소, ICAM1, ICAM2, IGF1R, IgG, Igg3, IL1, IL1B, IL6, ILK, 인테그린, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린α, IPO9, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA5, ITGA6, ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB5, JAK2, Jnk, KP-SD-1, LAMC1, 라미닌, 라미닌1, 레보티록신, LGALS3, LIF, 리포폴리사아카리드, LOX, LRP1, LRPAP1, MAD1L1, 만노스, MAPK7, MBL2, MERTK, 메트로니다졸, MGAT5, MMP2, Mn²⁺, NCK, NEDD9, NRG1, 오카디아산, OLR1, P38 MAPK, PDGF BB, 포스파티딜이노시톨, PKM, 혈소판 활성화 인자, PLD1, PLG, PMP22, PODXL, POSTN, PRKCD, PTAFR, PTEN, PTGER2, PTK2, PTK2B, PTN, PTPN11, PTPRZ1, 피롤리돈 다이티오카바메이트, Rac, RALB, RANBP9, RHOA, RHOB, RPSA, SDC3, SELE, 셀렉틴, SELL, SEMA3A, 심바스타틴, SIRPA, SPARC, 스핑고신-1-포스페이트, SPI1, SPP1, SPRY2, SRC, STARD13, SWAP70, TEK, TFPI, TFPI2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGM2, THBS2, THY1, 갑상선 호르몬, TIMP2, 티로피반, TLN1, TLN2, TNF, TP63, 트레티노인, VAV1, VCAM1, VCAN, Vegf, VHL, VTN, VWF, 및 WRR-086.

세포 흡착을 조절하는 197개의 유전자 중 HUVECs에서 LMW-DS에 의해 차등적으로 조절되는 유전자는 없다. Schwann 세포 배양물에서, 차등적으로 발현된 17개 분자들은 전체적으로 약간 증가된 흡착을 유도한다. 그러나, 뉴런에서 발현 패턴은 이들 세포에서 세포 흡착의 현저한 억제로 이어진다.

LMW-DS에 의해 영향을 받은 상류조절 경로

Schwann 세포에서, 상류 조절기 분석은 LMW-DS가 표 35에 나타낸 바와 같이, 이 시스템에서 활성화를 증가시키거나 또는 시스템에서 억제를 감소시킴으로써, 몇몇 성장 인자의 효과를 조절한다는 것을 밝혀냈다.

표 35 - Schwann 세포의 상류 조절인자 비교

HUVECs에서, LMW-DS에 의해 효과가 강화된 성장 인자들의 수는 상대적으로 적었지만, 여전히 매우 유의미했다, 표 36 참조.

표 36 - HUVECs에서 상류 조절인자 비교

운동 뉴런에서, 상류 조절인자 분석에서 LMW-DS는 표 37에 나타낸 바와 같이, 이 시스템에서 이의 활성화를 증가시키거나, 또는 시스템에 존재하는 억제를 감소시킴으로써, 몇몇 성장 인자의 효과에 영향을 주었다는 것이 밝혀졌다.

표 37 - 운동 뉴런에서 상류 조절인자 비교

대뇌피질 뉴런에서, 정상 배양 조건에서 대부분의 성장 인자 의존적 경로는 정상 배양 배지에 의해 유의하게 활성화되었다. 대부분의 경우, 이 활성화는 LMW-DS에 의해 변경되지 않았다. 그러나, GDF7의 하류 작동체인 LMW-DS 활성화 분자는 이 성장 인자의 효과가 LMW-DS에 의해 강화되었음을 낸다. GDF7은 뉴런에 대한 강력한 분화 인자이고, BDNF 및 NT3의 활성화에 대한 이러한 성장 인자의 추가 활성화는 배양물에서 이러한 세포의 향상된 분화에 대한 좋은 설명을 제공한다.

논의

HUVECs의 정상적인 배양 조건은 조직 저산소증 및 재관류-후 환경을 모방하며, 헤파린이 보충된 높은 영양 함량과 성장 인자들을 함유한다. LMW-DS-처리된 배양물은 저산소증 및 재관류 24시간 후 시점에 첨가된 LMW-DS의 효과를 모방했다. 이것이 관련된 실제 시나리오는 섬유증 상태와 같은 허혈 상태에 따른 혈관신생의 시나리오다.

Schwann 세포에서, 고-영양 함량과 포도당을 갖는 대조 배양물은 Schwann 세포의 활성화를 재현한다. LMW-DS-처리된 배양물은 신경교 활성화의 24시간 후 시점에 첨가된 LMW-DS의 효과를 모방했다. 이것이 개괄된 실제 시나리오는 신경계 손상에 따른 신경교 활성화이다.

고-영양 함량과 성장 인자들을 가진 운동 뉴런과 피질 뉴런 모두의 뉴런에 대한 정상적인 배양 조건은 정상적인 뉴런 분화 동안 환경을 모방한다. 이러한 배양에서 유일한 부정적인 영향은 세포가 겪는 산화성 스트레스이다. 이것이 관련된 실제 시나리오는 충분한 성장 및 분화 요인이 있는 상태에서 산화성 스트레스에 의해 유발되는 퇴행성 상태다. 이것은 산화성 스트레스가 중추적인 역할을 하는 퇴행성 신경 질환 또는 상태의 초기 단계에 해당한다.

Schwann 세포 및 HUVECs에서 나타나는 분자 효과는 자가사멸로부터 보호; 세포의 이동 및 운동 증가; 세포의 생존력 및 생존의 증가; 그리고 세포 분화의 유도에 있어서 LMW-DS의 역할을 뒷받침하는 세포 유형들로부터 명백하다. 중추 분자 경로의 분석에서, 뉴런에서 LMW-DS가 미토콘드리아에 대한 산화성 스트레스의 영향을 감소시키고, 아밀로이드-β 및 루이소체와 같은 신경변성-관련 분자를 감소시킬 것이라는 것이 드러났다.

따라서, HUVEC 세포 모델의 결과는 LMW-DS가 세포 손상으로부터 보호할 수 있고, 뇌졸중 후와 같이 손상되거나 또는 질환에 걸린 조직에서 새로운 혈관의 발달을 촉진할 수 있음을 나타낸다. Schwann 세포로부터 얻은 결과는 LMW-DS가 질환에 걸리거나 또는 손상된 신경계에서 세포 손실을 방지할 수 있음을 나타낸다.

중추 분자 경로의 분석에서, Schwann 세포에서 LMW-DS가 미토콘드리아에 대한 산화 스트레스의 영향을 감소시켰고, 글루타메이트의 흡수를 증가시켰던 것으로 나타났다. Schwann 세포의 결과는 LMW-DS가 질환에 걸리거나 또는 손상된 신경계에서 산화성 스트레스와 글루타메이트 흥분독성으로 인해 발생하는 세포 손실로부터 보호할 수 있음을 나타낸다.

특히 중요한 것은, LMW-DS는 Schwann 세포에 의해 제시된 바와 같이, 신경교 세포에서 글루타메이트 흡수를 증가시켰다. 그러나, LMW-DS는 뉴런에 의한 글루타메이트 생산을 변경시키지 않았다. 이것은 LTP, 학습 및 기억에 글루타메이트가 필요하기 때문에, 중요하다. 따라서, LMW-DS가 뉴런에 의한 글루타메이트 생산을 변경하지 않는 것은 이 글루타메이트가 위에서 언급한 처리된 정상적인 신경 전달에 필요하기 때문에 유리하다. 그러나, 손상되거나 또는 죽어가는 세포에서 방출되는 증가된 수준의 글루타메이트는 LMW-DS의 영향으로 인해 주변 신경교 세포에 효과적으로 흡수된다. 따라서, LMW-DS에 의해 유발된 신경교 세포에서 글루타메이트 수송체의 활성화는 신경 틈에서 손상되거나 또는 죽어가는 뉴런에 의해 방출되는 글루타메이트를 효과적으로 제거했다. 이것은 이어서, 글루타메이트가 흥분 독성을 발휘하여 추가 뉴런을 손상시키는 것을 방지시켰다. 따라서, LMW-DS는 신경교 세포에 의해 잠재적으로 해로운 신경독성 양의 글루타메이트 흡수를 유도했다.

따라서, 뉴런에서의 결과는 산화성 스트레스로 인한 2차 조직 손상을 줄이고, 복구를 촉진하며, 그리고 퇴행-관련된 단백질 축적 감소에 LMW-DS의 잠재적인 치료적 유용성을 확인시켜준다.

이를 종합하면, 이들 결과는 일반적으로 아팝토시스에 대항하는 보호 및 특히 신경 세포 사멸에 대한 보호, 혈관신생 유도, 세포 이주 및 움직임 증가, 세포 생존 및 생존 증가, 세포 분화 유도, 산화성 스트레스, 글루타메이트 흥분성독성 감소 그리고 퇴행 관련 단백질, 이를 테면, 아밀로이드-β 및 루이소체의 생산 감소에 대한 있어서 LMW-DS의 역할을 뒷받침한다.

세포 흡착은 뉴런과 Schwann 세포에서 주로 영향을 받았는데, 이들 세포에서 LMW-DS가 세포 탈착 및 움직임을 촉진시켰다. HUVECs에서, 세포 흡착은 영향을 받지 않았다. 세포 흡착에 대한 영향은 주로 메탈로프로테나제-유형 효소의 발현에 기인한 것이지만, 그러나 다른 흡착 분자의 조절 또한 이 효과에 기여했다.

병리학적 반응으로 인한 반흔은 TGFβ에 의해 유발된다. TGFβ는 면역 세포의 흡착, 세포의 활성화, 세포 운동, 세포의 응집, 섬유증 및 TGFβ의 유도를 유발하는 171개 분자의 큰 상호 연결된 네트워크를 유도한다. LMW-DS의 투여는 면역 세포의 접착, 세포의 활성화, 세포의 응집, 섬유증 및 TGFβ의 자가-활성화에서 TGFβ-유도된 효과를 완전히 폐지하였다. Schwann 세포에서 TGFβ에 의해 구동되는 분자 네트워크에 대한 LMW-DS의 이러한 불활성화 효과는 TGFβ가 활성화 된 경우, 심지어 과도한 TGFβ의 존재 하에서도 나타난다.

따라서, 이들 연구는 전-염증성 섬유성 사이토킨인 TGFβ에 의한 신호 전달 억제, 이어서 조직 섬유증 억제(그렇지 않으면, COVID-19 대상체의 심각한 구성 요소가 됨)에 있어서 LMW-DS의 잠재적인 치료적 유용성을 확인시켜 준다.

실시예 8

이 실시예는 LMW-DS가 설치류 및 인간 섬유성 질환 모델에서 염증성 반흔을 해결하고, 매트릭스 리모델링을 활성화시켜, 기능적 조직 재생을 가능하게 함을 보여주었다.

결과

POAG는 안구 만성적 섬유증 질환의 한 예이다. 눈에서 TGFβ는 TM, 특별히, 피브로넥틴에서 ECM의 침착을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 피브로넥틴은 TM의 가장 안쪽 영역과 Schlemm 관을 연결하는 덮개(sheath) 물질 내에서 발견되며, 조직의 수축 속성과 결과적으로, AqH 배수 및 IOP 조절에 도움이 된다. 녹내장 환자들에서 더 높은 수준의 TGFβ와 피브로넥틴이 검출되었다. 여기에서 우리는 LMW-DS가 TGFβ2로 처리된 배양된 인간 소주 그물망 세포에서 피브로넥틴 수준을 유의미적으로 감소시켰음을 입증했다(1136 ± 155 vs 1579 ± 210; P<0.05; 도 15A, 15B). 이에 따라, 우리는 녹내장의 실험 모델인 전방 분절 섬유증의 설치류 모델에서 LMW-DS의 피하(SC) 주사의 효과를 평가했고, 이때 섬유증이 격주로 TGFβ1의 전방내(IC) 주사를 통해 유도되는 경우(도 16a); TGF-β1의 매주 2회 IC 주사로 TM 섬유증을 확립함으로써 14일차 시점까지 IOP를 13mmHg로 유의하게 증가시켰고, 이 시점에서 LMW-DS 또는 염수를 매일 SC 주사가 시작되었다. IOP는 IC TGFβ1 및 염수의 SC 주사를 제공받은 대조군 래트에서 계속 증가하여, 28일차 시점에 17.6 ± 2.7mmHg에 도달했다(도 16b). 대조적으로, SC LMW-DS 주사와 함께 IC TGFβ1은 28일차 시점까지 IOP를 11.4 ± 0.2mmHg로 감소시켰으며(P<0.0001; 도 16b), 이것은 정상 범위(10-12mmHg) 내에 있었다. TM에서 섬유증의 면역조직화학 분석은 SC 식염수에서 TM 처리된 대조군 래트(각각 63.7 ± 6.8% 및 63.6 ± 2.9%)와 비교하여, ECM 분자 라미닌(25.6 ± 3.5%, P<0.001; 도 16c) 및 피브로넥틴(40.2 ± 4.0%, P<0.01, 도 16d)에서 상당한 감소를 보여주었다. 이것은 생존하는 망막 신경절 세포(RGC)의 현저하게 증가된 수와 동반되었으며(SC LMW-DS-주사를 맞은 래트의 경우 12.6 ± 0.4 RGC/mm, 대조 SC 염수-주사를 맞은 래트의 경우 9.0 ± 0.3 RGC/mm; P<0.01; 도 16e), 광간섭 단층촬영 이미지 (OCT)로 측정하였을 때 망막 신경 섬유층(RNFL) 두께가 보존되었다(SC LMW-DS-주사를 맞은 래트의 경우 59.9 ± 1.2μm, 대조군 SC 염수-주사를 맞은 래트의 경우 44.0 ± 1.6μm; P<0.01; 도 16f)

논의

염증이 섬유증식성 질환에서 섬유증보다 선행되기 때문에, LMW-DS가 인간 세포의 염증 및 조직 재형성 경로를 어떻게 조절할 수 있는지 이해하는 것이 중요하였다. 관련 배양된 인간 세포의 단백질 및 유전자 발현 데이터는 면역 활성화, 염증 해결 및 조직 리모델링의 재-프로그래밍을 통해(실시예 7) LMW-DS는 질환 및 손상된 인간 조직의 개선된 치유 및 기능적 리모델링으로 이어지는 주요 선천적 및 적응적 반응을 조절하는 것이 암시된다.

실시예 6에서, BioMAP® Diversity Plus 분석을 사용하여 단백질 수준에서 LMW-DS의 기계적 프로파일을 탐색했고, 이때 상기 분석은 상이한 인간 조직 유형들에서 염증 및 상처 치유 반응을 모델링한 12개의 서로 다른 검증된 인간 1차 세포 배양 시스템을 포함하고 있다. 이들 데이터는 LMW-DS가 다중-모드 작용과 함께 뚜렷한 표현형 프로파일을 가짐을 보여주었고; 다른 염증 매개체로 자극 후 상이한 세포 유형들에 영향을 갖는다. 구체적으로, LMW-DS는 구조적으로 모두 관련되어 있으며, CXC 수용체 3(CXCR3)을 통해 신호를 보내고 인터페론과 TNFα에 의해 유도되는, 3가지 케모킨, CXCL9, CXCL10 및 CXCL11의 수준을 감소시켰다. CXCR3 및 이의 관련 케모킨들은 면역 세포의 모집 및 기능에 중요한 역할을 하며, 수많은 염증 질환 및 자가면역 질환에 연루되어 있다. 또한, 이들은 질환의 예후 및 예측 바이오마커로 사용되었다. CXCR3 경로는 녹내장의 병인학에서 중요한 역할을 하며, 이의 발현 수준은 POAG의 진행과 관련된다. 안구 고혈압 모델에서, CXCR3의 길항작용으로 IOP는 감소되고, AqH 유출은 증가되며, 염증은 감소되고, TM 및 망막 세포의 아팝토시스는 감소된다.

유전자 발현 데이터(실시예 7)와 녹내장 모델의 결과는 TGFβ 신호 전달 경로 및 기타 ECM 리모델링 신호에 있어서 이의 작용으로 인하여, LMW-DS의 독특한 다중 모드 영향을 뒷받침한다. POAG에서, TGFβ는 TM에서 ECM 단백질의 점진적 축적에 역할을 하여, AqH의 정상적인 유출을 방지함으로써 IOP를 증가시킨다. 이 실시예에서 사용된 녹내장의 설치류 모델은 TGFβ 유도된 전안부 섬유증을 모델링하고, 항-섬유증 요법을 평가하는 강력하고, 임상적으로 관련된 수단을 제공한다. 여기에서, 우리는 LMW-DS의 매일 SC 주사로 염증 신호전달을 해결하였고, 확립된 TM 섬유증을 역전시켰고, IOP를 낮추었으며, 이로 인하여 점진적인 사멸로부터 RGC를 구제하였고, 이는 LMW-DS가 TGFβ 경로를 조절함으로써 섬유증식성 장애의 진행을 수정하는 잠재력을 뒷받침한다. 더욱이, LMW-DS의 주단위 SC 주사로 달성된 이들 결과는 데코린을 주-2회 IC 주사한 동일한 생체내 모델에서 명백한 결과와 필적하며, 이는 눈, 척수 및 뇌 섬유증의 실험 모델에서 유사한 항-섬유화 효능을 나타낸다. 흥미롭게도, LMW-DS는 유전자 발현 분석(실시예 7)에 나타난 바와 같이, 데코린 발현을 증가시켜 염증을 조절하고, 조직 리모델링 촉진에 일부분 역할을 할 수 있다.

결론적으로, 이것은 LMW-DS의 s.c. 주사는 설치류 및 인간 염증 및 섬유증 모델 모두에서 염증 및 초기/확립된 섬유증을 해결할 수 있으므로, 기능적 조직 재생을 뒷받침한다. 그 결과, 평가된 안구 질환 모델에서 염증성 섬유증이 해소되었고, IOP는 빠르게 정상화되었으며, 손상된 망막 세포가 진행성 사멸로부터 보호되었다. 우리는 또한 LMW-DS의 다중-모드 작용 기전에 대한 통찰력을 제공했다. 종합하면, 우리의 연구는 LMW-DS가 POAG 및 기타 급성 섬유증식성 질환 및 만성 섬유증식성 질환의 치료를 위한 새로운 질병 변형 요법으로서 잠재력이 있다는 개념의 증거를 제공한다. LMW-DS의 항-섬유화 및 섬유용해성 효과는 회복단계(단계 IV) 및 과염증 단계(단계 III) 이후, COVID-19 대상체들에서 반흔을 예방하거나, 또는 최소한 억제시키는 이점이 있다(도 25). 이로 인하여, LMW-DS는 폐, 간 및 심장에서 유해한 조직 반흔 형성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 반흔을 추가로 해결할 수 있다.

재료 및 방법

LMW-DS를 Tikomed AB, Viken, Sweden (WO 2016/076780)에 의해 20 mg/ml 의 스톡 농도로 제공하고, 온도 모니터링된 냉장고에 보관하였다. 사용 직전에, LMW-DS 분취량을 멸균 염수에 적절한 농도로 희석시키고, 피하 주사로 투여했다.

TM 세포 집단의 배양

인간 소주 그물망 세포 (TMC-6590; ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA)를 TMC(6591; ScienCell Research Laboratories) 완전 배지에서 배양하였고, 80-90% 합류에 도달할 때까지 5% CO₂에서 37℃에서 유지했다. 세포를 Greiner-Bio Cell 96 Well black Cell Culture Microplates(655090, Sigma)에서 웰당 5000-10000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 밤새 흡착되도록 두었다. 다음날, 세포를 무-혈청 조건 하에 72시간 동안 TGFβ2(1.0ng/ml; Preprotech) 및/또는 LMW-DS(4.0μM; Tikomed AB)로 처리하였다.

TM 세포에 대한 면역염색 및 공초점 이미징

72시간 처리 후, PBS내 4% PFA (28908, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여, 10분간 세포를 고정시켰고, PBS로 세척하고, 그 다음 사포닌-계 투과 완충액(00-8333-56, Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 세포를 실온에서 1hr 동안 암실에서 투과성 완충액에서 항-인간 Fibronectin Alexa Fluor® 488(53-9869-82, Thermo Fisher Scientific) 및 핵 착색 Hoeschst 33342(H21492, Thermo Fisher Scientific)로 면역착색했다. 마지막으로, 세포를 공초점 현미경으로 이미지 분석하기 전, 사포닌-계 투과 완충액을 함유하는 PBS에서 두 번 세척하고, PBS에서 한 번 세척하였고, Hoechst 및 Alexa Fluor® 488에 대해 40x 대물렌즈와 적절한 여기/방출 설정을 사용하여, Yokogawa CQ1 회전-디스크 현미경에서 이미지를 획득했다. Z-시리즈가 획득되었으며, 최대 강도 z-프로젝션으로 표시된다. Yokogawa 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석했다.

안구 고혈압 모델용 실험 설계

상승된 IOP를 유도하기 전, 래트를 무작위로 두 그룹(염수 비히클 처리용과 LMW-DS 처리용)으로 할당했다. 상승된 IOP의 유도는 이전에 설명된 대로 유도되었다(Hill LJ, et al. Decorin reduces intraocular pressure and retinal ganglion cell loss in rodents through fibrolysis of the scarred trabecular meshwork. Investigative ophthalmology & visual science. 2015; 56(6): 3743-57). 0 d 시점에, 일회용 15° 블레이드를 사용하여 각막을 통한 자체-밀봉 터널을 만들고, 이 접근 지점을 모든 후속적인 주 2회 5ng/ml TGFβ1(Peprotech, London, UK)의 3.5μl IC 주사에 사용했고, 멸균 유리 마이크로피펫(Harvard Apparatus, Kent, UK)을 사용하여 28 d 동안 실험을 수행했다. IOP는 28 d 실험 내내 주 2회(IC 주사 직전) 또한 측정되었다. 14 d 시점에, TGFβ에 대한 무-반응자(즉, 이의 IOP가 임의의 시점에서 기선 이상으로 증가하지 않았음)는 추가 분석에서 제외되어, LMW-DS의 경우 n=7 마리 래트(14개 안구), 그리고 염수 비히클 처리용의 경우 n=5 마리 래트(10개 안구)가 내포되었다. 14 d 시점에, 래트에게 15mg/kg LMW-DS(Tikomed AB) 또는 동등한 양의 염수를 14일 동안 매일 피하 주사했다. RFNL의 OCT 측정은 28 d 시점에 RGC 밀도에 대한 대체로 수행되었으며, 두 그룹의 안구 조직은 TM 섬유증 및 RGC 생존 수준을 평가하기 위해 면역조직화학을 위해 처리되었다.

동물 및 외과술

설치류 연구는 Biomedical Services Unit, University of Birmingham에서 1986년 제시된 동물 법령 (영국)에 명시된 본사 지침에 따라 ARRIVE 지침 및 동물 사용에 대한 ARVO 성명을 준수하면서 1986년 동물법(영국)에 명시된 Home Office 지침에 따라, ARRIVE 지침 및 UK Home Office 허가 번호 70/8611의 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO Statement을 준수한다.

성체(8-10주령) 수컷 Sprague Dawley 래트(Charles River, Kent, UK)는 12h 암/광 주기 하에, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하면서, 수용되었다. Biomedical Services Unit, University of Birmingham(UK)에서 1986 년 동물 법 (영국)에 명시된 본사 지침과 Ophthalmic and Vision Research에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수술을 수행했다. 안구 주사, 광간섭 단층촬영 및 안압 측정은 모두 래트가 2% - 5% 이소플루오란/98% - 95% O₂(National Vet Supplies, UK)를 사용하여 흡입 마취 하에 있는 동안 수행되었다. 모든 래트의 복지를 항상 면밀히 모니터링했다.

IOP 측정

IOP 측정은 쥐에 대해 보정된 iCare Tonolab(ICare, Helsinki, Finland)을 사용하여 얻었다. IOP는 IOP에서 혼란스러운 일주기 변동을 피하기 위해, 28 d 실험 내내 오전 9시~오전 11시에 매주 두 차례 기록되었다. 마취 유도 직후, 안압계로 중앙 각막에서 6회 반동 측정을 수행하였고, 평균을 내어 단일 판독값(mmHg)을 제공했다. 각 그래픽 데이터 포인트는 정확한 측정을 보장하기 위해, 각 래트에서 순차적으로 취한 3개의 판독값(6 리바운드)의 평균 ± SEM을 나타낸다.

광간섭 단층촬영 이미지

28 d에 Spectralis HRA3 공초점 스캐닝 레이저 검안경을 사용하여 망막 신경 섬유층(RNFL) 측정을 수행했다(Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany). 흡입 마취하에 래트로부터 이미지를 얻었다(위의 '동물 및 외과술' 섹션에 설명됨). OCT 이미지는 시신경 머리 주위의 망막에서 촬영되었으며, 내장 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분할하였고, RNFL 두께를 정량화시켰다.

면역조직화학을 위한 조직 준비

28 d에 펜토바르비탈 나트륨 (National Veterinary Supplies)을 복강내 주사하여 래트를 안락사시키고, 말기 마취 하에 PBS에서 4% 파라포름알데하이드(PFA; TAAB, Aldermaston, UK)로 심장 내 관류시켰다. 눈을 제거하였고, PBS 중 4% PFA에 실온에서 2시간 동안 담그고 고정시킨 다음, 농도 증가(10%, 20% 및 30% 자당)를 사용하여 각각 4℃에서 24시간 동안 동결 보호했다. 그 후, 필어웨이(peel-a-way) 몰드 용기(Agar Scientific, Essex, UK)에 최적 절단 온도(OCT) 매립 배지(Thermo Shandon, Runcorn, UK)에 눈을 매립시키고, 분쇄된 드라이아이스를 사용하여 급속 동결시켜 -80℃에 보관했다. Bright 저온유지장치 마이크로톰(Bright, Huntingdon, UK)을 사용하여 -22℃에서 시신경 머리를 통해 방사상 평면으로 눈을 절개(15μm)하였고, 양전하를 띤 유리 슬라이드(Superfrost Plus, Fisher Scientific, USA)에 탑재하였고, 37℃에서 2h 동안 건조되도록 두었으며, -20℃에서 보관했다.

면역조직화학

달리 명시되지 않는 한, 모든 시약은 Sigma(Poole, UK)에서 구입했다. 냉동된 조직 절편을 실온에서 평형을 이루기 위해 30분 동안 방치했고, 그런 다음, PBS 3×5분에 수화시킨 다음, 0.1% Triton X-100에 20분 동안 담구어, 이들 절편을 투과하도록 하였다. 추가 PBS 3×5분 세척-후, 소수성 PAP 펜(Vector Laboratories, Peterborough, UK)으로 눈 절편을 단리시켰다. 비-특이적 항체 결합 부위는 PBS에서 0.5% BSA, 0.3% TWEEN 20® 및 15% 정상 염소 혈청을 사용하여 차단시켰다. 그런 다음, 절편들을 1차 항체(Laminin L9393, Fibronectin F3648, Sigma, Brn3a SC-31984, Santa Cruz)에 넣어 4℃에서 밤새 방치한 후, PBS에서 3×5분 세척하였고, 2차 항체(염소-항 토끼 Alexa Fluor 594 또는 염소-항 마우스 Alexa Fluor 488)와 함께 실온에서 1hr 동안 항온처리했다. DAPI(Vector Laboratories)를 함유하는 Vectashield로 장착하기 전, 절편들을 PBS에서 3×5분 세척했다. 1차 항체 없이, 그러나, 2차 항체와 함께 항온처리된 대조군 조직 절편들은 모두 음성으로 착색되었다(제시되지 않음).

현미경관찰 및 분석

(Hill LJ, et al. Decorin이 반흔이 있는 소주 그물망의 섬유용해를 통해 설치류의 안압 및 망막 신경절 세포 손실을 감소시킨다, Investigative Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 3743-3757 (2015))고 이미 기술된 바와 같이, 형광 착색된 절편들은 Zeiss Axioplan 2 형광 현미경(Carl Zeiss Ltd, Oberkochen, Germany)을 사용하여, 무작위 수를 사용하여 처리 그룹들에 대한 정보가 차단된 작업자에 의해 분석되었다. 간략하게 설명하자면, 각 항체에 대한 이미지는 ECM 수준에 대한 픽셀 강도를 평가하기 위해 동일한 노출(250ms)에서 캡처되었다. 관심 영역 내 임계값을 초과하는 면역형광 픽셀의 백분율은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 측정되었다.

실시예 9

이 실시예는 시험관-내에서 인간 PBMC로부터 IL-6의 자극된 방출에 영향을 미치는 LMW-DS의 능력을 조사하였다.

인간 PBMC는 다양한 세포 하위 집합을 직접적으로, 그리고 간접적으로 활성화시키는 다양한 작용제들에 의해 시험관-내에서 자극될 수 있다. 사이토킨 방출을 모니터링하면, 환자들에서 작용 조사될 약물의 잠재적 영향을 예측할 수 있다. IL-6은 ALS와 같은 신경퇴행성 질환, 관절염과 같은 염증성 질환 및 COVID-19와 같은 바이러스 감염의 심각한 결과에 연합된 수많은 병리와 관련된 것으로 밝혀진 전형적인 전-염증성 사이토킨이다.

재료 및 방법

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare; 11778538) 밀도 원심분리를 통해 건강한 공여자들로부터 단리되었다. PBMC는 자극 부재(비-자극 PBS 비히클 대조군) 또는 자극 존재(LPS, 펩티도글리칸, 포크위드 미토겐, PHA-L, CpG + IL-15, 또는 사이토스팀) 하에서 3가지 농도; 60μg/ml, 200μg/ml 및 600μg/ml의 LMW-DS(Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780) 존재 하에서, 또는 이의 부재(비히클) 하에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 웰당 2×10⁵ 개 세포로 배양시켰다. 원심분리 후, 세포 배양 상층액을 제거하였고, ELISA에 의한 IL-6에 대한 분석을 기다리면서 -20℃에서 보관했다. IL-6의 수준은 제조업체의 지침에 따라, ELISA(R&D systems, DY206)에 의해 상청액에서 정량화되었다.

결과

이력에 따른 내부 데이터는 LPS, 펩티도글리칸, 포크위드 미토겐, PHA-L, CpG + IL-15 및 사이토스팀의 준-최대 농도를 사용하기 위해 자극 농도의 선별을 유도하였다. PBMC 믹스를 이용하여, 모든 자극은 세포 배양 상청액으로 IL-6 방출을 증가시켰다. LMW-DS가 LPS 자극에 미치는 영향과 관련하여, 처음 6명의 공여자의 세포들로부터 생성된 유망한 결과에 의해, 추가 6명의 공여자로 LPS 연구를 확장하기로 결정했다. 더욱이, 자극되지 않은 PBMC에 비해, CpG + IL-15 및 사이토스팀의 원래 선택된 농도에서는 IL-6 방출이 상대적으로 낮은 증가를 나타내므로, 추가 6명의 공여자의 세포에서 더 높은 농도의 CpG + IL-15 및 사이토스팀이 조사되었다. 이러한 더 높은 농도에서는 자극되지 않은 세포에 비해, IL-6 방출 증가가 더 크게 유발되었다.

LPS

LPS(리포폴리사카라이드)는 톨-유사 수용체 (TLR) 4 작용제다. 인간 PBMC 믹스에서, LPS에 의해 직접적으로 활성화된 주요 세포 유형은 TLR4를 발현시키는 단핵구다. 단핵구는 타고난 면역 체계의 일부이며; 이들 골수 세포는 대식세포 및 미세아교세포와 같은 다른 골수 세포에 대한 반응을 모델링하는 데 또한 사용할 수 있다. 현재 연구에서, LPS는 세포 배양 상청액으로의 IL-6 방출의 실질적인 증가를 유발시켰고(도 17a); LMW-DS는 IL-6 농도에서 농도 의존적이며, 통계적으로 유의미한 감소를 일으켰다(도 17a). 이것은 LMW-DS가 단핵구의 TLR4 활성화에 따른 IL-6의 전-염증성 결과를 감소시킬 가능성을 발휘한다는 것을 나타낸다.

펩티도글리칸

펩티도글리칸은 TLR2 작용제이며, PBMC 믹스에서 단핵구와 B 림프구에 의해 주로 발현되며; 후자는 항원에 대한 특정 항체의 생성에 필수적인 역할을 나타내는 것으로 가장 잘 알려진 후천적 면역계의 구성요소다. 펩티도글리칸은 세포 배양 상청액으로의 IL-6 방출의 상당한 증가를 유발했지만, 6명의 공여자의 세포를 사용한 실험에서 전반적으로 LMW-DS는 테스트된 최고 농도에서 조차도 IL-6 방출을 전반적인 감소를 유발한다는 증거가 거의 없었다(도 17b).

포크위드 미토겐

포크위드 미토겐은 피토라카 아메리카나(Phytolacca americana)로부터 정제된 렉틴이다. 이것은 B 림프구의 T 림프구-의존적 활성화를 일으킨다. 본 연구에서, 포크위드 미토겐은 PBMC 믹스에 의해 IL-6 방출을 크게 증가시켰지만, 그러나 이 방출은 LMW-DS에 의해 일반적으로 영향을 받지 않았다(도 17c).

PHA-L

PHA-L(식물적혈구응집소-L)은 파세울루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)(빨간 강낭콩)의 L-유형 하위단위 렉틴으로써, T 림프구 표면 수용체들을 교차연계시켜, 이들이 활성화된다. PHA-L은 PBMC 믹스로부터 IL-6 방출의 비교적 완만한 증가를 유도했으며, 이것은 LMW-DS에 의해 농도 의존적 방식으로 유의미하게 억제되었다(도 17d).

CpG + IL-15

CpG-ODN은 PBMC 믹스 내에서 주로 단핵구 B 세포에 의해 발현되는 TLR9를 활성화시키는 짧은 단일-가닥으로된 DNA 분자다. IL-15는 B 림프구의 자극에서 CpG와 상승 작용한다. 포크위드 미토겐과 달리, CpG + IL-15는 B 림프구를 직접적으로 활성화시키는, 즉, T 림프구에 독립적이다. 6명의 공여자로부터 얻은 PBMC를 사용한 첫 번째 실험에서, 선택된 CpG-ODN + IL-15의 농도는 세포 배양 상청액으로의 IL-6 방출을 약간만 증가를 유발했다. 상대적으로 낮은 수준의 IL-6 방출은 일반적으로 LMW-DS의 영향을 받지 않았지만(도 17e), LPS 자극에 대한 n 수를 증가시키기 위해 추가 공여자들에서 수행된 추가 실험에서, 이러한 동일한 추가 공여자들은 자극되지 않은 세포들에서 명백한 것보다 더 강력한 IL-6 방출을 유발하도록 더 높은 농도의 CpG + IL-15를 제공받았고; 이것이 달성되었지만, 여전히 LMW-DS의 전반적인 영향은 없었다(도 17f).

사이토스팀

사이토스팀은 T 림프구의 항체-기반 활성체다. 이것은 T 세포 수용체(TCR)에 결합하고, 이것은 항원-제시 세포의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자와 교차연계시킨다. 따라서, 사이토스팀은 CD4 및 CD8 T 림프구를 모두 자극한다. 본 연구에서, 6명의 공여자로부터 얻은 PBMC에 대한 첫 번째 실험 라운드에서 세포 배양 상청액으로 IL-6 방출이 상대적으로 약간만 증가하는 농도의 사이토스팀을 사용했으며, 이는 전반적으로 LMW-DS의 영향을 받지 않았다(도 17g). 동일한 추가 공여자들의 PBMC를 더 높은 농도의 사이토스팀으로 조사하여, 자극되지 않은 세포로부터의 IL-6 방출에 비해, IL-6의 더 큰 방출을 유발했지만, 여전히 LMW-DS의 전반적인 영향은 없었다(도 17h).

현재 연구에서 조사된 모든 자극은 PBMC 믹스에서 세포들로부터 IL-6 방출을 증가시킬 수 있었지만, IL-6 방출 시 LMW-DS(LPS 및 PHA-L에 대한)의 표적 작용은 IL-6 방출을 감소시키는 전반적인 능력보다는 개선된 작용 방식을 시사한다.

실시예 10

단핵구는 면역 체계의 핵심 구성 요소인 순환하는 타고난 면역세포다. 또한, 이들 단핵구는 쉽게 접근할 수 있기 때문에, 접근이 덜 용이한 다른 골수 세포, 이를 테면, 대식세포 및 미세아교세포를 모델링하는 세포로 사용할 수 있다.

다양한 골수 세포와 마찬가지로, 단핵구는 각각 TLR2 및 TLR4 수용체 작용제인, 차례로 펩티도글리칸 및 지질다당류(LPS)와 같은 Toll-유사 수용체(TLR) 작용제를 통해 활성화될 수 있다. 활성화 마커의 발현(유동 세포분석에 의해) 및/또는 사이토킨, 이를 테면, 전-염증성 사이토킨, 인터루킨-6 (IL-6)의 분비에 의해 활성화가 모니터링될 수 있다. 실시예 9에서, LMW-DS는 LPS 자극에 반응하여 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 준비물에서 IL-6 분비를 감소시켰다. 그러나, PBMC 믹스에서 세포 유형의 다양성은 이러한 반응을 매개하는 정확한 세포 유형의 해석을 방해한다. 본 연구에서는 LMW-DS에 대한 정확한 세포 표적을 식별하기 위한 시도로써, 인간의 정제 단핵구로부터 LPS-자극된 IL-6 방출을 변형시키는 LMW-DS의 능력이 조사되었다. IL-6은 ALS와 같은 신경퇴행성 질환, 관절염과 같은 염증성 질환 및바이러스성/박테리아성 감염, 이를 테면, COVID-19의 결과로써 심각한 결과에 연합된 수많은 병리와 관련된 것으로 밝혀진 전형적인 전-염증성 사이토킨이다.

재료 및 방법

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare; 11778538) 밀도 원심분리를 통해 건강한 공여자들로부터 단리되었다. 표현형을 유지하기 위해 '손대지 않은(untouched)' 단핵구를 정제하는 EasySep^TM 인간 단핵구 농축 키트(StemCell)를 사용하여, 단핵구를 정제했다.

단핵구는 LMW-DS(Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780; 3가지 농도; 상위 농도 600μg/ml, 200μg/ml 및 60μg/ml), 헤파린(2.0, 6.0 또는 20μg/ml; 0.406, 1.218 및 4.06 유닛/ml에 등가임; Sigma Aldrich) 또는 덱사메타손(3.0μM; Sigma Aldrich)의 존재 또는 부재 하에서, 그리고 자극의 부재(자극안됨 PBS 비히클) 또는 자극의 존재 (LPS 또는 펩티도글리칸) 하에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양되었다. 원심분리 후, 세포 배양 상층액을 제거하였고, ELISA에 의한 IL-6에 대한 분석을 기다리면서 -20℃에서 보관했다. IL-6의 수준은 제조업체의 지침에 따라, ELISA(R&D systems)에 의해 상청액에서 정량화되었다.

결과

이력에 따른 내부 데이터는 LPS 및 펩티도글리칸의 준-최대 농도를 사용하기 위해 자극 농도의 선별을 유도하였다. 이들은 인간 PBMC 믹스가 IL-6의 공급원으로 사용되었을 때, 실시예 9에서 사용된 동일한 농도의 LPS 및 펩티도글리칸에 또한 상응한다.

TLR2 작용제인 펩티도글리칸, 그리고 TLR4인 작용제 LPS는 인간 정제된 단핵구로부터 세포 배양 상청액으로 IL-6의 방출을 유발시켰다(도 18).

10명의 건강한 공여자의 단핵구에 대한 평균 결과에서 LMW-DS에 의한 세포 배양 상청액으로의 LPS-자극된 IL-6 방출의 농도 의존적인, 통계적으로 유의미한 억제를 입증되었고(도 18a), 반면 헤파린은 세포 배양 상청액으로부터 농도 의존적으로, LPS-자극된 IL-6 방출에서 통계적으로 유의미한 향상을 유발시켰다(도 18c). 예상대로, 글루코코르티코이드 스테로이드 덱사메타손은 통계적으로 유의한 방식으로 세포 배양 상청액으로의 LPS-자극된 IL-6 방출을 억제했다(도 18b).

10명의 건강한 공여자의 단핵구에 대한 평균 결과에서 LMW-DS에 의한 세포 배양 상청액으로의 펩티도글리칸-자극된 IL-6 방출의 농도 의존적인, 통계적으로 유의미한 증가가 입증되었다(도 18d). 이러한 추세가 통계적 유의미성에 도달하지는 않았지만, 이러한 향상은 헤파린에 의해 어느 정도 반영되었다(도 18f). 예상대로, 덱사메타손이 존재하면, 펩티도글리칸-자극된 IL-6이 세포 배양 상청액으로 방출되는 것이 통계적으로 유의미하게 억제되었다(도 18e).

단핵구는 타고난 면역 체계의 일부이며; 이들 골수 세포는 대식세포 및 미세아교세포와 같은 다른 골수 세포에 대한 반응을 모델링하는 데 또한 사용할 수 있다. 본 연구에서, 정제된 단핵구로부터 IL-6의 방출 증가를 유발하는 LPS를 억제하는 LMW-DS의 명확하고, 실질적인 영향은 이들 세포가 LMW-DS의 표적이라는 강력한 증거를 제공한다.

실시예 11

질환에 걸리거나, 손상되거나 또는 감염된 조직에서 면역 반응의 활성화는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 표현형 균형의 변화에 의해 반영된다. 따라서, 적응성 면역계 및 선천 면역 시스템의 구성 요소들에 대한 연구 약물의 영향을 평가하면, 이러한 연구 요법과 관련된 임상 변화를 더 잘 이해하도록 만들고, 뿐만 아니라 상이한 병리들에 대한 치료 효능을 예측하는 세포 및/또는 분자 바이오마커들을 잠재적으로 확인하기 위한 물리적 세포 경로를 밝힐 수 있다.

인간 PBMC는 다양한 세포 하위집합을 직접적으로, 그리고 간접적으로 활성화시키고, 손상된 조직과 연합된 면역 반응을 모방하는 다양한 제제에 의해 시험관-내에서 자극될 수 있다. PBMC에서 사이토킨 방출을 모니터링하면, 약물의 잠재적 영향을 조사하고, 특정 환자 병인에서 약물 작용을 예측할 수 있다.

재료 및 방법

실시예 9는 다양한 자극의 사용으로 인하여 발생된, 인간 PBMC로부터 IL-6의 분비를 변형시키는 LMW-DS의 능력을 조사하였다. 본 연구는 실시예 9에서 유래한 세포 배양 상청액의 광범위한 분석을 수행했다. 따라서, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)들은 Ficoll-Paque PLUS 밀도 원심분리를 통해 건강한 공여자들로부터 단리되었다. PBMC는 자극 부재(비-자극 PBS 비히클 대조군) 또는 자극 존재(LPS, 펩티도글리칸, 포크위드 미토겐, PHA-L, CpG + IL-15, 또는 사이토스팀) 하에서 3가지 농도; 상위 농도 600μg/ml, 200μg/ml 및 60μg/ml의 LMW-DS(Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780) 존재 하에서, 또는 이의 부재(비히클) 하에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 웰당 2×10⁵ 개 세포로 배양시켰다.

따라서, 각 PBMC 공여자에 대한 치료는 다음과 같다:

i. 비히클

ii. 시뮬레이션

iii. 자극 + LMW-DS(60μg/ml)

iv. 자극 + LMW-DS(200μg/ml)

v. 자극 + LMW-DS(600μg/ml)

각각 3회 평가되며, 샘플의 총 수가 다음과 같다:

1. LPS; 165개 샘플 (11명의 공여자로부터)

2. 펩티도글리칸-바실러스 서브틸리스(B. subtilis)로부터; 90개 샘플 (6명의 공여자로부터)

3. PHA-L; 90개 샘플 (6명의 공여자로부터)

4. 0.2μM CpG + IL-15; 90개 샘플 (6명의 공여자로부터)

5. 1.0μM CpG + IL-15; 90개 샘플 (6명의 공여자로부터)

6. 포크위드 미토겐; 90개 샘플 (6명의 공여자로부터)

7. 10μl/ml 사이토스팀; 90개 샘플 (6명의 공여자로부터)

8. 30μl/ml 사이토스팀; 90개 샘플 (6명의 공여자로부터)

모든 자극(모든 세포 유형)에서 얻은 상층액 샘플의 총 수 = 795

처리 후, 세포 배양 상층액을 제거하였고, 원심분리하였고, -20℃에서 보관했고, R&D systems의 5-plex 인간 자기 Luminex 분석(Cat. No. LXSAHM-05)을 사용하여, 다양한 사이토킨들의 다중 분석을 위한 해동했다. Luminex 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 정확히 수행되었다.

결과

이력에 따른 내부 데이터는 LPS, 펩티도글리칸, 포크위드 미토겐, PHA-L, CpG + IL-15 및 사이토스팀의 준-최대 농도를 사용하기 위해 자극 농도의 선별을 유도하였고; 준-최대 농도의 자극을 사용하면, 변조가 있는 경우, 변조의 증가 및 감소 모두를 식별하게 된 경향이 있다. PBMC 혼합물을 사용하면, 비록 일부 자극이 다른 자극보다 더 효과적이었지만, 모든 자극은 세포 배양 상청액으로 사이토카인의 방출을 증가시켰다(도 19-23).

LPS

LPS(리포폴리사카라이드)는 톨-유사 수용체 (TLR) 4 작용제다. 인간 PBMC 믹스에서, LPS에 의해 직접적으로 활성화된 주요 세포 유형은 TLR4를 발현시키는 단핵구다. 단핵구는 타고난 면역 체계의 일부이며; 이들 골수 세포는 대식세포 및 미세아교세포와 같은 다른 골수 세포에 대한 반응을 모델링하는 데 또한 사용할 수 있다. 본 연구에서, LPS의 효과를 평가할 때, IIFNγ, TNFα, IL-1β 및 IL-10의 분비는 약간 증가했지만, 그러나, IL-8의 분비는 상당한 증가를 보였다(도 19-23). LMW-DS는 농도 의존적이지만, IFNγ 및 IL-10을 약간 감소시켰으며(도 19, 23), 최고 농도의 LMW-DS는 존재하면 IL-1β, IL-8 및 TNFα의 자극된 분비가 중등도로 감소했다(도 20-22).

펩티도글리칸

펩티도글리칸은 TLR2 작용제이며, PBMC 믹스에서 단핵구와 B 림프구에 의해 주로 발현되며; 후자는 항원에 대한 특정 항체의 생성에 필수적인 역할을 나타내는 것으로 가장 잘 알려진 후천적 면역계의 구성요소다. 펩티도글리칸은 세포 배양 상청액으로 IL-1β, IL-8 및 TNFα의 방출 증가를 유발시켰지만, 그러나, 모든 공여자로부터의 결과를 검토하면, IL-1β 및 TNFα 분비와 연합된 증가는 비록 있었지만, 전반적으로, 테스트된 최고 농도에서도 LMW-DS가 사이토킨 방출을 전반적으로 감소시킨다는 증거는 거의 없었다(도 19-23).

PHA-L

PHA-L(식물적혈구응집소-L)은 파세울루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)(빨간 강낭콩)의 L-유형 하위단위 렉틴으로써, T 림프구 표면 수용체들을 교차연계시켜, 이들이 활성화된다. PBMC 믹스에서, PHA-L은 IFNγ, IL-8, IL-10 및 TNFα의 증가를 유도하였고, 전반적으로 IL-1β의 중등도 증가를 유도하였다(도 19-23). LMW-DS는 IFNγ, IL-8, TNFα의 자극된 방출에서 소규모 감소를 초래하였지만, 그러나 IL-1β의 경우는 아니다(도 19-22). 대조적으로, LMW-DS는 IL-10 방출에 있어서, 농도 의존적인 큰 감소를 초래하였다(도 23).

포크위드 미토겐

포크위드 미토겐은 피토라카 아메리카나(Phytolacca americana)로부터 정제된 렉틴이다. 이것은 B 림프구의 T 림프구-의존적 활성화를 일으킨다. 본 연구에서, 포크위드 미토겐은 PBMC 믹스에 의해 IFNγ, IL-1β, IL-8, IL-10 및 TNFα의 방출에서 강력한 증가를 유발시켰지만(도 19-23), 그러나, 이러한 방출은 IL-10 방출에 있어서 농도-의존적 감소를 제외하고, LMW-DS에 의해 전반적으로 영향을 받지 않았다(도 23).

CpG + IL-15

CpG-ODNs는 PBMC 믹스 내에서 주로 단핵구 및 B 세포에 의해 발현되는 TLR9를 활성화시키는 짧은 단일-가닥으로된 DNA 분자다. IL-15는 B 림프구의 자극에서 CpG와 상승 작용한다. 포크위드 미토겐과 달리, CpG + IL-15는 B 림프구를 직접적으로 활성화시키는, 즉, T 림프구에 독립적이다. 본 연구에서는 이러한 자극이 IL-8의 분비를 증가시킨다는 강력한 증거만 있었다. 전반적으로, LMW-DS는 이 실험에서 이 반응에 거의 영향을 미치지 않았다(도 19-23).

사이토스팀

사이토스팀은 T 림프구의 항체-기반 활성체다. 이것은 T 세포 수용체(TCR)에 결합하고, 이것은 항원-제시 세포의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자와 교차연계시킨다. 따라서, 사이토스팀은 CD4 및 CD8 T 림프구를 모두 자극한다. 전반적으로, 사이토스팀은 IFNγ, IL-1β, IL-8, IL-10 및 TNFα(도 19-23)의 방출에서 증가를 유발시켰고, IL-10 분비를 제외하고, LMW-DS의 존재와 관련된 약간의 감소가 있었으며, 여기에서 LMW-DS의 존재 하에서 명백한 농도 의존적인 큰 감소가 있었다(도 23).

전반적으로, 이들 데이터는 패혈증과 같은 감염-후 염증 반응이 있는 환자들에게 LMW-DS의 작용이 도움이 된다는 것을 뒷받침한다. 감염-후 패혈증은 장기의 기능 장애를 초래하는 조절 장애 면역 반응으로 간주된다. 패혈증은 주요 이환율, 사망률 및 의료비 지출의 원인이 된다. 패혈증으로 인한 중환자 COVID-19 환자들의 대부분이 사망하는 현재 대유행에서 새로운 치료제에 대한 긴급한 필요성이 다시 강조되었다.

패혈증 동안, 감염에 대한 반응으로 염증성 사이토킨들이 과도하게 생성되어(사이토킨 폭풍) 패혈성 쇼크를 유발할 수 있다. LMW-DS에 의해 조절되는 몇몇 사이토킨은 모두 상승되고, 이는 패혈증의 발병기전에 기여하는 것으로 간주된다. 예를 들면, IFNγ, IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα는 비생존자들 4에서 지속적인 증가된다. TNFα 및 IL-1β은 패혈증에 중요한 역할을 하며, 대식세포와 같은 세포에 작용하는 것으로 여겨지며, 대식세포들에서 염증 캐스케이드를 증폭시켜, 다른 전-염증성 사이토킨, 뿐만 아니라 반응성 산소종 및 질소 종의 방출을 증가시키고, 내피 세포에서 염증 유발 응고 활성화를 매개한다. TNFα의 추가 역할에는 내피 세포에 대한 작용을 통한 호중구 유출 촉진이 내포되며, 항체로 TNFα를 차단시켜면, 중증 패혈증 환자들의 생존율도 향상될 수 있다는 것이 입증되었다. IL-6은 T 세포, B 세포 및 응고 시스템의 활성화를 향상시킬 수 있으며, IL-6의 수준은 패혈증의 임상적 중증도와 상관관계가 있다. IL-6의 녹아웃은 급성 폐 손상의 마우스 모델에서 폐 손상을 감소시킨다. IL-8은 호중구를 강력하게 유인하고, 활성화하는 작용을 하며, 이의 수준은 패혈증의 중증도와 상관관계가 있다. 패혈증의 병리학적 역할 외에도, 사이토킨은 숙주 방어 및 면역 조절에서 숙주 보호 역할을 할 수 있고, 따라서, 위에서 설명한 표적화에 대한 전망에도 불구하고, 패혈증에서 사이킨인의 역할은 여전히 '양날의 검'이다.

염증성 질환, 이를 테면, 패혈증의 한 가지 숙제는 오래지속되는 면역 억제를 생성없이, 반응 요소들을 어떻게 표적화시키는 지에 있다. 패혈증에서 TNFα를 중화하는 이점이 입증되었지만, 긴 반감기를 갖는 단일클론항체들, 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab) 및 세르톨리주맙(certolizumab)은 반감기 값이 약 14일이므로, 투여 시기와 경로에 문제가 있다. 따라서, 질환의 특정 단계에서 LMW-DS와 같이 작용 시간이 상대적으로 짧은 다중 사이킨을 표적으로 하는 제제는 염증성 질환, 이를 테면, 폐혈증 환자들에게 잠재적인 추가 임상 이점을 가져올 수 있다. COVID-19 연합된 폐혈증의 경우, LMW-DS의 추가 이점은 바이러스에 대한 직접적인 영향으로 인해 발생할 수 있고; 따라서, SARS-CoV-2를 외인성 LMW-DS와 함께 항온처리하면 인간 상피 세포주에 대한 흡착이 감소되고, 생체-외 인간 폐 조직 외식편 내에서 바이러스 복제가 감소된다.

실시예 12

본 실시예의 목적은 '단일-중심, 개방 단일-부분 연구'라는 제목의 테스트에 참여한 스웨덴 ALS 환자들의 코호트로부터 혈청 샘플에서 혈청 대사산물의 농도에 대한 반복적인 LMW-DS 투여의 효과를 평가하는 것이며, 여기에서 피하로 투여된 ILB®의 안전성, 내약성 및 효능은 근위축성 측삭 경화증 환자들에서 평가될 것이다. 장기적 변화과정의 기획을 사용하여, 이 연구는 매주 LMW-DS 치료 전과 후에, 각 ALS 환자에서 선택된 혈청 대사산물의 변화를 결정하는 것을 목표로 하였다. 측정된 대사산물에서의 변화는 이 환자 집단에서 잠재적인 질환 변형 및 약물의 작용 기전을 뒷받침하는 LMW-DS에 대한 환자의 생화학적 반응을 나타낸다.

재료 및 방법

초기 스크리닝 방문 후, 환자들은 염수 중 체중 기준으로 1.0 mg/kg의 단회 LMW-DS(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780) 주사를 하복부 피하 지방으로 5주간 주단위 투여받았다.

적어도 15분의 완전한 휴식 후, 표준 지혈대 절차를 사용하여, 환자들로부터 말초 정맥 혈액 샘플을 전주 정맥(antecubital vein)에서 혈청 분리기와 응고 활성제가 함유된 단일 VACUETTE® 폴리프로필렌 튜브(Greiner-Bio One GmbH, Kremsmunster, Austria)로 수집했다. 실온에서 30분 후, 채취된 혈액을 1,890×g에서 10분 동안 원심분리하였고, 생성된 혈청 샘플을 분석할 때까지 -20℃에서 보관했다.

해동 후, 각 혈청 샘플의 500μl 분취량에 1ml의 HPLC-등급 아세토니트릴을 보충하였고, 60초 동안 와동시켰으며, 탑-벤치 원심분리기에서 최대 속도로 원심분리하여 단백질을 침전시켰다. 상층액을 HPLC-등급의 클로로포름 다량으로 세척하여 유기 용매를 제거했고, 원심분리시켰고, 상부 수성상을 다른 튜브로 옮기고, 샘플을 구별할 수 있도록 명확하게 라벨을 붙이고, 상이한 수용성 화합물들을 결정하기 위해 분석할 때까지 -80℃에서 보관했다.

각 혈청 샘플의 약 300μl의 두 번째 분취량을 빛-차단시킨 후, 도처에서 설명된 방법을 사용하여 지용성 항산화제들을 추출하도록 처리했다(Lazzarino et al., Single-step preparation of selected biological fluids for the high performance liquid chromatographic analysis of fat-soluble vitamins and antioxidants. J Chromatogr A. 2017; 1527: 43-52.). 간략하게 설명하자면, 샘플에 1 ml의 HPLC 등급 아세토니트릴을 보충하였고, 60 s 동안 격렬하게 볼텍싱하였고, 수조에서 교반 하에 1h 동안 37℃에서 항온처리하여, 지용성 화합물의 완전하게 추출하였다. 그런 다음, 샘플을 4C에서 15분 동안 20,690×g에서 원심분리하여 단백질을 침전시켰고, 투명한 상청액을 지용성 비타민 및 항산화제의 HPLC 분석할 때까지 -80℃에서 저장했다.

단백질이 제거된 혈청 샘플에서, 다음 수용성 화합물: 하이포잔틴, 잔틴, 요산, 말론디알데하이드(MDA), 아질산염, 질산염, N-아세틸아스파테이트(NAA), 시트룰린(CITR), 알라닌(ALA), 및 오르니틴(ORN)을 도처에서 설명된 방법에 따라 HPLC로 분리하고 정량화했다(Tavazzi et al., Simultaneous high performance liquid chromatographic separation of purines, pyrimidines, N-acetylated amino acids, and dicarboxylic acids for the chemical diagnosis of inborn errors of metabolism. Clin Biochem. 2005; 38: 997-1008; Romitelli et al., Comparison of nitrite/nitrate concentration in human plasma and serum samples measured by the enzymatic batch Griess assay, ion-pairing HPLC and ion-trap GC-MS: The importance of a correct removal of proteins in the Griess assay. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007; 851: 257-267; Amorini et al., Metabolic profile of amniotic fluid as a biochemical tool to screen for inborn errors of metabolism and fetal anomalies. Mol Cell Biochem. 2012; 359: 205-216).

단백화 제거된 혈청 샘플에서 다음 지용성 비타민 및 항산화제: α-토코페롤 (비타민 E) 및 γ-토코페롤을 이전에 기재된 방법에 따라 HPLC를 이용하여 분리 및 정량화하였다(Lazzarino et al., Cerebrospinal fluid ATP metabolites in multiple sclerosis. Mult Scler J. 2010; 16: 549-554). 상기에서 언급된 지용성 항산화제 및 비타민 외에도, 혈청 샘플에서 총 빌리루빈의 농도 또한 측정되었다.

통계

치료-전과 치료-후 하위그룹간의 비교는 쌍을 이루는 샘플에 대한 양방 Student t-검정에 의해 수행되었다. 각 하위그룹과 건강한 대조군 그룹의 비교는 쌍을 이루지 않은 관찰을 위해 양방 비-모수 Mann-Whitney U-테스트에 의해 수행되었다. p < 0.05인 차이는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.

결과

통계 분석에 따라, 환자 집단의 치료-전 및 치료-후 하위 그룹은 다음의 것들이 상당히 상이한 혈청 농도를 보유하였다: NAA(도 26), 요산(도 27), MDA(도 31), 질산염(NO₃)(도 29), 아질산염 + 질산염(NO₃ + NO₂)(도 30), 총 옥시퓨린(도 28), ALA(도 32), CITR(도 33), ORN/CITR 비율(도 34), 비타민 E(α-토코페롤 및 γ-토코페롤)(도 35 및 36) 및 총 빌리루빈(도 43).

앞서 언급한 화합물들의 데이터는 도 26-36에서 상자 플롯으로 표시되며 (최소, 최대, 중앙값, 25% 및 75% 백분위수 보고함) 이때 이탈리아 환자 코호트에서 파생된 과거이력 데이터 세트로부터 건강한 대조군(25-65세 범위)의 값도 또한 내포되어, 환자의 두 그룹(치료-전과 치려-후)과 비교되었다. 모든 도면에서, 대조군 값에 대한 차이는 별표 1개로 표시되고(*), 환자들의 두 하위그룹 간의 차이는 별표 2개(**)로 표시된다.

ALS 환자들은 건강한 대조군에서 측정된 것보다 혈청 NAA 수치가 더 높았으며, 이는 아마도 생존가능한 뉴런의 감소에서 비롯된 것으로 보인다(도 26). LMW-DS 처리-후 현저히 낮은 NAA 값이 측정되었으며, 따라서 세포 생존에 대한 이 약물의 보호 효과를 시사한다.

ALS 환자들은 요산 및 옥시퓨린의 합(하이포잔틴 + 잔틴 + 요산)이 대조군에서 측정된 것보다 더 높은 혈청 농도을 보유하였고(도 28), 아마도 에너지 대사 불균형의 결과로 인하여 아데닌 뉴클레오타이드 분해 경로가 활성화되고, 결과적으로 순환하는 퓨린 화합물이 증가한 것으로 추정된다. LMW-DS 처리는 이들 두 매개변수를 모두 감소시켰고, 따라서 세포 에너지 상태의 증가와 함께 미토콘드리아 기능의 개선을 시사했다.

ALS 환자들은 질산염(도 29), 아질산염 + 질산염(도 30) 및 MDA의 혈청 농도가 대조군에서 측정된 것보다 더 높은 농도를 보유하였고(도 31), 이는 지속적인 산화적/질산화적 스트레스를 강력하게 나타내어, ROS-매개된 지질 과산화(MDA) 및 산화질소 대사(질산염 및 아질산염 + 질산염)의 안정적인 최종 산물의 순환 수준을 증가시키는 원인이 된다. LMW-DS 치료는 이러한 매개변수들의 수준을 감소시켰고, 따라서, 화합물의 직접적인 소거 활성, BDNF와 같은 유전자에 대한 긍정적인 영향, 소거 효소들의 수준 조절 및/또는 궁극적으로 낮은 수준의 ROS 생산을 유발하는 미토콘드리아 기능에 대한 긍정적인 영향을 나타낸다.

ALS 환자들은 대조군에서 측정한 것보다 ALA의 혈청 농도가 더 높았으며(도 32), 아마도 더 높은 비율의 근육 단백질 분해 때문일 것이다. LMW-DS 처리는 ALA의 순환 값을 정규화했고(대조군과 동일하고, 처리-전 하위 그룹보다 유의미하게 낮음), 근육 대사 및 기능에 대한 이약물의 긍정적인 작용을 시사한다.

ALS 환자들은 대조군에서 측정된 것보다 CITR의 혈청 농도가 더 높았고(도 33), ORN/CITR 비율의 값이 더 낮았으며(도 34), 이로 인하여 과도한 산화질소 생성과 이에 따른 반응성 질소종(RNS)의 증가로 인한 지속적인 질산화적 스트레스의 존재를 입증한다. LMW-DS 처리는 질산화작 스트레스를 유발하는 효소인 유도성 산화질소 합성효소의 발현을 낮춤으로써, 두 매개변수를 모두 개선시켰다.

ALS 환자들은 대조군에서 측정된 것보다 α-토코페롤 및 γ-토코페롤(비타민 E의 두 가지 주요 형태) 모두 더 낮은 혈청 농도를 보유하였고(도 35 및 도36), 이로 인하여 막 인지질의 지방산의 ROS-매개된 과산화의 방해꾼으로서 중요한 역할을 하는 주요 지용성 항산화제의 현저한 감소를 시사한다. LMW-DS 치료는 두 매개변수 모두 개선시켰다.

ALS 환자들은 대조군에서 측정된 것보다 총 빌리루빈의 혈청 농도가 더 높으며, 이는 아마도 간 기능 교란을 반영하는 것이다. LMW-DS 치료는 이 혈청 대사산물의 수준을 정상화하는 경향을 갖는 이 매개변수를 감소시켰고, 이는 간 기능의 개선을 나타낸다.

LMW-DS는 간 기능을 개선할 수 있고, 이로 인하여 여러 COVID-19 환자들에서 나타나는 간 기능 저하를 억제할 수 있다. 따라서, LMW-DS 치료의 이러한 효과는 회복 단계 (단계 IV) 그리고 장기간 COVID-19 대상체들을 위해 특히 유익하다(도 25).

실시예 13

본 실시예는 RayBio® COVID-10 스파이크-ACE2 결합 분석 키트를 이용하여 평가된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 및 ACE2 간의 상호작용에 있어서 LMW-DS가 미치는 능력을 조사하였다.

COVID-19는 바이러스 SARS-CoV-2에 의한 감염으로 발생된다. 이 바이러스가 인간 세포에 침입하는 기전 중 하나는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 안지오텐신 I 전환 효소 2(ACE2) 간의 직접적인 상호작용을 통한 것으로 현재 이해되며; 후자는 다양한 인간 세포의 세포막에서 발현된다. 이 상호작용은 RayBio® COVID-19 스파이크-ACE2 결합 분석 키트를 이용하여 평가할 수 있는데, 이는 신속한 ELISA 기반된 비색 분석법이다.

재료 및 방법

SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 ACE2 간의 상호작용을 파괴시키는 LMW-DS 능력을 평가하기 위해, RayBio® COVID-19 스파이크-ACE2 결합 분석 키트(cat. 번호 CoV-SACE2)는 제조업체의 지침에 따라 (ver 1.6) 이용되었다.

염수에 LMW-DS(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780)를 3.0μ/mL ~ 600μg/ml 농도 범위로 추가하였다.

결과

LMW-DS가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 ACE2 간의 상호작용을 감소시킬 수 있다는 분명한 증거가 있다(도 37). 좀더 상세하게, LMW-DS는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 - ACE2 상호작용을 농도 의존적 방식으로 파괴시켰다. LMW-DS에 의해 야기되는 것과 같이, SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 ACE2 간의 상호작용 억제는 SARS-CoV-2 바이러스가 인간 세포로 진입하려는 능력을 감소시킴으로써, 이들 환자에게 유익할 것으로 예상된다.

실시예 14

장기적 변화과정의 기획을 사용하여, 본 연구는 덱스트란 설페이트 투여 전, 그리고 이러한 치료 시작 후 상이한 시간대 이후, ALS 환자들에서 선택된 혈청 대사산물의 변화를 결정하는 것을 목표로 했다. 측정된 대사산물에서의 변화는 이들 ALS 환자 집단에서 잠재적인 질환 변형 및 약물의 작용 기전을 뒷받침하는 덱스트란 설페이트에 대한 환자의 생화학적 반응을 나타내었다.

재료 및 방법

덱스트란 설페이트(ILB®, Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780)는 ALS를 앓고 있는 8명의 인간 환자들에게 10주 동안 매주 1회 일일 2 mg/kg를 피하 주사로 투여하였다.

표준 지혈대 절차를 사용하여, 덱스트란 설페이트 투여 전(0 주차), 그리고 이의 투여 후(5주차 및 10주차), 적어도 15분간의 완벽한 휴식 후 환자들로부터 말초 정맥 혈액 샘플을 전주 정맥에서 혈청 분리기와 응고 활성제가 함유된 단일 VACUETTE® 폴리프로필렌 튜브(Greiner-Bio One GmbH, Kremsmunster, Austria)로 수집했다. 실온(20-25℃)에서 30분 후, 채취된 혈액을 1,890×g에서 10분 동안 원심분리하여 혈청 분량을 얻었다.

500μl 혈청 분취량에 1ml의 HPLC-등급 아세토니트릴을 보충하였고, 60초 동안 와동시켰으며, 탑-벤치 원심분리기에서 최대 속도로 원심분리하여 단백질을 침전시켰다. 상층액을 HPLC-등급의 클로로포름 다량으로 세척하여 유기 용매를 제거했고, 원심분리시켰고, 상부 수성상을 다른 튜브로 옮기고, 샘플을 구별할 수 있도록 명확하게 라벨을 붙이고, 상이한 수용성 화합물들을 결정하기 위해 분석할 때까지 -80℃에서 보관했다.

ALSAQ-40은 치료-전과 치료-후 10주 동안 매주, 그리고 추적 관찰 기간에 방문시 평가되었다.

결과

젖산염은 근육에 의해 만들어지며, 정상 및 ALS 환자들의 운동 중에 혈액에 축적된다. 증가된 혈청 락테이트 수치는 개선된 근육 기능/사용을 나타낸다.

도 38은 덱스트란 설페이트 투여-전 (0주차) 및 투여-후 ALS 환자들의 혈청 락테이트 수준을 예시한다. 이들 데이터에서 주로 근육 세포의 대사에서 유래하는 순환하는 젖산 수준은 덱스트란 설페이트 투여 시간이 증가함에 따라 유의미하게 상승되었음을 보여준다(*0 주차 시점과 비교하였을 때 유의미적으로 상이함, p < 0.01). 덱스트란 설페이트 치료 5주 후, 혈청 락테이트 수준은 1.78±0.59에서 2.31±1.02μmol/L로 29.8% 증가되었고 (p < 0.01, Wilcoxon 사인된-랭크 테스트), 한편 덱스트란 설페이트 치료 10주-후, 혈청 락테이트 수준은 3.02±1.59μmol/L로, 70% 증가되었다. 따라서, 덱스트란 설페이트 투여로 ALS 환자들에서 근육 활성이 증가되었다.

'일상 생활/자립 활동'(ADL) 및 '신체 이동성'(PM)이라는 ALSAQ-40 하위-점수는 신체 활동 및 독립 수준에 대한 환자의 견해를 반영한다. 점수의 하락은 신체 활동의 향상을 반영한다. 덱스트란 설페이트 치료 10주 후, ADL 하위- 점수는 58.9 ± 21.4에서 44.4 ± 24.7로 18.6% 크게 감소했고(p < 0.05)(도 39 참고), 한편 PM 하위-점수는 27.2 ± 22.2에서 22.7 ± 20.2로 16% 감소되었다. 이들 결과는 치료 동안 환자들의 신체 활동이 개선되었음을 나타낸다.

덱스트란 설페이트 투여로 유발된 근육 기능 개선은 COVID-19 환자들에게 유익한데, 이런 치료가 없다면 근육 통증 및 근육 기능 저하로 고통을 받을 수 있다. 따라서, 덱스트란 설페이트에 의해 얻어지는 근육 개선은 회복 단계(단계 IV)에서 유익하다(도 25).

실시예 15

재료 및 방법

단계 IIa, 단일-중심의, 공개 라벨의, 단일-부분 연구 형태의 임상 시험으로 진행 속도가 중간 정도인 ALS 환자들을 대상으로 피하로 투여된 덱스트란 설페이트의 안전성, 내약성 및 가능한 효능을 평가하였다. 이 임상 시험은 Sahlgrenska University Hospital, Gothenburg, Sweden에서 수행되었으며, Ethics Committee of the University of Gothenburg 및 Swedish Medical Products Agency의 감독 및 승인을 받았다.

덱스트란 설페이트(Tikomed AB, Viken, Sweden, WO 2016/076780)는 ALS를 앓고 있는 13명의 인간 환자들에게 5주 동안 매주 1회 매일 1 mg/kg를 피하 주사로 투여하였다.

혈액 샘플은 정맥 카테터에 의해 진공관으로 특정된 연구 간격으로 채취되었다. 혈장의 실험실 분석은 Sahlgrenska University Hospital의 Clinical Chemistry Laboratory에서 수집한 직후 수행되었다.

ALSFRS-R은 치료-전과 5주-치료 동안 매주 치료 후, 그리고 추적 관찰 기간에 방문시 평가되었다.

결과

미오글로빈은 심장 및 골격근 조직에서 전형적으로 발견되는 단백질이다. 부상/질환으로 근육이 손상되면, 혈류에서 미오글로빈 수치가 상승된다. 혈청 미오글로빈 수치의 감소는 근육 퇴화의 감소를 나타낸다.

이들 환자들의 혈청 미오글로빈 데이터에서 미오글로빈 수준이 덱스트란 설페이트 치료 4주 후, 133.92 ± 126.28에서 103.69 ± 72.16μg/L (p = 0.021 vs 1일차)로 통계학적으로 유의미한 30% 감소되었는데, 이것은 치료 동안 환자들의 근육 조직 변성 및 근육 위축 속도가 약물-관련하여 감소됨을 나타낸다(도 40 참조).

혈액 내 근육 효소크레아틴 키나제의 출현은 일반적으로 근육 손상의 바이오마커로 간주되며, ALS를 비롯한 근육 위축과 관련된 의학적 상태 진단에 특히 유용할 것으로 간주된다. 크레아틴 키나아제 수치의 상승은 ALS 환자들의 공통적인 특징이다. 혈청 크레아틴 키나제의 수준 감소는 이 질환-관련된 근병증의 완화를 나타낸다.

이들 환자의 혈청 크레아틴 키나제 데이터로부터 덱스트란 설페이트 치료 4주 후, 이들 수준이 7.15 ± 5.74에서 6.2 ± 5.08μkat/L (p < 0.05, Wilcoxon 사인된-랭크 테스트) 통계학적으로 유의미한 13.3% 감소되었는데, 이것은 치료 동안 이들 환자의 근육 위축이 약물-관련하여 감소됨을 나타낸다(도 41 참조).

간세포 성장 인자(HGF)는 강력한 신경 보호 및 근육 생성 인자로 작용하는 자연 발생 성장 인자이며, ALS 모델을 비롯한 수많은 동물 모델에서 퇴행성 질환 진행에 대해 유용한 것으로 나타났다. 흥미롭게도, Hauerslev S et al. (2014, Plos One 9:e100594)는 근위축증의 마우스 모델에서 재조합 HGF 치료 2주 후, 근량이 18% 증가됨을 입증했다. HGF 치료가 근육 위축의 이러한 동물 모델에서 골격근에서 그러한 빠른 재생 반응을 유도할 수 있다는 관찰은 ALS 환자들에서 덱스트란 설페이트에 대한 반응으로 관찰된 빠른 근육 반응과 관련이 있다.

ALS 환자들의 약동학 데이터에서 덱스트란 설페이트 주사 후 2.5시간 시점에 37863 ± 14235μg/L의 피크까지 820 ± 581에서 순환 HGF의 약리학적으로 관련된 수준으로 통계적으로 유의한(p < 0.001) 증가를 나타냈다(도 42 참조). 이것은 덱스트란 설페이트 투여-후, 근위축증에 대한 직접적인 근육형성 및 간접적인 신경영양성 HGF 매개 효과의 가능성을 나타낸다.

근육 퇴화 감소의 생화학적 증거는 개선된 근육 기능의 임상 관찰을 뒷받침한다. 예를 들어, ALSFRS-R에서 경추, 체간, 요천추 및 호흡 근육에 의해 매개되는 기능은 각각 3개 항목으로 평가되며, 이 범주의 점수는 근력의 객관적인 측정과 밀접한 일치를 보인다. 참고로, 심한 안구 마비를 가진 두 명의 환자는 5-주간의 치료 기간 동안 이 증상의 거의 완전한 해결을 경험했다.

덱스트란 설페이트 투여로 유발된 근육 기능 개선은 COVID-19 환자들에게 유익한데, 이런 치료가 없다면 근육 통증 및 근육 기능 저하로 고통을 받을 수 있다. 따라서, 덱스트란 설페이트에 의해 얻어지는 근육 개선은 회복 단계(단계 IV)에서 유익하다(도 25). 또한, COVID-19 환자들에서 HGF 수준의 증가는 활성화 조직 복구 및 상처 치유를 활성화시켰고, 이는 폐 단계(단계 II)와 관련 있다(도 25).

위에서 설명된 실시형태들은 본 발명의 몇 가지 예시적인 예로서 이해되어야 한다. 당업자라면 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 실시형태에 다양한 수정, 조합 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 상이한 실시형태에서의 상이한 부분 용액은 기술적으로 가능한 다른 구성으로 결합될 수 있다.

Claims

코로나바이러스 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 이용하기 위한 용도의 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염성 질환은 중동 호흡기 증후군 (MERS), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 및 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)로 이루어진 군으로부터 선택된, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 2에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염성 질환은 COVID-19인, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염은 중동 호흡기 증후군-관련된 코로나바이러스(MERS-CoV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 이루어진 군으로부터 선택된 코로나바이러스에 의해 야기된 코로나바이러스 감염인, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 4에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염은 SARS-CoV-2에 의해 야기된, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
급성 호흡기 장애 증후군(ARDS) 및 전신 염증 반응 증후군(SIRS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도의 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
세포 표면 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 결합할 수 있는 병원체로 야기되는 감염 또는 감염성 질환의 예방, 억제 및/또는 치료에 이용하기 위한 용도의 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 7에 있어서, 상기 병원체는 최초 세포성 흡착 및/또는 후속적인 세포성 진입을 촉진시키기 위해 HSPG에 결합할 수 있는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 병원체는 HSPG의 헤파란 설페이트 부분에 결합할 수 있는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 상기 대상체에게 전신 투여용으로 제형화되는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 10에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 정맥내 또는 피하내 투여용으로 제형화되며, 바람직하게는 상기 대상체에게 피하내 투여용으로 제형화되는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 평균 분자량이 10 000 Da이거나 또는 그 미만인, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 12에 있어서, 상기 평균 분자량은 2 000 ~ 10 000 Da의 범위 내, 바람직하게는 3 000 ~ 10 000 Da의 범위 내, 그리고 더욱 바람직하게는 3 500 ~ 9 500 Da의 범위 안에 있는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 13에 있어서, 상기 평균 분자량은 4 500 ~ 7 500 Da의 범위 내, 바람직하게는 4 500 ~ 5 500 Da의 범위 안에 있는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 15 ~ 20% 범위의 평균 황 함량을 갖는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 핵 자기 공명(NMR) 분광법으로 측정하였을 때, 1850 ~ 3500 Da의 범위 내, 바람직하게는 1850 ~ 2500 Da의 범위 내, 그리고 더욱 바람직하게는 1850 ~ 2300 Da의 범위 내 수 평균 분자량(Mn)을 갖는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 16항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 NMR 분광법으로 측정하였을 때, 1850 ~ 2000 Da 범위 내의 Mn을 갖는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 단위 포도당 당(per) 2.5 ~ 3.0의 범위 내, 바람직하게는 2.5 ~ 2.8의 범위 내, 그리고 더욱 바람직하게는 2.6 ~ 2.7의 범위 내의 평균 설페이트 수를 갖는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 평균 5.1개의 포도당 단위와 단위 포도당 당(per) 2.6 ~ 2.7의 평균 설페이트 수를 갖는, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 수성 주사 용액으로 제형화되는, 덱스트란 설페이트, 또는 전술한 이의 약학적으로 수용가능한 염.
청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 덱스트란 설페이트의 나트륨 염인, 덱스트란 설페이트, 또는 전술한 이의 약학적으로 수용가능한 염.