KR20230004424A - 세포외 소포체 및 항체 전달을 위한 그의 용도 - Google Patents

Abstract

신경 세포, 예를 들어 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포로부터 유래된 세포외 소포체(EV)의 표면에 접합된 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분)를 대상체에게 투여함으로써 대상체의 중추 신경계에 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 같은 폴리펩타이드에 커플링된 신경 EV를 포함하는 접합체, 및 그의 사용 방법이 또한 제공된다. 또한, 신경 세포로부터 유래된 세포외 소포체(EV)의 내강 내에 로딩된 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분)를 대상체에게 투여함으로써 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 전달하는 방법이 본원에서 개시된다.

Description

세포외 소포체 및 항체 전달을 위한 그의 용도

관련 출원

본 출원은 2019년 11월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/930,178호에 기초한 우선권을 주장한다. 상기 우선권 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 2020년 10월 29일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 A106525_1040WO_SL.txt이고, 크기는 86,402 바이트이다.

알츠하이머병의 치료제인 솔라네주맙(Solanezumab) 및 아두카누맙(Aducanumab)을 포함한 항체 기반 약물의 최근 실패는 CNS에서 효과적인 생체이용률을 위한 투여 경로로서 IV를 사용하는 것을 비롯하여 CNS에서 치료 항체 치료의 미래에 대해 많은 질문을 제기하였다. 마우스에서, 항체 농도는 IV로 투여할 때 주입된 용량의 약 0.1% 수준으로 뇌에서 측정할 수 있으며, 매우 적은 양이지만 최대 72시간 후에 검출될 수 있다(Banks et al., Peptides, 2002. 23(12): p. 2223-6). 이와 유사하게, IV 전달 항체는 인간 임상 시험에서 혈청에서 발견된 농도의 0.1%의 CSF 수준을 보고하였으며, 이것은 IgG가 인간 혈액-뇌 장벽(BBB)을 쉽게 통과하지 않는다는 것을 나타낸다(Rubenstein et al., Blood 2003 101(2): pp. 466-8).

BBB 트랜스사이토시스(transcytosis) 단백질에 결합하는 하나의 가변 영역을 포함하고 다른 가변 영역은 특정 관심 표적에 결합하는 이중특이적 항체가 생성되었다. 특히, 트랜스페린 수용체는 BBB를 가로지르는 강력한 수송체인 것으로 나타났지만, 인간 시험에서 이 수용체를 사용하는 것은 안전성 문제로 인해 저지되었다(Couch et al., Sci Transl Med, 2013. 5(183): p. 183ra57, 1-12). 최근에, BBB-횡단 CD98hc(Zuchero et al., Neuron, 2016. 89(1): p. 70-82) 및 FC5(Muruganandam et al., 2002. 16(2): p. 240-242))를 포함한 다른 잠재적인 이중특이적 표적이 탐색되었지만, 아직까지 임상에서 입증된 바는 없다. 아데노 관련 바이러스(AAV)가 또한 BBB를 가로지르고(Deverman et al., Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 204-9), 뇌에서 분비되는 항체를 코딩할 수 있는 외인성 유전자를 전달하는(Ryan et al., 2010. 18(8): p. 1471-1481) 능력에 비추어 유망한 것으로 나타났다. 그러나, AAV는 특히 재투여시에 제거율이 높고, 상기 항체를 생성하기 위해 너무 많은 에너지를 사용하는 뉴런 또는 다른 CNS 세포의 잠재적인 붕괴가 발생하기 쉽다. 따라서, 치료용 단백질, 예를 들어 항체를 중추 신경계에 전달하기 위한 추가의 방법이 관련 기술 분야에 필요하다.

발명의 요약

항체와 같은 치료용 단백질의 대상체의 뇌 및 중추 신경계로의 전달을 개선하기 위해, 치료용 단백질에 대한 담체로서 신경 세포외 소포체(EV: extracellular vesicle)를 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 한 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 대상체의 중추 신경계로 전단하는 방법이 본원에서 제공되고, 상기 방법은 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 신경 세포로부터 유래된 세포외 소포체를 포함하는 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 클릭 링커(click linker)를 통해 세포외 소포체의 표면 및 관련 단백질에 접합된다.

한 측면에서, 대상체의 중추 신경계에 폴리펩타이드를 전달하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 폴리펩타이드 및 신경 세포로부터 유래된 세포외 소포체를 포함하는 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 폴리펩타이드는 클릭 링커를 통해 세포외 소포체의 표면 및 관련 단백질에 접합된다. 예시적인 실시양태에서, 폴리펩타이드는 외인성 폴리펩타이드이다. 다른 예시적인 실시양태에서, 폴리펩타이드는 치료용 폴리펩타이드이다.

일부 실시양태에서, 접합체는 정맥 내로 투여된다.

일부 실시양태에서, 접합체는 비강 내로 투여된다.

일부 실시양태에서, 접합체는 대상체의 뇌로 전달된다. 일부 실시양태에서, 접합체는 대상체의 혈액 뇌 장벽을 가로질러 전달된다.

일부 실시양태에서, 신경 세포는 신경 전구 세포이다. 일부의 상기 실시양태에서, 신경 전구 세포는 인간 만능 세포로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 인간 만능 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 인간 만능 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 IgG이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 Fab, F(ab')₂, scFv, 탠덤 scFv, 디아바디, 미니바디 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 단편이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 완전한 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.

일부 실시양태에서, 클릭 링커는 아지드 클릭 시약과 알킨 클릭 시약 사이의 반응으로부터 형성된다.

일부 실시양태에서, 클릭 링커는 아지드와 디벤조사이클로옥틴(DBCO) 사이의 반응으로부터 형성된다.

일부 실시양태에서, 클릭 링커는 테트라진과 트랜스사이클로옥텐 사이의 반응으로부터 형성된다.

일부 실시양태에서, 클릭 링커는 테트라진과 노르보르넨 사이의 반응으로부터 형성된다.

일부 실시양태에서, 항체는 대상체의 뇌로 전달된다.

일부 실시양태에서, 항체는 대상체의 중추 신경계로 전달된다.

일부 실시양태에서, EV는 외인성 핵산 및/또는 외인성 단백질을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, EV는 siRNA 및/또는 안티센스 핵산을 포함한다.

일부 측면에서, 항체-EV(Ab-EV) 접합체를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 접합체는 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 신경 세포로부터 유래된 세포외 소포체(EV)를 포함하고, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 클릭 링커에 의해 EV 표면에 접합된다.

일부 실시양태에서, 신경 세포는 신경 전구 세포이다. 일부의 상기 실시양태에서, 신경 전구 세포는 인간 만능 세포로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 인간 만능 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 인간 만능 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.

일부 실시양태에서, 클릭 링커는 다음 중 임의의 하나 이상의 반응에 의해 형성된다: 아지드와 디벤조사이클로옥틴; 테트라진과 트랜스사이클로옥텐; 테트라제인과 노르보르넨; 아지드와 알린; 아지드(스트레인 촉진)와 알킨; 아지드(스트레인 촉진)와 니트론; 알켄과 아지드; 알켄과 테트라진; 및/또는 알켄과 테트라졸.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 IgG이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 Fab, F(ab')₂, scFv, 탠덤 scFv, 디아바디, 미니바디, 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 단편이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 솔라네주맙, 아두카누맙, 니볼루맙, 베바치주맙, 오크렐리주맙, 나탈리주맙, 디누툭시맙, 간테네루맙, 레카네맙, 또는 유블리툭시맙 중 임의의 하나 이상의 것이다.

일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 세포외 소포체(EV)의 내강(lumen) 내에 로딩하는 방법이 본원에서 제공되고, 상기 방법은 i) EV를 사포닌으로 처리하여 EV 막을 투과시키는 단계; (ii) 처리된 EV를 초음파 처리하는 단계; 및 (iii) 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 EV에 첨가하여 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 EV의 내강 내에 로딩하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, EV는 약 0.05% 내지 0.3% 사포닌으로 처리된다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 세포외 소포체(EV)의 내강 내에 로딩하는 방법은 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 로딩할 때 항체의 적어도 10%가 EV 내에 로딩되기에 충분한 시간 동안 EV를 인큐베이션하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 대상체의 중추 신경계(CNS)에 전달하는 방법에 본원에서 제공되고, 상기 방법은 세포외 소포체(EV)의 내강에 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 EV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 EV는 신경 세포로부터 유래된다.

일부 실시양태에서, 신경 세포는 신경 전구 세포이다. 일부의 상기 실시양태에서, 신경 전구 세포는 인간 만능 세포로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 인간 만능 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 인간 만능 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 IgG이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 Fab, F(ab')₂, scFv, 탠덤 scFv, 디아바디, 미니바디, 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 단편이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 완전한 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.

일부 실시양태에서, 항체는 대상체의 뇌로 전달된다.

일부 실시양태에서, 항체는 대상체의 척수로 전달된다.

일부 실시양태에서, EV는 외인성 핵산 및/또는 외인성 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, EV는 외인성 siRNA 및/또는 안티센스 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, EV는 소분자를 추가로 포함한다.

도 1은 구리 부재 클릭(copperless click) 화학 반응을 사용하여 항체(Ab)를 세포외 소포체(EV)에 접합시키는 예시적인 방법을 도시한 개략도이다. 아지도 기는 비반응성 항체에 부가되었다. 별도로, 세포외 소포체(EV)는 아민 기를 공격하는 SDP 커플링을 통한 DIBO 기로 변형되었다. 구리 부재 클릭 화학 반응은 혼합될 때 EV에 항체를 접합하였다.
도 2a 및 도 2b는 접합되지 않은 항체(도 2a) 또는 신경 전구 세포로부터 유래된 세포외 소포체에 접합된 항체(도 2b)를 투여한 마우스로부터 얻은 마우스 뇌 절편의 이미지를 제공한다. 핵(파란색) 및 항체(흰색) 신호가 표시된다.
도 3a 및 도 3b는 다양한 로딩 조건을 사용하여 신경 전구 세포(AB126)로부터 유래된 세포외 소포체의 내강 내로의 항체(도 3a) 또는 루시페라제 단백질(도 3b)의 로딩 효율을 예시한 것이다.

발명의 상세한 설명

A. 정의

본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 또한, 매개변수의 값 또는 값의 범위가 언급될 때마다, 언급된 값의 중간 값 및 범위도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다는 점에 유의해야 한다.

"약" 또는 "대략"이라는 용어는 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 5% 이내, 보다 바람직하게는 1% 이내를 의미한다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 나노바디, 모노바디, 항체 모방체, 및 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 항체 단편을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 표적 항원에 결합하는 다양한 구조를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 디술파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 그의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄(HC)는 중쇄 가변 영역(또는 도메인)(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(또는 도메인)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄(LC)는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 명명된 보다 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접 항원 결합 부위를 지칭한다. 이러한 특정 영역은 문헌 [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)] 및 [Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)], 및 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 및 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 기재되어 있고, 여기서 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 하위세트를 포함한다.

용어 "Fc 도메인"은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. Fc 도메인은 천연 서열 Fc 도메인 또는 변이체 Fc 도메인일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 도메인은 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 선택적으로 CH4 도메인을 포함할 수 있다. 항체 이펙터 기능을 변경하기 위한 Fc 부분의 아미노산 잔기의 대체는 관련 기술 분야에 공지되어 있다(윈터(Winter) 등의 미국 특허 제5,648,260호; 제5,624,821호). 항체의 Fc 도메인은 몇 가지 중요한 이펙터 기능, 예를 들어 사이토카인 유도, ADCC, 식균 작용, 보체 의존성 세포독성(CDC), 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/제거율을 매개한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 Fc 도메인 함유 단백질의 Fc 도메인에서 변경(예를 들어, 결실, 삽입 또는 대체)되어, 결합 단백질의 이펙터 기능이 변경된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "무손상" 또는 "전장" 항체는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(F)를 포함하는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 무손상 항체는 무손상 IgG 항체이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 예를 들어 천연 생성 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하며 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는, 서열이 동일하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, "모노클로날"이라는 수식어는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것을 의도하지 않는다.

"인간화 항체"라는 용어는 하나의 비인간 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 인간 프레임워크 서열 및/또는 비인간 CDR 서열 내에서 추가의 프레임워크 영역 변형이 이루어질 수 있다. 항체, 예를 들어, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.

"키메라 항체"라는 용어는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하도록 의도된다.

항체의 "항체 단편", "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"은 무손상 항체의 일부를 포함하고 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 무손상 항체 이외의 다른 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자(예를 들어, scFv) 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

"다중특이적 항원 결합 폴리펩타이드" 또는 "다중특이적 항체"는 하나 초과의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다. "이중특이적", "이중 특이적" 또는 "이중기능적" 항원 결합 폴리펩타이드 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 하이브리드 분자이다. 이중특이적 항원 결합 폴리펩타이드 및 항체는 다중특이적 항원 결합 폴리펩타이드 또는 다중특이적 항체의 예이며, 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편 또는 반쪽 항체의 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553], [Brinkmann and Kontermann. 2017. MABS. 9(2):182-212]을 참조한다. 예를 들어, 이중특이적 항원 결합 폴리펩타이드 또는 항체의 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.

용어 "항체 모방체" 또는 "항체 모사체"는 항체와 구조적으로 관련되지 않지만, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 항체 모방체의 예는 애드넥틴(즉, 피브로넥틴 기반 결합 분자), 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 피노머, 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩타이드, 모노바디, nanoCLAMP, 나노바디, 유니바디, 베르사바디, 앱타머, 및 그 전부가 전통적인 항체 결합을 모방하지만 독특한 메커니즘을 통해 생성되고 기능하는 결합 구조를 사용하는 펩타이드 분자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. "자가 EV"라는 용어는 EV가 투여될 대상체 또는 환자의 세포에서 얻은 EV 집단을 설명하기 위해 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중추 신경계" 또는 "CNS"는 경막 물질 내의 모든 구조를 지칭한다. 이러한 구조에는 뇌 및 척수의 세포 및 조직이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. CNS는 또한 뇌의 뇌실 및 척수의 중심관(central canal)을 채우는 뇌척수액을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 장애 또는 그의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속 기간의 감소 또는 개선, 장애의 진행 방지, 장애의 퇴행 유발, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 발병 또는 진행의 방지, 또는 또 다른 요법의 예방 또는 치료 효과(들)의 향상 또는 개선을 위해 충분한 작용제, 예를 들어 EV, 예를 들어 엑소솜을 포함하는 조성물의 양을 지칭한다.

용어 "배아 줄기 세포"는 배반포 단계 배아로부터 단리된, 바람직하게는 인간을 포함하는 영장류의 만능 세포를 지칭한다.

용어 "세포외 소포체" 및 "EV"는 지질 이중층, 예를 들어 원형질막의 일부에 의해 둘러싸인, 크기가 약 10 nm 내지 10 μm인 소포체를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. EV는 세포의 유체, 거대 분자, 용질 및 대사산물을 포함할 수 있다. "EV"라는 용어에는 신경 EV와 같은 세포 유래 EV에서 발견되는 생리 활성 분자를 포함하도록 조작된 지질 소포체도 포함된다. 이러한 용어는 엑소솜과 엑토솜을 모두 포함한다. EV는 예를 들어 원심분리, 여과 및 초원심분리 방법과 같은 단리 기술의 조합을 사용하여 적절한 생물학적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 엑소솜은 다소포체(MVB)의 엑소사이토시스(exocytosis)를 통해 방출된다. 엑토솜은 원형질막에서 조립되고 방출되는 소포체이다. 경우에 따라, EV의 크기는 약 20 nm 내지 10 μm, 20 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 20 nm 내지 200 nm, 30 nm 내지 100 nm, 30 nm 내지 160 nm 또는 80 nm 내지 160 nm이다. 일부 실시양태에서, EV는 크기가 약 20 내지 150 nm인 엑소솜이다. EV는 전혈, 혈청, 혈장, 모유, 뇌척수액, 양수, 복수액 또는 골수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물의 임의의 적합한 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 배양된 포유동물 세포(예를 들어, 미성숙 수지상 세포(야생형 또는 불멸화), 유도 및 비유도 만능 줄기 세포, 섬유모세포, 혈소판, 면역 세포, 망상적혈구, 종양 세포, 중간엽 줄기 세포, 위성 세포, 조혈 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 백색 및 베이지색 전지방세포 등)로부터 단리될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, EV는 신경 세포(예를 들어, 신경 전구 세포, 신경 줄기 세포, 신경교 세포, 성상세포, 뉴런 등)로부터 단리될 수 있다.

"인간 배아 줄기 세포"(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)가 그의 하위세트인 "인간 만능 줄기 세포"라는 용어는 전배아, 배아, 태아 조직 또는 성체 줄기 세포(인간 유도 만능 줄기 세포의 경우)로부터 수정 후 임의의 시기에 유도되고, 특히 신경 줄기 및 전구 세포, 신경 능선 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 관련 증식성 및 비증식성 신경 세포를 포함하는 여러 상이한 세포 유형의 자손체를 적절한 조건 하에 생산할 수 있다는 특징을 갖는다. 이 용어는 다양한 종류의 줄기 세포의 확립된 계통과, 설명된 방식으로 만능인 1차 조직으로부터 얻은 세포를 모두 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 폐기하지 않고 비교적 무독성인 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 물질을 지칭하고, 즉, 상기 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나 그것이 함유된 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있다. 일부 예에서 "약제학적으로 허용되는" 담체 또는 부형제는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 EV에 항체를 공유적으로 부착하여 항체-EV 접합체를 형성하는 공유 결합 또는 원자 사슬을 포함하는 2가의 화학적 모이어티를 의미한다. 펩타이드 또는 거대분자의 접합에 대한 임의의 공지된 방법이 본 개시내용의 측면에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 항체와 EV의 공유 부착은 링커가 2개의 반응성 작용기를 가질 것을, 즉 반응성 측면에서 2가성일 것을 필요로 한다. 2개 이상의 기능적 또는 생물학적으로 활성인 모이어티를 부착하기에 유용한 2가 링커 시약이 알려져 있고, 이러한 접합을 위한 방법은 예를 들어 문헌 [Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242]에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 공유 접합에 적합한 링커에 관한 것이기 때문에 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 및 방법은 "클릭 링커"를 사용하며, 이는 두 개의 보완적인 클릭 작용기 사이의 반응을 통해 생성된다.

"링커"라는 용어가 접합된 형태의 링커를 설명할 때 사용되는 경우, 반응성 말단 중의 하나 또는 둘 모두가 부재(화학적 모이어티로 전환됨)하거나 또는 불완전(예를 들어, 단지 카르복실산의 카르보닐인 경우)이 될 것이고, 이것은 링커와 세포외 세포막 결합 모이어티 사이의, 및/또는 링커와 부위 지정 변형 폴리펩타이드 사이에 결합이 형성되기 때문이다. 따라서, 본원에 유용한 링커는 비제한적으로, 링커 상의 반응성 작용기와 항체 상의 친핵성 기 또는 다른 반응성 치환체 사이의 커플링 반응에 의해 형성된 화학적 모이어티, 및 링커 상의 반응성 작용기와 EV 상의 친핵성 기 사이의 커플링 반응에 의해 형성된 화학적 모이어티를 포함하는 링커를 포함한다.

이러한 커플링 반응에 의해 형성된 화학적 모이어티의 예는 친핵체/친전자체 쌍(예를 들어, 티올/할로알킬 쌍, 아민/카르보닐 쌍, 또는 티올/α,β-불포화 카르보닐 쌍 등), 디엔/친디엔체 쌍(예를 들어, 아지드/알킨 쌍, 또는 디엔/α,β-불포화 카르보닐 쌍 등) 등을 포함하는 화학적으로 반응성인 작용기 간의 반응으로 인해 발생한다. 화학적 모이어티를 형성하기 위한 반응성 작용기 사이의 커플링 반응에는 비제한적으로, 티올 알킬화, 하이드록실 알킬화, 아민 알킬화, 아민 또는 하이드록실아민 축합, 히드라진 형성, 아미드화, 에스테르화, 디술파이드 형성, 고리 첨가(예를 들어, [4+2] 딜스-알더(Diels-Alder) 고리 첨가, [3+2] 후이스겐(Huisgen) 고리 첨가 등), 친핵성 방향족 치환, 친전자성 방향족 치환, 및 관련 기술 분야에 공지되거나 본원에서 설명되는 기타 반응성 양식을 포함한다. 적합한 링커는 항체, EV, 또는 둘 모두 상의 친핵성 작용기와 반응하기 위한 친전자성 작용기를 함유할 수 있다.

"신경 세포"라는 용어는 뉴런으로 이루어진 끈 모양의 섬유 다발인 신경 또는 신경들에 속하는 세포이다. 신경 세포는 일반적으로 신경 전구 세포(NPC)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 신경 세포는 신경 전구 세포 또는 만능 줄기 세포로부터 시험관 내에서 유래될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에서 언급되는 신경 세포는 인간 신경 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경 세포는 뉴런, 신경교 세포, 성상세포, 희소돌기아교세포, 또는 미세아교세포, 슈반(Schwann) 세포, 또는 신경교종 세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, 신경 세포는 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포일 수 있다. 용어 "신경 전구 세포" 및 "신경 줄기 세포"는 뉴런 세포 및 신경교 세포 유형의 제한된 레퍼토리로 분화할 수 있는 능력을 갖는 다능성 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 신경 전구 세포는 만능 줄기 세포, 예를 들어 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ES 세포)로부터 시험관 내에서 유도될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에서 언급되는 신경 전구 세포는 인간 신경 전구 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경 전구 세포는 형질전환되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 신경 전구 세포는 증식한다. 일부 실시양태에서, 신경 전구 세포는 분화 없이 표현형을 유지한다.

용어 "신경 EV"는 신경 세포, 예를 들어 신경 전구 세포로부터 유래된 세포 유래 EV를 지칭하기 위해 사용된다. 이 용어는 또한 실질적으로 동일한 생리 활성을 갖도록 세포 유래 신경 EV에서 발견되는 충분한 수의 생리 활성 분자를 함유하도록 조작된 소포체를 지칭한다.

본 명세서에서 설명되는 "신경혈관 복구"는 뇌의 신경혈관 손상 후에 일어나는 회복을 의미한다. 신경 혈관 손상은 척추동맥, 뇌기저동맥 및 경동맥을 비롯하여 뇌, 뇌간 및 상부 척수를 공급하는 주요 혈관의 손상을 지칭한다. 이들 혈관은 두개외 및 두개내 둘 모두에 위치하며, 손상은 이러한 위치 중 하나 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 한 예에서, 신경혈관 복구는 신경발생 및 혈관신생의 증가 및/또는 출혈을 막고 치유를 위한 환경을 조성하기 위한 신경교 세포의 동원이 있을 때 발생한다. 성상세포, 혈관주위세포, 기질 프로테아제 및 혈관 평활근 세포가 또한 신경혈관 복구에서 중요한 역할을 수행한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상체로부터 채취한 표본(예를 들어, 세포(예를 들어, 신경 세포), 조직, 혈액, 혈액 성분(예를 들어, 혈청 또는 혈장), 소변, 타액, 양수, 뇌척수액, 췌장액, 융모막 융모 샘플 및 골수)을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적인 임의의 유기체를 지칭한다. "대상체"는 유기체, 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간, 비인간 포유동물, 비인간 영장류, 영장류, 실험 동물, 마우스, 래트, 햄스터, 고양이, 또는 개)일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어 내과 의사의 치료를 받는 인간 대상체를 지칭한다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다.

용어 "치료하다" 및 "치료"는 질병, 병리학적 상태 또는 장애를 개선, 호전, 안정화(즉, 악화시키지 않음), 예방 또는 치료할 의도로 대상체를 의학적으로 관리하는 것을 지칭한다. 이 용어에는 능동 치료(질병, 병리학적 상태 또는 장애를 개선하기 위한 치료), 원인 치료(관련 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 원인에 따라 대응한 치료), 완화 치료(증상의 완화를 위해 설계된 치료), 예방 치료(관련 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하기 위한 치료); 및 지지 치료(또 다른 요법을 보완하기 위해 사용되는 치료)가 포함된다. 또한, 치료에는 질병 또는 병태의 정도 감소; 질병 또는 병태의 확산 방지; 질병 또는 병태의 진행을 지연시키거나 늦추는 것; 질병 또는 병태의 개선 또는 완화; 및 관해(부분적이든 전체적이든)가 검출 가능 여부와 상관없이 포함된다. 질병 또는 병태의 "호전" 또는 "완화"는 질병, 장애 또는 병태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 치료를 실시하지 않은 경우의 정도 또는 시간 경과와 비교하여 감소되고/되거나, 진행의 시간 경과가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다. 치료는 증상 또는 질병의 완전한 호전을 필요로 하지 않으며, 증상 및/또는 근본적인 위험 인자를 감소시키는 실시양태를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 병태 또는 장애가 있는 대상체뿐만 아니라, 병태 또는 장애를 가지기 쉬운 대상체 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함한다. "방지하다"라는 용어는 사건이 발생할 가능성을 100% 제거할 것을 요구하지는 않는다. 오히려, 이것은 사건의 발생 가능성이 화합물 또는 방법의 존재 하에 감소됨을 나타낸다.

본 발명에 따르면, 통상의 세포 배양 방법, 화학적 합성 방법 및 관련 기술 분야의 기술 내의 다른 생물학적 및 약제학적 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 잘 알려져 있으며, 문헌에 상세하게 설명되어 있다. DNA 리가아제, DNA 폴리머라아제, 제한 엔도뉴클레아제 등을 포함하는 효소 반응을 위한 세포 성장, 세포 분리, 및 관련되는 경우 클로닝, DNA 단리, 증폭 및 정제를 위한 표준 기술, 및 다양한 분리 기술은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있고 이들에 의해 일반적으로 사용되는 기술이다. 많은 표준 기술이 다음과 같은 문헌에 기재되어 있다: [Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York]; [Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York]; [Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I]; [Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68]; [Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101]; [Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65]; [Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]; [Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley]; [Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology]; [Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK]; [Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK]; 및 [Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York]. 사용되는 경우, 약어 및 명명법은 관련 기술 분야의 표준으로 간주되며, 본원에서 언급되는 바와 같은 전문 저널에서 통상적으로 사용된다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 하한 단위의 1/10까지의 각각의 개재하는 값(예를 들어, 해당 범위 내에 속하는 각각의 탄소 원자 번호가 제공되는 많은 탄소 원자를 함유하는 기의 경우에서와 같이), 범위의 상한과 하한 사이 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재하는 값은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며, 이것은 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 제한 중의 어느 하나를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 설명되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형 "a", "and" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다는 점에 유의하여야 한다.

R. 세포외 소포체(EV) 및 치료용 단백질의 전달

본 발명은 신경 세포외 소포체(EV), 예를 들어 신경 세포로부터 유래된 엑소솜 및/또는 미세소포체의 표면에 접합된 폴리펩타이드를 투여함으로써, 예를 들어 대상체의 혈액 뇌 장벽을 가로질러 대상체의 중추 신경계에 항체와 같은 치료용 폴리펩타이드를 전달하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 치매, 신경계 암, 예를 들어 교모세포종, 또는 중추 신경계로 전이된 암을 포함하지만 이로 제한되지 않는 신경계 장애 및 손상의 치료와 관련된 다양한 적용시에 폴리펩타이드-EV 접합체, 예를 들어 항체(Ab)-EV 접합체를 사용하는 방법이 제공된다. 추가적으로, 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 커플링된 신경 EV를 포함하는 접합체, 및 그의 사용 방법이 본원에서 제공된다.

본 발명은 또한 신경 세포외 소포체(EV), 예를 들어 신경 세포로부터 유래된 엑소솜 및/또는 미세소포체의 내강 내에 로딩된 폴리펩타이드를 투여함으로써, 예를 들어 대상체의 혈액 뇌 장벽을 가로질러 대상체의 중추 신경계에 항체와 같은 치료용 폴리펩타이드를 전달하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 치매, 신경계 암, 예를 들어 교모세포종, 또는 중추 신경계로 전이된 암을 포함하지만 이로 제한되지 않는 신경계 장애 및 손상의 치료와 관련된 다양한 적용시에 내강 로딩된 EV를 사용하는 방법이 제공된다.

세포외 소포체는 지질 이중층, 예를 들어 세포 원형질막의 일부로 둘러싸인 작은 구조의 이질적인 그룹으로 이루어진다. EV의 크기는 직경이 약 10 nm에서 10 μm 사이일 수 있으며, 가장 일반적으로 약 25-500 nm 범위에 속한다. EV는 크게 두 개의 클래스, 즉 엑소솜 및 엑토솜으로 나눌 수 있다. 엑소솜은 다소포체(MVB)의 성숙 동안 엔도솜 막의 내부 출아(inward budding)를 통해 세포에 의해 형성될 수 있다. 그런 다음, 엑소솜은 MVB와 세포 표면의 융합에 의해 세포외 공간으로 방출될 수 있다. 엑소솜의 직경은 전형적으로 25-500 nm이고, 일부 실시양태에서 약 25-250 nm, 약 50-150 nm, 또는 약 50-200 nm의 범위 내에 있을 수 있다. 미세소포체라고도 알려져 있는 엑토솜은 원형질막의 출아를 통해 세포에 의해 형성될 수 있다. 엑토솜의 크기는 약 10 nm 내지 10 ㎛로 다양할 수 있고, 일부 실시양태에서 약 10-1000 nm, 또는 약 50-500 nm 범위 내일 수 있다.

본 발명의 접합체 및 방법에 사용하기에 적합한 EV는 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, EV는 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포와 같은 신경 세포, 또는 뉴런, 신경교 세포 또는 성상세포와 같은 분화된 신경 세포에서 유래될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 방법에 사용하기에 적합한 EV는 또한 합성에 의해 생산될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체 접합체에 사용되는 EV는 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포로부터 유래된다.

EV는 세포막과의 융합에 의해 또는 칼베올린 독립적 및 의존적 메커니즘, 클라트린 독립적 및 의존적 메커니즘, 거대 음세포 작용(macropinocytosis) 및/또는 식균 작용을 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포 흡수를 통해 물질이 EV로 전달될 수 있도록 허용하는 세포간 소통에 관여한다. EV는 면역 조절, 혈관신생, 종양 성장과 관련된 내피 세포의 이동 또는 허혈 재관류 손상의 손상 감소를 비롯한 수많은 생리학적 과정에 관여하는 것으로 보고되었다. 이러한 기능의 대부분은 소포체 내에 또는 소포체 상에 포함된 단백질, 핵산 또는 지질에 의해 매개된다.

EV는 내강에 화물을 실을 수 있으며, 지질 이중층에 포매되거나 부착된다. 이 화물에는 단백질, 지질 및/또는 핵산, 예를 들어, mRNA 또는 miRNA가 포함될 수 있다. EV가 세포에 의해 생산되는 경우, 화물의 조성은 세포 유형에 따라 크게 좌우된다. 예를 들어, 성상세포, 신경 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 EV는 각각 단백질 화물의 별개의 보체를 함유하는 것으로 나타났다(그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 US2018/0327714A1 참고). 이러한 상이한 세포 유형으로부터 유래된 EV는 mRNA 및/또는 miRNA를 비롯한 핵산 분자의 뚜렷한 프로파일도 포함한다. EV가 세포로부터 수득되는 실시양태에서, EV는 EV가 유래되는 세포에 의해 생산된 EV의 내용물을 반영하는 내인성 화물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포로부터 수득된 EV는 또한 외인성 화물을 함유할 수 있다. 외인성 화물에는 세포외 공간으로 방출된 후 소포체를 조작하여 EV에 도입되는 단백질, 핵산, 소분자 또는 지질이 포함된다. 다른 실시양태에서, 세포로부터 수득된 EV는 EV가 유래된 세포에 존재하는 재조합 핵산의 결과로서 EV에 패키징되는 외인성 화물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질을 포함하는 EV는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 세포로부터 유래될 수 있다. EV가 합성에 의해 생산되는 실시양태에서는, 소포체에 포함시키기 위해 적합한 화물을 선택할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 합성 EV는 신경 세포, 예를 들어, 신경 전구 세포, 뉴런, 신경교 세포 또는 성상세포로부터 유래된 EV에 존재하는 하나 이상의 단백질, 지질 또는 핵산을 함유할 수 있다.

세포로부터 유래된 EV, 예를 들어 엑소솜은 그의 세포 기원을 반영하는 다양한 생물학적 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신경 세포, 예를 들어, 신경 전구 세포로부터 유래된 EV의 집단을 제공한다. 이러한 신경 EV는 신경 세포로부터 유래된 사이토카인 및 성장 인자, 코딩 및 비코딩 RNA 분자를 비롯한 다양한 단백질을 포함한다. 신경 EV에 포함된 화물은 신경 보호 제공, 염증 감소, T 세포, 대식세포 및 미세아교세포에 대한 작용을 통한 면역 조절, 산화 스트레스 감소, 혈관 무결성 개선, 대사 활성에 대한 영향, 및 신경 발생, 세포 이동, 재수초화 및 분화의 증가를 통해 신경 재생 효과의 유도에 의해 신경 및 혈관 기능에 영향을 미칠 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 신경 세포(예를 들어, 신경 전구 세포, 신경 줄기 세포)로부터 유래된 EV의 표면 상에 발현된 천연 단백질의 조합은 소포체가 CNS에 국한되고 다른 공급원으로부터 유래된 EV보다 더 큰 정도로 혈액 뇌 장벽을 횡단할 수 있도록 하는 것으로 생각된다. CNS를 표적으로 하고/하거나 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 능력은 본원에서 표시된 것처럼 EV를 항체로 표면 표지함으로써 방해받지 않는다. 더욱이, 신경 세포(예를 들어, 신경 전구 세포, 신경 줄기 세포)로부터 유래된 EV를 포함하는 EV-항체 접합체는 기능적으로 온전한 항체 및 그의 항원 결합 단편을 뇌 및 중추 신경계의 표적에 전달하기 위해 혈액 뇌 장벽을 가로질러 수송할 수 있다.

일부 실시양태에서, 신경 세포 유래 EV, 예를 들어 엑소솜은 CD63, CD81 및 CD133을 포함하지만 이에 제한되지 않는 막 단백질을 함유할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 접합체 및 방법에 사용하기에 적합한 EV, 예를 들어 엑소솜은 다음과 같은 세포 표면 단백질 중 하나 이상(즉, 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 전부)을 포함한다: CD63, CD81 및 CD133. 또한, EV, 예를 들어 엑소솜은 다음과 같은 miRNA 중 하나 이상(즉, 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 또는 12개 전부)을 포함할 수 있다: hsa-miR-135a-2, hsa-miR-124-1, hsa-miR-124-2, hsa-miR-124-3, hsa-miR-489, hsa-miR-9-3, hsa-miR-9-2, hsa-miR-9-1, hsa-miR-219b, hsa-miR-219a-2, hsa-miR-363 및/또는 hsa-miR-20b. 한 실시양태에서, 단립된 EV 집단은 상기 miRNA 중 하나 이상이 농축된다. 농축은 비-신경 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 비변형 엑소솜과 비교할 때와 같이 상대적인 양으로 또는 절대적인 양으로 측정될 수 있다.

(i) EV 생산

본 명세서에서 개시되는 접합체 및 방법에 사용하기에 적합한 EV는 다양한 세포 유형에 의해 생성될 수 있거나, 합성에 의해 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, EV는 신경 전구 세포, 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 슈반 세포 또는 신경교종 세포와 같은 신경 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 형질전환된 세포주에 의해 생산될 수 있다. 다른 실시양태에서, EV는 형질전환되지 않은 세포에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 외인성 폴리펩타이드 및/또는 핵산을 발현하는 조작된 세포주, 예를 들어 재조합 세포주에 의해 생산될 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드-EV 접합체는 다른 공급원으로부터의 EV, 예를 들어 혈소판, 망상적혈구, 면역 세포, 장 상피 세포, 종양 세포, HELA 세포, 중간엽 줄기 세포, 인간 배아 신장 세포(HEK 세포) 및 모든 유형의 1차 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포 유형으로부터 유래된 EV를 사용하여 생산될 수 있다. 다른 실시양태에서, EV는 체액, 예를 들어 유즙, 초유 등으로부터 단리될 수 있다.

한 실시양태에서, EV는 엑소솜을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 엑소솜은 임의의 전술한 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시되는 접합체 및 방법에 사용하기에 적합한 엑소솜은 신경 엑소솜일 수 있다. 신경 엑소솜은 신경 전구 세포, 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 슈반 세포 또는 신경교종 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경 세포로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 엑소솜은 합성에 의해 생성된다.

또 다른 실시양태에서, EV는 미세소포체로도 알려진 엑토솜을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 미세소포체는 임의의 전술한 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시되는 접합체 및 방법에 사용하기에 적합한 미세소포체는 신경 미세소포체일 수 있다. 신경 미세소포체는 신경 전구 세포, 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 슈반 세포 또는 신경교종 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경 세포로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 미세소포체는 합성에 의해 생성된다.

일부 경우에, 개시된 EV는 세포가 EV를 생성하기에 충분한 시간 동안 신경 세포와 같은 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. EV를 생산하기 위해 사용되는 세포는 일부 실시양태에서 만능 줄기 세포, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 수득될 수 있다.

일부 실시양태에서, EV는 만능 줄기 세포로부터 분화된 신경 세포, 예를 들어 신경 전구 세포로부터 단리된다. 만능 줄기 세포는 단계 특이적 배아 항원(SSEA) 3 및 4 중 하나 이상, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 명명된 항체를 사용하여 검출 가능한 마커를 발현할 수 있다(Thomson et al., Science 282:1145, 1998). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가를 초래한다. 미분화 만능 줄기 세포는 일반적으로 알칼리성 포스파타제 활성을 가지며, 이는 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음, 제조업체(Vector Laboratories, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)가 지시한 바와 같이 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 사용하여 발색시킴으로써 검출할 수 있다. 또한, 미분화 만능 줄기 세포는 일반적으로 항체 또는 RT-PCR에 의해 검출되는 Oct-4 및 TERT를 발현한다. 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 접합체에 사용하기 위한 EV는 인간 ES 세포로부터 유래된 신경 전구 세포에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 설명되는 접합체에 사용하기 위한 EV는 인간 iPS 세포로부터 유래된 신경 전구 세포에 의해 생성될 수 있다.

사용할 수 있는 만능 줄기 세포의 유형에는 전배아 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 중 임의의 시기에, 일반적으로(반드시 그렇지는 않음) 임신 약 10-12주 이전에 채취한 태아 조직을 비롯하여 수정 후에 형성된 조직으로부터 유래한 확립된 만능 세포 계통이 포함된다. 비제한적인 예는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 생식 세포의 확립된 윤리적 계통, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포주 WA01, WA07 및 WA09(WiCell)이다. 또한, 이러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안 본 개시내용의 조성물의 사용이 고려되며, 이 경우에 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 채취한 1차 만능 세포일 것이다. 또한, 영양 세포의 부재 하에 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 채취한 세포도 적합하다. 또한, 예를 들어 BG01v(ViaCyte, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 같은 돌연변이체 인간 배아 줄기 세포주뿐만 아니라, WA01, WA07, WA09(WiCell, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 및 BG01, BG02(ViaCyte, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 같은 정상적인 인간 배아 줄기 세포도 적합하다.

인간 배아 줄기 세포(hESC)는 예를 들어 톰슨(Thomson) 등(미국 특허 제5,843,780호; [Science 282:1145, 1998]; [Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995])에 의해 설명된 바와 같이 관련 기술 분야에 설명되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 또는, 인간 배아 줄기 세포는 상업적으로 입수할 수 있다.

iPSC는 성체 체세포를 다시 만능 상태로 탈분화시킴으로써 제조된다. iPSC는 4개의 유전자(c-myc, Klf4, SOX2, OCT4) 또는 이와 유사한 유전자의 인공적인 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다.

인간 배아 줄기 세포(ESC)로부터 인간 신경 전구 세포(hNP)를 생산하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제7,531,354에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 인간 신경 전구 세포(hNP)는 네스틴(Nestin), 무사시(Musashi)-1, SOX1, SOX2 및 SOX3을 포함하는, 초기 다능성 신경 줄기 세포와 관련된 마커를 발현하는 것으로 알려져 있다. 한 예에서, hNP는 SOX1(SOX1+)을 발현한다. 또 다른 예에서, hNP는 SOX2(SOX2+)를 발현한다. 일부 다른 예에서, hNP는 SOX3(SOX3+)를 발현한다. 일부 특정 예에서, hNP는 네스틴, 무사시-1, SOX1, SOX2 및 SOX3 중 적어도 하나를 발현한다. 다른 경우에, hNP는 네스틴, 무사시-1, SOX1, SOX2 및 SOX3 중 2개 이상을 발현한다. 또 다른 예에서, hNP는 네스틴, 무사시-1, SOX1, SOX2 및 SOX3 중 3개 이상을 발현한다. 일부 경우에, hNP는 네스틴, 무사시-1, SOX1, SOX2 및 SOX3 중 적어도 하나를 발현하지만, OCT4는 발현하지 않는다. 일부 다른 예에서, hNP는 네스틴, 무사시-1, SOX1, SOX2 및 SOX3 중 적어도 2개를 발현하지만, OCT4는 발현하지 않는다. 또 다른 예에서, hNP는 네스틴, 무사시-1, SOX1, SOX2 및 SOX3 중 적어도 3개를 발현하지만, OCT4는 발현하지 않는다. 특정 예에서, hNP는 SOX1, SOX2 및 SOX3을 발현하지만, OCT4는 발현하지 않는다. 신경 전구 세포는 영양 세포가 있거나 없이 배양될 수 있다. 일부 경우에, 미국 특허 제7,531,354호에 제시되어 있는 방법에 따라 생산된 신경 전구 세포에는 영양 세포가 존재하지 않고, 배아체(embryoid body)도 존재하지 않는다.

개시된 EV는 일부 경우에 EV를 생성하기에 충분한 조건 하에 및 충분한 시간 동안 세포 배양 배지에서 만능 줄기 세포로부터 직접 또는 간접적으로 유도된 신경교 세포와 같은 분화된 신경 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 상기 EV를 단리함으로써 수득될 수 있다. 신경교 세포의 유형에는 희소돌기아교세포, 성상세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, 미세아교세포 및 위성 세포가 포함된다. 한 예에서, 분화된 신경 세포(예를 들어, 신경교 세포)는 성상세포를 포함한다. 사용될 수 있는 분화된 신경 세포는 hN2™ 신경 세포(ArunA Biomedical Inc.), NeuroNet™ 뉴런 및 AstroPro™ 성상세포(ArunA Biomedical Inc.)를 포함한다.

EV는 세포 배양 배지 또는 조직 배양 상청액으로부터 단리할 수 있다. 세포로부터 생산된 EV는 임의의 적절한 방법으로 배양 배지로부터 수집할 수 있다. 일반적으로, EV의 단립된 집단은 원심분리, 크기 배제 컬럼, 미세유동 장치, 중합체 침전, 여과 또는 이러한 방법의 조합에 의해 세포 배양 또는 조직 상청액으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, EV는 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 20140356382에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, EV는 분별 원심분리, 즉 더 큰 입자를 펠렛화하기 위한 저속(<2,0000 g) 원심분리 후, EV를 펠렛화하기 위한 고속(>100,000 g) 원심분리, 적절한 필터(예를 들어, 0.22 μm 필터)를 사용한 크기 여과, 구배 초원심분리(예를 들어, 수크로스 구배 사용) 또는 이러한 방법의 조합에 의해 제조될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 EV 생산 NP 세포 및/또는 신경 세포는 세포 및 EV를 생산하는 그의 능력에 따라 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월만큼 긴 기간 동안 배양된다. EV 생산 세포는 적절한 배지에서 배양될 수 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정되는 조건 하에 성장할 수 있다. 세포 배양 조건은 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 아래에 제시된 예는 적합한 배지 및 조건을 보여준다. 예를 들어, 엑소솜 고갈된 소 태아 혈청(예를 들어, 10%에서)을 포함하고 선택적으로 글루타민 또는 글루타민 함유 혼합물 및 항생제가 보충된 CMRL 1066 배지(인비트로겐(Invitrogen))를 사용할 수 있다. 세포는 일부 실시양태에서 표면에 부착하여 성장할 수 있고, 예를 들어 세포는 표면 상에서 단층 내지 단층으로서 성장할 수 있고(영양 세포가 없음), 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 합류될 때까지 성장할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 세포 응집체로서 또는 현탁 배양물에서 마이크로비드 상에서 성장될 수 있다.

세포 성장 배지는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 성장 인자, 아스코르브산, 글루코스, 비필수 아미노산, 염(미량 원소 포함), 글루타민, 인슐린(표시되고 배제되지 않은 경우), 액티빈 A, 트랜스페린, 베타 메르캅토에탄올, 및 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고 본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 기타 성분을 포함한다. 바람직한 배지는 신경 세포를 지지하는 저단백질, 무혈청 기반 성장 배지이다. 사용된 성장 인자는 단독으로 또는 바람직하게는 백혈병 억제 인자(LIF)와 조합된 섬유모세포 성장 인자 2(FGF2)일 수 있다. 성장 배지에서 성장할 NP 또는 신경 세포에 따라, LIF를 포함하는 것이 바람직하지만, 필요하지 않을 수 있다. 추가의 배지는 혈청, 예를 들어 약 0.1% 내지 20%(바람직하게는, 약 2-10%)의 소 태아 혈청을 함유하거나 정의된 배지의 경우 소 태아 혈청 및 KSR을 함유하지 않을 수 있고 선택적으로 소 혈청 알부민(약 1-5%, 바람직하게는 약 2%)을 포함하는 기초 세포 배지를 포함한다. 일부 경우에, 배지가 정의되고, 무혈청이며, 단백질 함량이 낮다. 다른 경우에, 배지는 ArunA의 배지 및 보충제로서, 신경 배양이 영양 세포에 대한 필요 없이 여러 계대에 걸쳐 안정적인 핵형을 유지할 수 있도록 하고, 따라서 초기 단계의 약물 발견을 비롯한 매우 다양한 연구 응용 분야에 대한 탁월한 선택이 된다. 성장 배지의 성분은 성장될 신경 세포의 유형에 의존하며, 이들 모두는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 한 예에서, AB2™ 신경 세포 배양 배지 키트가 사용되며, 여기에는 AB2™ 기저 신경 배지 및 ANS™ 신경 배지 보충제가 포함되어 있다. 특정 예에서, 위의 예에서 설명한 배지 및 보충제는 모든 신경 세포 배양 요구 사항을 충족할 수 있도록 다용도로 특별히 제작되었다. AB2™ 기저 신경 배지 및 ANS™ 신경 배지 보충제는 다양한 신경 표현형에 대한 hNP1™ 라인의 분화를 지시하는 특수 배지의 기반으로 사용할 수 있다. 배지 및 보충제의 각각의 로트는 세포 성장, 무균, pH, 삼투압 농도 및 내독소에 대한 시험에 의해 사용에 대해 사전 인증을 받았다.

배지에 선택적으로 첨가될 수 있는 다른 성분은 배지에서 성장한 세포 유형에 따라, 예를 들어 다수의 다른 성분 중에서 니코틴아미드, TGF-β 1, 2 및 3을 포함하는 TGF-β 패밀리의 구성원, 액티빈 A, 결절, 뼈 형태원 단백질(BMP 2 내지 7), 혈청 알부민, 섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리의 구성원, 혈소판 유래 성장 인자-AA 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II, LR-IGF), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩타이드-I 및 II(GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디(mimetobody), 엑센딘-4, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 표피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어 트리에틸렌 펜타민, 포스콜린, Na-부티레이트, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 결절, 발프로산, 트리코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간 세포 성장 인자(HGF), 스핑고신-1, VEGF, MG132(EMD, CA), N2 및 B27 보충제(Gibco, CA), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어 사이클로파민(EMD, CA), 각질세포 성장 인자(KGF), 딕코프(Dickkopf) 단백질 패밀리, 소 뇌하수체 추출물, 소도 신생 연관 단백질(INGAP), 인디언 헤지호그(Indian hedgehog), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog), 프로테아솜 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 헤레굴린, 또는 이들의 조합물 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 이러한 각각의 성분은 포함되는 경우 유효량으로 포함된다.

일부 경우에, 적절한 배지는 예를 들어 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(Eagle) 배지(DMEM), Gibco #11965-092; 녹아웃 둘베코 변형 이글 배지(KO DMEM), Gibco # 10829-018; 햄(Ham)의 F12/50% DMEM 기초 배지; 200 mM L-글루타민, Gibco #15039-027; 비필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마 #M7522; 인간 재조합 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), Gibco #13256-029와 같은 성분으로부터 제조될 수 있다. 다른 적합한 시약은 Neurobasal(Gibco), BrainPhys(Stem Cell Technologies) 및/또는 NeuroDiff(Stem Cell Technologies)를 포함할 수 있다.

세포 배지는 상업적으로 이용 가능하며, 인비트로겐 코퍼레이션(GIBCO), 셀 애플리케이션즈, 인크.(Cell Applications, Inc.), 바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries, 이스라엘 베쓰 해멕 소재), 및 칼바이오켐(Calbiochem)에서 입수 가능한 것과 같이 정의된 이종 미함유(xeno-free) 성분을 비롯하여 상업적으로 이용 가능한 성분으로 보충될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 세포 배지를 쉽게 변형하여 본 발명에 따른 표적 세포 중 임의의 하나 이상을 생성할 수 있을 것이다.

개시된 EV 생산 세포는 다양한 방식으로 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 영양 세포층 상에서 세포를 배양하기 위한 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 세포는 부착성 단층으로서 또는 현탁액 내의 세포 응집체로서 세포 지지체 또는 매트릭스 상에서 성장할 수 있다. 일부 경우에, EV를 생산하기 위해 사용되는 세포에 따라 세포 지지체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 사용되는 경우, 세포 지지체는 바람직하게는 적어도 하나의 기질 단백질을 포함한다. 기질 단백질은 예를 들어 성장 촉진을 나타내고 표피 성장 인자(EGF)에 대한 상동성을 갖는 도메인을 포함하고 성장 촉진 활성을 나타내는, 세포외 매트릭스에서 발견되는 단백질인 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 라미닌, 테나신, 트롬보스폰딘 및 이들의 혼합물을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 기질 단백질은 예를 들어 콜라겐, 피브로넥틴, 비브로넥틴, 폴리리신, 폴리오르니틴 및 이들의 혼합물을 포함한다. 또한, 이러한 배아 줄기 세포 분화 단백질 중 하나 이상을 유효 농도로 함유하는 겔 및 기타 겔의 메틸셀룰로오스와 같은 기타 물질도 사용할 수 있다. 이러한 분화 단백질을 포함하는 예시적인 분화 단백질 또는 물질은 특히 예를 들어 재조합 라미닌, BD Cell-Tak™ 세포 및 조직 부착제, BD™ 피브리노겐 인간 재조합 콜라겐 I, BD™ 피브리노겐 인간 재조합 콜라겐 III, BD 마트리겔(Matrigel)™ 기저막 매트릭스, BD 마트리겔™ 기저막 매트릭스 고농축물(HC), BD™ PuraMatrix™ 펩타이드 히드로겔, 콜라겐 I, 콜라겐 I 고농축물, 콜라겐 II(소), 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V 및 콜라겐 VI를 포함한다.

대안적으로, 이들 세포는 영양 세포가 없거나 본질적으로 영양 세포가 없지만 EV를 생성하기 위한 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양될 수 있다. 영양 세포가 없는 배양액에서 세포의 성장은 또 다른 세포 유형으로 미리 배양하여 조건화된 배지를 사용하여 지지할 수 있다. 대안적으로, 분화 없이 영양 세포가 없는 배양액에서 EV 생성 세포의 성장은 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 지지될 수 있다. 이러한 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 영양 세포 미함유 배지에서 성장한다.

EV는 다양한 시간 간격(예를 들어, EV 생산 속도에 따라 약 1, 2, 4, 6, 8일 또는 3, 6, 9, 12일 또는 더 긴 간격)으로 수확할 수 있다. EV의 예시적인 수율은 본 명세서의 다른 곳에서 설명되는 바와 같이 증식성 및 비증식성 신경 세포의 약 24시간 내지 7일의 배양 시간 동안, 적어도 약 1 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 10 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 50 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 100 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 500 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 750 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 800 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 900 ng EV/100만 개의 세포, 적어도 약 1.0 μg EV/100만 개의 세포, 적어도 약 1.5 μg EV/100만 개의 세포, 적어도 약 2.0 μg EV/100만 개의 세포, 적어도 약 2.5 μg EV/100만 개의 세포, 적어도 약 3.0 μg EV/100만 개의 세포, 적어도 약 5.0 μg EV/100만 개의 세포, 및 적어도 약 10.0 μg EV/100만 개의 세포일 수 있다.

많은 경우에, EV는 초원심분리 또는 분별 원심분리 또는 이들의 임의의 조합에 의해 수확 및 수집되고, 펠렛화된 EV는 수집되고, 선택적으로 수집된 펠렛화된 EV는 적합한 배지로 세척된다. 예를 들어, EV의 준비는 원심분리, 여과 또는 이러한 방법의 조합에 의해 세포 배양액 또는 조직 상청액에서 준비할 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 분별 원심분리, 즉 더 큰 입자를 펠렛화하기 위한 저속(<2,0000 g) 원심분리 후, EV를 펠렛화하기 위한 고속(>100,000 g) 원심분리, 적절한 필터(예를 들어, 0.22 μm 필터)를 사용한 크기 여과, 구배 초원심분리(예를 들어, 수크로스 구배 사용) 또는 이러한 방법의 조합에 의해 제조될 수 있다. EV는 분별 원심분리, 미세여과 및 한외여과, 중합체 침전, 미세유동 분리, 면역포획 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. EV를 단리하고 정제하기 위한 이들 및/또는 관련 방법은 문헌 [Thery, et al., Current Protocols in Cell Biology, (2006) 3.221-3.22.29, copyright 2006 by John Wiley & Sons, Inc.]; [Sokolova, et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2011, 87, 146-150]; [Wiklander, et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2015, 4, 26316, pp. 1-13]; 및 [Boeing, et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2014, 3, 23430, pp. 1-11]에 기재되어 있다. 다른 단리 방법, 예를 들어 전기장 무선주파수(electrical field radiofrequency) 및 음향(acoustics) 방법도 개발될 수 있다.

합성 엑소솜과 같은 합성 소포체를 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 본원에서 제공되는 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 합성 소포체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. EV의 내용물, 즉 지질 이중층이 제거되거나 소실되고 내용물이 획득된 EV는 인공 EV를 조작하기 위해 사용될 수도 있다.

(ii) 폴리펩타이드-EV 접합체

한 측면에서, 본 발명은 신경 세포(예를 들어, 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포)로부터 유래된 세포외 소포체를 포함하는 폴리펩타이드-EV 접합체를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 폴리펩타이드는 클릭 화학을 사용하여 소포체 표면에 접합된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 항체 또는 그의 항원 결합 부분(본원에서 "항체-EV(Ab-EV) 접합체"로 지칭됨)이다. 폴리펩타이드-EV 접합체(예를 들어, Ab-EV 접합체)는 소포체 표면 상에서 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분)에 접합된, 신경 세포(예를 들어, 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포)로부터 유래된 세포외 소포체를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)는 클릭 화학을 사용하여 소포체 표면에 접합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)는 2개의 상보적 클릭 화학 작용기 사이의 반응으로부터 생성된 링커에 의해 소포체에 커플링될 수 있다. 폴리펩타이드-EV 접합체의 추가의 특징은 아래에서 제공된다.

본원에서 제공되는 폴리펩타이드-EV(예를 들어, Ab-EV) 접합체를 제조하기 위해, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 다양한 접합 방법을 사용하여 EV에 접합될 수 있다.

일부 실시양태에서, EV에 커플링된 폴리펩타이드는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다. 항체는 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 나노바디, 모노바디, 및 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 항체 단편일 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 전장(무손상) 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')₂, Fv, scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(surrobody)(대리 경쇄 구축물 포함), 단일 도메인 항체, 낙타화 항체 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 그의 항원 결합 단편의 형태일 수 있다. 이것은 또한 예를 들어 IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), 또는 IgM을 포함하는 임의의 이소형이거간 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 완전한 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.

일부 실시양태에서, 항체 모방체가 본원에서 제공되는 EV에 접합된다. 항체 모방체의 예는 애드넥틴(즉, 피브로넥틴 기반 결합 분자), 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 피노머, 쿠니츠 도메인 펩타이드, 모노바디, nanoCLAMP, 나노바디, 유니바디, 베르사바디, 앱타머, 및 그 전부가 전통적인 항체 결합을 모방하지만 독특한 메커니즘을 통해 생성되고 기능하는 결합 구조를 사용하는 펩타이드 분자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분)는 "클릭 화학"을 사용하여 EV의 표면에 접합될 수 있다(예를 들어, 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angewandte Chemie, International Edition 2001, 40, 2004-2021; Kolb, H. C.; Sharpless, K. B. Drug Discovery Today 2003, 8, 1128-1137] 참조). 임의의 적합한 클릭 반응을 사용하여 폴리펩타이드를 EV 표면에 연결할 수 있다. 클릭 화학 반응은 일반적으로 빠르고, 모듈식이며, 효율적이고, 종종 독성 폐생성물을 생성하지 않으며, 물을 용매로 사용하여 수행할 수 있으며, 입체 특이적으로 설정할 수 있기 때문에 유리하다.

본원에 인용된 용어 "클릭 작용기"는 수용액에서 온건한 조건 하의 그의 상응하는 클릭 시약과 신속하게 선택적으로 반응(예를 들어, 고리 첨가 반응을 통해 "클릭")할 수 있는 시약을 지징하기 위해 "클릭 화학 시약" 또는 "클릭 시약"이라는 용어와 교환 가능하게 사용된다. 온건한 조건에는 낮은 반응물 농도와 함께 중성 pH, 수용액 및 주변 온도가 포함될 수 있다. 클릭 작용기의 예는 아지드, 알켄, 알킨, 디벤조사이클로옥틴(DBCO), 트랜스사이클로옥텐, 니트론, 니트릴이민, 니트릴 옥사이드, 이소니트릴, 테트라졸 및 테트라진 기를 포함한다. 예시적인 클릭 반응은 Cu-아지드-알킨, 스트레인 촉진된 아지드-알킨, 스타우딩거 결찰, 테트라진 결찰, 광 유도 테트라졸-알켄, 티올-엔, NHS 에스테르, 에폭사이드, 이소시아네이트, 및 알데히드-아미노옥시를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 EV에 커플링하는 링커는 2개의 상보적 클릭 작용기("클릭 링커") 사이의 반응으로부터 생성된다.

한 실시양태에서, 본원의 폴리펩타이드-EV 접합체의 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분) 또는 EV는 클릭 작용성 불포화 기인 클릭 작용기를 포함할 수 있다. 그 예는 알켄 및 알킨과 같은 친쌍극자체, 및 관련 헤테로원자 작용기,예를 들어 카르보닐 및 니트릴을 포함하는 분자이다. 클릭 작용성 불포화 기에 대한 반응물로서 사용될 수 있는 다른 클릭 작용기는 테트라진 및 테트라졸과 같은 디엔이다.

또 다른 실시양태에서, 본원의 폴리펩타이드-EV 접합체의 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분) 또는 EV는 클릭 작용성 쌍극성 기를 포함할 수 있다. 클릭 작용성 쌍극성 기는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고 하전된 쌍극자를 나타내는 적어도 하나의 메소메리(mesomeric) 구조를 갖는 화합물인 것으로 이해된다. 클릭 작용성 쌍극성 기의 예는 선형 1,3-쌍극성 기, 예를 들어 아지드, 니트릴 옥사이드, 디아조알칸, 니트릴이민 및 니트론이다.

특정 실시양태에서, EV-Ab 접합체는 제1 클릭 작용기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 클릭 화학 반응을 겪는 것으로 공지된 제2 클릭 작용기를 포함하는 EV와 반응시킴으로써 제조된다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 EV의 접합을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있는 작용기의 상보적 쌍의 비제한적인 예는 표 1에 제시되어 있다.

관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 클릭 시약의 다른 예시적인 쌍은 아지드 및 디벤조사이클로옥틴(DIBO로도 알려진 DBCO), 테트라진 및 트랜스사이클로옥텐, 및 테트라진 및 노르보르넨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

하나의 예시적인 실시양태에서, 아지드로 표지된 EV는 DBCO로 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 커플링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, DBCO로 표지된 EV는 아지드로 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 커플링될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 아지드와 DBCO의 반응으로부터 형성된 클릭 링커를 통해 EV에 접합된다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 테트라진으로 표지된 EV는 트랜스사이클로옥텐으로 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 커플링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스사이클로옥텐으로 표지된 EV는 테트라진으로 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 커플링될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 테트라진과 트랜스사이클로옥텐의 반응으로부터 형성된 클릭 링커를 통해 EV에 접합된다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 테트라진으로 표지된 EV는 노르보르넨으로 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 커플링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 노르보르넨으로 표지된 EV는 테트라진으로 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 커플링될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 테트라진과 노르보르넨의 반응으로부터 형성된 클릭 링커를 통해 EV에 접합된다.

본원에서 제공되는 EV에 항체를 접합하기 위해 사용할 수 있는 예시적인 반응에는 트리아졸을 형성하기 위한 아지드와 알킨의 구리 촉매 반응(후이스겐 1, 3-쌍극성 고리 첨가), 디엔과 친디엔체의 반응(딜스-알더), 스트레인 촉진 아지드-알킨 고리 첨가, 스트레인 촉진 알킨-니트론 고리 첨가, 변형 알켄과 아지드, 테트라진 또는 테트라졸의 반응, 알켄 및 아지드 [3+2] 고리 첨가, 알켄 및 테트라진 역전자 요구(inverse-demand) 딜스-알더, 또는 알켄 및 테트라졸 광반응이 포함된다. 일부 실시양태에서, 반응은 수성 환경에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 반응은 구리 촉매 또는 루테늄 촉매 반응(예를 들어, 아지드-알킨 고리 첨가 반응에서, 예를 들어 아지드와 알킨 사이의 반응을 개시하기 위한)이다. 대안적으로, 반응은 구리 부재 반응(예를 들어, 스트레인 촉진 아지드-알킨 고리 첨가 반응, 스트레인 촉진 알킨-니트론 고리 첨가)일 수 있다.

클릭 작용기를 단백질 및 EV에 통합하는 방법은 예를 들어 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Smyth et al. "Surface functionalization of exosomes using click chemistry." Bioconjugate chemistry 25.10 (2014): 1777-1784]; [Wang et al. "Integrating protein engineering and bioorthogonal click conjugation for extracellular vesicle modulation and intracellular delivery." PLoS One 10.11 (2015): e0141860]; 및 [Lee et al. "Facile metabolic glycan labeling strategy for exosome tracking." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects 1862.5 (2018): 1091-1100]에 기재되어 있다.

EV에 접합된 항체와 같은 단백질의 수는 EV의 클릭 접합 정도를 변경함으로써 변경할 수 있다. "치환도" 또는 "DS"라는 용어와 교환 가능하게 사용될 수 있는 "클릭 접합도"라는 용어는 EV당 클릭 시약의 평균 수를 나타낸다. 클릭 치환도는 클릭 접합 반응에서 EV의 농도에 대한 클릭 시약의 몰 당량 수를 변경함으로써 달라질 수 있다. 예를 들어, 클릭 접합 반응은 클릭 시약의 약 1 내지 약 5000 몰 당량 범위, 예를 들어 약 1, 약 5, 약 10, 약 20, 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1200, 약 1500, 약 1800, 약 2000, 약 2200, 약 2500, 약 2800, 약 3000, 약 3200, 약 3500, 약 4000, 약 4200, 약 4500 또는 약 5000 몰 당량을 포함할 수 있다. 언급된 값의 중간 범위도 본 발명의 일부로 의도된다. 예를 들어, 클릭 접합 반응은 약 1 내지 약 50, 약 10 내지 약 100, 약 150 내지 약 250, 약 200 내지 약 500, 약 400 내지 약 800, 약 700 내지 약 1000, 약 1200 내지 약 1600, 약 1500 내지 약 2000, 약 1800 내지 약 3500, 또는 약 3200 내지 약 5000 몰 당량의 클릭 시약을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 클릭 시약에 접합된 EV는 약 0.01% 내지 약 100%, 예를 들어, 약 0.01% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 90% 또는 약 85% 내지 약 100%의 클릭 치환도를 포함한다. 예를 들어, 클릭 시약에 접합된 본 발명의 EV는 약 0.01%, 약 0.05%, 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%의 클릭 치환도를 포함할 수 있다.

임의의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 본원에서 제공되는 방법을 사용하여 신경 세포로부터 유래된 EV에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간화 항체, 또는 그의 항원 결합 부분이다. 다른 실시양태에서, 항체는 완전한 인간 항체, 또는 그의 항원 결합 부분이다. 예시적인 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 뇌 또는 중추 신경계에서 발현되는 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 알츠하이머병과 관련된 아밀로이드 베타 폴리펩타이드(Aβ), 예를 들어 인간 아밀로이드 베타 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다.

예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-아밀로이드 베타 항체 솔라네주맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 솔라네주맙은 Aβ의 중간 도메인을 표적으로 하는 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다. 솔라네주맙(10D5 및 m266으로도 알려짐)은 예를 들어 미국 특허 제US7320790호, 제US7195761호, 제US8105597호, 제US8591894호, 및 제US8623365호에 기술되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 솔라네주맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-아밀로이드 베타 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-아밀로이드 베타 항체는 솔라네주맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 솔라네주맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

솔라네주맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 2에 기재되어 있다. 솔라네주맙의 CDR 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 굵게 강조되어 있다. 솔라네주맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 밑줄이 그어져 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 2에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 2에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호(SEQ ID NO:) 3의 VH CDR1, 서열 번호 4의 VH CDR2, 및 서열 번호 5의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 8의 VL CDR1, 서열 번호 9의 VL CDR2, 및 서열 번호 10의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 갖는다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 갖는다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-아밀로이드 베타 항체 아두카누맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 아두카누맙은 Aβ의 응집된 형태 상의 입체형태적 에피토프를 인식하는 완전한 인간 IgG1 모노클로날 항체이다. 아두카누맙(BIIB037 및 BART로도 알려짐)은 예를 들어 US20150315267, US20180333487, WO2017211827, 및 WO2019040612에 기재되어 있고, 이들은 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 아두카누맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-아밀로이드 베타 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-아밀로이드 베타 항체는 아두카누맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 아두카누맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

아두카누맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 3에 기재되어 있다. 아두카누맙의 CDR 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 굵게 강조되어 있다. 아두카누맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 밑줄이 그어져 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 3에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 3에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 13의 VH CDR1, 서열 번호 14의 VH CDR2, 및 서열 번호 15의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 18의 VL CDR1, 서열 번호 19의 VL CDR2, 및 서열 번호 20의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 갖는다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본원에서 제공되는 항-아밀로이드 베타 항체에 대해 적어도 95%의 동일성, 예를 들어, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 본원에서 제공되는 항-아밀로이드 베타 항체의 HC 가변 도메인을 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역, 또는 그의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 항-아밀로이드 베타 항체와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 항-아밀로이드 베타 항체와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 항-아밀로이드 베타 항체와 상이하고/하거나, (iv) 항-아밀로이드 베타 항체에 대해 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 임의의 하나에서 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 아밀로이드 베타 결합 특이성을 유지하면서 항-아밀로이드 베타 항체의 중쇄 가변 영역에 비해 향상된 생물학적 활성을 가질 수 있다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 인간 세포 예정사 1(PD1: Programmed Cell Death 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. PD1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-EV 접합체는 PD1이 관련된 질병 또는 장애의 치료, 예를 들어 다형성 교모세포종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-PD1 항체 니볼루맙, 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 니볼루맙은 PD1을 표적으로 하는 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙은 예를 들어 미국 특허 제US8008449호, 제US8168179호, 및 제US9387247호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 니볼루맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, PD1 항체는 니볼루맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 니볼루맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 니볼루맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 4에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 4에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 4에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 23의 VH CDR1, 서열 번호 24의 VH CDR2, 및 서열 번호 25의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 28의 VL CDR1, 서열 번호 29의 VL CDR2, 및 서열 번호 30의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 암과 관련된 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-EV 접합체는 VEGF가 관련된 질병 또는 장애의 치료에, 예를 들어 다형성 교모세포종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-VEGF 항체 베바치주맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 베바치주맙은 VEGF를 표적으로 하는 재조합 인간화 모노클로날 항체이다. 베바치주맙은 예를 들어 미국 특허 제US6632926호, 제US7169901호, 및 제US7575893호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 베바치주맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-VEGF 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, VEGF 항체는 베바치주맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 베바치주맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 베바치주맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 5에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 5에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 5에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 33의 VH CDR1, 서열 번호 34의 VH CDR2, 및 서열 번호 35의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 38의 VL CDR1, 서열 번호 39의 VL CDR2, 및 서열 번호 40의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 인간 B-림프구 항원 CD20(CD20) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-EV 접합체는 CD20이 관련된 질병 또는 장애의 치료, 예를 들어 재발성 MS, 1차 진행성 MS 및 2차 진행성 MS를 포함하는 다발성 경화증(MS)의 치료에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-CD20 항체 오크렐리주맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 오크렐리주맙은 CD20을 표적으로 하는 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다. 오크렐리주맙은 예를 들어 미국 특허 제US5,500,362호, 제US5,677,180호 및 제US7,799,900호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 오크렐리주맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, CD20 항체는 오크렐리주맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 오크렐리주맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 베오크렐리주맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 6에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 6에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 6에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 43의 VH CDR1, 서열 번호 44의 VH CDR2, 및 서열 번호 45의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 48의 VL CDR1, 서열 번호 49의 VL CDR2, 및 서열 번호 50의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 47에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 46에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 인간 알파-4 인테그린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. α-4 인테그린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-EV 접합체는 α-4 인테그린이 관련된 질병 또는 장애의 치료, 예를 들어 다발성 경화증, 예를 들어, 재발-완화성 다발성 경화증의 치료에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-α-4 인테그린 항체 나탈리주맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 나탈리주맙은 α-4 인테그린을 표적으로 하는 인간화 모노클로날항체이다. 나탈리주맙은 예를 들어 미국 특허 제US7,157,086호, 제US6,602,503호 및 제US8,124,350호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 나탈리주맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-α-4 인테그린 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, α-4 인테그린 항체는 나탈리주맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 나탈리주맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 나탈리주맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 7에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 7에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 7에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 52의 VH CDR1, 서열 번호 53의 VH CDR2, 및 서열 번호 54의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 56의 VL CDR1, 서열 번호 57의 VL CDR2, 및 서열 번호 58의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 55에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 인간 GD2 강글리오시드(GD2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. GD2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-EV 접합체는 GD2가 관련된 질병 또는 장애의 치료, 예를 들어 신경모세포종의 치료에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-GD2 항체 디누툭시맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 디누툭시맙은 GD2를 표적으로 하는 키메라 인간/마우스 모노클로날 항체이다. 디누툭시맙은 예를 들어 미국 특허 제US9,777,068호, 제US10,294,305호 및 제US9,840,566호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 디누툭시맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-GD2 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, GD2 항체는 디누툭시맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 디누툭시맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 디누툭시맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 8에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 8에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 8에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 61의 VH CDR1, 서열 번호 62의 VH CDR2, 및 서열 번호 63의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 66의 VL CDR1, 서열 번호 67의 VL CDR2, 및 서열 번호 68의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 60에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 65에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 59에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 알츠하이머병과 관련된 인간 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 아밀로이드 베타에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-EV 접합체는 아밀로이드 베타가 관련된 질병 또는 장애의 치료, 예를 들어 알츠하이머병의 치료에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-아밀로이드 베타 항체 간테네루맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 간테네루맙은 아밀로이드 베타를 표적으로 하는 인간 IgG1 모노클로날 항체이다. 간테네루맙은 예를 들어 미국 특허 제US7,794,719호, 제US8,216,577호 및 제US8,329,886호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 간테네루맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-아밀로이드 베타 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 아밀로이드 베타 항체는 간테네루맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 간테네루맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 간테네루맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 9에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 9에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 9에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 71의 VH CDR1, 서열 번호 72의 VH CDR2, 및 서열 번호 73의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 76의 VL CDR1, 서열 번호 77의 VL CDR2, 및 서열 번호 78의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 74에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-아밀로이드 베타 항체 레카네맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 레카네맙은 아밀로이드 베타를 표적으로 하는 인간화 마우스 모노클로날항체이다. 레카네맙은 예를 들어 미국 특허 제US8,106,164호, 제US8,999,936호, 및 제US9,573,994호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 레카네맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-아밀로이드 베타 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 아밀로이드 베타 항체는 레카네맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 레카네맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 레카네맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 10에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 80에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 82에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 79에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 81에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 인간 B-림프구 항원 CD20(CD20) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-EV 접합체는 CD20이 관련된 질병 또는 장애의 치료, 예를 들어 다발성 경화증, 예를 들어 재발성 다발성 경화증의 치료에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체-EV 접합체는 항-CD20 항체 유블리툭시맙, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 유블리툭시맙은 CD20을 표적으로 하는 키메라 인간/마우스 모노클로날 항체이다. 유블리툭시맙은 예를 들어 미국 특허 제US9,234,045호, 제US9,694,071호 및 제US9,873,745호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 유블리툭시맙의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 포함하는 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, CD20 항체는 유블리툭시맙의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 유블리툭시맙의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 유블리툭시맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 표 11에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 표 11에 제시된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 및/또는 표 11에 제시된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 영역, 또는 상기 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 85의 VH CDR1, 서열 번호 86의 VH CDR2, 및 서열 번호 87의 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 90의 VL CDR1, 서열 번호 91의 VL CDR2, 및 서열 번호 92의 VL CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 84에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열 번호 89에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체-EV 접합체는 서열 번호 83에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 88에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체-EV 접합체는 인간 면역 글로불린을 포함한다. 면역 글로불린은 인간 항체를 포함하는 인간 혈장으로 만든 멸균 용액이다. 면역 글로불린 제품은 가뮤넥스 씨(GAMUNEX C)™, 감마케드(GAMMAKED)™, 히젠트라(HIZENTRA)™, 프리비겐(PRIVIGEN)™ 및 감마가드(GAMMAGARD)™라는 상표명으로 판매된다. 면역 글로불린을 포함하는 항체-EV 접합체는 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP) 및 다초점성 운동 신경병증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 장애의 치료에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체 표지된 EV는 소분자, 핵산(예를 들어, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 및 이중 가닥 RNA(dsRNA)), 단백질 및/또는 펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분자를 추가로 포함할 수 있다.

일부 경우에, EV는 세포로부터 단리되고, EV를 대상체에게 투여하기 전에 원하는 분자가 로딩된다. 다른 경우에, 원하는 분자는 EV를 생성하는 세포를 하나 이상의 치료제와 공동으로 인큐베이션함으로써 EV 내에 로딩될 수 있다. 일부의 다른 예에서, 원하는 핵산, 단백질 또는 펩타이드는 EV를 생산하기 위해 사용되는 세포에서 원하는 분자의 과다발현에 의해 EV 내에 로딩될 수 있고, 이에 의해 EV에는 생산 동안 원하는 분자가 로딩된다. 또 다른 예에서, 원하는 분자는 원하는 분자의 엑소솜으로의 수송을 용이하게 하는 담체 분자(예를 들어, 단백질)의 과다발현에 의해 EV 내에 로딩될 수 있다. 예를 들어, 소 백혈병 바이러스 단백질의 담체 펩타이드는 관심 폴리펩타이드의 엑소솜 내로의 로딩을 용이하게 하기 위해 관심 폴리펩타이드와의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이러한 접근 방법은 예를 들어 미국 특허 제9,546,371호에 기재되어 있으며, 이 특허의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 다른 실시양태에서, 담체 분자는 EV를 생산하기 위해 사용되는 세포에서 억제 핵산으로 발현되고, 따라서 EV에 억제 핵산이 로딩될 수 있다.

위에서 설명한 예에서, 원하는 분자는 외인성 또는 내인성일 수 있다. 외인성 분자는 시험관 내에서, 생체 내에서 또는 생체 외에서, 예를 들어 EV에 자연적이지 않은 외부 공급원으로부터 EV에 부가되는 분자를 지칭한다. 내인성 분자는 EV 내부에 천연적으로 존재하거나, 시험관 내에서, 생체 내에서 또는 생체 외에서 EV와 회합된 분자를 나타낸다. 외인성 분자는 분자가 예를 들어 과다발현, 생산 후 로딩 등에 의해 외부 공급원으로부터 EV에 부가될 때, EV에 천연적으로 존재하는 동일한 유형의 분자(핵산, 단백질 등)를 포함할 수 있다.

EV는 항체 또는 그의 항원 결합 부분으로 EV를 표면 표지하기 전 또는 후에 원하는 화물 분자로 로딩될 수 있다. 본원에서 설명되는 원하는 분자는 인큐베이션, 초음파 처리, 전기천공 또는 막 투과제(예를 들어, 폴리올, 세제, 당)와 같은 형질감염 시약의 사용을 비롯한 많은 상이한 기술에 의해 EV 내에 도입될 수 있다. 전기천공 조건은 원하는 분자의 전하 및 크기에 따라 달라질 수 있다. 일반적인 전압은 20 V/cm 내지 1,000 V/cm, 예를 들어 20 V/cm 내지 1000 V/cm 범위에 있으며, 정전 용량은 일반적으로 25 μF 내지 250 μF, 예를 들어 25 μF 내지 125 μF이다. 150 mV 내지 250 mV 범위의 전압, 특히 200 mV의 전압이 EV에 항체를 로딩하는 데 바람직하다. 대안적으로, 형질감염 시약을 사용하여 EV에 원하는 분자(예를 들어, 외인성 단백질 및/또는 펩타이드)를 로딩할 수 있다. EV의 작은 크기에도 불구하고, 원하는 분자(예를 들어, 외인성 단백질 및/또는 펩타이드)로 EV를 형질감염시키기 위해 기존의 형질감염제가 사용될 수 있다. 한 예에서, EV는 또한 EV가 세포로부터 생산될 때 치료용 단백질 또는 펩타이드가 EV에 흡수되도록 관심 있는 치료용 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 핵산 구축물로 숙주 세포를 형질전환하거나 형질감염시킴으로써 로딩될 수 있다. 또 다른 예에서, EV는 또한 억제 핵산 구축물이 EV에 흡수되도록 담체/어댑터 분자가 있거나 없는 억제 핵산 구축물로 숙주 세포를 형질전환하거나 형질감염시킴으로써 억제 핵산 구축물로 로딩될 수 있다.

(iii) EV 내강에 항체가 로딩된 EV

한 측면에서, 본 발명은 EV의 내강에 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편)가 로딩된 EV를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 목적에 적합한 EV는 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 로딩하기 위한, 신경 세포(예를 들어, 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포)로부터 유래된 세포외 소포체를 포함할 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 항체가 예를 들어 위에서 설명된 바와 같이 클릭 화학을 통해 EV 표면 상에 로딩하는 것에 추가로 또는 이에 대한 대안으로서 EV 내강에 로딩하기 위해 사용될 수 있다.

폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분)는 다양한 방법을 사용하여 EV의 내강에 로딩될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 막 투과화에 적합한 세제, 예를 들어 사포닌을 사용하여 소포체 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 초음파 처리에 의해 소포체 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 전기천공에 의해 소포체 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 진탕(예를 들어, 100 rpm - 1500 rpm)과 함께 인큐베이션(예를 들어, 실온에서)에 의해 소포체 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 전술한 방법의 조합(예를 들어, 사포닌 투과화 및 초음파 처리, 전기천공 및 초음파 처리, 사포닌 투과화 및 전기천공 등)을 사용하여 소포체 내에 로딩된다. 단백질, 예를 들어 항체는 투과화, 초음파 처리 및/또는 전기천공 이전, 도중 또는 이후에 소포체에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 소포체는 내강에 로딩될 단백질, 예를 들어 항체의 존재 하에 세제, 초음파 처리 및/또는 전기천공을 사용하여 투과화된다. 다른 실시양태에서, 소포체는 세제, 초음파 처리, 및/또는 전기천공을 사용하여 투과화되고, 이어서 로딩될 단백질, 예를 들어 항체와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 로딩될 단백질(예를 들어, 항체)은 약 25 내지 약 2000 μg/mL의 농도로 소포체에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 로딩될 단백질(예를 들어, 항체)은 약 50 내지 약 1500 μg/mL의 농도로 소포체에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 로딩될 단백질(예를 들어, 항체)은 약 100 내지 약 1000 μg/mL의 농도로 소포체에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 단백질(예를 들어, 항체)는 약 25 μg, 약 50 μg/mL, 약 100 μg/mL, 약 200 μg/mL, 약 300 μg/mL, 약 400 μg/mL, 약 500 μg/mL, 약 600 μg/mL, 약 700 μg/mL, 약 800 μg/mL, 약 900 μg/mL, 약 1,000 μg/mL, 약 1,500 μg/mL, 또는 약 2,000 μg/mL의 농도로 소포체에 첨가된다.

일부 실시양태에서, 항체는 막 투과화에 적합한 세제를 사용하여 소포체의 내강 내에 로딩된다. 이러한 세제는 예를 들어 사포닌, 트윈(Tween)-20, 및 세포외 소포체 투과화에 적합한 관련 기술 분야에 공지된 기타 세제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 0.01%, 약 0.03%, 약 0.05%, 약 0.07%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.12%, 약 0.14%, 약 0.16%, 약 0.18%, 약 0.2%, 약 0.22 %, 약 0.24%, 약 0.26%, 약 0.28%, 또는 약 0.3%(w/v)의 세제(예를 들어, 사포닌)가 EV 막을 투과화하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 항체는 사포닌을 사용한 EV 막의 투과화에 의해 EV의 내강 내에 로딩된다. 예를 들어, 막은 항체를 첨가하기 전에, 예를 들어 0.01% - 5%(w/v) 사포닌과 함께 EV 제제를 인큐베이션함으로써 투과화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 막은 항체를 첨가하기 전에 EV 제제를, 예를 들어 약 0.01%, 약 0.03%, 약 0.05%, 약 0.07%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.12%, 약 0.14%, 약 0.16%, 약 0.18%, 약 0.2%, 약 0.22%, 약 0.24%, 약 0.26%, 약 0.28%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.2%, 약 1.4%, 약 1.6%, 약 1.8%, 약 2.0%, 약 2.2%, 약 2.4%, 약 2.8%, 약 3.0%, 약 3.2%, 약 3.4%, 약 3.6%, 약 3.8%, 약 4.0%, 약 4.2%, 약 4.4%, 약 4.6%, 약 4.8%, 또는 약 5.0% (w/v) 사포닌과 함께 인큐베이션함으로써 투과화될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 항체를 첨가하기 전에 1-20분 동안 사포닌과 함께 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 항체를 추가하기 전에 1-10분 동안 사포닌과 함께 인큐베이션할 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 항체를 첨가하기 전에 1-5분 동안 사포닌과 함께 인큐베이션될 수 있다. 그런 다음, 항체를 투과화된 EV에 추가하고, 선택적으로 부드럽게 혼합하거나 진탕(예를 들어, 100 rpm, 200 rpm, 300 rpm, 400 rpm, 500 rpm, 600 rpm, 700, 800 rpm, 900 rpm, 1000 rpm, 1100 rpm, 1200 rpm, 1300 rpm, 1400 rpm, 1500 rpm)하면서 1-30분(예를 들어, 1-20분, 1-15분, 1-10분, 또는 1-5분) 동안 인큐베이션할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 초음파 처리에 의해 소포체 내에 로딩된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 초음파 처리가 본 명세서에서 표 12에 예시된 바와 같이 상이한 진폭, 펄스 시간 및 사이클을 조합함으로써 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 초음파 처리를 위한 진폭은 다양한 펄스 시간(예를 들어, 4 sec 온 / 2 sec 오프; 4 sec 온 /4 sec 오프; 4 sec 온 / 8 sec 오프; 2 sec 온 / 2 sec 오프; 2 sec 온 / 4 sec 오프; 2 sec 온 / 8 sec 오프; 8 sec 온 / 2 sec 오프; 8 sec 온 / 4 sec 오프; 8 sec 온 / 8 sec 오프) 및 사이클 수(예를 들어, 2 사이클 내지 36 사이클, 예를 들어, 2 사이클, 4 사이클, 6 사이클, 8 사이클, 10 사이클, 12 사이클, 14 사이클, 16 사이클, 18 사이클, 20 사이클, 22 사이클, 24 사이클, 26 사이클, 28 사이클, 30 사이클, 32 사이클, 34 사이클 또는 36 사이클)과 조합하여 10% 내지 100% 진폭(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%) 사이에서 임의로 설정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 초음파 처리를 위한 진폭은 일정한 기간(예를 들어, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분 또는 그 초과)에 10% 내지 100% 진폭(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%) 사이에서 임의로 설정할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체는 예를 들어 전압(예를 들어, 100 V, 150 V, 200 V, 250 V, 300 V, 350 V, 400 V, 450 V, 500 V, 550 V, 600 V, 650 V, 700 V, 750 V, 800 V, 850 V, 900 V, 950 V, 1 kV, 또는 그 초과) 및 펄스의 지속 시간 및 수(예를 들어, 1펄스, 2펄스, 3펄스, 4펄스, 5펄스, 6펄스, 7펄스, 8펄스, 9펄스, 10펄스, 11펄스, 12펄스, 13펄스, 14펄스, 15펄스, 16펄스, 17펄스, 18펄스, 19펄스, 20펄스, 또는 그 초과)를 변경함으로써 알려진 방법을 사용하여 전기 천공에 의해 소포체에 로딩된다.

일부 실시양태에서, 항체는 진탕(예를 들어, 100 rpm, 200 rpm, 300 rpm, 400 rpm, 500 rpm, 600 rpm, 700, 800 rpm, 900 rpm, 1000 rpm, 1100 rpm, 1200 rpm, 1300 rpm, 1400 rpm, 1500 rpm)하거나 진탕하지 않으면서 인큐베이션에 의해 소포체 내에 로딩된다(예를 들어, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 또는 그 초과의 시간 동안). 인큐베이션은 임의의 적절한 온도에서 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 약 4 내지 약 37℃에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 실온에서, 얼음 상에서, 약 4℃, 또는 약 37℃에서 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)는 또한 본원에 예시된 바와 같이 소포체의 내강 내에 항체를 도입하기 위해 본원에서 설명되는 임의의 방법의 조합을 사용하여 소포체 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)는 소포체 막 투과화 동안 포함된다(소포체에 첨가된다). 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)는 소포체 막 투과화 후에 포함된다(소포체에 첨가된다).

특정 실시양태에서, 항체는 항체를 EV에 첨가하기 전에 5-30분의 시간 동안 10-100% 진폭에서 초음파 처리와 함께 EV의 사포닌 투과화(예를 들어, 0.01-5% 사포닌을 사용한)에 의해 EV 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체를 EV에 첨가하기 전에 10분의 시간 동안 20% 진폭에서 초음파 처리와 함께 EV의 사포닌 투과화(예를 들어, 0.2% 사포닌)에 의해 EV 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체를 EV에 첨가하기 전에 10분의 시간 동안 40% 진폭에서 초음파 처리와 함께 EV의 사포닌 투과화(예를 들어, 0.2% 사포닌)에 의해 EV 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체를 EV에 첨가하기 전에 5분의 시간 동안 20% 진폭에서 초음파 처리와 함께 EV의 사포닌 투과화(예를 들어, 0.2% 사포닌)에 의해 EV 내에 로딩된다.

일부 실시양태에서, 항체는 진탕과 조합된 0.01-5% 사포닌 투과화에 의해 EV 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 진탕(예를 들어, 500 rpm)과 조합된 0.2% 사포닌 투과화에 의해 EV 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 진탕(예를 들어, 1000 rpm)하면서 실온에서의 인큐베이션에 의해 EV 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 전기천공에 의해 EV 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 20% 진폭, 12 사이클, 4 sec 온 및 8 sec 오프에서의 초음파 처리에 의해 소포체 내에 로딩된다.

일부 실시양태에서, 항체는 6 사이클 동안 4 sec 온 /8 sec 오프의 시간 동안 60% 진폭에서의 초음파 처리에 의해 EV 내에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 6 사이클 동안 2 sec 온 /4 sec 오프의 시간 동안 60% 진폭에서의 초음파 처리에 의해 EV 내에 로딩된 후, 얼음 위에서 2분 동안 인큐베이션된다.

일부 실시양태에서, 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)는 예를 들어 100 ug/ml, 약 200 ug/ml, 약 300 ug/ml, 약 400 ug/ml, 500 ug/ml, 약 600 ug/ml, 약 700 ug/ml, 약 800 ug/ml, 약 900 ug/ml, 또는 약 1,000 ug/ml의 농도 범위에서 EV의 내강 내에 로딩될 수 있다.

EV의 내강 내에 항체를 로딩할 때, 한외여과, 초원심분리 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(크기 배제, 이온 교환 및 생체친화성 크로마토그래피 포함)를 포함하여 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 내강에 항체가 로딩된 EV를 유리 항체 및 비로딩 EV로부터 분리할 수 있다.

C. 제제, 전달 및 투여

항체-EV 접합체 및 항체가 내강에 로딩된 EV를 포함하는, 본원에서 제공되는 폴리펩타이드 로딩된 EV, 예를 들어 항체 로딩된 EV는 대상체에게 전달하기 위한 약제학적 조성물(예를 들어, 신경 세포 유래 Ab-EV 접합체를 포함하는 약제학적 조성물)로 제제화될 수 있다. 약제학적 조성물은 치료 유효량의 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV) 및 약제학상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료 유효량의 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, Ab-EV 접합체 및/또는 내강 내에 로딩된 EV)는 멸균 포스페이트 완충 식염수 내에 제공될 수 있다. 다른 적합한 부형제, 비히클 및 담체는 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990)]에 기재되어 있다. 통상적으로 사용되며 활성제에 대해 불활성인 임의의 투여 방식, 비히클 또는 담체가 본 개시내용의 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하고 투여하기 위해 사용될 수 있음을 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 이러한 방법, 비히클 및 담체의 예는 예를 들어 그 개시 내용이 참조로 본 명세서에 포함된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 4th ed. (1970)]에 기재된 것이다.

개시된 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV)를 함유하는 제제는 선택적으로 정확한 투여량의 간단한 투여에 적합한 단위 투여 형태로, 액체, 고체 또는 반고체, 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 지속 방출 제제, 로션, 에어로졸 등의 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 전형적으로 통상적인 약제학적 담체 및/또는 부형제를 포함하고, 추가로 다른 약제, 담체, 보조제, 첨가제 등을 포함할 수 있다. Ab-EV 접합체 대 하나 이상의 부형제의 중량 백분율 비는 약 20:1 내지 약 1:60, 또는 약 15:1 내지 약 1:45, 또는 약 10:1 내지 약 1:40, 또는 약 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1 내지 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 또는 1:35일 수 있고, 바람직하게는 약 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1 또는 5:1이다. 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 약 1 μg 내지 약 1 g 이상의 총 EV, 예를 들어, 약 1 μg 내지 약 100 μg, 약 100 μg 내지 약 200 μg, 약 200 μg 내지 약 300 μg, 약 300 μg 내지 약 400 μg, 약 500 μg 내지 약 600 μg, 약 700 μg 내지 약 800 μg, 약 900 μg 내지 약 1 mg, 약 100 μg 내지 약 500 μg, 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 5 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 500 mg, 약 25 mg 내지 약 500 mg, 약 50 mg 내지 약 350 mg, 약 75 mg 내지 약 450 mg, 약 50 mg 내지 약 450 mg, 약 75 mg 내지 약 325 mg, 약 100 mg 내지 약 650 mg, 또는 약 500 mg 내지 약 1 g의 총 EV를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 적합한 약제학적 담체, 첨가제 및/또는 부형제를 함유할 수 있다.

다양한 예에서, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV와 같은 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 약제학적 조성물)은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 투여 경로를 통해 세포 및/또는 대상체에게 전달하기 위해 제제화될 수 있다. 투여 방식은 일반적으로 알려져 있거나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명하다(예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co. 1985)] 참조).

본원에서 제공되는 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV)를 포함하는 조성물은 주사, 주입, 흡입, 비강내, 안내, 국소 전달, 캐뉼러 전달 또는 경구를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 경로에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 주사는 비제한적으로, 정맥내, 두개내, 척수강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 뇌실내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척수액내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 투여는 뇌척수액내 주사를 포함한다. 일부 다른 예에서, 투여는 예를 들어 분무와 함께 에어로졸 흡입을 포함한다. 다른 경우에, 투여는 전신(예를 들어, 경구, 직장, 비강, 설하, 협측 또는 비경구), 소화관내(예를 들어, 전신 효과, 그러나 CNS를 통해 전달됨), 또는 국소(예를 들어, 피부에 국소 도포, 유리체내 주사)를 포함한다. 일부 예에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV)의 투여는 항체가 로딩된 EV를 중추 신경계에 전달할 수 있고, 특정 실시양태에서 혈액-뇌 장벽을 가로질러 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 질병 및/또는 기능장애 조직(예를 들어, 뇌)의 부위에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 투여 부위는 병든 조직 및/또는 기능장애 조직 부위로부터 원위부에 있다(예를 들어, 정맥내 또는 비강내 전달의 경우). 한 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 조성물은 대상체에게 비경구로 투여된다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 조성물은 대상체에게 정맥 내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 조성물은 대상체에게 비강 내로 투여된다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 조성물은 대상체에게 두개 내로 투여된다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 조성물은 대상체에게 척수강 내로 투여된다.

비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 척수강내, 뇌척수액내, 또는 비강내)를 위한 주사 가능한 조성물은 선택적으로 멸균 생리학적 염 용액과 같은 적합한 i.v. 용액 내의 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV) 및 추가의 성분을 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 수성 에멀젼 내의 현탁액으로 제제화된다.

액체 약제학적 조성물은 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV) 집단, 및 선택적인 약제학적 보조제를, 예를 들어 수성 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올과 같은 담체에 용해시키거나 분산시켜 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다.

정맥내 제제는 본원에서 설명되는 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV), 등장성 매질 및 폴리펩타이드 로딩된 EV의 응집을 방지하는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 정맥내/척수강내/뇌척수액내 제제의 예는 식염수 용액(예를 들어, 생리 식염수(NS); 약 0.91% w/v의 NaCl, 약 300 mOsm/L) 및/또는 0.18% 식염수 내의 4%의 덱스트로스, 및 선택적으로 1%, 2% 또는 3% 인간 혈청 알부민을 함유할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 로딩된 EV는 본 발명에 따른 조성물에 사용되는 내용물을 얻기 위해 파괴될 수 있다.

경구 액체 제제에 사용하기 위해, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 시럽으로서 제조될 수 있으며, 액체 형태 또는 물 또는 생리 식염수에서 수화에 적합한 건조 형태로 공급된다. 경구 투여를 위해, 이러한 부형제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 원한는 경우, 조성물은 또한 습윤제, 유화제 또는 완충제와 같은 소량의 무독성 보조 물질을 함유할 수 있다.

비강내, 기관내 또는 폐내 투여의 경우, 조성물은 코, 기관 및/또는 폐에 분무될 수 있는 액체 또는 에어로졸 제제로 제공될 수 있다.

조성물이 경구 투여를 위한 고형 제제의 형태로 사용되는 경우, 제제는 정제, 과립제, 분말제, 캡슐제 등일 수 있다. 정제 제제에서, 조성물은 일반적으로 첨가제, 예를 들어 사카라이드 또는 셀룰로스 제제와 같은 부형제, 전분 페이스트 또는 메틸 셀룰로스와 같은 결합제, 충전제, 붕해제 및 의료용 제제의 제조에 통상적으로 사용되는 기타 첨가제와 함께 제제화된다.

본원에서 제공되는 약제학적 조성물(예를 들어, 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 약제학적 조성물)은 대상체에게 1회 투여될 수 있거나, 대안적으로, 일정 기간에 걸쳐 다중 투여가 수행될 수 있다. 예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 초과의 투여가 1회의 치료 동안 또는 정해진 기간에 걸쳐 대상체에게 제공될 수 있다. 일부 예에서, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20회 또는 그 초과의 투여가 1회의 치료 동안 또는 치료 요법으로서 일정 기간에 걸쳐 대상체에게 제공될 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어 신경 장애와 관련된 증상이 지속되는 한, 필요에 따라 투여가 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복 투여는 대상체의 남은 생애 동안 지시될 수 있다. 예시적인 투여 스케줄은 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 약제학적 조성물을 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월, 6개월, 12개월 또는 그 초과의 기간 동안 1회 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, EV는 하나 이상의 억제 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, EV는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 및 이중 가닥 RNA(dsRNA)로부터 선택되는 하나 이상의 억제 핵산을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, EV는 하나 이상의 신경영양제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, EV는 백혈병 억제 인자(LIF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 표피 성장 인자 수용체(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), FGF-6, 신경교 유래 신경영양 인자(GDNF), 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 간세포 성장 인자(HGF), IFN-γ, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1ra, IL-6, IL-8, 단핵구 주화성 단백질(MCP-1), 단핵 식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 신경영양 인자(NT3), 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(TIMP-1), TIMP-2, 종양 괴사 인자(TNF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF-D, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR), 뼈 형태원 단백질 4(BMP4), IL1-a, IL-3, 렙틴, 줄기 세포 인자(SCF), 기질 세포 유래 인자-1(SDF-1), 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGFBB), 전환 성장 인자 베타(TGFβ-1) 및 TGFβ-3으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다.

본원에서 설명되는 바와 같은 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 약제학적 조성물은 단일요법(단일 작용제)으로서 또는 대상체에게 폴리펩타이드 로딩된 EV를 하나 이상의 추가의 작용제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 투여되는 조합 요법으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 폴리펩타이드 로딩된 EV, 및 하나 이상의 추가의 작용제를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에게 동시에, 순차적으로 또는 일시적으로 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 신경계 장애, 예를 들어 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 신경계 암(예를 들어, 교모세포종 또는 신경모세포종), 시신경척수염, 다발성 경화증, 편두통, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP) 또는 다초점성 운동 신경병증을 갖는 대상체를 치료할 때 사용하기 위한, 본원에서 설명되는 바와 같은 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 약제학적 조성물(예를 들어, 항체 로딩된 신경 EV를 포함하는 약제학적 조성물)을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 신경계 장애, 예를 들어 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 신경계 암(예를 들어, 교모세포종 또는 신경모세포종), 시신경척수염, 다발성 경화증, 편두통, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP) 또는 다초점성 운동 신경병증을 갖는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에서 설명되는 바와 같은 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체-EV 접합체 및 항체가 내강 내에 로딩된 EV)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

일부 예에서, 약제학적 제제는 약 50 ng의 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 유체 매질, 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 예시적인 약제학적 제제는 약 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1.0 μg, 1.5 μg, 2.0 μg, 2.5 μg, 3.0 μg, 5.0 μg, 10.0 μg, 15.0 μg, 20.0 μg, 100 μg, 또는 그 초과의 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 유체 매질을 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 약제학적 제제는 약 0.1 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 배지, 약 0.2 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 0.3 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 0.4 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 0.5 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 0.6 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 0.7 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 0.8 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 0.9 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 1.0 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 1.5 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 2.0 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 2.5 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 예를 들어 적어도 약 3.0 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 예를 들어 적어도 약 5.0 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 약 10.0 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지, 15.0 μg 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지 또는 약 20.0 μg 또는 그 초과의 폴리펩타이드 로딩된 EV/ml 정맥내 배지를 포함할 수 있다.

일부 예에서, 조성물을 투여하는 것은 단일 용량으로 킬로그램당 1 x 10⁸개 또는 그 초과의 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함한다. 다른 예에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV 조성물의 투여는 1 x 10⁸개, 1 x 10⁸ 내지 1 x 10⁹개, 1 x 10⁹ 내지 1 x 10¹⁰개, 1 x 10¹⁰ 내지 1 x 10¹¹개, 1 x 10¹¹ 내지 1 x 10¹²개, 1 x 10¹²개 또는 그 초과의 폴리펩타이드 로딩된 EV의 투여를 포함한다. 일부 경우에, 단일 용량이 대상체에게 여러 번 투여된다. 특정 다른 예에서, 대상체에 대한 다중 투여는 정맥내, 뇌척수액내, 정맥내 주입 및 주사 중 2개 이상을 포함한다.

일부 경우에, 약제학적 조성물은 적어도 1 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 5 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 10 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 20 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 25 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 50 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 60 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 75 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 100 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 150 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 200 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 250 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 적어도 300 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 약 350 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 약 400 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 약 500 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 약 750 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV, 약 1 g(1,000 mg) 또는 그 초과의 폴리펩타이드 로딩된 EV를 단독으로 또는 적어도 하나의 추가의 작용제의 치료학적 유효량과 조합하여 포함하는 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약 10 mg 내지 약 750 mg, 약 25 mg 내지 약 650 mg, 또는 약 30 mg 내지 약 500 mg, 또는 약 35 mg 내지 약 450 mg, 가장 흔히 약 50 내지 약 500 mg의 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함한다.

폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는, 예를 들어 항체-EV 접합체 및 항체가 내강 내에 로딩된 EV를 포함하는 항체 로딩된 EV를 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량은 상당한 유해한 효과를 일으킬 수 있는 양을 초과하지 않으면서 치료되는 병태(예를 들어, 신경계 장애, 예를 들어, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 또는 신경계 암, 예를 들어 교모세포종)의 하나 이상의 증상을 치료하거나 개선하기에 충분한 양이다. 치료상 효과적인 투여량은 치료되는 특정 개인뿐만 아니라 치료되는 병태의 특성을 포함하는 많은 요인에 따라 달라질 수 있다.

D. 치료 방법

일부 측면에서, 본 발명은 폴리펩타이드 로딩된 EV(예를 들어, 항체-EV 접합체 및 항체가 내강 내에 로딩된 EV를 포함하는 항체 로딩된 EV)를 포함하는 조성물을 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 설명되는 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물은 본원에서 제공되는 임의의 방법에 사용하기에 적합하다. 예시적인 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV는 신경 세포, 예를 들어 신경 전구 세포, 뉴런, 또는 성상세포로부터 유래된다. 다른 예시적인 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV의 EV는 합성 방식으로 생성되고, 신경 EV의 특징적인 하나 이상의 마커, 예를 들어 MSC로부터 유래된 EV에는 존재하지 않는, 신경 EV에 존재하는 하나 이상의 단백질 또는 핵산을 함유한다.

일부 측면에서, 본 발명은 대상체에서 신경계 장애, 예를 들어 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 신경계 암(예를 들어, 교모세포종 또는 신경모세포종), 시신경척수염, 다발성 경화증, 편두통, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP) 또는 다초점성 운동 신경병증을 치료하는(예를 들어, 관련 증상을 치유, 억제, 호전시키는, 진행을 지연시키거나 예방하는, 발병을 지연시키거나 예방하는, 또는 재발 또는 악화를 예방하는) 방법을 제공하고, 이 방법은 본 명세서에서 설명되는 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 조성물을 대상체의 질환 또는 장애를 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 질병 또는 장애를 치료하기에 충분한 양은 바람직하게는 효과적인 양, 예를 들어 본원에서 제공되는 바와 같은 치료 유효량이다.

치료 결과로 인한 증상의 변화는 적절한 대조군과 비교하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 증상의 변화는 치료를 시작하기 전에 동일한 대상체가 경험하는 증상의 빈도, 중증도, 또는 지속 기간, 또는 수와 관련하여 측정될 수 있다. 다른 실시양태에서, 증상의 변화는 치료를 받지 않는, 즉 Ab-EV를 포함하는 조성물을 받지 않은, 유사한 증상을 갖는 상이한 대상체, 또는 대상체 그룹이 경험하는 증상의 빈도, 중증도, 지속 기간 또는 수와 관련하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개선 정도는 적절한 대조군과 비교하여 결정될 때, 적어도 5%, 즉, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 로딩된 EV를 포함하는 조성물은 단일 용량으로서 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, Ab-EV를 포함하는 조성물은 다중 용량으로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 일부 실시양태에서 매일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 6일마다 1회, 7일마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 8주마다 1회, 12주마다 1회 투여될 수 있다.

본 명세서에서 설명되는 본 발명의 방법에 대한 다른 적절한 수정 및 변용이 명백하고 본 발명 또는 본 명세서에 개시된 실시양태의 범위를 벗어나지 않으면서 적절한 등가물을 사용하여 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 이제 본 발명은 단지 예시의 목적으로 포함되고 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참조하여 더욱 명확하게 이해될 것이다.

실시예

하기 실시예는 단지 예시일 뿐이며, 본 명세서에 제공된 개시내용의 범위를 어떤 식으로든 제한하려고 의도하지 않는다.

실시예 1: 항체로 표면 표지된 신경 전구 세포 세포외 소포체의 제조

이 실시예에서는 클릭 화학을 사용하여 신경 전구 세포에서 유래된 세포외 소포체(EV)에 대한 항체(Ab)의 접합을 설명한다.

그의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제US2018/0327714A1호에 제시된 방법에 따라 신경 전구 세포로부터 정제된 EV 집단을 얻었다. 간단히 설명하면, 인간 신경 전구 세포를 미국 특허 출원 공개 제US2018/0327714A에 기재된 바와 같이 배양하였다. 배지 교체 24시간 후에 신경 전구 세포의 융합 배양물로부터 세포 배지를 수집하고, -20℃에서 동결시켰다. 배지를 4℃에서 밤새 해동하고, 세포외 소포체(EV) 정제 전에 0.22 μm 필터 유닛을 통해 여과하였다. 접선 유동 여과를 사용하여 여과된 세포 배양 배지로부터 세포외 소포체를 정제하였다.

AlexaFluor Plus 647로 표지된 염소 항-토끼 IgG 항체는 뮤린 모델에서 반응성 및 면역원성이 결여될 것으로 예상되기 때문에 개념 증명 실험을 위해 선택되었다. 항체(Ab)는 SITECLICK™ 항체 아지도 변형 방법을 사용하여 아지드 기를 포함하도록 변형되었다(ThermoFisher 카탈로그 번호 S20026 참조). 제조업체의 권장 사항을 따랐다.

이와 별도로, EV는 EV 표면의 아민 기를 표적으로 하는 SDP 에스테르 기를 통해 sDIBO를 표시하도록 변형되었다. sDIBO(CLICK-IT™ SDP 에스테르 sDIBO 알킨, ThermoFisher 카탈로그 번호 C20025)는 EV당 5.95e5 분자의 sDIBO 비율로 실온에서 2시간 동안 EV와 반응하였다. 이 숫자는 이후 단계에서 추가되는 Ab 분자의 수의 ~10배이기 때문에 선택되었다.

유리된 비접합 항체의 용량 증량 실험은 간에서 높은 신호를 정성적으로 검출하기 위해 100 μL 용량에 약 8x10¹³개의 Ab의 주사가 필요함을 나타내었고, 따라서 EV에 대한 가교연결을 위한 용량으로 선택되었다. 아지도-Ab는 EV당 5.95e4개 Ab의 비율로 sDIBO-EV와 혼합되었다. 이어서, 구리 부재 클릭 화학 반응을 통해 혼합될 때 항체를 EV에 접합시켰다(도 1).

실시예 2: EV-Ab 접합체의 생체내 투여

이 실시예는 마우스에서 세포외 소포체-항체(EV-Ab) 접합체의 생체내 투여를 설명한다. 밤새 인큐베이션한 후, EV-Ab 혼합물, Ab 단독 및 PBS(n=1 / 조건)를 동물에게 정맥 내로 주사하였다. 약 2시간 후, 동물들은 희생되고, 뇌를 보존하였다. 조직을 고정하고, 동결절편으로 만들고, 일부 경우에는 배경을 줄이기 위해 TrueBlack Lipofuscion 자가형광 소광체(Autofluorescence Quencher)(Biotium)로 처리하였다. 절편은 이미지화 전에 항-염소 이차 항체로 염색되었다.

염색된 부분과 염색되지 않은 부분을 자이스(Zeiss) LSM 710 공초점 현미경으로 이미지화하였다. 일부 경우에 자이스 젠(Zeiss Zen) 2012 블루 소프트웨어를 사용하여 선형 언믹싱(linear unmixing)으로 람다 이미지를 촬영하는 것을 비롯하여, 신호와 배경을 구별하기 위해 여러 파장에서 이미지를 촬영하였다. 처음에, PBS 처리 동물의 뇌 절편으로부터 무작위로 선택된 프레임을 이미지화하여 신호 대 노이즈에 대한 느낌을 얻었다. 처리되지 않은 뇌 절편이 이미지화되고 분석되면, Ab-EV 혼합물로 처리된 동물은 자동 타일링된 z-스택(tiled z-stack)에서 반구 슬라이스로서 이미지화되었다. 낮은 배율에서 여러 파장으로 전체 절편을 이미지화할 때, 줌 및 스캔을 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 절편을 수동으로 검사하였다. Ab로 처리된 동물의 한쪽 반구도 스캔하고 분석하였다. 분석 후에, 하나의 Ab-EV 반구(도 2b)는 PBS 처리 또는 Ab 단독(도 2a) 처리 뇌 슬라이스와 달리 신호 패턴을 가졌다. Ab 단독 및 PBS 처리된 마우스 둘 모두는 영역에 따라 그의 모양이 다른 고강도 점상(punctate) 형광을 나타내었고, 이것은 자가형광을 나타낸다. 점상 형광이 없는 영역에서, 신호는 TrueBlack Lipofuscion 자가형광 소광체(Biotium)에 의해 완전히 소멸되었다. Ab-EV 반구는 PBS 및 Ab 단독 처리된 뇌 슬라이스와 유사한 영역에서 유사한 자가형광을 보였다. 그러나, Ab 단독 및 PBS 처리된 뇌에서 소광된 영역에서, Ab-EV는 세포의 형태로 고강도의 신호 축적을 나타내는 고강도의 신호 축적 패턴을 나타내었고(도 2b), 이것은 뇌 조직에 대한 Ab-EV 접합체의 전달을 입증하였다.

실시예 3: 세포외 소포체의 내강내 로딩

이 예는 EV 막 투과화를 통해 신경 전구 세포로부터 유래된 세포외 소포체의 내강 내에 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 루시페라제 단백질)를 로딩하는 것을 설명한다.

항체는 사포닌 투과화(0.2% w/w), 인큐베이션, 전기천공 또는 초음파 처리에 의해 신경 전구 세포 유래 EV 내에 로딩되었다. 사포닌 투과화는 세제 기반 로딩을 제공하고, 진탕(500 rpm)과 조합되었다. 인큐베이션은 진탕하면서(1000 rpm) 실온에서 수행되었다. 500 V, 1 ms 폭 및 12 펄스에서 네온 형질감염(Neon Transfection) 시스템을 사용하여 전기천공을 수행하였다. 마지막으로, 20% 진폭, 12 사이클, 4 sec 온 및 8 sec 오프를 사용하여 피셔브랜드(Fisherbrand) 모델 505 초음파 처리기(500 W, 20 kHz)를 사용하여 초음파 처리를 수행하였다. 이러한 상이한 로딩 절차를 시험한 후, 엑소솜(EV)당 25,000개 이상의 항체 분자를 사용하여 엑소솜의 내강 내로의 항체 로딩을 달성하였다(도 3a).

루시페라제 단백질(62 kDa)은 사포닌 투과화, 인큐베이션 또는 초음파 처리에 의해 신경 전구 세포 EV 내에 로딩되었다. 사포닌 투과화는 세제 기반 로딩을 제공하고, 단백질을 추가하기 전에 초음파 처리와 조합되었다. 인큐베이션은 진탕하면서(1000 rpm) 실온에서 수행되었다. 마지막으로, 피셔브랜드 모델 505 초음파 처리기(500 W, 20 kHz)를 사용하여 초음파 처리를 수행하였다. 진폭, 펄스 시간 및 사이클 수를 변경한 여러 순열이 시험되었다(아래 표 12에 설명됨). 직접 프로브 초음파 처리가 루시퍼라제 단백질 기능을 파괴함에 따라, 모든 초음파 처리 프로토콜은 컵 혼 액세서리(cup horn accessary)를 사용하여 수행되었다. 50번 이상의 로딩 절차를 시험한 후, 루시페라제 단백질의 15% 이상의 로딩 효율이 달성되었다. 표 12에 기재되어 있는 각각의 조건에 대한 로딩 효율은 도 3b에 설명되어 있다.

참조에 의한 통합

본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허, 출원 중인 특허 출원 및 간행물의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 명시적으로 포함된다.

균등물

관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 균등물을 인식하고 있거나 또는 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음과 같은 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> ARUNA BIO, INC. <120> EXTRACELLULAR VESICLES AND USES THEREOF FOR ANTIBODY DELIVERY <130> A106525 1040WO <140> <141> <150> 62/930,178 <151> 2019-11-04 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 31 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Asn Ala Ser Gly Thr Arg 1 5 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Val <210> 74 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr 1 5

Claims (48)

1. 대상체의 중추 신경계(CNS)에 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 전달하는 방법으로서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 신경 세포로부터 유래된 세포외 소포체를 포함하는 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 클릭 링커에 의해 세포외 소포체의 표면에 접합되는 것인 대상체의 CNS에 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 전달하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 접합체가 정맥 내로 투여되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 접합체가 비강 내로 투여되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 접합체가 두개 내로 투여되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 접합체가 척수강 내로 투여되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 신경 세포가 신경 전구 세포인 방법.
7. 제6항에 있어서, 신경 전구 세포가 인간 만능 세포로부터 유래되는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 인간 만능 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
9. 제7항에 있어서, 인간 만능 세포가 유도 만능 줄기 세포인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 IgG인 방법.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 Fab, F(ab')2, scFv, 탠덤 scFv, 디아바디, 미니바디, 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 단편인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 부분인 방법.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 완전한 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 클릭 링커가 아지드 클릭 시약과 알킨 클릭 시약 사이의 반응으로부터 형성되는 것인 방법.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 클릭 링커가 아지드와 디벤조사이클로옥틴(DBCO) 사이의 반응으로부터 형성되는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 클릭 링커가 테트라진과 트랜스사이클로옥텐 사이의 반응으로부터 형성되는 것인 방법.
17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 클릭 링커가 테트라진과 노르보르넨 사이의 반응으로부터 형성되는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대상체의 뇌로 전달되는 것인 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대상체의 척수로 전달되는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, EV가 외인성 핵산 및/또는 외인성 단백질을 추가로 포함하는 것인 방법.
21. 제18항에 있어서, EV가 외인성 siRNA 및/또는 안티센스 핵산을 포함하는 것인 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, EV가 소분자를 추가로 포함하는 것인 방법.
23. 항체-세포외 소포체(EV)(Ab-EV) 접합체를 포함하는 조성물로서, 상기 접합체는 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 신경 세포로부터 유래된 세포외 소포체(EV)를 포함하고, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 클릭 링커에 의해 EV 표면에 접합되는 것인 Ab-EV 접합체를 포함하는 조성물.
24. 제23항에 있어서, 신경 세포가 신경 전구 세포인 조성물.
25. 제24항에 있어서, 신경 전구 세포가 인간 만능 세포로부터 유래되는 것인 조성물.
26. 제25항에 있어서, 인간 만능 세포가 인간 배아 세포 또는 유도 만능 세포인 조성물.
27. 제23항에 있어서, 클릭 링커가 아지드와 디벤조사이클로옥틴; 테트라진과 트랜스사이클로옥텐; 테트라제인과 노르보르넨; 아지드와 알린; 아지드(스트레인 촉진)와 알킨; 아지드(스트레인 촉진)와 니트론; 알켄과 아지드; 알켄과 테트라진; 및/또는 알켄과 테트라졸 사이의 반응 중 임의의 하나 이상의 반응에 의해 형성되는 것인 조성물.
28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 IgG인 조성물.
29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 Fab, F(ab')₂, scFv, 탠덤 scFv, 디아바디, 미니바디 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 단편인 조성물.
30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 부분인 조성물.
31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 솔라네주맙, 아두카누맙, 니볼루맙, 베바치주맙, 오크렐리주맙, 나탈리주맙, 디누툭시맙, 간테네루맙, 레카네맙, 또는 유블리툭시맙 중 임의의 하나 이상인 조성물.
32. 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 세포외 소포체(EV)의 내강 내에 로딩하는 방법으로서, i) EV를 사포닌으로 처리하여 EV 막을 투과화시키는 단계; (ii) 처리된 EV를 초음파 처리하는 단계; 및 (iii) 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 EV에 첨가하여 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 EV의 내강 내에 로딩하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 EV의 내강 내에 로딩하는 방법.
33. 제32항에 있어서, EV가 약 0.05% 내지 0.3% 사포닌으로 처리되는 것인 방법.
34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 로딩할 때 항체의 적어도 10%가 EV 내에 로딩되기에 충분한 시간 동안 EV를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
35. 대상체의 중추 신경계(CNS)에 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 전달하는 방법으로서, 세포외 소포체(EV)의 내강에 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 EV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 EV는 신경 세포로부터 유래되는 것인 대상체의 CNS에 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 전달하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 신경 세포가 신경 전구 세포인 방법.
37. 제36항에 있어서, 신경 전구 세포가 인간 만능 세포로부터 유래되는 것인 방법.
38. 제37항에 있어서, 인간 만능 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
39. 제37항에 있어서, 인간 만능 세포가 유도 만능 줄기 세포인 방법.
40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 IgG인 방법.
41. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 Fab, F(ab')₂, scFv, 탠덤 scFv, 디아바디, 미니바디 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 단편인 방법.
42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 부분인 방법.
43. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 완전한 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분인 방법.
44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대상체의 뇌로 전달되는 것인 방법.
45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대상체의 척수로 전달되는 것인 방법.
46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, EV가 외인성 핵산 및/또는 외인성 단백질을 추가로 포함하는 것인 방법.
47. 제46항에 있어서, EV가 외인성 siRNA 및/또는 안티센스 핵산을 포함하는 것인 방법.
48. 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, EV가 소분자를 추가로 포함하는 것인 방법.

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